JPH08502723A

JPH08502723A - オリゴヌクレオチド・アルキルホスホノチオエート

Info

Publication number: JPH08502723A
Application number: JP6504732A
Authority: JP
Inventors: パドマプリヤ、エイ．; アグラワル、スディール
Original assignee: ハイブライドンインコーポレイテッド
Priority date: 1992-07-27
Filing date: 1993-07-26
Publication date: 1996-03-26
Also published as: DE69316369D1; EP0652890B1; EP0652890A1; AU4688393A; RU95104940A; AU678769B2; WO1994002499A1; CA2140542A1; ATE162198T1; US5929226A

Abstract

(57)【要約】本発明は、アルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を有することにより、核酸分解に対する抵抗性が増大したより改善されたオリゴヌクレオチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチド・アルキルホスホノチオエート発明の背景１．発明の分野本発明は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドに関するものである。より具体的にいうならば、本発明は、核酸分解に対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高めるように修飾されたヌクレオチド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドに関するものである。２．関連技術の要約合成オリゴヌクレオチドは、基礎科学研究における重要な道具となってきている。最近では、遺伝子発現調節の領域で合成オリゴヌクレオチドがうまく利用されるようになってきており、それが、様々なウイルス感染症や遺伝子発現による疾患の治療のためのアンチセンス・オリゴヌクレオチド療法として知られる新しい治療法の基礎を成している。オリゴヌクレオチドがウイルス増殖阻止能、およびインビトロ（in vitro）での遺伝子発現調節能を有することが、複数の研究者により実証されている。ウイルス・ゲノムの一部に対して相補的な１３量体合成オリゴデオキシヌクレオチドが、感染ヒナ線維芽細胞においてラウス肉腫ウイルスの複製を特異的に阻止することが、ザメクニクおよびステファンソンによりProc．Natl．Acad．Sci．USA 7 5巻285-288頁（1978年）に開示されている。ウイルスＲＮＡに対して相補的な合成オリゴヌクレオチド・ホスホジエステルが、培養細胞においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、その後ＨＴＬＶ−ＩＩＩと呼ばれる）の複製および発現を阻止することが、ザメクニクらによりProc ．Natl．Acad．Sci．USA 83巻4143-4146頁（1986年）に開示されている。最近の研究により、オリゴヌクレオチドに核酸分解に対する抵抗性をもたらすような人工的ヌクレオチド間連鎖を含むようにオリゴヌクレオチドを修飾するアンチセンス法では、オリゴヌクレオチドがより効率よく働くことがわかっている。これらの研究では、多様な人工的ヌクレオチド間連鎖を用いている。中でも最もよく研究されている人工的ヌクレオチド間連鎖は、メチルホスホネート、ホスホロチオエートおよび様々なホスホルアミデートのヌクレオチド間連鎖である。オリゴデオキシヌクレオシド・メチルホスホネートは、従来のオリゴデオキシヌクレオチドに比べてＨＩＶ−１の阻害物質としてより活性が高いことが、サリンらによりProc．Natl．Acad．Sci．USA 85巻7448-7451頁（1988年）に記載されている。オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートおよび様々なオリゴヌクレオチド・ホスホルアミデートが、従来のオリゴデオキシヌクレオチドに比べてＨＩＶ−１阻害においてより有効であることが、アグラワルらによりProc．Natl．Acad．Sci．USA 85巻7079-7083頁（1988 年）に記載されている。感染初期の細胞および慢性感染細胞で、オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートがＨＩＶ−１の阻害において優れていることは、アグラワルらによりProc． Natl．Acad．Sci．USA 86巻7790-7794頁（1989年）に開示されている。オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートがＨＳＶを阻害することは、ガオらによりAntimicrob．Agents andChem．34巻808頁（1990年）に開示されている。オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートがＨＰＶを阻害することは、ストーレイらによりNucleic Acids Res．19巻4109頁（1991年）に開示されている。オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートがインフルエンザ・ウイルスを阻害することは、レイターらによりProc．Natl．Acad．Sci．USA 87巻3430頁（1990 年）に開示されている。残念ながら、オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートは、核酸分解に対する抵抗性が高まっているものの、インビボ（in vivo）において完全な抵抗力をもたらすにはいたっていない。オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートはマウスでは３’末端からどんどん分解されることが、アグラワルらによりProc．Natl．Acad．Sci．USA 88巻7595-7599頁（1991年）に記載されている。オリゴヌクレオチドに核酸分解に対する抵抗性をもたらす人工的ヌクレオチド間連鎖を有するようにオリゴヌクレオチドを修飾するアンチセンス法は効力がより大きいことから、核酸分解に対してさらに大きな抵抗性をもたらす新たな人工的ヌクレオチド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドを開発することはきわめて重要となる。非イオン性オリゴヌクレオチドは、細胞による取り込みがさらによいので、特に注目の的である。新しい有用な非イオン性人工的ヌクレオチド間連鎖の候補として考えられるのが、アルキルホスホノチオエート連鎖である。ただし、アルキルホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を合成オリゴヌクレオチドに組み入れるための方法はまだ開発されていない。これまでのところ試みられているのは、メチルホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を含有するジヌクレオチドを生成するための液相合成操作に限られている。二塩化メチルホスホノチオンを使ってメチルホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を有するジヌクレオチドを５６％の収率で生成する方法が、ブリルとカルーセルによりTet．Lett．28巻3205-3208頁（1987年）およびTet．Lett．29巻1 227-1230頁（1988年）に開示されている。二塩化メチルホスホノチオンを１−ヒドロキシ−６− トリフルオロメチルベンゾトリアゾールで処理することにより得られる試薬をそのまま用いて、メチルホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を６０〜７０％の収率でジヌクレオチドに導入する液相法が、ローレンらによりNucleic Acids Res．16巻7633-7645頁（1988年）に開示され、二量体を連続２回縮合することによってこの連鎖を含有する六量体が生成されている。立体特異的メチルホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を含有するジヌクレオチドを５０〜６０％の収率で生成する液相法が、レバデフらによりTet．Let t．31巻855-858頁（1990年）に開示されている。ヌクレオシドＨ−ホスホノチオエートおよびヌクレオシド・メチルホスホノチオエートの合成については、スタビンスキーらによりNucleic Acids Res．Sympo sium Series 21号47-48頁（1989年）に開示されている。しかしながら、アンチセンス法でアルキルホスホノチオエートの人工的ヌクレオチド間連鎖を使用するには、このヌクレオチド間連鎖をジヌクレオチドではなくオリゴヌクレオチドに組み込む必要がある。残念ながら、関連技術ではこれを容易に実現する方法はない。他の非イオン性人工的ヌクレオチド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドの合成についてはすでに知られている。たとえば、標準的なアミダイト縮合サイクルにおいて、メチルホスホネートのヌクレオチド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドを生成する、ヌクレオシド・メチルホスホンアミダイト法が、アグラワルとグッドチャイルドによりTet．Lett．28巻353 9-3592頁（1987年）に開示されている。ただし、この文献にはオリゴヌクレオチド・メチルホスホノチオエートまたはアルキルホスホノチオエートの合成に関しては何も書かれていない。オリゴヌクレオチドの酸化的硫化の方法について報告している文献は複数ある。たとえば、二硫化炭素：ピリジン：トリエチルアミン溶液で硫黄元素を使ってオリゴヌクレオチド亜リン酸トリエステルを硫化する方法がスタックらによりJ ．Am．Chem．Soc．106巻6077-6079頁（1984年）に開示されている。３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドを使ったオリゴヌクレオチドの硫化方法が、ボカージュらにより米国特許第５，００３，０９７号（1991年）に開示されている。しかしながら、これらの文献はオリゴヌクレオチドにおける天然ホスホジエステルのヌクレオチド間連鎖の酸化的硫化を示したものであり、メチルホスホノチエートを生成するための中間体メチル亜リン酸連鎖の酸化的硫化を示すものではない。そこで、アルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖など非イオン性の人工的ヌクレオチド間連鎖を有する修飾されたさらに新たなオリゴヌクレオチドを生成する方法が求められる。この方法は、オリゴヌクレオチド合成の標準的方法に適合させることができ、それによって修飾されたオリゴヌクレオチドおよび様々なヌクレオチド間連鎖を有するキメラ・オリゴヌクレオチドをうまく構築できるので理想的である。発明の概要本発明は、第１に、アルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドを合成する方法をもたらすものである。本発明の方法は、標準的なアミダイト縮合サイクルに容易に適合させることができるので、オリゴヌクレオチドをうまく生成することができる。本発明のこうした特徴により、合成しうるオリゴヌクレオチドのタイプに柔軟性をもたらすことも可能になる。これは、様々な縮合サイクルで異なるヌクレオチド間連鎖を導入することができるためである。そこで第２に、本発明はオリゴヌクレオチド内の１ないし複数のどの位置にでも、あるいは片端または両端にでも、１ないし複数のアルカリホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を有し、他の位置には天然のまたは他の人工的なヌクレオチド間連鎖を有するキメラ・オリゴヌクレオチドを合成する方法をもたらすものである。第３点として、本発明は、オリゴヌクレオチド内から選んだ１ないし複数の位置に、またはその片端もしくは両端、あるいはその両者に、１ないし複数のアルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドをもたらす。本発明に基づくこれらのオリゴヌクレオチドは、既知のオリゴヌクレオチドに比べて核酸分解に対する抵抗性が大きい。第４点として、本発明は、オリゴヌクレオチドのいずれかの位置にアルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を有し、他の位置に天然のまたは他の人工的なヌクレオチド間連鎖を有するキメラ・オリゴヌクレオチドをもたらす。これらのキメラ・オリゴヌクレオチドは、非イオン性のヌクレオチド間連鎖のみを有するオリゴヌクレオチドにつきものの可溶性や二重らせんの安定性の限界という問題点を克服することができる。本発明により、たとえば核酸分解に対する抵抗性が既知のオリゴヌクレオチドよりも高まり、また一部の実施例では可溶性や二重らせんの安定性が既知の非イオン性オリゴヌクレオチドに比べて高まるなど、オリゴヌクレオチドの特性が改善されることで、本発明に基づくオリゴヌクレオチドは、遺伝子制御の活性調節を調べる基礎科学研究への応用においても、ウイルスや病原菌による感染症ならびに遺伝子性疾患の治療に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド療法という取組みにおいても、格別有用なものとなる。図面の簡単な説明図１には、本発明の方法の好ましい実施例におけるオリゴヌクレオチド・メチルホスホノチオエート合成の段階を示す。図２は、アルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖である。Ｒは、１から７の炭素原子を有するアルキル基またはアリール基で、そのいずれも置換せずそのままにしておくこともできれば、ハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシロキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルバルコキシル基、またはアミノ基で置換することもできる。好ましい実施例の詳細な説明本発明は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド療法の取り組みにおいて有用なオリゴヌクレオチドに関する。より詳細には本発明は、ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高めるように修飾されたヌクレオチド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、第１に、アルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドを合成する方法をもたらす。この連鎖については図２に示す。本発明の方法を用いると、このようなアルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を、オリゴヌクレオチド内のどの位置にでも導入することができる。したがって、オリゴヌクレオチドの３’末端またはその近傍、５’末端またはその近傍、オリゴヌクレオチド内の中央、あるいはこれらの位置のどのような組合せにでも、アルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートを１ないし複数有するオリゴヌクレオチドを生成することができる。本発明でいうところの３’末端近傍または５’末端近傍とは、当該末端からヌクレオチド４個以内のところであり、また中央とは、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端あるいはその近傍を除いたオリゴヌクレオチド内のあらゆる位置のことである。本発明に基づくオリゴヌクレオチド合成方法は、オリゴヌクレオチド合成のためのＨ−ホスホネート法およびホスホルアミデート法のいずれとも互換性がある。こうした特徴はさらに利点をもたらす。なぜならば、Ｈ−ホスホネート法またはホスホルアミデート法、あるいはこれらの変法を用いて導入することのできる他のヌクレオチド間連鎖に加えて、アルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドを合成できるからである。このような他のヌクレオチド間連鎖としては、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネートのヌクレオチド間連鎖、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、ケトン、スルホン、カーボネートおよびチオアミデートの連鎖があるが、これらに限定されない。そこで第２点として、本発明は、オリゴヌクレオチド内の選ばれた１ないし複数の位置に、１ないし複数のアルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を有し、しかもオリゴヌクレオチド内の他の位置には他のタイプのヌクレオチド間連鎖を有するキメラ・オリゴヌクレオチドを合成する方法をもたらす。本発明のこの最初の２つの特徴のいずれかに基づいて、アルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドを合成するための本発明の方法は、次の段階から成る。（ａ）２つのヌクレオシドをアルキル亜リン酸連鎖またはアリール亜リン酸連鎖により縮合し、（ｂ）アルキル亜リン酸連鎖を酸化的にチオレーションして、アルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖をもたらす。図１には、本法の好ましい実施例を示したが、ここでは亜リン酸メチル連鎖が酸化的にチオレーションされ、メチルホスホノチオエート連鎖を形成している。図１の化合物１に示されているリン酸結合メチル基を他の置換したまたは置換していないアルキル基もしくはアリール基で置換することによって、その他の置換されたまたは置換されないアルキルホスホネート連鎖もしくはアリールホスホネート連鎖も同様に生成することができる。好ましい実施例では、上記の段階（ａ）の結合はβ−シアノアルキルホスホルアミダイトおよび標準的なアミダイト縮合サイクルを用いて行われている（たとえば、アグラワルとグッドチャイルドによるTet．Lett．28巻3539-3592頁（1987年）を参照）。別の好ましい実施例では、上記の段階（ｂ）の酸化的チオレーションを、適当な溶液中でボカージュ（Beau cage）試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−２−オン）を使ってアルキル亜リン酸またはアリール亜リン酸連鎖を処理して実行する。本発明に基づく方法のあらゆる実施例で、他のヌクレオチド、すなわちアルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖と結合していないヌクレオチドとの縮合は、既知の縮合法、好ましくは、Ｈ−ホスホネート法（米国特許第５，ＸＸＸ，ＸＸＸ号、出願番号０７／３３４，６７９、１９９２年３月１９日許可、その教示を参考のためここに引用する）により、あるいは従来のホスホルアミデート法により行うのが望ましい。アルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖により結合したヌクレオチドを生成するための上記の基本的な段階を反復することで、アルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖のみを有するオリゴヌクレオチドを生成するか、もしくは望ましくは他の縮合段階によって改変して、定められた位置にのみアルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖を有するオリゴヌクレオチドを生成することができる。したがって、３’末端またはその近傍にのみアルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖を有するオリゴヌクレオチドを生成するには、まずアルキル亜リン酸連鎖またはアリール亜リン酸連鎖によりヌクレオチドを縮合してから、ボカージュ試薬で酸化し、他のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を、たとえばＨ−ホスホネートまたはホスホルアミデート縮合サイクルによって追加する。それに対して、アルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖をオリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍に置こうとする場合には、最初の縮合でまず最初にたとえばＨ−ホスホネートまたはホスホルアミデートの化学作用を利用して、希望するいかなるヌクレオチド間連鎖を生成する。それから、アルキルチオホスホネート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖を希望する位置で、ヌクレオシドをアルキル亜リン酸連鎖またはアリール亜リン酸連鎖により結合し、それから酸化的チオレーションを行う。当業者であれば、上記の段階（ａ）および（ｂ）はオリゴヌクレオチド合成スキームのどの時点であれ導入でき、したがってアルキルチオホスホン酸連鎖またはアリールホスホノチオネート連鎖をオリゴノヌクレオチド内のどの位置であれ組み入れられることがわかるだろう。さらに、上記の段階（ａ）および（ｂ）は、どのような合成スキームにも組み込むことができるので、すでによく知られている他のどのヌクレオチド間連鎖でも、アルキルチオホスホネート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖を含有するオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。通常の合成スキームがよく知られている連鎖の例としては、アルキルホスホネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、ケトン、スルホン、カーボネート、およびチオアミデートの連鎖がある。第３に、本発明は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド療法で使用するためのより改良されたオリゴヌクレオチドをもたらす。本発明でオリゴヌクレオチドというときには、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいはその両者のモノマーがアンチセンス・オリゴヌクレオチド法における既知のどの連鎖でも含むことのできる５’から３’の連鎖により結合されている、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいはその両者のポリマーを含んでいる。さらに、オリゴヌクレオチドというときには、修飾した核酸塩基または糖、あるいはその両者を有する分子や、ジアミン、コレステリル、またはその他の親油基などの置換基が付け加えられている分子を含む。本発明に基づくオリゴヌクレオチドには、１ないし複数のアルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を含有する。好ましい実施例では、本発明に基づくオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドの３’末端またはその近傍、オリゴヌクレオチオドの５’末端またはその近傍、あるいはオリゴヌクレオチドの両端に２以上のアルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖がある。この好ましい実施例に基づくオリゴヌクレオチドは、既知のオリゴヌクレオチドに比べてヌクレアーゼに対する抵抗性が強い。さらに別の好ましい実施例では、アルキルホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖のアルキル基がメチル基になっている。ただし、この他に適当なアルキル基として、１から７の炭素原子を有するアルキル基があり、このアルキル基は置換されていないこともあれば、たとえばハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシロキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルバルコキシル基またはアミノ基によって置換されることもある。さらに、アリールホスホノチオエート連鎖のアリール基は、置換されていないこともあれば、たとえば、ハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシロキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルバルコキシル基またはアミノ基によって置換されることもある。本発明に基づくオリゴヌクレオチドは、ウイルス、病原菌、または異常な遺伝子発現または遺伝子産物が生じると病的状態をもたらす細胞遺伝子もしくは遺伝子転写物を形成している核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有するのが望ましい。ただし、本発明に基づくオリゴヌクレオチドは、どのようなヌクレオチド配列であれ、オリゴヌクレオチドの安定性の研究に有用である。本発明では、「核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列」とは、生理的条件下で、たとえばワトソン・クリック塩基対（オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸との相互作用）により、またはフーグスティーン型塩基対（オリゴヌクレオチドと二重鎖核酸の三重らせん構造を形成する相互作用）により、核酸配列とハイブリッドを形成するヌクレオチド配列を意味する。生理的条件下におけるこのようなハイブリッド形成は、実際には、核酸配列の働きによる干渉を観察することによって測定される。本発明に基づくオリゴヌクレオチドは、約８から５０のヌクレオチドを有することが望ましく、また最も望ましいヌクレオチドの数は約１４から約３５である。本発明に基づくオリゴヌクレオチドの標的ハイブリッド形成領域にとって相補的な核酸配列は、治療対象の病的状件によって異なる。多くの場合、この核酸配列はウイルス核酸配列である。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いて様々なウイルスを阻害することはよく知られており、最近ではTibtech 10巻152-158 頁（1992年）にアグラワルによるレビューが載っている。有効なアンチセンス・オリゴヌクレオチドと相補的なウイルス核酸配列は、多数のウイルスについて記述されており、その中にはヒト免疫不全ウイルス１型（グッドチャイルドとザメクニクによる米国特許第４，８０６，４６３号、その教示を参考のためここに引用する）、単純ヘルペスウイルス（米国特許第４，６８９，３２０号、その教示を参考のためここに引用する）、インフルエンザウイルス（米国特許第５，ＸＸＸ，ＸＸＸ号、出願番号０７／５１６，２７５、１９９２年６月３０日許可、その教示を参考のためここに引用する）、およびヒト乳頭腫ウイルス（ストーレイら、Nucleic Acids Res．19巻4109-4114頁（1994年））がある。これらの核酸配列のいずれかに対して相補的な配列は、本発明に基づくオリゴヌクレオチドの標的ハイブリッド形成領域として利用でき、また他のどのウイルスの核酸配列に対してでも相補的なヌクレオチド配列も利用できる。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを生成できる既知の核酸配列を有するウイルスとしては、この他に、***ウイルス（以下を参照：ロバートソンら、J．Vir ology 54巻651頁（1985年）、ハリスら、J．Virology 36巻659頁（1980年）参照）、黄熱病ウイルス（ライスら、Science 229巻726頁（1985年）参照）、水痘帯状疱疹ウイルス（ダビソンとソコット、J．Gen．Virology 67巻2279頁（1986年）参照）、および、キュウリモザイクウイルス（リチャーズら、Virology 89巻3 95頁（1978年）参照）がある。この代わりに、本発明に基づくオリゴヌクレオチドの標的ハイブリッド形成領域は、病原菌の核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有することもできる。多くの病原菌の核酸配列がすでに記述されており、その中にはマラリア菌、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）および多数の病原細菌も含まれる。これらのどの病原菌の核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列でも、本発明に基づくオリゴヌクレオチドを形成できる。それに対してアンチセンス・オリゴヌクレオチドを生成できるような既知の核酸配列を有する病原真核生物の例としては、トリパノソーマ・ブルセイ・ガンビエンス（Trypanosoma brucei gambiense）およびリーシュマニア（Leishmania）（キャンベルら、Nature 311巻350頁（1984年）参照）、および肝蛭（Fasciola hepatic）（ズリタら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84巻2340頁（1987年）参照）が挙げられる。さらに別の実施例として、本発明に基づくオリゴヌクレオチドは、異常な遺伝子発現または遺伝子産物が生じると病的状態をもたらす細胞遺伝子または遺伝子転写物に対して相補的なヌクレオチド配列を有することができる。このような細胞遺伝子の複数について核酸配列がすでに記述されており、これにはプリオン蛋白（スタールとプルジナー、FASEB J．5巻2799-2807頁（1991年））、アルツハイマー病に関連するアミロイド様蛋白（米国特許第５，０１５，５７０号、その教示を参考のためここに引用する）、および様々な癌遺伝子および癌原遺伝子、たとえばｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ａｂｌ、およびｎ−ｒａｓがある。これらの遺伝子のいずれかの核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を、本発明に基づくオリゴヌクレオチドに使用することができ、またその他、異常な遺伝子発現または遺伝子産物が生じると病的状態をもたらす細胞遺伝子または遺伝子転写物に対して相補的なヌクレオチド配列も利用できる。第４に、本発明は、混合バックボーン・オリゴヌクレオチドおよびキメラ・オリゴヌクレオチドをもたらす。本発明に基づく混合バックボーン・オリゴヌクレオチドおよびキメラ・オリゴヌクレオチドのいずれも、アルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖と、他のタイプのヌクレオチド間連鎖とを含有する。他のタイプのヌクレオチド間連鎖は、アルキルホスホネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、ケトン、カーボネート、スルホンおよびチオアミデートの連鎖、あるいはこれらのあらゆる組合せの中から選択するのが好ましいが、他のヌクレオチド間連鎖も同様に利用できる。本発明に基づく混合バックボーン・オリゴヌクレオチドについては、アルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖と他のヌクレオチド間連鎖は、オリゴヌクレオチド内でどのような順序であってもよい。本発明に基づくキメラ・オリゴヌクレオチドも同様であるが、ただし同一タイプのヌクレオチド間連鎖を有するヌクレオチドのグループがある。所定のヌクレオチドのグループには、アルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖またはその他のタイプのヌクレオチド間連鎖を有することがある。このようなグループは、オリゴヌクレオチドの５ ’末端または３’末端のいずれかに位置することができ、あるいはオリゴヌクレオチド内の中央に位置することもある。このようなグループのサイズは、一般に少なくとも３ヌクレオチド（アルキルホスホノチオエート連鎖が２つ）であり、それよりはるかに長くなることもある。好ましい実施例では、キメラ・オリゴヌクレオチドにはアルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートに連鎖したヌクレオチドのグループが各端に１つずつ、合計２つある。別の好ましい実施例では、そのようなアルキルホスホノチオエートに連鎖したヌクレオチドの基が１つ、オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれかにあり、さらにホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート連鎖により連鎖した４つ以上のヌクレオチドのグループがある。第５点として、本発明は、ウイルス、病原菌、あるいは異常な遺伝子発現または遺伝子産物が生じると病的状態をもたらす細胞遺伝子もしくは遺伝子転写物を阻害する方法を提供する。このような阻害作用を達成するには、本発明に基づくオリゴヌクレオチドを、当該ウイルスまたは病原菌に感染している細胞、あるいは異常な遺伝子発現または遺伝子産物が生じると病的状態をもたらす細胞遺伝子または遺伝子転写物の影響を受ける細胞に投与する。この細胞が人体内または動物体内にある場合には、オリゴヌクレオチドは経口投与、非経口的投与、局所投与、経皮投与、またはエアロゾル投与をする。この場合、本発明に基づくオリゴヌクレオチドをこのようにして投与することが、ヒトまたは動物のための治療方法となる。本発明の方法によって治療可能なものの一部を以下に示す。***形成、***の運動、***と卵の結合、その他***の生存に影響を及ぼすあらゆる段階に大いに関与するかもっぱら関与する構造蛋白質または酵素の合成を阻害するオリゴヌクレオチドは、ヒト男性の避妊薬として利用できる。同様に、***、受精、着床、またはこれらの過程に関与するホルモンの生合成に関係する蛋白質または酵素を阻害するオリゴヌクレオチドは、ヒト女性の避妊薬となりうる。高血圧症は、アンジオテンシン変換酵素またはレニン／アンジオテンシン系の関連酵素の合成を抑制するオリゴデオキシヌクレオチドによりコントロールすることができる。血小板凝集は、心筋および脳の循環疾患、梗塞、動脈硬化、塞栓症および血栓症で使用するトロンボキサンＡ２の合成に必要な酵素の合成を抑制することによってコントロールできる。脂肪アクリル補酵素Ａの合成を抑制すれば、動脈壁へのコレステロール沈着を阻止できる：すなわち動脈硬化症の場合にはコレステロール・アシル・トランスフェラーゼの合成を抑制する。低脂血症では、コリンホスホトランスフェラーゼの合成を阻害するのが有用である。ハイブリッド形成の阻止を利用して、疾患の有害作用を軽減したりなくしたりできる神経疾患は多数ある。たとえば、モノアミンオキシダーゼの合成抑制はパーキンソン病で利用でき、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの抑制はうつ病治療に利用できる。またインドール−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの抑制は、精神***病の治療に利用できる。プロスタグランディンやロイコトリエンをもたらすアラキドン酸カスケードの特定の酵素の抑制は、血小板凝集、アレルギー、炎症、疼痛、および喘息のコントロールに有用である。様々な抗癌剤に対する耐性発生の原因であり、また化学療法の大きな障害となっている多剤耐性（ｍｄｒ）遺伝子により発現する蛋白質を抑制することは、癌治療に利益をもたらす。これらのいずれかの遺伝子の核酸配列に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列は、本発明に基づくオリゴヌクレオチドの標的ハイブリッド形成領域として用いることができ、またその他、異常な遺伝子発現または遺伝子産物が生じると病的状態をもたらす細胞遺伝子または遺伝子転写物に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列も利用できる。植物細胞における遺伝子発現のアンチセンス調節については、米国特許第５，１０７，０６５号に記載されており、本文中でも参照している。さらに、本発明によれば、自己安定型のオリゴヌクレオチドは、たとえばエイズにおけるＡＺＴのように、他の治療薬と組み合わせて投与することもできる。本発明に基づく治療方法により、エイズ、ＡＲＣ、口腔ヘルペスや陰部ヘルペス、乳頭腫いぼ、インフルエンザ、***、黄熱病、水痘、帯状ヘルペス、ＨＴＬＶ白血病、および肝炎など様々なウイルス疾患を治療することができる。本発明に基づく治療法により治療可能な真菌症としては、カンジダ症、ヒストプラスマ症、クリプトコッカス症、ブラストミセス症、アスペルギルス症、スポロトリクス症、クロモミコーシス、皮膚糸状菌症（Dematophytosis）およびコクシジオイデス症がある。この治療法は、リケッチア感染症（たとえばチフス、ロッキー山紅斑熱）、またトラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）による性感染症または性病性リンパ肉芽腫（Lymphogranuloma venereum）の治療にも利用できる。本発明に基づく方法により、多様な寄生虫症、たとえばアメーバ症、シャーガス（Chegas）症、トキソプラスマ症、ニューモシスティス症、ジアルジア鞭毛虫症、クリプトスポリジオシス（Cryptosporidiosis）、トリコモナス症、およびニューモシスティス・カリニ肺炎も治療することができ、また回虫症、フィラリア症、旋毛虫症、住血吸虫症、線虫感染症や条虫感染症などの虫による疾患（嬬虫症）も治療できる。マラリアは、Ｐ．ファルシパルム（P．falci parum）、Ｐ．ビバックス（P．vivax）、Ｐ．オラレ（P．orale）、またはＰ．マラリア（P．malariae）のいずれが原因であれ、本発明に基づく治療法により治療できる。上に挙げた感染症は、その感染因子がわかっており、したがって必須遺伝子など当該感染因子の増殖のために必須の核酸配列に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列を有するような本発明に基づくオリゴヌクレオチドを生成できるので、本発明に基づく治療法によりすべて治療することができる。さらに、本発明に基づくオリゴヌクレオチドは、疾患治療のための他の化合物と同時投与することができる。本発明に基づくオリゴヌクレオチドと同時投与できる化合物の例としては、ＡＺＴ、ＤＤＩ、ＤＤＣ、およびメトトレキセートが挙げられる。本発明に基づくオリゴヌクレオチドは、アンチセンス・オリゴヌクレオチド療法における既知のオリゴヌクレオチドに比べて多くの点ですぐれている。まず第１に、アルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼに対して抵抗力があり、しかもこの抵抗力は、アルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートの連鎖の数、特にオリゴヌクレオチドの３’末端またはその近傍にある連鎖の数が増えるにしたがい強くなる。第２に、アルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートの連鎖の数が限られている場合であっても、きわめて強力なヌクレアーゼ抵抗性をもたらす。そのため、オリゴヌクレオチド内で他のタイプのヌクレオチド間連鎖を有するヌクレオチドを活用できるようになり、治療薬としてのオリゴヌクレオチドの利点がさらに増す。たとえば、４つ以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホジエステルが連鎖したヌクレオチドのグループを利用できれば、オリゴヌクレオチドは治療用のアンチセンス・オリゴヌクレオチドにとって重要な作用機序であるＲＮアーゼＨを活性化できる。さらに、オリゴヌクレオチド・ホスホジエステルを利用すると、アンチセンス・オリゴヌクレオチドと相補的な標的核酸との間により安定した二重らせんが形成されることになる。第３の利点は、本発明に基づくキメラ・オリゴヌクレオチドは、アグラワルとタングによりProc．Natl．Acad．Sci．USA 88巻7597-7599頁（1991 年）に記載されているようにマウス・モデルを使った場合に、オリゴヌクレオチド・ホスホジエステルまたはホスホロチオエートに比べて、インビボ（in vivo ）で核酸分解とクリアランスに対する抵抗性がかなり高いことである（データは示していない）。最後に、本発明に基づくオリゴヌクレオチドの合成は、従来のオリゴヌクレオチド合成法に２段階を追加挿入するだけなので、容易に合成できるという利点がある。以下に例を挙げるが、これは一定の好ましい実施例をさらに詳しく示したものにすぎず、これらに限定するというものではまったくない。実施例１ジヌクレオシド・メチルホスホノチオエートの調製メチルホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を合成するための条件を確立するために、当該連鎖を含有するジヌクレオチドを生成した。これは、チミジルでコントロールした細孔ガラス（Ｔ−ＣＰＧ）を使って８マイクロモルスケールで図１に示すようにして合成し、アグラワルとグッドチャイルドによりTet．Let t．28巻3539-3592頁（1987年）に記載されている標準的なアミダイト縮合サイクルを用いてＴ−メチルホスホンアミダイトと縮合させた。縮合後、アセトニトリル中の１％ボカージュ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−２−オン）を使って大気温で５分間、酸化的チオレーションを行い、ＣＰＧ−結合ジヌクレオシド・メチルホスホノチオエートを生成した。それからＣＰＧ−結合ジヌクレオシド・メチルホスホノチオエートを濃水酸化アンモニウム５ｍｌで室温で２時間処理し、ＣＰＧからジヌクレオシド・メチルホスホノチオエート（ジヌクレオシド５）を分離した。ジヌクレオシド・メチルホスホノチオエートＡＧ（８）およびＡＴ（９）も合成した。ジヌクレオチド８および９については、１：１エチレンジアミン−エタノールを使って室温で５時間脱保護を行った。脱保護されたジヌクレオシド５は、その後、真空中で蒸発させて溶媒を取り除いた後に、逆相ＨＰＬＣを使って分析した。その実施に当たっては、緩衝液Ａ（０．１ＭＮＨ₄ＯＡｃ）および緩衝液Ｂ（２０％緩衝液Ａ＋８０％ＣＨ₃ＣＮ）を、勾配：緩衝液Ｂ０％で２分間、その後Ａ＋Ｂ中に緩衝液Ｂ０〜６０％で３０分間として、ＲＣＭ１００カートリッジホルダー付きのＮｏｖａｐａｋ^TM Ｃ₁₈カートリッジで、室温、流速１．５ｍｌ／分で行った。ジヌクレオチドは、２６０ｎｍの検出波長で検出した。ジヌクレオチド５のＨＰＬＣプロフィール分析をしたところ、ＲＴ１９．９７分と２０．４６分の二峰性が見られ、図１の合成スキームに示すように、ジアステレオ異性体が形成されていることがわかった。その産物を標準のジヌクレオシド・メチルホスホネート（７）と比較したところ、これもやはり逆相ＨＰＬＣでＲＴ１５．３５分と１５．６２分の二峰性を示し、ジヌクレオチド７では疎水性が小さいところから保持時間が短かった。ジヌクレオチド８は、ＲＴ１７．２７分および１８．３６分の二峰性となった。ジヌクレオチド９は、ＲＴ２８．０８分でほとんど重なる二峰性であった。メチルホスホノチオエート連鎖の性質については、ＶａｒｉｏｎＧｅｍｉｎｉ２００^TMスペクトロメーターを使った³¹ＰＮＭＲ分析によってさらに確認した。ジヌクレオシド５は９５．９２ｐｐｍで、ジヌクレオシド７は３７．３ｐｐｍでピークを示した。この値は、メチルホスホノチオエート連鎖を含有する十分保護されたｄＴＴについて報告されている９７．９ｐｐｍという値によく一致する。（ローレンら、Nucleic Adids Res．16巻7633-7645頁（1988年）を参照）。実施例２様々な位置に単一のメチルホスホノチオエート連鎖を有するオリゴヌクレオチドの合成下記の５量体および６量体オリゴヌクレオチドを合成した。１．ｄＴＴＴＴＴＴ２．ｄＴＴＴＴＴ３．ｄＴＴＴＴＴ＊Ｔ４．ｄＴＴＴ＊ＴＴＴこれらのオリゴヌクレオチドそれぞれにおいて、アスタリスクはメチルホスホノチオエート連鎖の位置を示し、残りのヌクレオシド間連鎖はホスホジエステル連鎖である。オリゴヌクレオチド１および２は、１マイクロモルスケールにおけるヌクレオシド β−シアノエチルホスホルアミダイトおよび標準アミダイト縮合サイクルを用いて合成した。それぞれ縮合した後、ヨウ素を使って酸化を行った。オリゴヌクレオチド３は、実施例１に示すように最初にチミジン・メチルホスホンアミダイトを縮合させ、次いでボカージュ試薬を使って酸化し、それからさらにチミジン・β−シアノエチルホスホルアミダイトを使って縮合を後、ヨウ素酸化を行って合成した。オリゴヌクレオチド４は、チミジン・β−シアノエチルホスホルアミダイトを使って最初の２回の縮合を行い、それぞれの縮合後にヨウ素酸化し、その後チミジン・メチルホスホンアミダイトを使って３回目の縮合を行い、次いでボカージュ試薬を使って酸化してから、最後にチミジン・β−シアノエチルホスホルアミダイトで２回縮合させ、さらにヨウ素酸化を行って合成した。オリゴヌクレオチドそれぞれについて、１：１エチレンジアミン−エタノールを室温で５時間使用し、ＣＰＧ結合型オリゴヌクレオチドを構築後に脱保護した。オリゴヌクレオチドは、ＰａｒｔｉｓｉｌＳＡＸ（Ｚ−モジュール）で緩衝液Ａ（６０％ＨＣＯＮＨ₂中にＫＨ₂ＰＯ₄を１ｍＭ、ｐＨ６．３）および緩衝液Ｂ（６０％ＨＣＯＮＨ₂中にＫＨ₂ＰＯ₄を３００ｍＭ、ｐＨ６．３）を使って大気温でイオン交換ＨＰＬＣにより分析し、勾配はＡ０％で２分間、Ａ＋Ｂ中にＢ０〜２０％で２５分間とし、流速は３ｍｌ／分として行った。オリゴヌクレオチドは、検出波長２８０ｎｍで検出した。オリゴヌクレオチド１（負の電荷が５の６量体）のＲＴは１６．０８分であった。オリゴヌクレオチド２（負の電荷が４の５量体）のＲＴは１２．５３分であった。オリゴヌクレオチド３（負の電荷が４の６量体）のＲＴは１２．６９であった。オリゴヌクレオチド４（負の電荷が４の６量体）のＲＴは１３．２８分であった。これらの結果から、メチルホスホノチオエート連鎖はオリゴヌクレオチドの両端および中央に組み込むことができること、またそのような連鎖は標準的なアミダイト構築および脱保護条件下で安定していることがわかる。実施例３様々な位置にメチルホスホノチオエート連鎖を複数有するオリゴヌクレオチドの合成下記の２０量体オリゴヌクレオチドを合成した。５．ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧ６．ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴ＊Ｇ＊Ｇ７．ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｇ８．ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｇオリゴヌクレオチドそれぞれにおいて、アスタリスクはメチルホスホノチオエート連鎖の位置を示し、他の連鎖はすべてホスホジエステル連鎖である。オリゴヌクレオチド５は、米国特許第５，ＸＸＸ，ＸＸＸ号（出願番号０７／３３４，６７９、１９９２年３月１９日許可）に記載されている方法を使い、その後、濃アンモニア中でヨウ素酸化的脱保護を行い、標準的な逆相精製を行って合成した。オリゴヌクレオチド６は、次のようにして合成した。（ａ）ヌクレオシド・メチルホスホンアミダイトを使用して最初の２回の縮合をさせた。（ｂ）縮合したヌクレオチド・メチルホスホナイトを、実施例１に記載したようにボカージュ試薬で酸化した。（ｃ）残りの縮合は、上記のオリゴヌクレオチド５について記載したようにＨ−ホスホネートの化学作用を利用して行った。（ｄ）得られたオリゴヌクレオチドをヨウ素で酸化した。（ｅ）酸化されたオリゴヌクレオチドを０．５ｍｌの４５：４５：１０アセトニトリル：エタノール水：水酸化アンモニウムで、３０分間室温で脱保護した後、エチレンジアミン０．５ｍｌを加え、ときどき撹拌しながら６時間室温で放置した。（ｆ）混合液を濾過し、真空中で蒸発させて固形物を得た。（ｇ）その固形物を水に溶解し、ＳｅｐＰａｋＣ₁₈で脱塩した。オリゴヌクレオチド７および８の合成は、前者については実施例１の方法を最初の３回の縮合に、８については最初の４回の縮合に利用するという点を除いて同じように行った。オリゴヌクレオチドの純度は、ＰＡＧＥを使って確認した（データは示していない）。これらの結果から、複数のメチルホスホノチオエート連鎖をオリゴヌクレオチドの様々な位置に導入できること、またこのような連鎖は標準的なＨ−ホスホネート構築条件下で安定していることがわかる。実施例４メチルホスホノチオエートおよびホスホロチオエートの両方の連鎖を有するキメラ・オリゴヌクレオチドの合成下記の２０量体オリゴヌクレオチドを合成した。９．ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧ１０．ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴ＊Ｇ＊Ｇ１１．ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｇ１２．ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｇオリゴヌクレオチドそれぞれにおいて、アスタリスクはメチルホスホノチオエート連鎖の位置を示し、残りの連鎖はホスホロチオエート連鎖である。オリゴヌクレオチド９〜１２は、ヨウ素酸化によりホスホロチオエート連鎖を得るかわりに標準的なＳ₈酸化を用いて酸化を行った点を除いてはオリゴヌクレオチド５〜８と同じ方法で合成した。（たとえば、アグラワルら、Proc．Natl． Acad．Sci．USA 85巻7079-7083頁（1988年）を参照）。キメラ・オリゴヌクレオチドの純度は、ＰＡＧＥを使って確認した（データは示していない）。これらの結果から、メチルホスホノチオエート連鎖は、他の人工的なヌクレオチド間連鎖、この場合であればホスホロチオエート連鎖を有するオリゴヌクレオチドの様々な位置に導入できることがわかる。実施例５両端に複数のメチルホスホノチオエート連鎖を有するオリゴヌクレオチドの合成下記の２５量体オリゴヌクレオチドを合成した。１３．Ｃ＊Ｔ＊Ｃ＊ＴＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｔアスタリスクはメチルホスホノチオエート連鎖の位置を示し、残りの連鎖はホスホロチオエート連鎖である。オリゴヌクレオチド１３は、最初の３回の縮合については実施例１に記載した方法を使い、それに続く１８回の縮合では標準的なアミダイト化学作用を用いた後、ボカージュ試薬を使って酸化し、最後に実施例１の方法を使って３回縮合させた。ＤＭＴｒ−オリゴヌクレオチドについて、実施例３のオリゴヌクレオチド６について記載されている方法で脱保護を行った。脱保護の後、ＤＭＴｒ−オリゴヌクレオチド１３を、Ｃ₁₈低圧液体クロマトグラフィー（ＬＰＬＣ）を使って精製した。オリゴヌクレオチドの純度はＰＡＧＥを使って確認した（データは示していない）。これらの結果から、メチルホスホノチオエート連鎖を生成するのに使用する結合段階および酸化段階を、他の連鎖、この場合にはホスホジエステル連鎖を生成するのに使用する結合段階で置き換えることにより、オリゴヌクレオチドのどの位置にでもメチルホスホノチオエート連鎖を選択的に導入できることがわかる。実施例６核酸分解に対するメチルホスホノチオエート連鎖を有するオリゴヌクレオチドの抵抗性実施例３に記載したオリゴヌクレオチド５〜８の、３’エキソヌクレアーゼ分解に対する相対的な抵抗力を調べた。各オリゴヌクレオチドの０．４Ａ₂₆₀単位を凍結乾燥し、緩衝液（トリス１０ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ １０ｍＭ、ｐＨ８．５）０．５ｍｌに溶解し、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ５μｌ（１．５ミリ単位）と混ぜた。この混合液を温度調節したセル中で３７℃でインキュベートし、経時的なＡ₂₆₀をプロットした。オリゴヌクレオチド分解の指標としては濃色性増大度を用いた。結果を下の表１に示す。これらの結果から、３’末端近傍にメチルホスホノチオエート連鎖を有するオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド６〜８）は、このような連鎖を持たないオリゴヌクレオチドに比べてはるかに安定していることがわかる。さらに、メチルホスホノチオエート連鎖の数が増えるほどオリゴヌクレオチドの安定性は増した（４連鎖＞＞３連鎖＞２連鎖）。実施例７メチルホスホノチオエート連鎖を有するオリゴヌクレオチドの二重らせん安定性メチルホスホノチオエート連鎖を有するオリゴヌクレオチドと相補的なオリゴデオキシヌクレオチドとの間の二重らせんの安定性を、次の方法で試験した。オリゴヌクレオチド９、１０、１１および１２（０．２Ａ₂₆₀単位）を、同量の相補的オリゴデオキシヌクレオチド・ホスホジエステルと緩衝液（Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ １０ｍＭを含有するＮａＣｌ１００ｍＭ、ｐＨ７．４）１ｍｌ中で混合した。混合液を７０℃まで加熱した後、毎分２℃ずつ温度を下げて２０℃まで冷却し、その間、温度に対する関数としてＡ₂₆₀における濃色性を記録した。結果を図５に示す。濃色性の変化は全般に約２２％であった。メチルホスホノチオエート連鎖の数が多いオリゴヌクレオチドほど、各連鎖についてＴｍが約１〜２℃低下した。実施例８メチルホスホノチオエート含有オリゴヌクレオチドの抗ＨＩＶ作用組織培養におけるＨＩＶ−１阻害能を、３’末端にメチルホスホノチオエート連鎖を有するオリゴヌクレオチド・ホスホロチオエート（キメラ・オリゴヌクレオチド）、ならびにそのようなメチルホスホノチオエート連鎖がないオリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートについて調べた。この試験には、オリゴヌクレオチド９、１０および１１を用いた。この３種類のオリゴヌクレオチドのいずれも、ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子と相同のヌクレオチド配列を有している。Ｈ９リンパ球を、ＨＩＶ−１ビリオン（０．０１〜０．１ＴＣＩＤ₅₀／細胞）に３７℃で１時間感染させた。１時間後に、吸着されていないビリオンを洗い流し、感染した細胞を２４ウエルプレートのウエルに分けた。感染細胞に、（ストック液からの）適当な濃度のオリゴヌクレオチドを加えて、必要な濃度の２ｍｌの培養液を得た。それから細胞を３日間培養した。３日目の終わりに、感染細胞を肉眼で検査して、シンシチウム形成または細胞変性作用の徴候であるトリパン・ブルー染色が生じていないか調べた。その結果を下の表２に示す。これらの結果から、いずれのメチルホスホノチオエート含有オリゴヌクレオチドでも、シンシチウム形成減少や細胞変性作用軽減の効力がいくらか増していることがわかる。いずれのオリゴヌクレオチドも、インビトロ（in vitro）での有効用量がオリゴヌクレオチド９（オリゴヌクレオチドホスホロチオエート）と類似していた。オリゴヌクレオチド１０および１１は動物で安定しているのに対してオリゴヌクレオチド９は安定していないこと（データは示していない）を考えると、これらの結果から、メチルホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を有するキメラ・オリゴヌクレオチドのインビボ（in vivo）における効力は、オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートよりも大きいということが示唆される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ // Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者アグラワル、スディールアメリカ合衆国 01545 マサチューセッツ州シュルーズベリーランプライタードライブ 61

Claims

【特許請求の範囲】１．オリゴヌクレオチドにアルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間連鎖を組み込む方法であって、（ａ）アルキル亜リン酸連鎖またはアリール亜リン酸連鎖により２つのヌクレオシドを縮合させ；（ｂ）アルキル亜リン酸連鎖またはアリール亜リン酸連鎖の酸化的チオレーションによりアルキルホスホノチオエート連鎖を作り出す；段階から成る方法。２．３’末端に１ないし複数のアルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖を有するオリゴヌクレオチドを生成する方法であって、（ａ）アルキル亜リン酸連鎖またはアリール亜リン酸連鎖により２つのヌクレオシドを縮合し；（ｂ）アルキル亜リン酸連鎖またはアリール亜リン酸連鎖を酸化的チオレーションしてアルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖を生成し；（ｃ）アルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖を追加する場合には、追加それぞれについて段階（ａ）および（ｂ）を反復し；そして（ｄ）さらに縮合の段階を追加して、希望する数だけのヌクレオチドを次々と追加する；段階から成る方法。３．５’末端に１ないし複数のアルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖を有するオリゴヌクレオチドを生成する方法であって、（ａ）希望する数だけのヌクレオチドを次々と結合し；（ｂ）アルキル亜リン酸連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖により縮合した２つのヌクレオチドを次々と追加し；（ｃ）アルキル亜リン酸連鎖またはアリール亜リン酸連鎖を酸化的チオレーションしてアルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖を生成し；そして（ｄ）アルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖を追加する場合には、追加それぞれについて段階（ｂ）および（ｃ）を反復する；段階から成る方法。４．５’末端および３’末端に１ないし複数のアルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖を有するオリゴヌクレオチドを生成する方法であって、（ａ）アルキル亜リン酸連鎖またはアリール亜リン酸連鎖により２つのヌクレオシドを縮合し；（ｂ）アルキル亜リン酸連鎖またはアリール亜リン酸連鎖を酸化的チオレーションしてアルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖を生成し；（ｃ）アルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖を追加する場合には、追加それぞれについて段階（ａ）および（ｂ）を反復し；（ｄ）さらに縮合の段階を追加して、希望する数だけのヌクレオチドを次々と追加し；（ｅ）アルキル亜リン酸連鎖またはアリール亜リン酸連鎖により縮合した２つのヌクレオチドを次々と追加し；（ｆ）アルキル亜リン酸連鎖またはアリール亜リン酸連鎖を酸化的チオレーションしてアルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖を生成し；そして（ｇ）アルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖を追加する場合には、追加それぞれについて段階（ｅ）および（ｆ）を反復する；段階から成る方法。５．約８から約５０のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドであって、アルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖によって２以上のヌクレオチドが結合されているオリゴヌクレオチド。６．アルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖により縮合されているヌクレオチドが最も３’末端に近いオリゴヌクレオチドからなる請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。７．アルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖により結合されているヌクレオチドが最も５’末端に近いオリゴヌクレオチドからなる請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。８．アルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖により結合されているヌクレオチドが最も３’末端に近いオリゴヌクレオチドと５’末端に近いオリゴヌクレオチドからなる請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。９．アルキルホスホノチオエート連鎖またはアリールホスホノチオエート連鎖のアルキル基が、１〜５の炭素原子を有する置換されていないアルキル基、ならびに１〜５の炭素原子を有し、かつハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシロキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルバルコキシル基またはアミノ基およびその組合せで置換されたアルキル基から成るグループから選択されるアルキル基である請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。１０．アリールホスホノチオエートのアリール基が、置換されていないアリール基、またはハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシロキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルバルコキシル基またはアミノ基、およびその組合せで置換されたアリール基から成るグループから選択されたアリール基である請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。１１．さらに、１ないし複数のリボースまたはデオキシリボースのアルキルホスホネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、ケトン、スルホン、カーボネート、チオアミデートを含む請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。１２．ウイルス、病原菌、または異常な遺伝子発現または遺伝子産物が生じると病的状態をもたらす細胞遺伝子または遺伝子転写物の核酸配列に対して相補的な核酸配列を有している請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。１３．３’末端に最も近い２つのヌクレオチド間連鎖がアルキルホスホノチオエート連鎖であり、他のヌクレオチド間連鎖がすべてホスホロチオエート連鎖であり、５’−ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧ−３’の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド。１４．３’末端に最も近い３つのヌクレオチド間連鎖がアルキルホスホノチオエート連鎖であり、他のヌクレオチド間連鎖がすべてホスホロチオエート連鎖であり、５’−ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧ−３’の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド。１５．ウイルス、病原菌、または異常な遺伝子発現または遺伝子産物が生じると病的状態をもたらす細胞遺伝子を阻害する方法であって、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチドを投与する段階を含んでいる方法。１６．ウイルスまたは病原菌に感染しているか、もしくは細胞遺伝子の発現または産物の結果としての疾患を有する動物またはヒトの治療方法であって、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチドを動物またはヒトに投与する段階を含んでいる治療方法。