JPH08500970A - Molecular cloning of a gene responsible for collagenase production from Historicus. - Google Patents

Molecular cloning of a gene responsible for collagenase production from Historicus.

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JPH08500970A
JPH08500970A JP6502521A JP50252194A JPH08500970A JP H08500970 A JPH08500970 A JP H08500970A JP 6502521 A JP6502521 A JP 6502521A JP 50252194 A JP50252194 A JP 50252194A JP H08500970 A JPH08500970 A JP H08500970A
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dna
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Abstract

(57)【要約】 非天然型および天然型のヒストリチスク菌コラゲナーゼをコードする挿入部を含むベクターを担っている遺伝子工学的に操作されたE.coli。コラゲナーゼをコードする組換えＤＮＡセグメントは形質転換細胞により効率よく発現され、酵素的に活性で、免疫学的に交差反応性のコラゲナーゼをもたらす。遺伝子工学的操作により産生されたコラゲナーゼは膵島の分離、内皮細胞の分離、分散した腫瘍細胞の分離、あるいは“椎間板ヘルニア”の治療に用いられる。   (57) [Summary] Genetically engineered E. coli carrying a vector containing inserts encoding non-natural and native Histolyticus collagenase. The recombinant DNA segment encoding collagenase is efficiently expressed by transformed cells resulting in an enzymatically active, immunologically cross-reactive collagenase. Collagenase produced by genetic engineering is used for pancreatic islet isolation, endothelial cell isolation, dispersed tumor cell isolation, or the treatment of "disc herniation".

Description

【発明の詳細な説明】ヒストリチクス菌からのコラゲナーゼ産生に応答性の遺伝子の分子クローニング 背 景 本発明は、ヒストリチクス菌（Clostridium histolyticum）コラゲナーゼをコ ードする遺伝情報の単離及びクローニング及び適する宿主内でのその遺伝情報の 発現に関する。特に、この発明は、ヒストリチクス菌ゲノミックコード配列の自 然発現により測定された翻訳産物よりも高い分子量を有する型を含むヒストリチ クス菌コラゲナーゼの型をコードする遺伝情報の単離及びクローニングに向けら れている。要 旨 本発明によれば、ヒストリチクス菌コラゲナーゼの酵素活性及び抗原性を有す るポリペプチドをコードする組換えＤＮＡセグメントが提供される。しかしなが ら、このポリペプチドは、天然のヒストリチクス菌コラゲナーゼ、即ち、ヒスト リチクス菌ゲノムの自然発現により産生され続いてヒストリチクス菌から精製さ れるコラゲナーゼと区別可能である。ここでは非天然型と言うことにする本発明 のこのポリペプチドは、ヒストリチクス菌ゲノミックコード配列の自然発現によ り測定された翻訳産物よりも高い分子量を有する。 特許請求する組換えＤＮＡセグメントは、ヒストリチクス菌由来のプロモータ ーを含む。このプロモーターは独立して作動し、 特許請求するＤＮＡセグメントが前記プロモーターの制御の下に転写されるのを 可能にして、特許請求する組換えＤＮＡセグメントの外部にあるプロモーターが 機能することなしに特許請求するポリペプチドを産生する。 特許請求する組換えＤＮＡセグメントは、更に、特許請求する非天然の、つま り高分子量のポリペプチドよりも低い分子量を有する、コラゲナーゼ活性を有す る天然ポリペプチドを発現することができる。 本発明は、更に、特許請求する組換えＤＮＡセグメントを含みかつ宿主細胞を 形質転換して特許請求する非天然ポリペプチドを産生することができるベクター を提供する。 本発明者らは、形質転換された宿主細胞内の特許請求する組換えＤＮＡセグメ ントの発現がその宿主細胞の株によって決定されるということを見出した。従っ て、本発明のベクターで形質転換された異なる大腸菌宿主細胞が提供される。宿 主細胞株の１つは、コラゲナーゼ活性と抗原性を有する本発明の非天然ポリペプ チドを産生する。この宿主細胞によって産生されるコラゲナーゼ活性を有するポ リペプチド全体のうち５０重量％を超えるものが非天然高分子量ポリペプチドを 含む。 本発明は、更に、本発明のベクターで形質転換された他の大腸菌宿主細胞を提 供する。これら宿主細胞は、コラゲナーゼ活性と抗原性を有しかつ１１０，００ ０の分子量を有するポリペプチドを産生する。これら細胞によって産生されるコ ラゲナーゼ活性を有するポリペプチドの５０重量％を超えるものが１１０ｋｄコ ラゲナーゼを含む。 本発明の他の側面は、ヒストリチクス菌コラゲナーゼの実質的に精製された調 製物に関連する。１つの試料は、コラゲナーゼの非天然型を含む。本発明の実質 的に精製された他の調製物は、１１０ｋｄの分子量を有するコラゲナーゼを含む 。これら型のコラゲナーゼは、本発明のベクターで形質転換された異なる株の大 腸菌宿主細胞に由来する。 更に、本発明に従って遺伝子操作された大腸菌宿主細胞により産生されるコラ ゲナーゼを用いる方法が提供される。これら方法は、結合組織の消化及び包埋細 胞の放出、膵臓組織から分散された膵島の単離、血管からの内皮細胞の単離、及 び分散した腫瘍細胞を単離するための腫瘍の解離などに適している。この方法は 、次の２工程を含む： (1) 分散すべき組織を、本発明の実質的に精製された遺伝子操作コラゲナーゼ を含有する緩衝溶液中で約２５〜３９℃で振とうしながらインキュベートし、包 埋細胞を放出及び分散させ；そして (2) その分散した細胞を組織破片から分離する。組織破片から分散細胞を分離 する工程は、典型的には、密度勾配遠心分離法により行われる。 遺伝子操作した本発明のヒストリチクス菌コラゲナーゼは、髄核のヘルニア（ 椎間板ヘルニア）の円板内（intradiscal）治療方法に用いてもよい。この方法 は、次の工程を含む： (1) 特許請求する実質的に精製された遺伝子操作コラゲナーゼを含有する無菌 の緩衝溶液を調製し；そして (2) その特許請求する実質的に精製されたコラゲナーゼを含 有する無菌の緩衝溶液を髄核に注入する。 本発明のこれら及びその他の特徴、側面、及び効果は、以下の説明、添付の請 求の範囲、及び添付図面を参照することによってより良好に理解されるであろう 。図 面 図１は、無傷１２５ｋｄコラゲナーゼの発現プラスミドを得るためのクローニ ング戦略の略図である。 図２は、大腸菌株ＤＨ５α内でのコラゲナーゼの発現を示す。 図３は、コラゲナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列決定用のプラスミドｐＣＴ６及びｐ ＣＴ７の構築を示す。 図４は、１２５ｋｄコラゲナーゼをコードする遺伝子の部分的ＤＮＡ配列を決 定するのに用いた種々のクローンを示す。 図５は、１２５ｋｄコラゲナーゼ遺伝子の転写終結シグナルである。 図６ａは、市販のコラゲナーゼと比較した１２５ｋｄコラゲナーゼのクマシー ブルー染色ゲルであり；図６ｂは、市販のコラゲナーゼと比較したｌ２５ｋｄコ ラゲナーゼのウェスタンブロットである。 図７は、レーン１に、プラスミドｐ７０を含有する大腸菌株ＤＨ５αからの培 養培地のクマシーブルー染色ゲルを示し；レーン２は、培養培地からの精製１２ ５ｋｄコラゲナーゼのクマシーブルー染色ゲルである。 図８は、プラスミドｐＣＴ１１．１０の制限酵素地図である。 図９は、ＩＰＴＧがｐＣＴ１１．１０を保持する大腸菌ＤＨ５αからの組換え コラゲナーゼの発現を誘発しないことを示すクマシ ーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。 図１０は、ｐＲＳ２１及びｐＣＴ８Ｂから産生した組換えコラゲナーゼのウェ スタンイムノブロットの比較である。 図１１ａは、クマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥであり；図１１ｂは、イム ノブロットであり、いずれも大腸菌内で産生した組換えコラゲナーゼの細胞内局 在性を示している。 図１２は、組換え１１０ｋｄコラゲナーゼと天然産生１１０ｋｄコラゲナーゼ の精製及び比較のクマシーブルー染色及びイムノブロットの結果を示す。詳細な説明 本発明者らは、ヒストリチクス菌の遺伝子を大腸菌内にクローン化した。この クローン化遺伝子、即ち、本発明の組換えＤＮＡセグメントは、大腸菌内でポリ ペプチドとして産物を発現できる。大腸菌内で発現されたその産物は、抗コラゲ ナーゼ抗体と免疫反応性であるタンパク質の形でも検定可能なコラゲナーゼ活性 、即ち、コラーゲン消化の形でも検出可能である。 それが挿入される大腸菌宿主に依存して、4.9キロベースを有する同じ組換え ＤＮＡセグメントが翻訳されると、以下の実施例３及び１１に記載するように、 コラゲナーゼ活性を有する幾つかのポリペプチドを産することが見出された。特 許請求する本発明による組換えＤＮＡセグメントで形質転換された大腸菌株ＤＨ ５αは、特に、コラゲナーゼ活性と抗原性を有する、天然のヒストリチクス菌コ ラゲナーゼと区別可能なポリペプチドを産生した。この非天然ポリペプチドの明 確に異なる特徴は、それがヒストリチクス菌ゲノミックコード配列の自然配列に よって測定された翻 訳産物よりも高い分子量を有することであった。自然発現によって測定されたヒ ストリチクス菌コラゲナーゼは、コラゲナーゼをコードするＤＮＡセグメントを 保持する遺伝子ベクターが導入されていないヒストリチクス菌により直接に産生 されるコラゲナーゼの型である。以下の実施例で記載するように、種々の商業的 供給業者から購入したヒストリチクス菌の天然コラゲナーゼは、本発明の非天然 コラゲナーゼと同じサイズの分子量を有しない。 実施例８に詳述するように、特許請求する組換えＤＮＡセグメントは、ヒスト リチクス菌由来のプロモーターを含むことが見出された。以下に記載するように 、コラゲナーゼをコードする本発明の4.9ｋｂ組換えＤＮＡフラグメントは、大 腸菌内で独立に機能するクロストリジウムプロモーターを含んだ。 特許請求する組換えＤＮＡセグメントは、本発明の非天然コラゲナーゼよりも 低いコラゲナーゼ活性と分子量を有するポリペプチドを発現することが見出され た。実施例に記載するように、特許請求するＤＮＡセグメントから発現される天 然及び非天然コラゲナーゼの相対比は、本発明のベクターを介して特許請求する ＤＮＡセグメントで形質転換される大腸菌宿主細胞に従って変動する。 ヒストリチクス菌からＤＮＡを単離した後、クロストリジウムＤＮＡを含有す るｐＲＫ２９０ライブラリーを構築して（実施例１）そのコラゲナーゼ遺伝子を スクリーニングした。挿入したコラゲナーゼ遺伝子の特徴を制限酵素分析によっ て明らかにした（実施例２）。実施例４でコラゲナーゼ遺伝子の更なる特徴付け を行った。そこでは、その挿入物を順次欠失させたプラスミドｐ ＣＴ６及びｐＣＴ７内に反対の挿入方向で配置した。２５５１塩基対を配列決定 した。完全ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を配列番号：１に示す。この ＤＮＡ配列がクロストリジウムコラゲナーゼ遺伝子を含むことの更なる確認を実 施例５及び６に示す。 大腸菌内でのクロストリジウムコラゲナーゼ遺伝子の発現には、クロストリジ ウムＤＮＡを保持する適するプラスミド又は他のベクターでの宿主大腸菌細胞の 形質転換又は形質移入及びその形質転換細胞によって産生するコラゲナーゼの検 出を要する。米国特許出願第０７／４９８，９１９号に記載された形質転換及び コラゲナーゼ検出を行う標準的方法を用いて、本発明者らは、実施例３、７、９ 、１０及び１１において、形質転換宿主細胞内での特許請求した組換えＤＮＡセ グメントの発現を宿主細胞の株によって確認する。実施例３は、約２％の形質転 換大腸菌可溶性タンパク質が、抗コラゲナーゼ抗体でのイムノブロッティングに より、ウェスタンブロット及びＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシーブルー染色でコラゲ ナーゼであったことを証明している。 実施例８に記載するように、大腸菌内でのコラゲナーゼ発現の制御が、ヒスト リチクス菌由来の特許請求したＤＮＡセグメントを含む独立プロモーターの制御 下のものであることが見出された。 本発明者らは、以下の実施例１０に記載するように、形質転換大腸菌細胞から 及びこれら細胞を生育させた培養培地から天然及び非天然のコラゲナーゼを産生 させて精製した。細胞からのこれら酵素の精製は、当該技術分野で既知の標準的 方法を包含するものであった。本発明者らは、意外にも、これら形質転換細胞が 生育した発酵ブロス中に大量のコラゲナーゼを見出した。その観察 に基づいて、実質的に純粋な非天然コラゲナーゼ及び１１０ｋｄコラゲナーゼの 調製物を得るためのコラゲナーゼ精製戦略を立てた。 形質転換細胞から精製した組換えコラゲナーゼのコラーゲン消化活性は、細胞 から精製した組換えコラゲナーゼの活性とほぼ等しいことが分かった（実施例１ ０の表１）。精製組換え非天然コラゲナーゼのコラーゲン消化活性を、市販の天 然型精製コラゲナーゼと比較した（実施例１１の表２）。組換えコラゲナーゼは 、ウォーシントン（Worthington）・ケミカル、シグマ・ケミカル、及びカルバ イオケム（CalBiochem）から得た天然コラゲナーゼよりも活性が５０％から１０ ０％高かった。 特許請求するＤＮＡセグメントを含有する遺伝子操作大腸菌により産生された 精製組換え非天然又は組換え天然１１０ｋｄコラゲナーゼは、コラーゲンを消化 することが望まれるあらゆる応用に用いることができる。組織から細胞を単離又 は放出する特定の応用には：(1)細胞膜及び他の必須の特徴を破壊することなく 結合組織を消化して包埋細胞を放出すること；(2)内皮細胞を単離すること；(3) 腫瘍を解離すること；及び(4)髄核のヘルニア（椎間板ヘルニア）の円板内治療 ；が含まれる。実施例１２に示すように、本発明の精製１１０ｋｄ組換えコラゲ ナーゼは、トリプシンと組み合わせると、ヒト伏在静脈から内皮細胞を単離する のに効果的であった。 標的組織及び動物に依存して、本発明の方法を用いて解離組織試料を得るため の組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）、又は天然クラスIIコラゲナーゼ、又は 中性プロテアーゼの量は変動して もよい（ウォルターズ（G.H.J.Wolters），“An Analysis of theRole of Colla genase and Protease in the EnzymaticDissociation of the Rat Pancreas for Islet Isolation”，Diabetologia,35:735-742(1992)）。本発明の組成物及び 方法において組換えコラゲナーゼと共に要する中性プロテアーゼのタイプ及び量 は、標的組織に依存して変動してもよい。本発明の方法を用いて組織を消化又は 解離するのに、粗製又は精製天然コラゲナーゼ以外のプロテアーゼを、組換えコ ラゲナーゼ（配列番号：２）を含む組成物に用いてもよい。実施例 以下の実施例は説明のためだけであり、本発明を限定するものと解釈されるべ きではない。実施例１ 無傷１２５ｋｄコラゲナーゼをコードする遺伝子のクローニング及びスクリーニ ング 無傷１２５ｋｄコラゲナーゼをコードする遺伝子の方向は、米国特許出願第０ ７／４９８，９１９号において確認された。以下の実施例４及び５に記載するよ うに、遺伝子の終点をその遺伝子の配列決定によって確認し、Ｂｇｌ II部位に 密接していることが分かった。上の情報によって規定されるように、2.5ｋｂＤ ＮＡフラグメントが、最初のＥｃｏＲＩ部位から２番目のＥｃｏＲＩ部位を通過 してＢｇｌ II部位に伸びていた。2.5ｋｂＤＮＡフラグメントは、約１２５ｋ ｄの分子量を有するコラゲナーゼをコードするには十分なサイズではない。それ には、約4.4ｋｂを要する。従って、より多くのコラゲナーゼ遺伝子配列を同定 しよう と、新たなライブラリーを調製した。これは、Ｂｇｌ IIライブラリーの構築を 包含した。 ゲノミックＤＮＡからｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのような小さなプラスミドに直 接にＢｇｌ IIフラグメントをクローン化しようと試みた。本発明者らは、１２ ５ｋｄの分子量においてコラゲナーゼバンドを同定したが、独立の２実験を包含 する第２スクリーニングでは、その分子量は６８ｋｄのようであった。 本発明者らは、ｐＲＫ２９０（ハース（Haas，D．），Experientia，39:1199( 1983)）の如き低コピー数（細胞当たり１〜１０コピー）の他のプラスミドを用 いた。これにより、全縁コラゲナーゼ遺伝子をクローニングすることができた。 しかしながら、Ｂｇｌ IIフラグメントをｐＵＣ８の如き小さなプラスミドにク ローニングする困難さが残った。にも拘らず、本発明者らは、全縁コラゲナーゼ 遺伝子を組み込んだそのようなｐＵＣ８プラスミドの構築を達成した。 Ａ．ヒストリチクス菌からのＤＮＡ単離 ヒストリチクス菌ＡＴＣＣ２１０００をアメリカン・タイプ・カルチャー ・ コレクションから得た。この細菌を含有する紙製の錠剤をまずＴＹＥブロス（培 養培地１リッター当たり１５ｇトリプシン、１０ｇ酵母エキス、及び５ｇＮａＣ ｌ）中に４℃で３０分間時々振とうさせながら浸した。 この細胞懸濁液をＴＹＥアガープレート上に塗って嫌気性条件下で３７℃で生 育させた。単一のコロニーを拾って５０ｍｌＴＹＥブロス中で生育させ、嫌気性 条件下で３７℃で生育させた。遠心分離によって細胞を採集して、ＴＥＳ（０． １Ｍトリス（ｐＨ8. ０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中に再懸濁した。こ の細胞懸濁液を４回凍結及び融解することによって細胞を部分的に溶解した。次 いで、ＳＤＳ及びプロナーゼＫを添加してそれぞれ０．５％及び２００μｇ／ｍ Ｌの最終濃度にした。ベックマンＪ２−２１遠心分離機での１０，０００ｒｐｍ で４℃３０分間の遠心分離によって細胞破片を除去した。上澄み液を等容量のフ ェノール−クロロホルムで３回抽出して、ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ た。このＤＮＡをアガロースゲルで電気泳動に付し、臭化エチジウムの添加後に 蛍光を既知の濃度スタンダードの蛍光と比較することによって、ＤＮＡ濃度を測 定した。精製クロストリジウムＤＮＡの平均サイズは、０．６％アガロースゲル での電気泳動によって測定して３０ｋｂ及び４０ｋｂであった。 Ｂ．クロストリジウムＤＮＡを含有するｐＲＫ２９０ライブラリーの構築 精製ヒストリチクス菌染色体ＤＮＡを制限酵素Ｂｇｌ IIで消化した。エタノ ール沈殿の後、消化ＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、０． １ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。適当量の消化ＤＮＡを、前もってＢｇｌ IIで開裂してアルカリ性ホスファターゼで処理したｐＲＫ２９０と連結した。連 結は４℃で１６時間行った。この連結ＤＮＡを記載されている通りに大腸菌株Ｄ Ｈ５α内に形質転換した。形質転換細胞をＴＹＥ−Ｔｃ（１リッター当たり１５ ｇトリプトン、１０ｇ酵母エキス、５ｇＮａＣｌ、及び１５ｍｇのテトラサイク リン）プレート上にプレートして３５℃一晩インキュベートした。 Ｃ．コラゲナーゼ遺伝子のスクリーニング プレート当たり約１，０００コロニーを得た。約１０プレートを無傷コラゲナ ーゼ遺伝子についてスクリーニングした。簡単に説明すると、３５℃で１６時間 のインキュベーションを行った後、乾燥したニトロセルロースペーパー（Ｓ＆Ｓ ）をペトリ皿の上に置いてそれらコロニーを吸収した。そのニトロセルロースペ ーパーを注意してプレートから離して、調製したばかりのＴＹＥ−Ｔｃアガープ レートに移し、そして３５℃で更に４時間インキュベートした。もとのプレート をマスタープレートとして４℃で貯蔵した。ニトロセルロースペーパーを注意し てそのプレートから取り去って、０．１Ｍトリス（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ Ｎ ａＣｌ、及び５％スキムミルク中に浸し、そして静かに振とうしてそのニトロセ ルロースペーパーから細菌細胞を除去した。このニトロセルロースペーパーをウ サギ抗コラゲナーゼ抗体（米国特許出願第０７／４９８，９１９号の実施例２に 詳述されている）と共に１：１０００の希釈度で５％スキムミルクと共に室温で １時間インキュベートし、０．２Ｍ ＮａＣｌ及び１％トリトン（商標）Ｘ−１ ００を含有する０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、次いで プロテインＡ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体と共に５％スキムミ ルクを含むＰＢＳ中１：１０００の希釈度で室温で１時間インキュベートした。 ヤングとディビス（R.A.Young & R.W. Davis），“Efficient Isolation of Gen es byUsing Antibody Probes”，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80,1194-119 8 (1983)に記載された通りに、洗浄操作を繰り返してこのニトロセルロースペー パーをＰＢＳ中で４−クロロ−１−ナフトールとＨ2Ｏ2で発色させた。 このニトロセルロース上の陽性シグナルの位置に対応するプレート上のアガロ ースの部分を取ってＴＹＥ−Ｔｃブロス中に再懸濁させた。低細胞密度に段階的 に希釈した細胞懸濁液（プレート当たり３０〜１００細胞）をＴＹＥ−Ｔｃプレ ート上に再プレートし、第２スクリーニングを行って単一のコロニーを同定した 。Ｐ７０と名付けられたこの１コロニーは強いシグナルを示した。これを採集し てＴＹＥ−Ｔｃブロス中で生育させた。このコロニーの特徴を以下の実施例２及 び３のように更に明らかにした。実施例２ 挿入ＤＮＡの制限酵素分析 プラスミドＰ７０内のクロストリジウムＤＮＡの構成をより正確に特徴付けす るために、Ｐ７０を更なる制限酵素分析に付した。プラスミドＰ７０からのＤＮ Ａを、記載された通りに調製した（マニアチス(Maniatis)）。精製ＤＮＡをＢｇ ｌ IIで消化してクローン化ＤＮＡ挿入物を放出させた。見掛けのサイズが４． ９ｋｂのＤＮＡフラグメントをＢｇｌ II消化によってベクターｐＲＫ２９０か ら放出させた。Ｂｇｌ IIとＥｃｏＲＩを組み合わせてｐ７０を更に消化し、同 じ酵素で消化したｐＢＢ１及びｐＲＳ２１と比較した。３つ全てのプラスミドは 、同一の１．７ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ IIフラグメントを放出した。Ｐ７０及 びｐＢＢｌのいずれも同一の０．８ｋｂＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを 放出した。これら制限酵素分析は、３つ全てのプラスミドが共通のＤＮＡフラグ メントを有し、Ｐ７０は２．４ｋｂＢｇｌ II−ＥｃｏＲＩフラグメントの余剰 片を有したことを示唆した。実施例３ 大腸菌株ＤＨ５α内で産生されたコラゲナーゼの特徴付け 免疫反応性タンパク質のサイズを調べるために、Ｐ７０を含有する細胞を遠心 分離によって採集し、ゲル泳動用緩衝液中に再懸濁し、加熱し、ラエムリ（Laem mli, U.K.），“Cleavage ofStructural Proteins During the Assembly of the Head ofBacteriophage T4”，Nature, 227:680-685(1970)に記載された通りに ７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにかけた。それらタンパク質をニトロ セルロースペーパー上にエレクトロブロットして、米国特許出願第０７／４９８ ，９１９号（バーネット（W.H.Burnette），“Western Blotting: Electrophore tic Transfer ofProteins form SDS-polyacrylamide Gels to UnmodifiedNitroc ellulose and Radiographic Detection with Antibodyand Radioiodinated Prot ein A”，Anal. Biochem., 112, 195-203(1981)）のウサギ抗コラゲナーゼ抗体 で検出した。Ｐ７０クローンからのコラゲナーゼの分子量は、予備染色したタン パク質スタンダードとの比較によって決定した。 約１２５ｋｄ及びそれ未満の分子量を有する免疫反応性タンパク質バンドがＰ ７０クローンから発現した。６８〜１００ｋｄの分子量を有する幾つかのバンド は、本発明者らが米国特許出願第０７／４９８，９１９号に記載したものと類似 している。 大腸菌株ＤＨ５αをプラスミドｐＵＣ８又はＰ７０でそれぞれ形質転換して２ ５０ｍｌフラスコ内の５０ｍｌのＴＹＥブロス中で生育させた。細胞を採取して 、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）及び１ｍＭ ＰＭＳＦ中に再懸濁し、そして音 波処理した。遠心分 離によって細胞破片を除去した後、タンパク質濃度を測定して同量のタンパク質 を７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にのせて泳動させた。 本発明の組換えＤＮＡセグメントの発現を図２に示す。パネルＡは、クマシー ブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン１はプラスミドｐＵＣ８を保持する 大腸菌株ＤＨ５αであり、レーン２はプラスミドＰ７０を保持する大腸菌株ＤＨ ５αである。パネルＢは、Ｐ７０を保持する大腸菌株から調製した細胞抽出物の クマシーブルー染色（レーン１）及びイムノブロット（レーン２）ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥである。 ｐＵＣ８を保持する細胞ではなくプラスミドＰ７０を保持する細胞から調製し た細胞抽出物では、非常に強いクマシーブルー染色タンパク質バンドが分子量２ ００キロダルトンと９７キロダルトンの間に可視化された。プラスミドＰ７０形 質転換大腸菌株ＤＨ５αを５リッターバイオフロII発酵器（BioFloII Fermentor ）内で生育させてコラゲナーゼを産生させた。遠心分離によってそれら細胞を採 取した後、細胞ペーストを−７０℃で貯蔵した。少量の細胞について更に処理し て精製条件を決めた。音波処理及び澄明化した上澄み液をクマシーブルー染色及 び抗コラゲナーゼ抗体でのイムノブロッティングによって試験し、図２のパネル Ｂに示した。クマシー染色バンドの位置は、免疫反応性タンパク質バンドと同じ であった。従って、それは、２００ｋｄと９７ｋｄの間に存するクマシーブルー 染色性バンドがコラゲナーゼであることを確認するものであった。いずれの生育 条件の下でも、約２％の大腸菌可溶性タンパク質がコラゲナーゼであると判断さ れた。実施例４ コラゲナーゼ遺伝子の特徴付け Ａ．ＤＮＡ配列決定戦略 ヘニコフ（Henikoff, S.）（Methods in Enzymology,Unidirectional Digesti on With Exonuclease III in DNASequence Analysis, 155:156(1987)）により公 表された非ランダムＤＮＡ配列決定戦略に僅かに手を加えて、ｐＢＢｌによりコ ードされる２．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ II ＤＮＡフラグメントの配列決 定に用いた。２．５ｋｂ ＢａｍＨＩ／Ｂｇｌ IIフラグメントをプラスミドｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＢａｍＨＩ部位に反対方向に挿入すること によってプラスミドｐＣＴ６とｐＣＴ７とを構築した。 プラスミドｐＣＴ６とｐＣＴ７とを、Ｐ４２からの２．５ｋｂＢａｍＨＩ−Ｂ ｇｌ IIフラグメントをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩ部位に 挿入することによって構築した。プラスミドｐＣＴ６とｐＣＴ７は、図３に示す ように反対の挿入方向を表わしている。一方向性欠失体 （undirectionaldelet ion）を作るために、両プラスミドをまずＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで消化して、二 本鎖ＤＮＡの凹んだ３’−ヒドロキシル末端と他端において突き出た３’−末端 を作った。ＸｈｏＩにより作られたこの凹んだ３’−ヒドロキシル末端は、エン ドヌクレアーゼIIIに感受性であり段階的に除去されたが、ＫｐｎＩにより作ら れた突き出た３’−末端は無傷のままであった。消化は、開裂部位から離れて標 的ＤＮＡ配列の中に一方向で進行する。消化の度合いは時間によって制御した。 異なる時間に採集したアリコー トをＳ１ヌクレアーゼ消化に付した。この消化ＤＮＡサンプルをアガロースゲル 電気泳動によって分析し、所望のサイズを有するＤＮＡフラグメントを含有する サンプルを同定した。クレノウＤＮＡポリメラーゼを添加して両ＤＮＡ末端を平 滑にした。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加してこのプラスミドを再環状化した。次い で、連結ＤＮＡを大腸菌株ＤＨ５α内に形質転換した。 形質転換後、それら細胞をＴＹＥ−Ａｐプレート上にプレートして、３５℃で 一晩生育させた。欠失の検査及び配列決定用ＤＮＡの調製のために、コロニーを ランダムに拾い上げて５ｍｌのＴＹＥ−Ａｐブロス中で一晩生育させた。遠心分 離によって一晩培養液から細胞を採集した。細胞ペレットをトリ−ＥＤＴＡ緩衝 液中に再懸濁してマニアチスに記載されたアルカリ法を用いることによって溶解 した。エタノール沈殿後、ＤＮＡペレットを手短に乾燥してＴＥ（１０ｍＭトリ ス（ｐＨ８．２）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。欠失のサイズは制 限酵素分析によって調べた。適当な欠失を有するクローンを同定してＲＮアーゼ Ａで更に処理した。ＲＮアーゼ消化後、そのＤＮＡを１０ＰＥＧ及び１．２５Ｍ ＮａＣｌで沈殿させた。ＤＮＡペレットを１００％エタノールで洗浄しＴＥ緩衝 液中に再懸濁した。この方法により調製したＤＮＡは、サンガーのジデオキシチ ェインターミネーション法（サンガー（Sanger, F.）及びカールソン（A.R. Cou lson），J.Molec. Biol. 94:441 (1975)）を用いるＤＮＡ配列決定に適していた 。ＤＮＡ配列決定に用いたクローン及び得られた配列情報を図３に纏めた。ある 場合には、プラスミドｐＣＴ１２．８を系統的に欠失させ、サブクローンを用い てこの配列の部分を決定した。 プラスミドｐＣＴ１２．８は、Ｐ７０の４．９ｋｂＢｇｌ IIフラグメントをＢ ａｍＨＩで前処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ （ＳＫ−）内に挿入することに よって構築した。 Ｂ．ＤＮＡ配列及び分析 全部で２８０８塩基対の完全配列を配列番号：１に示す。このＤＮＡ配列は、 通常、高比率のＡ及びＴヌクレオチド（６９％）と３１％に過ぎないＧ及びＣヌ クレオチドを含有する。最初のＥｃｏＲＩ部位から２番目のＥｃｏＲＩ部位を通 過して塩基対２８０８に位置するＴＡＡ終結コドンで終わるオープンリーディン グフレームを同定した。９３６アミノ酸を含有する推定タンパク質配列を特定し て配列番号：２に示した。この部分は、通常、殆どの他のタンパク質と比較して 高度に荷電したアミノ酸（３０％）を含有する。 図５に示すように、典型的な細菌性転写終結シグナル（GeneFunction in Prok aryotes，ベックウイズ（J. Beckwith）ら編，p.123, Cold Spring Harbor Labo ratory, Cold Spring Harbor,NY(1983)中のプラット（Platt, T.）及びベア（D. G. Bear）の報文）を転写終結シグナル（ＴＡＡ）から１１塩基対下流に同定し た。このシグナルは、ステム−ロープ構造に続くＡ−Ｔに富む配列からなる。こ のデータは、このコラゲナーゼ遺伝子がこのステム−ロープ構造の下流のＡ−Ｔ に富む域内で終了することを示唆した。実施例５ 従来のクローンのＤＮＡ配列比較 従来の全てのクローンが、イムノブロット上でのそれらの移動 度から判断して、同一の免疫反応性タンパク質バンドを産生したことは明らかで あるが、微変異性の可能性を排除するものではなかった。もしも従来得られてい るクローンの間に微変異性が存在するとすれば、それは、ファン・バート（Van Wart）ら［REF］によって提案された、遺伝子重複及びその後の突然変異が異な るコラゲナーゼをもたらしたという概念を支持していたかも知れない。 それらの同一性を確認するために、次の２つのＤＮＡ配列プロジェクトを行っ た：１）Ｐ６、Ｐ９、Ｐ４１、Ｐ４２、及びＰ５１の如き異なる挿入物を有する クローン間の配列の比較及び２）見たところ全てが同じ挿入サイズを有する従来 得られた異なるもとの単離物間の配列の比較。多クローニング部位を両端に配置 した（flanked）ＤＮＡ配列をフランキングユニバーサルプライマーを用いて配 列決定した。平均１５０〜２００塩基対のクロストリジウムＤＮＡ配列を両末端 から得た。配列を比較した後、１塩基対の相違も同定されなかった。この結果は 、同じクラスのコラゲナーゼ中に相違点をもたらすことを司る手段としての遺伝 子重複を支持しなかった。 実施例６Ｐ７０由来のクローンのＤＮＡ配列と従来得られているクローンからの配列との 比較 Ｐ７０と従来得られている他のクローンの同一性を調べるため、多くのクロー ンを部分的に配列決定して比較した。クローンＰ７０からの０．７ｋｂＥｃｏＲ Ｉ及び１．８ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢｇｌIIフラグメントをｐＵＣ１３又はｐＢｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔ内に サブクローン化した。多クローニング部位を両端に配置したＤＮＡ配列をフラン キングユニバーサルプライマーを用いて配列決定した。プラスミドｐＢＢ１、ｐ ＲＳ２１、及びＰ４１のフランキング配列を決定してＰ７０のサブクローンから 得られた配列と比較した。相違点は認められなかった。この結果は、Ｐ７０がｐ ＢＢ１と同じＤＮＡフラグメントを有しかつ染色体上の同じところに位置するこ とを示唆した。 実施例７Ｐ７０のサブクローンから産生したコラゲナーゼとｐＲＳ２１から産生したコラ ゲナーゼとの比較 Ｐ７０と先に記載した他のクローン間の同一性の特徴を更に明らかにするため 、見たところ同じ挿入物を有するサブクローンから産生したコラゲナーゼ産物を 比較した。Ｐ７０をＢｇｌ II及びＥｃｏＲＩで消化して、ＢａｍＨＩ及びＥｃ ｏＲＩで予備消化したｐＵＣ１８と連結した。連結ＤＮＡを大腸菌株ＤＨ５αに 形質転換し、ＴＹＥ−Ａｐプレート上にプレートし、そして３５℃で一晩インキ ュベートした。１．７ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ II挿入物を含有しかつｐＲＳ２ １と同じ挿入方向を有するクローンを同定し、ｐＣＴ８Ｂと名付けた。プラスミ ドｐＣＴ８Ｂ、ｐＲＳ２１、又はｐＵＣ１８のいずれかを含有する大腸菌株ＤＨ ５αをＴＹＥ−Ａｐブロス中で３５℃で一晩生育させた。細胞を遠心分離により 採集してＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動用緩衝液で崩壊させた。放出されたタンパク質を ７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにかけ、ニトロセルロースペーパーに エレクトロブロットした。免疫反応性バンドを先に記載した通りに検出して比較 した。図１ ０のレーン１に示すように、ｐＵＣ１８を保持する大腸菌から産された溶解産物 は、免疫反応性コラゲナーゼバンドをもたらさなかった。しかしながら、ｐＲＳ ２１（レーン２）又はｐＣＴ８Ｂ（レーン３）を保持する大腸菌から産生したい ずれの細胞溶解産物も、６８ｋｄの分子量を有する同一の免疫反応性タンパク質 バンドを示した。これは両方のものが同じタンパク質を産生していることのあら われである（レーン１０）。 実施例８ヒストリチクス菌由来の独立プロモーターによる大腸菌内でのコラゲナーゼ発現 の制御 ＢａｍＨＩで予備消化したプラスミドｐＵＣ１３内にＰ７０からの４．９ｋｂ Ｂｇｌ IIフラグメントをクローニングすることによってプラスミドｐＣＴ１１ ．１０を構築し図８に示した。このコラゲナーゼ遺伝子の転写方向は、Ｌａｃプ ロモーターと同じである。 プラスミドｐＣＴ１１．１０を保持する大腸菌ＤＨ５αを５０ｍｌのＴＹＥ− Ａｐブロス中で１ｍＭ ＩＰＴＧと共に又はＩＰＴＧなしで３２℃で一晩振とう （１３０ｒｐｍ）しながら生育させた。細胞と上澄み液を遠心分離により分離し た。この細胞と上澄み液を泳動用緩衝液と共に９５℃でインキュベートしてから 、７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにかけた。上澄み液及び細胞のもと の容量にそれぞれ等しい２０μｌ及び８０μｌを各レーンにのせ、図９に示した 。クマシーブルー染色後の細胞抽出物のタンパク質プロフィールを図９のレーン １（ＩＰＴＧ含）及び２（ＩＰＴＧ不含）に示す。培養培地のタンパク質プロフ ィールを 図９のレーン３（ＩＰＴＧ含）及び４（ＩＰＴＧ不含）に示す。 ＩＰＴＧ含又はＩＰＴＧ不含では、細胞抽出物及び培養培地のいずれも組換え コラゲナーゼの発現にいかなる相違も示さなかった。強力なｌａｃプロモーター 誘導物質であるＩＰＴＧは、コラゲナーゼの発現を増加させなかった。これで、 ４．９ｋｂＤＮＡフラグメントが、大腸菌内で独立に機能できるクロストリジウ ムプロモーターを含有することがさらに確認された。 意外にも、図９のレーン３及び４に示すように、大量のコラゲナーゼが上澄み 液中に発見された。のせた当量の上澄み液（２０μｌ）は、のせた当量の細胞（ ８０μｌ）の４分の１であったので、染色ゲルから判断して、８０％のコラゲナ ーゼが上澄み液中に存すると見積もられた。培養培地中でのコラゲナーゼの蓄積 は、大腸菌細胞が培地の中にコラゲナーゼを分泌したことを示すものであった。 これら細胞は、コラゲナーゼをコードする本発明の組換え遺伝子セグメントを含 むこれら宿主細胞が生育した培養培地からコラゲナーゼを生産又は精製するのに 簡単でコスト的に有効な方法を提供するという利益を有する。実施例９ 大腸菌内で発現されたコラゲナーゼの細胞内局在性 異なる大腸菌コンパートメント内でのコラゲナーゼの細胞内局在性を調べた。 プラスミドＰ７０を含有する大腸菌株ＤＨ５αをＴＹＥ−Ｔｃブロス中で３５℃ で５時間振とうしながら生育させた。遠心分離によって細胞を採集した。細胞ペ レットを３０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０％スクロース緩衝液中に 再懸濁した。ライソザイム（７０マイクログラム／ｍｌ）及びＥＤＴ Ａ（２ｍＭ）を添加して４℃で３０分間インキュベートし、細胞壁を分解した。 遠心分離によって周縁質画分を細胞質及び膜画分（ＣＭ画分）から分離した。こ れら周縁質画分とＣＭ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで検査してクマシーブルー染色及 びイムノブロット法によって検出した。図１１のパネルＡに示すように、クマシ ーブルー染色ゲル上に１２５ｋｄの分子量を有する明瞭なタンパク質バンドが周 縁質画分中に見られ（レーン１）、そして細胞質画分中に僅かに見られた（レー ン２）。 図１１のパネルＢに示すように、多くの免疫反応性バンドがイムノブロットに よって見られた。殆どのバンドが周縁質領域に存在した（パネルＢのレーン１） 。これは、これらバンドに相当するタンパク質が内膜を通って分泌され周縁質域 に蓄積することができることを示唆したものである。ゲルにのせた量に基づいて （周縁質画分は、ＣＭ画分と比較して半分の原液当量でのせた）、８０％の１２ ５ｋｄコラゲナーゼが周縁質領域に局在すると見積もられる。周縁質領域及び細 胞質領域（レーン２）に存する免疫反応性バンドの比率は、各免疫反応性バンド の間で相違しているが、これらバンドの殆どは、見たところ、６８ｋｄの分子量 を有するタンパク質バンドを除いては、周縁質領域にむしろ局在している。この ６８ｋｄタンパク質は、むしろ細胞質領域内に存しており、周縁質領域には存し ていない。このことは、この６８ｋｄコラゲナーゼが内膜を通って効率的に輸送 され得ないことを示唆している。この６８ｋｄタンパク質がｐＲＳ２１内で産生 された６８ｋｄタンパク質と同一であるかは不明であるが、ｐＲＳ２１内で産生 された６８ｋｄタンパク質は、周縁質領域内に分泌され ることができなかった。これらデータは、大腸菌内で産生された１２５ｋｄの分 子量を有するコラゲナーゼが、大腸菌の分泌メカニズムを利用して内膜を通って 輸送され、周縁質領域内に蓄積され得ることを示している。実施例１０ 大腸菌細胞及び培養培地からのコラゲナーゼ生産と精製 Ａ．大腸菌からのコラゲナーゼの生産 プラスミドＰ７０を保持する大腸菌株Ｗ３１１０をニュー ・ブルンスウィッ ク（New Brunswick）・バイオフロ III発酵器中で生育させて、コラゲナーゼを 生産した。発酵培地（ＦＭ，培地リッター当たりのグラム）は、ＫＨ2ＰＯ4，３ ．５；Ｋ2ＨＰＯ4，５．０；（ＮＨ4）2ＨＰＯ4，３．５；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ，３．５；酵母エキス，５；及びトリプトン，５からなる。５０％のグルコース を別々にオートクレーブに掛けリッター当たり１０ｍｌを添加した。ＣａＣｌ2 及びＺｎＣｌ2の１Ｍストック溶液を調製して別々にオートクレーブに掛けリッ ター当たりそれぞれ２０μｌを添加した。Ｐ７０を保持する大腸菌株をＴＹＥ− Ｔｃ中で３０℃で一晩生育させた。この一晩培養液を発酵器内に直接接種した。 ＯＤ６００が１６に等しい細胞密度に達した後、細胞を遠心分離によって採取し て上澄み液と分離した。 Ｂ．細胞からの精製 細胞を遠心分離により採集して、１ｍＭ ＰＭＳＦを含む１０ｍＭビス−トリ ス緩衝液（ｐＨ６．５）中に再懸濁した。細胞を音波処理によって崩壊させ、破 片を遠心分離により除去した。タンパク質を逐次硫酸アンモニウム沈殿（sequen tial ammonium sulfate precipitation）によって分画した。コラゲナーゼを含有する画分を１ ０ｍＭビス−トリス緩衝液（緩衝液Ａ）中に再懸濁して、同緩衝液に対して４℃ で一晩透析した。透析サンプルをまずＤＥ５２カラムクロマトグラフィーによっ て分画した。コラゲナーゼを含有する画分をプールして緩衝液Ａに対して透析し た。透析サンプルをＱセファロースカラムクロマトグラフィーによって分画した 。９８％を超える純度を得るには、ゲル濾過が必要であるかも知れない。出発原 料中には多くの免疫反応性コラゲナーゼバンドが共存した。陰イオン交換カラム クロマトグラフィーで異なる分子量のコラゲナーゼをある程度まで分離すること ができた。以下の実施例１１に記載する実験では、コラゲナーゼの最も大きな型 を用いた。 Ｃ．培地からの精製 意外にも、発酵ブロス中に大量のコラゲナーゼが検出された。培養培地からコ ラゲナーゼを採集及び精製できる可能性を評価するために、精製戦略を立てた。 簡単に説明すると、遠心分離により細胞を除いた後に上澄み液を濃縮して、３０ ，０００分子量カットオフの中空繊維（アミコン（Amicon））を用いてダイア濾 過（diafiltrate）した。濃縮した上澄み液を硫酸アンモニウム示差沈殿法（dif ferential precipitation）により分画した。コラゲナーゼを含有する画分を採 集して、ビス−トリス緩衝液（ｐＨ６．５）中に再懸濁し、同緩衝液に対して透 析した。透析サンプルをＤＥ５２カラム（ワットマン）上にのせてＮａＣｌで溶 出させた。コラゲナーゼを含有する画分を採集してＱセファロースカラム（ファ ルマシア）で更に精製した。図７のレーン１は、プラス ミドＰ７０を保持する大腸菌株Ｗ３１Ｉ０からの培養培地（レーン１）及びこの 培養培地から精製したコラゲナーゼ（レーン２）のクマシーブルー染色ゲルを示 す。細胞及び培養培地の両方から調製したコラゲナーゼのコラーゲン消化活性を 比較した。培地から調製したコラゲナーゼは、細胞から調製したものの約２倍の 活性を有した。 Ｄ．細胞及び培地から精製したコラゲナーゼのコラーゲン消化活性 細胞又は培養培地のいずれかから精製した本発明の組換えコラゲナーゼのコラ ーゲン消化活性を測定した。以下の実施例１１に記載する通りに活性を測定した 。以下の表１はこれら活性を纏めたものである。 この表の結果は、培地から精製したコラゲナーゼ活性が、細胞から精製した組 換えコラゲナーゼの活性にほぼ等しいことを示している。実施例１１ 組換えコラゲナーゼとヒストリチクス菌により産生された天然コラゲナーゼとの 比較 Ａ．サイズ 組換えコラゲナーゼの同定物をヒストリチクス菌により産生された天然コラゲ ナーゼと比較した。未精製及び精製天然型コラゲナーゼの両方を、シグマ、ベー リンガー ・マンハイム・プロダクツ（コラゲナーゼＡ（ＣＨＳＡ）、コラゲナ ーゼＢ（ＣＨＳＢ）、コラゲナーゼＤ（ＣＨＳＤ））、ウォーシントン、及びカ ルバイオケムから購入した。異なる供給源のコラゲナーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥに かけ、それらの分子量を調べた。典型的なクマシーブルー染色ゲル及びイムノブ ロットを図６に示す。図６は、組換えコラゲナーゼ（ＲＣＬ）と天然コラゲナー ゼ間の比較を示す；パネルＡはクマシーブルー染色ゲルであり；パネルＢはＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥのウェスタンブロットである。 図６のレーンの割り当ては次の通りである： パネルＡ：レーン１，０．５μｇのロット１７ＲＣＬ；レーン２，２．５μｇの ロット１７ＲＣＬ；レーン３，２．５μｇのＣＨＳＤ（ＢＭＢ）；レーン４，１ ０μｇのＣＨＳＤ；レーン５，２．５μｇのＣＨＳＢ；レーン６，１０μｇのＣ ＨＳＢ；レーン７，２．５μｇのＣＨＳＡ；及びレーン８，１０μｇのＣＨＳＡ 。 パネルＢ：レーン１，０．０１μｇのロット１７ＲＣＬ；レーン２，０．０５μ ｇのロット１７ＲＣＬ；レーン３，０．２μｇのＣＨＳＤ：レーン４，０．２μ ｇのＣＨＳＢ；及びレーン５，０．５μｇのＣＨＳＡ。 本発明の精製組換えコラゲナーゼを、ベーリンガー ・マンハイム社から得た 市販のコラゲナーゼ（カタログ番号ＣＨＳＡ、ＣＨＳＢ、及びＣＨＳＤ）と比較 した。異なる量のタンパク質を７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにかけた 。ウェスタンブロット上のコラゲナーゼをウサギ抗コラゲナーゼ抗体で検出した 。抗コラゲナーゼ抗体の調製は、米国特許出願第０７／４９８，９１９号に記載 した。 クマシーブルー染色によって多くのタンパク質が可視化できるが、染色性バン ドの５０％を超えるものがコラゲナーゼ特異性抗体によって検出できない。最大 型の組換えコラゲナーゼは、明らかに、ベーリンガー ・マンハイムから得たコ ラゲナーゼのいかなる天然型よりも大きなサイズを示す。本発明の組換えコラゲ ナーゼとカルバイオケム、ウォーシントン、及びシグマから得た天然コラゲナー ゼとの比較で、同一の結果が得られた。 天然産物の最大コラゲナーゼ（１１０ｋｄ）に類似する組換えコラゲナーゼの 型は、特別の大腸菌宿主（ＪＭ１０５株）内で定量的にかつムラなく産生するこ とができた。 Ｂ．活性 異なる販売業者から市販されている精製天然コラゲナーゼのコラーゲン消化活 性を、１２５ｋｄの分子量を有する精製組換えコラゲナーゼと比較した。コラー ゲン消化活性は、メンドル（Mendl, I）ら，J. Clin. Invest., 32:1323(1953) に手を加えた方法に従って測定した。主要な変更は、１）用いた酵素の量を０． ２又は０．４μｇに減少したこと、及び２）基質（タイプ１コラーゲン）濃度を １０ｍｇ／ｍｌに増加したことである。コラゲ ナーゼ活性は次のように定義される：１ユニットのコラゲナーゼ活性は、３７℃ で５時間インキュベーションした後にコラーゲンから放出されるＬ−ロイシンの １μモル当量に等しい。異なる精製コラゲナーゼの酵素活性を以下の表２に示す 。 組換えコラゲナーゼのコラーゲン消化活性は、天然型の精製コラゲナーゼのも のよりも約２５〜１００％高かった。この結果は、本発明の組換えコラゲナーゼ が天然コラゲナーゼよりも優れていることを明確に示唆している。実施例１２ 組換えコラゲナーゼ＋トリプシンでの内皮細胞単離 大腸菌内で産生した本発明の精製組換えコラゲナーゼを用いてヒト伏在静脈か ら内皮細胞を採取した。ヒト伏在静脈を半分に分けて一方を０．１％タイプIIコ ラゲナーゼ（ウォーシントン）、０．５％ＢＳＡ、及びＰＢＳ／ＣＭＦで満たし 、他方を０．０１％トリプシンを含むか又は含まない同緩衝液中の０．０４８％ 組換えコラ ゲナーゼで満たした。組換えコラゲナーゼ単独では、この静脈から内皮細胞を解 放しなかった。ＲＣＬとトリプシンを組み合わせることにより、内皮細胞の収率 は粗製コラゲナーゼに比較して２倍になった。これら結果は、本発明の組換えコ ラゲナーゼを一定濃度のトリプシンと組み合わせることによってより多くの内皮 細胞が単離できることを証明した。これら結果は、異なる組織からの細胞単離に 、天然コラゲナーゼを本発明の組換えコラゲナーゼと置き換えることが可能であ ることを更に示唆した。実施例１３ 組換えコラゲナーゼを含む酵素混合物を用いるラット膵島単離 組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）、天然クラスIIコラゲナーゼ、及び中性 プロテアーゼを含む組成物を作り、膵臓組織を分散させて膵島を放出させた。 大腸菌から産生した約１１０，０００ダルトンの分子量を有する精製組換えコ ラゲナーゼ（配列番号：２）を用いて、本発明の方法に従ってラット膵臓からラ ット膵島を採取した。天然クラスＩ及びIIコラゲナーゼ及び中性プロテアーゼは 、ウォルターズ，“An Analysis of the Role of Collagenase and Protease in the Enzymatic Dissociation of the Rat Pancreas for IsletIsolation”，Dia betologia, 35:735-742(1992)に従って調製した。 ラット膵臓の消化は、ウォルターズ(1992)の通りに行った。組換えコラゲナー ゼ（配列番号：２）、天然クラスIIコラゲナーゼ及び中性プロテアーゼを含む混 合物は、粗製コラゲナーゼ調製物又は精製天然コラゲナーゼと中性プロテアーゼ の組み合わせを 用いた場合と同じラット膵島収率をもたらした。この混合物は、１０ｍｌ当たり 、ＫＲＨ緩衝液（ウォルターズ，1992）２ｍｇのクラスＩ組換えコラゲナーゼ（ 配列番号：２）、０．８ｍｇクラスII天然コラゲナーゼ、及び１００ユニットの 中性プロテアーゼから構成された。同じ膵島収率を得るのに同じような消化時間 を要することも観察された。 これら結果は、実質的に精製された組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）を含 む組成物は、膵臓組織を分散させて他の膵臓成分から膵島を放出させることを証 明した。更に、組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）と他のプロテアーゼを含む 組成物を用いて膵臓を消化した場合は、ウォルターズの1992年の文献に記載され た他の組み合わせに比較して、膵島当たりより大きな膵島質量を有する膵島がよ り少なくなったことが観察された。本発明の方法を用いて膵臓を消化すると、本 発明の組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）を含まない酵素組成物を用いた場合 に比較して、膵島の完全性への損傷がより少なくなるように思われた。 より大きな動物の膵臓消化から十分な膵島を得るには異なるロットの粗製コラ ゲナーゼ調製物が必要であることは知られている。従って、他の動物の膵臓消化 から膵島調製物を得るには、組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）、又は天然ク ラスIIコラゲナーゼ、又は中性プロテアーゼの量は変動させることができる。組 織消化に有用なタンパク質分解酵素の濃度を決定する手順は、ウォルターズ，19 92に例示されている。高度に精製した組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）を含 む組成物は、ヒトから膵島を単離する本発明の方法に用いることができる。 本発明をある種の好ましい態様に関してかなり詳しく説明してきたが、他の態 様も可能である。従って、補正した請求の範囲の精神及び範囲は、この好ましい 態様の説明に限定されるべきではない。 配列表 配列番号：１ 配列の長さ：2817 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(genomic) 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..2808 配列 配列番号：２ 配列の長さ：936 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：3 配列の長さ：80 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(genomic) 配列 Detailed Description of the InventionMolecular cloning of a gene responsible for collagenase production from Historicus. Background   The present invention is based on the analysis of Clostridium histolyticum collagenase. Isolation and cloning of the encoded genetic information and its genetic information in a suitable host. Regarding expression. In particular, the present invention is based on the discovery of the Histolyticus genomic coding sequence. Histochemistry containing forms with higher molecular weight than translation products measured by natural expression Towards the isolation and cloning of the genetic information encoding the type of C. fungus collagenase Have been.Point   According to the present invention, it has the enzymatic activity and antigenicity of Histolyticus collagenase. A recombinant DNA segment encoding a polypeptide is provided. But Naga Et al., This polypeptide is a natural histolyticus collagenase, Produced by spontaneous expression of the Rhiticus genome and subsequently purified from H. It can be distinguished from the collagenase. The present invention, here referred to as non-natural type This polypeptide of, by natural expression of the Histolyticus genomic coding sequence. It has a higher molecular weight than the measured translation product.   The claimed recombinant DNA segment is a promoter derived from Histolyticus. Including This promoter works independently, Ensure that the claimed DNA segment is transcribed under the control of the promoter. Enabling promoters external to the claimed recombinant DNA segment It produces the claimed polypeptide without functioning.   The claimed recombinant DNA segment is further described as a claimed non-natural, non-naturally occurring fragment. Has collagenase activity, having a lower molecular weight than higher molecular weight polypeptides The native polypeptide can be expressed.   The invention further comprises a host cell comprising the claimed recombinant DNA segment. Vectors that can be transformed to produce the claimed non-naturally occurring polypeptides I will provide a.   We have claimed the claimed recombinant DNA segmentation in transformed host cells. It was found that the expression of the component is determined by the strain of the host cell. Follow Thus, different E. coli host cells transformed with the vectors of the invention are provided. Inn One of the main cell lines is a non-natural polypeptide of the present invention having collagenase activity and antigenicity. Produces tide. The po- gen with collagenase activity produced by this host cell. More than 50% by weight of the total amount of lipid peptides are non-natural high molecular weight polypeptides Including.   The present invention further provides another E. coli host cell transformed with the vector of the present invention. To serve. These host cells have collagenase activity and antigenicity and It produces a polypeptide having a molecular weight of 0. The cells produced by these cells More than 50% by weight of the polypeptide having lagenase activity is 110 kd Contains a lagenase.   Another aspect of the invention is a substantially purified preparation of Historicus collagenase. Related to manufactured goods. One sample contains a non-native form of collagenase. The substance of the present invention Other purified preparations contain collagenase with a molecular weight of 110 kd . These forms of collagenase are found in different strains of different strains transformed with the vectors of the invention. Derived from Enterobacteriaceae host cells.   In addition, colas produced by E. coli host cells genetically engineered according to the invention Methods using genase are provided. These methods involve digestion and embedding of connective tissue. Cell release, isolation of dispersed islets from pancreatic tissue, isolation of endothelial cells from blood vessels, and It is suitable for tumor dissociation to isolate dispersed and dispersed tumor cells. This method , Including the following two steps:   (1) The tissue to be dispersed is a substantially purified genetically engineered collagenase of the present invention. Incubate with shaking in a buffer solution containing Release and disperse embedded cells; and   (2) Separate the dispersed cells from the tissue debris. Separate dispersed cells from tissue debris The step of performing is typically performed by a density gradient centrifugation method.   The genetically engineered Histolyticus collagenase of the present invention has a herniated nucleus pulposus ( It may be used as an intradiscal treatment method for disc herniation. This way Includes the following steps:   (1) Claimed sterile containing substantially purified genetically engineered collagenase A buffer solution of   (2) Containing the claimed substantially purified collagenase. The sterile buffered solution with is injected into the nucleus pulposus.   These and other features, aspects, and advantages of the present invention are described in the following description and attached contract. It will be better understood by referring to the scope of the invention and the accompanying drawings .Figure   FIG. 1 shows the cloning of an intact 125 kd collagenase expression plasmid. FIG.   FIG. 2 shows the expression of collagenase in E. coli strain DH5α.   FIG. 3 shows plasmids pCT6 and p for DNA sequencing of the collagenase gene. 3 shows the construction of CT7.   Figure 4 shows the partial DNA sequence of the gene encoding the 125kd collagenase. The various clones used to define are shown.   FIG. 5 is a transcription termination signal of the 125 kd collagenase gene.   Figure 6a is a Coomassie of 125 kd collagenase compared to commercial collagenase. Blue-stained gel; Figure 6b shows the 125kd codon compared to commercial collagenase. It is a western blot of a lagenase.   FIG. 7 shows in lane 1 the culture from E. coli strain DH5α containing plasmid p70. Shown is a Coomassie blue stained gel of nutrient medium; lane 2 shows purified 12 from culture medium. Coomassie blue stained gel of 5kd collagenase.   FIG. 8 is a restriction map of plasmid pCT11.10.   Figure 9: IPTG recombination from E. coli DH5α carrying pCT11.10. Kumasi showing no induction of collagenase expression -Blue stained SDS-PAGE.   FIG. 10 shows a recombinant collagenase wafer produced from pRS21 and pCT8B. It is a comparison of Stan immunoblot.   FIG. 11a is a Coomassie blue stained SDS-PAGE; FIG. 11b is an im It is a noblot, both of which are intracellular units of recombinant collagenase produced in E. coli. It is demonstrative.   FIG. 12 shows recombinant 110 kd collagenase and naturally produced 110 kd collagenase. 2 shows the results of Coomassie blue staining and immunoblotting for the purification and comparison.Detailed description   The present inventors have cloned the gene of Histolyticus in E. coli. this The cloned gene, ie, the recombinant DNA segment of the present invention, is expressed in E. coli. The product can be expressed as a peptide. The product expressed in E. coli is anti-collagen. Collagenase activity that can be assayed in the form of a protein that is immunoreactive with a nuclease antibody That is, it can also be detected in the form of collagen digestion.   The same recombination with 4.9 kilobases, depending on the E. coli host into which it is inserted Once the DNA segment is translated, as described in Examples 3 and 11 below, It has been found to yield several polypeptides with collagenase activity. Special E. coli strain DH transformed with a recombinant DNA segment according to the invention claimed 5α is a naturally-occurring histolyticus strain that has collagenase activity and antigenicity. A polypeptide was produced which was distinguishable from the lagenase. The light of this non-natural polypeptide A distinct feature is that it is a natural sequence of the Histolyticus genomic coding sequence. So the measured transposition It had a higher molecular weight than the translated product. Hi measured by spontaneous expression Streptococcus collagenase contains a DNA segment encoding collagenase. Produced directly by a histolyticus that does not have the gene vector to be retained It is a type of collagenase that is used. As described in the examples below, various commercial The natural collagenase of Histolyticus purchased from a supplier is a non-natural source of the present invention. It does not have the same molecular weight as collagenase.   As detailed in Example 8, the claimed recombinant DNA segment is It has been found to contain a promoter from Rhiticus. As described below , A 4.9 kb recombinant DNA fragment of the present invention encoding collagenase It contained a Clostridium promoter that functions independently in Enterobacter.   The claimed recombinant DNA segment is more than a non-natural collagenase of the invention. Was found to express a polypeptide with low collagenase activity and molecular weight. It was As described in the Examples, cels expressed from the claimed DNA segment. The relative ratio of natural and unnatural collagenase is claimed via the vector of the invention. Varies according to the E. coli host cell transformed with the DNA segment.   Contains Clostridium DNA after Isolation of DNA from Histolyticus The pRK290 library was constructed (Example 1) and its collagenase gene Screened. The characteristics of the inserted collagenase gene were analyzed by restriction enzyme analysis. (Example 2). Further characterization of the collagenase gene in Example 4 Was done. There, a plasmid p was obtained in which the inserts were sequentially deleted. Placed in CT6 and pCT7 with opposite insertion directions. Sequenced 2551 base pairs did. The complete nucleotide sequence and deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 1. this Further confirmation that the DNA sequence contains the Clostridium collagenase gene This is shown in Examples 5 and 6.   Expression of the Clostridium collagenase gene in E. coli requires Host E. coli cells with a suitable plasmid or other vector carrying Transformation or transfection and detection of collagenase produced by the transformed cells Need to go out. The transformations described in US patent application Ser. No. 07 / 498,919 and Using standard methods for performing collagenase detection, we have determined that Examples 3, 7, 9 10 and 11, the claimed recombinant DNA cell in transformed host cells. The expression of the pigment is confirmed by the strain of the host cell. Example 3 shows about 2% transformation. Recombinant E. coli soluble protein for immunoblotting with anti-collagenase antibody From Western blot and SDS-PAGE with Coomassie blue staining Prove that it was Nase.   As described in Example 8, regulation of collagenase expression in E. coli resulted in histology. Control of an independent promoter containing the claimed DNA segment from Ryticus It was found to be below.   The present inventors have demonstrated that transformed E. coli cells can be prepared as described in Example 10 below. And production of natural and unnatural collagenase from the culture medium in which these cells are grown And purified. Purification of these enzymes from cells is performed using standard techniques known in the art. It included a method. The present inventors have surprisingly found that these transformed cells are A large amount of collagenase was found in the grown fermentation broth. That observation Of the substantially pure unnatural collagenase and the 110 kd collagenase. A collagenase purification strategy was set up to obtain the preparation.   The collagen digestion activity of recombinant collagenase purified from transformed cells It was found that the activity was almost equal to that of the recombinant collagenase purified from (Example 1 0 Table 1). The collagen-digesting activity of purified recombinant non-natural collagenase was evaluated using commercially available A comparison was made with native purified collagenase (Table 2 of Example 11). Recombinant collagenase , Worthington Chemical, Sigma Chemical, and Carba 50% to 10% more active than natural collagenase obtained from Iochem (CalBiochem) It was 0% higher.   Produced by genetically engineered E. coli containing the claimed DNA segment Purified recombinant non-natural or recombinant natural 110kd collagenase digests collagen It can be used in any application where it is desired to Isolate cells from tissue For specific applications that release: (1) without destroying cell membranes and other essential features Digesting connective tissue to release embedded cells; (2) isolating endothelial cells; (3) Dissociating the tumor; and (4) Intradiscal treatment of herniated nucleus (disc herniation) Is included. As shown in Example 12, the purified 110 kd recombinant collagen of the present invention Nase isolates endothelial cells from human saphenous vein when combined with trypsin It was effective.   To obtain a dissociated tissue sample using the method of the invention, depending on the target tissue and animal Recombinant collagenase (SEQ ID NO: 2), or native class II collagenase, or The amount of neutral protease varies Moyo (G.H.J.Wolters), “An Analysis of theRole of Colla genase and Protease in the EnzymaticDissociation of the Rat Pancreas for  Islet Isolation ", Diabetologia, 35: 735-742 (1992)). Type and amount of neutral protease required with recombinant collagenase in the method May vary depending on the target tissue. Digesting tissue using the method of the invention or To dissociate, a protease other than crude or purified natural collagenase was It may also be used in a composition comprising lagenase (SEQ ID NO: 2).Example   The following examples are for illustration only and are to be construed as limiting the invention. I'm not.Example 1 Cloning of a gene encoding an intact 125kd collagenase and screening Long   The orientation of the gene encoding the intact 125 kd collagenase is described in US patent application Ser. Confirmed in 7 / 498,919. As described in Examples 4 and 5 below. The end point of the gene was confirmed by sequencing the gene and It turned out to be close. 2.5 kbD, as specified by the information above NA fragment passes from the first EcoRI site to the second EcoRI site And extended to the Bgl II site. 2.5 kb DNA fragment is about 125 k It is not large enough to encode a collagenase with a molecular weight of d. That Requires about 4.4 kb. Therefore, identify more collagenase gene sequences Try Then, a new library was prepared. This is the construction of the Bgl II library. Included.   Direct conversion of genomic DNA to small plasmids such as pBluescript An attempt was made to clone the BglII fragment into close proximity. We have 12 A collagenase band was identified at a molecular weight of 5 kd, but included two independent experiments In the second screen, the molecular weight appeared to be 68 kd.   The present inventors have found that pRK290 (Haas, D., Experientia, 39: 1199 ( 1983)) and other low copy number (1-10 copies per cell) other plasmids I was there. This allowed cloning of the full-length collagenase gene. However, the BglII fragment was cloned into a small plasmid such as pUC8. The difficulty of rolling remained. Nevertheless, the present inventors have found that full-length collagenase Construction of such a pUC8 plasmid incorporating the gene was achieved. A.DNA isolation from Histolyticus   American type culture of Histolyticus ATCC21000 Got from the collection. A paper tablet containing this bacterium was first prepared in TYE broth. 15 g trypsin, 10 g yeast extract, and 5 g NaC per liter of culture medium It was immersed in l) at 4 ° C. for 30 minutes with occasional shaking.   This cell suspension was spread on a TYE agar plate and grown at 37 ° C under anaerobic conditions. I was raised. Single colonies picked and grown in 50 ml TYE broth, anaerobic It was grown under conditions of 37 ° C. The cells were harvested by centrifugation and the TES (0. 1M Tris (pH 8. 0), 0.1 mM EDTA, and 0.15 M NaCl). This The cells were partially lysed by freezing and thawing the cell suspension in 4 times. Next , SDS and Pronase K were added to 0.5% and 200 μg / m, respectively. L was the final concentration. 10,000 rpm in a Beckman J2-21 centrifuge Cell debris was removed by centrifugation at 4 ° C for 30 minutes. Add an equal volume of supernatant liquid. 3 times extraction with ethanol-chloroform to precipitate the DNA with isopropanol It was The DNA was electrophoresed on an agarose gel and after addition of ethidium bromide DNA concentration is measured by comparing the fluorescence with that of a known concentration standard. Decided The average size of purified Clostridium DNA is 0.6% agarose gel. Were 30 kb and 40 kb as determined by electrophoresis at. B.Construction of pRK290 library containing Clostridium DNA   Purified Histolyticus chromosomal DNA was digested with the restriction enzyme BglII. Ethano Digestion DNA after TE precipitation (10 mM Tris (pH 7.4), 0. Resuspended in 1 mM EDTA). Preliminary Bgl digestion of appropriate amount of digested DNA It was ligated with pRK290 which had been cleaved with II and treated with alkaline phosphatase. Communicating The binding was performed at 4 ° C. for 16 hours. This ligated DNA was used as described for E. coli strain D Transformed into H5α. Transformed cells with TYE-Tc (15 per liter) g tryptone, 10 g yeast extract, 5 g NaCl, and 15 mg tetracycline Phosphorus) plates and incubated at 35 ° C. overnight. C.Collagenase gene screening   About 1,000 colonies were obtained per plate. About 10 plates intact collagena Were screened for enzyme genes. Briefly, 16 hours at 35 ℃ After incubating, dry nitrocellulose paper (S & S ) Were placed on Petri dishes to absorb the colonies. That nitrocellulose Carefully separate the taper from the plate and remove the freshly prepared TYE-Tc agarp. Transferred to a plate and incubated at 35 ° C. for an additional 4 hours. Original plate Was stored as a master plate at 4 ° C. Be careful with nitrocellulose paper And remove from the plate, 0.1M Tris (pH 8.0), 0.2M N Soak in aCl and 5% skim milk and shake gently to remove the nitrose. Bacterial cells were removed from the lulose paper. Use this nitrocellulose paper Heron anti-collagenase antibody (see Example 2 of US patent application Ser. No. 07 / 498,919). At a dilution of 1: 1000 with 5% skim milk at room temperature Incubate for 1 hour, 0.2M NaCl and 1% Triton ™ X-1. Washed with 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 00, 5% skim with protein A-horseradish peroxidase complex Incubated for 1 hour at room temperature at a dilution of 1: 1000 in PBS containing Luk. R.A. Young & R.W. Davis, “Efficient Isolation of Gen es byUsing Antibody Probes ”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80,1194-119 8 (1983) and repeated washing operations to obtain this nitrocellulose page. Par in PBS with 4-chloro-1-naphthol and H2O2The color was developed.   The agaro on the plate corresponding to the position of the positive signal on this nitrocellulose An aliquot was taken and resuspended in TYE-Tc broth. Gradual to low cell density The diluted cell suspension (30-100 cells per plate) was diluted with TYE-Tc Re-plated on a plate and screened a second time to identify single colonies . This single colony, designated P70, showed a strong signal. Collect this And grown in TYE-Tc broth. The characteristics of this colony are described in Example 2 and below. And 3 more clearly.Example 2 Restriction enzyme analysis of inserted DNA   More accurately characterize the organization of Clostridium DNA in plasmid P70 For this, P70 was subjected to further restriction enzyme analysis. DN from plasmid P70 A was prepared as described (Maniatis). Bg of purified DNA Digested with II to release the cloned DNA insert. Apparent size is 4. The 9 kb DNA fragment was digested with Bgl II to give the vector pRK290. Released. P70 was further digested with BglII and EcoRI, Compared to pBB1 and pRS21 digested with the same enzymes. All three plasmids Released the same 1.7 kb EcoRI-BglII fragment. P70 and And pBBl both contain the same 0.8 kb EcoRI-EcoRI fragment. Released. These restriction enzyme analyzes show that all three plasmids have a common DNA flag. And P70 is a surplus of the 2.4 kb BglII-EcoRI fragment. It was suggested that it had a piece.Example 3 Characterization of collagenase produced in E. coli strain DH5α   Centrifuge cells containing P70 to determine size of immunoreactive protein Collected by separation, resuspended in gel running buffer, heated and Laemri (Laemri) mli, U.K.), “Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the  Head of Bacteriophage T4 ”, Nature, 227: 680-685 (1970) It was run on a 7.5% SDS-polyacrylamide gel. Nitro those proteins Electroblotted onto Cellulose Paper, US Patent Application No. 07/498 , 919 (W.H. Burnette), “Western Blotting: Electrophore tic Transfer of Proteins form SDS-polyacrylamide Gels to UnmodifiedNitroc ellulose and Radiographic Detection with Antibodyand Radioiodinated Prot ein A ”, Anal. Biochem., 112, 195-203 (1981)) rabbit anti-collagenase antibody Detected in. The molecular weight of collagenase from the P70 clone was determined by prestaining Determined by comparison with the quality standard.   An immunoreactive protein band with a molecular weight of about 125 kd and below is P Expressed from 70 clones. Several bands with a molecular weight of 68-100 kd Is similar to that described by the inventors in US patent application Ser. No. 07 / 498,919. are doing.   The E. coli strain DH5α was transformed with the plasmid pUC8 or P70, respectively. Grow in 50 ml TYE broth in a 50 ml flask. Collect cells Resuspend in 10 mM Tris (pH 7.4) and 1 mM PMSF and sonicate Wave treated. Centrifuge After removing cell debris by detachment, measure the protein concentration to determine the same amount of protein. Was loaded on a 7.5% SDS-polyacrylamide gel and electrophoresed.   The expression of the recombinant DNA segment of the present invention is shown in FIG. Panel A is Coomassie Blue SDS-PAGE. Lane 1 carries plasmid pUC8 E. coli strain DH5α, lane 2 is E. coli strain DH carrying plasmid P70 It is 5α. Panel B shows a cell extract prepared from an E. coli strain carrying P70. Coomassie blue stain (lane 1) and immunoblot (lane 2) SDS-PA It is GE.   prepared from cells harboring plasmid P70 but not cells harboring pUC8 In the cell extract, the very strong Coomassie blue stained protein band had a molecular weight of 2 It was visualized between 00 and 97 kilodaltons. Plasmid P70 type The quality-converting Escherichia coli strain DH5α was added to a 5 liter BioFlo II Fermentor. ) To produce collagenase. Collect those cells by centrifugation After harvesting, the cell paste was stored at -70 ° C. Further processing on small amount of cells The purification conditions were determined. Sonicate and clarify the supernatant and stain it with Coomassie blue. And panel of Figure 2 tested by immunoblotting with anti-collagenase antibody. Shown in B. Coomassie stained bands are in the same position as immunoreactive protein bands Met. Therefore, it is a Coomassie blue that exists between 200kd and 97kd. It was confirmed that the stainable band was collagenase. Which growth Even under the conditions, approximately 2% of the E. coli soluble protein was determined to be collagenase. It wasExample 4 Characterization of the collagenase gene A.DNA sequencing strategy   Henikoff (S.) (Methods in Enzymology, Unidirectional Digesti on With Exonuclease III in DNA Sequence Analysis, 155: 156 (1987)) A slight modification of the represented non-random DNA sequencing strategy was performed with pBB1. Sequencing of the encoded 2.5 kb EcoRI-BglII DNA fragment Used to determine. The 2.5 kb BamHI / BglII fragment was added to plasmid p Insertion in the opposite direction to the BamHI site of Bluescript SK (-) The plasmids pCT6 and pCT7 were constructed by   Plasmids pCT6 and pCT7 were cloned from P42 to 2.5 kb BamHI-B The glII fragment was added to the BamHI site of the plasmid pBluescript. Constructed by inserting. Plasmids pCT6 and pCT7 are shown in Figure 3. Thus, the opposite insertion direction is indicated. Unidirectional deletion In order to generate (ion), both plasmids are first digested with XhoI and KpnI, Recessed 3'-hydroxyl end of double-stranded DNA and 3'-end protruding at the other end made. This recessed 3'-hydroxyl end created by XhoI Made by KpnI, which was sensitive to donuclease III and was gradually removed The protruding 3'-end that was left intact. Digestion should be done away from the cleavage site. In one direction into specific DNA sequences. The degree of digestion was controlled by time. Alicho collected at different times Were subjected to S1 nuclease digestion. This digested DNA sample is agarose gel Contains DNA fragments with the desired size, analyzed by electrophoresis The sample was identified. Add Klenow DNA polymerase to flatten both DNA ends. I slipped. The plasmid was recircularized by adding T4 DNA ligase. Next The ligated DNA was transformed into E. coli strain DH5α.   After transformation, the cells are plated on TYE-Ap plates at 35 ° C. It was grown overnight. Colonies were prepared for deletion inspection and DNA preparation for sequencing. Randomly picked up and grown overnight in 5 ml TYE-Ap broth. Centrifuge Cells were harvested from overnight cultures by detachment. Buffer cell pellet with Tri-EDTA buffer Resuspend in liquid and dissolve by using the alkaline method described in Maniatis did. After ethanol precipitation, the DNA pellet is dried briefly and TE (10 mM Tri Solution (pH 8.2), 0.1 mM EDTA). The size of the deletion is limited It was examined by restriction enzyme analysis. A clone with the appropriate deletion was identified to identify RNase. Further treatment with A. After digestion with RNase, the DNA was treated with 10 PEG and 1.25 M Precipitated with NaCl. Wash the DNA pellet with 100% ethanol and buffer with TE Resuspend in liquid. The DNA prepared by this method is a Sanger dideoxy Termination method (Sanger, F.) and Carlson (A.R. Cou lson), J. Molec. Biol. 94: 441 (1975)). . The clones used for DNA sequencing and the sequence information obtained are summarized in FIG. is there In some cases, plasmid pCT12.8 was systematically deleted and subclones were used. The part of the lever sequence was determined. Plasmid pCT12.8 contains the 4.9 kb BglII fragment of P70 in B To be inserted into pBluescript (SK-) pretreated with amHI So it was built. B.DNA sequence and analysis   The complete sequence of 2808 base pairs is shown in SEQ ID NO: 1. This DNA sequence is Usually a high proportion of A and T nucleotides (69%) and only 31% G and C nucleotides. Contains cleotide. From the first EcoRI site through the second EcoRI site Open reading that ends with a TAA stop codon located at base pair 2808 The gram frame was identified. A putative protein sequence containing 936 amino acids was identified Is shown in SEQ ID NO: 2. This part is usually compared to most other proteins It contains highly charged amino acids (30%).   As shown in FIG. 5, a typical bacterial transcription termination signal (GeneFunction in Prok aryotes, edited by J. Beckwith et al., p.123, Cold Spring Harbor Labo Ratory, Cold Spring Harbor, NY (1983) and Platt (T.) and Bear (D. G. Bear)) was identified 11 base pairs downstream from the transcription termination signal (TAA). It was This signal consists of an AT-rich sequence following the stem-rope structure. This Data show that this collagenase gene is the AT downstream of this stem-rope structure. It is suggested that it will end within the rich region.Example 5 Conventional clone DNA sequence comparison   All traditional clones have their migration on the immunoblot Judging from the degree, it was clear that the same immunoreactive protein band was produced. However, it did not rule out the possibility of microvariability. If it has been obtained in the past If there is a slight variability between clones that Wart) et al. [REF] proposed a different gene duplication and subsequent mutations. May have supported the notion that it resulted in collagenase.   In order to confirm their identities, we carried out the following two DNA sequence projects. 1) with different inserts such as P6, P9, P41, P42, and P51 Sequence comparison between clones and 2) Conventionally all seemingly have the same insert size Sequence comparison between the different original isolates obtained. Place multiple cloning sites on both ends The flanked DNA sequence was sequenced using flanking universal primers. The row was decided. Clostridium DNA sequence of average 150-200 base pairs at both ends Got from No single base pair difference was also identified after comparing the sequences. This result is , Heredity as a means of controlling differences in collagenases of the same class Did not support child duplication. Example 6Of the DNA sequence of the P70-derived clone and the sequence from the previously obtained clone Comparison   To determine the identity of P70 with other previously obtained clones, many clones were used. The sequences were partially sequenced and compared. 0.7 kb EcoR from clone P70 The I and 1.8 kb EcoRI-BglII fragment was added to pUC13 or pBlue. in escript Subcloned. A DNA sequence with multiple cloning sites at both ends Sequenced using King Universal primer. Plasmid pBB1, p The flanking sequences of RS21 and P41 were determined from the P70 subclone. The obtained sequence was compared. No difference was found. The result shows that P70 is p It has the same DNA fragment as BB1 and is located at the same position on the chromosome. Was suggested. Example 7Collagenase produced from P70 subclone and Collagen produced from pRS21 Comparison with Genase   To further characterize the identity between P70 and the other clones described above. , A collagenase product produced from a subclone with apparently the same insert Compared. P70 was digested with BglII and EcoRI to give BamHI and Ec Ligated with pUC18 pre-digested with oRI. Ligated DNA to E. coli strain DH5α Transform, plate on TYE-Ap plates and incubate at 35 ° C overnight. Was added. Containing the 1.7 kb EcoRI-BglII insert and pRS2 A clone with the same insertion direction as 1 was identified and named pCT8B. Plastic E. coli strain DH containing either pCT8B, pRS21, or pUC18 5α was grown overnight in TYE-Ap broth at 35 ° C. By centrifuging the cells The cells were collected and disrupted with SDS-PAGE running buffer. Released protein Apply 7.5% SDS-polyacrylamide gel to nitrocellulose paper Electroblotted. Detect and compare immunoreactive bands as described above did. FIG. Lysate produced from E. coli harboring pUC18, as shown in Lane 1 of 0. Did not yield an immunoreactive collagenase band. However, pRS We want to produce from E. coli harboring 21 (lane 2) or pCT8B (lane 3) The other cell lysates also have the same immunoreactive protein with a molecular weight of 68 kd The band was shown. This is an indication that both produce the same protein. I am (lane 10). Example 8Expression of collagenase in Escherichia coli by an independent promoter derived from Historicus. Control of   4.9 kb from P70 in plasmid pUC13 pre-digested with BamHI The plasmid pCT11 was cloned by cloning the Bgl II fragment. ． 10 was constructed and shown in FIG. The transcription direction of this collagenase gene is Same as Romotor.   E. coli DH5α containing the plasmid pCT11.10 was treated with 50 ml of TYE- Shake overnight at 32 ° C. with or without 1 mM IPTG in Ap broth. It was grown while (130 rpm). The cells and the supernatant are separated by centrifugation. It was Incubate the cells and the supernatant with running buffer at 95 ° C before , 7.5% SDS-polyacrylamide gel. Source of supernatant and cells 20 μl and 80 μl, which are equal to the respective volumes, were loaded in each lane and shown in FIG. . The protein profile of the cell extract after Coomassie blue staining is shown in the lane in FIG. It is shown in 1 (including IPTG) and 2 (without IPTG). Culture medium protein profile Wheel Lanes 3 (including IPTG) and 4 (without IPTG) are shown in FIG.   Recombinant of both cell extract and culture medium with or without IPTG It did not show any difference in the expression of collagenase. Strong lac promoter The inducer IPTG did not increase collagenase expression. with this, Clostridia that allows a 4.9 kb DNA fragment to function independently in E. coli It was further confirmed to contain the mu promoter.   Unexpectedly, as shown in lanes 3 and 4 of FIG. Found in the liquid. Equivalent amount of supernatant (20 μl) was added to the equivalent amount of cells ( Since it was 1/4 of 80 μl), 80% of the collagen was judged from the stained gel. It was estimated that the enzyme was present in the supernatant. Accumulation of collagenase in culture medium Indicates that the E. coli cells secreted collagenase into the medium. These cells contain the recombinant gene segment of the invention encoding collagenase. For producing or purifying collagenase from the culture medium in which these host cells grow It has the benefit of providing a simple and cost effective method.Example 9 Intracellular localization of collagenase expressed in Escherichia coli.   The intracellular localization of collagenase within different E. coli compartments was investigated. E. coli strain DH5α containing plasmid P70 was placed in TYE-Tc broth at 35 ° C. It was grown for 5 hours with shaking. Cells were harvested by centrifugation. Cell Lett in 30 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20% sucrose buffer. Resuspended. Lysozyme (70 microgram / ml) and EDT A (2 mM) was added and incubated at 4 ° C. for 30 minutes to decompose the cell wall. The periplasmic fraction was separated from the cytoplasmic and membrane fractions (CM fraction) by centrifugation. This The peripheral and CM fractions were examined by SDS-PAGE and stained with Coomassie blue. And immunoblotting. As shown in panel A of FIG. -A clear protein band with a molecular weight of 125 kd was found on the blue stained gel. It was found in the limbal fraction (lane 1) and slightly in the cytoplasmic fraction (ray). 2).   As shown in panel B of FIG. 11, many immunoreactive bands were detected in the immunoblot. Therefore it was seen. Most of the bands were in the periplasmic area (panel B lane 1) . This is because the proteins corresponding to these bands are secreted through the inner membrane and It suggests that it can be accumulated in. Based on the amount loaded on the gel (The periplasmic fraction was applied at half the stock solution equivalent to the CM fraction), 80% of 12 It is estimated that the 5kd collagenase is localized in the periplasmic region. Periplasmic area and fine The ratio of immunoreactive bands existing in the cytoplasmic region (lane 2) is shown by However, most of these bands have apparently a molecular weight of 68 kd. It is rather localized in the periplasmic region, except for the protein band with. this The 68 kd protein is rather located in the cytoplasmic region and in the periplasmic region. Not not. This means that this 68kd collagenase is efficiently transported through the inner membrane. Suggests that it cannot be done. This 68kd protein is produced in pRS21 It is unknown whether it is the same as the isolated 68kd protein, but it is produced in pRS21. Secreted 68kd protein is secreted into the periplasmic region I couldn't. These data are for the 125 kd produced in E. coli. Collagenase, which has high molecular weight, passes through the inner membrane using the secretion mechanism of Escherichia coli. It has been shown that it can be transported and accumulated in the periplasmic region.Example 10 Collagenase production and purification from E. coli cells and culture media. A.Collagenase production from E. coli   The E. coli strain W3110 carrying the plasmid P70 was cloned into New Brunswick Collagenase was grown in a New Brunswick Bioflo III fermentor. Produced. Fermentation medium (FM, grams per medium liter) is KH2POFour, 3 ． 5; K2HPOFour, 5.0; (NHFour)2HPOFour, 3.5; MgSOFour・ 7H2O , 3.5; yeast extract, 5; and tryptone, 5. 50% glucose Were autoclaved separately and 10 ml was added per liter. CaCl2 And ZnCl21M stock solution is prepared and separately autoclaved and 20 μl each was added per turn. The E. coli strain harboring P70 was TYE- Grow overnight at 30 ° C in Tc. This overnight culture was inoculated directly into the fermenter. After OD600 reached a cell density equal to 16, cells were harvested by centrifugation. And separated from the supernatant. B.Purification from cells   Cells were harvested by centrifugation and 10 mM Bis-Tris containing 1 mM PMSF. Resuspended in S buffer (pH 6.5). Cells are disrupted by sonication and The pieces were removed by centrifugation. Proteins are sequentially ammonium sulfate precipitated (sequen tial ammonium It fractionated by sulfate precipitation). 1 fraction containing collagenase Resuspend in 0 mM Bis-Tris buffer (buffer A) at 4 ° C against the same buffer Dialyzed overnight. The dialysis sample was first subjected to DE52 column chromatography. Fractionated. Fractions containing collagenase were pooled and dialyzed against buffer A It was The dialyzed sample was fractionated by Q Sepharose column chromatography . Gel filtration may be necessary to obtain greater than 98% purity. Origin of departure Many immunoreactive collagenase bands coexisted in the material. Anion exchange column Chromatographic separation of collagenases of different molecular weights to some extent I was able to. In the experiment described in Example 11 below, the largest form of collagenase Was used. C.Purification from medium   Surprisingly, a large amount of collagenase was detected in the fermentation broth. From the culture medium A purification strategy was set up to assess the potential of collecting and purifying the lagenase. Briefly, after removing cells by centrifugation, the supernatant was concentrated to Diafiltration using hollow fiber (Amicon) with a cut-off of 1,000 molecular weight Diafiltrate. The concentrated supernatant liquid was subjected to the ammonium sulfate differential precipitation method (dif It was fractionated by ferential precipitation). Collect the fraction containing collagenase Collect, resuspend in Bis-Tris buffer (pH 6.5), and permeate the same buffer. Was analyzed. Place the dialyzed sample on a DE52 column (Whatman) and dissolve with NaCl. I let it out. Fractions containing collagenase were collected and collected on a Q Sepharose column (Phar It was further purified by Lumasia). Lane 1 in Figure 7 is positive Culture medium from E. coli strain W31I0 carrying amide P70 (lane 1) and this Shown is a Coomassie blue stained gel of collagenase (lane 2) purified from the culture medium. You Collagen digestive activity of collagenase prepared from both cells and culture medium Compared. Collagenase prepared from the medium is about twice as much as that prepared from cells. It had activity. D. Collagen digestion of collagenase purified from cells and mediumActivity   Collagen of the recombinant collagenase of the present invention purified from either cells or culture medium Digestive activity was measured. Activity was measured as described in Example 11 below. . Table 1 below summarizes these activities.   The results in this table show that collagenase activity purified from the medium was It shows that the activity is almost equal to that of the recombinant collagenase.Example 11 Between recombinant collagenase and natural collagenase produced by Histolyticus Comparison A.size   Natural Collagen Produced by Histolyticus with Identification of Recombinant Collagenase Compared with Nase. Both unpurified and purified native collagenase were treated with Sigma, Ringer Mannheim Products (collagenase A (CHSA), collagena Case B (CHSB), collagenase D (CHSD)), Worthington, and mosquito I purchased it from Rubaiochem. Collagenase from different sources for SDS-PAGE And examined their molecular weight. Typical Coomassie blue stained gel and Imnobu The lot is shown in FIG. FIG. 6 shows recombinant collagenase (RCL) and natural collagenase. Shown is a comparison between the two; panel A is a Coomassie blue stained gel; panel B is SD It is a Western blot of S-PAGE.   The lane assignments in Figure 6 are as follows: Panel A: Lane 1, 0.5 μg lot 17RCL; Lane 2, 2.5 μg Lot 17RCL; Lane 3, 2.5 μg CHSD (BMB); Lane 4, 1 0 μg CHSD; lane 5, 2.5 μg CHSB; lane 6, 10 μg C HSB; lane 7, 2.5 μg CHSA; and lane 8, 10 μg CHSA. . Panel B: Lane 1, 0.01 μg lot 17 RCL; Lane 2, 0.05 μ g lot 17RCL; lane 3, 0.2 μg CHSD: lane 4, 0.2 μg g CHSB; and lane 5, 0.5 μg CHSA.   Purified recombinant collagenase of the present invention was obtained from Boehringer Mannheim. Compared to commercial collagenases (catalog numbers CHSA, CHSB, and CHSD) did. Different amounts of protein were run on a 7.5% SDS polyacrylamide gel . Collagenase on Western blot was detected by rabbit anti-collagenase antibody . Preparation of anti-collagenase antibodies is described in US patent application Ser. No. 07 / 498,919. did.   Although many proteins can be visualized by Coomassie blue staining, More than 50% of the peptides cannot be detected by the collagenase-specific antibody. maximum A type of recombinant collagenase is apparently obtained from Boehringer Mannheim. It exhibits a larger size than any of the native forms of lagenase. The recombinant collagen of the present invention Natural Collageners from Nase and Calbiochem, Worthington, and Sigma Identical results were obtained in comparison with ze.   Of a recombinant collagenase similar to the natural product maximum collagenase (110 kd) The type can be produced quantitatively and evenly in a special E. coli host (JM105 strain). I was able to. B.Activity   Collagen digestion activity of purified natural collagenase from different vendors Sex was compared to purified recombinant collagenase with a molecular weight of 125 kd. Coller Gen-digestive activity was determined by Mendl, I. et al., J. Clin. Invest., 32: 1323 (1953). The measurement was performed according to the method modified with. The major changes were 1) changing the amount of enzyme used to 0. 2 or 0.4 μg, and 2) the substrate (type 1 collagen) concentration The increase was 10 mg / ml. Collage Nase activity is defined as: 1 unit of collagenase activity is 37 ° C Of L-leucine released from collagen after incubation for 5 hours in Equivalent to 1 μmol equivalent. The enzymatic activities of different purified collagenases are shown in Table 2 below. .   The collagen digestive activity of recombinant collagenase is similar to that of natural purified collagenase. Was about 25-100% higher than This result indicates that the recombinant collagenase of the present invention. Clearly suggests that is superior to natural collagenase.Example 12 Endothelial cell isolation with recombinant collagenase + trypsin   Using the purified recombinant collagenase of the present invention produced in E. coli, human saphenous vein Endothelial cells were collected. Divide the human saphenous vein into halves and use 0.1% type II Filled with Lagenase (Worthington), 0.5% BSA, and PBS / CMF , 0.048% in the same buffer with or without 0.01% trypsin Recombinant Photoshop Filled with Genase. Recombinant collagenase alone will release endothelial cells from this vein. I didn't let go. Yield of endothelial cells by combining RCL and trypsin Was doubled compared to crude collagenase. These results show that the recombinant More endothelium by combining lagenase with a constant concentration of trypsin It proved that the cells could be isolated. These results are useful for cell isolation from different tissues. , It is possible to replace the natural collagenase with the recombinant collagenase of the present invention. Further suggested that.Example 13 Isolation of rat pancreatic islets using an enzyme mixture containing recombinant collagenase   Recombinant collagenase (SEQ ID NO: 2), natural class II collagenase, and neutral A composition containing a protease was made and the pancreatic tissue was dispersed to release the islets.   Purified recombinant co-produced from E. coli having a molecular weight of about 110,000 daltons Lagenase (SEQ ID NO: 2) was used to assay rat pancreas according to the method of the present invention. The pancreatic islets were collected. Native class I and II collagenases and neutral proteases are , Walters, “An Analysis of the Role of Collagenase and Protease in the Enzymatic Dissociation of the Rat Pancreas for IsletIsolation ”, Dia Prepared according to betologia, 35: 735-742 (1992).   Digestion of rat pancreas was performed as per Walters (1992). Recombinant collagener Ze (SEQ ID NO: 2), a natural class II collagenase and a neutral protease The mixture is either a crude collagenase preparation or a purified natural collagenase and a neutral protease. The combination of It resulted in the same rat islet yield as when used. This mixture per 10 ml , KRH buffer (Walters, 1992) 2 mg of class I recombinant collagenase ( SEQ ID NO: 2), 0.8 mg class II natural collagenase, and 100 units It was composed of neutral proteases. Similar digestion time to get the same islet yield It was also observed that   These results include substantially purified recombinant collagenase (SEQ ID NO: 2). The composition is shown to disperse pancreatic tissue and release islets from other pancreatic components. Revealed In addition, it contains recombinant collagenase (SEQ ID NO: 2) and other proteases Digestion of the pancreas with the composition is described in Walters, 1992. Islets with greater islet mass per islet compared to other combinations. It was observed that the amount became less. When the pancreas is digested using the method of the present invention, When the enzyme composition containing no recombinant collagenase (SEQ ID NO: 2) of the invention is used There appeared to be less damage to the integrity of the islets compared to.   Different lots of crude cola to obtain sufficient islets from the pancreatic digestion of larger animals It is known that a genase preparation is needed. Therefore, the pancreatic digestion of other animals To obtain a pancreatic islet preparation from, recombinant collagenase (SEQ ID NO: 2) or natural The amount of ras II collagenase, or neutral protease, can vary. set Procedures for determining the concentration of proteolytic enzymes useful in textile digestion are described by Walters, 19 Illustrated at 92. Contains highly purified recombinant collagenase (SEQ ID NO: 2) The composition can be used in the method of the present invention for isolating pancreatic islets from humans.   Although the present invention has been described in considerable detail with respect to certain preferred embodiments, other aspects It is also possible. Therefore, the spirit and scope of the appended claims should be regarded as preferred It should not be limited to the description of aspects. Sequence listing SEQ ID NO: 1 Array length: 2817 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: DNA (genomic) Sequence features   Characteristic symbol: CDS   Location: 1..2808 Array SEQ ID NO: 2 Array length: 936 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Protein Array SEQ ID NO: 3 Array length: 80 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: DNA (genomic) Array

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 9/52 9152−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI C12N 1/21 8828-4B 9/52 9152-4B // (C12N 1/21 C12R 1:19)

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．ヒストリチクス菌のコラゲナーゼの酵素活性を有するポリペプチドをコード しているヒストリチクス菌由来のＤＮＡを含む組換えＤＮＡセグメントであって 、該ポリペプチドは、ヒストリチクス菌のゲノミックコード配列の自然発現によ り測定された翻訳産物よりも高い分子量をもつ点で、ヒストリチクス菌のゲノミ ックコード配列の自然発現により測定された翻訳産物と区別できるものである、 上記の組換えＤＮＡセグメント。 ２．転写されてｍＲＮＡを生成することができ、該ｍＲＮＡは翻訳されて請求項 １のポリペプチドを生成することができる、請求項１に記載のＤＮＡセグメント 。 ３．転写されてｍＲＮＡを生成することができ、該ｍＲＮＡは翻訳されてヒスト リチクス菌コラゲナーゼの抗原性を示す請求項１のポリペプチドを生成すること ができる、請求項１に記載のＤＮＡセグメント。 ４．前記のＤＮΛセグメントがヒストリチクス菌由来のプロモーターを含み、そ れゆえ、該ＤＮＡセグメントは、宿主細胞のゲノムに組み込まれると、該ＤＮＡ セグメントと無関係なプロモーターの作用を受けることなく、ヒストリチクス菌 由来の該プロモーターの制御下で転写され得る、請求項１に記載のＤＮＡセグメ ント。 ５．ヒストリチクス菌の構造遺伝子がコラゲナーゼ活性を有するポリペプチドを さらに発現することができ、該ポリペプチドは請求項１のポリペプチドよりも低 い分子量をもつものである、請求項１に記載のＤＮＡセグメント。 ６．宿主細胞を形質転換することができるプラスミドの中に請求項１のＤＮＡセ グメントを組み入れてあるベクターであって、該プラスミドは薬剤耐性マーカー と複製起点の両方をもつプラスミドの群から選ばれたものである、上記のベクタ ー。 ７．前記の宿主細胞が E．coli、Bacillus subtilis、ヒストリチクス菌、およ び酵母よりなる群から選ばれる、請求項６に記載のベクター。 ８．請求項６ベクターで形質転換された、コラゲナーゼ活性を有しかつヒストリ チクス菌コラゲナーゼの抗原性を有するポリペプチドを産生する E．coli宿主細 胞であって、該ポリペプチドは、ヒストリチクス菌のゲノミックコード配列の自 然発現により測定された翻訳産物よりも高い分子量をもつ点で、ヒストリチクス 菌のゲノミックコード配列の自然発現により測定された翻訳産物と区別できるも のである、上記の E．coli宿主細胞。 ９．請求項６のベクターで形質転換された、コラゲナーゼ活性を有するポリペプ チド類を産生する E．coli宿主細胞であって、産生された、コラゲナーゼ活性を 有する総ポリペプチド類の約５０重量％以上がヒストリチクス菌のゲノミックコ ード配列の自然発現により測定された翻訳産物よりも高い分子量をもつポリペプ チドで占められている、上記の E．coli宿主細胞。 10．請求項６のベクターで形質転換された、コラゲナーゼ活性を有する分子量が 約１１０，０００ダルトンのポリペプチドを産生する E．coli宿主細胞であって 、約１１０，０００ダルトンの分子量の該ポリペプチドが、産生された、コラゲ ナーゼ活性を有する総ポリペプチドの約５０重量％以上を占めている、上記の E ． coli宿主細胞。 11．ヒストリチクス菌のゲノミックコード配列の自然発現により測定された翻訳 産物よりも高い分子量を有するヒストリチクス菌コラゲナーゼの実質的に精製さ れた調製物。 12．Clostridium ＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換した E．coliから精製 された請求項10に記載の調製物。 13．Clostridium ＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換した E．coliから調製 された、約１１０，０００ダルトンの分子量を有するヒストリチクス菌コラゲナ ーゼの実質的に精製された調製物。 14．ヒストリチクス菌のゲノミックコード配列の自然発現により測定された翻訳 産物よりも高い分子量を有するヒストリチクス菌コラゲナーゼの実質的に精製さ れた調製物を含有する組成物。 15．Clostridium ＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換した E．coliから調製 された、約１１０，０００ダルトンの分子量を有するヒストリチクス菌コラゲナ ーゼの実質的に精製された調製物を含有する組成物。 16．細胞膜および他の必要な構造を破壊せずに結合組織を消化して包埋細胞を放 出させる方法であって、次の段階： (a) 請求項11の実質的に精製されたコラゲナーゼを含有する緩衝溶液中で組織 を約２５〜３９℃で振とうしながらインキュベートし、包埋細胞を放出および分 散させること；および (b) 分散した細胞を組織破片から分離すること； からなる方法。 17．分散した細胞を組織破片から分離する段階を密度勾配遠心分離により行う、 請求項16に記載の方法。 18．Clostridium ＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換した E．coliから調製 された、約１１０，０００ダルトンの分子量を有するヒストリチクス菌コラゲナ ーゼの実質的に精製された調製物を用いる、請求項16に記載の方法。 19．分散した膵島を単離する方法であって、次の段階： (a) 請求項11の実質的に精製されたコラゲナーゼを含有する緩衝溶液中で膵臓 の組織を約２５〜３９℃で振とうしながらインキュベートし、膵島を放出および 分散させること；および (b) 分散した膵島を組織破片から分離すること； からなる方法。 20．分散した膵島を分離する段階を密度勾配遠心分離により行う、請求項19に記 載の方法。 21．Clostridium ＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換した E．coliから調製 された、約１１０，０００ダルトンの分子量を有するヒストリチクス菌コラゲナ ーゼの実質的に精製された調製物を用いる、請求項19に記載の方法。 22．腫瘍を解離させる方法であって、次の段階： (a) 請求項11の実質的に精製されたコラゲナーゼを含有する緩衝溶液中で腫瘍 組織を約２５〜３９℃で振とうしながらインキュベートし、腫瘍細胞を解離およ び分散させること；および (b) 分散した腫瘍細胞を組織破片から分離すること； からなる方法。 23．分散した腫瘍細胞を分離する段階を密度勾配遠心分離により行う、請求項22 に記載の方法。 24．Clostridium ＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換した E． coliから調製された、約１１０，０００ダルトンの分子量を有するヒストリチク ス菌コラゲナーゼの実質的に精製された調製物を用いる、請求項22に記載の方法 。 25．髄核のヘルニア形成の円板内治療方法であって、次の段階： (a) 請求項11の実質的に精製されたコラゲナーゼを含有する無菌の緩衝溶液を 調製すること；および (b) 実質的に精製されたコラゲナーゼを含有する無菌の緩衝溶液を髄核に注入 すること； からなる方法。 26．Clostridium ＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換した E．coliから調製 された、約１１０，０００ダルトンの分子量を有するヒストリチクス菌コラゲナ ーゼの実質的に精製された調製物を用いる、請求項25に記載の方法。[Claims] 1. Encodes a polypeptide having the enzymatic activity of the collagenase of Histolyticus Is a recombinant DNA segment containing DNA from Histolyticus , The polypeptide is derived from the natural expression of the Histolyticus genomic coding sequence. It has a higher molecular weight than the measured translation product. A translation product measured by the natural expression of the coding sequence, The above recombinant DNA segment. 2. Can be transcribed to produce mRNA, which is translated The DNA segment according to claim 1, which is capable of producing one polypeptide. . 3. Can be transcribed to produce mRNA, which is translated into hist Producing the polypeptide of claim 1 which exhibits the antigenicity of Rhithix collagenase. The DNA segment according to claim 1, which is capable of 4. The above-mentioned DNΛ segment contains a promoter derived from Histolyticus, and Therefore, when the DNA segment is integrated into the genome of the host cell, the DNA segment Histolyticus without being affected by a segment-independent promoter The DNA segment according to claim 1, which can be transcribed under the control of the promoter derived from I don't know. 5. A structural gene of Histolyticus has a polypeptide with collagenase activity. Further expressed, the polypeptide is lower than the polypeptide of claim 1. The DNA segment according to claim 1, which has a high molecular weight. 6. The DNA cell of claim 1 in a plasmid capable of transforming a host cell. And a plasmid incorporating a drug resistance marker. And the above vector selected from the group of plasmids having both an origin of replication and an origin of replication. -. 7. The host cell is E. coli, Bacillus subtilis, histolyticus, and 7. The vector according to claim 6, which is selected from the group consisting of yeast and yeast. 8. 6. Transformed with the vector, having collagenase activity and history Producing a polypeptide having the antigenicity of C. thixis collagenase E. coli host cell And the polypeptide is the autologous sequence of the genomic coding sequence of Historicus. Histolytics have a higher molecular weight than the translation product measured by natural expression. It can be distinguished from the translation product measured by the natural expression of the bacterial genomic coding sequence. The above E. coli host cells. 9. Polypept having collagenase activity, transformed with the vector of claim 6. Producing tides E. Escherichia coli host cells that produce the produced collagenase activity About 50% by weight or more of the total polypeptides possessed are genomic co-proteins of Histolyticus. Polypeptide with a higher molecular weight than the translation product measured by spontaneous expression of the coding sequence The above E. coli host cells. Ten. The molecular weight transformed with the vector of claim 6 and having collagenase activity is E. coli that produces a polypeptide of about 110,000 daltons. is a coli host cell , The collagen having a molecular weight of about 110,000 daltons was produced. The above-mentioned E, which accounts for about 50% by weight or more of the total polypeptide having the enzyme activity. ． coli host cells. 11. Translation measured by spontaneous expression of the genomic coding sequence of Historicus. Substantially purified histolyticus collagenase with a higher molecular weight than the product. Preparations. 12. E. coli transformed with a vector containing Clostridium DNA Purified from coli The preparation according to claim 10, which has been prepared. 13. E. coli transformed with a vector containing Clostridium DNA Prepared from coli Histolytica Collagena with a molecular weight of about 110,000 Daltons A substantially purified preparation of the enzyme. 14. Translation measured by spontaneous expression of the genomic coding sequence of Historicus. Substantially purified histolyticus collagenase with a higher molecular weight than the product. A composition containing the prepared preparation. 15． E. coli transformed with a vector containing Clostridium DNA Prepared from coli Histolytica Collagena with a molecular weight of about 110,000 Daltons A composition containing a substantially purified preparation of an enzyme. 16. Digest connective tissue and release embedded cells without destroying cell membranes and other necessary structures How to get out, the next step:   (a) Tissue in a buffered solution containing the substantially purified collagenase of claim 11. Cells at about 25-39 ° C with shaking to release embedded cells and Dispersal; and   (b) separating the dispersed cells from the tissue debris; A method consisting of. 17． Performing the step of separating the dispersed cells from the tissue debris by density gradient centrifugation, The method of claim 16. 18. E. coli transformed with a vector containing Clostridium DNA Prepared from coli Histolytica Collagena with a molecular weight of about 110,000 Daltons 17. The method of claim 16, wherein a substantially purified preparation of the enzyme is used. 19. A method of isolating dispersed islets, comprising the following steps:   (a) the pancreas in a buffer solution containing the substantially purified collagenase of claim 11 Tissue is incubated at about 25-39 ° C with shaking to release islets and Dispersing; and   (b) separating dispersed islets from tissue debris; A method consisting of. 20. The step of separating dispersed islets is performed by density gradient centrifugation, according to claim 19. How to list. twenty one. E. coli transformed with a vector containing Clostridium DNA Prepared from coli Histolytica Collagena with a molecular weight of about 110,000 Daltons 20. The method of claim 19, wherein a substantially purified preparation of the enzyme is used. twenty two. A method of dissociating a tumor, which comprises the following steps:   (a) A tumor in a buffered solution containing the substantially purified collagenase of claim 11. Incubate the tissue at about 25-39 ° C with shaking to dissociate the tumor cells. And dispersing; and   (b) separating dispersed tumor cells from tissue debris; A method consisting of. twenty three. 23. The step of separating dispersed tumor cells is performed by density gradient centrifugation. The method described in. twenty four. E. coli transformed with a vector containing Clostridium DNA prepared from Escherichia coli with a molecular weight of about 110,000 daltons The method of claim 22, wherein a substantially purified preparation of subtilis collagenase is used. . twenty five. An intradiscal method of herniation of the nucleus pulposus, comprising the following steps:   (a) a sterile buffered solution containing the substantially purified collagenase of claim 11 Preparing; and   (b) Injecting a sterile buffered solution containing substantially purified collagenase into the nucleus pulposus To do; A method consisting of. 26. E. coli transformed with a vector containing Clostridium DNA Prepared from coli Histolytica Collagena with a molecular weight of about 110,000 Daltons 26. The method of claim 25, wherein a substantially purified preparation of the enzyme is used.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009525283A (en) * 2006-01-30 2009-07-09 オーキシリウム インターナショナル ホールディングス，インコーポレイテッド Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases
JP2011509690A (en) * 2008-01-22 2011-03-31 ベイラー リサーチ インスティテュート Islet cell preparation and transplantation
JP2015506176A (en) * 2012-01-12 2015-03-02 オーキシリウム インターナショナル ホールディングス，インコーポレイテッド Clostridium histolyticum enzyme and method for its use
US11473074B2 (en) 2017-03-28 2022-10-18 Endo Global Aesthetics Limited Method of producing collagenase

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995005477A1 (en) * 1993-08-12 1995-02-23 University Of Maryland Thermostable alkaline metalloprotease produced by a hyphomonas, and preparation thereof
DE4408940A1 (en) * 1994-03-16 1995-10-05 Boehringer Mannheim Gmbh Recombinant type II collagenase from Clostridium histolyticum and its use for the isolation of cells and cell assemblies
JPH11501517A (en) * 1995-03-16 1999-02-09 クノル アクチエンゲゼルシャフト Defined novel enzyme mixtures for producing cells and for treating wounds
CA2193354A1 (en) * 1995-04-25 1996-10-31 Catherine Lee Composition containing collagenase and chymopapain for isolating hepatocytes and pancreatic islet cells
US5670358A (en) * 1995-10-19 1997-09-23 Baxter International Inc. Method for inhibiting chymopapain and papain enzyme activity with polysaccharides of animal origin
CA2272244A1 (en) * 1996-11-19 1998-05-28 Roche Diagnostics Gmbh Recombinant collagenase type i from clostridium histolyticum and its use for isolating cells and groups of cells
US6280993B1 (en) * 1999-08-24 2001-08-28 Ichiro Yamato Gene encoding class I collagenase
IT1397646B1 (en) 2009-12-15 2013-01-18 Seidita RECOMBINANT COLLAGENASIS OF C. HISTOLYTICUM AND METHOD FOR THEIR PRODUCTION.
CN102174548B (en) * 2011-03-01 2012-07-11 山东大学 Deep-sea cold-adapted and salt-tolerant collagenase as well as encoding gene myr02 and application of same
US11123280B2 (en) 2017-03-01 2021-09-21 Endo Ventures Limited Method of assessing and treating cellulite
CN115058443B (en) * 2022-06-22 2023-03-24 广州市乾相生物科技有限公司 Transcription inhibition plasmid pCRISPR-nadG and application thereof in improving intracellular reducing power of solvolytic clostridium

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5177017A (en) * 1990-03-22 1993-01-05 Trigen, Inc. Molecular cloning of the genes responsible for collagenase production from Clostridium histolyticum

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009525283A (en) * 2006-01-30 2009-07-09 オーキシリウム インターナショナル ホールディングス，インコーポレイテッド Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases
JP2015128447A (en) * 2006-01-30 2015-07-16 オーキシリウム インターナショナル ホールディングス，インコーポレイテッド Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases
JP2017006143A (en) * 2006-01-30 2017-01-12 エンド グローバル ベンチャーズ Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases
JP2017218452A (en) * 2006-01-30 2017-12-14 エンド グローバル ベンチャーズ Composition and method for treating collagen-mediated disease
JP2018143258A (en) * 2006-01-30 2018-09-20 エンド グローバル ベンチャーズ Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases
JP2020039371A (en) * 2006-01-30 2020-03-19 エンド グローバル ベンチャーズ Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases
JP2021113212A (en) * 2006-01-30 2021-08-05 エンド グローバル ベンチャーズ Compositions and Methods for Treating Collagen-Mediated Diseases
JP2011509690A (en) * 2008-01-22 2011-03-31 ベイラー リサーチ インスティテュート Islet cell preparation and transplantation
JP2015506176A (en) * 2012-01-12 2015-03-02 オーキシリウム インターナショナル ホールディングス，インコーポレイテッド Clostridium histolyticum enzyme and method for its use
US11879141B2 (en) 2012-01-12 2024-01-23 Endo Global Ventures Nucleic acid molecules encoding clostridium histolyticum collagenase II and methods of producing the same
US11975054B2 (en) 2012-01-12 2024-05-07 Endo Global Ventures Nucleic acid molecules encoding clostridium histolyticum collagenase I and methods of producing the same
US11473074B2 (en) 2017-03-28 2022-10-18 Endo Global Aesthetics Limited Method of producing collagenase

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Publication number Publication date
AU4644793A (en) 1994-01-24
WO1994000580A1 (en) 1994-01-06
CA2138948A1 (en) 1994-01-06
EP0654084A4 (en) 1996-07-03
EP0654084A1 (en) 1995-05-24

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