JPH08501684A

JPH08501684A - トウモロコシ花粉特異的ポリガラクツロナーゼ遺伝子

Info

Publication number: JPH08501684A
Application number: JP6503409A
Authority: JP
Inventors: アラン，レベッカ・ルイーズ; ロンズデール，デイビツド・マイケル
Original assignee: パイオニア・ハイ−ブレツド・インターナシヨナル・インコーポレイテツド
Priority date: 1992-07-09
Filing date: 1993-07-01
Publication date: 1996-02-27
Also published as: WO1994001572A3; US5545546A; ES2099968T3; WO1994001572A2; CA2139661C; BR9306689A; MX9304114A; ATE147434T1; NZ255026A; GR3023015T3; DE69307320D1; EP0651814A1; DE69307320T2; DK0651814T3; US5412085A; AU669384B2; EP0651814B1; AU4769693A

Abstract

(57)【要約】本発明は、花粉特異的プロモーターとして機能することができ且つ花粉における遺伝子の発現に関与するトウモロコシから単離された単離精製ＤＮＡ配列に係る。本発明は更に、通常は花粉では発現されない遺伝子に花粉特異性を付与するための方法にも係る。

Description

【発明の詳細な説明】トウモロコシ花粉特異的ポリガラクツロナーゼ遺伝子産業上の利用分野本発明は真核細胞においてプロモーターとして機能し得る単離精製ＤＮＡ配列に係る。より特定的には、本発明は花粉特異的プロモーターとして機能し、花粉における遺伝子の発現に関与する、トウモロコシからの単離精製ＤＮＡ配列に係る。本発明は更に、通常は花粉では発現されない遺伝子に、花粉特異的に発現される能力を付与するための方法にも係る。発明の背景トウモロコシにおける雄性配偶子形成は生化学的及び細胞学的に十分に特徴付けられているが、被子植物生活環においてこの重要なプロセスを制御する分子事象は現時点ではほとんど解明されていない。トウモロコシ花粉母細胞から高度に特殊化した三核花粉粒への複雑な分化は、雄性配偶子形成が多数の遺伝子産物の逐次生産を含むことを示唆している。しかしながら、花成植物において雄性配偶子形成に関与する遺伝子はほんの少数しか単離されていない。雄性配偶子形成中に発現された２種の転写物の同定から葯における遺伝子の連続発現が立証され（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ１９９０）、「初期」遺伝子は減数***後に発現され、その発現レベルは花粉粒の成熟につれてまず増加した後、低下する。「後期」遺伝子は小胞子有糸***後に現れ、成熟花粉で最大まで増加する。約２０，０００個の遺伝子がトウモロコシ花粉で発現されると推定され（Ｗｉｌｌｉｎｇら，１９８８）、恐らく１０％までが花粉特異的である（Ｓｔｉｎｓｏｎら，１９８７）。トウモロコシからクローニングされた花粉特異的遺伝子として報告されているのはＺｍ１３（Ｈａｎｓｏｎら，１９８９）及びＺｍ５８（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ１９９０）のみである。これらの遺伝子の発現はまず小胞子有糸***後に検出することができ、成熟花粉で最大まで増加する。Ｚｍｃ１３はその予想アミノ酸配列に関してＫｕｎｉｔｚトリプシンインヒビタータンパク質及びトマト葯発現遺伝子ＬＡＴ５２との間に相同を示す（Ｈａｎｓｏｎら，１９８９）。Ｚｍ５８はその予想アミノ酸配列に関してペクチン酸リアーゼとの間に相同を示す（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ１９９０）。この類における遺伝子産物は花粉発芽及び／又は花粉管成長に関与し、「初期」遺伝子の産物は小胞子発生に関与する可能性が高いと推測される。配列比較及び突然変異誘発実験の結果、所定のＤＮＡ配列モチーフがトマトにおけるＬＡＴ遺伝子の花粉発現の制御に関与していると予想された（Ｔｗｅｌｌら，１９９１）。ペチュニアにおける葯特異的発現に関与する領域の推定同定には、配列比較が単独で使用された（ｖａｎＴｕｎｅｎら，１９８９）。現在、花粉発生に固有の機能の組織特異的発現に関与し得るトウモロコシゲノムでシス作用すると思われる配列はほとんど知られていない。他方、トウモロコシクローンＺｍ１３はトマトＬＡＴ遺伝子で同定された提案花粉ボックスと数個の相同領域を有する。Ｒｏｇｅｒｓら，１９９１は、その予想アミノ酸配列に関して真核及び原核両種からのポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）との間に相同を示すトウモロコシからｃＤＮＡクローン３Ｃ１２（その５’末端は不完全）を単離したことを記載しており、このようなＰＧはＯｅｎｏｔｈｅｒａｏｒｇａｎｅｎｓｉｓからの花粉発現ＰＧ（Ｂｒｏｗｎ及びＣｒｏｕｃｈ１９９０）を含む。ポリガラクツロナーゼはトウモロコシ及び他の単子葉植物種の花粉で検出された（Ｐｒｅｓｓｅｙ及びＲｅｇｅｒ１９８９）。花粉粒におけるポリガラクツロナーゼの機能は、ペクチンを加水分解し、花粉管細胞壁の前駆物質として使用可能な成分を提供することにより花粉管から絹毛への成長に関与することであるか、又は花粉管を貫入させるように絹毛内の細胞材料の分解に関与することであると思われる。Ａｌｌｅｎ及びＬｏｎｓｄａｌｅ（公開特許明細書）も、トウモロコシクローン３Ｃ１２の５’末端をプローブとして使用することにより、４個のゲノムＰＧクローンを単離したことを記載している。ＰＧゲノムクローンの３個の配列分析によると、ポリガラクツロナーゼは多重遺伝子族に属すると推測される（Ａｌｌｅｎ及びＬｏｎｓｄａｌｅ、公開特許明細書）。トマトから単離され、果実登熟に関与するポリガラクツロナーゼ遺伝子（Ｇｒｉｅｒｓｏｎら，１９８６）はトマトゲノム中に単一コピーで存在する。Ｂｒｏｗｎ及びＣｒｏｕｃｈ（１９９０）は、Ｏｅｎｏｔｈｅｒａｏｒｇａｎｅｎｓｉｓの花粉ｃＤＮＡライブラリーからのポリガラクツロナーゼとの間に相同を有する少なくとも６個のユニークなｃＤＮＡクローンを単離し、多重ＰＧ遺伝子が該種の花粉で発現されることを示唆している。トウモロコシの予想される２，０００種の花粉特異的遺伝子のうちで特徴付けられているものは２種に過ぎない。米国特許第５，０８６，１６９号（’１６９）は、トウモロコシで発現された未同定遺伝子から単離された花粉特異的プロモーターＺｍ１３のヌクレオチド配列を開示している。花粉特異的プロモーター配列は花粉のみに存在するｍＲＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ領域から上流の１３１５塩基対から構成される。これはＨａｎｓｏｎら（１９８９）により記載されていると同一の花粉特異的プロモーターである。本発明の目的は、花粉特異的プロモーターとして作用することが可能なＤＮＡ配列を単離及び特徴付けることである。より特定的には、本発明の目的は、花粉特異的ポリガラクツロナーゼ遺伝子に由来する花粉特異的プロモーター領域を単離及び特徴付けることである。発明の要約本発明はトウモロコシ近交系Ｗ２２の花粉特異的遺伝子のプロモーター領域からの単離精製ＤＮＡ配列に係る。単離精製ＤＮＡ配列は主に図３に示す配列から構成される。本発明は更に、ポリガラクツロナーゼの花粉特異的プロモーター領域に対応する単離精製ＤＮＡ配列に係る。本発明は更に、図３に示すトウモロコシ近交系Ｗ２２の花粉特異的遺伝子のプロモーター領域（配列番号１）からの単離精製ＤＮＡ配列に係り、該配列は、ａ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約８０塩基対（配列番号２）、ｂ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約３４７塩基対（配列番号３）、ｃ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約３７７塩基対（配列番号４）、ｄ）プロモーター領域の３’末端から上流のＤＮＡの約１〜約４６４塩基対（配列番号５）、ｅ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約５９５塩基対（配列番号６）、ｆ）プロモーター領域の３’末端から上流のＤＮＡの約１〜約１５７９塩基対（配列番号７）、及びｇ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約２６８７塩基対（配列番号８）から構成される群から選択される。本発明は更に、ａ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約８０塩基対（配列番号２）、ｂ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約３４７塩基対（配列番号３）、ｃ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約３７７塩基対（配列番号４）、ｄ）プロモーター領域の３’末端から上流のＤＮＡの約１〜約４６４塩基対（配列番号５）、ｅ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約５９５塩基対（配列番号６）、ｆ）プロモーター領域の３’末端から上流のＤＮＡの約１〜約１５７９塩基対（配列番号７）、及びｇ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約２６８７塩基対（配列番号８）から構成される群から選択されるＤＮＡ配列で野生型プロモーターを置換した遺伝子を含む花粉特異的キメラ遺伝子に係る。本発明は、トランスファーベクターを更に含む花粉特異的キメラ遺伝子にも係る。本発明の別の態様は、遺伝子に花粉特異的発現を付与するための方法に係り、該方法は、ａ）遺伝子の野生型プロモーター領域を図１に示す配列から主に構成される花粉特異的プロモーター領域で置換し、花粉特異的キメラ遺伝子を生成する段階と、ｂ）花粉特異的キメラ遺伝子をトランスファーベクターに導入する段階と、ｃ）キメラ遺伝子を同化及び発現することが可能な花粉に、花粉特異的キメラ遺伝子を含むトランスファーベクターを導入する段階と、ｄ）花粉におけるキメラ遺伝子の発現を試験する段階とを含む。本発明は更に、遺伝子に花粉特異的発現を付与するための花粉特異的プロモーター領域が、ａ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約８０塩基対（配列番号２）、ｂ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約３４７塩基対（配列番号３）、ｃ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約３７７塩基対（配列番号４）、ｄ）プロモーター領域の３’末端から上流のＤＮＡの約１〜約４６４塩基対（配列番号５）、ｅ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約５９５塩基対（配列番号６）、ｆ）プロモーター領域の３’末端から上流のＤＮＡの約１〜約１５７９塩基対（配列番号７）、及びｇ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約２６８７塩基対（配列番号８）から構成される群から選択される、上記方法にも係る。本発明の方法は更に、タバコ花粉への本発明のキメラ遺伝子の導入にも係る。本発明の方法は更に、遺伝子がβ−グルクロニダーゼである本発明のキメラ遺伝子の導入にも係る。本発明の方法は更に、微小発射体撃ち込みによる花粉及び植物へのキメラ遺伝子の導入にも係る。本発明は更に、ａ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約８０塩基対（配列番号２）、ｂ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約３４７塩基対（配列番号３）、ｃ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約３７７塩基対（配列番号４）、ｄ）プロモーター領域の３’末端から上流のＤＮＡの約１〜約４６４塩基対（配列番号５）、ｅ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約５９５塩基対（配列番号６）、ｆ）プロモーター領域の３’末端から上流のＤＮＡの約１〜約１５７９塩基対（配列番号７）、及びｇ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約２６８７塩基対（配列番号８）から構成される群から選択されるＤＮＡ配列を含む形質転換花粉にも係る。本発明は更に、ａ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約８０塩基対（配列番号２）、ｂ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約３４７塩基対（配列番号３）、ｃ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約３７７塩基対（配列番号４）、ｄ）プロモーター領域の３’末端から上流のＤＮＡの約１〜約４６４塩基対（配列番号５）、ｅ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約５９５塩基対（配列番号６）、ｆ）プロモーター領域の３’末端から上流のＤＮＡの約１〜約１５７９塩基対（配列番号７）、及びｇ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約２６８７塩基対（配列番号８）から構成される群から選択されるＤＮＡで形質転換されたタバコ花粉にも係る。図面の簡単な説明図１種々のトウモロコシ組織からのＲＮＡのノーザンブロット。各レーンは１：花粉、２：出芽した雄穂、３：出芽中の雄穂、４：出芽前雄穂、５：子葉鞘、６：葉、７：根、８：穂軸、９：絹毛からのポリＡ⁺ ＲＮＡ２μｇをｃＤＮＡクローン３Ｃ１２でプローブした。図２アンチセンス（ｉ）及びセンス（ii）プローブでプローブしたトウモロコシ葯及び花の切片と３Ｃ１２ｃＤＮＡとのｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション。（Ａ）減数***前段階（ＰＭ）及び減数***段階（Ｍ）の葯を有するトウモロコシ小穂の切片。（Ｂ）最初の花粉有糸***段階におけるトウモロコシ葯の切片。（Ｃ）裂開直前のトウモロコシ葯の切片。図３（Ａ）Ｗ２２４７の上流２．８７ｋｂｐのヌクレオチド配列（配列番号１）。ＡＴＧ開始部位及び推定“ＴＡＴＡ”ボックスを下線で示す。ＰＢコアモチーフ及びＬＡＴ５６／５９ボックスとの相同を上線で示し、転写開始を矢印で示す。指示した数字は転写開始部位に対する位置である。（Ｂ）トウモロコシ（配列番号１０）及びタバコ（配列番号９）ＰＧ遺伝子の上流領域間の相同。図４（１）花粉からのＰｏｌｙＡ⁺ＲＮＡ、（２）花粉ＲＮＡ全体、（３）穂軸からのＰｏｌｙＡ⁺ＲＮＡ及び（４）ｔＲＮＡ上でプライマー（配列番号１１）“ＧＴＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＴＡＧＧ”を使用したプライマー伸長。Ｗ２２４７で同一プライマーを使用して配列ラッダーを得た。＊は主要転写開始を示し、・は副産物を示す。本図は配列番号１２を示す。図５ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、クローンＢ７３１７からの１．３ｋｂｐＮｃｏＩプローブでプローブしたトウモロコシからのゲノムＤＮＡのサザンブロット。コピー数標準はＷ２２４７の直鎖化３．３ｋｂｐサブクローンとした。図６Ｗ２２４７の上流領域におけるＰＢコアモチーフ及びＬＡＴ５６／５９ボックスとの相同。本図は配列番号１３〜１９を示す。図７ β−グルクロニダーゼコーディング領域へのＷ２２４７の上流領域の翻訳融合。図８ｐ４７．４２７の５’欠失誘導体。図９トランジェントアッセイシステムにおける完全長ｐ４７．４２７（配列番号８）及び５’欠失誘導体の相対プロモーター活性。各被験プラスミドに撃ち込みを３回ずつ繰り返して実施し、結果をルシフェラーゼ活性に対するＧＵＳの比として表す。転写開始部位までの５’末端側上流領域の寸法を示す。図１０トウモロコシ及びタバコの組織に転写及び翻訳融合物と欠失誘導体を撃ち込んだ。Ｘ−Ｇｌｕｃ染色後、活性を青色スポットの有無として表した。ＮＴは試験せずを意味する。発明の詳細な説明材料及び手法ＲＮＡ単離及びノーザン分析温室栽培植物から組織を回収し、液体窒素中で迅速に凍結し、−７０℃で貯蔵した。暗所で４〜５日間２２℃で穀粒を発芽させることにより子葉鞘及び根を得た後、上述のように凍結した。ポリＡ⁺ＲＮＡをＢａｕｌｃｏｍｂｅ及びＢｕｆｆａｒｄ（１９８３）の方法により単離した。Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に従ってホルムアルデヒド含有ゲルからＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎプラス膜（ＤｕＰｏｎｔＷｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）にノーザンブロットにより移行させ、ｃＤＮＡクローン３Ｃ１２（Ｒｏｇｅｒｓら，１９９１）のランダムプライムドプローブ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，１９８７）でプローブした。５０％ホルムアミド；５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３Ｍクエン酸ナトリウム・２Ｈ₂Ｏ，ｐＨ７．０）；１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液＝２０ｇ／ｌＦｉｃｏｌｌ４００，２０ｇ／１ポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン［フラクションＶ］）：１００μｇ／ｍｌニシン***ＤＮＡの溶液中で４２℃でフィルターをハイブリダイズし、６５℃ で０．１×ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳで洗浄した。サザン分析Ｄｈｉｌｌｏｎら（１９８０）の方法によりゲノムＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼで消化し、電気泳動により分離し、Ｒｉｇａｕｄら（１９８７）のアルカリ移行法によりナイロン膜に移行させた。紫外線照射によりＤＮＡを膜に架橋させた。フィルターをランダムプライムド³²Ｐ標識ＤＮＡフラグメント（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，１９８７）でプローブし、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％ＳＤＳ及び剪断変質ニシン***ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌの溶液中で６５℃でハイブリダイズした。０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃で洗浄し、フィルターを−７０℃でオートラジオグラフィーにかけた。配列決定Ｍｕｒｐｈｙ及びＫａｖａｎａｇｈ（１９８８）により二重鎖鋳型に適応するように改変したＳａｎｇｅｒら（１９７７）のジデオキシチェーンターミネーション法を使用して配列決定を行った。Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８７）の方法に従ってエキソヌクレアーゼIII及びＳ１ヌクレアーゼで消化することにより１組の入れ子式鋳型を生成した。Ｍ１３プライマーを使用して配列決定反応を開始した。プライマー伸長標準プロトコル（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７）により花粉ＲＮＡのプライマー伸長を実施した。Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に従ってポリヌクレオチドキナーゼを使用してγ標識オリゴヌクレオチドを生成した。４×１０⁵ｃｐｍのプローブを反応で使用した。６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル上で電気泳動後、−７０℃でオートラジオグラフィーにより伸長産物を分析した。ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションｐＵＢＳ３クローニングしたｃＤＮＡ、３Ｃ１２からｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用するリボプローブを生成した。ｐＵＢＳ３はＡａｔII及びＮｄｅＩで消化することによりｐＵＣ１８からＤｒａＩ部位を除去した後、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端化し、平滑末端を相互に連結して形質転換することにより調製した。得られたプラスミドをＰｖｕIIで消化し、ポリリンカーフラグメントを除去し、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａＣＡ）からの対応するＰｖｕIIフラグメントを挿入した（Ｍｕｒｐｈｙら，１９９２）。３Ｃ１２ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＵＢＳ３を直鎖化し、４ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ；８ｍＭＭｇＣｌ₂；２ｍＭスペルミジン；５０ｍＭＮａＣｌ；１ｍＭＡＴＰ，ＧＴＰ及びＣＴ；０．６５ｍＭＵＴＰ；０．３５ｍＭＤＩＧ− ＵＴＰ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＣａｔＮｏ．１２０９２５６）；２５ｕＲＮアーゼインヒビターを含有する反応体でＴ３及びＴ７ポリメラーゼを使用して１μｇをｉｎｖｉｔｒｏ転写し、夫々センス及びアンチセンスプローブを生成した。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識及び³⁵Ｓ標識プローブの両者を使用した。組織をホルムアルデヒドで固定し、パラフィンろうに埋め込み、１５μｍ厚に薄片化し、Ｊａｃｋｓｏｎ（１９９１）の記載に従ってハイブリダイズした。放射性プローブで標識した切片を２週間エマルジョンに暴露した。ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＣａｔＮｏ．１１７５０４１）を使用し、＜ＤＩＧ＞アルカリホスファターゼ（ＡＰ）複合体の１：３０００希釈液１００μｌ／スライドを加え、４℃で一晩インキュベートする修正を加え、ＤＩＧ標識プローブの検出を行った。色検出反応を４〜５時間実施した後、ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．５；１ｍＭＥＤＴＡ）で反応を停止した。微小発射体撃ち込みＴｗｅｌｌら（１９８９）の方法を使用してタバコ花粉粒の撃ち込みを行った。プラスミドＤＮＡをＬｏｎｓｄａｌｅら（１９９０）に記載されているようにスペルミジンの存在下でタングステン微小発射体に吸着させた。この試験で使用したリポーター遺伝子は大腸菌β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）又はホタルルシフェラーゼであった。プレート当たり花粉１０ｍｇに撃ち込みを行った。撃ち込みを行ったプレートを明所で一晩２５℃でインキュベートした後、β−グルクロニダーゼ及びルシフェラーゼ活性を定量した。ＧＵＳ活性はＪｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８７）の方法に従って蛍光定量アッセイを使用して決定した。ルシフェラーゼ活性はＯｗら（１９８６）の方法に従って定量し、Ｂｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターで測定した。完全組織の撃ち込みにあたっては、スクロース及び１％寒天を補充したＭＳ培地に組織を入れてＷｈａｔｍａｎＮｏ．１濾紙上に置き、欠失誘導体単独を撃ち込んだ。プレートを明所で２５℃で２日間インキュベートした後、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−Ｇｌｕｃ）（１ｍｇ．ｍｌ）；５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０；０．１ｍＭフェリシアニド；０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の溶液に組織を移し、６時間３７℃でインキュベートした。花粉サンプルでは、ナイロン膜をＸ −Ｇｌｕｃ溶液に浸漬したＷａｔｍａｎｎＮｏ．１濾紙に移し、上述のようにインキュベートした。ＧＵＳを発現する組織はこのシステムで青色に染色する。ポリガラクツロナーゼ発現の空間特異性上記ポリガラクツロナーゼ３Ｃ１２ｃＤＮＡを使用して、葯、種々の成熟段階の雄穂、花粉、絹毛、穂軸、葉、根及び子葉鞘から単離したトウモロコシポリＡ⁺ｍＲＮＡを含むノーザンブロットをプローブした。葯ｍＲＮＡ調製物の全てと成熟花粉で約１．５ｋｂｐの転写物が検出された（図１）。該転写物は未成熟葯では低レベルであり、成熟花粉で最大レベルまで増加した。栄養組織サンプルから単離したｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションは認められなかった。葯の内部の転写物の細胞特異性を決定するために、３Ｃ１２ｃＤＮＡから合成してジゴキシゲニン−ＵＴＰで標識したセンス及びアンチセンスリボプローブを使用してｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。ノーザンハイブリダイゼーションの結果と一致して、穂軸、葉、絹毛又は根切片にはセンス又はアンチセンスプローブのいずれのハイブリダイゼーションも検出されなかった。葯の色、葯長と包穎長の比及び植物上の雄穂の位置により判定した（Ｃｈａｎｇ及びＮｅｕｆｆｅｒ１９８９）種々の発生段階の葯の切片を同様にセンス及びアンチセンスプローブでプローブした。小穂内の各トウモロコシ小花は３本の葯２組を含み、そのうち２組は異なる発生段階であった。３本の減数***前の葯と３本の減数***葯の横断切片はセンス又はアンチセンスプローブとのハイブリダイゼーションを示さなかった（図２Ａ）。他方、最初の花粉有糸***段階の葯の横断切片はアンチセンスプローブのみが成熟中の小胞子とのハイブリダイゼーションを示した（図２Ｂ）。葯壁又はタペート細胞層とのハイブリダイゼーションは認められなかった。裂開直前の成熟花粉を含む葯の横断切片は、最初の花粉有糸***段階と同一のハイブリダイゼーションパターンを示した（図２Ｃ）。³⁵Ｓ標識リボプローブを使用した処、発現は花粉粒に局在し、被験胞子体組織には全く検出されなかった。これらのデータは、この特定ポリガラクツロナーゼ遺伝子の発現が花粉特異的であることを裏付けるものである。ＰＧゲノムクローンの単離ＥＭＢＬ３で作成したトウモロコシのライブラリー（Ａｌｌｅｎ及びＬｏｎｓｄａｌｅ、公開特許明細書）から４個のゲノムクローンを単離した。クローンのうちでＢ７３、Ｂ７３１７及びＢ７３３９種のライブラリーから単離した２個のクローンは完全長であった。Ｗ２２、Ｗ２２４７及びＷ２２６５種のライブラリーから単離した残りの２個のクローンは３’末端が不完全であった。ＤＮＡ配列分析の結果、これらの４個のクローンはそのコーディング配列の相同度が高い（＞９９％）ことが判明し、同一の遺伝子族に属すると思われる。完全長クローンはイントロンを含まない。クローンＷ２２４７の予想ＡＴＧ開始部位から上流のＤＮＡの２．８７ｋｂｐのヌクレオチド配列を決定した（図３）。他の３個のクローンの制限配列決定の結果、４個のクローンの上流領域はコーディング領域と同様にヌクレオチド配列の相同度が高いことが判明した。クローンＷ２２４７の転写開始部位のマッピングクローンＷ２２４７の転写開始部位（配列番号１）を花粉ＲＮＡのプライマー伸長によりマッピングした。推定翻訳開始部位に対して−５３ｂｐ位のプライマー（配列番号２０）（ＧＴＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＴＡＧＧ）をポリＡ⁺ＲＮＡにアニールし、材料と手法の項に記載したように伸長させ、１５５ｂｐの主産物を得た（図４）。１５８ｂｐの副産物も得られたことから、遺伝子は２個の転写開始点を有するか、又は副産物は遺伝子族の他の員からの転写開始に相当すると予想される。ポリＡ⁺ＲＮＡの代わりに基質として全ＲＮＡを使用してプライマー伸長を行った結果、１５５ｂｐ、１５８ｂｐの産物と共に、もっと大きい数個の産物が得られた。これらの産物はオリゴクレオチドと他の無関係の非ポリＡ⁺転写物とのハイブリダイゼーションに起因すると思われる。更に、１１６ｂｐの産物も生成された。この産物はｔＲＮＡを基質として使用した場合にも合成されたので、恐らくアーチファクトに相当する。１５５ｂｐ産物は、予想ＡＴＧ翻訳開始部位に対して１８８ｂｐのＡ残基から転写が開始されたことを立証した。推定ＴＡＴＡモチーフ“ＴＡＴＴＴＡＡ”はこの転写開始部位に対して−３５ｂｐに位置する。トウモロコシのＺｍ１３花粉特異的遺伝子では転写開始部位に対して−３４ｂｐにも同一の配列が検出された（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，１９８９）。遺伝子コピー数材料と手法の項に記載したようにサザンブロット分析によりポリガラクツロナーゼ遺伝子のコピー数を決定した。トウモロコシＢ７３からの完全ゲノムＤＮＡをＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、電気泳動により分離し、ナイロン膜にブロットし、クローンＢ７３１７の１．３ｋｂｐＮｃｏＩフラグメントでプローブした。このプローブは多重バンドにハイブリダイズした（図５）。これらのバンドを遺伝子コピー数標準と比較した処、細胞当たり＞５のコピーとして存在することが判明し、遺伝子は同一遺伝子族に属すると予想された。より弱いハイブリダイジングバンドは、プローブとして使用した花粉特異的クローンとの相同度が低い非花粉特異的なＰＧ遺伝子族に属し得る。花粉特異的トウモロコシＰＧ遺伝子が多重遺伝子族に属するという予想は、Ｏ．ｏｒｇａｎｅｎｓｉｓの花粉特異的ＰＧｃＤＮＡクローンで得られた結果（Ｂｒｏｗｎ及びＣｒｏｕｃｈ１９９０）及びトウモロコシＰＧの３個のゲノムクローンの制限地図とヌクレオチド配列の比較から得られた本発明者らの比較（Ａｌｌｅｎ及びＬｏｎｓｄａｌｅ、公開特許明細書）に一致する。配列分析クローンＷ２２４７の上流配列の２．８７ｋｂｐ（配列番号１）を材料と手法の項に記載した方法により配列決定し、他の葯及び花粉特異的遺伝子で同定された潜在的シス作用配列との相同を分析した。配列を図３に示す（配列番号１）。トマトからの３個の花粉発現遺伝子の上流領域の分析（Ｔｗｅｌｌら，１９９１）の結果、花粉における発現に重要な２個のシス作用配列が判明した。これらの配列は、“ＴＧＴＧＧＴＴ”（ＰＢコアモチーフと命名）及び“ＧＡＡＰｕＴＴＧＴＧＡ”（ＬＡＴ５６／５９ボックスと命名）であった。その突然変異によりプロモーターの活性が低下するモチーフ“ＧＴＧＧ”及び“ＧＴＧＡ” もＺｍ１３及びペチュニアＣＨＩＡＰ_A2遺伝子の上流領域に存在する（ｖａｎＴｕｎｅｎら，１９８９）。トウモロコシＰＧ遺伝子の上流領域の２．８７ｋｂｐに、本発明者らは、“ＧＴＧＧ”モチーフを含むＰＢコアモチーフとの間に少なくとも５／７の一致を有する７個の配列を見出した（図６）。“ＧＴＧＡ”モチーフを含むＬＡＴ５６／５９ボックスとの間に少なくとも７／１０の一致を有する６個の配列も知見された。提案されたＡＴＧ開始部位はＬｕｔｃｋｅ（１９８７）により提案されたコンセンサス植物翻訳開始領域との間に６７％の相同を有しており、フレームメチオニンコドン中の最初の部位であるので適正なＡＴＧ開始部位であると予想される。クローンＷ２２４７の上流領域（配列番号１）をＺｍ１３の上流領域と比較した結果、ある程度の相同が認められたが、２個の遺伝子における転写開始部位からの距離は異なっていた。クローンＷ２２４７の上流領域には、Ｚｍ１３の上流配列（配列番号１）に存在する構造に類似する一連の直接反復が存在する。これらの構造の機能は未だ解明されていない。相互間の唯一の顕著な相同は同一の推定ＴＡＴＡボックス“ＴＡＴＴＴＡＡ”であった。同一組織で組織特異的に発現される同一種からの遺伝子の上流領域におけるこの相同の不在は、他の遺伝子組でも報告されている（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ１９９１）。一部の葯及び花粉発現遺伝子の上流領域でＨａｍｉｌｔｏｎら（１９８９）により同定されたモチーフとの間にある程度の配列相同が認められた。他方、これらの配列が発現に関与するという証拠はない。クローン２２４７の上流領域とＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ（Ａｌｂａｎｉら，１９９１）からの２個の花粉特異的遺伝子の上流領域の保存配列との間に目立った相同は認められない。ポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）のタバコ遺伝子はクローニング及び配列決定されている（Ｔｅｂｂｕｔｔ及びＬｏｎｓｄａｌｅ、未公開特許明細書）。コーディング領域の上流のタバコ及びトウモロコシＰＧのヌクレオチド配列を比較した処、１個の領域を除き相同はほとんど認められない。この配列は報告されている他の花粉特異的遺伝子の上流領域には存在しないので、花粉特異的発現の絶対要件であるとは思われない。この配列は、夫々の転写開始部位に対して類似の位置即ちトウモロコシでは−１１７ｂｐに存在し、タバコでは−１４０ｂｐに存在する。この配列内に保存された９ｂｐは、トマトで果実登熟に関与するＰＧの上流領域−７００ｂｐにも存在する。トウモロコシ及びタバコＰＧ遺伝子の花粉特異的発現におけるこの配列の関与は目下研究中である。好適態様の説明クローンＷ２２４７及び欠失誘導体のプロモーター活性クローンＷ２２４７の完全上流領域（配列番号１）を大腸菌β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子のコーディング領域に融合し、このトウモロコシプロモーターによる有効な遺伝子発現のアッセイのためのキメラ遺伝子を生成した（図７）。無プロモーターＧＵＳ遺伝子及びｎｏｓターミネーター配列を含むｐＵＣをベースとするベクターであるｐＴＡＫ１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら，１９８７）の平滑末端化ＢａｍＨＩに、クローンＷ２２４７からの２．７５ｋｂｐの平滑末端化ＡｐａＬＩフラグメントを融合することにより、翻訳融合物ｐ４７．４２７（配列番号８）を生成した。こうしてｐ４７．４２７（配列番号８）は＋１０ｂｐで天然ＡＴＧに融合され、クローンＷ２２４７からの３個のコドンとＧＵＳコーディング領域のＡＴＧに先行するベクターからの８個のコドンを含んでいた。平滑末端化完全上流領域を含むｐ４７．４２７のＳｍａＩ／ＳａｌＩフラグメントの融合により逆転写融合物ｐ４７．４３０を生成し、ＳｍａＩ及びＳａｌＩで切断して平滑末端化したｐＴＡＫ１に逆向きに挿入した。花粉特異的発現に関与する上流領域の区域を限定するために、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）の方法に従ってインサート（図８）の５’末端からｐ４７．４２７の１組の入れ子式欠失誘導体（配列番号８）を生成した。材料と手法の項に記載したようにタバコ花粉の微小発射体撃ち込み（Ｔｗｅｌｌら，１９９０）に基づくトランジェントアッセイシステムを使用して欠失誘導体のプロモーター活性をアッセイした。タバコ形質転換実験の結果、クローンＷ２２４７の上流領域の２．６８７ｋｂｐは天然バックグラウンドにおける活性と同様にＧＵＳ遺伝子の発現を活性化し得ることが判明した（Ａｌｌｅｎ及びＬｏｎｓｄａｌｅ、未公開特許明細書）。タバコ花粉に欠失分子を及び参照プラスミドを同時に撃ち込んだ。参照プラスミドは撃ち込み間で標準化するために使用し、ホタルルシフェラーゼコーディング領域及びｎｏｓターミネーターに融合した花粉発現アクチン遺伝子の上流領域から構成した。各撃ち込みでルシフェラーゼに対するＧＵＳの相対活性として活性を測定した。被験プラスミドの各々に３回ずつ撃ち込みを繰り返し実施した。図８は本発明の好適態様を図示するものである。欠失誘導体Ｄ１６．６（配列番号５）は本発明のより好適な態様に相当する。図９は上記トランジェント発現システムでアッセイした場合の欠失誘導体の活性を示す。欠失誘導体はすべて完全長配列ｐ４７．４２７（配列番号８）に類似の活性を示した。他方、上流領域の４６４ｂｐを含むより好適な態様Ｄ１６．６（配列番号５）は完全長クローンｐ４７．４２７（配列番号８）の９〜１８倍の発現レベルを示した。更に、欠失誘導体が種々のトウモロコシ及びタバコ組織の微小発射体撃ち込みとそれに続くＸ−Ｇｌｕｃ染色により花粉特異性を維持するか否かを決定する試験も実施した。青色スポットの存在は、欠失誘導体の発現を示す。トウモロコシＡｄｈｌイントロン及びＧＵＳコーディング領域に融合したＣＡＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス）３５Ｓプロモーター（ＣＡＭＶＡＤＨ：：ＧＵＳ）を発現の陽性対照として使用した。このプロモーターは、試験した全トウモロコシ及びタバコ組織で活性であることが判明した。これらの実験では、欠失誘導体はタバコ花粉のみでＧＵＳ活性を示し、被験タバコ葉又は他のトウモロコシ組織では示さなかった（図１０）ので、組織特異性を維持した。転写開始部位の上流配列の８０ｂｐのみを含む欠失誘導体Ｄ１７．１２（配列番号２）は弱い発現を示した。これはＣＡＭＶＡＤＨ：：ＧＵＳ構築物及びｐ４７．４３０により示される発現と同等であった。トランスジェニック双子葉植物で正確に保存されるトウモロコシ単子葉プロモーターの組織特異性の報告（Ｇｕｅｒｒｅｒｏら，１９９０）は、関連する推定トランス作用因子の結合部位の配列保存を示唆している。他の研究者により所謂「花粉ボックス」が同定され、１例では花粉における発現に影響することが示されている。ＬＡＴ遺伝子の上流領域でＴｗｅｌｌら（１９９１）により同定されたＰＢコアモチーフに類似のモチーフがＷ２２４７の上流領域で検出されたが、 −８及び−１４位を除き、これらの全モチーフは花粉特異的発現には不要な領域である転写開始部位の少なくとも１ｋｂ上流に存在する。ＬＡＴ５２遺伝子では花粉発現に必要な最小プロモーターは−７１〜＋１１０である（Ｔｗｅｌｌら，１９９１）。本発明者らは領域−８０〜＋５が弱い花粉特異的発現を示すことをタバコ半ｉｎｖｉｖｏシステムで立証した。Ｄ１６．６（配列番号５）及びＤ１８．５（配列番号４）の５’末端間の８７ｂｐの内側には完全長クローンに比較して著しく高レベルまでタバコ花粉におけるトウモロコシＰＧプロモーターからの発現を助長する領域が存在すると思われる。この活性は別の上流配列の存在により実質的に低下する。図９参照。植物、植物細胞及び／又は植物プロトプラストへの花粉特異的キメラ遺伝子の導入本発明の花粉特異的ＰＧプロモーターを定義し、単離した配列がタバコ花粉における外来遺伝子（β−グルクロニダーゼ）の発現を誘導する能力を立証したので、植物及び花粉におけるキメラ遺伝子の導入及び発現を助長するためにこれらの配列を使用することができる。従って、本発明は更に図３に示すＰＧプロモーター領域又は図８及び９の欠失誘導体のいずれか１種と、上記配列により発現を調節され得る外来遺伝子（その野生型プロモーターを欠失する）とから主に構成されるキメラ遺伝子及びトランスファーベクターに関する。植物又は植物細胞にベクターを導入する方法は当業者に周知である。このような方法の非限定的な例としては、カルシウムホスフェート共沈法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、微小発射体媒介移入、ウイルス感染及び細菌（例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ）感染（Ｊｏｎｅｓ，１９８５）が挙げられる。この関連における花粉特異的キメラ遺伝子の使用方法の１例は上述した通りであり、即ちこの方法では大腸菌β−グルクロニダーゼ遺伝子をタバコ花粉及びタバコ葉組織に順次移入し、発現させた。別の例としては、細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓを使用して本発明のキメラ遺伝子を植物、植物、細胞又はプロトプラストに導入してもよい。より具体的には、本発明のプロモーター配列を上述のようにβ−グルクロニダーゼのようなリポーター遺伝子と連結し、更にＴｉプラスミド（例えばｐＢＩ１０１．２）に組み込み、常法によりＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓに導入する（Ｈｏｒｓｈら，１９８５）。その後、この細菌を使用して当業者に周知の方法によりプラスミドを植物に導入する（Ｈｏｒｓｈら，１９８５）。花粉発生を阻止し、植物雄株を不稔性にする目的で遺伝子を花粉に導入するために本発明の方法を使用することができる。このような遺伝子は花粉に対して毒性のタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。花粉発生に関与する遺伝子の発現を阻止することが可能なアンチセンスｍＲＮＡの発現を可能にするキメラプラスミドを構築できることも予想される。本発明のベクターは、非限定的な例として耐殺虫剤性、耐昆虫害虫性もしくは対昆虫害虫毒性を含み得るか、又は他の花粉機能を最適化する有用な表現型特徴を花粉に導入するために有用であることも予想される。参考文献配列表配列番号：１配列の長さ：２８７３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：ゼア・メイズ株名：Ｗ２２組織の種類：花粉配列配列番号：２配列の長さ：８０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：ゼア・メイズ株名：Ｗ２２配列配列番号：３配列の長さ：３４７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：ゼア・メイズ株名：Ｗ２２配列配列番号：４配列の長さ：３７７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：ゼア・メイズ株名：Ｗ２２配列配列番号：５配列の長さ：４６４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：ゼア・メイズ株名：Ｗ２２配列配列番号：６配列の長さ：５９５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：ゼア・メイズ株名：Ｗ２２配列配列番号：７配列の長さ：１５７９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：ゼア・メイズ株名：Ｗ２２配列配列番号：８配列の長さ：２６８７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：ゼア・メイズ株名：Ｗ２２配列配列番号：９配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：１０配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：１１配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：１２配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：１３配列の長さ：１０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：１４配列の長さ：１０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：１５配列の長さ：１０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：１６配列の長さ：１０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：１７配列の長さ：１０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：１８配列の長さ：１０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：１９配列の長さ：１０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：２０配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ

Claims

【特許請求の範囲】１．図３に示す配列から主に構成される、トウモロコシ近交系Ｗ２２の花粉特異的遺伝子のプロモーター領域からの単離精製ＤＮＡ配列。２．花粉特異的遺伝子がポリガラクツロナーゼである請求項１に記載のＤＮＡ配列。３．ａ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約８０塩基対（配列番号２）、ｂ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約３４７塩基対（配列番号３）、ｃ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約３７７塩基対（配列番号４）、ｄ）プロモーター領域の３’末端から上流のＤＮＡの約１〜約４６４塩基対（配列番号５）、ｅ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約５９５塩基対（配列番号６）、ｆ）プロモーター領域の３’末端から上流のＤＮＡの約１〜約１５７９塩基対（配列番号７）、及びｇ）プロモーター領域の３’末端から上流の約１〜約２６８７塩基対（配列番号８）から構成される群から選択される、図３に示すトウモロコシ近交系Ｗ２２の花粉特異的遺伝子のプロモーター領域（配列番号１）からの単離精製ＤＮＡ配列。４．遺伝子の野生型プロモーターが請求項３に記載のＤＮＡ配列（配列番号１〜８）からなる群から選択されるＤＮＡ配列で置換された遺伝子を含む花粉特異的キメラ遺伝子。５．トランスファーベクターを更に含む請求項４に記載の花粉特異的キメラ遺伝子。６．ａ）花粉特異的発現が所望される遺伝子の野生型プロモーター領域を、図１に示すＤＮＡ配列（配列番号１）から主に構成される花粉特異的プロモーター領域で置換し、花粉特異的キメラ遺伝子を生成する段階と、ｂ）花粉特異的キメラ遺伝子をトランスファーベクターに導入する段階と、ｃ）キメラ遺伝子を同化及び発現することが可能な花粉に、花粉特異的キメラ遺伝子を含むトランスファーベクターを導入する段階と、ｄ）花粉におけるキメラ遺伝子の発現を試験する段階とを含む、花粉において遺伝子に花粉特異的発現を付与するための方法。７．花粉特異的プロモーター領域が請求項１又は３に記載のＤＮΛ配列（配列番号１〜８）から主に構成される請求項６に記載の方法。８．花粉がタバコ花粉である請求項７に記載の方法。９．花粉特異的キメラ遺伝子を微小発射体撃ち込みにより植物に導入する請求項６に記載の方法。１０．段階（ａ）の遺伝子がβ−グルクロニダーゼをコードする請求項６に記載の方法。１１．Ｄ１７．１２（配列番号２）、Ｄ１７．２（配列番号３）、Ｄ１８．５（配列番号４）、Ｄ１６．６（配列番号５）、Ｄ１６．４（配列番号６）、Ｄ１０．２（配列番号７）及びｐ４７．４２７（配列番号８）からなる群の１員を含む形質転換花粉。１２．前記花粉がタバコ花粉である請求項１１に記載の形質転換花粉。