JPH08501684A - トウモロコシ花粉特異的ポリガラクツロナーゼ遺伝子 - Google Patents
トウモロコシ花粉特異的ポリガラクツロナーゼ遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、花粉特異的プロモーターとして機能することができ且つ花粉における遺伝子の発現に関与するトウモロコシから単離された単離精製DNA配列に係る。本発明は更に、通常は花粉では発現されない遺伝子に花粉特異性を付与するための方法にも係る。
Description
【発明の詳細な説明】
トウモロコシ花粉特異的ポリガラクツロナーゼ遺伝子産業上の利用分野
本発明は真核細胞においてプロモーターとして機能し得る単離精製DNA配列
に係る。より特定的には、本発明は花粉特異的プロモーターとして機能し、花粉
における遺伝子の発現に関与する、トウモロコシからの単離精製DNA配列に係
る。本発明は更に、通常は花粉では発現されない遺伝子に、花粉特異的に発現さ
れる能力を付与するための方法にも係る。発明の背景
トウモロコシにおける雄性配偶子形成は生化学的及び細胞学的に十分に特徴付
けられているが、被子植物生活環においてこの重要なプロセスを制御する分子事
象は現時点ではほとんど解明されていない。トウモロコシ花粉母細胞から高度に
特殊化した三核花粉粒への複雑な分化は、雄性配偶子形成が多数の遺伝子産物の
逐次生産を含むことを示唆している。しかしながら、花成植物において雄性配偶
子形成に関与する遺伝子はほんの少数しか単離されていない。
雄性配偶子形成中に発現された2種の転写物の同定から葯における遺伝子の連
続発現が立証され(Mascarenhas 1990)、「初期」遺伝子は減
数***後に発現され、その発現レベルは花粉粒の成熟につれてまず増加した後、
低下する。「後期」遺伝子は小胞子有糸***後に現れ、成熟花粉で最大まで増加
する。約20,000個の遺伝子がトウモロコシ花粉で発現されると推定され(
Willingら,1988)、恐らく10%までが花粉特異的である(Sti
nsonら,1987)。トウモロコシからクローニングされた花粉特異的遺伝
子として報告されているのはZm13(Hansonら,1989)及びZm5
8(Mascarenhas 1990)のみである。これらの遺伝子の発現は
まず小胞子有糸***後に検出することができ、成熟花粉で最大まで増加する。Z
mc13はその予想アミノ酸配列に関してKunitzトリプシンインヒビター
タンパク質及びトマト葯発現遺伝子LAT52との間に相同を示す(Hanso
nら,1989)。Zm58はその予想アミノ酸配列に関してペクチン酸リアー
ゼとの間に相同を示す(Mascarenhas 1990)
。この類における遺伝子産物は花粉発芽及び/又は花粉管成長に関与し、「初期
」遺伝子の産物は小胞子発生に関与する可能性が高いと推測される。
配列比較及び突然変異誘発実験の結果、所定のDNA配列モチーフがトマトに
おけるLAT遺伝子の花粉発現の制御に関与していると予想された(Twell
ら,1991)。ペチュニアにおける葯特異的発現に関与する領域の推定同定に
は、配列比較が単独で使用された(van Tunenら,1989)。
現在、花粉発生に固有の機能の組織特異的発現に関与し得るトウモロコシゲノ
ムでシス作用すると思われる配列はほとんど知られていない。他方、トウモロコ
シクローンZm13はトマトLAT遺伝子で同定された提案花粉ボックスと数個
の相同領域を有する。
Rogersら,1991は、その予想アミノ酸配列に関して真核及び原核両
種からのポリガラクツロナーゼ(PG)との間に相同を示すトウモロコシからc
DNAクローン3C12(その5’末端は不完全)を単離したことを記載してお
り、このようなPGはOenothera or ganensis
からの花粉発現PG(Brown及びCrouch 1990
)を含む。ポリガラクツロナーゼはトウモロコシ及び他の単子葉植物種の花粉で
検出された(Pressey及びReger 1989)。花粉粒におけるポリ
ガラクツロナーゼの機能は、ペクチンを加水分解し、花粉管細胞壁の前駆物質と
して使用可能な成分を提供することにより花粉管から絹毛への成長に関与するこ
とであるか、又は花粉管を貫入させるように絹毛内の細胞材料の分解に関与する
ことであると思われる。Allen及びLonsdale(公開特許明細書)も
、トウモロコシクローン3C12の5’末端をプローブとして使用することによ
り、4個のゲノムPGクローンを単離したことを記載している。PGゲノムクロ
ーンの3個の配列分析によると、ポリガラクツロナーゼは多重遺伝子族に属する
と推測される(Allen及びLonsdale、公開特許明細書)。トマトか
ら単離され、果実登熟に関与するポリガラクツロナーゼ遺伝子(Grierso
nら,1986)はトマトゲノム中に単一コピーで存在する。Brown及びC
rouch(1990)は、Oenothera or ganensis
の花粉cDNAライブラリーからのポリガラクツロナーゼとの
間に相同を有する少なくとも6個のユニークなcDNAクローンを単離し、多重
PG遺伝子が該種の花粉で発現されることを示唆している。
トウモロコシの予想される2,000種の花粉特異的遺伝子のうちで特徴付け
られているものは2種に過ぎない。米国特許第5,086,169号(’169
)は、トウモロコシで発現された未同定遺伝子から単離された花粉特異的プロモ
ーターZm13のヌクレオチド配列を開示している。花粉特異的プロモーター配
列は花粉のみに存在するmRNAにハイブリダイズするDNA領域から上流の1
315塩基対から構成される。これはHansonら(1989)により記載さ
れていると同一の花粉特異的プロモーターである。
本発明の目的は、花粉特異的プロモーターとして作用することが可能なDNA
配列を単離及び特徴付けることである。より特定的には、本発明の目的は、花粉
特異的ポリガラクツロナーゼ遺伝子に由来する花粉特異的プロモーター領域を単
離及び特徴付けることである。発明の要約
本発明はトウモロコシ近交系W22の花粉特異的遺伝子のプロモーター領域か
らの単離精製DNA配列に係る。単離精製DNA配列は主に図3に示す配列から
構成される。本発明は更に、ポリガラクツロナーゼの花粉特異的プロモーター領
域に対応する単離精製DNA配列に係る。本発明は更に、図3に示すトウモロコ
シ近交系W22の花粉特異的遺伝子のプロモーター領域(配列番号1)からの単
離精製DNA配列に係り、該配列は、
a)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約80塩基対(配列番号2)
、
b)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約347塩基対(配列番号3
)、
c)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約377塩基対(配列番号4
)、
d)プロモーター領域の3’末端から上流のDNAの約1〜約464塩基対(配
列番号5)、
e)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約595塩基対(配列番号6
)、
f)プロモーター領域の3’末端から上流のDNAの約1〜約1579塩基対(
配列番号7)、及び
g)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約2687塩基対(配列番号
8)
から構成される群から選択される。
本発明は更に、
a)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約80塩基対(配列番号2)
、
b)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約347塩基対(配列番号3
)、
c)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約377塩基対(配列番号4
)、
d)プロモーター領域の3’末端から上流のDNAの約1〜約464塩基対(配
列番号5)、
e)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約595塩基対(配列番号6
)、
f)プロモーター領域の3’末端から上流のDNAの約1〜約1579塩基対(
配列番号7)、及び
g)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約26
87塩基対(配列番号8)
から構成される群から選択されるDNA配列で野生型プロモーターを置換した遺
伝子を含む花粉特異的キメラ遺伝子に係る。本発明は、トランスファーベクター
を更に含む花粉特異的キメラ遺伝子にも係る。
本発明の別の態様は、遺伝子に花粉特異的発現を付与するための方法に係り、
該方法は、
a)遺伝子の野生型プロモーター領域を図1に示す配列から主に構成される花粉
特異的プロモーター領域で置換し、花粉特異的キメラ遺伝子を生成する段階と、
b)花粉特異的キメラ遺伝子をトランスファーベクターに導入する段階と、
c)キメラ遺伝子を同化及び発現することが可能な花粉に、花粉特異的キメラ遺
伝子を含むトランスファーベクターを導入する段階と、
d)花粉におけるキメラ遺伝子の発現を試験する段階とを含む。
本発明は更に、遺伝子に花粉特異的発現を付与するための花粉特異的プロモー
ター領域が、
a)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約80塩基対(配列番号2)
、
b)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約347塩基対(配列番号3
)、
c)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約377塩基対(配列番号4
)、
d)プロモーター領域の3’末端から上流のDNAの約1〜約464塩基対(配
列番号5)、
e)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約595塩基対(配列番号6
)、
f)プロモーター領域の3’末端から上流のDNAの約1〜約1579塩基対(
配列番号7)、及び
g)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約2687塩基対(配列番号
8)
から構成される群から選択される、上記方法にも係る。
本発明の方法は更に、タバコ花粉への本発明のキメラ遺伝子の導入にも係る。
本発明の方法は更に、遺伝子がβ−グルクロニダーゼである本発明のキメラ遺伝
子の導入にも係る。本発明の方法は更に、微小発射体撃ち込みによる花
粉及び植物へのキメラ遺伝子の導入にも係る。
本発明は更に、
a)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約80塩基対(配列番号2)
、
b)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約347塩基対(配列番号3
)、
c)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約377塩基対(配列番号4
)、
d)プロモーター領域の3’末端から上流のDNAの約1〜約464塩基対(配
列番号5)、
e)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約595塩基対(配列番号6
)、
f)プロモーター領域の3’末端から上流のDNAの約1〜約1579塩基対(
配列番号7)、及び
g)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約2687塩基対(配列番号
8)
から構成される群から選択されるDNA配列を含む形質転換花粉にも係る。
本発明は更に、
a)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約80塩基対(配列番号2)
、
b)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約347塩基対(配列番号3
)、
c)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約377塩基対(配列番号4
)、
d)プロモーター領域の3’末端から上流のDNAの約1〜約464塩基対(配
列番号5)、
e)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約595塩基対(配列番号6
)、
f)プロモーター領域の3’末端から上流のDNAの約1〜約1579塩基対(
配列番号7)、及び
g)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約2687塩基対(配列番号
8)
から構成される群から選択されるDNAで形質転換されたタバコ花粉にも係る。図面の簡単な説明 図1
種々のトウモロコシ組織からのRNAのノーザンブロッ
ト。各レーンは1:花粉、2:出芽した雄穂、3:出芽中の雄穂、4:出芽前雄
穂、5:子葉鞘、6:葉、7:根、8:穂軸、9:絹毛からのポリA+ RNA
2μgをcDNAクローン3C12でプローブした。図2
アンチセンス(i)及びセンス(ii)プローブでプローブしたトウモロコシ葯
及び花の切片と3C12 cDNAとのin situハイブリダイゼーション
。(A)減数***前段階(PM)及び減数***段階(M)の葯を有するトウモロ
コシ小穂の切片。(B)最初の花粉有糸***段階におけるトウモロコシ葯の切片
。(C)裂開直前のトウモロコシ葯の切片。図3
(A)W2247の上流2.87kbpのヌクレオチド配列(配列番号1)。
ATG開始部位及び推定“TATA”ボックスを下線で示す。PBコアモチーフ
及びLAT56/59ボックスとの相同を上線で示し、転写開始を矢印で示す。
指示した数字は転写開始部位に対する位置である。
(B)トウモロコシ(配列番号10)及びタバコ(配列
番号9)PG遺伝子の上流領域間の相同。図4
(1)花粉からのPoly A+RNA、(2)花粉RNA全体、(3)穂軸
からのPoly A+RNA及び(4)tRNA上でプライマー(配列番号11
)“GTTGCCTGGGCACTAGG”を使用したプライマー伸長。W22
47で同一プライマーを使用して配列ラッダーを得た。*は主要転写開始を示し
、・は副産物を示す。本図は配列番号12を示す。図5
NcoI及びBamHIで消化し、クローンB7317からの1.3kbp
NcoIプローブでプローブしたトウモロコシからのゲノムDNAのサザンブロ
ット。コピー数標準はW2247の直鎖化3.3kbpサブクローンとした。図6
W2247の上流領域におけるPBコアモチーフ及びLAT56/59ボック
スとの相同。本図は配列番号13〜19を示す。図7
β−グルクロニダーゼコーディング領域へのW2247の上流領域の翻訳融合
。図8
p47.427の5’欠失誘導体。図9
トランジェントアッセイシステムにおける完全長p47.427(配列番号8
)及び5’欠失誘導体の相対プロモーター活性。各被験プラスミドに撃ち込みを
3回ずつ繰り返して実施し、結果をルシフェラーゼ活性に対するGUSの比とし
て表す。転写開始部位までの5’末端側上流領域の寸法を示す。図10
トウモロコシ及びタバコの組織に転写及び翻訳融合物と欠失誘導体を撃ち込ん
だ。X−Gluc染色後、活性を青色スポットの有無として表した。NTは試験
せずを意味する。発明の詳細な説明
材料及び手法RNA単離及びノーザン分析
温室栽培植物から組織を回収し、液体窒素中で迅速に凍結し、−70℃で貯蔵
した。暗所で4〜5日間22℃で穀粒を発芽させることにより子葉鞘及び根を得
た後、上述のように凍結した。ポリA+RNAをBaulcombe及びBuf
fard(1983)の方法により単離した。Maniatisら(1982)
に従ってホルムアルデヒド含有ゲルからGenescreenプラス膜(DuP
ont Wilmington,Delaware)にノーザンブロットにより
移行させ、cDNAクローン3C12(Rogersら,1991)のランダム
プライムドプローブ(Feinberg及びVogelstein,1987)
でプローブした。50%ホルムアミド;5×SSC(20×SSC=3Mクエン
酸ナトリウム・2H2O,pH7.0);10×Denhardt溶液(Den
hardt溶液=20g/l Ficoll 400,20g/1ポリビニルピ
ロリドン、10gウシ血清アルブミン[フラクションV]):100μg/ml
ニシン***DNAの溶液中で42℃でフィルターをハイブリダイズし、65℃
で0.1×SSC;0.1%SDSで洗浄した。サザン分析
Dhillonら(1980)の方法によりゲノムDNAを単離し、制限エン
ドヌクレアーゼで消化し、電気泳動により分離し、Rigaudら(1987)
のアルカリ移行法によりナイロン膜に移行させた。紫外線照射によりDNAを膜
に架橋させた。フィルターをランダムプライムド32P標識DNAフラグメント(
Feinberg及びVogelstein,1987)でプローブし、5×S
SC、5×Denhardt溶液、0.1%SDS及び剪断変質ニシン***DN
A100μg/mlの溶液中で65℃でハイブリダイズした。0.1×SSC、
0.1%SDS中で65℃で洗浄し、フィルターを−70℃でオートラジオグラ
フィーにかけた。配列決
定
Murphy及びKavanagh(1988)により二重鎖鋳型に適応する
ように改変したSangerら(1977)のジデオキシチェーンターミネーシ
ョン法を使用して配列決定を行った。Henikoff(1987)の
方法に従ってエキソヌクレアーゼIII及びS1ヌクレアーゼで消化することによ
り1組の入れ子式鋳型を生成した。M13プライマーを使用して配列決定反応を
開始した。プライマー伸長
標準プロトコル(Ausubelら,1987)により花粉RNAのプライマ
ー伸長を実施した。Maniatisら(1982)に従ってポリヌクレオチド
キナーゼを使用してγ標識オリゴヌクレオチドを生成した。4×105cpmの
プローブを反応で使用した。6%ポリアクリルアミド配列決定ゲル上で電気泳動
後、−70℃でオートラジオグラフィーにより伸長産物を分析した。in situハイブリダイゼーション
pUBS3クローニングしたcDNA、3C12からin situハイブリ
ダイゼーションに使用するリボプローブを生成した。pUBS3はAatII及び
NdeIで消化することによりpUC18からDraI部位を除去した後、T4
ポリメラーゼで平滑末端化し、平滑末端を相互に連結して形質転換することによ
り調製した。得られたプラスミドをPvuIIで消化し、ポリリンカーフラグメン
トを
除去し、StratageneベクターBluescript(登録商標)KS
(Stratagene,La Jolla CA)からの対応するPvuIIフ
ラグメントを挿入した(Murphyら,1992)。
3C12 cDNAを含むプラスミドpUBS3を直鎖化し、4mM Tri
sHCl;8mM MgCl2;2mMスペルミジン;50mM NaCl;1
mM ATP,GTP及びCT;0.65mM UTP;0.35mMDIG−
UTP(Boehringer Mannheim Cat No.1209
256);25u RNアーゼインヒビターを含有する反応体でT3及びT7ポ
リメラーゼを使用して1μgをin vitro転写し、夫々センス及びアンチ
センスプローブを生成した。ジゴキシゲニン(DIG)標識及び35S標識プロー
ブの両者を使用した。組織をホルムアルデヒドで固定し、パラフィンろうに埋め
込み、15μm厚に薄片化し、Jackson(1991)の記載に従ってハイ
ブリダイズした。放射性プローブで標識した切片を2週間エマルジョンに暴露し
た。Boehringer Mannheim Nucleic
Acid Detection Kit(Cat No.1175 041)を
使用し、<DIG>アルカリホスファターゼ(AP)複合体の1:3000希釈
液100μl/スライドを加え、4℃で一晩インキュベートする修正を加え、D
IG標識プローブの検出を行った。色検出反応を4〜5時間実施した後、TE(
10mM Tris HCl pH7.5;1mM EDTA)で反応を停止し
た。微小発射体撃ち込み
Twellら(1989)の方法を使用してタバコ花粉粒の撃ち込みを行った
。プラスミドDNAをLonsdaleら(1990)に記載されているように
スペルミジンの存在下でタングステン微小発射体に吸着させた。この試験で使用
したリポーター遺伝子は大腸菌β−グルクロニダーゼ(GUS)又はホタルルシ
フェラーゼであった。プレート当たり花粉10mgに撃ち込みを行った。撃ち込
みを行ったプレートを明所で一晩25℃でインキュベートした後、β−グルクロ
ニダーゼ及びルシフェラーゼ活性を定量した。GUS活性はJefferson
(1987)の方法に従って蛍光定量アッセイを使用して決定した。ルシフェ
ラーゼ活性はOwら(1986)の方法に従って定量し、Bertholdルミ
ノメーターで測定した。完全組織の撃ち込みにあたっては、スクロース及び1%
寒天を補充したMS培地に組織を入れてWhatman No.1濾紙上に置き
、欠失誘導体単独を撃ち込んだ。プレートを明所で25℃で2日間インキュベー
トした後、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−グルクロン酸(
X−Gluc)(1mg.ml);50mMリン酸ナトリウム pH7.0;0
.1mMフェリシアニド;0.1% Triton X−100の溶液に組織を
移し、6時間37℃でインキュベートした。花粉サンプルでは、ナイロン膜をX
−Gluc溶液に浸漬したWatmann No.1濾紙に移し、上述のように
インキュベートした。GUSを発現する組織はこのシステムで青色に染色する。ポリガラクツロナーゼ発現の空間特異性
上記ポリガラクツロナーゼ3C12 cDNAを使用して、葯、種々の成熟段
階の雄穂、花粉、絹毛、穂軸、葉、根及び子葉鞘から単離したトウモロコシポリ
A+mRNAを含むノーザンブロットをプローブした。葯mRNA調製
物の全てと成熟花粉で約1.5kbpの転写物が検出された(図1)。該転写物
は未成熟葯では低レベルであり、成熟花粉で最大レベルまで増加した。栄養組織
サンプルから単離したmRNAとのハイブリダイゼーションは認められなかった
。
葯の内部の転写物の細胞特異性を決定するために、3C12 cDNAから合
成してジゴキシゲニン−UTPで標識したセンス及びアンチセンスリボプローブ
を使用してin situハイブリダイゼーションを実施した。ノーザンハイブ
リダイゼーションの結果と一致して、穂軸、葉、絹毛又は根切片にはセンス又は
アンチセンスプローブのいずれのハイブリダイゼーションも検出されなかった。
葯の色、葯長と包穎長の比及び植物上の雄穂の位置により判定した(Chang
及びNeuffer 1989)種々の発生段階の葯の切片を同様にセンス及び
アンチセンスプローブでプローブした。小穂内の各トウモロコシ小花は3本の葯
2組を含み、そのうち2組は異なる発生段階であった。3本の減数***前の葯と
3本の減数***葯の横断切片はセンス又はアンチセンスプローブとのハイブリダ
イゼーショ
ンを示さなかった(図2A)。他方、最初の花粉有糸***段階の葯の横断切片は
アンチセンスプローブのみが成熟中の小胞子とのハイブリダイゼーションを示し
た(図2B)。葯壁又はタペート細胞層とのハイブリダイゼーションは認められ
なかった。裂開直前の成熟花粉を含む葯の横断切片は、最初の花粉有糸***段階
と同一のハイブリダイゼーションパターンを示した(図2C)。35S標識リボプ
ローブを使用した処、発現は花粉粒に局在し、被験胞子体組織には全く検出され
なかった。これらのデータは、この特定ポリガラクツロナーゼ遺伝子の発現が花
粉特異的であることを裏付けるものである。PGゲノムクローンの単離
EMBL3で作成したトウモロコシのライブラリー(Allen及びLons
dale、公開特許明細書)から4個のゲノムクローンを単離した。クローンの
うちでB73、B7317及びB7339種のライブラリーから単離した2個の
クローンは完全長であった。W22、W2247及びW2265種のライブラリ
ーから単離した残りの2個のクローンは3’末端が不完全であった。DNA配列
分析の
結果、これらの4個のクローンはそのコーディング配列の相同度が高い(>99
%)ことが判明し、同一の遺伝子族に属すると思われる。完全長クローンはイン
トロンを含まない。クローンW2247の予想ATG開始部位から上流のDNA
の2.87kbpのヌクレオチド配列を決定した(図3)。他の3個のクローン
の制限配列決定の結果、4個のクローンの上流領域はコーディング領域と同様に
ヌクレオチド配列の相同度が高いことが判明した。クローンW2247の転写開始部位のマッピング
クローンW2247の転写開始部位(配列番号1)を花粉RNAのプライマー
伸長によりマッピングした。推定翻訳開始部位に対して−53bp位のプライマ
ー(配列番号20)(GTTGCCTGGGCACTAGG)をポリA+RNA
にアニールし、材料と手法の項に記載したように伸長させ、155bpの主産物
を得た(図4)。158bpの副産物も得られたことから、遺伝子は2個の転写
開始点を有するか、又は副産物は遺伝子族の他の員からの転写開始に相当すると
予想される。ポリA+RNAの代わりに基質として全RNAを使用してプライマ
ー伸長を行った結
果、155bp、158bpの産物と共に、もっと大きい数個の産物が得られた
。これらの産物はオリゴクレオチドと他の無関係の非ポリA+転写物とのハイブ
リダイゼーションに起因すると思われる。更に、116bpの産物も生成された
。この産物はtRNAを基質として使用した場合にも合成されたので、恐らくア
ーチファクトに相当する。155bp産物は、予想ATG翻訳開始部位に対して
188bpのA残基から転写が開始されたことを立証した。推定TATAモチー
フ“TATTTAA”はこの転写開始部位に対して−35bpに位置する。トウ
モロコシのZm13花粉特異的遺伝子では転写開始部位に対して−34bpにも
同一の配列が検出された(Hamiltonら,1989)。遺伝子コピー数
材料と手法の項に記載したようにサザンブロット分析によりポリガラクツロナ
ーゼ遺伝子のコピー数を決定した。トウモロコシB73からの完全ゲノムDNA
をNcoI及びBamHIで消化し、電気泳動により分離し、ナイロン膜にブロ
ットし、クローンB7317の1.3kbp N
coIフラグメントでプローブした。このプローブは多重バンドにハイブリダイ
ズした(図5)。これらのバンドを遺伝子コピー数標準と比較した処、細胞当た
り>5のコピーとして存在することが判明し、遺伝子は同一遺伝子族に属すると
予想された。より弱いハイブリダイジングバンドは、プローブとして使用した花
粉特異的クローンとの相同度が低い非花粉特異的なPG遺伝子族に属し得る。花
粉特異的トウモロコシPG遺伝子が多重遺伝子族に属するという予想は、O.o rganensis
の花粉特異的PGcDNAクローンで得られた結果(Bro
wn及びCrouch 1990)及びトウモロコシPGの3個のゲノムクロー
ンの制限地図とヌクレオチド配列の比較から得られた本発明者らの比較(All
en及びLonsdale、公開特許明細書)に一致する。配列分析
クローンW2247の上流配列の2.87kbp(配列番号1)を材料と手法
の項に記載した方法により配列決定し、他の葯及び花粉特異的遺伝子で同定され
た潜在的シス作用配列との相同を分析した。配列を図3に示す(配列番
号1)。トマトからの3個の花粉発現遺伝子の上流領域の分析(Twellら,
1991)の結果、花粉における発現に重要な2個のシス作用配列が判明した。
これらの配列は、“TGTGGTT”(PBコアモチーフと命名)及び“GAA
PuTTGTGA”(LAT56/59ボックスと命名)であった。その突然変
異によりプロモーターの活性が低下するモチーフ“GTGG”及び“GTGA”
もZm13及びペチュニアCHIAPA2遺伝子の上流領域に存在する(van
Tunenら,1989)。トウモロコシPG遺伝子の上流領域の2.87kb
pに、本発明者らは、“GTGG”モチーフを含むPBコアモチーフとの間に少
なくとも5/7の一致を有する7個の配列を見出した(図6)。“GTGA”モ
チーフを含むLAT56/59ボックスとの間に少なくとも7/10の一致を有
する6個の配列も知見された。
提案されたATG開始部位はLutcke(1987)により提案されたコン
センサス植物翻訳開始領域との間に67%の相同を有しており、フレームメチオ
ニンコドン中の最初の部位であるので適正なATG開始部位であると予
想される。
クローンW2247の上流領域(配列番号1)をZm13の上流領域と比較し
た結果、ある程度の相同が認められたが、2個の遺伝子における転写開始部位か
らの距離は異なっていた。クローンW2247の上流領域には、Zm13の上流
配列(配列番号1)に存在する構造に類似する一連の直接反復が存在する。これ
らの構造の機能は未だ解明されていない。相互間の唯一の顕著な相同は同一の推
定TATAボックス“TATTTAA”であった。同一組織で組織特異的に発現
される同一種からの遺伝子の上流領域におけるこの相同の不在は、他の遺伝子組
でも報告されている(McCormick 1991)。一部の葯及び花粉発現
遺伝子の上流領域でHamiltonら(1989)により同定されたモチーフ
との間にある程度の配列相同が認められた。他方、これらの配列が発現に関与す
るという証拠はない。クローン2247の上流領域とBrassica nap us
(Albaniら,1991)からの2個の花粉特異的遺伝子の上流領域の
保存配列との間に目立った相同は認められない。
ポリガラクツロナーゼ(PG)のタバコ遺伝子はクローニング及び配列決定さ
れている(Tebbutt及びLonsdale、未公開特許明細書)。コーデ
ィング領域の上流のタバコ及びトウモロコシPGのヌクレオチド配列を比較した
処、1個の領域を除き相同はほとんど認められない。この配列は報告されている
他の花粉特異的遺伝子の上流領域には存在しないので、花粉特異的発現の絶対要
件であるとは思われない。この配列は、夫々の転写開始部位に対して類似の位置
即ちトウモロコシでは−117bpに存在し、タバコでは−140bpに存在す
る。この配列内に保存された9bpは、トマトで果実登熟に関与するPGの上流
領域−700bpにも存在する。トウモロコシ及びタバコPG遺伝子の花粉特異
的発現におけるこの配列の関与は目下研究中である。好適態様の説明 クローンW2247及び欠失誘導体のプロモーター活性
クローンW2247の完全上流領域(配列番号1)を大腸菌β−グルクロニダ
ーゼ(GUS)遺伝子のコーディング領域に融合し、このトウモロコシプロモー
ターによる有
効な遺伝子発現のアッセイのためのキメラ遺伝子を生成した(図7)。無プロモ
ーターGUS遺伝子及びnosターミネーター配列を含むpUCをベースとする
ベクターであるpTAK1(Jeffersonら,1987)の平滑末端化B
amHIに、クローンW2247からの2.75kbpの平滑末端化ApaLI
フラグメントを融合することにより、翻訳融合物p47.427(配列番号8)
を生成した。こうしてp47.427(配列番号8)は+10bpで天然ATG
に融合され、クローンW2247からの3個のコドンとGUSコーディング領域
のATGに先行するベクターからの8個のコドンを含んでいた。平滑末端化完全
上流領域を含むp47.427のSmaI/SalIフラグメントの融合により
逆転写融合物p47.430を生成し、SmaI及びSalIで切断して平滑末
端化したpTAK1に逆向きに挿入した。
花粉特異的発現に関与する上流領域の区域を限定するために、Henikof
f(1989)の方法に従ってインサート(図8)の5’末端からp47.42
7の1組の入れ子式欠失誘導体(配列番号8)を生成した。材料と手法
の項に記載したようにタバコ花粉の微小発射体撃ち込み(Twellら,199
0)に基づくトランジェントアッセイシステムを使用して欠失誘導体のプロモー
ター活性をアッセイした。タバコ形質転換実験の結果、クローンW2247の上
流領域の2.687kbpは天然バックグラウンドにおける活性と同様にGUS
遺伝子の発現を活性化し得ることが判明した(Allen及びLonsdale
、未公開特許明細書)。タバコ花粉に欠失分子を及び参照プラスミドを同時に撃
ち込んだ。参照プラスミドは撃ち込み間で標準化するために使用し、ホタルルシ
フェラーゼコーディング領域及びnosターミネーターに融合した花粉発現アク
チン遺伝子の上流領域から構成した。各撃ち込みでルシフェラーゼに対するGU
Sの相対活性として活性を測定した。被験プラスミドの各々に3回ずつ撃ち込み
を繰り返し実施した。
図8は本発明の好適態様を図示するものである。欠失誘導体D16.6(配列
番号5)は本発明のより好適な態様に相当する。図9は上記トランジェント発現
システムでアッセイした場合の欠失誘導体の活性を示す。欠失誘導体はす
べて完全長配列p47.427(配列番号8)に類似の活性を示した。他方、上
流領域の464bpを含むより好適な態様D16.6(配列番号5)は完全長ク
ローンp47.427(配列番号8)の9〜18倍の発現レベルを示した。更に
、欠失誘導体が種々のトウモロコシ及びタバコ組織の微小発射体撃ち込みとそれ
に続くX−Gluc染色により花粉特異性を維持するか否かを決定する試験も実
施した。青色スポットの存在は、欠失誘導体の発現を示す。トウモロコシAdh
lイントロン及びGUSコーディング領域に融合したCAMV(カリフラワーモ
ザイクウイルス)35Sプロモーター(CAMV ADH::GUS)を発現の
陽性対照として使用した。このプロモーターは、試験した全トウモロコシ及びタ
バコ組織で活性であることが判明した。これらの実験では、欠失誘導体はタバコ
花粉のみでGUS活性を示し、被験タバコ葉又は他のトウモロコシ組織では示さ
なかった(図10)ので、組織特異性を維持した。転写開始部位の上流配列の8
0bpのみを含む欠失誘導体D17.12(配列番号2)は弱い発現を示した。
これはCAMV ADH::GUS構築物及びp47.430に
より示される発現と同等であった。
トランスジェニック双子葉植物で正確に保存されるトウモロコシ単子葉プロモ
ーターの組織特異性の報告(Guerreroら,1990)は、関連する推定
トランス作用因子の結合部位の配列保存を示唆している。他の研究者により所謂
「花粉ボックス」が同定され、1例では花粉における発現に影響することが示さ
れている。LAT遺伝子の上流領域でTwellら(1991)により同定され
たPBコアモチーフに類似のモチーフがW2247の上流領域で検出されたが、
−8及び−14位を除き、これらの全モチーフは花粉特異的発現には不要な領域
である転写開始部位の少なくとも1kb上流に存在する。
LAT52遺伝子では花粉発現に必要な最小プロモーターは−71〜+110
である(Twellら,1991)。本発明者らは領域−80〜+5が弱い花粉
特異的発現を示すことをタバコ半in vivoシステムで立証した。D16.
6(配列番号5)及びD18.5(配列番号4)の5’末端間の87bpの内側
には完全長クローンに比較して著しく高レベルまでタバコ花粉におけるトウモロ
コシP
Gプロモーターからの発現を助長する領域が存在すると思われる。この活性は別
の上流配列の存在により実質的に低下する。図9参照。植物、植物細胞及び/又は植物プロトプラストへの花粉特異的キメラ遺伝子の導 入
本発明の花粉特異的PGプロモーターを定義し、単離した配列がタバコ花粉に
おける外来遺伝子(β−グルクロニダーゼ)の発現を誘導する能力を立証したの
で、植物及び花粉におけるキメラ遺伝子の導入及び発現を助長するためにこれら
の配列を使用することができる。
従って、本発明は更に図3に示すPGプロモーター領域又は図8及び9の欠失
誘導体のいずれか1種と、上記配列により発現を調節され得る外来遺伝子(その
野生型プロモーターを欠失する)とから主に構成されるキメラ遺伝子及びトラン
スファーベクターに関する。
植物又は植物細胞にベクターを導入する方法は当業者に周知である。このよう
な方法の非限定的な例としては、カルシウムホスフェート共沈法、プロトプラス
ト融合、エレクトロポレーション、微小発射体媒介移入、ウイルス感染
及び細菌(例えばAgrobacterium tumifaciens)感染
(Jones,1985)が挙げられる。
この関連における花粉特異的キメラ遺伝子の使用方法の1例は上述した通りで
あり、即ちこの方法では大腸菌β−グルクロニダーゼ遺伝子をタバコ花粉及びタ
バコ葉組織に順次移入し、発現させた。
別の例としては、細菌Agrobacterium tumifaciens
を使用して本発明のキメラ遺伝子を植物、植物、細胞又はプロトプラストに導入
してもよい。より具体的には、本発明のプロモーター配列を上述のようにβ−グ
ルクロニダーゼのようなリポーター遺伝子と連結し、更にTiプラスミド(例え
ばpBI101.2)に組み込み、常法によりAgrobacterium t umifaciens
に導入する(Horshら,1985)。その後、この細
菌を使用して当業者に周知の方法によりプラスミドを植物に導入する(Hors
hら,1985)。
花粉発生を阻止し、植物雄株を不稔性にする目的で遺伝子を花粉に導入するた
めに本発明の方法を使用することが
できる。このような遺伝子は花粉に対して毒性のタンパク質をコードする遺伝子
を含み得る。花粉発生に関与する遺伝子の発現を阻止することが可能なアンチセ
ンスmRNAの発現を可能にするキメラプラスミドを構築できることも予想され
る。
本発明のベクターは、非限定的な例として耐殺虫剤性、耐昆虫害虫性もしくは
対昆虫害虫毒性を含み得るか、又は他の花粉機能を最適化する有用な表現型特徴
を花粉に導入するために有用であることも予想される。参考文献
配列表
配列番号:1
配列の長さ:2873
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA(ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
起源
生物名:ゼア・メイズ
株名:W22
組織の種類:花粉
配列
配列番号:2
配列の長さ:80
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA(ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
起源
生物名:ゼア・メイズ
株名:W22
配列
配列番号:3
配列の長さ:347
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA(ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
起源
生物名:ゼア・メイズ
株名:W22
配列
配列番号:4
配列の長さ:377
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA(ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
起源
生物名:ゼア・メイズ
株名:W22
配列
配列番号:5
配列の長さ:464
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA(ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
起源
生物名:ゼア・メイズ
株名:W22
配列
配列番号:6
配列の長さ:595
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA(ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
起源
生物名:ゼア・メイズ
株名:W22
配列
配列番号:7
配列の長さ:1579
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA(ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
起源
生物名:ゼア・メイズ
株名:W22
配列
配列番号:8
配列の長さ:2687
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA(ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
起源
生物名:ゼア・メイズ
株名:W22
配列
配列番号:9
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:10
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:11
配列の長さ:17
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:12
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:13
配列の長さ:10
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:14
配列の長さ:10
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:15
配列の長さ:10
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:16
配列の長さ:10
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:17
配列の長さ:10
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:18
配列の長さ:10
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:19
配列の長さ:10
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:20
配列の長さ:17
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AT,AU,BB,BG,BR,CA,
CH,CZ,DE,DK,ES,FI,GB,HU,J
P,KP,KR,LK,LU,MG,MN,MW,NL
,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,
SK,UA
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.図3に示す配列から主に構成される、トウモロコシ近交系W22の花粉特異 的遺伝子のプロモーター領域からの単離精製DNA配列。 2.花粉特異的遺伝子がポリガラクツロナーゼである請求項1に記載のDNA配 列。 3.a)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約80塩基対(配列番号 2)、 b)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約347塩基対(配列番号3 )、 c)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約377塩基対(配列番号4 )、 d)プロモーター領域の3’末端から上流のDNAの約1〜約464塩基対(配 列番号5)、 e)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約595塩基対(配列番号6 )、 f)プロモーター領域の3’末端から上流のDNAの約1〜約1579塩基対( 配列番号7)、及び g)プロモーター領域の3’末端から上流の約1〜約26 87塩基対(配列番号8) から構成される群から選択される、図3に示すトウモロコシ近交系W22の花粉 特異的遺伝子のプロモーター領域(配列番号1)からの単離精製DNA配列。 4.遺伝子の野生型プロモーターが請求項3に記載のDNA配列(配列番号1〜 8)からなる群から選択されるDNA配列で置換された遺伝子を含む花粉特異的 キメラ遺伝子。 5.トランスファーベクターを更に含む請求項4に記載の花粉特異的キメラ遺伝 子。 6.a)花粉特異的発現が所望される遺伝子の野生型プロモーター領域を、図1 に示すDNA配列(配列番号1)から主に構成される花粉特異的プロモーター領 域で置換し、花粉特異的キメラ遺伝子を生成する段階と、 b)花粉特異的キメラ遺伝子をトランスファーベクターに導入する段階と、 c)キメラ遺伝子を同化及び発現することが可能な花粉に、花粉特異的キメラ遺 伝子を含むトランスファーベクターを導入する段階と、 d)花粉におけるキメラ遺伝子の発現を試験する段階と を含む、花粉において遺伝子に花粉特異的発現を付与するための方法。 7.花粉特異的プロモーター領域が請求項1又は3に記載のDNΛ配列(配列番 号1〜8)から主に構成される請求項6に記載の方法。 8.花粉がタバコ花粉である請求項7に記載の方法。 9.花粉特異的キメラ遺伝子を微小発射体撃ち込みにより植物に導入する請求項 6に記載の方法。 10.段階(a)の遺伝子がβ−グルクロニダーゼをコードする請求項6に記載 の方法。 11.D17.12(配列番号2)、D17.2(配列番号3)、D18.5( 配列番号4)、D16.6(配列番号5)、D16.4(配列番号6)、D10 .2(配列番号7)及びp47.427(配列番号8)からなる群の1員を含む 形質転換花粉。 12.前記花粉がタバコ花粉である請求項11に記載の形質転換花粉。
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