JPH0833492A - Production of l-aspartic acid - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To produce L-aspartic acid on an industrial scale in high yield at a low cost without discharging a waste liquid containing a large amount of ammonium salt by a process capable of continuing the reaction over a long period without cooling the reactor. CONSTITUTION:This process for the production of L-aspartic acid comprises the production of L-aspartic acid from fumaric acid and ammonia or ammonium fumarate and the collection of the produced L-aspartic acid. The fumaric acid concentration is maintained to <=13wt.% before reaction, the reaction product is incorporated with 0.85-1.2 times mol (based on the produced L-aspartic acid) of fumaric acid after the reaction to effect the crystallization of L-aspartic acid and the mother liquor is reused after recovering the L-aspartic acid.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、フマル酸とアンモニア
又はフマル酸アンモニウムからＬ−アスパラギン酸を生
産する際に、反応済媒体からの母液をリサイクル使用す
ることによって、大量の硫酸アンモニウム塩など鉱酸の
アンモニウム塩を含んだ廃水が排出されないように改良
された方法及びフマル酸及び／またはその塩を随伴して
いる結晶Ｌ−アスパラギン酸製品に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to the production of L-aspartic acid from fumaric acid and ammonia or ammonium fumarate by recycling the mother liquor from the reacted medium to produce a large amount of mineral acid such as ammonium sulfate. And a crystalline L-aspartic acid product associated with fumaric acid and / or its salts so as not to discharge wastewater containing ammonium salts thereof.

【０００２】[0002]

【従来の技術】Ｌ−アスパラギン酸はフマル酸とアンモ
ニア又はフマル酸アンモニウムを含有する基質媒体にア
スパルターゼ活性を有する酵素含有物を接触させること
によって生産されている。通常この反応の際の基質の濃
度は１７．４〜２０重量％で行われており、高濃度であ
るため生産性がよいとされている。しかしながら、フマ
ル酸とアンモニアの反応は１０Kcal／mol もの発熱を伴
う反応であるため、高濃度で反応を行う場合にはアスパ
ルターゼの失活を防ぐために冷却が必要となっている。L-Aspartic acid is produced by contacting a substrate medium containing fumaric acid and ammonia or ammonium fumarate with an enzyme-containing substance having aspartase activity. Usually, the concentration of the substrate in this reaction is 17.4 to 20% by weight, and it is said that the productivity is good because of the high concentration. However, the reaction between fumaric acid and ammonia is exothermic as much as 10 Kcal / mol, and therefore cooling is necessary to prevent inactivation of aspartase when the reaction is carried out at a high concentration.

【０００３】実際に工業的に用いられている例を文献か
らあげると、アスパルターゼを固定化して反応器に充填
し、連続的にフマル酸アンモニウム溶液を流通させて、
この反応を行っている例では、フマル酸濃度が高いため
に発熱が大きく、アスパルターゼの失活を防ぐために、
熱交換器を装着したカラム型の反応器が用いられている
（Applied Biochemistry and Biotechnology vol13,231
(1986)）。また菌体を限外濾過膜などを用いて反応器内
に閉じ込めることによってアスパルターゼを固定化した
例では、反応器は熱交換器を装備しても比較的簡易な構
造であるが、菌体を分離するのに特殊な膜を必要とする
ことなど、工程上の問題点を有している。[0003] As an example from the literature which is actually used industrially, aspartase is immobilized and charged into a reactor, and ammonium fumarate solution is continuously circulated,
In the example where this reaction is carried out, the fumarate concentration is high, so that the fever is large, and in order to prevent the deactivation of aspartase,
A column-type reactor equipped with a heat exchanger is used (Applied Biochemistry and Biotechnology vol13,231
(1986)). Also, in the example in which the aspartase was immobilized by confining the bacterial cells in the reactor using an ultrafiltration membrane, the reactor has a relatively simple structure even if it is equipped with a heat exchanger. There is a problem in the process such that a special film is required to separate the two.

【０００４】また生成物であるＬ−アスパラギン酸の分
離に関して、通常は、反応済み媒体からＬ−アスパラギ
ン酸を回収するためには、硫酸などの鉱酸を用いて、反
応済み媒体のpHをＬ−アスパラギン酸の等電点であるpH
２．７程度に調節後、冷却することによってＬ−アスパ
ラギン酸の結晶を析出させ、これを濾別する方法がとら
れている。Regarding the separation of the product L-aspartic acid, usually, in order to recover L-aspartic acid from the reacted medium, the pH of the reacted medium is adjusted to L by using a mineral acid such as sulfuric acid. -PH, the isoelectric point of aspartic acid
After adjusting to about 2.7, a method of precipitating L-aspartic acid crystals by cooling and filtering the crystals is used.

【０００５】この方法は安価な鉱酸を用いること、生産
物であるＬ−アスパラギン酸の結晶としての回収率が高
いこと、得られるＬ−アスパラギン酸の純度が高いこと
から工業的に用いられている。しかしながら、原料とし
てのアンモニアのロスが大きく、さらに高濃度の硫酸ア
ンモニウムなどの鉱酸のアンモニウム塩を含有した廃水
が大量に排出されるという問題点を有している。水溶液
中のアンモニウムイオンの除去は廃水処理の面でも非常
に困難であり、湖沼や瀬戸内海などの内湾ではアンモニ
ウムイオンを含む窒素濃度が上昇することによる水質汚
染など問題が生じてきている。This method is industrially used because an inexpensive mineral acid is used, the recovery rate of the product L-aspartic acid as crystals is high, and the purity of the obtained L-aspartic acid is high. There is. However, there is a problem that the loss of ammonia as a raw material is large and a large amount of waste water containing a high concentration ammonium salt of a mineral acid such as ammonium sulfate is discharged. The removal of ammonium ions from the aqueous solution is also very difficult in terms of wastewater treatment, and problems such as water pollution due to an increase in the concentration of nitrogen containing ammonium ions have arisen in inland bays such as lakes and the Seto Inland Sea.

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】本発明では、前記のよ
うな複雑な反応器、特殊な膜を必要としない簡単な工程
によって、且つ多量のアンモニウム塩を排出しない、Ｌ
−アスパラギン酸の製造方法を提供しようとするもので
ある。SUMMARY OF THE INVENTION In the present invention, L is a simple process that does not require the complicated reactor and special membrane as described above, and does not discharge a large amount of ammonium salt.
-To provide a method for producing aspartic acid.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明者らは反応に伴う
発熱の問題、高濃度のアンモニウム塩を含有した廃水が
大量に排出されない、簡易なＬ−アスパラギン酸の製造
方法について鋭意検討を行った結果、基質であるフマル
酸の濃度を１３重量％以下に低くすること、得られたＬ
−アスパラギン酸アンモニウム含有反応済み媒体中に、
硫酸などの鉱酸のかわりにＬ−アスパラギン酸の原料で
あるフマル酸を添加すると、Ｌ−アスパラギン酸アンモ
ニウム塩とフマル酸との間で塩の交換が起こり、Ｌ−ア
スパラギン酸とフマル酸モノアンモニウム塩となり、溶
解度の低いＬ−アスパラギン酸が結晶として分離できる
こと、また添加するフマル酸量はＬ−アスパラギン酸と
大体当量用いるとＬ−アスパラギン酸の結晶としての回
収率が高くなることの発見し、本発明を完成させるに至
った。[Means for Solving the Problems] The inventors of the present invention have made earnest studies on a simple method for producing L-aspartic acid, which does not generate a large amount of wastewater containing a high concentration of ammonium salt, which is a problem of heat generation accompanying the reaction. As a result, the concentration of fumaric acid as a substrate was reduced to 13% by weight or less, and the obtained L
-In the reacted medium containing ammonium aspartate,
When fumaric acid, which is a raw material of L-aspartic acid, is added in place of a mineral acid such as sulfuric acid, salt exchange occurs between the L-aspartic acid ammonium salt and fumaric acid, resulting in L-aspartic acid and monoammonium fumarate. It was discovered that L-aspartic acid, which becomes a salt and has low solubility, can be separated as crystals, and that the amount of fumaric acid added is approximately equivalent to L-aspartic acid and the recovery rate of L-aspartic acid as crystals increases. The present invention has been completed.

【０００８】基質であるフマル酸の濃度を低くすると、
発熱を少なくすることができるため、アスパルターゼの
反応熱による失活を防ぐことができる。また、鉱酸のか
わりにフマル酸を用いて生成物であるＬ−アスパラギン
酸の晶析を行う場合も、１３重量％以下の低濃度の場合
には単に生成したＬ−アスパラギン酸とほぼ当量のフマ
ル酸を添加して攪拌し、濾過、水洗浄するだけで、特に
加熱、冷却の操作を要せずにＬ−アスパラギン酸を晶析
分離することができる。When the concentration of the substrate fumaric acid is lowered,
Since it is possible to reduce heat generation, it is possible to prevent deactivation due to the reaction heat of aspartase. Also, when the product L-aspartic acid is crystallized using fumaric acid instead of the mineral acid, in the case of a low concentration of 13% by weight or less, an amount equivalent to that of L-aspartic acid produced is almost the same. L-Aspartic acid can be crystallized and separated by adding fumaric acid, stirring, filtering and washing with water, without particularly requiring heating and cooling operations.

【０００９】固定化酵素触媒を用いる反応では、高濃度
のフマル酸を基質として反応を行うと反応熱が大きく、
温度上昇も大きいので、固定化酵素の活性が高ければ高
いほど、酵素の熱失活を防ぐための冷却が必要になり、
反応器の構造が複雑になったり、反応率の管理が複雑に
なったりする。In the reaction using the immobilized enzyme catalyst, the reaction heat is large when the reaction is carried out using a high concentration of fumaric acid as a substrate,
Since the temperature rise is also large, the higher the activity of the immobilized enzyme, the more cooling is required to prevent heat inactivation of the enzyme,
The structure of the reactor becomes complicated and the control of the reaction rate becomes complicated.

【００１０】しかし、基質であるフマル酸濃度１３重量
％以下、特に１モル／Ｌ以下の濃度での反応では、例え
ば２５℃程度のフマル酸溶液を固定化酵素を充填した反
応器に導入した場合、全く冷却を行わなくても反応器中
で完全に平衡まで反応が進行したとしても、温度上昇は
１０℃程度にすぎず、最高温度は３５℃程度である。こ
のような温度範囲では酵素の熱失活の問題がないので、
固定化酵素の活性を最大限利用できるようになり、高流
速、高転換率での反応を長期間、安定に行うことができ
るようになる。However, in the reaction at a concentration of fumaric acid as a substrate of 13% by weight or less, particularly 1 mol / L or less, for example, when a fumaric acid solution at about 25 ° C. is introduced into a reactor filled with immobilized enzyme. Even if the reaction proceeds completely to equilibrium in the reactor without any cooling, the temperature rise is only about 10 ° C and the maximum temperature is about 35 ° C. Since there is no problem of heat inactivation of the enzyme in such a temperature range,
The activity of the immobilized enzyme can be utilized to the maximum, and the reaction at a high flow rate and a high conversion rate can be stably performed for a long period of time.

【００１１】また、このような濃度範囲では、生成した
Ｌ−アスパラギン酸を晶析させるのに、生成したＬ−ア
スパラギン酸に対して、だいたい当量のフマル酸を添加
して攪拌、濾過するだけで、何等加熱、冷却などの操作
を要せずにＬ−アスパラギン酸を高回収率で分離するこ
とができる。Further, in such a concentration range, in order to crystallize the produced L-aspartic acid, approximately equivalent amount of fumaric acid is added to the produced L-aspartic acid, and the mixture is stirred and filtered. It is possible to separate L-aspartic acid at a high recovery rate without requiring any operation such as heating or cooling.

【００１２】従って本発明はフマル酸とアンモニア及び
／またはフマル酸アンモニウムを含有する基質媒体にア
スパルターゼ活性を有する酵素含有物を作用せしめるこ
とによりＬ−アスパラギン酸を生成せしめる反応をフマ
ル酸濃度１３重量％以下で行い、次に反応済み媒体中に
存在するＬ−アスパラギン酸に対して０．８５〜１．２
倍モルのフマル酸を添加することによりＬ−アスパラギ
ン酸を析出せしめ、折出したアスパラギン酸の結晶を濾
過水洗浄することによってＬ−アスパラギン酸を採取
し、次いで母液と洗液にアンモニアを添加して基質媒体
として再使用することを特徴とするＬ−アスパラギン酸
の製造方法を提供する。本発明はまた、上記の方法によ
り製造された、フマル酸を含有する工業用結晶Ｌ−アス
パラギン酸製品を提供する。Accordingly, the present invention is a reaction for producing L-aspartic acid by causing an enzyme-containing substance having an aspartase activity to act on a substrate medium containing fumaric acid and ammonia and / or ammonium fumarate to give a fumaric acid concentration of 13% by weight. % And then 0.85-1.2 relative to L-aspartic acid present in the reacted medium.
L-Aspartic acid was precipitated by adding twice the molar amount of fumaric acid, and L-aspartic acid was collected by filtering and washing the precipitated aspartic acid crystals with water, and then ammonia was added to the mother liquor and the washing liquid. The present invention provides a method for producing L-aspartic acid, which is characterized in that it is reused as a substrate medium. The present invention also provides an industrial crystalline L-aspartic acid product containing fumaric acid produced by the above method.

【００１３】[0013]

【発明の効果】本発明によれば、Ｌ−アスパラギン酸を
製造するに要する設備を簡易な構造にできるため、設備
のコストを削減することができる。またＬ−アスパラギ
ン酸の製造に際して、アンモニウム塩を含有する大量の
廃水を排出しない。さらには反応済み媒体からの母液を
リサイクルするため、結晶を分離した濾液中に溶解して
いるＬ−アスパラギン酸も次のサイクルで回収されるの
で、原料基質の有効利用が図られ、環境面でも経済面で
も従来法より有利なＬ−アスパラギン酸の製造方法を提
供することができる。According to the present invention, the equipment required for producing L-aspartic acid can have a simple structure, so that the equipment cost can be reduced. Also, when producing L-aspartic acid, a large amount of wastewater containing ammonium salt is not discharged. Furthermore, since the mother liquor from the reaction-completed medium is recycled, L-aspartic acid dissolved in the filtrate from which the crystals have been separated is also recovered in the next cycle, so that the raw material substrate can be effectively used and environmentally friendly. It is possible to provide a method for producing L-aspartic acid which is more economical than the conventional method.

【００１４】[0014]

【具体的な説明】以下本発明の方法について実施態様を
説明するが、本発明はかかる実施態様のみに限定される
ものではない。本発明に用いるアスパルターゼ活性を有
する酵素含有物は、例えば、高アスパルターゼ活性を有
することが知られている大腸菌やＢｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ属の微生物などの菌体、あるいは超音波、摩
砕、凍結融解、酵素処理、界面活性剤処理などを施して
破砕した菌体破砕物、さらに硫酸アンモニウム塩析、ア
セトン沈澱等常法により得られる部分精製したもの、あ
るいはクロマトカラム等常法で得られる精製したものな
どであり、そのいずれでも反応に使用できる。DETAILED DESCRIPTION Embodiments of the method of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to such embodiments. The enzyme-containing product having aspartase activity used in the present invention is, for example, Escherichia coli or Brevibacte known to have high aspartase activity.
Obtained by conventional methods such as microbial cells of genus Rium, or crushed cells subjected to ultrasonication, grinding, freeze-thawing, enzyme treatment, surfactant treatment, etc., and further ammonium sulfate salting-out, acetone precipitation A partially purified product, a purified product obtained by a conventional method such as a chromatography column, and the like can be used in the reaction.

【００１５】これらのアスパルターゼ活性含有微生物菌
体、あるいはその処理物または酵素を担体に固定化して
用いることもできる。固定化の担体としては、セルロー
ス、アルギン酸、カラギーナン、マンナンゲルなどの天
然系高分子、あるいはイオン交換樹脂やポリビニルアル
コール、ポリアクリルアミドなどの適当な合成系高分子
を常法により用いることができる。固定化することによ
り、アスパルターゼまたはアスパルターゼ含有物と生産
物との分離が容易になり、反応済み媒体からの母液の循
環使用の操作をより容易に行うことが可能である。These aspartase activity-containing microbial cells, or their treated products or enzymes may be immobilized on a carrier before use. As a carrier for immobilization, a natural polymer such as cellulose, alginic acid, carrageenan, mannan gel, or an appropriate synthetic polymer such as an ion exchange resin, polyvinyl alcohol, or polyacrylamide can be used by a conventional method. The immobilization facilitates the separation of the aspartase or the aspartase-containing product from the product, and makes it possible to more easily carry out the operation of recycling the mother liquor from the reacted medium.

【００１６】また、反応に用いるアスパルターゼ活性を
有する酵素含有物中に含まれるフマラーゼ活性など該反
応の妨げになりうるアスパルターゼ活性以外の酵素活性
を予め失活させた後に反応に用いることも可能である。
例えば、酵素含有物を、予め、Ｌ−アスパラギン酸およ
びアンモニウムイオン存在下、アルカリ域で４０〜６０
℃に加熱処理を行うことでフマラーゼ活性を予め失活さ
せておくこともできる。It is also possible to use in the reaction after previously deactivating an enzyme activity other than the aspartase activity that may interfere with the reaction, such as fumarase activity contained in the enzyme-containing material having aspartase activity used in the reaction. Is.
For example, the enzyme-containing material is preliminarily added in the presence of L-aspartic acid and ammonium ions in an alkaline range of 40 to 60.
It is also possible to deactivate the fumarase activity in advance by performing heat treatment at ℃.

【００１７】本発明に用いられる基質はフマル酸あるい
はフマル酸塩から選ばれるものであって、これらの混合
物でもよい。また本発明に用いられるアンモニアはガス
状アンモニア、アンモニア水溶液等が使用可能である
が、取扱上アンモニア水溶液が有利である。アンモニア
水の濃度としては特に限定されるものではないが、工業
的には１０〜３５重量％が利用するのに好ましい。The substrate used in the present invention is selected from fumaric acid or fumarate, and a mixture thereof may be used. As the ammonia used in the present invention, gaseous ammonia, aqueous ammonia solution, etc. can be used, but aqueous ammonia solution is advantageous in handling. Although the concentration of the ammonia water is not particularly limited, it is industrially preferably 10 to 35% by weight.

【００１８】使用されるアンモニアの量は反応に供され
るフマル酸に対して１．０倍モル以上３倍モル以下が好
ましい。アンモニアの量が１倍モル未満ではＬ−アスパ
ラギン酸の回収率が低下する結果を招いてしまい好まし
くない。またアンモニア量が３倍モル以上では反応に関
与する酵素又は酵素含有物の安定性が悪くなる可能性が
高く好ましくない。また必要に応じて上記のアンモニア
量の範囲で水酸化ナトリウムあるいは水酸化カリウムな
どのアルカリ金属水酸化物を併用することもできる。な
お、反応液のpHは５〜１０の範囲、好ましくは７．０〜
９．０の範囲、さらに好ましくはアスパルターゼの至適
pHである８．０〜９．０にするのが好ましい。The amount of ammonia used is preferably 1.0 times or more and 3 times or less the mol of fumaric acid used in the reaction. If the amount of ammonia is less than 1 time mol, the recovery rate of L-aspartic acid is lowered, which is not preferable. Further, when the amount of ammonia is 3 times or more mols, the stability of the enzyme or the enzyme-containing product involved in the reaction may be deteriorated, which is not preferable. If necessary, an alkali metal hydroxide such as sodium hydroxide or potassium hydroxide may be used in combination within the above-mentioned ammonia amount range. The pH of the reaction solution is in the range of 5 to 10, preferably 7.0.
The range of 9.0, more preferably the optimum aspartase
It is preferable to adjust the pH to 8.0 to 9.0.

【００１９】フマル酸とアンモニアを混合する場合、混
合はどのように行ってもよいが、両者の全量を一度に混
合するのではなく、一方の全量に対して他方を徐々に添
加するのが好ましく、特にフマル酸の懸濁液に対してア
ンモニアまたはアンモニア水を徐々に添加するのが好ま
しい。本発明の方法において基質媒体の調製に用いる反
応媒体は、水性のものであれば特に限定されず、最も典
型的なものは水である。さらに緩衝液、例えばリン酸緩
衝液等の常用の緩衝液を用いることもできる。反応の際
のフマル酸濃度は通常５〜１３重量％が好ましいが、生
産性を考慮すると特に１０〜１３重量％の範囲の水溶液
で反応させるのが効果的である。When fumaric acid and ammonia are mixed, the mixing may be carried out in any manner, but it is preferable to gradually add one to the whole instead of mixing all of the both at once. In particular, it is preferable to gradually add ammonia or aqueous ammonia to the fumaric acid suspension. The reaction medium used for preparing the substrate medium in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is aqueous, and the most typical one is water. Further, a buffer solution, for example, a commonly used buffer solution such as a phosphate buffer solution may be used. The fumaric acid concentration during the reaction is usually preferably 5 to 13% by weight, but in view of productivity, it is particularly effective to react with an aqueous solution in the range of 10 to 13% by weight.

【００２０】また基質媒体にはさらに塩化マンガン、硫
酸マンガンなどのマンガン塩、または塩化マグネシウ
ム、硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩、または亜
鉛塩、カルシウム塩、ニッケル塩、コバルト塩、鉄塩な
どの２価金属塩を０．１〜５０mM、好ましくは１〜１０
mMの濃度で添加することが望ましい。本発明における反
応槽の態様は特に限定されないが、例えばバッチ型反応
装置、カラム型反応装置など従来から知られている反応
槽で反応を行うことができる。反応槽は１つであっても
複数であっても差し支えない。反応の際の温度は低温で
は反応速度が低下するため通常２０℃程度を下限とし、
高温下ではアスパルターゼの失活を招くため５０℃程度
を上限とするのが好ましく、より好ましくは２５〜４０
℃の範囲で行うのがよい。The substrate medium further includes manganese salts such as manganese chloride and manganese sulfate, magnesium salts such as magnesium chloride and magnesium sulfate, and divalent metals such as zinc salts, calcium salts, nickel salts, cobalt salts and iron salts. 0.1 to 50 mM salt, preferably 1 to 10
It is desirable to add it at a concentration of mM. The mode of the reaction vessel in the present invention is not particularly limited, but the reaction can be carried out in a conventionally known reaction vessel such as a batch type reaction apparatus or a column type reaction apparatus. The number of reaction tanks may be one or plural. Since the reaction rate decreases at low temperature during the reaction, the lower limit is usually about 20 ° C.,
Since it causes inactivation of aspartase at high temperature, the upper limit is preferably about 50 ° C, more preferably 25 to 40.
It is better to carry out in the range of ° C.

【００２１】上記のような条件でフマル酸とアンモニア
を反応させた後、得られた反応済み媒体中にフマル酸を
添加することにより、Ｌ−アスパラギン酸を析出させ
る。また、母液の循環使用の妨げにならない範囲でフマ
ル酸塩の添加も可能である。フマル酸塩としては、フマ
ル酸アンモニウム、フマル酸ナトリウム、フマル酸カリ
ウムなどが使用される。After the fumaric acid is reacted with ammonia under the conditions as described above, L-aspartic acid is precipitated by adding fumaric acid to the obtained reaction-completed medium. Further, it is possible to add the fumarate within a range that does not hinder the circulation and use of the mother liquor. As the fumarate, ammonium fumarate, sodium fumarate, potassium fumarate and the like are used.

【００２２】前記したフマル酸などを用いてＬ−アスパ
ラギン酸の析出を行うことにより母液の循環使用が可能
になる。析出に鉱酸を用いると鉱酸のアンモニウム塩が
蓄積し、母液を循環使用するためには脱塩工程が必要に
なり好ましくない。ここでＬ−アスパラギン酸の析出の
ために添加されるフマル酸は固体でもよく、またフマル
酸を水に懸濁させたスラリーとして添加することも可能
である。いずれにせよ無機塩が生成しないため晶析物や
母液からの無機塩の除去操作を不要にすることが可能で
ある。Precipitation of L-aspartic acid using the above-mentioned fumaric acid or the like makes it possible to reuse the mother liquor. If a mineral acid is used for precipitation, an ammonium salt of the mineral acid accumulates, and a desalting step is required to reuse the mother liquor, which is not preferable. The fumaric acid added here for the precipitation of L-aspartic acid may be a solid, or may be added as a slurry in which the fumaric acid is suspended in water. In any case, since the inorganic salt is not produced, it is possible to eliminate the operation of removing the inorganic salt from the crystallization product or the mother liquor.

【００２３】Ｌ−アスパラギン酸の析出のために反応済
み媒体に添加されるフマル酸の量は、生成したＬ−アス
パラギン酸に対してほぼ当量用いればよく、好ましくは
反応済み媒体中に生成しているＬ−アスパラギン酸に対
して０．８５〜１．２倍モル、好ましくは０．８５〜
１．１倍モル添加してＬ−アスパラギン酸を析出させる
ことができる。The amount of fumaric acid added to the reacted medium for the precipitation of L-aspartic acid may be approximately equivalent to the amount of L-aspartic acid formed, and preferably, it is formed in the reacted medium. The amount of L-aspartic acid is 0.85 to 1.2 times mol, preferably 0.85 to
L-aspartic acid can be precipitated by adding 1.1 times mol.

【００２４】この範囲より少ないと結晶として分離でき
るＬ−アスパラギン酸の量が少なくなり、回収率が低く
なり好ましくない。またこの範囲より多いとＬ−アスパ
ラギン酸の結晶にフマル酸塩が大量に混入してくるため
好ましくない。Ｌ−アスパラギン酸を析出せしめる際に
は反応済み媒体にフマル酸を徐々に添加していくほうが
好ましい。この方法であれば、析出したＬ−アスパラギ
ン酸の結晶は大きく、遠心濾過などによる母液からの分
離が容易になり、また結晶の取り扱いも容易になる。If the amount is less than this range, the amount of L-aspartic acid that can be separated as crystals becomes small and the recovery rate becomes low, which is not preferable. On the other hand, if the amount is more than this range, a large amount of fumarate is mixed in the crystals of L-aspartic acid, which is not preferable. When precipitating L-aspartic acid, it is preferable to gradually add fumaric acid to the reacted medium. According to this method, the precipitated L-aspartic acid crystals are large, and the crystals can be easily separated from the mother liquor by centrifugal filtration and the crystals can be easily handled.

【００２５】フマル酸を添加した反応済み媒体は０〜１
００℃で、１０分間〜４時間、好ましくは、２０〜８０
℃で３０〜１２０分間攪はんして塩の交換、晶析を完了
させる。析出したＬ−アスパラギン酸の分離方法につい
ては、吸引濾過や遠心濾過など通常の方法で行うことが
できるが、含液率を低くすることができる遠心濾過など
の方法がより好ましい。The reacted medium containing fumaric acid is 0 to 1
10 minutes to 4 hours at 00 ° C, preferably 20 to 80
Stir at 30 ° C. for 30 to 120 minutes to complete salt exchange and crystallization. The precipitated L-aspartic acid can be separated by a usual method such as suction filtration or centrifugal filtration, but a method such as centrifugal filtration that can reduce the liquid content is more preferable.

【００２６】分離されたＬ−アスパラギン酸の結晶は必
要に応じて水を用いて洗浄される。洗浄を行うことによ
り、Ｌ−アスパラギン酸の結晶に少量混入してくるフマ
ル酸塩の量を少なくすることができ、得られるＬ−アス
パラギン酸の結晶の純度を高くすることができるので好
ましいが、母液の再利用を考えた場合、あまり大量の水
で洗浄することは好ましいことではない。使用する洗浄
水の量は、Ｌ−アスパラギン酸結晶の量に対して５〜５
００重量％、好ましくは１０〜２００重量％の範囲で用
いるのがよい。The separated L-aspartic acid crystals are washed with water as needed. By washing, it is possible to reduce the amount of the fumarate salt mixed in the L-aspartic acid crystals in a small amount, and to increase the purity of the obtained L-aspartic acid crystals, which is preferable. When considering the reuse of the mother liquor, it is not preferable to wash it with a large amount of water. The amount of washing water used is 5 to 5 with respect to the amount of L-aspartic acid crystals.
It is preferable to use it in an amount of 00% by weight, preferably 10 to 200% by weight.

【００２７】このようにして極めて簡単な方法で少量
の、例えば０．１〜３重量％、好ましくは０．１〜１重
量％のフマル酸及び／またはフマル酸塩を含有するＬ−
アスパラギン酸の結晶を得ることができる。こうして得
られるＬ−アスパラギン酸の結晶のサイズは晶析の方法
を変えることにより所望の平均サイズにすることができ
るが、特に取扱やすい結晶の平均サイズとして５０〜５
００μｍの範囲の結晶を得ることも可能である。このＬ
−アスパラギン酸は工業用アスパラギン酸として極めて
有用である。また、このＬ−アスパラギン酸はさらに精
製を繰り返すことによって、食品添加物、医薬品用など
に用いることも可能である。L-containing a small amount of fumaric acid and / or fumarate, for example 0.1 to 3% by weight, preferably 0.1 to 1% by weight, in a very simple manner.
Crystals of aspartic acid can be obtained. The crystal size of the L-aspartic acid thus obtained can be set to a desired average size by changing the crystallization method, but the average crystal size of 50 to 5 is particularly easy to handle.
It is also possible to obtain crystals in the range of 00 μm. This L
-Aspartic acid is extremely useful as industrial aspartic acid. Further, this L-aspartic acid can be used for food additives, pharmaceuticals, etc. by repeating purification.

【００２８】Ｌ−アスパラギン酸の結晶を分離した母液
は、前記洗液と混合し、アンモニアを添加してＬ−アス
パラギン酸の製造用の基質媒体として再使用する。必要
に応じてフマル酸を添加したり、母液あるいは洗液を濃
縮したりして適宜調整を行う。例えば、Ｌ−アスパラギ
ン酸を析出させるために加えたフマル酸のモル数に対し
て、結晶として分離されたＬ−アスパラギン酸のモル数
が多いと、その後のフマル酸とアンモニアの反応で得ら
れるＬ−アスパラギン酸の量が少なくなっていくため、
必要に応じてフマル酸を追加することによって、Ｌ−ア
スパラギン酸を析出せしめる前の反応済み媒体中に含ま
れていたＬ−アスパラギン酸に対して、それを析出せし
める際に添加したフマル酸と追加するフマル酸の合計の
量が０．８５倍モルから１．２倍モルになるように調整
する。The mother liquor from which L-aspartic acid crystals have been separated is mixed with the above washing solution, ammonia is added, and the mixture is reused as a substrate medium for the production of L-aspartic acid. If necessary, fumaric acid is added, or the mother liquor or washing liquid is concentrated to make appropriate adjustments. For example, when the number of moles of L-aspartic acid separated as crystals is large relative to the number of moles of fumaric acid added to precipitate L-aspartic acid, L obtained by the subsequent reaction of fumaric acid and ammonia. -Because the amount of aspartic acid decreases,
By adding fumaric acid as necessary, the fumaric acid added when precipitating L-aspartic acid was added to the L-aspartic acid contained in the reaction-completed medium before the precipitation of L-aspartic acid. The total amount of fumaric acid to be used is adjusted to 0.85 times to 1.2 times the molar amount.

【００２９】また必要に応じて母液を濃縮することによ
って容量を初期基質媒体と同じ容積とするなど調整し、
フマル酸に対するアンモニアの比が１〜３倍モルになる
ように調節したのち、フマル酸とアンモニアのアスパル
ターゼ活性を有する酵素含有物による反応、フマル酸の
添加によるＬ−アスパラギン酸の析出、Ｌ−アスパラギ
ン酸の結晶の分離、母液の調整を繰り返すことにより、
母液が基質媒体として循環使用される。本発明によれ
ば、母液の循環は１０回以上可能である。If necessary, the mother liquor is concentrated to adjust the volume to the same volume as the initial substrate medium,
After adjusting the ratio of ammonia to fumaric acid to 1 to 3 moles, the reaction of fumaric acid and ammonia with an enzyme having an aspartase activity, the addition of fumaric acid to precipitate L-aspartic acid, L- By repeating the separation of aspartic acid crystals and the adjustment of the mother liquor,
The mother liquor is recycled as the substrate medium. According to the invention, the circulation of the mother liquor is possible 10 times or more.

【００３０】母液へのアンモニアの添加は、例えば、次
の点を考慮して行うのが、母液の循環使用を繰り返すた
めに、また微生物菌体あるいはその破砕物のアスパルタ
ーゼ活性を長く保つためには好ましい。すなわち、循環
使用される母液中に含まれるアンモニア量が該母液に含
まれるフマル酸に対して１〜３倍モル、好ましくは１．
５〜２．５倍モルになるように、アンモニアを添加す
る。The addition of ammonia to the mother liquor should be carried out, for example, in consideration of the following points, in order to keep the mother liquor recycled and to keep the aspartase activity of the microbial cells or its crushed product for a long time. Is preferred. That is, the amount of ammonia contained in the mother liquor circulated and used is 1 to 3 times mol of the fumaric acid contained in the mother liquor, preferably 1.
Ammonia is added so that the molar ratio becomes 5-2.5 times.

【００３１】本発明では、フマル酸とアンモニアあるい
はフマル酸アンモニウム塩を、フマル酸に対してアンモ
ニアの量が１〜３倍モルとなる量で用い、アスパルター
ゼ活性を有する酵素含有物と２０〜５０℃で反応させ
る。この反応によりＬ−アスパラギン酸アンモニウムが
生成するが、得られた反応済み媒体に、フマル酸を添加
してＬ−アスパラギン酸を析出させる。In the present invention, fumaric acid and ammonia or fumaric acid ammonium salt are used in an amount such that the amount of ammonia is 1 to 3 times the molar amount of fumaric acid, and an enzyme-containing substance having aspartase activity and 20 to 50 mol are used. React at ℃. Although L-aspartic acid ammonium is produced by this reaction, fumaric acid is added to the obtained reacted medium to precipitate L-aspartic acid.

【００３２】析出したＬ−アスパラギン酸を母液から分
離してＬ−アスパラギン酸が得られる。採取したＬ−ア
スパラギン酸はフマル酸及び／またはその塩を随伴して
いるが、水洗を行うことによりその量を減少させること
ができる。析出物を分離した母液はＬ−アスパラギン酸
結晶を洗浄した液とともに、Ｌ−アスパラギン酸の製造
用基質媒体として循環使用を繰り返すことができる。こ
れにより、原料の効率的利用、及び、廃棄物の減少が図
られる。The precipitated L-aspartic acid is separated from the mother liquor to obtain L-aspartic acid. The collected L-aspartic acid is accompanied by fumaric acid and / or its salt, but the amount thereof can be reduced by washing with water. The mother liquor from which the precipitate has been separated can be repeatedly circulated as a substrate medium for producing L-aspartic acid together with the liquid from which L-aspartic acid crystals have been washed. As a result, efficient use of raw materials and reduction of waste can be achieved.

【００３３】[0033]

【実施例】次に実施例をあげて説明するが、本発明はか
かる実施例のみに限定されるものではない。実施例１． ５Ｌジャーファーメンターに１Ｌ当りフマル
酸２０ｇ、リン酸１カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７
水塩０．５ｇ、酵母エキス２０ｇ及びコーンスティープ
リカー２０ｇを水に溶解し、pHをアンモニアで６．８に
調節した培地３Ｌを仕込み滅菌したのち、別に５００ml
振とうフラスコに同上の培地５０mlを入れて培養してお
いたエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)(ATCC 11
303)を接種し、３７℃で通気攪拌培養した。培地中のフ
マル酸が消失した時点で、菌体培養液に酢酸を加え、pH
を約５にして４５℃、１時間放置後、培養液を遠心分離
にかけ、菌体を分離した。この菌体を、−８０℃で凍結
して冷蔵した。EXAMPLES Examples will be described below, but the present invention is not limited to these examples. Example 1. 20 g of fumaric acid, 1 g of potassium phosphate 1 g, and magnesium sulfate 7 per 1 L in a 5 L jar fermenter
Dissolve 0.5 g of water salt, 20 g of yeast extract and 20 g of corn steep liquor in water, sterilize by charging 3 L of medium whose pH is adjusted to 6.8 with ammonia, and then separate 500 ml.
Escherichia coli (ATCC 11
303) and inoculated with aeration and agitation at 37 ° C. When fumaric acid in the medium disappeared, acetic acid was added to the cell culture medium to adjust the pH.
To about 5 and left at 45 ° C. for 1 hour, and then the culture solution was centrifuged to separate the bacterial cells. The cells were frozen at -80 ° C and refrigerated.

【００３４】凍結菌体を融解させ５０mMのリン酸緩衝液
５Ｌに懸濁した中に、イオン交換樹脂デュオライトＡ−
７（米国ダイヤモンドシャムロックケミカル）１．５Ｌ
を添加し、４℃で２４時間、攪拌を行い、イオン交換樹
脂に菌体中の酵素を吸着させた。イオン交換樹脂１Ｌあ
たり１４．５ｇのアスパルターゼを含む酵素タンパクが
吸着された。この酵素を吸着させたイオン交換樹脂１．
５Ｌを全容２Ｌの円筒型カラムに充填し、カラム全体を
発泡ポリスチレンの保温材で覆って保温した。Frozen cells were thawed and suspended in 5 L of 50 mM phosphate buffer, and the ion exchange resin Duolite A-
7 (US Diamond Shamrock Chemical) 1.5L
Was added, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 24 hours to adsorb the enzyme in the bacterial cells to the ion exchange resin. An enzyme protein containing 14.5 g of aspartase was adsorbed per 1 L of the ion exchange resin. Ion exchange resin with this enzyme adsorbed 1.
5 L was filled in a cylindrical column having a total volume of 2 L, and the whole column was covered with a heat insulating material of expanded polystyrene to keep it warm.

【００３５】このカラムに、１Ｌ中にフマル酸１１６ｇ
と硫酸マグネシウム７水塩０．２ｇを含有するフマル酸
アンモニウム水溶液（pH８．３）を基質媒体として１．
５Ｌ／hrの速度で流通させた。反応温度はカラムの直前
に３０℃の恒温槽を設置して、カラムに流入する基質媒
体の温度が３０℃になるようにし、カラム自体は保温す
るだけにした。この条件で連続反応を行ったところ、３
０日以上、９８モル％以上の転化率で安定に運転するこ
とができた。In this column, 116 g of fumaric acid per liter
And an ammonium fumarate aqueous solution (pH 8.3) containing 0.2 g of magnesium sulfate heptahydrate as a substrate medium.
It was circulated at a speed of 5 L / hr. Regarding the reaction temperature, a thermostat of 30 ° C. was installed immediately before the column so that the temperature of the substrate medium flowing into the column was 30 ° C., and the column itself was kept warm. When a continuous reaction was performed under these conditions, 3
It was possible to operate stably for 0 days or more at a conversion rate of 98 mol% or more.

【００３６】比較例１．１Ｌ中にフマル酸２００ｇと硫
酸マグネシウム０．２ｇを含有するフマル酸アンモニウ
ム水溶液を基質媒体として用いた以外は実施例１と同様
にして連続反応を行った。反応初期の転化率は９９．２
モル％であった。１４日後、カラムから流出する反応済
み媒体を分析したところ転化率８５モル％であった。ま
た３０日目後の転化率は７５モル％であり、高い転化率
を維持することはできなかった。 Comparative Example 1. A continuous reaction was carried out in the same manner as in Example 1 except that an aqueous solution of ammonium fumarate containing 200 g of fumaric acid and 0.2 g of magnesium sulfate in 1 L was used as a substrate medium. The conversion in the initial stage of the reaction is 99.2.
It was mol%. After 14 days, the reaction medium flowing out of the column was analyzed and found to have a conversion of 85 mol%. Moreover, the conversion rate after 30 days was 75 mol%, and it was not possible to maintain a high conversion rate.

【００３７】実施例２．５Ｌジャーファーメンターに１
Ｌ当りフマル酸２０ｇ、リン酸１カリウム１ｇ、硫酸マ
グネシウム７水塩０．５ｇ、酵母エキス２０ｇ及びコー
ンスティープリカー２０ｇを水に溶解し、pHをアンモニ
アで６．８に調節した培地３Ｌを仕込み滅菌したのち、
別に５００ml振とうフラスコに同上の培地５０mlを入れ
て培養しておいたエッシェリヒア・コリ(Escherichia c
oli)(ATCC 11303)を接種し、３７℃で通気攪拌培養し
た。培地中のフマル酸が消失した時点で、菌体培養液に
酢酸を加え、pHを約５にして４５℃、１時間放置後、培
養液を遠心分離にかけ、菌体を分離した。この菌体を３
０等分し、−８０℃で凍結して冷蔵した。 Example 2. 1 to 5L jar fermenter
20 g of fumaric acid, 1 g of potassium phosphate, 0.5 g of magnesium sulfate heptahydrate, 20 g of yeast extract and 20 g of corn steep liquor were dissolved in water and sterilized with 3 L of a medium whose pH was adjusted to 6.8 with ammonia. After that,
Separately, 50 ml of the above medium was placed in a 500 ml shake flask and cultured, and Escherichia c
oli) (ATCC 11303) was inoculated and cultured at 37 ° C. with aeration and stirring. When the fumaric acid in the medium disappeared, acetic acid was added to the cell culture solution to adjust the pH to about 5 and left at 45 ° C. for 1 hour, and then the culture solution was centrifuged to separate the cells. This fungus body 3
It was divided into 0 equal parts, frozen at −80 ° C. and refrigerated.

【００３８】フマル酸１００ｇ、硫酸マグネシウム７水
塩０．２５ｇを水約６００mlに加えた後、２５％アンモ
ニア水で中和してpHを８．３に調節後、水を追加して１
Ｌの基質媒体とした。この基質媒体に先に３０等分した
凍結菌体の一つをいれ、３７℃で穏やかに振とうしなが
ら５時間反応させた。反応済み媒体の分析の結果、初期
仕込みフマル酸に対して９９．０モル％のＬ−アスパラ
ギン酸アンモニウムが生成していた。100 g of fumaric acid and 0.25 g of magnesium sulfate heptahydrate were added to about 600 ml of water, neutralized with 25% ammonia water to adjust the pH to 8.3, and water was added to add 1
L was used as the substrate medium. One of the frozen bacterial cells previously divided into 30 equal parts was put into this substrate medium, and the reaction was carried out at 37 ° C. for 5 hours while gently shaking. As a result of analysis of the reacted medium, 99.0 mol% of ammonium L-aspartate was produced based on the initially charged fumaric acid.

【００３９】この反応済み媒体を遠心分離して菌体を除
いた後、フマル酸１００ｇを添加し、３０分間攪拌して
Ｌ−アスパラギン酸を晶析させた。晶析後、吸引濾過器
で濾過して母液からＬ−アスパラギン酸の結晶を分離
し、この結晶を水５０mlで洗浄し、充分に水分をきった
後、乾燥させた。得られたＬ−アスパラギン酸結晶は１
１１．８ｇ、純度９６．５重量％（水分除く）（フマル
酸３．１重量％）（平均サイズ１００μｍ）であった。After the reaction-completed medium was centrifuged to remove the cells, 100 g of fumaric acid was added and stirred for 30 minutes to crystallize L-aspartic acid. After crystallization, the crystals of L-aspartic acid were separated from the mother liquor by filtration with a suction filter, and the crystals were washed with 50 ml of water, drained sufficiently, and dried. The obtained L-aspartic acid crystal was 1
The content was 11.8 g and the purity was 96.5% by weight (excluding water) (fumaric acid 3.1% by weight) (average size 100 μm).

【００４０】ついで、先の母液と洗液をあわせて、減圧
下で濃縮した後、２５％アンモニアを加えてpHを８．３
に調節し、水を加えて１Ｌの基質媒体とした。この基質
媒体に先と同様に凍結菌体の一つをいれ３７℃で５時間
反応させた。先と同様に遠心分離して菌体を除いた後、
反応済み媒体にフマル酸１００ｇを添加して攪拌晶析を
行った。析出したＬ−アスパラギン酸を吸引濾過して母
液からＬ−アスパラギン酸の結晶を分離し、この結晶を
約５０mlの水で２回結晶を洗浄し、充分に水をきった
後、乾燥した。得られた結晶の重量は１１４．２ｇ、純
度は９９．０重量％（水分除く）（フマル酸０．７０重
量％）（結晶平均サイズ８０μｍ）であった。Then, the mother liquor and the washing liquid were combined, concentrated under reduced pressure, and 25% ammonia was added to adjust the pH to 8.3.
And added water to make 1 L of substrate medium. One of the frozen cells was added to this substrate medium in the same manner as above, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 5 hours. After removing the cells by centrifugation as in the previous step,
100 g of fumaric acid was added to the reaction-completed medium to carry out stirring crystallization. The precipitated L-aspartic acid was suction filtered to separate L-aspartic acid crystals from the mother liquor, and the crystals were washed twice with about 50 ml of water, drained sufficiently and then dried. The weight of the obtained crystals was 114.2 g, and the purity was 99.0% by weight (excluding water) (fumaric acid 0.70% by weight) (average crystal size 80 μm).

【００４１】同様に母液と洗液をあわせて減圧濃縮した
後、２５％アンモニアでpHを８．３に調節し、水を加え
て１Ｌの基質媒体とした。以下、２回目の操作を繰り返
し、フマル酸とアンモニアの反応を合計１０回行った
（母液の循環使用回数は９回）。１０回の操作により、
得られたＬ−アスパラギン酸は、９回目の操作において
晶析のために添加されたフマル酸に対して収率９８．０
モル％、純度９９．０重量％（水分除く）（フマル酸
０．６１重量％）（結晶平均サイズ１００μｍ）であっ
た。Similarly, the mother liquor and the washing liquid were combined and concentrated under reduced pressure, the pH was adjusted to 8.3 with 25% ammonia, and water was added to make 1 L of the substrate medium. Thereafter, the second operation was repeated, and the reaction between fumaric acid and ammonia was carried out 10 times in total (the mother liquor was circulated and used 9 times). With 10 operations,
The obtained L-aspartic acid had a yield of 98.0 with respect to fumaric acid added for crystallization in the ninth operation.
The content was mol% and the purity was 99.0% by weight (excluding water) (fumaric acid 0.61% by weight) (crystal average size 100 μm).

【００４２】１０回目の繰り返し操作により得られた結
晶に水１００mlを加えてよく混合した後、再度吸引濾過
し、充分に水分をきり、乾燥する操作を繰り返し３回行
ったところ、結晶の純度は９９．６重量％（水分除く）
（フマル酸０．１３重量％）（結晶平均サイズ６０μ
ｍ）になった。100 ml of water was added to the crystals obtained by the 10th repeated operation and mixed well, then suction filtration was performed again, the water was sufficiently drained off, and the drying operation was repeated 3 times. 99.6% by weight (excluding water)
(Fumaric acid 0.13% by weight) (Crystal average size 60μ
m).

【００４３】実施例３．実施例２と同様にして１Ｌの基
質媒体に凍結菌体の一つをいれ反応を行った。反応済み
媒体を分析したところ、仕込フマル酸に対して９９．２
モル％のＬ−アスパラギン酸が生成していた。この反応
済み媒体を遠心分離して菌体を除いた後、フマル酸９０
ｇを添加し３０分間攪拌し、Ｌ−アスパラギン酸を晶析
させた。晶析後、吸引濾過器で吸引濾過し、母液約９０
０mlを得た。濾別したＬ−アスパラギン酸を水５０mlで
洗浄し、充分に水分をきって乾燥した。得られた結晶の
純度を調べたところ、重量１１２．４ｇ、純度９９．４
重量％（フマル酸０．５重量％）であった。 Example 3. In the same manner as in Example 2, one of the frozen bacterial cells was added to 1 L of the substrate medium to carry out the reaction. Analysis of the reacted medium showed 99.2 for fumaric acid charged.
Mol% L-aspartic acid was produced. After centrifuging the reaction-completed medium to remove bacterial cells, fumaric acid 90
g was added and stirred for 30 minutes to crystallize L-aspartic acid. After crystallization, suction filtration with a suction filter to give about 90
0 ml was obtained. The L-aspartic acid separated by filtration was washed with 50 ml of water, sufficiently drained, and dried. When the purity of the obtained crystals was examined, the weight was 112.4 g and the purity was 99.4.
% By weight (0.5% by weight of fumaric acid).

【００４４】ついで、先の母液と母液をあわせて、減圧
下で濃縮し、フマル酸１０ｇと２５％アンモニア水を加
えてpHを８．３に調節し、水を加えて１Ｌの基質媒体と
した。この基質媒体に先と同様に凍結菌体の一つをい
れ、３７℃で５時間反応させた。この反応済み媒体を先
と同様に遠心分離して菌体を除いた後、フマル酸９０ｇ
を添加して３０分間攪拌して晶析を行った。析出したＬ
−アスパラギン酸の結晶を吸引濾過し、水５０mlで結晶
を洗浄し、充分に水分をきったのち、乾燥した。得られ
た結晶の重量は１１３．３ｇ、純度は９９．２重量％
（フマル酸０．６重量％）（結晶平均サイズ１００μ
ｍ）であった。Then, the mother liquor and the mother liquor were combined and concentrated under reduced pressure, 10 g of fumaric acid and 25% aqueous ammonia were added to adjust the pH to 8.3, and water was added to make 1 L of the substrate medium. . One of the frozen cells was added to this substrate medium in the same manner as above, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 5 hours. This reacted medium was centrifuged to remove the cells in the same manner as above, and then 90 g of fumaric acid was added.
Was added and stirred for 30 minutes for crystallization. L deposited
-The crystals of aspartic acid were suction filtered, washed with 50 ml of water, drained well and dried. The obtained crystals weigh 113.3 g and have a purity of 99.2% by weight.
(Fumaric acid 0.6% by weight) (Crystal average size 100μ
m).

【００４５】比較例２．実施例２と同様にして１Ｌの基
質媒体に凍結菌体の一つをいれ、３７℃で穏やかに振と
うしながら５時間反応させた。反応済み媒体の分析の結
果、初期仕込フマル酸に対して９９．０モル％のＬ−ア
スパラギン酸が生成していた。この反応済み媒体を遠心
分離して菌体を除いた後、フマル酸７０ｇを添加し、３
０分攪拌してＬ−アスパラギン酸を晶析させた。晶析
後、吸引濾過器で吸引濾過し、母液約９２０mlを得た。
濾別したＬ−アスパラギン酸を水５０mlで吸引しながら
洗浄し、乾燥した。得られた結晶の純度を調べたとこ
ろ、重量８３．３ｇ、純度９９．３重量％（フマル酸
０．４５重量％）であった。 Comparative Example 2. In the same manner as in Example 2, 1 L of the substrate medium was charged with one of the frozen cells, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 5 hours with gentle shaking. As a result of analysis of the reacted medium, 99.0 mol% of L-aspartic acid was formed with respect to the initially charged fumaric acid. After centrifuging the reacted medium to remove the cells, 70 g of fumaric acid was added to
The mixture was stirred for 0 minutes to crystallize L-aspartic acid. After crystallization, suction filtration was performed with a suction filter to obtain about 920 ml of mother liquor.
The L-aspartic acid separated by filtration was washed with 50 ml of water by suction and dried. When the purity of the obtained crystals was examined, it was found to have a weight of 83.3 g and a purity of 99.3% by weight (fumaric acid 0.45% by weight).

【００４６】実施例４．１Ｌ中にフマル酸１１６ｇ、硫
酸マグネシウム０．２ｇを含有するフマル酸アンモニウ
ム水溶液（pH８．３）を基質媒体として用いた以外は実
施例２と同様にして、１Ｌの基質媒体に凍結菌体の一つ
をいれ反応を行った。反応済み媒体を分析したところ、
仕込フマル酸に対して９９．２モル％のＬ−アスパラギ
ン酸が生成していた。この反応済み媒体を遠心分離して
菌体を除いた後、フマル酸１０４．４ｇを添加し３０分
間攪拌し、Ｌ−アスパラギン酸を晶析させた。晶析後、
吸引濾過器で吸引濾過し、母液約８９０mlを得た。濾別
したＬ−アスパラギン酸を水５０mlで吸引しながら洗浄
し、乾燥した。得られた結晶の純度を調べたところ、重
量１２６．４ｇ、純度９９．０重量％（フマル酸０．７
重量％）（結晶平均サイズ１５０μｍ）であった。 Example 4. In the same manner as in Example 2 except that an aqueous ammonium fumarate solution (pH 8.3) containing 116 g of fumaric acid and 0.2 g of magnesium sulfate in 1 L was used as the substrate medium, 1 L of the frozen bacterial cells was added to the substrate medium. The reaction was carried out by putting in one. When the reacted medium was analyzed,
99.2 mol% of L-aspartic acid was formed with respect to the charged fumaric acid. After the reaction-completed medium was centrifuged to remove bacterial cells, 104.4 g of fumaric acid was added and stirred for 30 minutes to crystallize L-aspartic acid. After crystallization,
Suction filtration was performed with a suction filter to obtain about 890 ml of mother liquor. The L-aspartic acid separated by filtration was washed with 50 ml of water by suction and dried. When the purity of the obtained crystal was examined, it weighed 126.4 g and had a purity of 99.0% by weight (fumaric acid 0.7
% By weight (average crystal size 150 μm).

【００４７】ついで、先の母液と洗液をあわせて、減圧
下で濃縮し、フマル酸１１．６ｇと２５％アンモニア水
を加えてpHを８．３に調節し、水を加えて１Ｌの基質媒
体とした。この反応済み媒体に先と同様に凍結菌体の一
つをいれ、３７℃で５時間反応させた。この反応済み媒
体を先と同様に遠心分離して菌体を除いた後、フマル酸
１０４．４ｇを添加して３０分間攪拌して晶析を行っ
た。析出したＬ−アスパラギン酸の結晶を吸引濾過し、
水５０mlで結晶を洗浄し、充分に水分をきったのち、乾
燥した。得られた結晶の重量は１３２．８ｇ、純度は９
９．１重量％（フマル酸０．７重量％）（結晶平均サイ
ズ１２０μｍ）であった。Then, the mother liquor and the washing liquid were combined and concentrated under reduced pressure, 11.6 g of fumaric acid and 25% aqueous ammonia were added to adjust the pH to 8.3, and 1 L of substrate was added with water. The medium. One of the frozen cells was added to this reaction-completed medium in the same manner as above, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 5 hours. The reaction-completed medium was centrifuged in the same manner as described above to remove the bacterial cells, 104.4 g of fumaric acid was added, and the mixture was stirred for 30 minutes for crystallization. The precipitated L-aspartic acid crystals were suction filtered,
The crystals were washed with 50 ml of water, drained sufficiently, and dried. The obtained crystals weigh 132.8 g and have a purity of 9
It was 9.1% by weight (fumaric acid 0.7% by weight) (crystal average size 120 μm).

【００４８】比較例３．１Ｌ中にフマル酸１５０ｇ及び
硫酸マグネシウム０．２ｇを含有するフマル酸アンモニ
ウム水溶液（pH８．３）を基質媒体として用いた以外は
実施例２と同様にして、１Ｌの基質媒体に凍結菌体の一
つをいれ反応を行った。反応済み媒体を分析したとこ
ろ、仕込フマル酸に対して９９．１モル％のＬ−アスパ
ラギン酸が生成していた。この反応済み媒体を遠心分離
して菌体を除いた後、フマル酸１３５ｇを添加し、３０
分間攪拌してＬ−アスパラギン酸を晶析させた。晶析
後、吸引濾過器で吸引濾過し、水５０mlで洗浄して乾燥
した。得られた結晶の純度を調べたところ、重量２５
０．１ｇ、純度６７．８重量％（フマル酸３０．３重量
％）であった。以上の実施例、比較例の結果を以下の表
にまとめた。 Comparative Example 3. In the same manner as in Example 2 except that an ammonium fumarate aqueous solution (pH 8.3) containing 150 g of fumaric acid and 0.2 g of magnesium sulfate in 1 L was used as the substrate medium, 1 L of the frozen bacterial cells was added to the substrate medium. The reaction was carried out by putting in one. Analysis of the reacted medium revealed that 99.1 mol% of L-aspartic acid was formed with respect to the charged fumaric acid. After centrifuging the reaction-completed medium to remove bacterial cells, 135 g of fumaric acid was added,
After stirring for a minute, L-aspartic acid was crystallized. After crystallization, it was suction filtered with a suction filter, washed with 50 ml of water and dried. When the purity of the obtained crystals was examined, the weight was 25
The amount was 0.1 g and the purity was 67.8% by weight (fumaric acid 30.3% by weight). The results of the above Examples and Comparative Examples are summarized in the table below.

【００４９】[0049]

【表１】 表に示されるとおり、添加するフマル酸のモル比が小さ
いと、結晶として分離できるＬ−アスパラギン酸の回収
率が低くなり、初期フマル酸濃度が高くなると得られる
Ｌ−アスパラギン酸結晶の純度が低くなることがわか
る。[Table 1] As shown in the table, when the molar ratio of fumaric acid to be added is small, the recovery rate of L-aspartic acid that can be separated as crystals is low, and when the initial fumaric acid concentration is high, the purity of L-aspartic acid crystals obtained is low. You can see.

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 フマル酸とアンモニア及び／またはフマ
ル酸アンモニウムを含有する基質媒体にアスパルターゼ
活性を有する酵素含有物を作用せしめることによりＬ−
アスパラギン酸を生成せしめる反応をフマル酸濃度１３
重量％以下で行い、次に反応済み媒体中に存在するＬ−
アスパラギン酸に対して０．８５〜１．２倍モルのフマ
ル酸を該反応済み媒体に添加することによりＬ−アスパ
ラギン酸を析出させ、折出したＬ−アスパラギン酸の結
晶を濾過水洗することによってＬ−アスパラギン酸を採
取し、次いで母液と洗液にアンモニアを添加して基質媒
体として再使用することを特徴とするＬ−アスパラギン
酸の製造方法。1. L- by reacting an enzyme-containing substance having an aspartase activity with a substrate medium containing fumaric acid, ammonia and / or ammonium fumarate.
The fumaric acid concentration of 13 was used as the reaction for producing aspartic acid.
Wt% or less, then L- present in the reacted medium
L-aspartic acid was precipitated by adding 0.85 to 1.2 times the molar amount of fumaric acid to the reaction medium to aspartic acid, and the precipitated crystals of L-aspartic acid were filtered and washed with water. A method for producing L-aspartic acid, which comprises collecting L-aspartic acid, then adding ammonia to a mother liquor and a washing liquor and reusing it as a substrate medium. 【請求項２】 フマル酸及び／またはその塩を０．１〜
３重量％随伴しており、かつ結晶の平均サイズが５０〜
５００μｍであるＬ−アスパラギン酸を最終製品として
採取する請求項１に記載の方法。2. A fumaric acid and / or a salt thereof is added in an amount of 0.1 to 10.
3% by weight, and the average crystal size is 50 to
The method according to claim 1, wherein L-aspartic acid having a size of 500 μm is collected as a final product. 【請求項３】 フマル酸及び／またはその塩を０．１〜
３重量％随伴しており、かつ結晶の平均サイズが５０〜
５００μｍであるＬ−アスパラギン酸製品。3. A fumaric acid and / or a salt thereof is added in an amount of 0.1 to 10.
3% by weight, and the average crystal size is 50 to
An L-aspartic acid product that is 500 μm.