JPH083479B2 - マルトオリゴ糖計測用酵素電極 - Google Patents
マルトオリゴ糖計測用酵素電極Info
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- JPH083479B2 JPH083479B2 JP63061322A JP6132288A JPH083479B2 JP H083479 B2 JPH083479 B2 JP H083479B2 JP 63061322 A JP63061322 A JP 63061322A JP 6132288 A JP6132288 A JP 6132288A JP H083479 B2 JPH083479 B2 JP H083479B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は固定化酵素電極（以下酵素電極と略す）に関
し、特に重合度の異るマルトオリゴ糖について、各重合
度のマルトオリゴ糖の重量％濃度当たりの応答が等しい
マルトオリゴ糖計測用酵素電極に関するものである。
し、特に重合度の異るマルトオリゴ糖について、各重合
度のマルトオリゴ糖の重量％濃度当たりの応答が等しい
マルトオリゴ糖計測用酵素電極に関するものである。
（従来の技術） マルトオリゴ糖はデンプンの酸加水分解，酵素分解等
により製造され、その用途も甘味料，増粘剤といった食
品分野や、医薬品原料，臨床検査におけるα−アミラー
ゼ活性測定用基質等として広く利用されている。このた
め、その濃度計測法の開発は重要な課題であると言え
る。
により製造され、その用途も甘味料，増粘剤といった食
品分野や、医薬品原料，臨床検査におけるα−アミラー
ゼ活性測定用基質等として広く利用されている。このた
め、その濃度計測法の開発は重要な課題であると言え
る。
この分析法はマルトオリゴ糖が水溶性，難揮発性化合
物であるということから、従来高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC）による定量法が有力なものとされてきた。
しかし、HPLCにおいては試料の前処理が繁雑で、かつ分
析に要する時間が長いという問題点があった。そこで酵
素を利用した分析法、中でも分光光度計等の機器を必要
とせず、前処理が殆んど不要で迅速なバイオセンサーに
よる分析方法が注目されている。バイオセンサーを用い
る分析方法において現在最も良く利用されており、信頼
性が高い方法は、基質を酵素的に酸化還元し、その時の
酵素、過酸化水素等の減少もしくは生成を電流値として
とらえる酵素電極法である。
物であるということから、従来高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC）による定量法が有力なものとされてきた。
しかし、HPLCにおいては試料の前処理が繁雑で、かつ分
析に要する時間が長いという問題点があった。そこで酵
素を利用した分析法、中でも分光光度計等の機器を必要
とせず、前処理が殆んど不要で迅速なバイオセンサーに
よる分析方法が注目されている。バイオセンサーを用い
る分析方法において現在最も良く利用されており、信頼
性が高い方法は、基質を酵素的に酸化還元し、その時の
酵素、過酸化水素等の減少もしくは生成を電流値として
とらえる酵素電極法である。
ただし現状ではマルトオリゴ糖を一段階で酸化還元で
きる酵素は実用的には利用できず、主にマルトオリゴ糖
を加水分解しグルコースに導いて、生成するグルコース
をグルコースオキシダーゼにより酸化し、その反応によ
る酸素の減少、または過酸化水素の生成を電気化学的に
検知する方法がとられている。
きる酵素は実用的には利用できず、主にマルトオリゴ糖
を加水分解しグルコースに導いて、生成するグルコース
をグルコースオキシダーゼにより酸化し、その反応によ
る酸素の減少、または過酸化水素の生成を電気化学的に
検知する方法がとられている。
グルコアミラーゼとグルコースオキシダーゼを用いて
マルトースを計測する試みは比較的古くからあり、例え
ばInmanら（D.J.Inman,W.E.Hornby:Biochem.J.,137,25
−32（1974））はナイロンチューブ中にグルコアミラー
ゼとグルコースオキシダーゼを固定化し、連続したチュ
ーブ中にマルトースを含む試料を流し定量を行ってい
る。
マルトースを計測する試みは比較的古くからあり、例え
ばInmanら（D.J.Inman,W.E.Hornby:Biochem.J.,137,25
−32（1974））はナイロンチューブ中にグルコアミラー
ゼとグルコースオキシダーゼを固定化し、連続したチュ
ーブ中にマルトースを含む試料を流し定量を行ってい
る。
この酵素電極法の原理は次のようなものである。酵素
電極の酵素固定層内に試料溶液からマルトオリゴ糖の分
子が拡散して来てグルコアミラーゼにより分解されてグ
ルコースが生成され、生成されたグルコースがグルコー
スオキシダーゼにより酸化され、過酸化水素が生成せら
れる。
電極の酵素固定層内に試料溶液からマルトオリゴ糖の分
子が拡散して来てグルコアミラーゼにより分解されてグ
ルコースが生成され、生成されたグルコースがグルコー
スオキシダーゼにより酸化され、過酸化水素が生成せら
れる。
発生した過酸化水素が白金電極で電気分解され、その
ときの電気分解電流が検出信号となるのであるが、酵素
固定層内では基気質濃度に比し、酵素濃度が充分高いの
で過酸化水素の発生速度は基質であるグルコースの生成
速度によって決定されており、グルコースの生成速度は
酵素固定層におけるマルトオリゴ糖の拡散速度によって
規制され、拡散速度は試料中のマルトオリゴ糖の濃度に
より規制されているので、結局もとのマルトオリゴ糖の
濃度が電流信号に変換されて検出されることになる。
ときの電気分解電流が検出信号となるのであるが、酵素
固定層内では基気質濃度に比し、酵素濃度が充分高いの
で過酸化水素の発生速度は基質であるグルコースの生成
速度によって決定されており、グルコースの生成速度は
酵素固定層におけるマルトオリゴ糖の拡散速度によって
規制され、拡散速度は試料中のマルトオリゴ糖の濃度に
より規制されているので、結局もとのマルトオリゴ糖の
濃度が電流信号に変換されて検出されることになる。
もう少し詳細に云うと酵素電極における酵素固定層へ
の基質の拡散速度は試料溶液中の基質濃度と共に酵素固
定層内における酵素反応による基質消費速度によって左
右され、拡散速度と基質消費速度とがバランスするよう
に拡散速度が決まる。従って酵素固定層内において基質
の単位濃度に対する酵素反応速度が一定である場合には
酵素固定層内で生成される酵素反応生成物の生成速度が
試料溶液中の基質濃度に比例するのである。臨床分野に
おいて、α−アミラーゼ活性を計測する上でマルトース
センサーは種々検討を加えられている。従来、膵炎、肝
炎等の検査において、血中α−アミラーゼ活性の増大が
調べられているが、このような検査では、でんぷんをα
−アミラーゼが分解して生成するマルトオリゴ糖のおお
よその値が分れば良いのであって、重合度の異なるマル
トオリゴ糖を正確に計測する試みはなされていなかっ
た。所が実際の使用面においてはマルトオリゴ糖と呼ば
れる物質はグルコースの単一重合度の物質ではなく、マ
ルトース，マルトトリオース，マルトテトラオース等の
種々の重合度のものの混合物であり、定量ではそれらの
物質のグルコース換算濃度或は重量％濃度が知りたいの
である。所がこれら各種重合度のマルトオリゴ糖は重合
度によってグルコアミラーゼによる酵素反応速度が異っ
ており、このためマルトオリゴ糖の見かけ上のグルコー
ス換算濃度は試料における各種重合度のマルトオリゴ糖
の組成によって異ったものとなる。即ちグルコアミラー
ゼの速度論は各種アミラーゼの中でも良く研究されてい
る（中村道徳監修：アミラーゼ，学会出版センター（19
86））が、マルトオリゴ糖の鎖長が変化すると、ミハエ
リス定数，分子活性共に変化する。この理由は酵素活性
中心と基質の相互作用の観点からサブサイト理論により
説明されている。実際にグルコアミラーゼにより各鎖長
を有するマルトオリゴ糖（例えばマルトース，マルトト
リオース，マルトテトラオース）を加水分解すると各マ
ルトオリゴ糖に対する加水分解速度は各々異なる。この
ような酵素とグルコースオキシダーゼを同一固定層内に
共存せしめ、計測を行う場合、一種類の鎖長しか有さな
い単分散オリゴ糖を定量することは可能であるが、混合
物においては検量線を作成することが困難であり、従来
有効な対策は提示されていなかった。
の基質の拡散速度は試料溶液中の基質濃度と共に酵素固
定層内における酵素反応による基質消費速度によって左
右され、拡散速度と基質消費速度とがバランスするよう
に拡散速度が決まる。従って酵素固定層内において基質
の単位濃度に対する酵素反応速度が一定である場合には
酵素固定層内で生成される酵素反応生成物の生成速度が
試料溶液中の基質濃度に比例するのである。臨床分野に
おいて、α−アミラーゼ活性を計測する上でマルトース
センサーは種々検討を加えられている。従来、膵炎、肝
炎等の検査において、血中α−アミラーゼ活性の増大が
調べられているが、このような検査では、でんぷんをα
−アミラーゼが分解して生成するマルトオリゴ糖のおお
よその値が分れば良いのであって、重合度の異なるマル
トオリゴ糖を正確に計測する試みはなされていなかっ
た。所が実際の使用面においてはマルトオリゴ糖と呼ば
れる物質はグルコースの単一重合度の物質ではなく、マ
ルトース，マルトトリオース，マルトテトラオース等の
種々の重合度のものの混合物であり、定量ではそれらの
物質のグルコース換算濃度或は重量％濃度が知りたいの
である。所がこれら各種重合度のマルトオリゴ糖は重合
度によってグルコアミラーゼによる酵素反応速度が異っ
ており、このためマルトオリゴ糖の見かけ上のグルコー
ス換算濃度は試料における各種重合度のマルトオリゴ糖
の組成によって異ったものとなる。即ちグルコアミラー
ゼの速度論は各種アミラーゼの中でも良く研究されてい
る（中村道徳監修：アミラーゼ，学会出版センター（19
86））が、マルトオリゴ糖の鎖長が変化すると、ミハエ
リス定数，分子活性共に変化する。この理由は酵素活性
中心と基質の相互作用の観点からサブサイト理論により
説明されている。実際にグルコアミラーゼにより各鎖長
を有するマルトオリゴ糖（例えばマルトース，マルトト
リオース，マルトテトラオース）を加水分解すると各マ
ルトオリゴ糖に対する加水分解速度は各々異なる。この
ような酵素とグルコースオキシダーゼを同一固定層内に
共存せしめ、計測を行う場合、一種類の鎖長しか有さな
い単分散オリゴ糖を定量することは可能であるが、混合
物においては検量線を作成することが困難であり、従来
有効な対策は提示されていなかった。
（発明が解決しようとする課題） 本発明はグルコアミラーゼとグルコースオキシダーゼ
を固定化した酵素電極を用いるマルトオリゴ糖定量法に
関し、重合度の異なるマルトオリゴ糖に対して、単位モ
ル数に対する応答値を重合度に比例して増大させるか、
もしくは単位重量パーセントに対する応答値を各重合度
のマルトオリゴ糖に関して等しくなるようにしようとす
るものである。即ちマルトオリゴ糖はグルコースの重合
体であるから、重量％が同じであれば重合度の異なるマ
ルトオリゴ糖の混合物であっても、重合度の異なる分子
の組成比の如何にかゝわらず、グルコース換算濃度は同
じになる。
を固定化した酵素電極を用いるマルトオリゴ糖定量法に
関し、重合度の異なるマルトオリゴ糖に対して、単位モ
ル数に対する応答値を重合度に比例して増大させるか、
もしくは単位重量パーセントに対する応答値を各重合度
のマルトオリゴ糖に関して等しくなるようにしようとす
るものである。即ちマルトオリゴ糖はグルコースの重合
体であるから、重量％が同じであれば重合度の異なるマ
ルトオリゴ糖の混合物であっても、重合度の異なる分子
の組成比の如何にかゝわらず、グルコース換算濃度は同
じになる。
（課題を解決するための手段） 少なくともグルコアミラーゼとグルコースオキシダー
ゼを含有する酵素電極において、グルコアミラーゼのマ
ルトースに対するグルコース生成速度で表わした最大反
応速度が、グルコースオキシダーゼのグルコースに対す
る過酸化水素生成速度で表わした最大反応速度の0.4倍
以上になる酵素量比で両酵素を混合し、固定化すること
により問題を解決できる。
ゼを含有する酵素電極において、グルコアミラーゼのマ
ルトースに対するグルコース生成速度で表わした最大反
応速度が、グルコースオキシダーゼのグルコースに対す
る過酸化水素生成速度で表わした最大反応速度の0.4倍
以上になる酵素量比で両酵素を混合し、固定化すること
により問題を解決できる。
（作用） 酵素電極におけるグルコアミラーゼとグルコースオキ
シダーゼの濃度比を変えてマルトースからマルトヘプタ
オースまでの各種マルトオリゴ糖水溶液を接触させ、各
マルトオリゴ糖の濃度に対する電流値のグラフから、単
位濃度あたり（重量パーセントあたり）の電流値を求め
ると第１表のようになる。なお出力値を規格化するため
各電極のマルトースに関する値を100としてある。
シダーゼの濃度比を変えてマルトースからマルトヘプタ
オースまでの各種マルトオリゴ糖水溶液を接触させ、各
マルトオリゴ糖の濃度に対する電流値のグラフから、単
位濃度あたり（重量パーセントあたり）の電流値を求め
ると第１表のようになる。なお出力値を規格化するため
各電極のマルトースに関する値を100としてある。
第１表に示すようにグルコアミラーゼのマルトースに
対するグルコース生成の最大反応速度がグルコースオキ
シダーゼのグルコースに対する過酸化水素生成の最大反
応速度の0.4倍未満では、単位重量パーセント当たりの
出力値が各マルトオリゴ糖について最大２倍程度異な
り、単独のマルトオリゴ糖を計測する場合でも各々検量
線を作成しなければいけない。ところが0.4倍以上にな
るとマルトースを基準にして、各マルトオリゴ糖に対す
る応答が非常に近くなる。特に1.0倍以上の比率では応
答はほぼ完全に等しくなり、マルトースで電極を較正す
れば、他のマルトオリゴ糖も重量パーセント濃度を容易
に算出することがきる。また混合物であってもその重量
パーセントを算出できる。なお12倍を越える比率とした
場合、グルコースオキシダーゼの絶対量が減少しすぎ
て、著しく感度が低下するため実際上用いられる２種の
酵素の最大反応速度比は0.4倍から12倍の範囲、より好
ましくは１倍から10倍の範囲である。
対するグルコース生成の最大反応速度がグルコースオキ
シダーゼのグルコースに対する過酸化水素生成の最大反
応速度の0.4倍未満では、単位重量パーセント当たりの
出力値が各マルトオリゴ糖について最大２倍程度異な
り、単独のマルトオリゴ糖を計測する場合でも各々検量
線を作成しなければいけない。ところが0.4倍以上にな
るとマルトースを基準にして、各マルトオリゴ糖に対す
る応答が非常に近くなる。特に1.0倍以上の比率では応
答はほぼ完全に等しくなり、マルトースで電極を較正す
れば、他のマルトオリゴ糖も重量パーセント濃度を容易
に算出することがきる。また混合物であってもその重量
パーセントを算出できる。なお12倍を越える比率とした
場合、グルコースオキシダーゼの絶対量が減少しすぎ
て、著しく感度が低下するため実際上用いられる２種の
酵素の最大反応速度比は0.4倍から12倍の範囲、より好
ましくは１倍から10倍の範囲である。
このような特性が得られる理由は明瞭ではないが、次
のように推定できる。一般にミハエリス−メンテン型の
反応速度曲線に従う酵素を固定した酵素電極では、ミハ
エリス定数（Km）に比べて膜内基質濃度が充分に低い場
合に基質濃度と速度が直線関係を示す。つまり基質濃度
と出力値が正確に比例する。同じくマルトオリゴ糖を固
定化されたグルコアミラーゼで加水分解する場合にも基
質濃度が充分Kmより低い場合にグルコースの生成速度は
膜内マルトオリゴ糖濃度に比例する。ただしグルコアミ
ラーゼは、マルトオリゴ糖の重合に応じてKmと分子活性
（kc）が変化する（中村道徳監修：アミラーゼ．学会出
版センター（1986））。この値を用いて溶液中において
酵素濃度が低い場合の各マルトオリゴ糖のモル濃度に対
する加水分解速度（グルコースの生成速度）を計算する
と基質濃度が比較的高い場合にはマルトースからマルト
ペンタオースまで速度が７倍程度上昇し、マルトヘキサ
オースで一度減少し、マルトヘプタオースで再度上昇す
るという不規則な変化を示す。ところが固定化酵素膜内
においては相対的な酵素量はきわめて高く、一方基質は
拡散がおさられているために相対的に基質量は低くなる
ので、基質はきわめて高速で最初の分解を受け、グルコ
ースと鎖長が一つ短いマルトオリゴ糖になる。この条件
下で前記と同様な計算を行うとマルトースからマルトヘ
プタオースまでやや湾曲傾向はあってもグルコース生成
の速度は鎖長にほぼ比例して上昇する。固定化酵素膜内
では生成したグルコースは速やかにグルコースオキシダ
ーゼにより酸化を受け過酸化水素となって検知される。
もしグルコアミラーゼの反応速度がグルコースオキシダ
ーゼに比べて充分速ければ全体の系の律速段階はグルコ
ースオキシダーゼによる反応段階となりさらにグルコー
スオキシダーゼのKmはグルコアミラーゼのKmに対して一
般に10倍程度となるため、マルトオリゴ糖の鎖長に比例
してグルコースが生成されれば、グルコースオキシダー
ゼにより、グルコース量に比例した過酸化水素が生成さ
れる。逆にグルコースオキシダーゼの活性が非常に高い
場合、律速段階はグルコアミラーゼ反応となり、全体の
電極出力値はグルコアミラーゼ固有の鎖長に対して複雑
な挙動を示すと考えられる。
のように推定できる。一般にミハエリス−メンテン型の
反応速度曲線に従う酵素を固定した酵素電極では、ミハ
エリス定数（Km）に比べて膜内基質濃度が充分に低い場
合に基質濃度と速度が直線関係を示す。つまり基質濃度
と出力値が正確に比例する。同じくマルトオリゴ糖を固
定化されたグルコアミラーゼで加水分解する場合にも基
質濃度が充分Kmより低い場合にグルコースの生成速度は
膜内マルトオリゴ糖濃度に比例する。ただしグルコアミ
ラーゼは、マルトオリゴ糖の重合に応じてKmと分子活性
（kc）が変化する（中村道徳監修：アミラーゼ．学会出
版センター（1986））。この値を用いて溶液中において
酵素濃度が低い場合の各マルトオリゴ糖のモル濃度に対
する加水分解速度（グルコースの生成速度）を計算する
と基質濃度が比較的高い場合にはマルトースからマルト
ペンタオースまで速度が７倍程度上昇し、マルトヘキサ
オースで一度減少し、マルトヘプタオースで再度上昇す
るという不規則な変化を示す。ところが固定化酵素膜内
においては相対的な酵素量はきわめて高く、一方基質は
拡散がおさられているために相対的に基質量は低くなる
ので、基質はきわめて高速で最初の分解を受け、グルコ
ースと鎖長が一つ短いマルトオリゴ糖になる。この条件
下で前記と同様な計算を行うとマルトースからマルトヘ
プタオースまでやや湾曲傾向はあってもグルコース生成
の速度は鎖長にほぼ比例して上昇する。固定化酵素膜内
では生成したグルコースは速やかにグルコースオキシダ
ーゼにより酸化を受け過酸化水素となって検知される。
もしグルコアミラーゼの反応速度がグルコースオキシダ
ーゼに比べて充分速ければ全体の系の律速段階はグルコ
ースオキシダーゼによる反応段階となりさらにグルコー
スオキシダーゼのKmはグルコアミラーゼのKmに対して一
般に10倍程度となるため、マルトオリゴ糖の鎖長に比例
してグルコースが生成されれば、グルコースオキシダー
ゼにより、グルコース量に比例した過酸化水素が生成さ
れる。逆にグルコースオキシダーゼの活性が非常に高い
場合、律速段階はグルコアミラーゼ反応となり、全体の
電極出力値はグルコアミラーゼ固有の鎖長に対して複雑
な挙動を示すと考えられる。
ところでグルコースは溶液中では約60％のβアノマー
と約40％のαアノマーの混合物として存在している。グ
ルコースオキシダーゼはこの中でβアノマーのみを酸化
する。一方グルコアミラーゼはマルトオリゴ糖からβア
ノマーの形でグルコースを遊離する。固定化酵素膜内で
は遊離されたβアノマーは変旋光現象によってα，β混
合物になるよりも早く酸化されてしまう。グルコアミラ
ーゼの活性をマルトースを基準にして溶液系で測定する
と、充分変旋光が進行しているためα，βアノマーの混
合したグルコースの生成速度が得られる。従ってグルコ
アミラーゼとグルコースオキシダーゼの溶液中における
最大反応速度の比を0.4として固定化すると固定化酵素
電極においてマルトースが加水分解された場合、グルコ
ースオキシダーゼの基質は0.4×２の速度で生成される
のでではなく、マルトースの還元末端の60％がβアノマ
ーであるため、0.4＋（0.4/0.6）の速度、つまりグルコ
ースオキシダーゼのグルコース消費速度の約1.1倍のβ
−グルコース生成速度が得られグルコースオキシダーゼ
による反応が全体の律速段階になると考えられる。
と約40％のαアノマーの混合物として存在している。グ
ルコースオキシダーゼはこの中でβアノマーのみを酸化
する。一方グルコアミラーゼはマルトオリゴ糖からβア
ノマーの形でグルコースを遊離する。固定化酵素膜内で
は遊離されたβアノマーは変旋光現象によってα，β混
合物になるよりも早く酸化されてしまう。グルコアミラ
ーゼの活性をマルトースを基準にして溶液系で測定する
と、充分変旋光が進行しているためα，βアノマーの混
合したグルコースの生成速度が得られる。従ってグルコ
アミラーゼとグルコースオキシダーゼの溶液中における
最大反応速度の比を0.4として固定化すると固定化酵素
電極においてマルトースが加水分解された場合、グルコ
ースオキシダーゼの基質は0.4×２の速度で生成される
のでではなく、マルトースの還元末端の60％がβアノマ
ーであるため、0.4＋（0.4/0.6）の速度、つまりグルコ
ースオキシダーゼのグルコース消費速度の約1.1倍のβ
−グルコース生成速度が得られグルコースオキシダーゼ
による反応が全体の律速段階になると考えられる。
より鎖長の長いマルトオリゴ糖でもグルコースオキシ
ダーゼによる反応が律速段階となり見かけ上マルトオリ
ゴ糖に対する単位モル数当たりの出力値は鎖長に比例
し、換算すると単位重量％濃度あたりの出力値が等しく
なるものと考えられる。そしてグルコースオキシダーゼ
による反応を律速段階反応とするためには上述したよう
に、グルコアミラーゼによる反応速度をグルコースオキ
シダーゼによる反応速度の0.4倍以上とすればよいので
ある。
ダーゼによる反応が律速段階となり見かけ上マルトオリ
ゴ糖に対する単位モル数当たりの出力値は鎖長に比例
し、換算すると単位重量％濃度あたりの出力値が等しく
なるものと考えられる。そしてグルコースオキシダーゼ
による反応を律速段階反応とするためには上述したよう
に、グルコアミラーゼによる反応速度をグルコースオキ
シダーゼによる反応速度の0.4倍以上とすればよいので
ある。
尚グルコアミラーゼの活性がグルコースオキシダーゼ
の活性に比べて極端に大きい場合は、グルコアミラーゼ
蛋白量が一定のときはグルコースオキシダーゼ量が減る
ことによって出力値が減少すること、またグルコースオ
キシダーゼ量を一定にするとグルコアミラーゼの蛋白量
がふえて膜が厚くなり応答速度が遅くなるという欠点が
生じる。よって、最大反応速度比が極端に大きくなるの
も好ましくない。
の活性に比べて極端に大きい場合は、グルコアミラーゼ
蛋白量が一定のときはグルコースオキシダーゼ量が減る
ことによって出力値が減少すること、またグルコースオ
キシダーゼ量を一定にするとグルコアミラーゼの蛋白量
がふえて膜が厚くなり応答速度が遅くなるという欠点が
生じる。よって、最大反応速度比が極端に大きくなるの
も好ましくない。
実施例 （実施例１） グルコースオキシダーゼ（Sigma社製,Type II Lot.75
−9595）1mg,グルコアミラーゼ（Sigma社製,Lot.46F−0
5572）を16.7μ，ウシ血清アルブミン（Sigma社製,Fr
action V,Lot.45F−0064）5mgを0.2重量％グルタルアル
デヒドを含むpH6.0の100mMリン酸緩衝液に溶解させ全量
を1000μとした。この混合酵素溶液は、グルコースオ
キシダーゼを過酸化水素生成速度で表わした最大反応速
度で、16μmol/minの最大反応速度を示す酵素量を含ん
でいる。またグルコアミラーゼをマルトースに対するグ
ルコース生成速度で表わした最大反応速度で、10μmol/
minの最大反応速度を示す酵素量を含んでいるので、グ
ルコアミラーゼのグルコースオキシダーゼに対する最大
反応速度比は0.62となる。
−9595）1mg,グルコアミラーゼ（Sigma社製,Lot.46F−0
5572）を16.7μ，ウシ血清アルブミン（Sigma社製,Fr
action V,Lot.45F−0064）5mgを0.2重量％グルタルアル
デヒドを含むpH6.0の100mMリン酸緩衝液に溶解させ全量
を1000μとした。この混合酵素溶液は、グルコースオ
キシダーゼを過酸化水素生成速度で表わした最大反応速
度で、16μmol/minの最大反応速度を示す酵素量を含ん
でいる。またグルコアミラーゼをマルトースに対するグ
ルコース生成速度で表わした最大反応速度で、10μmol/
minの最大反応速度を示す酵素量を含んでいるので、グ
ルコアミラーゼのグルコースオキシダーゼに対する最大
反応速度比は0.62となる。
この混合酵素溶液を、直径2mmの白金電極表面に５μ
滴下展開させ40℃で30分間処理して固定化を行い酵素
電極とした。測定装置（第１図）はμオーダーの試料
注入が可能な高速液クロ用インジェクター１と、酵素電
極を取り付けた測定セル２を内径0.5mmのテフロン管で
結合した装置を用いた。
滴下展開させ40℃で30分間処理して固定化を行い酵素
電極とした。測定装置（第１図）はμオーダーの試料
注入が可能な高速液クロ用インジェクター１と、酵素電
極を取り付けた測定セル２を内径0.5mmのテフロン管で
結合した装置を用いた。
測定セル２の内容積は40μで酵素電極に対向してAg
/AgCl参照電極を配置し、対Ag/AgCl参照電極＋0.45Vの
電圧を酵素電極に印加し、その電流値を測定した。送液
は高速液クロ用ポンプ３を用い、pH6.0の100mMリン酸緩
衝液を1.0ml/minの流速で送液した。
/AgCl参照電極を配置し、対Ag/AgCl参照電極＋0.45Vの
電圧を酵素電極に印加し、その電流値を測定した。送液
は高速液クロ用ポンプ３を用い、pH6.0の100mMリン酸緩
衝液を1.0ml/minの流速で送液した。
マルトース，マルトトリオース，マルトテトラオー
ス，マルトペンタオース，マルトヘキサオース，マルト
ヘプタオースの各水溶液で濃度系列を作り各物質につい
ての検量線を作成した。その検量線の傾きすなわち各物
質についての単位モル濃度あたりの出力値とマルトオリ
ゴ糖の糖鎖の鎖長数（重合度）との関係を図示すると第
２図の様に糖鎖の鎖長数と比例関係があった。また各物
質についての単位重量％濃度あたりの出力値とマルトオ
リゴ糖の糖鎖の鎖長数との関係を図示すると第３図のよ
うにマルトオリゴ糖の糖鎖の鎖長数によらず一定であっ
た。
ス，マルトペンタオース，マルトヘキサオース，マルト
ヘプタオースの各水溶液で濃度系列を作り各物質につい
ての検量線を作成した。その検量線の傾きすなわち各物
質についての単位モル濃度あたりの出力値とマルトオリ
ゴ糖の糖鎖の鎖長数（重合度）との関係を図示すると第
２図の様に糖鎖の鎖長数と比例関係があった。また各物
質についての単位重量％濃度あたりの出力値とマルトオ
リゴ糖の糖鎖の鎖長数との関係を図示すると第３図のよ
うにマルトオリゴ糖の糖鎖の鎖長数によらず一定であっ
た。
（実施例２） グルコースオキシダーゼ1mg,グルコアミラーゼ83.4μ
，ウシ血清アルブミン5mgを0.2重量％グルタルアルデ
ヒドを含むpH6.0の100mMリン酸緩衝液に溶解させ全量を
1000μとした。この混合酵素溶液は、グルコースオキ
シダーゼを過酸化水素生成速度で表わした最大反応速度
で、16μmol/minの最大反応速度を示す酵素量を含んで
いる。またグルコアミラーゼをマルトースに対するグル
コース生成速度で表わした最大反応速度で50μmol/min
の最大反応速度を示す酵素量を含んでいるので、グルコ
アミラーゼのグルコースオキシダーゼに対する最大反応
速度比は3.1となる。この混合酵素溶液を用い、実施例
１と同様の方法で酵素電極とした。実施例１と同様の装
置を用いてマルトース，マルトトリオース，マルトテト
ラオース，マルトペンタオース，マルトヘキサオース，
マルトヘプタオースの各水溶液で濃度系列を作り各物質
についての検量線を作成した。その検量線の傾きすなわ
ち各物質についての単位モル濃度あたりの出力値とマル
トオリゴ糖の糖鎖の鎖長数との関係を図示すると第４図
の様に糖鎖の鎖長数と比例関係があった。また各物質に
ついての単位重量％濃度あたりの出力値とマルトオリゴ
糖の糖鎖の鎖長数との関係を図示すると第５図の様にマ
ルトオリゴ糖の糖鎖の鎖長数によらず完全に一定であっ
た。
，ウシ血清アルブミン5mgを0.2重量％グルタルアルデ
ヒドを含むpH6.0の100mMリン酸緩衝液に溶解させ全量を
1000μとした。この混合酵素溶液は、グルコースオキ
シダーゼを過酸化水素生成速度で表わした最大反応速度
で、16μmol/minの最大反応速度を示す酵素量を含んで
いる。またグルコアミラーゼをマルトースに対するグル
コース生成速度で表わした最大反応速度で50μmol/min
の最大反応速度を示す酵素量を含んでいるので、グルコ
アミラーゼのグルコースオキシダーゼに対する最大反応
速度比は3.1となる。この混合酵素溶液を用い、実施例
１と同様の方法で酵素電極とした。実施例１と同様の装
置を用いてマルトース，マルトトリオース，マルトテト
ラオース，マルトペンタオース，マルトヘキサオース，
マルトヘプタオースの各水溶液で濃度系列を作り各物質
についての検量線を作成した。その検量線の傾きすなわ
ち各物質についての単位モル濃度あたりの出力値とマル
トオリゴ糖の糖鎖の鎖長数との関係を図示すると第４図
の様に糖鎖の鎖長数と比例関係があった。また各物質に
ついての単位重量％濃度あたりの出力値とマルトオリゴ
糖の糖鎖の鎖長数との関係を図示すると第５図の様にマ
ルトオリゴ糖の糖鎖の鎖長数によらず完全に一定であっ
た。
（比較例） グルコースオキシダーゼ1mg,グルコアミラーゼ4.0μ
，ウシ血清アルブミン5mgを0.2重量％グルタルアルデ
ヒドを含むpH6.0の100mMリン酸緩衝液に溶解させ全量を
1000μとした。この混合酵素溶液は、グルコースオキ
シダーゼを過酸化水素生成速度で表わした最大反応速度
で、16μmol/minの最大反応速度を示す酵素量を含んで
いる。またグルコアミラーゼをマルトースに対するグル
コース生成速度で表わした最大反応速度で2.4μmol/min
の最大反応速度を示す酵素量を含んでいるので、グルコ
アミラーゼのグルコースオキシダーゼに対する最大反応
速度比は0.15となる。この混合酵素溶液を用い、実施例
１と同様の方法で酵素電極とした。実施例１と同様の装
置を用いて、マルトース，マルトトリオース，マルトテ
トラオース，マルトペンタオース，マルトヘキサオー
ス，マルトヘプタオースの各水溶液で濃度系列を作り各
物質についての検量線を作成した。その検量線の傾きす
なわち各物質についての単位モル濃度あたりの出力値と
マルトオリゴ糖の糖鎖の鎖長数との関係を図示すると第
６図の様に鎖長数に比例した関係は見られなかった。ま
た各物質についての単位重量％濃度あたりの出力値は第
７図の様に各々の鎖長のマルトオリゴ糖について各々異
なる出力値を示した。
，ウシ血清アルブミン5mgを0.2重量％グルタルアルデ
ヒドを含むpH6.0の100mMリン酸緩衝液に溶解させ全量を
1000μとした。この混合酵素溶液は、グルコースオキ
シダーゼを過酸化水素生成速度で表わした最大反応速度
で、16μmol/minの最大反応速度を示す酵素量を含んで
いる。またグルコアミラーゼをマルトースに対するグル
コース生成速度で表わした最大反応速度で2.4μmol/min
の最大反応速度を示す酵素量を含んでいるので、グルコ
アミラーゼのグルコースオキシダーゼに対する最大反応
速度比は0.15となる。この混合酵素溶液を用い、実施例
１と同様の方法で酵素電極とした。実施例１と同様の装
置を用いて、マルトース，マルトトリオース，マルトテ
トラオース，マルトペンタオース，マルトヘキサオー
ス，マルトヘプタオースの各水溶液で濃度系列を作り各
物質についての検量線を作成した。その検量線の傾きす
なわち各物質についての単位モル濃度あたりの出力値と
マルトオリゴ糖の糖鎖の鎖長数との関係を図示すると第
６図の様に鎖長数に比例した関係は見られなかった。ま
た各物質についての単位重量％濃度あたりの出力値は第
７図の様に各々の鎖長のマルトオリゴ糖について各々異
なる出力値を示した。
以上の実施例ではウシ血清アルブミンとグルタルアル
デヒドを用いる例を示したが、これ以外の公知の固定化
法、例えば包括法・イオン交換体結合法、他の共有結合
法等を用いることも可能である。また実試料を分析する
際に問題となる電気化学的妨害物、例えば過酸化水素を
検出する場合のアスコルビン酸、尿酸、還元型グルタチ
オンを除去するために、固定化酵素層と電極の間に各種
選択透過膜を設けることが可能である。
デヒドを用いる例を示したが、これ以外の公知の固定化
法、例えば包括法・イオン交換体結合法、他の共有結合
法等を用いることも可能である。また実試料を分析する
際に問題となる電気化学的妨害物、例えば過酸化水素を
検出する場合のアスコルビン酸、尿酸、還元型グルタチ
オンを除去するために、固定化酵素層と電極の間に各種
選択透過膜を設けることが可能である。
（発明の効果） マルトオリゴ糖はグルコースの種々な重合度の多糖類
の混合物として供給されており、これに対して実用上要
求される濃度表示はグルコース換算濃度或は重量％であ
るが、従来の酵素電極法では各種マルトオリゴ糖の組成
比によって出力が異なるため、組成比が異なる毎に一々
検量線を作り直さなければならず、大へん面倒であった
が、本発明によれば例えばマルトースについて検量線を
作っておけば、後はどのような組成比のマルトオリゴ糖
でも測定でき、測定能率を著しく向上させることができ
る。
の混合物として供給されており、これに対して実用上要
求される濃度表示はグルコース換算濃度或は重量％であ
るが、従来の酵素電極法では各種マルトオリゴ糖の組成
比によって出力が異なるため、組成比が異なる毎に一々
検量線を作り直さなければならず、大へん面倒であった
が、本発明によれば例えばマルトースについて検量線を
作っておけば、後はどのような組成比のマルトオリゴ糖
でも測定でき、測定能率を著しく向上させることができ
る。
第１図は本発明酵素電極を用いた測定装置の側面図、第
２図は本発明の第１実施例電極による測定結果のグラ
フ、第３図は上記結果の鎖長数と相対出力値との関係グ
ラフ、第４図は本発明の第２実施例電極による測定結果
のグラフ、第５図は上記結果の鎖長数と相対出力との関
係グラフ、第６図は比較例による測定結果のグラフ、第
７図は上記結果の鎖長数と相対出力との関係グラフであ
る。 １……インジェクター、２……測定セル、３……ポン
プ、４……緩衝液槽、５……排液槽。
２図は本発明の第１実施例電極による測定結果のグラ
フ、第３図は上記結果の鎖長数と相対出力値との関係グ
ラフ、第４図は本発明の第２実施例電極による測定結果
のグラフ、第５図は上記結果の鎖長数と相対出力との関
係グラフ、第６図は比較例による測定結果のグラフ、第
７図は上記結果の鎖長数と相対出力との関係グラフであ
る。 １……インジェクター、２……測定セル、３……ポン
プ、４……緩衝液槽、５……排液槽。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−31954（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−114760（ＪＰ，Ａ) 片岡照栄外編「センサハンドブック」培 風館（昭和61年５月30日発行）、第575〜 576頁
Claims (1)
- 【請求項１】少なくともグルコアミラーゼとグルコース
オキシダーゼを含有する酵素電極において、グルコアミ
ラーゼのマルトースに対するグルコース生成速度で表わ
した最大反応速度が、グルコースオキシダーゼのグルコ
ースに対する過酸化水素生成速度で表わした最大反応速
度の0.4倍以上になる酵素量比で両酵素を混合し、固定
することを特徴とするマルトオリゴ糖計測用酵素電極。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63061322A JPH083479B2 (ja) | 1988-03-15 | 1988-03-15 | マルトオリゴ糖計測用酵素電極 |
| US07/321,165 US5081037A (en) | 1988-03-15 | 1989-03-09 | Enzyme electrode for measuring malto-oligosaccharide |
| EP89104556A EP0335167B1 (en) | 1988-03-15 | 1989-03-15 | Enzyme electrode for measuring malto-oligosaccharide and measuring apparatus using the same |
| DE68919426T DE68919426T2 (de) | 1988-03-15 | 1989-03-15 | Enzymelektrode zur Messung von Malto-Oligosacchariden und Messapparat dafür. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63061322A JPH083479B2 (ja) | 1988-03-15 | 1988-03-15 | マルトオリゴ糖計測用酵素電極 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01233362A JPH01233362A (ja) | 1989-09-19 |
| JPH083479B2 true JPH083479B2 (ja) | 1996-01-17 |
Family
ID=13167786
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63061322A Expired - Fee Related JPH083479B2 (ja) | 1988-03-15 | 1988-03-15 | マルトオリゴ糖計測用酵素電極 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5081037A (ja) |
| EP (1) | EP0335167B1 (ja) |
| JP (1) | JPH083479B2 (ja) |
| DE (1) | DE68919426T2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5200051A (en) * | 1988-11-14 | 1993-04-06 | I-Stat Corporation | Wholly microfabricated biosensors and process for the manufacture and use thereof |
| JPH04218394A (ja) * | 1990-04-10 | 1992-08-07 | Kanzaki Paper Mfg Co Ltd | デンプンまたはその関連糖質分析方法及び分析装置 |
| WO1992015706A1 (en) * | 1991-03-09 | 1992-09-17 | Fisons Plc | Analytical methods and devices |
| US5651869A (en) * | 1995-02-28 | 1997-07-29 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Biosensor |
| US8945943B2 (en) | 2010-05-26 | 2015-02-03 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Personal glucose meters for detection and quantification of a broad range of analytes |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4172765A (en) * | 1977-09-14 | 1979-10-30 | Technicon Instruments Corporation | Method for the quantitative determination of alpha-amylase |
| US4340448A (en) * | 1978-08-28 | 1982-07-20 | University Of Pittsburgh | Potentiometric detection of hydrogen peroxide and apparatus therefor |
| JPS60114760A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-21 | Hitachi Ltd | マルト−スセンサ |
| JPS62296A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-01-06 | Kyowa Medetsukusu Kk | 過酸化水素の定量方法 |
-
1988
- 1988-03-15 JP JP63061322A patent/JPH083479B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-03-09 US US07/321,165 patent/US5081037A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-15 DE DE68919426T patent/DE68919426T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-15 EP EP89104556A patent/EP0335167B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 片岡照栄外編「センサハンドブック」培風館（昭和６１年５月３０日発行）、第５７５〜５７６頁 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0335167B1 (en) | 1994-11-23 |
| DE68919426T2 (de) | 1995-06-29 |
| US5081037A (en) | 1992-01-14 |
| DE68919426D1 (de) | 1995-01-05 |
| JPH01233362A (ja) | 1989-09-19 |
| EP0335167A1 (en) | 1989-10-04 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |