JP3816593B2 - Killer protein - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キラータンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子によって形質転換された形質転換体及び該キラータンパク質の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵母又はその近縁菌類がキラートキシンと呼ばれる抗菌活性を示すキラータンパク質を産生することが知られて以来、いくつかの分泌タンパク質性のキラートキシンが発見されており、これらの酵母等によって生産されるキラータンパク質の種々の性質又は作用機序が知られている。
【０００３】
例えば、ハンゼヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）が産生するKh-IIキラータンパク質は、作用pHを３〜６にもち、パパインによって分解されず、麹菌プロテアーゼによって徐々に分解されることが報告されている（特公平5-70639 号公報、特公平5-70640 号公報）。
【０００４】
また、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae) が産生するＫ１キラータンパク質（二本鎖RNAプラスミド上にコードされている。）は、標的となる酵母のプロトンポンプを阻害することにより感受性酵母を殺すことが知られており、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lacits）菌が産生するキラータンパク質（直鎖状の二本鎖DNAプラスミド上にコードされている。）は、本来キチナーゼ活性を有するが、感受性酵母のアデニレートサイクラーゼを阻害することが知られており、ピチア・クルイベリ（Pchia kluyveri）菌が産生するキラータンパク質は、標的酵母の脂質二重層膜に穴をあけることが知られている。
【０００５】
自然界には、酵母（広くは有核系微生物）が抗生物質的作用を有するタンパク質性毒素を生産・分泌し、互いに相克するという現象がある。この現象は、かかるタンパク質性毒素は標的菌に対し特異的で毒性を示すが自己に対しては無害であるというタンパク質工学上興味ある事象である。従って、昨今のいわゆる「State of Arts」を考慮すると、遺伝子工学的手法を用いてタンパク質性毒素を改変することにより、カビ等の病原性真菌に対するタンパク質性抗生物質を創製し、真菌症の治療、洗剤等に利用できるタンパク質を開発する必要があることは明らかである。また、前記キラータンパク質のように小分子量のタンパク質の立体構造を決定し、その活性部位領域の立体構造から非タンパク質性抗菌化合物をドラッグデザインすることも可能である。
【０００６】
一方、エイズに感染したり、免疫力が低下したり、老化が進行すると、真菌に感染しやすくなるため、全身に感染症状を呈する感染症が発症するようになる。このため、感染症を治療目的とする抗生剤（抗生物質）の開発が試みられ、すでに、有機化合物であるアクレアシンAやパプラカンデンBといった細胞壁成分のグルカンを合成阻害する抗カビ性の抗生物質が知られている。
【０００７】
しかし、これら抗生物質は肝毒性が高く、薬剤耐性を誘発するなどの問題点がある。従って、薬剤耐性を誘発せず、しかも安全性に優れた抗生物質が要求されている。
そこで、キラータンパク質を抗生物質や洗剤等に利用できるようにするため、病原性真菌類に有効であり、アルカリ耐性かつプロテアーゼ耐性を示すキラータンパク質の作製が必要となってきた。
【０００８】
従来より、ハンゼヌラ・ムラキ（Hansenula mrakii) が産生するキラータンパク質が、抗カビ剤や洗剤等に有用であることが知られている。
しかし、ハンゼヌラ・ムラキが産生するキラータンパク質は微量であるため大量生産が困難であり、抗菌剤等として実際に適用することは困難である。また、該キラータンパク質はプロテアーゼに感受性であるため失活しやすい。さらに、動物細胞などを培養する際にキラータンパク質の代わりに種々の抗菌剤（例えばファンギゾン等）を用いることもできるが、これらの抗菌剤は熱に不安定であるため、培養液の滅菌処理にしばしば利用される高温滅菌（例えばオートクレーブ）をすることができない。従って、培養液の滅菌とは別途に滅菌しなければならず、操作が煩雑である。
【０００９】
一方、遺伝子工学的手法によりタンパク質を大量生産しようとする場合、その有用形質転換宿主として酵母サッカロミセス・セレビシエを用いることが適当であるが、サッカロミセス・セレビシエは、ハンゼヌラ・ムラキが産生するキラータンパク質に感受性でその標的となるため、ハンゼヌラ・ムラキ由来のキラータンパク質の遺伝子を導入することができない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、キラータンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子によって形質転換された形質転換体、並びに抗菌石鹸及び抗カビ剤を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、ハンゼヌラ・ムラキ（Hansenula mrakii）が産生する微量なHM-1キラータンパク質をサッカロミセス・セレビシエを用いた遺伝子工学的手法により大量生産し、しかも、プロテアーゼ耐性を有し、かつ病原性真菌に一層有効であるキラータンパク質を創製することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち第98番目及び／又は第122番目のアルギニンがアラニンに変異したアミノ酸配列を実質的に含み、抗菌活性を有するキラータンパク質である。
さらに、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち第98番目及び／又は第122番目のアルギニンがアラニンに変異したアミノ酸配列を実質的にコードするＤＮＡを含むキラータンパク質遺伝子である。該遺伝子としては、配列番号２又は３で表される塩基配列を実質的に含むものが挙げられる。
【００１３】
ここで、「実質的に」とは、本発明のキラータンパク質が抗菌活性を有する限り、また、本発明の遺伝子がキラータンパク質の活性を発現させる機能を有する限り、当該タンパク質（ポリペプチド）に含まれるアミノ酸配列、又は当該遺伝子の塩基配列に欠失、置換、挿入等の変異が生じてもよいことを意味する。
【００１４】
従って、例えば本発明のキラータンパク質に含まれる第１番目のメチオニン（Met)が欠失しているものなども、このアミノ酸配列の変化によるタンパク質に含まれる。また、本発明のキラータンパク質に含まれるアミノ酸をコードする塩基配列のほか、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体も本発明の遺伝子に含まれる。
【００１５】
但し、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、変異箇所（第98番目のアルギニンに代わるアラニン及び／又は122番目のアルギニンに代わるアラニン）には、上記欠失、置換、挿入等の変異は生じないものとし、また、アラニンをコードする塩基配列には、アラニンの縮重異性体による変異以外は上記欠失、置換、挿入等の変異は生じないものとする。
【００１６】
さらに、本発明は、前記キラータンパク質遺伝子を含む組換え体ＤＮＡである。
さらに、本発明は、前記組換え体ＤＮＡ、及び前記キラータンパク質耐性遺伝子を含む組換え体ＤＮＡによって形質転換された形質転換体である。
さらに、本発明は、前記形質転換体を培地に培養し、得られる培養物からキラータンパク質を採取することを特徴とするキラータンパク質の製造方法である。
【００１７】
さらに、本発明は、前記キラータンパク質を有効成分として含む抗菌剤である。
さらに、本発明は、前記キラータンパク質を抗菌成分として含む抗菌石鹸である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明のキラータンパク質（以下、キラータンパク質を「HM-1」という) は、遺伝子工学的手法により変異を導入してプロテアーゼ耐性を付与したHM-1遺伝子を、あらかじめHM-1耐性遺伝子（HM-1感受性遺伝子を破壊して得られる遺伝子）を導入してHM-1耐性を付与した酵母に導入し、発現させることにより得られるものである。本発明のHM-1は抗菌活性が上昇しており、かつプロテアーゼ耐性で作用pHをアルカリ側にもつものである。また、本発明のHM-1は、酵母サッカロミセス・セレビシエを宿主として産生させることが可能となったため、効率よく得ることができる。
【００１９】
本発明のHM-1を得るための手法を説明する。
まず、ハンゼヌラ・ムラキが産生するHM-1遺伝子をクローニングし、得られる遺伝子の一部を変異することによりHM-1変異遺伝子を作製する。一方、HM-1耐性遺伝子を酵母サッカロミセス・セレビシエに導入し、HM-1耐性の形質転換体（形質転換酵母）を作製する。得られる形質転換酵母に前記変異遺伝子を導入し、変異遺伝子及びHM-1耐性遺伝子両者を含む形質転換体を作製する。そして、得られる形質転換体を培養することにより、本発明のHM-1を得ることができる。
【００２０】
(1) HM-1遺伝子のクローニング
▲１▼ ハンゼヌラ・ムラキからのゲノムDNAの調製
まず、ハンゼヌラ・ムラキを培養し、得られる培養物からゲノムDNAを調製する。ハンゼヌラ・ムラキとしては、IFO 0895又はIFO 8075などが挙げられる。
【００２１】
ハンゼヌラ・ムラキの培養は、通常の方法により行うことができる（実験医学別冊：酵母による遺伝子実験法、14〜15頁、羊土社、1994年）。例えば、YPD培地などの栄養培地又は最小培地に菌株を接種し、30℃で対数増殖期まで培養する。次に、培養菌株からゲノムDNAを調製する。ゲノムDNAの調製についても、公知手法を用いることができる（Methods in Enzymology,194,218-219 ）。
【００２２】
▲２▼ 公知アミノ酸配列からのオリゴヌクレオチドの設計
既に公知であるHM-1のアミノ酸配列(FEBS LETT.,195,253-257,1986) に基づいて、ゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行うためのヌクレオチドを設計する。例えば、HM-1の公知アミノ酸配列のうち、第20番目のトリプトファン（Trp)から第26番目のスレオニン(Thr) までのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド20マー（配列番号４）、及び第33番目のアスパラギン(Asn) から第38番目のバリン(Val) までのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドのアンチコドンの17マー（配列番号５）の２種のオリゴヌクレオチドプローブを合成する。ヌクレオチドの合成は、例えば、ABI 社(Applied Biosystems Inc.) 製の自動DNA合成装置等を用いて行うことができる。得られるヌクレオチドは、ゲノムDNAとのハイブリダイゼーションに使用する。
【００２３】
▲３▼ ハイブリダイゼーション
前記▲１▼で調製されたゲノムDNAを適当な制限酵素（例えばHindIII、EcoRI又はBamHI等）で切断し、得られるDNA断片と前記▲２▼で合成された２種のオリゴヌクレオチドプローブとを用いたサザンブロットハイブリダイゼーション（サザンブロッティング）を行う。サザンブロッティングについては、公知の方法により行うことができる（FEBS LETT.,195,253-257,1986)。
【００２４】
サザンブロッティングの結果目的とされるDNA断片を得た場合は、該DNA断片の物理地図を作製し、適当な制限酵素、例えばEcoRI 、Hind III等で処理することにより適当な長さの断片にする。なお、得られる断片をもとに、目的とされるDNA断片に不要のDNA領域が含まれていることがわかった場合は、さらに制限酵素EcoRI 、Hind III等で消化して不要のＤＮＡ領域を除き、前記と同様に、２種の合成オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号４及び５）を用いてゲノムDNAライブラリーから目的とするHM-1遺伝子をスクリーニングする。
【００２５】
▲４▼ 塩基配列の決定
前記▲３▼で得られたDNA断片の塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、公知の手法、例えばジデオキシ法、マキサム−ギルバート法等により行うことができ、ABI 社製のオートシークエンサー等を用いてもよい。
【００２６】
(2) HM-1耐性形質転換体の作製
サッカロミセス・セレビシエがHM-1に対し感受性であるのは、HM-1と相互作用し、HM-1感受性を表現する遺伝子がサッカロミセス属菌に存在しているためであると予想することができる。従って、本発明においては、まずHM-1感受性遺伝子をクローニングした後、HM-1感受性遺伝子を破壊することによりHM-1耐性遺伝子を作製する。そして、得られるHM-1耐性遺伝子を酵母に形質転換することによりHM-1耐性形質転換体を作製する。
【００２７】
▲１▼ サッカロミセス・セレビシエのゲノムDNAライブラリーの調製
サッカロミセス・セレビシエのHM-1感受性遺伝子をクローニングするため、まず、サッカロミセス酵母ベクターYCp50に連結されたサッカロミセス・セレビシエのゲノムDNAライブラリーを作製する。ライブラリーは、サッカロミセス・セレビシエのゲノムDNAを制限酵素BamHIで消化し、得られる断片をYCp50と連結することにより作製することができる。
【００２８】
▲２▼ HM-1耐性変異株の調製
次に、サッカロミセス・セレビシエのゲノムDNAライブラリーを導入するためのHM-1耐性変異株（ウラシル要求性）を分離・調製する。ウラシル要求性の変異株を宿主として用いるのは、ウラシル非要求性遺伝子をもつライブラリーのみをスクリーニングするためである。
【００２９】
HM-1耐性変異株の分離法としては、EMS（エチルメタンスルホン酸）若しくはニトロソグアニジンで誘発する方法、紫外線照射による方法又はトランスポゾンTyを利用する方法が挙げられる。
【００３０】
例えば、EMSを用いたHM-1耐性変異株の調製の場合は、以下のように行う。すなわち、サッカロミセス・セレビシエBJ1824（a, ura3,leu2,trp1,pep4）をYPD培地に接種し、増殖させた後集菌し、リン酸カリウムバッファーで洗浄後、同じバッファーに懸濁する。これにEMSを加え、激しくボルテックスし、30℃で30分振盪後、等量のチオ硫酸ナトリウムを加え、よく混合する。集菌し滅菌水で２回洗い、滅菌水に懸濁、希釈する。
【００３１】
このようにして調製された前記細胞懸濁液を、HM-1を含むYPD寒天培地にプレーテイングし、30℃で36時間のインキュベートにより、HM-1耐性変異株を取得する。
【００３２】
▲３▼ ゲノムDNAライブラリーのHM-1耐性変異株への導入
前記▲１▼で得られたDNAライブラリーを、前記▲２▼で作製されたHM-1耐性変異株（以下「rhk1-1」という) に導入することにより、rhk1-1の形質転換を行う。DNAライブラリーの導入は、通常の方法（例えば酢酸リチウム法等）を用いることができる。
【００３３】
▲４▼ ゲノムDNAライブラリー導入株の選別
rhk1-1を形質転換した段階では、ゲノムDNAを含まない酵母も存在するため、ゲノムDNAが導入された酵母のみを選別する必要がある。
そこで、YCp50 がURA3遺伝子を含むことを利用して、▲３▼により得られた形質転換体を、CMドロップアウト培地からウラシルを除いた培地を用いて培養することにより、ゲノムDNAが導入された形質転換体のみを選別する。
【００３４】
ここで、CMドロップアウト培地とは、アミノ酸フリーの酵母ナイトローゲンベース0.67％、グルコース２％、並びにアミノ酸及び核酸の混合物であるドロップアウトパウダー0.13％を含む培地である。
【００３５】
宿主rhk1-1はウラシル要求性であるためウラシルを含まない培地では生育できないが、宿主中に導入されたプラスミドYCp50 がウラシル非要求性遺伝子であるURA3遺伝子を保有するため、rhk1-1はウラシル無添加培地でも生育することができる。この性質を利用して、ウラシル非要求性のコロニー(Ura+ 形質転換体）を得ることができる。
【００３６】
▲５▼ HM-1感受性遺伝子を含むコロニーの選別
得られたウラシル非要求性の形質転換体の中には、ゲノムDNAのうちHM-1感受性遺伝子を含むYCp50プラスミドを保有するもののほか、HM-1感受性遺伝子とは異なる遺伝子を含むYCp50プラスミドを保有するもの、及びYCp50しか保有しないものが混在している。そこで、HM-1感受性遺伝子を含むYCp50プラスミドを保有する形質転換体のみを選択するため、レプリカ法（J.Bacteriol.,63,399,1952) によりUra+形質転換体をHM-1を含むCMドロップアウト寒天培地へレプリカする。これにより、HM-1感受性遺伝子を含むコロニーのみを取得することができる。
得られたコロニーからのプラスミドDNAの調製は、ゲノムDNAの調製法の記載（前記(1) の▲１▼）に準じて行う。
【００３７】
▲６▼ インサートDNAの確認及びクローニング
インサートDNA(HM-1感受性遺伝子が含まれているDNA断片) を確認するために、前記▲５▼により得られたプラスミドを制限酵素BamHIで消化し、電気泳動する。得られるDNAをさらに切りとって縮めるために、該DNAの物理地図を作成し、種々の制限酵素で消化する。得られたDNA断片をベクターYCp50にサブクローニングし、rhk1-1に導入し、選択培地（HM-1を含む合成寒天培地）上でHM-1に対する感受性を試験する。そして、感受性を有することが確認されたDNAの塩基配列を決定し、HM-1感受性遺伝子をクローニングする。
【００３８】
▲７▼ 遺伝子破壊によるHM-1耐性遺伝子の構築及びHM-1耐性株の作出
前記▲６▼のようにしてクローニングされたHM-1感受性遺伝子（以下「RHK1遺伝子」という) の一部を制限酵素（例えばSphI）で切断し、別に同じ制限酵素で消化したURA3 DNA断片（ニューイングランド・バイオラボ社）をRHK1遺伝子断片の間に挿入することにより、RHK1遺伝子はURA3遺伝子により破壊され、RHK1遺伝子の制限酵素切断部位をURA3遺伝子で置き換えたキメラ遺伝子（RHK-1-URA3キメラDNA）が構築される。なお、RHK1遺伝子のURA3遺伝子による破壊は、四分子分析により確認することができる。
このキメラDNAをrhk1-1に導入し、HM-1耐性の形質転換体であるサッカロミセス・セレビシエBJ1824rhk1△::URA3を作製する。
【００３９】
(3) 変異型HM-1遺伝子の構築
公知のHM-1にプロテアーゼ耐性を付与するため、HM-1のアミノ酸配列の一部に変異（置換）を導入する。
本発明では、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、第１番目のメチオニン(Met) から数えて98番目及び／又は122番目のアルギニン(Arg) をアラニン(Ala) に置換することにより変異型HM-1を作製する。但し、変異は第98番目又は第122番目の一方に導入してもよく、両方に導入してもよい。
【００４０】
なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列には、第119番目及び第123番目にもアルギニンが存在するため、これらの部位についても変異を導入して得られる変異型HM-1遺伝子の構築も試みる。
【００４１】
変異の導入は、公知の方法を用いることができる。例えば、点突然変異導入法、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)を利用した突然変異の導入法等が挙げられる。
変異型HM-1遺伝子は、例えばLA PCR in vitroミュタージェネシスキット（宝酒造社製）を用いて構築することができる。
【００４２】
すなわち、前記(1) でクローニングされたHM-1遺伝子領域を含むDNA断片の5'側をキロシーケンス用デレーションキット（宝酒造）で短くした後、BamHIリンカーを連結する。この5'側にBamHI部位をもつBamHI-HindIII断片をpUC118へ挿入し、鋳型のDNAとする。
一方、HM-1の第98、119、122又は123番目のアルギニン(Arg) をアラニン(Ala)に変えるために、予想される相補鎖の配列に従ってオリゴヌクレオチドを化学合成し、プライマーを作製する。
【００４３】
次に、前記鋳型及びプライマーを用いて、キットの説明書に従ってPCRを行い、変異型遺伝子を作製する。得られた変異型遺伝子をpUC18のEcoRI部位とHindIII部位との間に挿入し、大腸菌 DH5αへ導入する。得られた形質転換体をLB培地で培養することによりプラスミドを調製し、次いでHidIIIとBamHIでこのプラスミドを消化後、アガロース電気泳動で精製する。この精製された変異型遺伝子断片を、酵母ベクターYEp51のHindIIIとBamHI部位に挿入してYEp51のGal10プロモーターの下流につないだ後、大腸菌DH5αに形質転換し、プラスミドを抽出精製する。
【００４４】
(4) 変異型HM-1の精製及び活性の測定
前記(2) で作成された形質転換酵母サッカロミセス・セレビシエBJ1824rhk1△::URA3に変異型HM-1遺伝子を導入した後、形質転換体を培地に培養する。得られる培養物を通常のタンパク質精製手法に従って精製する。
【００４５】
精製は、塩析、セファデックスG-50などを用いたゲル濾過、CMセルロース、DEAE等を用いたイオン交換クロマトグラフィー、抗HM-1モノクローナル抗体を利用したアフィニティクロマトグラフィー、その他逆相クロマトグラフィー等を単独で、又は適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００４６】
精製されたタンパク質が目的のものであるか否かの確認は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。ここで、HM-1を精製する際に、培養物中に変異型HM-1の生産がされているか否かの検定を行う。検定は、抗HM-1モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング等により行うことができる。
【００４７】
また、生産された変異型HM-1のキラー活性の検定は、ハンゼヌラ・アノマラ(Hansenula anomala) IFO 0569株を含む寒天培地上に、前記のようにして精製された変異型HM-1を浸したペーパーディスクを置き、生じる阻止円のサイズを測定することにより行うことができる。
【００４８】
(5) 抗菌石鹸及び抗菌剤
本発明のHM-1を抗菌石鹸として使用する場合は、使用する対象を特に限定しない。例えば、手洗い用洗剤、衣類や寝具（シーツ、枕カバー等）の洗剤、又は衣類の洗濯後のコーティング等に使用することができる。
また、前記キラータンパク質のように小分子量のタンパク質の立体構造を決定し、その活性部位領域の立体構造から非タンパク質性抗菌化合物をドラッグデザインすることも可能である。
【００４９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例にその技術的範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕HM-1遺伝子のクローニング
(1) ゲノムDNAライブラリーの調製
▲１▼ ゲノムDNAの調製
ハンゼヌラ・ムラキIFO 0895を酵母エキス１％、ペプトン２％、ソルビトール２％からなるYPD培地に接種し、30℃で対数増殖期まで培養した後、染色体DNAを調製した。
【００５０】
すなわち、HM-1感受性コロニーをYPD 液体培地1.5 mlに植えて一晩培養し、得られた培養液をエッペンドルフチューブに移し、遠心後水で１回洗った。
これを0.5 mlのソルビトール溶液（１M ソルビトール, 100mM EDTA(pH7.5))に懸濁後、ザイモリエース酵素溶液(10mg/ml zymolyase-100T;生化学工業社製)0.02ml を加え、37℃で攪拌しながら60分間インキュベートした。3,000rpmで30秒遠心後、細胞をトリス溶液(50mM Tris-HCl(pH7.5), 20mM EDTA)0.5mlに懸濁し、さらに10％SDS 0.05mlを加え、よく混ぜた。これを65℃で30分間インキュベートし、4M酢酸カリウム溶液を0.25ml加え、よく混ぜた後０℃で60分間静置した。
【００５１】
次に、12,000rpm、４℃で５分間遠心した。上清を別のエッペンドルフチューブに移し、等量のイソプロパノールを加えよく混ぜた後、室温で５分間静置した。12,000rpm、室温で10秒間遠心した後、上清を捨て、沈殿を70％エタノールで洗浄した。沈殿をTE溶液(10mM Tris-HCl(pH8), 1mM EDTA)0.2ml に溶解後、RNase 酵素溶液（１mg/ml RNaseA) ５μLを加え、37℃で30分間インキュベートした。フェノール抽出後、３M 酢酸ナトリウム溶液20μLとともにイソプロパノール0.2ml を加え、よく混ぜ合わせ、室温で５分間置いた後、12,000rpmで５分間遠心し、沈殿を70％エタノールで洗った。乾燥後の100 μLのTE溶液に溶解した。
このようにして得られた染色体DNAは約10μgであった。
【００５２】
▲２▼ ゲノムDNAライブラリーの作製
まず、λファージのクローニングベクターEMBL3をBamHIで切断し、BamHI切断面を有するEMBL3 DNA を得た。次に、上記ハンゼヌラ・ムラキ IFO 0895 株から得られた染色体DNAを制限酵素Sau3AIで部分消化した。
【００５３】
このようにして得られた処理液を、in vitroパッケージングキット(STRATAGENE 社製) に添加して、in vitroパッケージング法(Horn, B.,Methods in Enzymology,68,299(1979)) により当該DNA をファージ粒子に導入し、ハンゼヌラ・ムラキIFO 0895のゲノムDNAライブラリーを作製した（Weiss,B. et al.,J.Biol.Chem.,243,4543(1968))。
【００５４】
別に、山本らにより報告されているHM-1のアミノ酸配列(FEBS LETT.,195,253-257,1986) のうち、第20番目のトリプトファンから第26番目のスレオニンに相当するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド20マー（以下「プローブ１」という；配列番号４）、及び第33番目のアスパラギンから第38番目のバリンに相当するヌクレオチドのアンチコドンの17マー（以下「プローブ２」という；配列番号５）の２種の合成オリゴヌクレオチドプローブを作製した。
【００５５】
(2) ゲノムDNAのクローニング
制限酵素HindIII、EcoRI又はBamHIで切断した染色体DNAと、プローブ１及びプローブ２とを、サザンブロットハイブリダイゼーションさせた(Gene 137, 265-270,1993)。
【００５６】
その結果、１本のバンドが検出されたので、次に前記プローブ１及びプローブ２を用いて、同様にゲノムDNAライブラリーからスクリーニングし、3.6kb のHindIII DNA 断片を含むDNA（λHMK08）を釣り上げた。得られた3.6kb の HindIII DNA断片の物理地図を作成し、プローブ１及びプローブ２とハイブリダイズする断片をEcoRI 及びHind IIIで消化し、DNA断片を縮小した。
その結果、DNAの両端にEcoRI 及びHind III部位を有する2.4kb の断片(2.4kb EcoRI-HindIII DNA) を得た。
【００５７】
〔実施例２〕HM-1耐性酵母の作製
(1) ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
シャトルベクターYCp50に連結されたサッカロミセス・セレビシエのDNAライブラリーは、サッカロミセス・セレビシエのゲノムDNAを制限酵素Sau3AIで部分消化し、得られる断片とBamHIで切断したYCp50とをT4 DNAリガーゼで連結することにより作製した。
【００５８】
(2) HM-1耐性変異株（rhk1-1) の作製
サッカロミセス・セレビシエBJ1824（a, ura3,leu2,trp1,pep4）を５mlのYPD培地に接種し、30℃で細胞濃度２×10⁸ 細胞/mlまで増殖させ、2.5mlを遠心集菌した。50mMリン酸カリウムバッファー（pH7.0）で２回洗い、10mlの同じバッファーに懸濁した。これに300μlのEMS（エチルメタンスルホン酸）を加え、激しくボルテックスした。30℃で30分振盪後、等量のチオ硫酸ナトリウムを加え、よく混合した。集菌し滅菌水で２回洗い、滅菌水に懸濁、希釈した。
このようにして調製された上記細胞懸濁液を３μg/mlのHM-1を含むYPD寒天培地にプレーテイングし、30℃で36時間のインキュベートにより、HM-1耐性変異株rhk1-1を取得した。
【００５９】
(3) DNAライブラリーのrhk1-1への導入
こうして得られたrhk1-1に上記のYCp50-ゲノムDNAライブラリーを導入する形質転換を、酢酸リチウム法に従って行った。
【００６０】
すなわち、100 mlのYPD 培地にrhk1-1を植え、OD₆₀₀ が1.0 〜2.0 になるまで30℃で培養した。培養後、3,000rpm、５分間の遠心により集菌し、５mlのTE(10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA)に懸濁した。同様の遠心により集菌して５mlの酢酸リチウム溶液に懸濁した。再度遠心により集菌し、１mlの酢酸リチウム溶液(100mM酢酸リチウム, 10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA) に懸濁した。これを30℃で60分間振盪した後、400 μgのキャリアDNA(仔ウシ胸腺DNA)を加え、エッペンドルフチューブに100 μLずつ分注した。これに１μgのDNAを加え、30℃で30分間保温した。これに700 μLのPEG溶液(35 ％(w/v) ポリエチレングリコール4000、100mM 酢酸リチウム、10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA) を加え、30℃で50分間保温した後、42℃で５分間熱ショックを与えた。次いで、４秒間遠心し、上清をアスピレーターにより除去し、沈殿を500 μLのTEで洗浄した後、100 μLのTEに懸濁した。
その結果、YCp50-ゲノムDNAライブラリーが導入された形質転換体を得た。
【００６１】
(4) HM-1感受性コロニーの選別
CMドロップアウト培地（アミノ酸フリーの酵母ナイトローゲンベース0.67％、グルコース２％、並びにアミノ酸及び核酸の混合物であるドロップアウトパウダー0.13％からなる）よりウラシルを除いた培地の上に細胞懸濁液を広げて30℃で培養した。宿主rhk1-1はウラシル要求性であるが、YCp50 を有するrhk1-1の形質転換体であれば、YCp50 のもつURA3遺伝子の存在によりウラシル無添加培地でも生育することができることを利用して、ウラシル非要求性のコロニー(Ura⁺ 形質転換体)20,000 個を得た。
【００６２】
得られたウラシル非要求性の形質転換体の中には、ゲノムDNAのうちHM-1感受性遺伝子を含むYCp50プラスミドを保有するもののほか、HM-1感受性遺伝子とは異なる遺伝子を含むYCp50プラスミドを保有するもの、及びYCp50しか保有しないものが混在している。そこで、HM-1感受性遺伝子を含むYCp50プラスミドを持つ形質転換体のみを選別するために、Ura+形質転換体を３μg/mlのHM-1を含むCMドロップアウト寒天培地へレプリカした。
その結果、HM-1感受性のコロニーを取得し、実施例１(1) のゲノムDNAの調製の記載に準じてコロニーよりプラスミドを調製した。
【００６３】
このプラスミドが有するインサートDNAを確認するために、プラスミドを含む10μlのTE溶液を制限酵素BamHIで消化し、電気泳動したところ、13.4kbのインサートDNAをもつプラスミドであることがわかった。このインサートDNAをさらに切りとって縮めるために、種々の制限酵素で消化した（図１(1) 〜(5) ）。得られたそれぞれのDNA断片をベクターYCp50にサブクローニングし、rhk1-1に導入し、それぞれのDNA断片について、選択培地（HM-1を含む合成寒天培地）上でHM-1に対する感受性を試験した。
【００６４】
その結果、HM-1存在下でrhk1-1の生育が阻止されたことから（図１Ａの(3) ）、HM-1感受性を表現する遺伝子領域は2.5kb のKpnI-ScaI断片に局在することが示された（図１(3) ）。
【００６５】
(5) DNA配列の決定
次に、この2.5kb断片の塩基配列を決定した結果、配列番号６で表される配列が得られ、この配列中に、458アミノ酸からなるオープンリーディングフレーム(ORF) が含まれていた。このORFをコードする遺伝子をRHK1と命名した。
【００６６】
(6) 遺伝子破壊によるHM-1耐性株の作出
YCp50 にRHK1が連結された遺伝子(YCp50-RHK1)を制限酵素KpnI及びHind IIIで消化後、RHK1断片を切り出してpUC118に連結した。得られたpUC118-RHK1 を制限酵素SphIで切断し、別にSphIで消化したURA3 DNA断片と連結することにより、RHK1遺伝子のSphI-SphI領域をURA3遺伝子で置き換えた（図２）。RHK1-URA3 キメラDNAをもつpUC118を制限酵素XhoIで切断後、RHK1-URA3 キメラDNA 断片をウラシル要求性株BJ1824(ura3, leu2, trp1, pep4)へ酢酸リチウム法により導入し、選択培地（ウラシルを含まないCMドロップアウト培地）上でウラシル非要求性株を選別した。RHK1遺伝子がURA3遺伝子により破壊されているか否か、すなわちURA3遺伝子がRHK1遺伝子の内部に組み込まれているか否かは、RHK1遺伝子をプローブとしてゲノムサザンブロッティングにより確認した。
【００６７】
得られたウラシル非要求性株がHM-1耐性であるか否かを試験した結果、該ウラシル非要求性株は、HM-1を含むYPD培地で生育することからHM-1耐性株と判断された（サッカロミセス・セレビシエ(BJ1824rhk1 △::URA3) ）を作製した。
【００６８】
〔実施例３〕変異型HM-1の構築と発現
HM-1は、プロテアーゼの一種であるトリプシンと長時間反応させると分解されることが知られている。そこで、トリプシンによる作用を受けにくい変異型HM-1を作製するために、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、第１番目のメチオニン(Met) から数えて98番目又は122番目のアルギニン(Arg) を、アラニン(Ala) に変換した。
また、119 番目及び123番目のアルギニンについても同様にアラニンに変換して試験を行った。
【００６９】
(1) 発現プラスミドの構築条件
HM-1領域を含む2.4kb EcoRI-HindIII DNA断片の5'側をキロシーケンス用デレーションキット（宝酒造）で短くした後、BamHIリンカーを連結した。この5'側にBamHI部位をもつBamHI-HindIII断片をpUC118へ挿入し、鋳型のDNAとした。
【００７０】
別にHM-1タンパク質の98番目、122番目、第119番目又は第123番目のArgをAlaに変えるために、予想される相補鎖の配列に従ってオリゴヌクレオチド23マーを化学合成し、プライマーとした（それぞれ、R98Aプライマー（配列番号７）、R122A プライマー（配列番号８）、R119Aプライマー（配列番号９）、R123Aプライマー（配列番号10））。
【００７１】
変異型HM-1遺伝子は、LA PCR in vitroミュタージェネシスキット（宝酒造）を用いて構築した。すなわち、BamHI及びHind III制限部位を両端に持つプラスミド(pUC118-BamHI-HindIII)を鋳型DNAとして用い、前記各プライマーとミーュタージェネシスキットに含まれるM13RVプライマーとの間でPCRを行った。別に、同じキットにあるMUT1プライマーとM13M4プライマーのと間でもPCRを行った。以下、同じキットの手順に従って変異型遺伝子（HM-1R98A、HM-1R122A、HM-1R122A及びHM-1R122A）を作製した後、それぞれをpUC18のEcoRIとHindIII部位に挿入し、大腸菌 DH5αへ導入した。得られた形質転換体をLB培地で培養することによりプラスミドを調製し、次いでHidIIIとBamHIでこのプラスミドを消化後、アガロース電気泳動で精製した。この精製された変異型遺伝子断片を、酵母ベクターYEp51のHindIIIとBamHI部位へ挿入してYEp51のGal10プロモーターの下流につないだ後、大腸菌DH5αに形質転換し、プラスミドを抽出精製した。得られたプラスミドをサッカロミセス・セレビシエBJ1824rhk1△::URA3へ導入し、形質転換体を得た（図３）。形質転換体の選択は、CMドロップアウト培地からロイシンを除いたものにより行った。
【００７２】
次いで、形質転換体を、HM-1感受性菌10⁶細胞をまいたYPD 寒天培地上にストリークすることにより、キラー活性を測定した(J.Fermentation & Bioengineering, 80,423-428,1995)。
【００７３】
その結果、変異型遺伝子HM-1R98A（配列番号２）及びHM-1R122A(配列番号３）に活性が認められた（図４）。
なお、変異型遺伝子HM-1R122A を保有する形質転換体（Saccharomyces cerevisiae BJ1824rhk1△::URA3／YEp51-HM-1R122A)は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、FERM P- 15811 として寄託されている。
【００７４】
(2) 変異型HM-1の精製
サッカロミセス・セレビシエBJ1824rhk1△::URA3／YEp51-HM-1R98A（またはYEp51-HM-1R122A）をショ糖0.５％を含むYPG培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、ガラクトース２％）にて30℃でOD600nmが50になるまで（約72時間）培養し、その上清液を得た。
【００７５】
まず、培地中に変異型HM-1が産生されているかどうかは、HM-1に対するポリクローナル抗体でウエスタンブロッテイングすることにより、HM-1と同じ位置に新規な変異型HM-1のバンドが検出されるか否かを調べることにより判断した。
次に、上記産生された変異型HM-1のうちどのHM-1がキラー活性を有するかを検定した。新規HM-1タンパク質がキラー活性をもつことは、YPD寒天培地上でハンゼヌラ・アノマラIFO0569株を検定菌とすることにより判定した。
【００７６】
すなわち、YPD寒天培地上にステンレスカップを置き、次いでハンゼヌラ・アノマラIFO 0569株１×10⁶細胞／mlを含むYPD軟寒天培地を重層後、ステンレスカップを除いて得られた穴へ、変異型HM-1を含む培養液を入れ、30℃にて一夜放置後、生じる阻止円を測定することにより検定を行った。
【００７７】
次に、活性の認められた変異型HM-1を精製するために、サッカロミセス・セレビシエBJ1824rhk1△::URA3／YEp51-HM-1R98A（またはYEp51-HM-1R122A）を、500 mlの三角フラスコ中、200 mlのYPG ＋ 0.5％ Sucrose培地で、５日培養した（30℃，120rpm) 。
【００７８】
培養物を7000rpmで10分遠心し、培養上清を0.45μm のフィルターに通し、遠心式濃縮機で濃縮した。得られた濃縮液を、分子量3500カットの透析チューブを用いて多量の水に対して透析した。透析後遠心式濃縮機で試料を濃縮し、Sephadex G-50(Fine 2.5×96cm) を用いてゲル濾過を行った。溶出は20mMトリメチルアミン- 酢酸(pH5.0) バッファーを用いた。
【００７９】
活性画分を集め、遠心式濃縮機で濃縮後、70mlの20mM水酸化アンモニウム- 酢酸(pH8.5) バッファーに溶解し、２M の同バッファーでpHを8.0 に調整した。この試料をSuperQトヨパール650S(1.9×7cm)のカラムにかけ、20mM水酸化アンモニウム- 酢酸(pH8.5) バッファーで溶出し、溶出液を10mMトリメチルアミン- 酢酸(pH3.0) バッファーで透析した。
【００８０】
得られた試料を、10mMトリメチルアミン- ギ酸(pH3.0) バッファーで平衡化したSPトヨパール650S(1.5×7cm)にかけ、１M の同バッファーで溶出した。活性画分を集め、10mMトリメチルアミン- ギ酸(pH3.0) バッファーで透析した後、HPLC(SP-5PW(7.5mm ×7.5cm); トーソー) を行った。HPLCは、10mMトリメチルアミン- ギ酸(pH3.0) バッファーと２M トリメチルアミン- ギ酸(pH3.0) バッファーとのリニアグラジエントにより行い、最終的に変異型HM-1を精製した。
こうして得られた標品は、20％アクリルアミドゲルを含むSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一のバンドを示した。
【００８１】
〔実施例４〕本発明の変異型HM-1の性質
(1) プロテアーゼに対する分解性（プロテアーゼ耐性）
配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち第98番目をアラニンに変異させた変異型HM-1における第98番目のアラニンと第99番目のセリンとの間の結合、及び配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち第122番目をアラニンに変異させた変異型HM-1における第122番目のアラニンと第123番目のアルギニンとの間の結合が、トリプシンにより切断されるか否かを検討した。
【００８２】
精製した変異型HM-1タンパク質にトリプシンを加えて作用させたところ、トリプシンによる消化は認められなかったことから、変異型HM-1タンパク質は強いトリプシン耐性を示した。
【００８３】
(2) キラー活性
本発明の精製変異型HM-1についてキラー活性を調べた結果、HM-1と同等のキラー活性が認められた。
【００８４】
【発明の効果】
本発明により、変異型キラータンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、及び該遺伝子によって形質転換された形質転換体が提供される。
本発明のタンパク質は強いプロテアーゼ耐性を示し、しかも大量生産することができるため、例えば抗菌剤又は抗菌性石鹸等に利用することができる。
【００８５】
【配列表】

【００８６】

【００８７】

【００８８】

【００８９】

【００９０】

【００９１】

【００９２】

【００９３】

【００９４】

【図面の簡単な説明】
【図１】 HM-1感受性の試験結果を示す写真である（生物の形態）。
【図２】 HM-1耐性遺伝子の構築図である。
【図３】本発明の形質転換体の構築図である。
【図４】変異型HM-1のキラー活性を示す写真である（生物の形態）。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a killer protein, a gene encoding the protein, a transformant transformed with the gene, and use of the killer protein.
[0002]
[Prior art]
Since it was known that yeast or its related fungi produce a killer protein exhibiting antibacterial activity called killer toxin, several secretory protein killer toxins have been discovered and produced by these yeasts, etc. Various properties or mechanisms of action of killer proteins are known.
[0003]
For example, it has been reported that Kh-II killer protein produced by Hansenula anomala has a working pH of 3-6, is not degraded by papain, but is gradually degraded by gonococcal protease (specialty). No. 5-70639, No. 5-70640).
[0004]
K1 killer protein (encoded on double-stranded RNA plasmid) produced by Saccharomyces cerevisiae is known to kill sensitive yeast by inhibiting the proton pump of the target yeast. The killer protein produced by Kluyveromyces lacits (encoded on a linear double-stranded DNA plasmid) originally has chitinase activity but is sensitive to the yeast of sensitive yeast. It is known to inhibit denylate cyclase, and the killer protein produced by Pchia kluyveri is known to make a hole in the lipid bilayer membrane of the target yeast.
[0005]
In nature, there is a phenomenon in which yeasts (generally nucleated microorganisms) produce and secrete proteinaceous toxins that have an antibiotic action and conflict with each other. This phenomenon is an interesting phenomenon in protein engineering that such proteinaceous toxins are specific and toxic to the target bacteria but are not harmful to self. Therefore, in consideration of the so-called “State of Arts” in recent years, we have created protein antibiotics against pathogenic fungi such as fungi by modifying protein toxins using genetic engineering techniques to treat mycoses. Clearly, there is a need to develop proteins that can be used in detergents and the like. It is also possible to determine the three-dimensional structure of a small molecular weight protein such as the killer protein, and to design a non-protein antibacterial compound from the three-dimensional structure of the active site region.
[0006]
On the other hand, infection with AIDS, immunity decline, or aging progresses, making it easier for fungi to be infected, leading to the development of infectious diseases that present infectious symptoms throughout the body. For this reason, the development of antibiotics (antibiotics) for the treatment of infectious diseases has been attempted, and antifungal antibiotics that inhibit the synthesis of glucan, a cell wall component such as organic compounds such as acreasin A and papracanden B, are already known It has been.
[0007]
However, these antibiotics are highly hepatotoxic and have problems such as inducing drug resistance. Therefore, there is a demand for antibiotics that do not induce drug resistance and are excellent in safety.
Therefore, in order to make killer proteins available for antibiotics and detergents, it has become necessary to produce killer proteins that are effective against pathogenic fungi and exhibit alkali resistance and protease resistance.
[0008]
Conventionally, it has been known that killer proteins produced by Hansenula mrakii are useful for antifungal agents, detergents and the like.
However, since the amount of killer protein produced by Hansenula Muraki is very small, mass production is difficult, and it is difficult to actually apply it as an antibacterial agent or the like. Further, the killer protein is susceptible to inactivation because it is sensitive to protease. Furthermore, when cultivating animal cells, various antibacterial agents (for example, fungizone) can be used instead of killer protein. However, these antibacterial agents are unstable to heat, so that they can be used for sterilization of culture solutions. The high temperature sterilization often used (eg autoclave) is not possible. Therefore, it must be sterilized separately from the sterilization of the culture solution, and the operation is complicated.
[0009]
On the other hand, when mass-producing proteins by genetic engineering techniques, it is appropriate to use yeast Saccharomyces cerevisiae as a useful transformation host, but Saccharomyces cerevisiae is sensitive to the killer protein produced by Hansenula muraki. Therefore, the gene for the killer protein derived from Hansenula muraki cannot be introduced.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a killer protein, a gene encoding the protein, a transformant transformed with the gene, an antibacterial soap and an antifungal agent.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
As a result of earnest research based on the above problems, the present inventor mass-produces a trace amount of HM-1 killer protein produced by Hansenula mrakii by genetic engineering using Saccharomyces cerevisiae, Moreover, the present inventors have succeeded in creating a killer protein that has protease resistance and is more effective against pathogenic fungi, thereby completing the present invention.
[0012]
That is, the present invention is a killer protein that substantially includes an amino acid sequence in which the 98th and / or 122th arginine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is mutated to alanine and has antibacterial activity.
Furthermore, the present invention is a killer protein gene comprising DNA that substantially encodes an amino acid sequence in which the 98th and / or 122th arginine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is mutated to alanine. Examples of the gene include those substantially containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3.
[0013]
Here, “substantially” is included in the protein (polypeptide) as long as the killer protein of the present invention has antibacterial activity and the gene of the present invention has a function of expressing the activity of the killer protein. It means that mutation such as deletion, substitution, insertion and the like may occur in the amino acid sequence to be determined or the base sequence of the gene.
[0014]
Therefore, for example, a protein lacking the first methionine (Met) contained in the killer protein of the present invention is also included in the protein due to this amino acid sequence change. In addition to the base sequence encoding the amino acid contained in the killer protein of the present invention, degenerate isomers encoding the same polypeptide that differs only in the degenerate codon are also included in the gene of the present invention.
[0015]
However, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, mutations such as the above deletion, substitution, insertion, etc. are present at the mutation site (alanine in place of the 98th arginine and / or alanine in place of the 122nd arginine) In addition, the nucleotide sequence encoding alanine shall not cause mutations such as the above-mentioned deletion, substitution, and insertion other than mutation due to a degenerate isomer of alanine.
[0016]
Furthermore, the present invention is a recombinant DNA containing the killer protein gene.
Furthermore, the present invention is a transformant transformed with the recombinant DNA and the recombinant DNA containing the killer protein resistance gene.
Furthermore, the present invention provides a method for producing a killer protein, comprising culturing the transformant in a medium and collecting the killer protein from the obtained culture.
[0017]
Furthermore, the present invention is an antibacterial agent comprising the killer protein as an active ingredient.
Furthermore, the present invention is an antibacterial soap containing the killer protein as an antibacterial component.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0018]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The killer protein of the present invention (hereinafter, killer protein is referred to as “HM-1”) is an HM-1 resistance gene (HM-) that has previously been introduced with mutations by genetic engineering techniques to impart protease resistance. 1) a gene obtained by destroying a susceptibility gene), introduced into a yeast imparted with HM-1 resistance, and expressed. HM-1 of the present invention has an increased antibacterial activity, is resistant to proteases, and has an action pH on the alkali side. Moreover, since HM-1 of the present invention can be produced using yeast Saccharomyces cerevisiae as a host, it can be obtained efficiently.
[0019]
A method for obtaining HM-1 of the present invention will be described.
First, the HM-1 gene produced by Hansenula Muraki is cloned, and a part of the obtained gene is mutated to produce an HM-1 mutant gene. On the other hand, an HM-1 resistant gene is introduced into the yeast Saccharomyces cerevisiae to produce an HM-1 resistant transformant (transformed yeast). The mutant gene is introduced into the resulting transformed yeast to produce a transformant containing both the mutant gene and the HM-1 resistance gene. Then, HM-1 of the present invention can be obtained by culturing the obtained transformant.
[0020]
(1) Cloning of HM-1 gene
(1) Preparation of genomic DNA from Hansenula muraki
First, Hansenula muraki is cultured, and genomic DNA is prepared from the resulting culture. Examples of Hansenula Muraki include IFO 0895 or IFO 8075.
[0021]
Hansenula muraki can be cultured by a usual method (experimental medicine separate volume: genetic experiment method using yeast, pages 14 to 15, Yodosha, 1994). For example, the strain is inoculated into a nutrient medium such as YPD medium or a minimal medium, and cultured at 30 ° C. until the logarithmic growth phase. Next, genomic DNA is prepared from the cultured strain. Known methods can also be used for the preparation of genomic DNA (Methods in Enzymology, 194, 218-219).
[0022]
(2) Design of oligonucleotides from known amino acid sequences
Based on the already known amino acid sequence of HM-1 (FEBS LETT., 195, 253-257, 1986), nucleotides for hybridization with genomic DNA are designed. For example, among the known amino acid sequences of HM-1, a nucleotide 20mer (SEQ ID NO: 4) encoding the amino acid sequence from the 20th tryptophan (Trp) to the 26th threonine (Thr), and the 33rd Two oligonucleotide probes of 17-mer (SEQ ID NO: 5) of nucleotide anticodon encoding amino acid sequence from asparagine (Asn) to 38th valine (Val) are synthesized. Nucleotide synthesis can be performed using, for example, an automatic DNA synthesizer manufactured by ABI (Applied Biosystems Inc.). The resulting nucleotide is used for hybridization with genomic DNA.
[0023]
(3) Hybridization
The genomic DNA prepared in (1) above is cleaved with an appropriate restriction enzyme (for example, HindIII, EcoRI, BamHI, etc.), and the resulting DNA fragment and the two oligonucleotide probes synthesized in (2) above are used. Southern blot hybridization (Southern blotting). Southern blotting can be performed by a known method (FEBS LETT., 195, 253-257, 1986).
[0024]
When the desired DNA fragment is obtained as a result of Southern blotting, a physical map of the DNA fragment is prepared and treated with an appropriate restriction enzyme such as EcoRI or Hind III to obtain an appropriate length fragment. . In addition, based on the obtained fragment, if it is found that the target DNA fragment contains an unnecessary DNA region, further digestion with restriction enzymes EcoRI, Hind III, etc. Except for the above, the target HM-1 gene is screened from the genomic DNA library using two kinds of synthetic oligonucleotide probes (SEQ ID NOs: 4 and 5) in the same manner as described above.
[0025]
(4) Determination of base sequence
The base sequence of the DNA fragment obtained in (3) above is determined. The base sequence can be determined by a known method such as the dideoxy method or the Maxam-Gilbert method, and an auto sequencer manufactured by ABI may be used.
[0026]
(2) Preparation of HM-1 resistant transformants
It can be expected that Saccharomyces cerevisiae is sensitive to HM-1 because a gene that interacts with HM-1 and expresses HM-1 sensitivity exists in the genus Saccharomyces. Therefore, in the present invention, an HM-1 resistance gene is first prepared by cloning an HM-1 sensitivity gene and then destroying the HM-1 sensitivity gene. Then, an HM-1 resistant transformant is prepared by transforming the obtained HM-1 resistant gene into yeast.
[0027]
(1) Preparation of Saccharomyces cerevisiae genomic DNA library
In order to clone the HM-1-sensitive gene of Saccharomyces cerevisiae, a genomic DNA library of Saccharomyces cerevisiae linked to the Saccharomyces cerevisiae yeast vector YCp50 is first prepared. The library can be prepared by digesting Saccharomyces cerevisiae genomic DNA with the restriction enzyme BamHI and ligating the resulting fragment with YCp50.
[0028]
(2) Preparation of HM-1 resistant mutant
Next, an HM-1 resistant mutant strain (requiring uracil) for introducing a Saccharomyces cerevisiae genomic DNA library is isolated and prepared. The reason why the uracil-requiring mutant is used as a host is to screen only a library having a uracil non-requiring gene.
[0029]
Examples of the method for isolating HM-1 resistant mutants include a method induced by EMS (ethyl methanesulfonic acid) or nitrosoguanidine, a method using ultraviolet irradiation, and a method using transposon Ty.
[0030]
For example, in the case of preparing an HM-1 resistant mutant using EMS, the procedure is as follows. That is, Saccharomyces cerevisiae BJ1824 (a, ura3, leu2, trp1, pep4) is inoculated into a YPD medium, grown, collected, washed with a potassium phosphate buffer, and suspended in the same buffer. Add EMS, vortex vigorously, shake at 30 ° C for 30 minutes, add an equal volume of sodium thiosulfate and mix well. Collect bacteria, wash twice with sterile water, suspend and dilute in sterile water.
[0031]
The cell suspension thus prepared is plated on a YPD agar medium containing HM-1, and an HM-1 resistant mutant is obtained by incubation at 30 ° C. for 36 hours.
[0032]
(3) Introduction of genomic DNA library into HM-1 resistant mutant
The rhk1-1 is transformed by introducing the DNA library obtained in (1) above into the HM-1-resistant mutant strain (hereinafter referred to as “rhk1-1”) prepared in (2) above. . For introducing the DNA library, a usual method (for example, lithium acetate method) can be used.
[0033]
(4) Selection of genomic DNA library introduced strain
At the stage of transforming rhk1-1, there are yeasts that do not contain genomic DNA, so it is necessary to select only yeasts into which genomic DNA has been introduced.
Thus, utilizing the fact that YCp50 contains the URA3 gene, the transformant obtained in (3) was cultured using a medium in which uracil was removed from the CM dropout medium, whereby genomic DNA was introduced. Only transformants are selected.
[0034]
Here, the CM dropout medium is a medium containing 0.67% amino acid-free yeast nitrogen base, 2% glucose, and 0.13% dropout powder which is a mixture of amino acids and nucleic acids.
[0035]
Since the host rhk1-1 is uracil-requiring, it cannot grow in a medium that does not contain uracil, but the plasmid YCp50 introduced into the host carries the URA3 gene, which is a non-uracil-requiring gene. It can also grow on supplemented media. By utilizing this property, uracil non-requiring colonies (Ura + transformants) can be obtained.
[0036]
(5) Selection of colonies containing HM-1 susceptibility genes
Among the obtained non-uracil-requiring transformants, genomic DNA possesses YCp50 plasmid containing HM-1 sensitive gene and YCp50 plasmid containing gene different from HM-1 sensitive gene And those that only have YCp50. Therefore, in order to select only transformants carrying the YCp50 plasmid containing the HM-1 susceptibility gene, the Ura + transformant was transformed into CM dropout agar containing HM-1 by the replica method (J. Bacteriol., 63, 399, 1952). Replicate to medium. Thereby, only colonies containing HM-1 sensitive genes can be obtained.
Preparation of plasmid DNA from the obtained colonies is carried out according to the description of the method for preparing genomic DNA ((1) in (1) above).
[0037]
(6) Confirmation and cloning of insert DNA
In order to confirm the insert DNA (DNA fragment containing the HM-1 sensitive gene), the plasmid obtained in (5) above is digested with the restriction enzyme BamHI and electrophoresed. In order to further cut and shrink the resulting DNA, a physical map of the DNA is prepared and digested with various restriction enzymes. The obtained DNA fragment is subcloned into vector YCp50, introduced into rhk1-1, and tested for sensitivity to HM-1 on a selective medium (synthetic agar medium containing HM-1). Then, the base sequence of the DNA confirmed to be sensitive is determined, and the HM-1 sensitive gene is cloned.
[0038]
(7) Construction of HM-1 resistant gene by gene disruption and creation of HM-1 resistant strain
A part of the HM-1 susceptibility gene (hereinafter referred to as “RHK1 gene”) cloned as described in (6) above was cleaved with a restriction enzyme (eg, SphI) and digested separately with the same restriction enzyme (New 3 (England Biolab) is inserted between RHK1 gene fragments, the RHK1 gene is destroyed by the URA3 gene, and the restriction enzyme cleavage site of the RHK1 gene is replaced with the URA3 gene (RHK-1-URA3 chimeric DNA) Is built. The disruption of RHK1 gene by URA3 gene can be confirmed by tetramolecular analysis.
This chimeric DNA is introduced into rhk1-1 to produce Saccharomyces cerevisiae BJ1824rhk1Δ :: URA3, which is a transformant resistant to HM-1.
[0039]
(3) Construction of mutant HM-1 gene
In order to confer protease resistance to known HM-1, a mutation (substitution) is introduced into a part of the amino acid sequence of HM-1.
In the present invention, for example, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the 98th and / or 122th arginine (Arg) counted from the first methionine (Met) is substituted with alanine (Ala). Mutant HM-1 is produced. However, the mutation may be introduced at one of the 98th and 122nd positions, or may be introduced at both.
[0040]
Since the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 also contains arginine at the 119th and 123rd positions, the construction of a mutant HM-1 gene obtained by introducing a mutation at these sites is also possible. Try.
[0041]
A known method can be used for introducing the mutation. Examples thereof include a point mutation introduction method and a mutation introduction method using polymerase chain reaction (PCR).
The mutant HM-1 gene can be constructed using, for example, the LA PCR in vitro mutergenesis kit (Takara Shuzo).
[0042]
That is, after shortening the 5 ′ side of the DNA fragment containing the HM-1 gene region cloned in (1) with a kilosequence deletion kit (Takara Shuzo), a BamHI linker is ligated. This BamHI-HindIII fragment having a BamHI site on the 5 ′ side is inserted into pUC118, and used as template DNA.
On the other hand, in order to change the 98th, 119th, 122th, or 123rd arginine (Arg) of HM-1 to alanine (Ala), an oligonucleotide is chemically synthesized according to the sequence of the expected complementary strand to prepare a primer.
[0043]
Next, PCR is performed using the template and primers according to the instructions of the kit to produce a mutant gene. The obtained mutant gene is inserted between the EcoRI site and HindIII site of pUC18 and introduced into E. coli DH5α. A plasmid is prepared by culturing the obtained transformant in LB medium, and then this plasmid is digested with HidIII and BamHI and then purified by agarose electrophoresis. This purified mutant gene fragment is inserted into the HindIII and BamHI sites of the yeast vector YEp51 and connected downstream of the Gal10 promoter of YEp51, and then transformed into E. coli DH5α, and the plasmid is extracted and purified.
[0044]
(4) Purification of mutant HM-1 and measurement of activity
After introducing the mutant HM-1 gene into the transformed yeast Saccharomyces cerevisiae BJ1824rhk1Δ :: URA3 prepared in (2) above, the transformant is cultured in a medium. The resulting culture is purified according to conventional protein purification techniques.
[0045]
Purification includes salting out, gel filtration using Sephadex G-50, ion exchange chromatography using CM cellulose, DEAE, etc., affinity chromatography using anti-HM-1 monoclonal antibody, other reverse phase chromatography, etc. Can be carried out alone or in appropriate combination.
[0046]
Whether or not the purified protein is the target can be confirmed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, Western blotting or the like. Here, when HM-1 is purified, it is tested whether or not mutant HM-1 is produced in the culture. The assay can be performed by Western blotting using an anti-HM-1 monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
[0047]
In addition, the assay of killer activity of the produced mutant HM-1 was performed by immersing the mutant HM-1 purified as described above on an agar medium containing Hansenula anomala IFO 0569 strain. This can be done by placing a paper disk and measuring the size of the resulting blocking circle.
[0048]
(5) Antibacterial soap and antibacterial agent
When HM-1 of the present invention is used as an antibacterial soap, the target to be used is not particularly limited. For example, it can be used for detergents for hand-washing, detergents for clothes and bedding (sheets, pillow covers, etc.), or coatings after washing clothes.
It is also possible to determine the three-dimensional structure of a small molecular weight protein such as the killer protein, and to design a non-protein antibacterial compound from the three-dimensional structure of the active site region.
[0049]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Cloning of HM-1 gene
(1) Preparation of genomic DNA library
(1) Preparation of genomic DNA
Hansenula Muraki IFO 0895 was inoculated into a YPD medium consisting of 1% yeast extract, 2% peptone, and 2% sorbitol and cultured at 30 ° C. until the logarithmic growth phase, and then chromosomal DNA was prepared.
[0050]
That is, HM-1-sensitive colonies were planted in 1.5 ml of YPD liquid medium and cultured overnight, and the resulting culture was transferred to an Eppendorf tube, centrifuged and washed once with water.
Suspend this in 0.5 ml sorbitol solution (1 M sorbitol, 100 mM EDTA (pH 7.5)), add 0.02 ml of zymolyce enzyme solution (10 mg / ml zymolyase-100T; manufactured by Seikagaku Corporation), and stir at 37 ° C. Incubated for 60 minutes. After centrifugation at 3,000 rpm for 30 seconds, the cells were suspended in 0.5 ml of a Tris solution (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 20 mM EDTA), and 0.05 ml of 10% SDS was further added and mixed well. This was incubated at 65 ° C. for 30 minutes, added with 0.25 ml of 4M potassium acetate solution, mixed well, and then allowed to stand at 0 ° C. for 60 minutes.
[0051]
Next, it was centrifuged at 12,000 rpm and 4 ° C. for 5 minutes. The supernatant was transferred to another Eppendorf tube, equal volume of isopropanol was added and mixed well, and then allowed to stand at room temperature for 5 minutes. After centrifugation at 12,000 rpm for 10 seconds at room temperature, the supernatant was discarded and the precipitate was washed with 70% ethanol. The precipitate was dissolved in 0.2 ml of TE solution (10 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA), 5 μL of RNase enzyme solution (1 mg / ml RNase A) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After phenol extraction, 0.2 ml of isopropanol was added together with 20 μL of 3M sodium acetate solution, mixed well, placed at room temperature for 5 minutes, centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes, and the precipitate was washed with 70% ethanol. It melt | dissolved in 100 microliters TE solution after drying.
The chromosomal DNA thus obtained was about 10 μg.
[0052]
(2) Preparation of genomic DNA library
First, λ phage cloning vector EMBL3 was cleaved with BamHI to obtain EMBL3 DNA having a BamHI cut surface. Next, the chromosomal DNA obtained from the Hansenula muraki strain IFO 0895 was partially digested with the restriction enzyme Sau3AI.
[0053]
The treatment solution thus obtained is added to an in vitro packaging kit (manufactured by STRATAGENE), and the DNA is obtained by an in vitro packaging method (Horn, B., Methods in Enzymology, 68, 299 (1979)). Introduced into phage particles, a genomic DNA library of Hansenula Muraki IFO 0895 was prepared (Weiss, B. et al., J. Biol. Chem., 243,4543 (1968)).
[0054]
In addition, among the amino acid sequences of HM-1 reported by Yamamoto et al. (FEBS LETT., 195,253-257, 1986), nucleotide 20 encoding the amino acid sequence corresponding to the 20th tryptophan to the 26th threonine. And a 17-mer of an anticodon of a nucleotide corresponding to the thirty-third asparagine to thirty-eighth valine (hereinafter referred to as “probe 2”; SEQ ID NO: 5). A synthetic oligonucleotide probe was prepared.
[0055]
(2) Cloning of genomic DNA
Chromosomal DNA cleaved with restriction enzymes HindIII, EcoRI or BamHI was hybridized with Southern blot hybridization (Gene 137, 265-270, 1993).
[0056]
As a result, one band was detected. Next, using the probe 1 and probe 2, screening was similarly performed from a genomic DNA library, and a DNA (λHMK08) containing a 3.6 kb HindIII DNA fragment was picked up. . A physical map of the obtained 3.6 kb HindIII DNA fragment was prepared, and the fragment hybridizing with probe 1 and probe 2 was digested with EcoRI and Hind III to reduce the DNA fragment.
As a result, a 2.4 kb fragment (2.4 kb EcoRI-HindIII DNA) having EcoRI and HindIII sites at both ends of the DNA was obtained.
[0057]
[Example 2] Production of HM-1-resistant yeast
(1) Preparation of genomic DNA library
The Saccharomyces cerevisiae DNA library linked to the shuttle vector YCp50 is obtained by partially digesting Saccharomyces cerevisiae genomic DNA with the restriction enzyme Sau3AI and ligating the resulting fragment with YCp50 cleaved with BamHI with T4 DNA ligase. Produced.
[0058]
(2) Construction of HM-1 resistant mutant (rhk1-1)
Saccharomyces cerevisiae BJ1824 (a, ura3, leu2, trp1, pep4) is inoculated into 5 ml of YPD medium, and the cell concentration is 2 x 10 at 30 ° C. ⁸ The cells were grown to cells / ml, and 2.5 ml was collected by centrifugation. It was washed twice with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) and suspended in 10 ml of the same buffer. To this, 300 μl of EMS (ethyl methanesulfonic acid) was added and vortexed vigorously. After shaking at 30 ° C. for 30 minutes, an equal amount of sodium thiosulfate was added and mixed well. The cells were collected, washed twice with sterilized water, suspended and diluted in sterilized water.
The cell suspension thus prepared is plated on a YPD agar medium containing 3 μg / ml HM-1 and incubated at 30 ° C. for 36 hours to obtain a HM-1-resistant mutant rhk1-1. did.
[0059]
(3) Introduction of DNA library into rhk1-1
Transformation to introduce the above YCp50-genomic DNA library into the thus obtained rhk1-1 was performed according to the lithium acetate method.
[0060]
That is, plant rhk1-1 in 100 ml of YPD medium and add OD ₆₀₀ Was cultured at 30 ° C. until 1.0 to 2.0. After culturing, the cells were collected by centrifugation at 3,000 rpm for 5 minutes and suspended in 5 ml of TE (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA). Bacteria were collected by the same centrifugation and suspended in 5 ml of lithium acetate solution. The cells were collected again by centrifugation, and suspended in 1 ml of lithium acetate solution (100 mM lithium acetate, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA). After shaking this at 30 ° C. for 60 minutes, 400 μg of carrier DNA (calf thymus DNA) was added, and 100 μL each was dispensed into an Eppendorf tube. 1 μg of DNA was added to this and incubated at 30 ° C. for 30 minutes. 700 μL of PEG solution (35% (w / v) polyethylene glycol 4000, 100 mM lithium acetate, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA) was added to this, and the mixture was incubated at 30 ° C. for 50 minutes, then 42 ° C. Heat shock was applied for 5 minutes. Subsequently, the mixture was centrifuged for 4 seconds, the supernatant was removed by an aspirator, the precipitate was washed with 500 μL of TE, and then suspended in 100 μL of TE.
As a result, a transformant in which the YCp50-genomic DNA library was introduced was obtained.
[0061]
(4) Selection of HM-1 sensitive colonies
Spread the cell suspension on the medium where uracil is removed from CM dropout medium (consisting of 0.67% amino acid-free yeast nitrogen base, 2% glucose, and 0.13% dropout powder, which is a mixture of amino acids and nucleic acids). And cultured at 30 ° C. Although the host rhk1-1 is uracil-requiring, a rhk1-1 transformant having YCp50 can grow in a uracil-free medium due to the presence of the URA3 gene of YCp50. Unrequired colonies (Ura ⁺ 20,000 transformants were obtained.
[0062]
Among the obtained non-uracil-requiring transformants, genomic DNA possesses YCp50 plasmid containing HM-1 sensitive gene and YCp50 plasmid containing gene different from HM-1 sensitive gene And those that only have YCp50. Therefore, in order to select only transformants having a YCp50 plasmid containing an HM-1 sensitive gene, Ura + transformants were replicated on a CM dropout agar medium containing 3 μg / ml HM-1.
As a result, colonies sensitive to HM-1 were obtained, and plasmids were prepared from the colonies according to the description of preparation of genomic DNA in Example 1 (1).
[0063]
In order to confirm the insert DNA of this plasmid, 10 μl of TE solution containing the plasmid was digested with the restriction enzyme BamHI and electrophoresed, and it was found that the plasmid had a 13.4 kb insert DNA. This insert DNA was digested with various restriction enzymes to further cut and shrink (FIGS. 1 (1) to (5)). Each of the obtained DNA fragments was subcloned into vector YCp50 and introduced into rhk1-1, and each DNA fragment was tested for sensitivity to HM-1 on a selective medium (synthetic agar medium containing HM-1).
[0064]
As a result, since the growth of rhk1-1 was inhibited in the presence of HM-1 ((3) in FIG. 1A), the gene region expressing HM-1 sensitivity was localized in the 2.5 kb KpnI-ScaI fragment. (Fig. 1 (3)).
[0065]
(5) Determination of DNA sequence
Next, as a result of determining the base sequence of this 2.5 kb fragment, the sequence represented by SEQ ID NO: 6 was obtained, and this sequence contained an open reading frame (ORF) consisting of 458 amino acids. The gene encoding this ORF was named RHK1.
[0066]
(6) Generation of HM-1 resistant strain by gene disruption
A gene in which RHK1 was linked to YCp50 (YCp50-RHK1) was digested with restriction enzymes KpnI and HindIII, and then the RHK1 fragment was excised and ligated to pUC118. The obtained pUC118-RHK1 was cleaved with the restriction enzyme SphI and ligated with a URA3 DNA fragment separately digested with SphI to replace the SphI-SphI region of the RHK1 gene with the URA3 gene (FIG. 2). After cleaving pUC118 with the RHK1-URA3 chimeric DNA with the restriction enzyme XhoI, the RHK1-URA3 chimeric DNA fragment was introduced into the uracil-requiring strain BJ1824 (ura3, leu2, trp1, pep4) by the lithium acetate method, and the selective medium (uracil) Non-uracil-requiring strains were selected on CM dropout medium (without CM). Whether or not the RHK1 gene was disrupted by the URA3 gene, that is, whether or not the URA3 gene was incorporated into the RHK1 gene was confirmed by genomic Southern blotting using the RHK1 gene as a probe.
[0067]
As a result of testing whether or not the obtained uracil non-requiring strain is HM-1 resistant, the uracil non-requiring strain is judged to be an HM-1 resistant strain because it grows in a YPD medium containing HM-1. (Saccharomyces cerevisiae (BJ1824rhk1 Δ :: URA3)) was produced.
[0068]
[Example 3] Construction and expression of mutant HM-1
HM-1 is known to be degraded when reacted with trypsin, a kind of protease, for a long time. Therefore, in order to produce a mutant HM-1 that is not easily affected by trypsin, among the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the 98th or 122th arginine (counted from the first methionine (Met) ( Arg) was converted to alanine (Ala).
Similarly, the 119th and 123rd arginines were converted to alanine and tested.
[0069]
(1) Expression plasmid construction conditions
The 5 ′ side of the 2.4 kb EcoRI-HindIII DNA fragment containing the HM-1 region was shortened with a kilosequence deletion kit (Takara Shuzo), and then a BamHI linker was ligated. A BamHI-HindIII fragment having a BamHI site on the 5 ′ side was inserted into pUC118 to obtain a template DNA.
[0070]
Separately, in order to change 98th, 122th, 119th or 123rd Arg of HM-1 protein to Ala, oligonucleotide 23mer was chemically synthesized according to the sequence of the expected complementary strand and used as a primer (respectively R98A primer (SEQ ID NO: 7), R122A primer (SEQ ID NO: 8), R119A primer (SEQ ID NO: 9), R123A primer (SEQ ID NO: 10)).
[0071]
Mutant HM-1 gene was constructed using LA PCR in vitro mutergenesis kit (Takara Shuzo). That is, PCR was performed between each of the above primers and the M13RV primer included in the Mute Genesis Kit, using a plasmid (pUC118-BamHI-HindIII) having BamHI and HindIII restriction sites at both ends as template DNA. Separately, PCR was also performed between the MUT1 primer and M13M4 primer in the same kit. Thereafter, mutant genes (HM-1R98A, HM-1R122A, HM-1R122A and HM-1R122A) were prepared according to the same kit procedure, and then inserted into the EcoRI and HindIII sites of pUC18, respectively, and introduced into E. coli DH5α. A plasmid was prepared by culturing the obtained transformant in LB medium, and then this plasmid was digested with HidIII and BamHI and purified by agarose electrophoresis. This purified mutant gene fragment was inserted into the HindIII and BamHI sites of the yeast vector YEp51 and connected downstream of the Gal10 promoter of YEp51, and then transformed into E. coli DH5α, and the plasmid was extracted and purified. The obtained plasmid was introduced into Saccharomyces cerevisiae BJ1824rhk1Δ :: URA3 to obtain a transformant (FIG. 3). Transformants were selected by removing CM from the CM dropout medium.
[0072]
The transformant was then transformed into HM-1-sensitive bacteria 10 ⁶ Killer activity was measured by streaking the cells on a YPD agar medium (J. Fermentation & Bioengineering, 80, 423-428, 1995).
[0073]
As a result, activity was observed in the mutant genes HM-1R98A (SEQ ID NO: 2) and HM-1R122A (SEQ ID NO: 3) (FIG. 4).
The transformant carrying the mutant gene HM-1R122A (Saccharomyces cerevisiae BJ1824rhk1 △ :: URA3 / YEp51-HM-1R122A) was deposited with the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as FERM P-15811 Yes.
[0074]
(2) Purification of mutant HM-1
Saccharomyces cerevisiae BJ1824rhk1 △ :: URA3 / YEp51-HM-1R98A (or YEp51-HM-1R122A) in YPG medium containing 0.5% sucrose (yeast extract 1%, peptone 2%, galactose 2%) 30 Culturing was performed at 50 ° C. until the OD600nm reached 50 (about 72 hours), and the supernatant was obtained.
[0075]
First, whether or not mutant HM-1 is produced in the medium is detected by western blotting with a polyclonal antibody against HM-1, and a new mutant HM-1 band is detected at the same position as HM-1. Judgment was made by examining whether or not it was done.
Next, it was tested which HM-1 of the produced mutant HM-1 had killer activity. Whether the novel HM-1 protein has killer activity was determined by using Hansenula anomala IFO0569 strain as a test bacterium on a YPD agar medium.
[0076]
In other words, a stainless steel cup was placed on the YPD agar medium, and then Hansenula Anomala IFO 0569 strain 1 × 10 ⁶ After overlaying the YPD soft agar medium containing cells / ml, put the culture solution containing the mutant HM-1 into the hole obtained by removing the stainless steel cup, leave it overnight at 30 ° C, and measure the inhibition circle produced. The test was performed.
[0077]
Next, in order to purify the mutant HM-1 that was found to be active, Saccharomyces cerevisiae BJ1824rhk1 △ :: URA3 / YEp51-HM-1R98A (or YEp51-HM-1R122A) was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask, The cells were cultured in 200 ml of YPG + 0.5% Sucrose medium for 5 days (30 ° C., 120 rpm).
[0078]
The culture was centrifuged at 7000 rpm for 10 minutes, and the culture supernatant was passed through a 0.45 μm filter and concentrated with a centrifugal concentrator. The obtained concentrated solution was dialyzed against a large amount of water using a dialysis tube having a molecular weight of 3500 cut. After dialysis, the sample was concentrated using a centrifugal concentrator, and gel filtration was performed using Sephadex G-50 (Fine 2.5 × 96 cm). Elution was performed using 20 mM trimethylamine-acetic acid (pH 5.0) buffer.
[0079]
The active fractions were collected, concentrated with a centrifugal concentrator, dissolved in 70 ml of 20 mM ammonium hydroxide-acetic acid (pH 8.5) buffer, and the pH was adjusted to 8.0 with 2 M of the same buffer. This sample was applied to a SuperQ Toyopearl 650S (1.9 × 7 cm) column, eluted with 20 mM ammonium hydroxide-acetic acid (pH 8.5) buffer, and the eluate was dialyzed against 10 mM trimethylamine-acetic acid (pH 3.0) buffer.
[0080]
The obtained sample was applied to SP Toyopearl 650S (1.5 × 7 cm) equilibrated with 10 mM trimethylamine-formic acid (pH 3.0) buffer and eluted with 1 M of the same buffer. The active fractions were collected, dialyzed against 10 mM trimethylamine-formic acid (pH 3.0) buffer, and then subjected to HPLC (SP-5PW (7.5 mm × 7.5 cm); Tosoh). HPLC was performed with a linear gradient of 10 mM trimethylamine-formic acid (pH 3.0) buffer and 2 M trimethylamine-formic acid (pH 3.0) buffer, and finally the mutant HM-1 was purified.
The specimen thus obtained showed a uniform band by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis containing 20% acrylamide gel.
[0081]
[Example 4] Properties of mutant HM-1 of the present invention
(1) Degradability to protease (protease resistance)
The binding between the 98th alanine and the 99th serine in the mutant HM-1 in which the 98th amino acid is mutated to alanine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and represented by SEQ ID NO: 1 Whether or not the bond between the 122nd alanine and the 123rd arginine in the mutant HM-1 in which the 122nd amino acid was mutated to alanine was cleaved by trypsin was examined.
[0082]
When trypsin was added to the purified mutant HM-1 protein and allowed to act, digestion with trypsin was not observed. Therefore, the mutant HM-1 protein showed strong trypsin resistance.
[0083]
(2) Killer activity
As a result of examining the killer activity of the purified mutant HM-1 of the present invention, a killer activity equivalent to that of HM-1 was observed.
[0084]
【The invention's effect】
According to the present invention, a mutant killer protein, a gene encoding the protein, and a transformant transformed with the gene are provided.
Since the protein of the present invention exhibits strong protease resistance and can be mass-produced, it can be used, for example, as an antibacterial agent or antibacterial soap.
[0085]
[Sequence Listing]

[0086]

[0087]

[0088]

[0089]

[0090]

[0091]

[0092]

[0093]

[0094]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph showing the test results of HM-1 sensitivity (biological morphology).
FIG. 2 is a construction diagram of an HM-1 resistance gene.
FIG. 3 is a construction diagram of the transformant of the present invention.
FIG. 4 is a photograph showing the killer activity of mutant HM-1 (form of organism).

Claims (2)

配列番号６で表されるキラータンパク質感受性遺伝子を破壊することにより得られたキラータンパク質耐性遺伝子をサッカロミセス・セレビシエに導入することにより得られたキラータンパク質耐性サッカロミセス・セレビシエ株を、
（ 1 ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち第 98 番目及び／若しくは第 122 番目のアルギニンがアラニンに変異したアミノ酸配列を実質的にコードするＤＮＡを含むキラータンパク質遺伝子を含む組み換え体 DNA 、又は（ 2 ）配列番号２若しくは３で表される塩基配列を実質的に含むキラータンパク質遺伝子を含む組み換え体 DNA で、
形質転換したサッカロミセス・セレビシエ形質転換体。A killer protein resistant Saccharomyces cerevisiae strain obtained by introducing a killer protein resistant gene obtained by disrupting the killer protein susceptibility gene represented by SEQ ID NO: 6 into Saccharomyces cerevisiae,
( 1 ) a recombinant DNA comprising a killer protein gene comprising a DNA that substantially encodes an amino acid sequence in which the 98th and / or 122th arginine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is mutated to alanine ; Or ( 2 ) a recombinant DNA containing a killer protein gene substantially comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3 ,
A transformed Saccharomyces cerevisiae transformant. 請求項１記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物からキラータンパク質を採取することを特徴とするキラータンパク質の製造方法。A method for producing a killer protein, comprising culturing the transformant according to claim 1 in a medium and collecting the killer protein from the obtained culture.

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