JPH08502062A

JPH08502062A - ワクチンおよび抗原結合体

Info

Publication number: JPH08502062A
Application number: JP6508977A
Authority: JP
Inventors: スティーヴンス，ヴァーノン・シー
Original assignee: ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデーション
Priority date: 1992-09-30
Filing date: 1992-09-30
Publication date: 1996-03-05
Also published as: DE69233711D1; WO1994007530A1; CA2145391A1; AU2806392A; ATE373486T1; EP1129724B1; EP1129724A3; EP0662839A1; EP0662839A4; AU679902B2; EP1129724A2

Abstract

(57)【要約】受精のコントロールおよび癌治療に有用なワクチンは、化学的に修飾したジフテリアトキソイドと結合したタンパク質生殖性ホルモン、このようなホルモンのフラグメントまたはこのようなホルモンまたはフラグメントと実質的に免疫学的等価のペプチドの抗原結合体、および助剤とを含み、両方とも水性媒体中で分散されるかまたは油混合物で乳化される。この、または類似ワクチンに使用することができる抗原結合体は、結合体で処理されるべき動物に外来のタンパク質の少なくとも一つのT-細胞リンパ球エピトープの配列を有するエピトープペプチドまたはこのようなエピトープと実質的に免疫学的等価の配列と結合した、タンパク質生殖性ホルモン、このようなホルモンのフラグメントまたはこのようなホルモンまたはフラグメントと実質的に免疫学的等価のペプチドを含む。

Description

【発明の詳細な説明】ワクチンおよび抗原結合体本発明は、タンパク質生殖ホルモンの抗原結合体を含むワクチンおよびエピトープペプチドを含むタンパク質生殖ホルモンの抗原結合体に関する。本発明者の米国特許第４，２０１，７７０号明細書；同第４，３０２，３８６号明細書；同第４，３８４，９９５号明細書；同第４，５２６，７１６号明細書；同第４，６９１，００６号明細書；同第４，７１３，３６６号明細書；同第４，８５５，２８５号明細書；および同第５，００６，３３４号明細書において；１９８９年８月７日および１９８９年２月１７日にそれぞれ出願の同時係属出願第０７／３９０，５３０号明細書および同第０７／３１１，３３１号明細書において；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８３／００７７７号明細書において；並びにその多数の対応する他の諸国の特許および出願において、雌性タンパク質生殖ホルモン、このようなホルモンのフラグメントまたはこのようなホルモン若しくはフラグメントとほぼ免疫学的に同等のペプチドを、ヒトまたは他の哺乳動物の体内に投与された後に抗体反応を引き出すのに十分な大きさの非内因性物質に対して結合することによって得られる抗原性ポリペプチドが記載され且つ請求の範囲に記載されている。ヒトまたは他の哺乳動物に対して投与された場合、これらの抗原性ポリペプチドは、それらが誘導される雌性タンパク質生殖ホルモンに対して抗体を発生させるので、抗原性ポリペプチドはヒトまたは他の哺乳動物の生物学的活性を制御するのに有用である。制御される生物学的活性は、特に、受精または悪性腫瘍の発生でありうる。このような抗原性ポリペプチドの好ましい態様において、担体はジフテリアトキソイドである。前述の特許および出願は、その内容が本明細書中に参考として包含されていて、更に、抗原性ポリペプチドをアジュバントおよび油と一緒に含むワクチンであって、該抗原性ポリペプチドおよび該アジュバントが水性媒質中に分散されて水性相を生成し、そしてこの水性相が油と乳化している上記ワクチンを開示している。本発明は、前述の特許および出願に記載されたワクチンの改良された形を提供する。本発明は、更に、前述の特許および出願に記載された結合体と概して同様であるが、異なった種類の非内因性物質を用いるタンパク質生殖ホルモンの抗原結合体を提供する。一つの態様において、本発明は、タンパク質生殖ホルモン、このようなホルモンのフラグメントまたはこのようなホルモン若しくはフラグメントとほぼ免疫学的に同等のペプチドの抗原結合体；アジュバント；および少なくとも１種類の油を含むワクチンであって、該結合体およびアジュバントが水性媒質中に分散されて水性相を生成し、この水性相が１種類またはそれ以上の油と乳化している上記ワクチンを提供する。このワクチンは、抗原結合体が、化学的に修飾されたジフテリアトキソイドと結合したホルモン、フラグメントまたはペプチドを含み、そして水性相が油または油混合物によって乳化していることを特徴とする。本発明は、更に、タンパク質すなわち生殖ホルモンに対する抗体を生じさせるためのおよび／またはこのような抗体を発現することができるリンパ腫細胞を生じさせるための方法であって、哺乳動物に対して本発明のワクチンを投与し且つ抗体および／またはリンパ腫細胞を該哺乳動物から回収することによる上記方法を提供する。本発明は、タンパク質すなわち生殖ホルモンに対する抗体、このような抗体を発現することができるリンパ腫細胞およびこの方法によって生じたリンパ腫細胞に由来するハイブリドーマ細胞に関する。本発明は、更に、悪性疾患に苦しむヒトを治療するためのこのようなワクチンの使用を提供する。もう一つの態様において、本発明は、タンパク質生殖ホルモン、このようなホルモンのフラグメントまたはこのようなホルモン若しくはフラグメントとほぼ免疫学的に同等のペプチドの抗原結合体を提供し、この結合体は、ホルモン、フラグメントまたはペプチドが、該結合体によって治療される動物にとって異種のタンパク質の少なくとも１種類のＴ細胞リンパ球エピトープの配列またはそれとほぼ免疫学的に同等の配列を有するエピトープペプチドに対して結合していることを特徴とする。本発明は、ヒトにおいて受精を制御するまたは悪性疾患を治療するためのこのような抗原結合体の使用を提供する。本発明は、更に、タンパク質生殖ホルモンに対する抗体またはこのような抗体を発現することができるリンパ腫細胞を製造するための方法であって、哺乳動物中に修飾ポリペプチドを導入し、それによって哺乳動物において抗体の生成を引き起こし、そして抗体またはリンパ腫細胞を該哺乳動物から回収することを含む上記方法を提供する。この方法は、用いられた修飾ポリペプチドが本発明の抗原結合体であることを特徴とする。本発明は、タンパク質すなわち生殖ホルモンに対する抗体、このような抗体を発現することができるリンパ腫細胞およびこの方法によって生じたリンパ腫細胞に由来するハイブリドーマ細胞に関する。本発明は、哺乳動物におけるタンパク質の存在若しくは不存在を決定する、または哺乳動物におけるタンパク質の量を検定する方法であって、哺乳動物からの体組織または体液を、該タンパク質と反応することができる抗体と接触するようにし、そして抗体およびタンパク質間の複合体の生成または非生成を観察することを含む上記方法を提供する。この方法は、用いた抗体が、前の段落に定義された方法によって製造されることを特徴とする。最後に、本発明は、哺乳動物における疾患を治療するための、前記に定義された方法によって製造された抗体の使用に関する。図１は、本発明の結合体を製造するのに用いられた三つの結合剤の式を示し；そして図２は、本発明の結合体を製造するのに用いられた典型的な反応を、このような結合反応によって生じた修飾ポリペプチドの例と一緒に示す。既述したように、本発明は、化学的に修飾されたジフテリアトキソイドと結合したタンパク質生殖ホルモンの抗原結合体を含むワクチンを提供する。ワクチンは、更に、アジュバントおよび油混合物を含む。ワクチンを生成するために、結合体およびアジュバントを水性媒質、好ましくはリン酸緩衝食塩水中に分散させて水性相を生成し、そしてこの水性相を油混合物によって乳化させる。前述の特許および出願に記載された本発明者の初期のワクチンと比較して、本発明のワクチンは、注射部位に免疫細胞を引付け、そして治療されるヒトまたは他の哺乳動物から望ましい抗体反応を生じさせる改良された能力を示す。本発明のワクチンの好ましい実施態様は、更に、抗原結合体を注射部位から徐々に放出し、したがって望ましい長期間の抗原反応を展開させる濃厚エマルジョンを生成する。本発明のワクチンにおいて用いるのに適当なジフテリアトキソイドは、例えば、コンノート・ラボラリトーズ（ＣｏｎｎａｕｇｈｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、スウィフトウォーター、マサチューセッツから商業的に入手可能であり；このようなジフテリアトキソイドは、以下に記載のようにエチレンジアミンと反応することができる。ワクチン中の結合体に対する生殖ホルモン、フラグメントまたはペプチドの比率は、広範囲に変化することができが、望ましくは、抗原結合体は、化学的に修飾されたジフテリアトキソイド１０⁵ダルトン当り２０〜３０ペプチドを含む。本発明のワクチンにおいて用いるのに好ましいアジュバントは、Ｎ−アセチル −Ｄ−グルコサミン−３−イルーアセチル−Ｌ−アラ−Ｄ−イソグルタミン（ノルムラミルジペプチド）であるが、好ましい油混合物は、モノオレイン酸マンニドおよび溶解したまたは懸濁したモノステアリン酸アルミニウムの一方または両方を含んでいるのが望ましいスクアレンおよびスクアランを含む。好ましくは、このような混合物は、スクアレン３５〜４５重量％、スクアラン３５〜４５重量％、モノオレイン酸マンニド６〜１６重量％およびモノステアリン酸アルミニウム１〜５重量％を含み、具体的な好ましい配合は、スクアレン４４％、スクアラン４１％、モノオレイン酸マンニド１１％および溶解したまたは懸濁したモノステアリン酸アルミニウム４％である。ワクチンの各種成分の比率は広範囲に変化しうるが、最終エマルジョン１ｍｌ当り抗原結合体約０．５〜約２．０ｍｇおよびアジュバント約０．２〜約１．０ｍｇが存在するのが望ましい。便宜上、ワクチンは、ほぼ等容量の水性相および油混合物を含む。本発明のワクチンは、受精制御を含む前述の特許および出願に記載されたいずれの目的にも用いることができる。しかしながら、本発明のワクチンは、悪性疾患、例えば、乳癌、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫または膀胱癌に苦しむヒト（または他の動物）の治療に特に有用である。本発明のワクチンは、注射部位に免疫細胞を誘引する場合に有効であることが分かったが、濃厚エマルジョンであるワクチンの物理的性質は、更に、結合体の徐放を確実にするのに役立つ。更に既述されたように、本発明は、少なくとも１種類の異種Ｔ細胞リンパ球エピトープの配列またはそれとほぼ免疫学的に同等の配列を有するエピトープペプチドに対して典型的にＮ末端かまたはＣ末端で結合したタンパク質生殖ホルモン、このようなホルモンのフラグメントまたはこのようなホルモン若しくはフラグメントとほぼ免疫学的に同等のペプチドの抗原結合体を提供する。Ｔ細胞エピトープを用いて生成された結合体は、前述の特許および出願に記載されたジフテリアトキソイドなどの複合担体で生成された結合体よりも安価に製造される傾向がある。更に、Ｔ細胞エピトープは、ジフテリアトキソイドおよび同様の複合担体よりもはるかに構造が単純であるので、Ｔ細胞エピトープ結合体は過敏感反応を引き起こすとはあまり考えられない。最近まで、結合体におけるＴ細胞エピトープの使用は、異種分子上の異なるＴ細胞エピトープに応答したヒトまたは他の動物の異種交配集団における遺伝的変化のために逆に示されていて、単一のＴ細胞エピトープのみが与えられた場合（普通に抗原結合体を用いた場合）、治療された動物全部が陽性反応を示したわけではなく、したがってＴ細胞エピトープ結合体を信頼できないものにしていた。しかしながら、最近、異種分子からのある種のＴ細胞エピトープはこのような遺伝的制限によって制限されないことが示されており、これらのＴ細胞エピトープの使用は、ヒトおよび他の動物の遺伝学的に異なる集団において信頼しうる抗体反応を生じる結合体およびワクチンの製造を可能にする。例えば、ホー（Ｈｏ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，４７７〜４８３（１９９０）およびパーチドス（Ｐａｒｔｉｄｏｓ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１，２０９９〜２１０５（１９９０）を参照されたい。本発明の結合体において用いるのに好ましいエピトープペプチドは、ａ．破傷風トキソイドのアミノ酸５８０〜５９９： Asn-Ser-Val-Asp-Asp-Ala-Leu-Ile-Asn-Ser-Thr-Lys-Ile-Try-Ser-Tyr-Ph e-Pro-Ser-Val ｂ．破傷風トキソイドのアミノ酸８３０〜８４４： Gln-Try-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-Leu ｃ．破傷風トキソイドのアミノ酸９１６〜９３２： Pro-Gly-Ile-Asn-Gly-Lys-Ala-Ile-His-Leu-Val-Asn-Asn-Gln-Ser-Ser-Gl u ｄ．破傷風トキソイドのアミノ酸９４７〜９６７： Phe-Asn-Asn-Phe-Thr-Val-Ser-Phe-Trp-Leu-Arg-Val-Pro-Lys-Val-Ser-Al a-Ser-His-Leu-Glu ｅ．麻疹ウイルスタンパク質のアミノ酸２８８〜３０２： Leu-Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val ｆ．Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のアミノ酸１６〜３３： Gln-Ala-Gly-Phe-Phe-Leu-Leu-Thr-Arg-Ile-Leu-Thr-Ile-Pro-Gln-Ser-Le u-Asp またはｇ．マラリアＣＳＰタンパク質のアミノ酸３１７〜３３６： Thr-Cys-Gly-Val-Gly-Val-Arg-Val-Arg-Ser-Arg-Val-Asn-Ala-Ala-Asn-Ly s-Lys-Pro-Glu に対応するかまたはほぼ免疫学的に同等の配列を有するものである。以下に更に詳細に論及されるように、エピトープペプチドは、結合体を生成するのに用いたホルモン、フラグメントまたはペプチドに対して直接的に結合していてよいし、または結合はスペーサーペプチドによって行なわれてよく、このスペーサーペプチドは約２個〜約８個のアミノ酸残基を含むのが好ましい。本発明のワクチンと同様に、本発明のＴ細胞エピトープ結合体は、受精制御を含む前述の特許および出願に記載された目的、または悪性疾患、例えば、乳癌、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫若しくは膀胱癌に苦しむヒト（または他の動物）の治療のいずれにも用いることができる。若干の場合、この目的のための２種類またはそれ以上のＴ細胞エピトープ結合体の混合物を用いて、改良された抗体生産を確実にすることは好都合でありうる。本発明のワクチンおよび抗原結合体についての多数の好ましい特徴は、概して、前述の特許および出願に記載されたものと同様である。したがって、これらの好ましい特徴を以下に論及するが、読者は更に別の情報についてこれらの特許および出願を参照されたい。タンパク質生殖ホルモン、このようなホルモンのフラグメントまたはこのようなホルモン若しくはフラグメントとほぼ免疫学的に同等のペプチドは、天然または合成の起源によることができる。合成ホルモン分子は、本発明の目的に相当する、天然に存在するものと同様の機能を果たす。これに関連して、本発明に関するある種の天然物質にはその若干の部位に結合した炭水化物残基があるが、対応する合成ポリペプチドにはないことが注目される。それにもかかわらず、本明細書および請求の範囲の目的のために、合成および天然ポリペプチドを同等物として扱い、そして両方を本発明に包含するものとする。したがって、「ホルモン」または「ホルモン分子」という用語を本明細書中で用いる場合、論及の意味を変更することなく、「合成」という用語を「ホルモン」の前に付け加えることができる。同様に、「合成」を「ホルモン」の前に挿入してもしなくても、論及する意味を変更することなく、「フラグメント」という用語を「ホルモン」または「分子」の後に挿入することができる。「内因性」という用語は、本明細書中において、適切なタンパク質、フラグメントまたは抗原が、治療されている特定の個々の動物にとって内因性であるかどうかにかかわりなく、治療される種に固有のタンパク質を意味するのに用いられる。したがって、例えば、本出願の目的のために、ブタ***抗原は、たとえこのような***抗原が雌ブタ体内に通常存在しないことは明らかであるとしても、雌ブタにとって内因性であるとみなされる。同様に、動物の胚、胎児または胎盤の抗原は、たとえこのような抗原が誕生後の動物体内に存在しないかもしれないとしても、同種の成体動物にとって内因性であるとみなされる。突然変異種または他の遺伝偏向によって形質転換された動物の正常細胞から生産された更に別の抗原は、これらの細胞が形質転換または偏向の際に存在する種にとって内因性と考えるべきである。本発明の抗原結合体は、内因性タンパク質生殖ホルモン、そのフラグメントまたはそれと同等のペプチドに由来し、適当な哺乳動物の体内に投与された場合、修飾ペプチドが由来する内因性タンパク質に対する抗体およびこのような抗体を発現することができるリンパ腫細胞の生成を引き起こす。したがって、このような結合体は、それらを投与される哺乳動物において、該哺乳動物の内因性タンパク質に対する抗体を生じさせることによって生物学的活性に影響を与えるように用いることができるのみならず、本発明の結合体は、哺乳動物の体内に結合体を導入することによって哺乳動物において「内因性タンパク質」に対する抗体の生成を引き起こすために、抗血清および／またはリンパ腫細胞を生じさせるようにも用いることができる。このような方法においては、結合体を、それが由来する動物と同一個体の哺乳動物中または同一種の哺乳動物中にさえも導入する必要がないので、または合成フラグメントを基剤とする結合体の場合、この方法で用いられるそれが模擬している哺乳動物タンパク質であるいわゆる「内因性タンパク質」は、抗体を生じさせる哺乳動物にとって内因性である必要はないということに注目されたい。哺乳動物において抗体および／またはリンパ腫細胞を生じさせた後、免疫学当業者が熟知している従来の技術を用いて若干の抗体および／または細胞を哺乳動物から回収することができる。単クローン性抗体を生じさせる技術も、望ましい抗体を生じさせるのに用いることができる。例えば、前記のように生じたリンパ腫細胞は、ハイブリドーマ技術の業者に知られている従来の技術によって適切な抗体を発現することができるハイブリドーマ細胞を生成するのに用いることができる。次に、このように生成された抗体は、様々な目的に用いることができる。例えば、このような抗体は、少なくとも若干の回収された抗体を、哺乳動物からの体組織または体液と接触するようにし、そして回収された抗体と、検定される体組織または体液中の内因性タンパク質の存在または不存在を示す内因性タンパク質との間の反応過程の生成または非生成を観察することによって哺乳動物中の内因性タンパク質の量を検定するのに用いることができる。この方法において検定される内因性タンパク質が妊娠に関係したものである場合、この検定法は妊娠検査として機能しうる。もう一方において、検定された内因性タンパク質の存在または不存在下が、体組織または体液が由来する哺乳動物における低減した受精率または不妊に関係している場合、検定はこのような哺乳動物の低減した受精率または不妊についての検査として機能しうる。修飾のためのホルモン、フラグメントまたはペプチドの選択本発明にしたがって修飾することができる天然タンパク質生殖ホルモンの例としては、ろ胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）、レラキシン、絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、例えば、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、胎盤性ラクトゲン、例えば、ヒト胎盤性ラクトゲン（ＨＰＬ）およびプロラクチン、例えば、ヒトプロラクチンがある。本発明の技術によって修飾するための適当なポリペプチドの選択を考える場合に常に心に留めておくべきいくつかの問題がある。第一に、ホルモン若しくはホルモンの組合せまたは他のタンパク質が、処置することが望まれる症状または問題の原因となっていることを確認することは当然ながら必要である。しかしながら、多くの場合、これは本発明の技術によって修飾しうる多数の可能なタンパク質についての問題をなお残している。例えば、本発明を用いて雌の哺乳動物を不妊性にさせる結合体を与えることが望まれる場合、雌の哺乳動物生殖システムに関係していることが知られているＦＳＨ、ＬＨ、ＬＨ−ＲＨ、ＣＧ、ＰＬ、レラキシンまたは他のタンパク質ホルモンを修飾することによってその問題に取りかかることができる。本発明による修飾のためにポリペプチドを選択する場合に常に心に留めておくべき一つの重要な問題は、交差反応性の問題である。免疫学当業者に周知のように、一つのタンパク質（「標的」タンパク質）と反応するための抗体が、他の非標的タンパク質とかなりの程度まで反応することを見出すのは珍しいことではない。これは、一つの特定の天然のホルモンに対する抗体の生成を引き起こすための結合体の投与が、引き起こされるのが望ましくない１種類またはそれ以上の他のホルモンに対する抗体の生成を引き起こすことがあるので、それは重大な問題である。若干の場合、非標的タンパク質との反応は、不可欠な生体機能を損傷させることがある。したがって、可能な限り、本発明による修飾のために選択されたホルモン、フラグメントまたはペプチドは、治療される哺乳動物体内において結合体が標的タンパク質に対して極めて特異的な抗体の生成を引き起こすように選択されるべきである。若干の場合において、特に標的タンパク質が比較的小さい場合（例えば、ＬＨ−ＲＨ）、標的タンパク質全体よりも小さいフラグメントは、たとえ本発明の技術によって修飾された場合でも、標的タンパク質に対する十分な抗体を引き出すことができないので、標的タンパク質全体を修飾することが実際に不可欠でありうる。しかしながら、概して、特にＨＣＧなどの比較的複雑な標的タンパク質を扱う場合、標的タンパク質そのままよりもむしろ標的タンパク質のフラグメントを用いることが、本発明の結合体を生成する場合の使用に勧められる。それは免疫学当業者によって十分に認識されている（例えば、Ｗ．Ｒ．ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、「免疫学的受精調節（ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＦｅｒｔｉｌｉｔｙＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」、ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ヴィクトリア、オーストラリア（１９８２），１１頁以下を参照されたい）、ワクチン、特に避妊用ワクチンの最大の潜在的危険の一つは、本質的に、交差反応性抗原を有する組織中の免疫病理学的障害および／またはその組織機能の欠損を引き起こしうる人工的に誘導された自己免疫疾患を生じる非標的抗原との交差反応性である。この論文の開示は全て本明細書中に参考として包含される。このような交差反応性についての２種類の可能な機序は、（ａ）共有された抗原決定基の存在；複雑な標的タンパク質は、非標的タンパク質中に存在するものと同一の成分（アミノ酸配列）を含むことがある；および（ｂ）標的と非標的タンパク質との間の同一ではないが構造的に関係がある部分の立体的重複である。明らかに、交差反応性のこれら両方の態様によってもたらされる脅威は、本発明の結合体においてタンパク質そのままよりもむしろ複合タンパク質のフラグメントを用いることによって減少させることができる。フラグメントは、それが由来するタンパク質よりも簡単な構造を有するので、非標的タンパク質との共有される抗原決定基または立体的重複の可能性は少ない。特に、交差反応は、非標的であるが交差反応性であるタンパク質とは配列が異なる標的タンパク質の一部分に由来するフラグメントを用いることによって避けることができる。一つの具体的な例を取ると、ＨＣＧに対する抗体を引き出す場合の主要な問題の一つは、ＨＣＧ抗体とＬＨとの交差反応性であり、この交差反応性は、少なくとも主としてＬＨと、ＨＣＧのβサブユニットの１〜１１０アミノ酸配列との間のアミノ酸配列の実際の同一性のためである。したがって、本発明のＨＣＧ由来結合体を生成することが望まれる場合、用いられるフラグメントは、好ましくは、ＨＣＧのβ サブユニットの１１１〜１４５（または以下に論及される理由により１０９〜１４５）配列の一部分または全部と同様の分子構造を有するものであり、それは、ＬＨの対応する配列と有意に異なるのが、β−ＨＣＧのこの１１１〜１４５配列だけであるという理由による。しかしながら、以下に更に詳細に論及されるように、βサブユニットの３８〜５７領域またはヒト絨毛性性腺刺激ホルモンに似ているアミノ酸配列を有する哺乳動物黄体形成ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモンまたはろ胞分泌ホルモンのフラグメントも本発明において有用である。したがって、大部分の場合、本発明の技法によって修飾されるポリペプチドは、好ましくは、標的タンパク質そのままではなく標的タンパク質のフラグメントである。更に正確には、本発明の技法によって修飾されるポリペプチドのフラグメントとして、標的タンパク質のフラグメントと「同様の」分子構造を有するフラグメントを用いるべきである。フラグメントの分子構造が標的タンパク質のフラグメントと「同様である」という場合、フラグメントの全アミノ酸配列が標的タンパク質の配列の一部分に対して正確に対応するということを必ずしも示す必要はない。例えば、若干の場合、アミノ酸のある種の置換は、フラグメントの免疫学的特性に影響を与えることなく可能でありうる。概念的にはＨＣＧのβサブユニットに由来するが、１１０−位のシステイン残基がα−アミノ酪酸で置換されている構造（ＩＸ）（以下にも詳細に論及されている）と称するポリペプチドを記載している前述の米国特許第４，３０２，３８６号明細書を参照されたい。更に、ＨＣＧのβサブユニットの天然の形が、アミノ酸鎖に結合した多数の炭水化物残基を有するとしても、ＨＣＧ配列の適切な部分に対して配列は対応するがこのような炭水化物残基を欠いている合成ペプチドを、本発明の結合体を与え且つ良好な結果を与えるように修飾することができる。種特異性はいずれの免疫学的方法においても当然問題であるが、多数のタンパク質は、２種類の種の対応するタンパク質に対する抗体間にかなりの交差反応性が存在するほどアミノ酸配列が種間で同一であるかまたは互いに僅かしか違わないので、本発明は、修飾されるホルモン、フラグメントまたはペプチドが実際に、結合体を投与される哺乳動物とは異なる哺乳動物種のタンパク質に由来することができる可能性を除外しない。更に、本発明によって修飾されるフラグメントは、フラグメントが概念的に由来するタンパク質の配列中に対応物を持たないアミノ酸配列を包含することができる。また例えば、本発明の方法において、概念的にはＨＣＧのβサブユニットに由来するが多数のプロリン残基を含むスペーサー配列を包含する構造（ＩＶ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）および（ＸＩＶ）と称するポリペプチドフラグメントを用いることができることを以下に示す。当然ながら、標的タンパク質の部分に正確に対応していない配列を用いる場合は注意を払うべきである。例えば、タンパク質レラキシンは極めて種特異的であることが知られており、したがって、非ヒトレラキシンタンパク質のフラグメントを、本発明の方法によって修飾し且つヒトに注射してヒトにおける抗レラキシン抗体の生成を引き起こすことは勧められない。しかしながら、結合体の生成に適当なホルモン、フラグメントまたはペプチドを選択する場合、アミノ酸配列のみが考慮されるべき唯一の因子ではなく、コンホメーション、すなわち、標的タンパク質の天然のコンホメーションに相対して選択されたタンパク質、フラグメントまたはペプチドの物理的形状にも周到に留意する必要がある。抗原のコンホメーションすなわち形状が、抗体に抗原を認識させる重要な因子であるということは免疫学当業者に周知である。したがって、本発明の結合体が標的タンパク質の適切な部分のコンホメーションを保持していない場合、哺乳動物中に結合体を注射することによって引き出された抗体は、天然の標的タンパク質に対して最適の活性を示さないと考えられる。例えば、標的タンパク質の一部分と同様の配列を有するペプチドは、もしも天然の標的タンパク質中の決定的な抗原決定基の位置に影響を与える標的タンパク質の配列の他の部分が存在しないために、結合体を製造するのに用いられたフラグメントが、標的タンパク質中の同様のアミノ酸配列のコンホメーションと全く異なるコンホメーションをとるならば、おそらくほとんど機能しない。同様に、複合標的タンパク質の鎖は通常折りたたまれているので、抗原−抗体結合反応は、標的タンパク質の鎖に沿って大きく隔てられているが標的タンパク質の天然のコンホメーションでは間隔が互いに近接している２種類またはそれ以上のアミノ酸配列の認識に頼ることがある。これらの考察は全て、本発明において用いるための大部分の適当なホルモン、フラグメントまたはペプチドが何であるかという問題に関係しうる。当業者が承知しているように、複合タンパク質のコンホメーション、したがって抗原性および抗原決定基に影響を与える一つとの主要な因子は、このようなタンパク質におけるシステイン残基およびジスルフィド橋の存在である。システイン残基を有する多数の天然タンパク質において、これらの残基が遊離−ＳＨ基を含むそれらのチオールの形で存在していないことは当業者に周知である。その代わり、システイン残基対はジスルフィド橋によって結合してシステインを形成する。このようなジスルフィド橋は、タンパク質のコンホメーションを決定するのに極めて重要である。大部分の場合、天然の形のタンパク質中に存在するジスルフィド橋は、温和な還元剤によってタンパク質分子の残部を未変化のまま残す条件下において容易にチオール基に還元される。このようなジスルフィド橋の破壊は、たとえアミノ酸配列の妨害が起こらないとしても、タンパク質のコンホメーションを主に変化させる。特に、ＨＣＧのβサブユニット中に存在する１２個のシステイン残基は、天然の形のサブユニットにおいては互いに結合して６個のジスルフィド橋を形成するので、天然の形のタンパク質は遊離チオール基を持たない。天然に存在する形のタンパク質におけるジスルフィド橋の還元による遊離チオール基の生成は、タンパク質またはそのフラグメントに由来する結合体を動物に注射した場合に生産される抗体の交差反応性に影響を与えることがある。既述したように、抗体は、しばしば、その対応する抗原をその抗原中のアミノ酸配列によってのみならず抗原のコンホメーションによっても認識する。したがって、タンパク質またはその天然のコンホメーション中のペプチドに対して極めて強く結合する抗体は、そのコンホメーションがそのジスルフィド橋の破壊によって驚異的に変化した後の同じタンパク質またはポリペプチドに対して、結合したとしてもはるかに弱く結合するかもしれない。したがって、タンパク質または他のポリペプチド中のジスルフィド橋の破壊は、分子の一部分に沿って同様のアミノ酸配列を有する抗原に対する抗体間の交差反応性を減少させる根拠を与えることができる。例えば、β−ＨＣＧおよびＨＬＨ配列中の最初の１１０残基は２種類の天然の形の分子において実際に同一であり、したがってコンホメーションもおそらく極めて類似しているので、交差反応は、しばしば、β−ＨＣＧおよびＨＬＨに対する抗体間で見られることが上記で指摘された。ＨＬＨとほとんど交差反応しないβ−ＨＣＧに対して抗体を動物で生産する一つの手段は、β−ＨＣＧの残基１１１〜１４５の全部または一部分を含むがβ−ＨＣＧの残基１〜１１０の全部またはほとんど全部を欠いているポリペプチドに由来する本発明の結合体を動物に与えることであるということが上記で示唆された。実際に、このアプローチは、β−ＨＣＧおよびＨＬＨに共通している残基の配列を結合体から化学的に除去することによってＨＬＨとの抗体交差反応を回避する。別のアプローチとして、天然の形のβ−ＨＣＧ中の適当な数のジスルフィド橋を開裂することにより、その残基１〜１１０のコンホメーションを変更して、この変更されたβ−ＨＣＧを基剤とする本発明の結合体を動物に投与した場合に生成される抗体がＨＬＨともうほとんど交差反応しないようにすることは可能でありうる。言い換えると、交差反応を妨げるようにβ−ＨＣＧから共通配列の残基を化学的に切断する代わりに、β−ＨＣＧ中のこの共通配列の残基を残すがこの共通配列のコンホメーションを変更し、抗体にとって、変更されたコンホメーション共通配列が天然の形の共通配列のように「見える」ことがないようにすることは可能でありうるので、変更されたコンホメーション共通配列を認識する抗体は、ＨＬＨ中の天然のコンホメーション共通配列を認識しない。更に、残基１〜１１０の配列の天然のコンホメーションがジスルフィド橋の破壊によっていったん破壊されたら、この共通配列は、おそらくジスルフィド橋を欠いているポリペプチドに共通のらせんコンホメーションをとるので、結果としてこのβ−ＨＣＧ部分は強く免疫原性ではなく、しかも変更されたコンホメーションβ−ＨＣＧを基剤とする結合体によって生成された抗体の大部分は、ＨＬＨと共通性がない配列１１１〜１４５に対する抗体である。明らかに、他の対のホルモンに対する抗体間の交差反応性は、類似していてしたがってそのままでは抗原交差反応性を促進する２種類のタンパク質の部分のコンホメーションを変更することによって同様に破壊することができる。現在のところ好ましい結合体は、ＣＧに由来するもの（若干類似した黄体形成およびろ胞分泌ホルモンに由来するものも含む）およびレラキシンに由来するものである。絨毛性性腺刺激ホルモンおよび関連ホルモンホルモンである絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）は、広範囲にわたる研究の課題であって、１９２７年に、実験動物に注射された場合に顕著な性腺増殖を生じた性腺刺激物質が妊婦の血液および尿中に含まれていることが実証された。後に、研究者達は、下垂体ではなく、胎盤絨毛膜絨毛がこのホルモン源であることを確証した。このようにして、絨毛性性腺刺激ホルモンまたはヒトの場合ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）の名称がこの妊娠ホルモンに対して与えられた。最近、正常なおよび異常な生理学的状態におけるＨＣＧ濃度を記載する多種多様の研究が行なわれてきており、妊娠を維持する場合のその役割が示された。研究により、***を誘導し且つ黄体機能を刺激するホルモンの能力が示され、そしてリンパ球作用を抑制するその能力を示すための根拠が引き出された。ＨＣＧに対する抗体とヒト下垂体黄体形成ホルモン（ＬＨ）との交差反応および逆の場合も、広範囲に実証された。例えば、ポール（Ｐａｕｌ），Ｗ．Ｅ．およびロス（Ｒｏｓｓ），Ｆ．Ｔ．、ＨＣＧおよびヒト下垂体黄体形成ホルモン間の免疫学的交差反応（ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃＣｒｏｓｓＲｅａｃｔｉｏｎＢｅｔｗｅｅｎＨＣＧａｎｄＨｕｍａｎＰｉｔｕｉｔａｒｙＧｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ．）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，７５，３２５〜３５８（１９６４）；フラクス（Ｆｌｕｘ），Ｄ．Ｘ．およびリー（Ｌｉ），Ｃ．Ｈ．、性腺刺激ホルモン間の免疫学的交差反応（ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＣｒｏｓｓＲｅａｃｔｉｏｎＡｍｏｎｇＧｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎｓ．）ＡｃｔａＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃ，４８，６１〜７２（１９６５）；バグショウ（Ｂａｇｓｈａｗｅ），Ｋ．Ｄ．；オル（Ｏｒｒ），Ａ．Ｈ．およびゴドン（Ｇｏｄｄｅｎ）Ｊ．、ＨＣＧと様々な種由来血漿とのラジオイムノアッセイにおける交差反応（Ｃｒｏｓｓ−ＲｅａｃｔｉｏｎｉｎＲａｄｉｏ− ＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｂｅｔｗｅｅｎＨＣＧａｎｄＰｌａｓｍａｆｒｏｍＶａｒｉｏｕｓＳｐｅｃｉｅｓ．）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，４２，５１３〜５１８（１９６８）；フランチモント（Ｆｒａｎｃｈｉｍｏｎｔ），Ｐ．、ＨＣＧおよび下垂体ＬＨ間の交差反応の研究（ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＣｒｏｓｓ−ＲｅａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＨＣＧａｎｄＰｉｔｕｉｔａｒｙＬＨ．）ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１，６５〜６８（１９７０）；ドーナー（Ｄｏｒｎｅｒ），Ｍ．；ブロスマー（Ｂｒｏｓｓｍｅｒ），Ｒ．；ヒルゲンフェルト（Ｈｉｌｇｅｎｆｅｌｄｔ），Ｕ．およびトルード（Ｔｒｕｄｅ），Ｅ．、タンパク質およびポリペプチドホルモンの構造−活性関係におけるＨＣＧに対する抗体とＨＣＧおよびその化学誘導体の免疫学的反応（ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｒｅａｃｔｉｏｎｓｏｆＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏＨＣＧｗｉｔｈＨＣＧａｎｄｉｔｓｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＡｃｔｉｖｉｔｙＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅＨｏｒｍｏｎｅｓ）（Ｍ．マルゴーリーズ（Ｍａｒｇｏｕｌｉｅｓ）およびＦ．Ｃ．グリーンウッド（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ）監修）、５３９頁，５４１Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：ＥｘｃｅｒｐｔａＭｅｄｉｃａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２）を参照されたい。更に、これらの交差反応を用いて、ＣＧおよびＬＨ両方のホルモンの免疫検定が実施されている。ミッドグレイ（Ｍｉｄｇｌｅｙ），Ａ．Ｒ．Ｊｒ．、ＨＣＧおよびＬＨのための方法、ラジオイムノアツセイ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ａｍｅｔｈｏｄｆｏｒＨＣＧａｎｄＬＨ．）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，７９，１０〜１６（１９６６）；クロシグナニ（Ｃｒｏｓｉｇｎａｎｉ），Ｐ．Ｇ．、ポルヴァニ（Ｐｏｌｖａｎｉ），Ｆ．およびサラシ（Ｓａｒａｃｃｉ）Ｒ．、タンパク質およびポリペプチドホルモンのＨＣＧ−ＬＨのラジオイムノアッセイの特徴（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆａｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｆｏｒＨＣＧ−ＬＨｉｎＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅＨｏｒｍｏｎｅｓ）（Ｍ．マルゴーリーズ監修）４０９頁，４１１Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：ＥｘｃｅｒｐｔａＭｅｄｉｃａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９６９）；イソジマ（Ｉｓｏｊｉｍａ），Ｓ；ネイク（Ｎａｋｅ），Ｏ．；コジャマ（Ｋｏｊａｍａ），Ｋ．；およびアダチ（Ａｄａｃｈｉ），Ｈ．、重合された抗ヒトＨＣＧを免疫吸着剤として用いるヒトＬ．Ｈ．のラピッドラジオイムノアッセイ（ＲａｐｉｄｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｏｆｈｕｍａｎＬ．Ｈ．ｕｓｉｎｇｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄａｎｔｉｈｕｍａｎＨＣＧａｓｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂｅｎｔ．）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ，３１，６９３〜６９９（１９７０）を参照されたい。完全なＣＧホルモンまたはそのサブユニット、例えばβサブユニットは本発明の結合体において用いることができるが、概して、βサブユニットのフラグメントのみに対応するペプチドを用いることが好ましい。更に具体的には、既述したように、ＬＨの対応するβサブユニットとほぼ同一のＣＧのβサブユニットが多量に存在するので、ＬＨと共通性がないＣＧのβサブユニットの１１１〜１４５配列の一部分に対応するフラグメントを用いることによって上記で既に論及されたＣＧおよびＬＨ抗体の交差反応性を避けることが望ましい。したがって、ホルモンＣＧに対する免疫学的反応は、天然に存在する生体成分ＬＨに対して望ましくない免疫反応を引き起こすことなく達成することができる。ＣＧの望ましいフラグメントに対応する合成ポリペプチドは、避妊剤において商業的に用いるのに必要とされる生産費用および高度の純度の両方の観点から、増大した実用性を与える。タンパク質性生殖ホルモンのサブユニットおよびフラグメントとしては、天然ろ胞性刺激ホルモンのβサブユニット、天然ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニット、天然ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβサブユニットのＣ末端残基から成る、特に２０〜３０または３０〜３９アミノ酸ペプチドを含むフラグメント、並びに天然ヒトプロラクチンおよび天然ヒト胎盤性ラクトゲンの特異的な独特のフラグメントがあり、これらは他のタンパク質ホルモンの同様の部分とあまり類似性がない。本発明が関する新規の化学物質の種類に関して、更に、例えばＨＣＧのβサブユニットの化学的立体配置を記載することができる。その構造は以下の通りである。抗体作用の特異性のために、他のホルモンとは完全にまたは実質的に完全に異なる分子構造を有する個々のペブチドを単離するかまたは製造することが必要である。ＨＣＧのβサブユニットは、ヒト黄体形成ホルモンのポリペプチド鎖とは完全にかまたは本質的に異なるアミノ酸残基の特異的な１種類または複数の鎖を有する。これらの鎖またはフラグメントは、担体と結合した場合、本発明の更に別の態様を示す。したがって、ポリペプチド構造（ＩＩ）および（ＩＩＩ）［構造ＩのＣ末端部分］は、純粋に合成法によって得られようと天然のまたは親ポリペプチドから酵素分解によって得られようと、［チャールソン（Ｃｈａｒｌｓｏｎ）ら、Ｊ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８４（１９），６８１０，（１９７３）］本発明にしたがって修飾された場合、望ましい免疫学的応答を与えるのに十分な抗原性を有する物質を同様に提供する。構造（Ｉ）で記載したβサブユニットは、１４５アミノ酸成分の化学的配列を示すことが分かる。この構造は、最初の１１０アミノ酸成分の範囲まで黄体形成ホルモン（ＬＨ）の対応するサブユニットと構造的に高度の相同性を有する。上記に示したように、したがって、サブユニットのＣ末端の１１１〜１４５アミノ酸配列と同様のフラグメントの使用によって絨毛性性腺刺激ホルモンまたは類似物質に対する高い特異性を引き起こすのが望ましいことが分かった。上記構造（ＩＩ）は、まさにその配列を示す。構造（ＩＩＩ）は僅かながら更に短く、サブユニット配列中の１１６〜１４５アミノ酸位置を示す。天然ＣＧに対して作られる抗体を促進する本発明の抗原結合体において有用な更に別のポリペプチド鎖としては、構造（ＩＶ）〜（ＸＩＶ）と称する以下の構造がある。本発明の結合体において、これらのポリペプチドは、ＨＣＧに対する免疫原活性を与える。これらのポリペプチドは全て、天然ホルモンの化学的立体配置に対するそれらの実質的類似性および本発明の方法によって修飾された場合のそれらによって与えられる免疫学的応答のために、ＨＣＧのフラグメントと考えられる。構造（ＩＶ）は、アミノ末端すなわちＮ末端にプロリンスペーサー配列と結合しているＣｙｓ成分を包含する。これらのスペーサーは、続く配列を担体修飾因子から物理的に離れた位置に存在させるのに役立つ。後ろの配列は、サブユニット構造（Ｉ）の１３８番目〜１４５番目のアミノ酸配列を示すことが分かる。一方、構造（Ｖ）は、サブユニット構造（Ｉ）の１１１番目〜１１８番目のアミノ酸配列に対応する最初の配列に続いて６個のプロリンスペーサー成分の配列およびシステインとして存在するカルボキシル末端を示す。このようなスペーサー成分を与える場合の論拠は、性能が抗原的に中性のままであるかもしれない部位を排除することである。構造（ＩＶ）および（Ｖ）は、それぞれが一つの決定基部位を生じるのに役立つ範囲までの比較的短いアミノ酸配列である。したがって。以下に更に詳細に言及されるように、それらは、不可欠な２種類の異なる決定基が、それぞれ別個に結合した２種類のこのようなフラグメントの同時投与によって与えられる混合免疫感作技術によって用いられる。構造（ＶＩ）は、構造（Ｉ）の１１５番目〜１４５番目までの成分配列である。構造（ＶＩＩ）は構造（Ｉ）の一部分であるが；しかしながら、本質的には、その１１１番目〜１３０番目の成分の配列を形成している。構造（ＶＩＩＩ）は２種類の配列を包含しており、その一方は構造（Ｖ）において、もう一方は構造（ＩＶ）において認識されうる。これらの２種類の配列は、プロリン成分の２種類のスペーサー配列によって隔てられ、一方は、結合機能に役立つ中間に配列されたシステイン成分と結合している。この配列により、２種類の異なる決定基部位は、それらの相互の結合付近で引き起こされるおそれがある望ましくない人為的な決定基の出現を避けるように、物理的に隔てられた関係で生じる。構造（ＶＩＩＩａ）は、決定基部位の間隔を広げるように追加のプロリンスペーサー残基を含む構造（ＶＩＩＩ）である。構造（ＩＸ）は構造（Ｉ）からの配列に似ていて、追加のプロリンスペーサー配列、Ｃ末端のシステイン成分および１１０位のシステインの代わりに置換されたＡｂａを含む。呼称Ａｂａは、本明細書中においてシステインのαアミノ酪酸を意味するためのものである。構造（Ｘ）は、構造（ＩＩ）と、６残基プロリンスペーサー配列およびＣ末端のシステイン成分との組合せとして認識される。同様に、構造（ＸＩ）は、構造（ＩＩ）とＣ末端のシステイン成分とを、プロリンスペーサー配列を含まないで組合せる。他の有用なペプチドとしては次のものがある。構造（ＸＩＩ）は、構造（ＩＩ）の配列と、そのＮ末端の追加のＴｈｒ−Ｃｙｓ残基とを有すると認識される。構造（ＸＩＩＩ）は、構造（ＩＸ）と同様であるがスペーサー配列を含まない。構造（ＸＩＶ）は構造（ＩＩ）と同様であるが、Ｎ末端の追加のスペーサー成分およびシステイン残基を含むと認識され、これらは以下に更に詳細に記載されるように、修飾反応に有用でありうる。既述したように、ＬＨの対応する配列と異なるのはβ−ＨＣＧの１１１〜１４５アミノ酸配列のみである。しかしながら、研究により、本発明の結合体で用いられるペプチドは、ＬＨに対して反応性の抗体の生成を引き起こすことなく、β −ＨＣＧおよびβ−ＬＨに共通の１０１〜１１０配列に対応する配列を含むことができることが示される。したがって、本発明の結合体において、ＬＨとの実質的な交差反応性を引き起こすことなく、共通の１０１〜１１０配列の一部分または全部を含むペプチドを用いることができる。例えば、上記構造（ＩＩ）は、β −ＨＣＧの１１１〜１４５アミノ酸配列である。したがって、所望ならば、β− ＨＣＧの１０１〜１４５アミノ酸を有するペプチドを、修飾ポリペプチドの活性にほとんど影響を与えることなくおよびβ−ＬＨとの交差反応性を引き起こすことなく、本発明の結合体における構造（１１）のペプチドの代わりに置換しうると考えられる。既述したように、β−ＨＣＧの１０９〜１４５配列に対応するぺプチドは、本発明のワクチンおよび結合体において特に有用である。既述された理由により、黄体形成ホルモンとの交差反応性を避ける必要性は、本発明のワクチンおよび結合体で用いられる絨毛性性腺剌激ホルモン由来ペプチドを、主として絨毛性性腺刺激ホルモンの１０１〜１４５配列の全部または一部分を含むペプチドに制限し、それは、黄体形成ホルモンと有意に異なるのが絨毛性性腺刺激ホルモン配列のこの部分だけであるためである。しかしながら、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン分子上にはヒト絨毛性性腺刺激ホルモンに特異的な抗体を生産する抗原決定基が存在し、その抗原決定基はヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの１０１〜１４５配列上に位置していないことが分かっている。一つのこのような抗原決定基は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの配列４０〜５２または配列３８〜５７に対応する配列である。したがって、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの配列３８〜５７領域（またはこの領域の一部分）と実質的に同様のアミノ酸配列を含むペプチドは、本発明のワクチンおよび結合体において用いることができる。 β−ＨＣＧ（３８〜５７）ペプチドは、しかしながら、前に論及されたβ−ＨＣＧ（１０１〜１４５）ペプチドとはかなり異なる様式で用いられる。ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの３８〜５７領域は、ヒト黄体形成ホルモン、ろ胞刺激ホルモンおよび甲状腺刺激ホルモンの対応する領域と実質的に同様である（ヒト以外の種においても同様のことがいえる）ので、本発明のワクチンおよび結合体においてβ−ＨＣＧ（３８〜５７）ペプチドを単独で用いることは賢明ではなく、それは、これが他のホルモンとの望ましくない程度の交差反応性を有する抗体を生産する実質的な危険を伴うからである。しかしながら、前記のように、標的タンパク質の２種類以上の抗原決定基を含むことは本発明のワクチンおよび結合体に好都合であり、それは、これが、抗体を生じさせる場合のワクチンまたは結合体の有効性を増加させ、したがって治療される動物においてより高い抗体力価を生じさせるためである。したがって、ワクチンまたは結合体が抗体を引き起こすのに極めて有効であるが、なおかつ、望ましくない程度の交差反応を経験しないように十分に特異的であるようにするためには、ワクチンおよび結合体において、β−ＨＣＧ（３８〜５７）および同様のペプチドを、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンにより特異的なペプチドと一緒に用いることが極めて好都合である。特に、β−ＨＣＧ（３８〜５７）ペプチドを、同様のホルモンサブユニットの１０９〜１４５配列（または上記で論及された理由により、１０１〜１４５配列）に由来するまたはと同様のペプチドと一緒に用いることが勧められる。３８〜５７および１０１〜１４５ペプチドの共同使用は、３種類の別個の方法で達成されうる。第一に、β−ＨＣＧ（３８〜５７）ペプチドは、同様のホルモンサブユニットの１０１〜１４５領域の少なくとも一部分と実質的に同様の１種類またはそれ以上のアミノ酸配列を更に含むことができる、すなわち、ペプチドを修飾する前に、２種類の配列を同一ペプチドに化学的に結合することができる。第二に、両方のペプチドを、最初に互いに化学結合させることなく、同一担体に対して化学結合させることができる。最後に、２種類のペプチドを別個の担体に対して結合し、そして得られた２種類の結合体の混合物を治療される動物中に導入することができる。このようなポリペプチドは、当然ながら、得られた結合体が用いられる哺乳動物に応じて、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの３８〜５７領域または他の哺乳動物の絨毛性性腺刺激ホルモンの同様の配列を含むことができる。この３８〜５７配列は単独で用いることができるし、または該配列は、適当な絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの隣接部分と実質的に同様の隣接部分を、たとえこのような隣接部分の存在が結合体における適当な抗原性を生じるのに不必要であるとしても、含むことができる。極めて長いペプチドを合成する難しさおよび費用などの実際的な理由により、βサブユニットの、４０〜５２領域から成るおよび３８〜５７領域に対応するアミノ酸配列を有するペプチドは約４０個以下のアミノ酸残基を含む。抗原活性を引き起こすのに十分であるとしても、ＨＣＧの単なる３８〜５７領域に対応するアミノ酸配列は、担体に対する、または本発明のワクチンおよび結合体の合成において用いられる他のフラグメントに対するペプチドの結合を行なうことができる好都合な部位を全く有していないという欠点を有する。したがって、好都合な結合部位を有するペプチドを提供するために、ペプチドは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの残基３８に対応するアミノ酸配列の部分に対して、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの３０〜３７領域と実質的に同様でないアミノ酸残基のスペーサー配列を結合していて、そして更に、ペプチドは、このスペーサー配列のＮ末端に対して、担体に対するまたは本発明の結合体の別のペプチドフラグメントに対するペプチドの結合に適当な反応性残基を結合していることが好ましい。好ましくは、スペーサー配列は多数（便宜上６個）のプロリン残基を含み、そして反応性残基はアラニン残基を含む。これにかわって、ペプチドにおける遊離スルフィドリル基の存在が必要なある種の好ましいカップリング反応（以下に検討）に38-57ペプチドを使用することができるようになるには、38-57ペプチドの一つの末端（好ましくはN-末端）へシステイン残基を加えてもよい。しかしながら、もしこのような追加のシステイン残基を38-57ペプチドヘ加えるならば、ペプチドの必要な環化の間に正しいシステイン残基がジスルフィド橋により連結されるように注意しなければならない。これは、ペプチドへ入れる前に“余分の”システイン残基に遮断基を置きそしてジスルフィド橋が形成された後にのみ遮断基を除去することにより都合よく行われる。適当な遮断基は当業者に良く知られており、幾つかを以下に検討する。本発明の修飾ワクチンおよび結合体に使用する場合、HCGのβサブユニットの3 8-57領域に相当するアミノ酸配列を含むペプチドは、HCGのβサブユニットの38 位および57位におけるシステイン残基に相当する二つのシステイン残基がジスルフィド橋に連結したこれらの硫黄原子を有する形で使用される。なぜなら、事実上、ジスルフィド橋はループ状に閉じ、これはインビボで強い抗原性を有するペプチドのこの形のみであるようであるからである。化学合成の現段階において、環化に必要な条件はペプチドが担体（または他のペプチドフラグメント）と結合した後では簡単に作ることはできないので、これを担体（または他のペプチドフラグメント）と結合する前に38-57ペプチドを環化することが実際上必要である。内因性タンパク質ホルモンのフラグメントに似せた他のペプチドに関するのと同様に、HCG のβサブユニットの38-57の範囲に相当するペプチドは天然βサブユニットに存在するものと同じアミノ酸配列を有する必要はないが、ただしペプチドのアミノ酸配列と天然βサブユニットにおけるアミノ酸配列の間に十分な程度の免疫学的類似性があり、すなわち本発明によるワクチンまたは結合体を形成するために修飾された場合、ペプチドは十分な抗原活性をもたらし、天然HCGとの良好な反応性およびこれに対する選択性を抗体が有することが必要てある。人工ペプチドとHCGのβサブユニットの天然配列の間の免疫学的類似性を実質的に減らすことなく行われうるある種のアミノ酸置換は当業者に良く知られており、提案されたアミノ酸配列のいずれの免疫学的類似性の程度は、もちろん、一般的な経験上の試験により決定することができる。他の哺乳動物種から誘導される絨毛性ゴナドトロピンはヒト絨毛性ゴナドトロピンの38-57配列と非常に近似した領域を有するばかりでなく、非常に近似した領域が他の哺乳動物糖タンパク質ホルモン、たとえば黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモンおよび甲状腺剌激ホルモンにおいて存在する。したがって同様の領域を有する非ヒト絨毛性ゴナドトロピンおよび他の哺乳動物糖タンパク質ホルモンの領域から誘導されるペプチドもまた本発明のワクチンおよび結合体の製造に使用される。HCGの38-57領域と類似するいくつかの特異的哺乳動物糖タンパク質の領域を以下に詳細に示すが、しかし当業者であれば他の特異的哺乳動物糖タンパク質における類似領域を同定するのは難しくない。すでに記載したように、天然配列と同一ではないが、類似の配列を有するペプチドもまた使用されるが但しこれらは天然配列と免疫学的的にほとんど均等であることが条件である。 HCGの38-57領域と類似の配列を有し、本発明のワクチンおよび結合体に使用される特定の好ましいペプチドの例は以下のようである；構造式XXVIIはヒト絨毛性ゴナドトロピンの38-57領域である。構造式XXXはウマ絨毛性ゴナドトロピンからの相当する配列である。構造式XXVIはヒト黄体形成ホルモンの相当する領域であり、構造式XXVはヒツジ／ウシ黄体形成ホルモンの相当する領域である。構造式XXVIIIはヒト卵胞刺激ホルモンの相当する領域であり、構造式XXIXはウマ卵胞刺激ホルモンの相当する領域である。構造式XXXIは甲状腺刺激ホルモンの相当する領域である。このホルモン配列の（Lys-Tyr）領域は、これが相当するHCG配列の50と51位の間の“挿入部”を表すので括弧に入れてあり、したがって上記で与えた他の配列のいずれにも全く同じものはない。上記配列のある種の細かい部分に関してタンパク質配列決定の分野における当業者間に幾つかの異なった意見があることは注意すべきである。たとえば、次のようなものである；ピールス（Pierce）およびパーソンズ（Parsons）、Ann.Rev.Biochem,50:469- 95（1981）。特に、ヒト甲状腺刺激ホルモン配列において、前述の（Lys-Tyr）挿入部の存在に反対する専門家もおり、他方ヒト黄体形成ホルモン配列の42位におけるメチオニンおよび55位におけるバリンの存在に反対する専門家もいる。しかしながら、上記で検討した理由のため、天然配列が上に与えられたものとは異なるとはいえ、上に与えられた配列は天然配列と十分に近似しており本発明ワクチンおよび結合体に組み合わせたとき強い抗原反応を生じる。レラキシン本発明ワクチンおよび結合体に使用することができるペプチドの別の群は、レラキシンおよびこれから誘導されるポリペプチドである。レラキシンは妊娠中に卵巣の黄体において合成されるペプチドホルモンであり、このホルモンは出産前に血液流れへ放出されることが長い間知られてきた。レラキシンの主な生物学的作用は、主に、子宮頸部を弛緩しこれにより出産前に子宮頸部の拡張を助けることにより哺乳動物の生殖管を生誕過程が楽になるように変えることである。インシュリンのものと幾つかの類似点を有するアミノ酸配列が決定されている：ハドソン（Hudson）ら、Structure of a Genomic Clone Encoding Biologic aly Active Human Relaxin この論文はまたある種のレラキシン誘導ペプチドの合成法を示している。本発明ワクチンおよび結合体において、レラキシンまたはこれから誘導されるペプチドを使用することは、分娩の間におけるレラキシンの天然の機能に依るものではなく、抗−レラキシン抗体が***の運動を阻止することが知られているという事実に依るものである。すなわち、特に抗体/***複合体へレラキシンを加えることにより***の不動性を逆戻りさせることができるので、***の表面にはレラキシン様抗原が存在するようである。理論的には修飾した***抗原を使用して***に存在する様々な抗原に対する抗体を雄において発生させることができるが、しかし血液／睾丸バリヤーのために、このような抗-***抗体が睾丸を通過しないという深刻な問題がある。抗-レラキシン抗体の不動性の非常に迅速な誘発の可能性により、男性におけるこのような抗体の発生は男性避妊の非常に魅力的で可能性のある形態である。抗-レラキシン抗体が血液／睾丸バリヤーのために睾丸を通過しないかもしれないが、これらは副睾丸を通過することができ、そしてこれらはまた***前またはその間に短時間で***と混合するようになる液体へ分泌されるであろう。すなわち、男性において抗-レラキシン抗体を産生することにより、***は普通に起こるであろうが、しかし産生される***は不動性でになる。さらに、このような本発明法による合併症の危険および意図しない組織の損傷は軽く、なぜなら抗体は睾丸へ入らず、これにより睾丸で抗体-抗原の結合による損傷反応のおそれを避けることができるからである。女性へ本発明のレラキシン誘導化結合体を投与することは薦められないことは注意すべきである。このような方法は女性において卵巣損傷の非常に大きな危険をもたらすであろう。レラキシンは高度に種特異性のタンパク質であることは注意すべきことである。したがって、レラキシンから誘導される好適なペプチドを選択する場合、ペプチドがヒトレラキシン（または、もちろん治療を考えられている他のいずれかの種のレラキシン）の配列の一部に相当することを確実にするように注意すべきである。癌の治療本発明方法で治療することのできる別の健康上の問題はある種の内分泌またはホルモン依存性腫瘍または癌である。ある種の乳癌は、引き続く生存に関し、ホルモンプロラクチンの多量の分泌に依存することがわかっている。プロラクチンの分泌阻害はこれらの腫瘍のあるものの増殖速度および現実的生存を減らすことが示されている。このような腫瘍を患っている哺乳動物のプロラクチンと関連する結合体を用いた免疫化は、系を循環するプロラクチンのレベルを全身的に減少する結果となり、したがって腫瘍増殖が退行または抑制することになる。この治療の結果はこの病気の効果的治療の観点から非常に好ましく、なぜなら***の外科的除去が現在可能な原則的治療方法であるからである。本発明のワクチンおよび結合体が生存のためにプロラクチン（または他の幾つかのホルモン）の分泌に依存する腫瘍に対してのみ有効であることは勿論であろう。研究者はまた、たとえばある種のポリペプチド物質がヒトおよび他の哺乳動物の両方の腫瘍性病気に対する支持因子およびそれからの分泌物質であることも確定している。これらの支持因子は生化学的、生物学的および免疫学的にホルモン特にCGならびにLHに非常に近似している。本発明のワクチンおよび結合体を使用すると、このようなポリペプチドまたは内因性同等物の機能が中和されて悪性腫瘍の調節を行うことができる。たとえば、霊長目の雄および雌の両方における腫瘍はCGまたはLHまたはこれらと類似する病気支持因子に対する抗体を発現するイソ免疫化法により治療されうる。さらに、雌霊長目における悪性腫瘍は内因性LH に対する抗体を発現するイソ免疫化法により調節されうる。このホルモンは腫瘍状態と合わさると、腫瘍状態を悪化させる傾向にある。ある種の癌は、これらの表面にCGまたはその免疫学的類似物を滲出させ、これにより宿主動物に対し内因性の物質を形成し、したがって比較的非免疫原性であるように表面的には見える表面を宿主動物の免疫システムへ提示することがわかっている。ある種の癌とCGまたはCG様物質の間のこの公知の組合せのために、本発明のCG誘導化結合体は受精のコントロールばかりでなくCGまたはCG様物質と組み合わせた腫瘍の治療にも有効である。すでに記載したように、本発明のワクチンおよび結合体は、乳癌、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫および膀胱癌を含む様々な悪性腫瘍疾患の治療に有効である。ホルモン、フラグメントまたはペプチドの修飾に対する技術広範囲の技術が本発明ワクチンに使用する結合体を形成するために使用されうる。以下に記載の技術の多くは、それ自体新規ではなく、そのうち幾つかの技術は以下の参考文献のリストに見いだされるが、他の様々な技術も当業者により文献のいずれかに見出されるであろう。１．クロッツ（Klotz）ら、Arch.of Biochem．and Biophys，96,60 605-612, （1966）．２．コラナ（Khorana）、Chem．Rev．S3 145（1953）．３．セラ（Sela）ら、Biochem．J.,85,223（1962）．４．エイセン（Eisen）ら、J．Am．Chem．Soc.,75,4583（1953）．５．センテノ（Centeno）ら、Fed．Proc.（ABSTR），25,729（1966）．６．ソコロウスキー（Sokolowsky）ら、J．Am．Chem．Soc.,86,1212（1964）．７．タバチニック（Tabachnick）ら、J．Biol．Chem.,234,1726,（1959）．８．クランポン（Crampon）ら、Proc．Soc．Exper.Biol.& Med.,80,448（1952 ）．９．グッドフレンド（Goodfriend）ら、Science，144,1344（1964）． 10．セラ（Sela）ら、J．Am．Chem．Soc.,78,746（1955）． 11．シナダー（Cinader）ら、Brit．J.Exp．Pathol.,36,515（1955）． 12．フィリップス（Phillips）ら、J．of Biol．Chem.,240（2）,699-704（19 65）． 13．バール（Bahl）ら、J．of Biol．Chem.,244,575（1969）．本発明において、ホルモン、フラグメントまたはペプチドの化学的修飾は、動物の身体へ結合体を入れる前に動物の身体の外部で行われることは、当業者であれば理解されるであろう。ホルモン、フラグメントまたはペプチドを化学的に修飾したジフテリアトキソイドまたはT-細胞エピトープに対して結合し本発明のワクチンおよび結合体を形成することは、ホルモン、フラグメントまたはペプチドへ一つ以上の外来性反応（修飾）基を付着させるか、および／または二つのフラグメントペプチドを一つの外来性反応基（すなわち、担体）もしくは上記の両方ともを付着させ、これにより外来物として結合体を認識する動物の身体が抗体を産生し、これが結合体だけでなく調節される医療上の問題の原因である未修飾ホルモンと複合化することにより行われる。特に大きな完全ホルモンまたはサブユニット型分子構造が関連する場合、ホルモンまたはサブユニットに付着すべき外来性反応基の数および外来性反応基と付着すべきホルモンまたはサブユニットの数は治療される特定の問題に依存する。基本的には、要求されるものは結合体が動物の身体へ注射された場合これが抗原性を起こすのに十分な程度まで修飾されることである。あまり僅かな修飾しか行われない場合、身体は結合体を外来物として認めず、これに対する抗体を作りださないであろう。添加される外来分子の数が多すぎる場合、身体は結合体に対し抗体を作りだすが、しかし抗体は結合体と特異的であり、関連する天然の内因性ホルモンの作用を中和せず、すなわちこれらは修飾剤に対し特異的になるであろう。一般に、大きな分子のサブユニットまたは完全なホルモンについて、ホルモンまたはサブユニット１分子当たり約1-40個の修飾基がポリペプチドを適切に修飾するのに有用であり、これにより本発明の所望の免疫学的効果を得る。当業者であれば良く知っているように、修飾基のこの比はホルモン全体を修飾に利用するかまたはたとえばホルモンの比較的小さな合成フラグメントを修飾するかによって変わるであろう。大きな分子については一般に、ポリペプチド１分子当たり2- 40個の修飾基を本発明により使用することが好ましい。ポリペプチドがHCGのβ サブユニットである場合、ポリペプチド１分子当たり約5-30個、さらに好ましくは10-26個の修飾基を使用する。ポリペプチドの修飾の程度は、動物により、標的ホルモンまたは非ホルモンタンパク質の幾つかを中和するのに適切な抗体を産生するのに十分なようにすべきである。修飾の必要な程度は関連する各ポリペプチドで変わるであろうし、および関係する身体の機能に望ましい補正または変化の程度にもよる。すでに記載されているように、本発明ワクチンにおいて、結合体は化学的に修飾したジフテリアトキソイド10⁵ダルトンにつき20-30個のペプチドを含むことが好ましい。修飾物は、これが抗体反応を呼び出すことが望まれる天然タンパク質において表される二つ以上の免疫学的決定因子を構成することが好ましい。効果は抗体発現の異原抗原性の一つである。すなわち、HCGβサブユニットにおいて表される少なくとも二つの全く別のアミノ酸配列を有する幾つかのペプチドが上述されている。これらの配列は間隔があいており相互に単離された決定因子を提供し、一方間隔があいた配列フラグメントは担体と結合する。これにかわり、混合した免疫化配列を利用し、すなわち一つの決定因子を表す第一のペプチドフラグメントを第一の担体分子と結合して、第二の担体分子と結合する第二の全く別のペプチドフラグメントと組み合わせて投与してもよく、その際、第二の担体は第一の担体と同じであるかまたは異なるものでよい。すなわち、各マクロ分子担体は各フラグメントが二つ以上の免疫学的決定因子を表すようにホルモンフラグメントと結合されうる。一つの好ましい修飾方法において、修飾されるべきホルモン、フラグメントまたはペプチド、たとえば上記の構造式（XII）として指定されたものは、最初に活性化され、その後これを担体（化学的に修飾されたジフテリアトキソイドまたはT-細胞エピトープ）と結合する。その末端で異なった機能を示し、そして反応条件の選択によりこれらの末端機能を選択的に反応するようにすることができる活性剤も利用できる。たとえば、各々はマレイミド基と置換酸基を有する添付の図面の図１に示される式ＡおよびＢの活性剤を使用してもよい。これらの活性剤において、Ｘは置換もしくは非置換フェニルまたはC1-C10アルキレン部分またはこれらの組み合わせたものである非反応基である。フェニル環における置換基（もし存在すれば）はもちろん、基Ｘの残りもそうであるように、活性剤の反応を妨害すべきでない。基Ｘは、中でもペンタメチレン、1,4-フェニレンまたはモノメチル-1,4-フェニレン基である。上記活性剤のマレイミド基は、試薬の反対端部（活性エステル端部）がホルモン、フラグメントまたはペプチドに存在するアミノ基と反応しない条件下で、修飾されるべきホルモン、フラグメントまたはペプチドにおけるスルフドリル（SH ）基と反応するであろう。すなわち、たとえばペプチドのたとえば上記の構造式（XII）として指定されたものはシステインアミノ酸を含み、それゆえSH基は添付の図面の図２において反応１で示されるように反応する。上記反応に続いて、 pHをややアルカリ性、たとえばpH8まで調節し、担体を添加すると、結合が完了し図２に示す式２の生成物が生成する。 SH基を含まないがNH₂基を含む担体は、最初に図１に示す式ＡまたはＢ（式中、Ｘは上記定義したのものである）の活性剤とpH7またはそれ以下で最初に処理して、担体と活性剤の活性エステル端部の反応を起こさせ、図２に示す式３の化合物を得るようにするのが好ましい。その後、活性化担体をSH基を含有するホルモン、フラグメントまたはペプチドと反応させると、直前で検討したものと同じ結合体が得られる。たとえば構造式（II）,（III）,（VI）または（VII）のようにホルモン、フラグメントまたはペプチドがSH基を含まないなら、このような構造のものを修飾するには、最初にたとえば“チオラクトン化”のような標準的方法によりこのような基を導入し、続いてこれらを上述の選択的二官能性試薬を利用しながら結合する。これら試薬のさらに詳細な記載について、以下の刊行物を参照せよ：オー．ケラー（O.Keller）およびジェイ．ライジンガー（J.Ridinger）,Hel v.Chim．Acta．58,531-541（1975）ダブリュ．トロマー（W.Trommer）、エッチ．コルケンブロック（H.Kolkenb rock）およびジィ．プフレイデラー（G.Pfleiderer），ホップ−セイラー（Hopp e-Seyler's）Z．Physiol．Chem.,356,1455-1458（1975）すでに記載のように、システイン残基を含む多くの天然タンパク質において、これらの残基は遊離SH基を含むチオール形において存在しない；これにかわり、何対かのシステイン残基がジスルフィド橋を介して結合してシステインを形成する。したがって、タンパク質において遊離SH基を作り、上述のようにカップリング反応を実施することを所望する場合、このような遊離SH基を提供する一つの都合のよい方法は、結合を望むタンパク質または他のポリペプチドに天然に存在するジスルフィド橋を開裂することである。たとえば、上述のようにβ-HCGの天然形は６個のジスルフィド橋を含む。カップリング反応のための遊離チオール基を作るために、これらの１−６の橋のいずれかの数をたとえば次に示すような公知技術を用いて破壊してもよい：バール（Bahls）ら、Biochem．Ｂiophys．Res．Comm.，70,525-532（1976）．この特定の文献には、β-HCGにおける６個のジスルフィド橋の3-5個を開裂することを記載しているが、しかし所望するならば同じ技術を使用して６個の橋全てを壊してもよい。しかしながら、この文献に開示された技術は非選択的であり、そしてジスルフィド橋破壊の程度を調節することができるとはいえ、特定の橋を破壊し他をそのままにすることは不可能である。橋の破壊はランダムで、生成したチオール基はβ-HCGにおいて可能な位置にわたってランダムに分布している。上述したマレイミド基試薬の利用への別の方法として、結合を起こさせるためにアルキル化工程を使用してもよい。アミノ基の存在下に特にチオール基のみをアルキル化するように条件を選択することができる。この方法を用いて、より大きな担体分子を、図１に示す式Ｃの化合物のようなクロロ、ジクロロ、ブロモまたはヨード酢酸の活性エステルを用いてそのアミノ基の部分と反応させることにより最初に修飾する。この修飾された担体を次いで修飾されるべきホルモン、フラグメントまたはペプチドにおけるスルフィドリル基と反応させる（または最初からこのような遊離チオール基を有さない場合、遊離チオール基を含むようにすでに修飾（たとえば、上述のようなチオラクトン化により）されたホルモン、フラグメントまたはペプチドの修飾形と反応させる）。反応は遊離チオール（スルフィドリル）基のアルキル化によりチオエーテル結合を作る。構造式（IV）,（V）,（IX）,（X）,（XI）,（XII）,（XIII）および（XIV）の観察から、還元状態でSH反応基を提供するCysアミノ酸はペプチド構造のC-末端またはN-末端のいずれかに位置することがわかる。この位置によりペプチドがいずれの末端でも担体分子と化学的に連結できるようになる。さらに、構造式（XIV）,（X）,（IX ）,（X）,（IV）は、ペプチド配列のCys残基と残部とのあいだに6-プロリンスペーサー鎖（Pro）6を有する。この後者の配列は、結合した担体と天然ホルモンのフラグメントを表す配列との間に化学スペーサーを提供する。6-プロリンスペーサーは、最初に下記（リシン）残基における遊離または非遮断ε-アミノ基へSH 基（チオラクトン化）を付与することにより、たとえば構造式（II）における12 2位（リシン）に側鎖スペーサーとして添加することができる。すでに記載したように、このようなスペーサーを使用する場合、これは2-8個のアミノ酸残基を含むことが望ましい。次いで、成分“Ｘ”が６個のプロリンアミノ酸の鎖である図１の活性剤ＡまたはＢを利用して、結合を実施することができる。後者の場合、スペーサーは、中間位置たとえば構造式（II）における122位で連結した担体とペプチドの間で提供される。前者の場合、結合試薬から誘導されるスペーサーのみが担体およびペプチドを連結する。遊離アミノ基を含む担体は緩衝溶液たとえばリン酸緩衝剤において、pH6-8で塩化ナトリウム溶液中で調製されうる。この溶液へ、ジオキサンで約1-10倍から約1-40倍まで希釈したトリレンジイソシアネート（T.D.I.C.）試薬を担体へ添加する。一般的手法は、シンガー（Singer）およびシック（Schick），J.Biophysi cal and Biochem．Cytology，9,519（1961）によりすでに開示されている。添加されるT.D.I.C.の量は使用される担体の0.075-1,000モル当量の範囲である。反応は約-5℃〜約＋10℃、好ましくは０℃〜４℃で、約1/2〜２時間行う。過剰のT .D.I.C.のいずれも遠心分離により除去する。沈殿物を上述のリン酸塩緩衝液で洗い、上澄みを集める。この活性化担体溶液を次いで結合すべきホルモン、フラグメントまたはペプチドと一緒にする。ホルモン、フラグメントまたはペプチドを同じリン酸塩緩衝液（5-30 mg/ml）に溶かし、結合体におけるホルモン、フラグメントまたはペプチドに対する担体の所望のモル比をもたらすのに必要な二つの溶液の容量を一緒にする。一緒にした溶液は所望により30℃-50℃）好ましくは35℃-40℃で、3-6時間反応させる。修飾または未修飾ホルモン、フラグメントまたはペプチドの分離は、常法により、たとえばゲル濾過により行われる。Ｉ¹²⁵標識化ポリペプチドのピコグラム量を結合時に反応混合物へトレーサーとして添加し、担体へ結合したホルモン、フラグメントまたはペプチドの量（モル比）を、回収した放射能の量により測定する。修飾方法において、水溶性カルボジイミドを使用することによりホルモン、フラグメントおよびペプチドを結合する。未修飾ホルモン、フラグメントまたはペプチドのアミノ基を最初にアセチル化により保護することが好ましい。この（アセチル化）未修飾ホルモン、フラグメントまたはペプチドを次いで活性剤として 10-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを用いて担体へ結合する。この方法は、ホアレ（Hoare）およびコシュランドジュニア（KoshlandJ r.）,J.of Biological Chemistry，242,2447（1967）に一般的記載として開示されている。未修飾ホルモン、フラグメントまたはペプチドと担体との結合は、たとえばグリシンメチルエステルのような溶媒中で行われ、その間pHを約4-5、好ましくは約4.5-4.8に維持する。反応の温度はほぼ室温が都合がよく、反応は約2 -8時間、好ましくは５時間進行させる。得られた結合体は、常法により、たとえばカラムクロマトグラフィーにより精製される。結合剤としてグルタルジアルデヒドを用いて、結合体を調製してもよい。リチャード(Richards)およびノウレス(Knowles)［J．Mol．Biol.,37,231(1968)］により提案された理論に従って、市販のグルタルジアルデヒドは大部分は遊離グルタルジアルデヒドを含まず、むしろα，β-不飽和アルデヒドに富んだ非常に複雑なポリマーの混合物からなる。アミノ酸担体との反応において、これらのポリマーは遊離アミノ基を介して安定な結合を形成し、アルデヒド基を遊離したままにする。次いでこの中間体生成物をアルカリ金属ボロハイドライドたとえばホウ水素化ナトリウムの存在下に未修飾ホルモン、フラグメントまたはペプチドと反応させる。この中間体はpH7-10、好ましくは8-9で、ほぼ室温にて形成される。修飾したホルモン、フラグメントまたはペプチドはまたほぼ室温にて約1/4-2時間の反応時間後にも都合よく得られる。得られた生成物は、常法、たとえばゲル濾過、透析および凍結乾燥により純粋な形で回収される。前述の開示を通して、用語“修飾”または“結合”は、担体の分子がホルモン、フラグメントまたはペプチドにおける特定部位に化学的に付着するようになる化学的反応に関し使用されている。これが実施されるための特定メカニズムがここに詳細に記載されているとはいえ、他の適当なメカニズムも所望により使用されうる。担体がこれが修飾するホルモン、フラグメントまたはペプチドより物理的に大きな分子またはフラグメントでありうることは明らかである。明らかなことに、担体の物理的大きさは常に臨界的ではなく（本発明の結合体に使用されるT- 細胞エピトープの多くは約15-20個のアミノ酸残基しか含んでいない）、有効性に対する要求は哺乳動物の身体の反応が標的ホルモンに対する十分な量および特異性において抗体を発生させることだけである。ワクチン／結合体の投与本発明の結合体が動物の身体内部で標的ホルモンに対する抗体の形成を引き起こすために、これらは抗体の形成に対応する細胞と接触することができるようになるように動物へ投与されなければならない。実際、このことは結合体がこれらを投与する哺乳動物の循環系へ導入されなければならないことを実質的に意味する。他の形の投与の使用を絶対に排除するものではないが、実際に使用されそうな本発明の結合体のほとんどの分子サイズおよび分子量の点で、通常のルートまたは投与は腸管外投与たとえば注射によるものであろう。広範囲の場合において、投与に必要であろう結合体の量は通常の処理だけに対してはあまりに少な過ぎて、いずれの場合もほとんどの結合体の化学的性質は液体ビヒクルを含まない純粋形で製造されることを阻害する。したがって、結合体をビヒクルと一緒に含むワクチンとして本発明結合体を投与することが普通は必要である；そのようなワクチンは望ましくは本発明のワクチンであり、結合体および助剤をリン酸塩緩衝化生理食塩水溶液中に分散し、これを次いで油の混合物、好ましくはスクワレンおよびスクワランオイルおよびマンニットモノオレエートの混合物で乳化したものである。このようなワクチンにおける結合体の投与は、ワクチンを動物へ投与する場合、結合体により起こされる抗体の量が増加することがわかっている。ワクチンの投与により引き起こされる抗体の量をさらに増加するために、ワクチンにおいて免疫学的助剤を含む事が有利である。用語“助剤”とは免疫学の分野における当業者にとって普通の意味、すなわちワクチンを投与される動物の免疫反応全体を高めるであろう物質を意味するものとして使用され、すなわち助剤は非特異的免疫刺激剤である。すでに言及したように、好ましい助剤はN-アセチル-D-グルコサミン-3-イル-アセチル-L-アラ-D-イソグルタミン（ノルムラミルジペプチド）であるが、他の助剤、特に他のムラミルジペプチドも所望により使用され、たとえば、次のものを所望のにより使用できる： NAc-ノルMur-L.Ala-D.イソGln NAc-Mur-(6-0-ステアロイル)-L.Ala-D.イソGlnまたはＮグリコール-Mur-L．αＡbu-D．イソGln 本発明のワクチンおよび結合体は保護されるべき動物へ腸管外投与されるワクチンの投与の通常の形態は筋肉内および皮下注射である。使用されるワクチンの量は、もちろん治療される状態およびその深刻度を含む様々な因子によるであろう。しかしながら、一般に、大きな哺乳動物におてて、0.1-50mgの単位投与量が 1-5週間の間隔で1-5回投与されると好ましい結果が得られる。主な免疫化に続いて1-12カ月の間隔で“ブースター”免疫化を行ってもよい。本発明の結合体についての他の有用な投与法は結合体自体、またはその溶液もしくはエマルジョンを、たとえばマイクロカプセル形のような薬剤上許容されうるポリマー組成物へ入れるものを含む。次いで、マイクロカプセル封入結合体を、たとえば皮膚または筋肉内注射下で移植し、これにより結合体の調節されたおよび／または延長したおよび／または時間を定めた放出ができるようになる。引き続いて結合体のこの放出はここに記載した目的のための調節され、延長され、経験時されまたは所望による有用な抗体の上昇を引き出す。カプセル封入のために有用なポリマー組成物の例は薬剤用マイクロカプセル化についての技術において公知の薬剤上許容されうるポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマーを含む。以下の実施例を本発明に使用される特に好ましい試薬、条件および技術の詳細を示すために提供するが、これは説明だけのためである。実施例１本実施例は本発明の好ましいワクチンの調製を説明する。ペプチドの調製 β-HCG（109-145）ペプチドを、上述の米国特許第4,855,285号および同第5,00 6,334号に記載のように、固相合成により合成した。遊離チオール基を含むペプチドだけがトキソイドと結合することができ、したがって結合する前にエルマン（Elman）の方法により定量的にペプチドのチオール含有量を測定することが適切である。必要ならば、N-アセチルホモシステインチオラクトンまたはN-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルチオ）プロピオネートのいずれかを使用してペプチドに遊離チオール基をもたらしてもよい。修飾されたジフテリアトキソイドの調製ジフテリア−百日咳−破傷風ワクチンを調製するために市販され使用される型のジフテリアトキソイドを市販の供給源から得た。トキソイドは活性度1000-150 0Lf/mlを有し、保存剤として1/5000チメロサルを含む液体形状で得られた。このトキソイドに対し、エチレンジアミン（0.1M）を液体トキソイド100mlにつき2ml の比で加え、得られた混合物を限外濾過によりほぼ10倍に濃縮した。濃縮液をセファデックスG-50またはバイオゲルP-60のいずれかを用いて0.2M重炭酸アンモニウム中でゲル濾過した。非-遅延容量を集め凍結乾燥した。修飾したトキソイドのアミノ含有率を測定するために、フルオレスカミン法を使用した。修飾したトキソイドほぼ1.0mg/mlを含むサンプル溶液の少量を調製し、そして20μｌアリコートについて10^-9〜10^-8モルを含むα-N-アセチル-L-リシンサンプルの標準曲線に対し分析した。トキソイドに対するペプチドの結合マレイミド基は光感受性なので、この基を用いた以下の調製の工程は暗所または弱い照明において実施されるのが好ましい。トキソイド10⁵ダルトンにつきほぼ25個のペプチドを含む抗原結合体を調製するために、上述のように調製し化学的に修飾されたトキソイド20mgをpH6.6の0.5 Mリン酸ナトリウム緩衝剤水溶液1mlに溶かした。別に、6-マレイミドカプロン酸アシルスクシニルエステル（MCS）6.18mgを、精製しそして乾燥したジメチルホルムアミド（DMF）100μlに溶かした。得られたDMF溶液25μlを15分間かけて室温にて攪拌したトキソイド溶液へ添加した。添加完了後、得られた溶液をさらに75分間攪拌し、過剰のMCSおよび反応副産物を0-4℃にて0.1Mクエン酸ナトリウム／0.1M EDTA、pH 6.0で平衡化したセファデックスG-25上でゲル濾過により除去した。カラムから排出された活性化トキソイドをP 10膜上の限外濾過によりほぼ20mg/mlまで濃縮した。修飾したトキソイドに対しペプチドの結合を行うために、上述のように調製した修飾トキソイドの溶液を同じクエン酸ナトリウム／EDTA、pH6.0の緩衝液中のペプチド溶液へ加え、そして得られた混合物を窒素気流下に攪拌し、その間室温で18時間光から遮断した。次いで、溶液を、0-4℃にて0.2M重炭酸アンモニウムで平衡化したセファデックスG-50またはバイオゲルP60カラムに通し、ボイド流出液中に溶出した結合体を凍結乾燥した。ワクチンの調製このように調製した結合体2.0mgとノルムラミルジペプチド1.0mgをリン酸緩衝化生理食塩水0.6mlに溶かした。これと別に、スクワレン44重量部、スクワラン4 1重量部、マンニドモノオレエート11重量部およびモノステアリン酸アルミニウム４重量部を含む油混合物0.6mlを調製した。三方閉止コックを介して接続する二本のガラスシリンジを含む装置を用いて、手により乳化を行った。緩衝溶液を一つの注入器へ入れ、他の注入器に油混合物を入れ、そして混合後、得られた混合物をエマルジョンが完全に粘稠になるまで少なくとも25回両方の注入器の間を往復させた。このように製造されたワクチンは、ヒトにおける投与量0.5-1.5mlで筋肉内注射するのに好適であった。実施例２本実施例はT-細胞エピトープを含む本発明の好ましい抗原結合体の調製を説明する。これらの結合体は、上記実施例１で言及した同じ固相合成技術を用いて合成された。T-細胞ペプチドは最初に樹脂上で合成され、次いでβ−回転（β-turn）を含む４〜５個のアミノ酸残基のスペーサー配列を加えた。最後に、β−HCG（1 09-145）ペプチドをスペーサー配列のN-末端に合成した。第二の方法では、末端リシンを有するペプチドを調製した。リシンの第一のアミノ基を遮断し、ε−アミノ基を遊離状態にした。T-細胞またはβ−HCG（109-1 45）ペプチドをリシンε−アミノ基における側鎖として合成し、もう一度配列決定して正しい配列を確認した。リシンにおける遮断基を除去し、主鎖を延長し、添加した最後のアミノ酸残基は別のリシンであった。次いで、側鎖合成を繰り返した。この手段をさらに繰り返すと二つ異なったT-細胞エピトープと二つのβ-H CG（109-145）ペプチドを含むペプチドが得られた。また、本発明の好ましい方法において、Fmoc/t-ブチル技術を用いた樹脂において次の配列を有するβ-ストランド鋳型が形成された： Gly-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Gly-COOH 両方のリシンはBoc基で保護されたε−アミノ基を有する。この鋳型ペプチドのN-末端をNps-Leuの添加により保護し、次いでε−遮断基をペプチドのN-末端に隣接するリシンから除去した。その後、T-細胞エピトープを、前述の米国特許に記載のBoc／ベンジル技術を用いてリシンの遊離ε−アミノ基において組み立てた。T-細胞エピトープのN-末端をアセチル化により遮断し、次いでNpys保護基を鋳型のN-末端から除去した。ペプチドの主鎖をFmoc/t-ブチル技術を用いて延長して次の配列を作った：（Ac）Gly-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Leu-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Gly-Leu- Lys-Leu-Lys-Leu-Gly-COOH （式中、“（Ac）”により示されるように、N-末端はアセチル化により保護された（Gly-Ser-Pro-Leu配列は鋳型にβ-回転スペーサーを提供する。））。 ε-遮断基をペプチドのN-末端に隣接するリシンから除去し、B-細胞エピトープをFmoc/t-ブチル技術を用いてリシンの遊離ε-アミノ基において組み立てた。B- 細胞エピトープのＮ末端をアシル化により遮断した。最後に、t-ブチルおよびBo c保護基をTFAで除去し、次いで低／高HF処理によりペプチドを樹脂から開裂した。以下のT-細胞エピトープを含む結合体をこれら二つの方法により調製した：ａ．破傷風トキソイドのアミノ酸 580-599 ｂ．破傷風トキソイドのアミノ酸 830-844 ｃ．破傷風トキソイドのアミノ酸 916-932 ｄ．破傷風トキソイドのアミノ酸 947-967 ｅ．麻疹ウィルスタンパク質のアミノ酸 288-302 ｆ．Ｂ型肝炎ウィルスタンパク質のアミノ酸 16-33 ｇ．マラリアCSPタンパク質のアミノ酸 317-336

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ｊ 9284−4ＣＴ 9284−4Ｃ 47/28 Ｚ 7433−4Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】１．タンパク質生殖性ホルモン、このようなホルモンのフラグメントまたはこのようなホルモンまたはフラグメントと実質的に免疫学に均等なペプチドの抗原結合体；助剤；および少なくとも一つの油からなり、結合体と助剤は水性媒体に分散して水相を形成し、この水相は少なくとも一つの油で乳化されてなり、抗原結合体は化学的に修飾されたジフテリアトキソイドと結合したホルモン、フラグメントまたはペプチドを含み、そして水相が油の混合物と乳化されていることを特徴とするワクチン。２．ホルモン、フラグメントまたはペプチドがヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニット、そのフラグメントまたはこれらと実質的に免疫学的に均等なペプチドである請求項１のワクチン。３．フラグメントまたはペプチドはヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのアミノ酸109-145に相当する配列またはこれらと実質的に免疫学的に均等な配列を有する請求項１のワクチン。４．化学的に修飾されたジフテリアトキソイドがジフテリアトキソイドとエチレンジアミンとの反応生成物である前記請求項のいずれか１項のワクチン。５．抗原結合体が化学的に修飾されたジフテリアトキソイド10⁵ダルトン当たり2 0-30個のペプチドを含む前記請求項のいずれか１項のワクチン。６．助剤がN-アセチル-D-グルコサミン-3-イル-アセチル-L-アラ-D-イソグルタミン（ノルムラミルジペプチド）である前記請求項のいずれか１項のワクチン。７．油混合物がスクワレンおよびスクワランからなる前記請求項のいずれか１項のワクチン。８．さらにマンニドモノオレエートおよびモノステアリン酸アルミニウムの少なくとも一つを含む請求項７のワクチン。９．油混合物がスクワレン35-45重量％、スクワラン35-45重量％、マンニドモノオレエート6-16重量％およびモノステアリン酸アルミニウム1-5重量％を含む請求項８のワクチン。 10．抗原結合体0.5-2.0mgが最終エマルジョン１ml当たり存在する前記請求項のいずれか１項のワクチン。 11．助剤0.2-1.0mgが最終エマルジョン１ml当たり存在する前記請求項のいずれか１項のワクチン。 12．水相と油混合物をほぼ等量含む前記請求項のいずれか１項のワクチン。 13．水相がリン酸塩緩衝化生理食塩水である前記請求項のいずれか１項のワクチン。 14．悪性腫瘍疾患にかかっているヒトを治療するための前記請求項のいずれか１項のワクチンの使用。 15．．乳癌、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫または膀胱癌にかかっているヒトを治療するための前記請求項のいずれか１項のワクチンの使用。 16．請求項1-13のいずれか１項のワクチンを哺乳動物へ投与し、哺乳動物からの抗体および／またはリンパ腫細胞を回収することからなる、タンパク質または生殖性ホルモンに対する抗体を産生するかおよび／またはこのような抗体を発現することのできるリンパ腫細胞を産生する方法。 17．抗体および／またはリンパ腫細胞が請求項16の方法により産生されるものである、タンパク質または生殖性ホルモンに対する抗体、このような抗体を発現しうるリンパ腫細胞、およびこのようなリンパ腫細胞から誘導されるハイブリドーマ細胞。 18．タンパク質生殖性ホルモン、このようなホルモンのフラグメントまたはこのようなホルモンまたはフラグメントと実質的に免疫学的に均等なペプチドの抗原結合体であって、このホルモン、フラグメントまたはペプチドが、結合体で処理されるべき動物に対して外来性のタンパク質の少なくとも一つのT-細胞リンパ球エピトープの配列または実質的にこれと免疫学的に均等な配列を有するエピトープペプチドと結合している前記抗原結合体。 19．ホルモン、フラグメントまたはペプチドがヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニット、そのフラグメントまたは実質的にこれと免疫学的に均等なペプチドである請求項18の抗原結合体。 20．フラグメントまたはペプチドがヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのアミノ酸109-145または111-145に相当する配列を有するかまたは実質的にこれと免疫学的に均等な配列を有する請求項19の抗原結合体。 21．エピトープペプチドが以下に相当する配列；ａ．破傷風トキソイドのアミノ酸 580-599 ｂ．破傷風トキソイドのアミノ酸 830-844 ｃ．破傷風トキソイドのアミノ酸 916-932 ｄ．破傷風トキソイドのアミノ酸 947-967 ｅ．麻疹ウィルスタンパク質のアミノ酸 288-302 ｆ．Ｂ型肝炎ウィルスタンパク質のアミノ酸 16-33 ｇ．マラリアCSPタンパク質のアミノ酸 317-336 または実質的にこれと免疫学的に均等な配列を有する請求項18から請求項20のいずれか１項の抗原結合体。 22．ホルモン、フラグメントまたはペプチドがアミノ酸残基約２〜約８個を含むスペーサーペプチドを介してエピトープペプチドと結合する請求項18から請求項 21のいずれか１項の抗原結合体。 23．ヒトにおいて受精をコントロールし、または悪性腫瘍疾患を治療する請求項 18から請求項22のいずれか１項の抗原結合体の使用。 24．乳癌、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫または膀胱癌にかかっているヒトの治療のための請求項23の使用。 25．請求項18から請求項22のいずれか１項の抗原結合体二つ以上の混合物を用いる請求項23または24の使用。 26．タンパク質生殖性ホルモンに対する抗体および／またはこのような抗体を発現しうるリンパ腫細胞を調製する方法であって、該方法が修飾したポリペプチドを哺乳動物へ導入し、これにより哺乳動物に抗体を形成させ、哺乳動物から抗体および／またはリンパ腫細胞を回収するものであり、使用する修飾ポリペプチドが請求項16-20のいずれか１項の抗原結合体である前記方法。 27．抗体および／またはリンパ腫細胞が請求項26の方法により産生されることからなるタンパク質または生殖性ホルモンに対する抗体、このような抗体を発現しうるリンパ腫細胞およびこのようなリンパ腫細胞から誘導されるハイブリドーマ細胞。 28．哺乳動物からの身体の組織または体液を下記タンパク質と反応しうる請求項 26の方法により産生した抗体と接触させ、抗体とタンパク質の間に複合体が形成されるかまたは形成されないことを観察することからなる、哺乳動物におけるタンパク質の存在または不存在を決定しまたは哺乳動物におけるタンパク質の量を検定する方法。 29．請求項26の方法により生成された抗体、リンパ腫細胞またはハイブリドーマ細胞の哺乳動物における病気治療への使用。