JPH08322573A - スルホトランスフェラーゼをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 コンドロイチンのN-アセチルガラクトサミン
残基の６位に硫酸基を転移するコンドロイチン６−スル
ホトランスフェラーゼ（Ｃ６ＳＴ）をコードするＤＮＡ
を提供する。 【構成】 ニワトリ胚軟骨細胞の培養液からＣ６ＳＴを
精製してその部分的アミノ酸配列を決定し、その配列に
基づいて作製したオリゴヌクレオチドプライマーを用い
たＰＣＲにより上記細胞から調製したポリ(A)⁺RNAから
Ｃ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡを増幅し、得られたｃＤＮＡ断
片をプローブとするハイブリダイゼーションによりｃＤ
ＮＡライブラリーからＣ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡを得た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、スルホトランスフェラ
ーゼ（硫酸基転移酵素）をコードする新規なＤＮＡ、お
よび該ＤＮＡに由来するＤＮＡ断片から発現される新規
なポリペプチド、および該ポリペプチドに反応する抗体
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】コンドロイチン硫酸は、代表的な硫酸化
ムコ多糖（グリコサミノグリカン）である。コンドロイ
チン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）は軟骨に豊富に
存在し、軟骨細胞(chondrocyte)の表現型の発現および
維持に寄与していると考えられている(Tsukahara, T.,
Okamura, M., Suzuki, S., Iwata, H., Miura, T., and
Kimata, K. (1991) J. Cell Sci. 100, 387-395)。ＣＳ
ＰＧは、また軟骨以外のさまざまな組織中に存在してお
り、細胞間相互作用に重要な役割を果たしていると考え
られる(Kjellen, L., and Lindahl, U. (1991) Annu. R
ev. Biochem. 60, 443-475)。

【０００３】ほ乳類や鳥類の組織に見られる主要なコン
ドロイチン硫酸は、アセチルガラクトサミン残基の６位
もしくは４位に硫酸基を持っている。６−硫酸化／４−
硫酸化の割合については、次のような知見が得られてい
る。軟骨の最終分化に伴い、コンドロイチン６−硫酸
／コンドロイチン４−硫酸の比（６／４比）が増加す
る。ラットの皮膚においては、出生後の日齢とともに
ＣＳＰＧで６／４比が減少する。アテローム性動脈硬
化症に抵抗性と感受性のハトの品種から得られた各々の
動脈平滑筋細胞を比較した結果、ＣＳＰＧ、ＤＳＰＧ
（デルマタン硫酸プロテオグリカン）いずれにおいても
抵抗性品種ではコンドロイチン４−硫酸が主成分である
が、感受性品種ではコンドロイチン６−硫酸が主であ
る。単球性白血病細胞(M1)において、培養条件を細胞
増殖、高密度での増殖阻害、マクロファージへの分化誘
導が起きる条件へと変化させてみると、増殖、増殖阻
害、分化誘導と変化するにつれてＣＳＰＧにおける６／
４比が減少し、分化誘導状態ではほとんどコンドロイチ
ン４−硫酸が合成される。ヒト正常結腸組織とヒト結
腸癌組織を比較した結果、癌組織のＰＧでは正常組織に
比べてコンドロイチン６−硫酸とコンドロイチンが増加
する。マウス骨芽細胞において、石灰化が起きる前後
で比較した結果、石灰化後は石灰化前に比べてＤＳＰＧ
の６／４比が減少する。サル動脈平滑筋細胞の培養培
地にＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）を添加すると、バ
ーシカン様ＣＳＰＧにおける６／４比がＰＤＧＦ無添加
の対照よりも増加する（グリコバイオロジーシリーズ
糖鎖の多様な世界 講談社 第１６４、１６６頁）。

【０００４】またコンドロイチン硫酸においては、１つ
の繰り返し２糖単位あたり２つの硫酸基の存在も報告さ
れている。例えば、GlcAβ1→3GalNAc(4,6-bisS)は、継
代培養したニワトリ胚軟骨細胞、マウス脾臓細胞を培養
して得たコンディションドメディウム添加培地で培養す
ることにより骨髄細胞から分化したマウス肥満細胞、ラ
ット糸球体、器官培養したヒト結腸粘膜の培養液、ラッ
ト漿膜肥満細胞、ヒト肺肥満細胞の分泌顆粒、ホルボー
ルミリステートアセテートで活性化されたヒト単球およ
び単球由来のマクロファージ、マウス骨芽細胞、ラット
糸球体脈管膜細胞、ナマコ体壁から見つかっている。ま
た非還元末端GalNAc(4,6-bisS)が、ニワトリ胚骨端軟骨
およびラット剣状突起軟骨、ニワトリ胚軟骨細胞を培養
したときの細胞層から、また非還元末端GalNAc(4,6-bis
S)β1→4GlcAβ→3GalNAc(4,6-bisS)が、ウサギ肺から
抽出精製したトロンボモジュリンから見つかった。さら
に、GlcA(2S)-GalNAc(6S)は、マウスリンパ節由来の肥
満細胞から見つかっている（グリコバイオロジーシリー
ズ 糖鎖の多様な世界 講談社 第１６６頁）。

【０００５】このようなコンドロイチン硫酸の硫酸化の
パターンの多様性は、コンドロイチン硫酸の機能の分子
的な基盤を反映していると思われる。また、コンドロイ
チン硫酸の生理活性発現には、硫酸化が重要な役割を果
たしていると考えられる。コンドロイチン硫酸の生理活
性発現における硫酸化の重要性を考えると、コンドロイ
チン硫酸の特異的な部位を硫酸化する方法は、コンドロ
イチン硫酸の生理活性の解析や機能改変に必須であると
考えられる。グリコサミノグリカンの糖残基の特異的な
部位の硫酸化は、その部位に特異的なスルホトランスフ
ェラーゼにより触媒される。

【０００６】グリコサミノグリカンのスルホトランスフ
ェラーゼ遺伝子がクローニングされれば、受容体の基質
特異性についての情報が得られ、グリコサミノグリカン
の構造-機能関係の研究に有用なアプローチを提供する
と思われる。グリコサミノグリカンの合成には、さまざ
まなグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼが
関与しているようである。しかしながら、スルホトラン
スフェラーゼのcDNAのクローニングは困難なものであ
り、ラットの肝臓、ヘパリン産生細胞系(cell line)、
及びマウスの肥満細胞腫からのN-スルホトランスフェラ
ーゼ／N-デアセチラーゼのcDNAがクローニングされてい
るのみである。

【０００７】本発明者らは、既に3'-ホスホアデノシン
5'-ホスホ硫酸からコンドロイチン等のグリコサミノグ
リカンのN-アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基
を転移するコンドロイチン６−スルホトランスフェラー
ゼ（以下「Ｃ６ＳＴ」と略記することもある）を、無血
清培地で培養したニワトリの軟骨細胞の培養上清から見
かけ上均一に精製した(Habuchi, O., Matsui, Y., Koto
ya, Y., Aoyama, Y., Yasuda, Y., and Noda, M. (199
3) J. Biol. Chem. 268, 21968-21974)。しかし、該酵
素の収率は、培養上清中の全タンパク質量に対して０．
０１５％と低いものであった。そのため、工業的に使用
可能な量の酵素を得ることは困難であった。また、該酵
素を免疫学的に検出するための該酵素に対する抗体も、
それに用いる抗原としての酵素タンパク質（もしくは酵
素タンパク質由来のペプチド）が満足できる量が得られ
なかったため、作製できなかった。

【０００８】通常、天然のソースから得ることが困難な
タンパク質を大量に得るためには、遺伝子工学的手法に
よりタンパク質をコードする遺伝子のクローニングが有
用であり、そのためにはタンパク質のアミノ酸配列の決
定が不可欠である。しかし、前記コンドロイチン６−ス
ルホトランスフェラーゼの分子量はSDS-PAGEで75,000と
決して小さくなく、また低収率であったため、アミノ酸
配列を決定するに至らず、該酵素をコードする遺伝子の
クローニングを困難なものとしていた。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】コンドロイチン硫酸の
生理活性発現における硫酸化の重要性を考えると、コン
ドロイチン硫酸に硫酸基を転移する酵素は、コンドロイ
チン硫酸の機能解析の研究のみならず、ヒトに好ましい
生理活性を有する医薬品の創造を目的としたコンドロイ
チン硫酸を提供するためにも非常に重要である。特に3'
-ホスホアデノシン5'-ホスホ硫酸からコンドロイチンの
N-アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移す
るコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ（Ｃ６
ＳＴ）が精製されている今、該酵素を工業的に使用可能
な程度まで大量生産するために必要なcDNAのクローニン
グが待たれていた。また、該酵素を免疫学的に検出する
ために必要な該タンパク質に対する抗体の作製、また該
抗体の作製に必要な抗原の大量生産が待たれていた。本
発明は上記観点からなされたものであり、コンドロイチ
ンのN-アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転
移するコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼを
コードするＤＮＡ、および該ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片か
ら発現されるポリペプチド、および該ポリペプチドと反
応する抗体を提供することを課題とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、コンドロ
イチンやコンドロイチン硫酸に含まれるN-アセチルガラ
クトサミン残基の６位に選択的に硫酸基を転移する酵
素、コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼをコ
ードするＤＮＡを鋭意検索し、該酵素をコードするｃＤ
ＮＡのクローニングに成功し、該ｃＤＮＡによりコンド
ロイチン６−スルホトランスフェラーゼが発現すること
を確認し、本発明に到達した。

【００１１】また、該酵素をコードするｃＤＮＡ由来の
ＤＮＡ断片から新規なペプチドを調製し、該ペプチドを
抗原として得られる抗体が該ペプチドおよびＣ６ＳＴと
反応することを確認し、本発明に到達した。

【００１２】すなわち本願発明は、以下の性質を有する
スルホトランスフェラーゼをコードするＤＮＡである。 作用：硫酸基供与体から硫酸基を、グリコサミノグリ
カンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に転移す
る。 基質特異性：コンドロイチン、ニワトリ胚軟骨由来の
コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロ
イチン硫酸Ｃには硫酸基を転移するが、コンドロイチン
硫酸Ｅ、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸には硫酸基を実
質的に転移しない。 至適反応ｐＨ：６．４付近。 阻害及び活性化 プロタミンおよびMnCl₂により活性化される。 分子量：還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により推定される分子量：約７５，００
０。

【００１３】非還元条件下でのゲル濾過により推定され
る分子量：約１６０，０００。

【００１４】本願発明は、また、配列番号２に示すアミ
ノ酸配列を有し、硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミ
ノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に
転移する活性を実質的に害さないアミノ酸残基の置換、
欠失、挿入を有していてもよいスルホトランスフェラー
ゼの少なくとも一部をコードするＤＮＡである。

【００１５】本発明のＤＮＡとして具体的には、配列番
号２においてアミノ酸番号−３３〜４２５で表されるア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列
番号２においてアミノ酸番号−１４〜４２５で表される
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配
列番号２においてアミノ酸番号１〜４２５で表されるア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、及び
配列番号２においてアミノ酸番号５〜１５４で表される
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが挙
げられる。

【００１６】また本発明は、上記ＤＮＡによってコード
されるスルホトランスフェラーゼの部分ペプチドを提供
する。部分ペプチドとして具体的には、配列番号２にお
いてアミノ酸番号５〜１５４で表されるアミノ酸配列を
有するペプチドが挙げられる。

【００１７】本発明はさらに、配列番号２に示すアミノ
酸配列を有するスルホトランスフェラーゼまたはその部
分ペプチドに反応する抗体を提供する。尚、本発明のＤ
ＮＡがコードする酵素を便宜的にコンドロイチン６−ス
ルホトランスフェラーゼまたはコンドロイチン６−硫酸
基転移酵素と呼ぶが、これは該酵素の基質がコンドロイ
チンに限られることを意味するものではなく、コンドロ
イチンの他にも、プロタミン等を添加することによっ
て、ニワトリ胚軟骨由来のコンドロイチン硫酸、コンド
ロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、角膜由来のケ
ラタン硫酸に対しても硫酸基転移活性を有する。

【００１８】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１９】＜１＞本発明のコンドロイチン６−スルホ
トランスフェラーゼをコードするＤＮＡ 本発明のＤＮＡによってコードされるコンドロイチン６
−スルホトランスフェラーゼは、本発明者らによって、
無血清培地で培養したニワトリの軟骨細胞の培養上清か
ら精製された(Habuchi, O., Matsui, Y., Kotoya, Y.,
Aoyama, Y., Yasuda, Y., and Noda, M. (1993) J. Bio
l. Chem. 268, 21968-21974)酵素であり、下記のような
酵素学的性質を有する。

【００２０】作用：硫酸基供与体から硫酸基を、グリ
コサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の
６位に転移する。 基質特異性：コンドロイチン、ニワトリ胚軟骨由来の
コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロ
イチン硫酸Ｃには硫酸基を転移するが、コンドロイチン
硫酸Ｅ、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸には実質的に硫
酸基を転移しない。

【００２１】なお、角膜由来のケラタン硫酸にも硫酸基
を転移する。その転移部位は、ガラクトース残基の６位
であることが本発明者らによって確かめられている。 至適反応ｐＨ：６．４付近 阻害及び活性化 プロタミンおよびMnCl₂により活性化される。 分子量還元条件下でのＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）により推定される分子量：約７５，０００ 非還元条件下でのゲル濾過（スーパロース１２(Superos
e12)、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）に
より推定される分子量：約１６０，０００

【００２２】本発明のＤＮＡは、本発明により初めて単
離されたＤＮＡであり、コンドロイチン６−スルホトラ
ンスフェラーゼをコードしている。本発明のＤＮＡの塩
基配列は、コンドロイチン６−スルホトランスフェラー
ゼをコードしていれば、その塩基配列は特に限定されな
いが、具体的には配列番号２に示されるアミノ酸配列を
コードし得る塩基配列が挙げられる。本発明のＤＮＡの
塩基配列としてさらに具体的には、配列番号１に示す塩
基配列が挙げられるが、遺伝暗号の縮重による異なった
塩基配列のＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含されること
は、当業者であれば容易に理解されるところである。

【００２３】また、本発明のＤＮＡは、前記アミノ酸配
列のうち、硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリ
カンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に転移す
る活性を実質的に害さないアミノ酸残基の置換、欠失、
挿入又は転移を有していてもよい。そのようなＤＮＡの
いずれもが本発明のＤＮＡに包含される。

【００２４】さらに本発明のＤＮＡは、Ｃ６ＳＴをコー
ドするコード鎖のみの一本鎖であってもよいし、この一
本鎖及びこれと相補的な配列を有するＤＮＡ鎖とからな
る二本鎖であってもよい。

【００２５】また、本発明のＤＮＡは、Ｃ６ＳＴ全体を
コードするコード領域全長を有していてもよいし、Ｃ６
ＳＴの一部のペプチドをコードするものであってもよ
い。本発明のＤＮＡは、それがコードするアミノ酸配列
が本発明により明らかにされたので、その配列に基づい
て合成することも可能であるが、本発明においては後記
実施例に示すように、Ｃ６ＳＴの部分アミノ酸配列の
決定、そのアミノ酸配列に基づいたＰＣＲ用オリゴヌ
クレオチドプローブの作製、ニワトリ胚の軟骨細胞(c
hondrocyte)由来のポリ(A)⁺RNAからのＣ６ＳＴ部分ｃＤ
ＮＡのＰＣＲ法による増幅、ニワトリ胚の軟骨細胞(c
hondrocyte)由来のｃＤＮＡライブラリーからのＣ６Ｓ
Ｔ完全長ｃＤＮＡの選択、の各工程によるｃＤＮＡクロ
ーニングによって初めて得られたものである。

【００２６】以下に、本発明のＤＮＡを得る方法を具体
的に説明する。

【００２７】（１）コンドロイチン６−スルホトランス
フェラーゼ（Ｃ６ＳＴ）の部分アミノ酸配列の決定及び
ＰＣＲ用プライマーの調製 (i)Ｃ６ＳＴの精製 コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼは、軟骨
細胞等、コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ
を発現する培養細胞から、通常のタンパク質の精製方
法、及び通常のスルホトランスフェラーゼの精製方法を
組み合わせることによって精製することができる。具体
的には、J. Biol. Chem. 268,(29),21968-21974,(1993)
に記載された方法に従って行うことが好ましい。すなわ
ち、例えば無血清培地で培養したニワトリ胚の軟骨細胞
(chondrocyte)の培養上清から、ヘパリン−セファロー
スＣＬ６Ｂ（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社
から購入できる）、コムギ胚芽アグルチニン−アガロー
ス（生化学工業（株）から購入できる）、及び3',5'-AD
P-アガロース（シグマ(Sigma)社から購入できる）によ
るアフィニティークロマトグラフィーによって、実質的
に均一なＣ６ＳＴが得られる。尚、スルホトランスフェ
ラーゼ活性の測定法、及び硫酸基を転移する位置を調べ
る方法は、実施例に詳述した。

【００２８】(ii)コンドロイチン６−スルホトランスフ
ェラーゼの部分アミノ酸配列の決定 精製したＣ６ＳＴには糖鎖が結合していることが知られ
ているので、この糖鎖を除去するために精製Ｃ６ＳＴを
Ｎ−グリカナーゼ等の糖鎖分解酵素で消化する。これに
より脱グリコシル化されたＣ６ＳＴをSDS-PAGE（SDS-ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）等に付して分離し、ポ
リビニリデンフルオリド(polyvinylidene fluoride; PV
DF)膜やニトロセルロース膜等に転写する。この膜をク
マシー・ブリリアント・ブルーやアミドブラック等のタ
ンパク質を染色する色素で染色し、Ｎ−グリカナーゼ消
化後に形成したタンパク質バンドを切り出して、脱グリ
コシル化されたＣ６ＳＴのアミノ酸配列決定に用いる。
また、Ｃ６ＳＴの内部アミノ酸配列を決定する場合は、
脱グリコシル化されたＣ６ＳＴをSDS-PAGE等に付して分
離し、ゲルをクマシー・ブリリアント・ブルーやアミド
ブラックのようなタンパク質を染色する色素で染色し、
Ｎ−グリカナーゼ消化後に形成したタンパク質バンドを
切り出して断片化に用いる。

【００２９】断片化の方法は特に限定されないが、プロ
テアーゼＶ８(protease V8、sequencing grade, ベーリ
ンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)製)等のタンパ
ク質分解酵素を用いることが好ましい。また、切り出し
たゲルをタンパク質分解酵素に接触させ、その後SDS-PA
GE等で分離しても良い。簡便な操作としては、Clevelan
d, D. W., Fischer, S. G., Kirshner, M. W., and Lae
mmli, U. K.(1977) J.Biol. Chem. 252, 1102-1106 の
方法がある。すなわち、タンパク質バンドを切り出して
別のゲルのウェルに挿入し、タンパク質分解酵素を含む
緩衝液を、挿入したゲルにのせてSDS-PAGEを行い、色素
の先端が分離ゲルに入る前に電源を切ることによって泳
動を一時中止し、約30分間酵素消化を行い、その後電気
泳動を再開するという方法である。この方法によれば酵
素消化と消化後のペプチド断片の分離がワンステップで
できるので便利である。プロテアーゼ消化により形成し
たペプチドはPVDF膜やニトロセルロース膜等に転写す
る。この膜をクマシー・ブリリアント・ブルーやアミド
ブラック等のタンパク質を染色する色素で染色した後、
ペプチドバンドを切り出す。タンパク質分解酵素消化後
に生じたペプチドを含むPVDF膜やニトロセルロース膜等
は、公知の方法でペプチドのアミノ末端配列決定を行う
ことができる。なお、業者に依頼して上記方法でアミノ
酸配列を決定してもらうこともできる。

【００３０】上記のようにして決定された部分的アミノ
酸配列の例を配列番号３〜６に示す。

【００３１】(iii)オリゴヌクレオチドプライマーの合
成 Ｃ６ＳＴの部分的アミノ酸配列が決定されたら、そのア
ミノ酸配列に基づいてＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプラ
イマーを作製することができる。アミノ酸配列のうち、
なるべくコドンの縮重の少ない部位を用いるとよい。こ
のようなプライマーの例として、センスプライマーを配
列番号７、８に、アンチセンスプライマーを配列番号９
に示す。尚、配列番号７に示すプライマーはHindIII部
位を含む配列を、配列番号９に示すアンチセンスプライ
マーはEcoRI部位を含む配列を、それぞれ５’末端に有
する。これは、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をベ
クターに挿入する操作を簡便にするためである。

【００３２】（２）Ｃ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡの調製 (i)Ｃ６ＳＴをコードするmRNAを含むpoly(A)⁺RNAの調製 全ＲＮＡの調製 全RNAは、公知の方法(Kingston, R. E., (1991) in Cur
rent Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Un
it 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Int
erscience, New York 等)で得ることができる。材料
は、コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼのｍ
ＲＮＡを発現している材料であれば限定されないが、取
扱いの容易さ、および増殖可能な点で培養細胞が好まし
い。培養細胞の中でも特にニワトリ胚の軟骨細胞(chond
rocyte)が好ましい。軟骨細胞は、公知の方法（Kim, J.
J., and Conrad, H. E. (1976) J. Biol. Chem. 251,
6210-6217、Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1977) J.
Biol. Chem. 252, 8292-8299、Kim, J. J., and Conra
d, H. E. (1980) J. Biol. Chem. 255, 1586-1597等)で
培養することができる。培地としては、培養細胞が生育
可能な培地であれば特に限定されないが、ダルベッコ改
変イーグル培地等が通常の培養で良く用いられ、入手も
容易であり、なおかつ該培養細胞が生育可能であること
から好ましい。培地のpHは中性域、特にpH7.0に調整す
ることが好ましい。培地には２g/l程度のD-グルコース
を加えることが好ましい。また、微生物の生育を防ぐた
め、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質を培
地に添加することが好ましい。また、培地に10％のウシ
胎仔血清を加えることが好ましい。

【００３３】上記のような培地を用い、ローラボトルや
ディシュを使用して通常の培養細胞と同様にして培養す
れば良い。培養は、炭酸ガスインキュベーター中で行う
ことが好ましく、インキュベーター中の炭酸ガス濃度が
５〜７％、空気が９７〜９３％となるように調整するこ
とが好ましい。また、温度は３７〜３８℃程度に調整す
ることが好ましい。

【００３４】全ＲＮＡは、前述のように培養した培養細
胞から通常用いられる全ＲＮＡの調製方法により得るこ
とができるが、グアニジンチオシアネート／CsCl法(Kin
gston, R. E., (1991) in Current Protocols in Molec
ular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishi
ng Associates and Wiley Interscience, New York)で
調製するのが好ましい。

【００３５】poly(A)⁺RNAの調製 poly(A)⁺RNAは、上記のようにして得られた全RNAから、
オリゴdT（oligo-(dT)）セルロースカラムクロマトグラ
フィーなどによって精製することができる。

【００３６】ＰＣＲ法によるＣ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡ
の増幅 上記ポリ(A)⁺RNAを鋳型とし、オリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いた逆転写ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリ
アクション）により、Ｃ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡを増幅す
ることができる。ＰＣＲは、通常の方法と同様にして行
えばよいが、具体的方法を示せば以下の通りである。１
μｇのポリ(A)⁺RNA、50pmolのオリゴヌクレオチド3a、
それぞれ500μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リ
ン酸、200単位のM-MLV逆転写酵素（ギブコＢＲＬ(Gibco
BRL)）、１mM ジチオスレイトール、120単位のRNase
インヒビター(宝酒造(株)製)を含む緩衝液（終体積20μ
ｌ）を、37℃で60分間インキュベートし、ｃＤＮＡ一次
鎖を合成する。次に、上記の逆転写反応混合液10μｌ、
オリゴヌクレオチドプライマー（センス、アンチセンス
それぞれ50pmol）、それぞれ100μＭの４種類のデオキ
シヌクレオシド三リン酸、2.5単位のTaqポリメラーゼを
含む反応液（終体積100μｌ）に対し、94℃１分間、45
℃１分間、55℃３分間からなる反応サイクルを30サイク
ル行う。

【００３７】このようにして得られた部分的ｃＤＮＡ
は、ｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡ（コード
領域全長を含むｃＤＮＡ）をスクリーニングするための
ハイブリダイゼーションプローブとして用いられる。

【００３８】（３）ｃＤＮＡライブラリーの作製 (i)cDNAの合成と組換えＤＮＡの作製 cDNAは、poly(A)⁺RNAを鋳型とした逆転写酵素反応によ
り合成することができる。市販のcDNA合成用キットを用
いるのが便利である。例えばTimeSaver cDNA synthesis
kit(ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー)を用いる
と、cDNAの合成、およびcDNAをクローニングベクター
（例えばEcoRI消化したλｇｔ１１）に連結させること
ができる。本発明においてもEcoRI消化したλｇｔ１１
を用いることが好ましい。なお、逆転写酵素反応のプラ
イマーとしては、ランダムオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いることが好ましい。cDNAをクローニングベクタ
ーに結合させることによって得られた組換えＤＮＡは、
宿主細菌細胞中に導入（トランスフェクション）する。
用いる宿主細菌細胞は、用いるクローニングベクターに
より選択する必要があるが、通常は大腸菌（エシェリキ
ア・コリ：Escherichia coli(E. coli)）を宿主とする
クローニングベクターと大腸菌との組み合わせが頻用さ
れている。

【００３９】トランスフェクションは、通常、組換えＤ
ＮＡと30mM塩化カルシウムの存在下で細胞膜の透過性を
変化させた大腸菌とを混合することにより行われる。λ
ｇｔ１１のようなλファージベクターの場合、組換えＤ
ＮＡを直接塩化カルシウム処理した大腸菌に導入できる
が、あらかじめ試験管中でファージ外殻に入れて（invi
troパッケージングという）、大腸菌に効率よく感染さ
せる方法が一般に使用されており、そのためのキットも
市販されている（Gigapack II packaging extract、ス
トラタジーン(Stratagene) 製等)。本発明でもこの方法
を用いることが好ましい。

【００４０】in vitroパッケージングした組換えＤＮＡ
は、大腸菌にトランスフェクションするが、用いるクロ
ーニングベクターによって用いる大腸菌株を選択する必
要がある。すなわち、抗生物質耐性遺伝子を含むクロー
ニングベクターを用いる場合は、大腸菌に抗生物質に耐
性の性質があってはいけない。また、β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）等の遺伝子を含むクローニング
ベクターを用いる場合は、β−ガラクトシダーゼ活性を
発現しない大腸菌を選択する必要がある。このことは、
組換えＤＮＡがトランスフェクションされた大腸菌をス
クリーニングするために必要なことである。例えば、ク
ローニングベクターにλｇｔ１１を用いる場合、E. col
i Y1088等のβ−ガラクトシダーゼ活性を発現しない大
腸菌株を選択すれば良い。組換えベクターが導入された
大腸菌は、抗生物質に対する耐性の獲得や、β−ガラク
トシダーゼ活性の獲得等によりスクリーニングできる。
具体的には、大腸菌を寒天培地にまき、生育したコロニ
ーを選択すれば良い。生育した大腸菌（組換えＤＮＡが
トランスフェクションされた大腸菌）は、ｃＤＮＡライ
ブラリーを構成する。ベクターにλｇｔ１１を用いた場
合は、指示菌とともに軟寒天培地に懸濁し、寒天培地上
に重層してプラークを形成させればよい。ＤＮＡ断片が
挿入されたベクターを保持するファージプラークは、β
−ガラクトシダーゼ活性を発現しないので、容易に選択
することができる。

【００４１】(ii)Ｃ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡクローニング 次に、上記のようにして得られたｃＤＮＡライブラリー
から、Ｃ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡを有するファージクロー
ンを、Ｃ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡをプローブとしてハイブ
リダイゼーションにより選択することができる。ハイブ
リダイゼーションは、通常の方法に従って行えばよい。

【００４２】選択された陽性クローンから、ファージＤ
ＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断することによっ
て、Ｃ６ＳＴｃＤＮＡを切り出すことができる。得られ
たｃＤＮＡは、そのまま、あるいは適当なプラスミドに
サブクローニングして、塩基配列を決定する。

【００４３】上記のようにして決定されたＣ６ＳＴｃＤ
ＮＡの塩基配列及びこの塩基配列から予想されるアミノ
酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２
に示す。Ｃ６ＳＴｃＤＮＡのオープンリーディングフレ
ームの５’末端部には、２つのイン・フレームのATGコ
ドンが含まれている。 第１番目のATGコドンの周囲の
塩基配列は、真核細胞の翻訳開始部位の共通配列と比較
すると、−３の位置のプリンは保存されていないが、＋
４の位置のＧ（グアニン）が保存されている。このこと
は、効率的な翻訳には、−３の位置にプリンがないとき
は＋４の位置のＧが必須であるというKozakの知見（Koz
ak, M. (1986) Cell, 44, 283-292）を満足している。
また、第２番目のATGコドンの周囲の塩基配列も、−３
の位置がＡ（アデニン）であり、＋４の位置がＧではな
くＡであって、共通配列に部分的に適合しており、いず
れのATGコドンも開始コドンとして機能する可能性があ
る。

【００４４】ところで、β−１，４−ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼは、フレーム内に２つのATGコドンを含
むことが知られている（Nakazawa, K. et al. (1988)
J. Biochem, 104, 165-168、Shaper, N. et al. (1988)
J. Biol. Chem., 263, 10420-10428）。また、Shaper
らは、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ
は、２箇所からの翻訳開始の結果、長いものと短いもの
との両方の形態が合成されることを示している。さら
に、Lopezらは、長い形態のものは原形質膜を優先的に
標的とし、短い形態のものは主としてゴルジ体内に存在
することを示唆する証拠を示している（Lopez, L. et a
l. (1991) J. Biol. Chem., 266, 15984-15991）。同様
に、Ｃ６ＳＴについても、２つのATGコドンは両方とも
開始コドンとして機能する可能性はあるが、定かではな
い。

【００４５】最初のATGコドンで始まる単一のオープン
リーディングフレームからは、458アミノ酸残基からな
り、分子量52193、Ｎ−結合グリコシレーション部位で
ある可能性がある６カ所の部位を有するタンパク質が予
測される。このアミノ酸配列から作成したヒドロパシー
プロット（図４）から、Ｎ−末端から24〜37番目のアミ
ノ酸残基にわたる長さ１４残基の１つの顕著な疎水性部
分が認められ、トランスメンブレン（膜貫通）ドメイン
を有することが予想された。

【００４６】上記のようにして得られるＤＮＡは、この
ＤＮＡによってコードされるＣ６ＳＴが、硫酸基供与体
から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラ
クトサミン残基の６位に転移する活性を実質的に害され
ない限り、１つ又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失
又は挿入を起こすようなヌクレオチドの置換、欠失又は
挿入を有していてもよい。ＤＮＡ配列へのヌクレオチド
の置換、欠失又は挿入は、両末端に制限酵素切断末端を
持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡ
配列の相当する部分と入れ換える事により、導入するこ
とができる。また、部位特異的変異法（Kramer,W. and
Frits,H.J.,Meth. in Enzymol.,154,350(1987); Kunke
l,T.A. et.al.,Meth. in Enzymol.,154,367(1987)）な
どの方法によっても、ＤＮＡ配列に置換、挿入又は欠失
を導入することができる。

【００４７】＜２＞本発明のＣ６ＳＴをコードするＤＮ
Ａの利用 本発明のＤＮＡを保持する細胞を、好適な培地で培養
し、Ｃ６ＳＴを培地中に生成蓄積させ、その培地からＣ
６ＳＴを採取することによって、Ｃ６ＳＴを製造するこ
とができる。本発明のＤＮＡの発現は、通常タンパク質
の製造に用いられる宿主−ベクター系を使用することが
できるが、ＣＯＳ−７細胞等の哺乳類細胞が好ましい。
発現は、本発明のＤＮＡを直接発現させてもよいし、他
のタンパク質との融合タンパク質として発現させてもよ
い。また、本発明のＤＮＡは全長を発現させてもよい
し、一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。部分
ペプチドとしては、配列番号２においてアミノ酸番号５
〜１５４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが挙
げられる。この部分ペプチドをコードするＤＮＡとして
は、配列番号１において塩基番号３２２〜７７１で表さ
れる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。

【００４８】上記のようにして製造されたＣ６ＳＴもし
くはその部分ペプチドまたはこれらと他のタンパク質と
の融合タンパク質を用いて、Ｃ６ＳＴに結合する抗体を
調製することができる。抗体の調製は、通常の抗体の調
製と同様にして行えばよい。また、常法によってＣ６Ｓ
Ｔに結合するモノクローナル抗体を調製することもでき
る。

【００４９】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。 ＜１＞コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼの
調製およびアミノ酸配列分析 （１）コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼの
調製 ニワトリ胚の軟骨細胞を、培養皿に5.6×10⁴個細胞／皿
となるように接種し、２ｇ／ＬのＤ−グルコース、１０
０ユニット／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのスト
レプトマイシン、10％ウシ胎仔血清（FBS）を含むｐＨ
７．０に調整したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中
で、７％CO₂、93％空気、38℃の条件下で11日間培養し
た。培養開始から２、４、７、９、１０日目に、pH7.4
の新鮮な培地に交換した。

【００５０】１０日目に、FBSを60℃で60分加熱して調
製した熱不活化血清を10%含む培地を用いた。１１日目
には5.0×10⁶個細胞／皿にまで生育した。それ以後は、
５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸ナトリウムを添加した
コスメディウム(Cosmedium)−００１（コスモバイオ社
から購入）を用い、毎日培地を交換しながら１０日間培
養を続けた。

【００５１】使用した培地を集め、10,000×gで10分遠
心し、上清の組成が10mM Tris-HCl,pH7.2、0.1％ Trito
n X-100、20mM MgCl₂、10mM 2-メルカプトエタノール、
20％グリセロールとなるように調製した。

【００５２】上記培養上清を、0.15M NaClを含む緩衝液
Ａ(10mM Tris-HCl,pH7.2、0.1％ Triton X-100、20mM M
gCl₂、2mM CaCl₂、10mM 2-メルカプトエタノール、20％
グリセロール)で平衡化したヘパリン−セファロースＣ
Ｌ６Ｂカラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー
社製、2.2×28cm）にアプライした。カラムを0.15M NaC
lを含む緩衝液Ａで洗浄した後、０．１５〜０．７５Ｍ
のＮａＣｌを含む緩衝液Ａの直線グラジエント１Ｌで溶
出し、１２ｍｌ／フラクションで分画した。スルホトラ
ンスフェラーゼ活性を有する分画を集め、0.15MのNaCl
を含む緩衝液Ａで平衡化したコムギ胚芽アグルチニン−
アガロースカラム（生化学工業（株）製、1.2×15cm）
にアプライした。カラムを0.15MのNaClを含む緩衝液Ａ2
00mlで洗浄した後、0.15MのNaCl及び0.3MのＮ−アセチ
ルグルコサミンを含む緩衝液Ａ200mlで溶出した。溶出
分画を集め、0.05MのNaClを含む緩衝液Ａに対して透析
した。

【００５３】上記溶出分画を、0.05MのNaClを含む緩衝
液Ａで平衡化した3',5'-ADP-アガロースカラム（シグマ
社製、1.2×11.8cm、1.9μmol 3',5'-ADP／mlゲル）に
アプライした。カラムを0.05MのNaClを含む緩衝液Ａ150
mlで洗浄した後、０〜0.2mMの3',5'-ADPを含む0.05M Na
Clを含む緩衝液Ａの直線グラジエント300mlで溶出し
た。スルホトランスフェラーゼ活性を有する分画を集
め、1M NaClを含む緩衝液Ａ、続いて0.05M NaClを含む
緩衝液Ａに対して透析した。

【００５４】上記精製工程において、スルホトランスフ
ェラーゼ活性は次のようにして測定した。反応液組成は
以下の通りとした。2.5μmolイミダゾール−塩酸，pH6.
8，1.25μgのプロタミン塩酸、0.1μmolジチオスライト
ール、25nmol（グルクロン酸の量として）のコンドロイ
チン（生化学工業（株））、50pmol[³⁵S]PAPS（アデノ
シン３’-リン酸，５’-ホスホ硫酸）、及び酵素を含む
50μl。

【００５５】基質として種々のグリコサミノグリカンに
対する活性は、コンドロイチンの代わりに、25nmol（コ
ンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸についてはガラク
トサミンの量として、ヘパラン硫酸及びケラタン硫酸に
ついてはグルコサミンの量として）のグリコサミノグリ
カンを用いて測定した。

【００５６】反応液を３７℃で２０分インキュベートし
た後、反応チューブを沸騰水に１分浸けることによって
反応を停止させた。反応停止後、0.1μmol（グルクロン
酸の量として）のコンドロイチン硫酸Ａをキャリアとし
て加え、1.3%酢酸カリウムを含むエタノールを３体積加
えて、³⁵S-標識された多糖類を沈澱させた。混合液を1
0,000×gで10分遠心し、得られた沈澱を70μlの水に溶
解させた。この溶液50μlを0.1M NH₄HCO₃で平衡化した
脱塩カラムに注入し、³⁵S-標識された多糖類を含む溶出
分画を集めた。得られた分画の200μlにシンチレーショ
ンカクテル（クリアゾル(Clearsol)、ナカライテスク社
製）１mlを加え、³⁵S放射活性を測定することにより、
多糖類への³⁵Sの取り込みを測定した。

【００５７】残りの溶液から400μl取り、1.3%酢酸カリ
ウムを含むエタノール800μlを加えて混合した。混合液
を30分氷上に置いた後、10,000×gで10分遠心して³⁵S-
多糖類を沈澱させた。沈澱を0.1mg/mlのBSA、0.05Mトリ
ス−酢酸，pH7.5、10ミリユニットのコンドロイチナー
ゼACII（アースロバクター・アウレッセンス(Arthrobac
ter aurescens)由来、生化学工業(株)）を含む緩衝液25
μlに溶解し、37℃で２時間反応させた。反応物を、0.1
μmolづつの2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-(β-D-グ
ルコ-4-エンピラノシルロン酸)-6-O-スルホ-D-ガラクト
ース（△Di-6S）、及び2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O
-(β-D-グルコ-4-エンピラノシルロン酸)-4-O-スルホ-D
-ガラクトース（△Di-4S）（いずれも生化学工業(株)
製）とともに、ワットマン(Whatman)No.1濾紙にスポッ
トし、1-ブタノール／酢酸／1M 水酸化アンモニウム
（2:3:1(V/V/V)）で20時間展開した。

【００５８】△Di-6S及び△Di-4Sの位置を紫外線ランプ
で調べ、それぞれの部位を濾紙から切り出し、１Ｌのト
ルエンにジフェニルオキサゾール5g、ジメチル１，４−
ビス(2-(5-フェニルオキサゾール))ベンゼン0.25gを溶
解させたシンチレーターに入れ、放射活性を測定した。
コンドロイチナーゼACIIで消化した試料では、濾紙の原
点に残った放射活性はスポットした放射活性の1%以下で
あった。△Di-6S及び△Di-4Sへの³⁵Sの取り込みから、
それぞれコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ
活性及びコンドロイチン４−トランスフェラーゼ活性を
算出した。1pmol硫酸基／分の転移を触媒する活性を１
ユニットとした。その結果、コンドロイチン６−スルホ
トランスフェラーゼの比活性は4.3×10⁵ユニット／mgで
あり、コンドロイチン４−スルホトランスフェラーゼ活
性／コンドロイチン６−トランスフェラーゼ活性の比は
0.02であった。

【００５９】上記のようにして精製されたＣ６ＳＴは、
還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを形成
し、分子量は75,000と決定された。また、スーパロース
12 HR10/30ゲル濾過クロマトグラフィー（溶出液：10mM
Tris-HCl,pH7.2、2M NaCl、20mM MgCl₂、2mM CaCl₂、
0.1% Triton X-100、20％グリセロール）で測定したと
ころ、160,000であった。このことから、2M NaCl存在下
ではダイマーを形成していることが示唆された。

【００６０】様々な基質に対してスルホトランスフェラ
ーゼ活性を測定したところ、上記のようにして得られた
Ｃ６ＳＴは、コンドロイチン、ニワトリ胚軟骨由来のコ
ンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイ
チン硫酸Ｃ、角膜由来のケラタン硫酸には硫酸基を転移
するが、コンドロイチン硫酸Ｅ、デルマタン硫酸、ヘパ
ラン硫酸には硫酸基をわずかにしか転移しないことが示
された。なお、本Ｃ６ＳＴは、ケラタン硫酸の場合、ガ
ラクトース残基の６位に硫酸基を転移することが本発明
者らにより確認されている。

【００６１】また、本Ｃ６ＳＴは、プロタミンおよびMn
Cl₂により活性化された。上記、測定系におけるＣ６Ｓ
Ｔの至適反応ｐＨはおよそ６．４であった。

【００６２】（２）コンドロイチン６−スルホトランス
フェラーゼ（Ｃ６ＳＴ）のアミノ酸配列分析 精製したＣ６ＳＴをＮ−グリカナーゼで消化した。すな
わち、１ｍｌ（タンパク質として１０μｇ）のＣ６ＳＴ
溶液に２００μｌのトリクロロ酢酸を加え、氷上に３０
分置いた後、１０，０００×ｇで２０分遠心分離した。
沈澱を１ｍｌのアセトンで２回洗浄し、真空デシケータ
で乾燥した。乾燥されたＣ６ＳＴタンパク質を０．５％
ＳＤＳを含む０．１５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．８）
１０μｌに溶解し、１００℃で３分加熱した後、冷却
し、５μｌの７．５％（ｗ／ｖ）ノニデットＰ−４０，
１．２μｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８），０．３
μｌのフェニルメタンスルホフォニルフルオライド，１
０．５μｌの水，及び３μｌ（０．７５単位）のリコン
ビナントＮ−グリカナーゼ（ジェンザイム(Genzyme)社
製）を加えた。混合液を３７℃で１２時間インキュベー
トし、脱グリコシル化反応を行った。

【００６３】上記のようにして脱グリコシル化したＣ６
ＳＴ（１０μｇ）、及び完全な（すなわち脱グリコシル
化してない）Ｃ６ＳＴ（２０μｇ）を10％ SDS-PAGEに
付した。なお、タンパク質量0.6μgのＣ６ＳＴについて
のSDS-PAGEの銀染色像を図１に示す。レーン２、３、４
は、Ｎ−グリカナーゼ処理をそれぞれ１時間、２時間、
１２時間行ったものである。完全なＣ６ＳＴはSDS-PAGE
において幅広いバンドを形成した(図１、レーン１）。
これは、この酵素に付着しているＮ−結合したオリゴ糖
の微小不均一性(microheterogeneity)が原因であると思
われる。一方、Ｎ−グリカナーゼでＣ６ＳＴを消化する
と、75kDaのタンパク質のバンドが消失し、２本のシャ
ープなバンド（49kDaと47kDa）が出現した（図１、レー
ン２〜４）。

【００６４】アミノ酸配列分析のためには、SDS-PAGE
後、ゲルを染色せずにポリビニリデンフルオリド(polyv
inylidene fluoride; PVDF)膜に転写した。この膜をク
マシーブルーで染色した。Ｎ−グリカナーゼ消化後のタ
ンパク質のバンド（49および47kDa）および未消化のタ
ンパク質のバンド（75kDa）を膜から切り出して、アミ
ノ酸配列決定に用いた。

【００６５】一方、Ｃ６ＳＴの内部アミノ酸配列を決定
するため、プロテアーゼで部分消化したＣ６ＳＴペプチ
ドの調製を行った。これは、クリーブランドらの方法
（Cleveland, D. W., Fischer, S. G., Kirshner, M.
W., and Laemmli, U. K.(1977)J. Biol. Chem. 252, 11
02-1106）に従って行った。すなわち、精製したタンパ
ク質（30μｇ）を10％ゲルによるSDS-PAGEで分離した。
ゲルをクマシーブルーで染色した後、75kDaのタンパク
質バンドを切り出して、別の16％ゲルのウェルに挿入し
た。このウェルに、プロテアーゼＶ８(protease V8、se
quencing grade,ベーリンガーマンハイム製)を0.05μｇ
／μｇ精製タンパク質の比で含む緩衝液を重層し、SDS-
PAGEを開始した。色素の先端が分離ゲルの端に到達した
時に電源を切った。30分後、電気泳動を再開した。プロ
テアーゼ消化により形成したペプチドは、PVDF膜にトラ
ンスブロットした。この膜をクマシーブルーで染色した
後、19kDaのペプチドバンドを切り出した。

【００６６】上記のようにして調製した、Ｎ−グリカナ
ーゼ消化後に生じたタンパク質、完全なタンパク質、プ
ロテアーゼＶ８消化後に生じたペプチドを各々含むPVDF
フィルターを、宝酒造株式会社（京都）に送り、アミノ
末端のアミノ酸配列の決定を委託した。結果を表１に示
す。

【００６７】

【表１】 表１ ─────────────────────────────── 49-kDaタンパク質 LVIXXXXNNFIXXV （配列番号３） 47-kDaタンパク質 XVIXEXXNNFIXXV （配列番号４） 完全なタンパク質 LVIXEKENNFISRVSDKLKXXPXV （配列番号５） 19-kDaペプチド SFISPAPEEXLTA （配列番号６） ───────────────────────────────

【００６８】＜２＞Ｃ６ＳＴ部分ｃＤＮＡのＰＣＲによ
る増幅 （１）ＰＣＲ用プライマーの作製 上記のようにして決定されたアミノ酸配列に基づいて、
ｃＤＮＡライブラリーからＣ６ＳＴｃＤＮＡクローンを
ＰＣＲにより増幅するためのオリゴヌクレオチドプライ
マーを作製した。オリゴヌクレオチドプライマーは、図
２に示すようにデザインした。２種類のセンスプライマ
ー（プライマー１ｓ（配列番号７）及び２ｓ（配列番号
８））を、完全なＣ６ＳＴタンパク質（75kDa）から得
られたアミノ配列（配列番号５）に基づいて、アンチセ
ンスプライマー（プライマー3a（配列番号９））はプロ
テアーゼ消化で得られたペプチド（19kDa）から得られ
たアミノ酸配列（配列番号６）に基づいて、各々合成し
た。

【００６９】プライマー1sの５’末端にはHindIII認識
配列を含むヌクレオチド配列を、プライマー3aの５’末
端にはEcoRI認識配列を含むヌクレオチド配列を導入し
た。

【００７０】（２）ポリ(A)⁺RNAの調製 全RNAは、公知の方法(Kim, J. J., and Conrad, H. E.
(1976) J. Biol. Chem. 251, 6210-6217、Kim, J. J.,
and Conrad, H. E. (1977) J.Biol. Chem. 252, 8292-8
299、Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1980) J. Biol.
Chem. 255, 1586-1597)で10％ウシ胎仔血清を含むダル
ベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で11日間培養したニワ
トリ胚の軟骨細胞(chondrocyte)から、グアニジンチオ
シアネート／CsCl法(Kingston, R. E., (1991) in Curr
ent Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Uni
t 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Inte
rscience, New York)により調製した。得られた全RNAか
らポリ(A)⁺RNAを、オリゴ(dT)セルロースカラムクロマ
トグラフィーにより精製した。

【００７１】（３）ＰＣＲ反応 上記ポリ(A)⁺RNAを鋳型とし、オリゴヌクレオチド3aを
プライマーとして用いた逆転写反応によりｃＤＮＡ一次
鎖を合成した。逆転写反応は、終体積20μｌに１μｇの
ポリ(A)⁺RNA、50pmolのオリゴヌクレオチド3a、それぞ
れ500μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、2
00単位のM-MLV逆転写酵素(ギブコBRL(Gibco BRL)製)、
１mM ジチオスレイトール、120単位のRNase インヒビタ
ー(宝酒造(株)製)を含む緩衝液を、37℃で60分間インキ
ュベートすることにより行った。

【００７２】ＰＣＲ反応は、上記の逆転写反応混合液10
μｌ、オリゴヌクレオチド1s及び3aをそれぞれ50pmol、
それぞれ100μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リ
ン酸、2.5単位のTaqポリメラーゼ（AmpliTaq polymeras
e、パーキン−エルマー(Perkin-Elmer)製)を含む反応液
（終体積100μｌ）中で行った。増幅反応は、94℃１分
間、45℃１分間、55℃３分間からなる反応サイクルを30
サイクル行った。

【００７３】反応生成物を、アガロース電気泳動に付し
たところ、400及び600bpのＤＮＡ断片が認められた(図
３、レーン１)。これらの増幅産物のうち400bpの生成物
は特異的であると考えられた。なぜならば、プライマー
2s及び3aをプライマーとし、この400bp断片を鋳型とし
たＰＣＲ反応を行うと、鋳型よりもわずかに短い断片が
増幅されたからである(図３、レーン２)。さらに、この
400bp断片の塩基配列決定により、この400bp断片はプラ
イマー2sに相当するヌクレオチド配列がプライマー1sに
相当する配列の近くに存在する465ヌクレオチドを含ん
でいることがわかり、Ｃ６ＳＴタンパク質のｍＲＮＡか
ら増幅されたことが証明された。

【００７４】＜３＞Ｃ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡの取得 （１）ハイブリダイゼーション用プローブの作製 また、上記400bp増幅断片（図３中、矢印で示した）を
ゲルから回収し、HindIIIおよびEcoRIで消化し、プラス
ミドベクターであるブルースクリプト(Bluescript、ス
トラタジーン(Stratagene)製)のこれらの制限酵素切断
部位にサブクローニングした。サブクローンはＴ３プラ
イマー(T3 primer)もしくはM13-20プライマーを用いた
配列決定により確認した。

【００７５】cDNAライブラリースクリーニングのための
放射性プローブは、上記のＰＣＲ生成物を、［α-³²P］
dCTP（アマシャム(Amersham)製）およびDNAランダムラ
ベリングキット（宝酒造（株）製）を用いたランダムオ
リゴヌクレオチドプライムドラベリング法(random olig
onucleotide-primed labeling method(Feinberg, A.P.,
and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6-1
3)を用いて放射性標識することによって得た。

【００７６】（２）ｃＤＮＡライブラリーの構築 次に、Ｃ６ＳＴのコード領域全長を含むｃＤＮＡを得る
ために、ラムダベクターλｇｔ１１を用いてｃＤＮＡク
ローニングを行った。

【００７７】前記＜２＞（２）と同様にして、ニワトリ
胚の軟骨細胞(chondrocyte)からポリ(A)⁺RNAを調製し、
これを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成し、EcoRI消化
したλｇｔ１１(EcoRI-digested λｇｔ１１、ファルマ
シア(Pharmacia)社製)に連結した。ｃＤＮＡの合成とベ
クターへの連結には、ｃＤＮＡ合成キット（TimeSaver
cDNA synthesis kit、ファルマシア社製)を使用した。
逆転写反応のプライマーには、ランダムオリゴヌクレオ
チドプライマーを用いた。

【００７８】ｃＤＮＡが挿入された組換えファージベク
ターは、インビトロパッケージングキット（Gigapack I
I packaging extract、ストラタジーン製）を用いてフ
ァージ粒子にパッケージした。このファージ粒子を、Es
cherichia coli Y1088に感染させ、プレートに重層し、
プラークを形成させた。こうして得られたファージライ
ブラリーはさらに増幅させることなしに、cDNAスクリー
ニングに用いた。

【００７９】（３）Ｃ６ＳＴｃＤＮＡクローンのスクリ
ーニング 上記のようにして得られたλｇｔ１１cDNAライブラリー
のプラーク約５×10⁵個について、スクリーニングを行
った。プラークを市販のナイロン膜(Hybond N⁺nylon me
mbrane、アマシャム社製)に転写し、製品に添付されて
いる説明書中で推奨されているアルカリ固定法によりフ
ァージＤＮＡをナイロン膜に固定した。

【００８０】ファージＤＮＡを固定した膜を、50％ホル
ムアミド、５×SSPE（１×SSPEの組成：10mM NaH₂PO₄(p
H7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA）、５×Denhardt's solu
tion（１×Denhardt's solutionの組成：0.02%フィコー
ル４００、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02% BSA）、
0.5％ SDS、0.04mg／mlの変性サケ***DNA、0.004mg／m
lの E. coli DNAを含む溶液中で、3.5時間、42℃でプレ
ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、³²Ｐ
標識したプローブを含む上記と同じ緩衝液中で16時間、
42℃で行った。続いて、フィルターを１×SSPE、0.1％
SDS中、次いで0.1×SSPE、0.1％ SDS中で、55℃で洗浄
した後、オートラジオグラフィーによりハイブリダイゼ
ーション陽性クローンを検出した。５×10⁵個のプラー
クから約90個の陽性クローンが得られた。

【００８１】（４）Ｃ６ＳＴｃＤＮＡの塩基配列解析 ハイブリダイゼーション陽性λｇｔ１１クローンから16
個の独立クローンを選択し、各々ファージＤＮＡを調製
し、ベクターＤＮＡからcDNA挿入断片を単一断片で切り
出すEcoRIで切断した。これらのｃＤＮＡ断片をブルー
スクリプトにサブクローニングした。これらのｃＤＮＡ
断片のうち、もっとも長い断片(2.3kb)のヌクレオチド
配列を決定した。

【００８２】ブルースクリプトにｃＤＮＡをサブクロー
ニングした組換えプラスミドから、欠失クローンをDNA
deletion kit（宝酒造（株）製）を用いて既知の方法(H
enikoff, S.(1984) Gene 28, 351-359、Yanisch-Perro
n, C., Viera, J., and Messing, J. (1985) Gene 33,
103-109)により調製した。その際、3'-突出末端を残す
制限酵素、及び5'-突出末端を残す制限酵素として、そ
れぞれSacI及びXbaIを用いた。

【００８３】得られた欠失クローンを用いて、［α-³²
Ｐ］dCTP及びＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（Sequenase、U.
S.バイオケミカル(U.S. Biochemical)製)を用いたジデ
オキシチェーンターミネーション法(Sanger, F., Nickl
ens, S., and Coulson, A. R.(1977) Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467)により、両方の鎖のヌ
クレオチド配列を独立に決定した。こうして決定された
Ｃ６ＳＴ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および予測され
るアミノ酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列のみを配
列番号２に示す。

【００８４】決定されたDNA配列について、ジーンワー
クス コンピュータープログラム(Gene Works computer
programs、インテリジェネティクス(IntelliGenetics)
製)を用いて解析した。Ｃ６ＳＴｃＤＮＡのオープンリ
ーディングフレームの５’末端部には、２つのイン・フ
レームのATGコドンが含まれている。最初のATGコドンで
始まる単一のオープンリーディングフレーム(open read
ing frame)からは、458アミノ酸残基からなり、分子量5
2193、Ｎ−結合グリコシレーション部位である可能性が
ある６カ所の部位を有するタンパク質が予測される。

【００８５】トランスメンブレン（膜貫通）ドメインを
有するか否か、あるとすればその位置を決定するため
に、予想アミノ酸配列からヒドロパシープロットを作成
した（図４）。ヒドロパシープロットは、、Kyteらの方
法（Kyte, J. and Doolittle,R. F., (1982) J. Mol. B
iol. 157, 105-132）により、１１アミノ酸のウィンド
ウで計算した。プロットの解析からアミノ末端部位に、
Ｎ−末端から24〜37番目のアミノ酸残基に渡る長さ１４
残基の１つの顕著な疎水性部分が認められ(図４)、トラ
ンスメンブレンドメイン（配列番号２においてアミノ酸
番号−１０〜４）であると推定された。精製された完全
なＣ６ＳＴのアミノ末端アミノ酸配列は、この膜貫通ド
メイン中に認められた。トランスメンブレンドメインで
切ったタンパク質の分子量は47885と計算され、これは
Ｎ−グリカナーゼ消化後に形成されたタンパク質の分子
量によく一致する。精製タンパク質から得られた全ての
アミノ酸配列は、予測されたタンパク質の配列中に見ら
れ、ｃＤＮＡクローンがＣ６ＳＴをコードすることが確
認された。また、Ｃ６ＳＴは前駆体として発現され、膜
透過の際にＮ−末端部が除去され、425アミノ酸残基か
らなる成熟タンパク質が生成すると考えられた。

【００８６】＜４＞Ｃ６ＳＴｃＤＮＡの発現 （１）Ｃ６ＳＴ発現プラスミドの構築 Ｃ６ＳＴｃＤＮＡを発現させるために、発現ベクターに
ｃＤＮＡ断片を挿入し、組換えプラスミドを構築した。
発現ベクターには、哺乳類細胞用発現ベクターｐＣＸＮ
２（東京大学の宮崎純一博士により構築され(Niwa, H.,
Yamamura, K.,and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 19
3-200)、東京都臨床医学総合研究所の橋本康弘博士より
恵与された）を用いた。ｐＣＸＮ２は、ストレプトマイ
シン耐性遺伝子及びペニシリン耐性遺伝子を有し、EcoR
I部位に挿入されたＤＮＡ断片をβ−アクチン遺伝子プ
ロモーターにより発現させることができるベクターであ
る。ｐＣＸＮ２のEcoRI部位へ2354bpのcDNA断片（配列
番号１）を連結させた。E. coli JM109を、この連結反
応液を用いて形質転換し、アンピシリンを含むLBプレー
トに塗布した。形質転換体から組換えプラスミドを回収
し、３回のCsCl／エチジウムブロマイド平衡遠心により
精製した。ベクターのプロモーターの向きとｃＤＮＡの
向きが一致している組換えプラスミドをｐＣＸＮＣ６Ｓ
Ｔ、ｃＤＮＡが逆向きに挿入されている組換えプラスミ
ドをｐＣＸＮＣ６ＳＴ２と名付けた。ｃＤＮＡの向き
は、BamHIを用いた制限マッピングにより解析した。

【００８７】（２）ＣＯＳ−７細胞中でのＣ６ＳＴｃＤ
ＮＡのトランジェント（一過性）な発現 Ｃ６ＳＴｃＤＮＡの発現の宿主にはＣＯＳ−７細胞を用
いた。ＣＯＳ−７細胞（理研細胞バンク(筑波)から入手
した）を８×10⁵細胞／皿の密度で直径100mmの培養皿に
まいた。培養液には、ペニシリン(100単位／ml)、スト
レプトマイシン(50μｇ／ml)及び10％ウシ胎仔血清(ギ
ブコBRL製）を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)
を培養皿１枚当たり10ml用い、５％CO₂、95％空気中で3
7℃で培養した。

【００８８】細胞密度が３×10⁶細胞／皿に達したとき
(培養48時間後)、ＣＯＳ−７細胞をｐＣＸＮＣ６ＳＴも
しくはｐＣＸＮＣ６ＳＴ２でトランスフェクトした。ト
ランスフェクションは、DEAE-デキストラン法(Aruffo,
A.(1991) in Current Protocols in Molecular Biolog
y, Suppl. 14, Unit 16.13, Greene Publishing Associ
ates and Wiley Interscience, New York)により行っ
た。10％のNu serum（低タンパク質濃度の血清代用品：
コラボレーティブ・バイオメディカル・プロダクツ(Col
laborative Biomedical Products)）を含む予め加温し
ておいた５mlのDMEMを、10mg／ml DEAE-デキストランと
2.5mMクロロキン(chloroquine)溶液を含む0.2ml のＰＢ
Ｓ(リン酸緩衝生理食塩水）と混合した。この溶液と15
μｇの組換えプラスミドを混合し、その混合液を細胞懸
濁液に添加した。

【００８９】上記細胞を、CO₂インキュベーター中で４
時間インキュベートした後、培養液を５mlの10％ジメチ
ルスルホキシド(DMSO)を含むＰＢＳ溶液で置換した。こ
の細胞を室温で２分間放置した後、ジメチルスルホキシ
ド溶液をアスピレートにより除去し、ペニシリン(100単
位／ml)、ストレプトマイシン(50μｇ／ml)及び10％ウ
シ胎仔血清を含む25mlのDMEMを加えた。この細胞を67時
間インキュベートした後、DMEMのみで洗浄した。細胞を
集めて、培養皿１枚分の細胞当たり1.5mlの0.25M スク
ロース、10mM Tris-HCl,pH7.2、及び0.5％ Triton X-10
0中でダウンスホモジナイザー(Dounce homogenizer)に
よりホモジナイズした。得られたホモジネートを10,000
×ｇで20分間遠心し、上清分画中のＣ６ＳＴ活性、コン
ドロイチン４−スルホトランスフェラーゼ（Ｃ４ＳＴ）
活性及びケラタン硫酸スルホトランスフェラーゼ（ＫＳ
ＳＴ）活性を測定した。これらの活性は、硫酸基受容体
としてのコンドロイチンまたはケラタン硫酸の存在下ま
たは非存在下で測定した。また、発現プラスミドでトラ
ンスフェクトしてないＣＯＳ−７細胞についても同様に
行った。結果を表２に示す。

【００９０】

【表２】 表２ ──────────────────────────────────── プラスミド Ｃ６ＳＴ活性 Ｃ４ＳＴ活性 ＫＳＳＴ活性 受容体(-) 受容体(+) 受容体(-) 受容体(+) 受容体(-) 受容体(+) ──────────────────────────────────── (pmol/分/mgタンハ゜ク) なし 0.3±0.1 1.4±0.2 <0.1 0.2±0.1 <0.1 0.5±0.2 pCXNC6ST2 0.4±0.1 1.7±0.3 <0.1 0.3±0.1 <0.1 0.3±0.1 pCXNC6ST 4.3±0.8 40.4±3.0 <0.1 0.3±0.1 <0.1 4.6±0.2 ────────────────────────────────────

【００９１】表に示したように、上記で単離されたｃＤ
ＮＡを正しい方向で発現させる発現ベクターを保持する
細胞のＣ６ＳＴ活性及びＫＳＳＴ活性は、ｃＤＮＡが逆
向きに挿入された発現ベクターを保持する細胞のそれぞ
れ約20倍、約15倍であった。これに対して、トランスフ
ェクション細胞のＣ４ＳＴ活性は増加しなかった。これ
らの結果から、単離されたｃＤＮＡがＣ６ＳＴ活性を持
つタンパク質をコードしていることが証明された。

【００９２】＜５＞Ｃ６ＳＴに反応する抗体の調製 （１）Ｃ６ＳＴ融合ペプチドの調製 配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号５
のGluからアミノ酸番号１５４のIleまでの150アミノ酸
残基をコードするDNA断片（配列番号１において塩基番
号３２２〜７７１）を、上記＜２＞（３）に示したpoly
(A)⁺RNAからＰＣＲにより増幅された465bpのDNA断片と
同様にして得た。尚、Glu⁵から始まるセンスプライマー
にはBamHI部位を、Ile¹⁵⁴から始まるアンチセンスプラ
イマーにはEcoRI部位を含む配列を導入した。

【００９３】ＰＣＲ反応は、94℃１分間、45℃２分間、
及び72℃２分間からなるサイクルを30サイクル行った。
ＰＣＲ生成物を、EcoRI及びBamHIで消化し、pRSET Aプ
ラスミド(インビトロジェン(Invitrogen)製)のこれらの
部位へサブクローニングした。pRSET Aは、挿入断片が
コードするペプチドとヒスチジン（His）６個を含むリ
ーダーペプチドとの融合ペプチドをＴ７プロモーターの
制御下に発現するプラスミドである。

【００９４】E. coli DE3を得られた組換えプラスミド
でトランスフェクトし、融合ペプチドを産生させた。融
合ペプチドは、Ni²⁺をチャージしたレジンアフィニティ
ーカラム（ProBond Resin、インビトロジェン製）を用
い、製品に添付された説明書に記載の方法にしたがって
精製した。精製された融合ペプチドに混在するタンパク
質の最終的な除去は、15％ SDS-PAGEにより行った。22k
Daの融合ペプチドを、150mM NaCl、100mM EDTA、0.1％
SDS、及び５mM ジチオスレイトールを含む50mMTris-HC
l,pH8.0により、泳動後のポリアクリルアミドゲルから
溶出させ、５倍容量のアセトンで沈澱させた。

【００９５】（２）融合ペプチドに対する抗体の調製 上記融合ペプチドの沈澱を、６M グアニジン塩酸、150m
M NaCl、0.1mM EDTA、0.1％ Nonidet P-40、及び１mM
ジチオスレイトールを含む50mM Tris-HCl,pH8.0に溶解
し、ＰＢＳに対して透析した。透析した融合ペプチド溶
液をマウスに腹腔内注射した。２回の追加注射(boost i
njections)後に、ポリクローナル抗体（抗血清）を得
た。

【００９６】（３）抗体のアッセイ及び軟骨細胞培養液
中のＣ６ＳＴの検出 上記で得られた抗血清を、イムノブロッティングにより
アッセイした。無血清培地で培養した軟骨細胞培養液中
のタンパク質、精製したＣ６ＳＴ及び上記の22kDaの融
合ペプチドを、Laemmliの方法(Laemmli, U.K. (1970) N
ature 227, 680-685)に従って12％ SDS-PAGEに付し、ニ
トロセルロースフィルターに転写した。タンパク質のバ
ンドをアミドブラックで染色し、視覚化した。また、イ
ムノブロッティングの場合は、フィルターをブロッキン
グした後、上記で得られた抗血清希釈液(1:1000)を加え
てインキュベートした。フィルターに結合した抗体は、
ペルオキシダーゼ結合抗マウスイムノグロブリンヤギIg
G（カッペル(Cappel)製）を２次抗体として用いた酵素
免疫測定法により視覚化した。

【００９７】図５に、アミドブラックによる染色の結果
（レーン４〜６）、及びイムノブロッエィングの結果
（レーン１〜３）を示す。前記22kDaの融合ペプチドに
対して作製されたポリクローナル抗体は、融合ペプチド
及び75kDaの精製Ｃ６ＳＴに交叉反応(cross-react)した
(図５、レーン２、３)。

【００９８】上記抗体は、軟骨細胞の培養液中に含まれ
るタンパク質には反応しなかった(レーン１)。この結果
は、おそらく培養液中のＣ６ＳＴが微量であることによ
ると思われる。

【００９９】（４）Ｃ６ＳＴのイムノプレシピテーショ
ン 22kDaの融合ペプチドに対するマウス抗血清（３μｌ）
を、23ngの精製Ｃ６ＳＴを含む31μｌの緩衝液Ｂ(10mM
Tris-HCl,pH7.2、130mM NaCl、10mM MgCl₂、2mM CaC
l₂、0.1％ Triton X-100、20％グリセロール)に加え
た。この混合物を、４℃で一晩インキュベートした後、
６μｌの抗マウスIgGウサギIgG（カッペル製）を加え
た。１時間、０℃でさらにインキュベーションした後、
その反応混合物を緩衝液Ｂで平衡化した20μｌの50％(v
/v)プロテイン Ａ−セファロース(proteinA-Sepharos
e、ファルマシア製)の懸濁液と混合し、30分間、４℃で
振盪した。プロテイン Ａ−セファロース上の免疫複合
体を遠心で除去し、上清溶液中に残っているＣ６ＳＴ活
性を測定した。コントロールとして、融合ペプチドで免
疫してない血清を用い、あるいは血清を加えずに、上記
と同様の操作を行った。結果を表３に示す。

【０１００】

【表３】

【０１０１】表に示されるように、抗融合ペプチド血清
を精製Ｃ６ＳＴ溶液に添加し、抗体−Ｃ６ＳＴ免疫複合
体を除去すると、大部分のＣ６ＳＴ活性は可溶性画分か
らなくなった。この結果からも、22kDa融合ペプチドは
Ｃ６ＳＴと免疫的に区別できないアミノ酸配列を含んで
いることが明らかであり、単離されたｃＤＮＡがＣ６Ｓ
Ｔタンパク質をコードしていることが確認された。

【０１０２】（５）ニワトリの軟骨細胞poly(A)RNA⁺の
ノーザンブロットによるＣ６ＳＴ発現の解析 ニワトリの軟骨細胞(chondrocytes)から上記と同様にし
て調製したpoly(A)⁺RNA ５μｇを、50％(v/v)ホルムア
ミド、５％(v/v)ホルムアルデヒド、20mM MOPS,pH7.0中
で65℃で10分間変性させ、５％(v/v)ホルムアルデヒド
を含む1.2％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜
（Hybond N⁺、アマシャム製)へ一晩転写した。80℃、２
時間の焼き付けによってＲＮＡを固定した膜を、50％ホ
ルムアミド、５×SSPE、５×Denhardt's solution、0.5
％ SDS、及び0.1mg／mlの変性したサケ***DNAを含む溶
液中で３時間、42℃でプレハイブリダイズした。この膜
を^{3 2}Ｐ−標識したプローブを含む同じ緩衝液中に浸し、
14時間、42℃でインキュベートしてハイブリダイゼーシ
ョンを行った。³²Ｐ−標識プローブは、上述したcDNAラ
イブラリースクリーニングに用いたプローブと同じもの
を使用した。この後、フィルターを６５℃で、２×SSP
E、0.1％ SDS中、次いで１×SSPE、0.1％ SDS中で洗浄
した。この膜を、増感スクリーンを用いてＸ線フィルム
に26時間、−80℃で露光させた。その結果、図６に示す
ように、5.8、4.5、3.2、及び2.5kbの関連したサイズの
４つのバンドが得られた。

【０１０３】

【発明の効果】本発明により、コンドロイチンのN-アセ
チルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移するコン
ドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ（Ｃ６ＳＴ）
をコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片
から発現されるポリペプチド、および該ポリペプチドと
反応する抗体が得られる。本発明により、Ｃ６ＳＴをコ
ードするＤＮＡが得られたので、Ｃ６ＳＴを工業的に使
用可能な程度まで大量生産できることが期待される。

【０１０４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：2354 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ニワトリ 組織の種類：胚軟骨細胞 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：211..1584 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：sig_peptide 存在位置：211..309 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：mat_peptide 存在位置：310..1584 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：transmembrane domain 存在位置：280..321 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：potential N-glycosilation site 存在位置：394..402 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：potential N-glycosilation site 存在位置：427..435 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：potential N-glycosilation site 存在位置：493..501 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：potential N-glycosilation site 存在位置：916..924 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：potential N-glycosilation site 存在位置：1405..1413 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：potential N-glycosilation site 存在位置：1537..1545 特徴を決定した方法：S 配列 CCGTGAAGAA AAGCAGGGCC CCCGCCGCCC GCCCCGCCGC ACCGCACGAC CGGGCCCTCG 60 CGGGCCAGAA CCACCTGGGA AGGGATGCTG CGGGACGGCA GGTGCCCTGC AGATAGCCCA 120 GGGCATCAGG TGCCTGCCTG GGGGATCCTC TGAGGACAAC ATGGACATGC AGAGGACACA 180 AAAGGTGTAG CTCCCTCACT CACCGTCCCA ATG GAG AGG AGA TCA GCT TTG CCC 234 Met Glu Arg Arg Ser Ala Leu Pro -33 -30 CAG GAT TTT CGG GAG GTG CTG CAC TGC CTG AAG ATG AGG AGC AAG TAT 282 Gln Asp Phe Arg Glu Val Leu His Cys Leu Lys Met Arg Ser Lys Tyr -25 -20 -15 -10 GCC GTG CTG CTG GTG TTC GTG GTG GGG CTA GTC ATC ATC GAG AAG GAA 330 Ala Val Leu Leu Val Phe Val Val Gly Leu Val Ile Ile Glu Lys Glu -5 1 5 AAC AAC TTC ATC TCC AGG GTG TCG GAC AAG CTG AAG CAA TCC CCG CAG 378 Asn Asn Phe Ile Ser Arg Val Ser Asp Lys Leu Lys Gln Ser Pro Gln 10 15 20 GTG CTG CCG GAG GCC AAC GAG ACA GAG GCC AGC CCA GTG CAG GCT GAG 426 Val Leu Pro Glu Ala Asn Glu Thr Glu Ala Ser Pro Val Gln Ala Glu 25 30 35 AAC GGG TCT CTG GCC TCA CTG CGG CAG CTG GAC ACA GCC TTC TCA CAG 474 Asn Gly Ser Leu Ala Ser Leu Arg Gln Leu Asp Thr Ala Phe Ser Gln 40 45 50 55 CTG AGG ACG CGG CTG CGC AAC GTC ACC TTG CAG TTG GCT GGG GAG CTG 522 Leu Arg Thr Arg Leu Arg Asn Val Thr Leu Gln Leu Ala Gly Glu Leu 60 65 70 GGC ATA GCA GCC CCA GAG CCG CGG CGG CAT GTC CTG CTG ATG GCC ACC 570 Gly Ile Ala Ala Pro Glu Pro Arg Arg His Val Leu Leu Met Ala Thr 75 80 85 ACA CGC ACC GGC TCC TCC TTC GTT GGG GAG TTC TTC AAC CAG CAG GGC 618 Thr Arg Thr Gly Ser Ser Phe Val Gly Glu Phe Phe Asn Gln Gln Gly 90 95 100 AAC ATA TTC TAC CTC TTT GAG CCC CTG TGG CAC ATC GAG AGG ACG GTC 666 Asn Ile Phe Tyr Leu Phe Glu Pro Leu Trp His Ile Glu Arg Thr Val 105 110 115 ACT TTT GAG CCA GGG GGG GCC AAC GCG GTG GGC TCG GCC CTG GTG TAC 714 Thr Phe Glu Pro Gly Gly Ala Asn Ala Val Gly Ser Ala Leu Val Tyr 120 125 130 135 CGC GAC GTG CTG CAG CAG CTC CTC CTC TGC GAC CTC TAC ATT CTG GAG 762 Arg Asp Val Leu Gln Gln Leu Leu Leu Cys Asp Leu Tyr Ile Leu Glu 140 145 150 AGC TTC ATC TCA CCA GCG CCC GAG GAG CAC CTA ACT GCT GCC CTG TTC 810 Ser Phe Ile Ser Pro Ala Pro Glu Glu His Leu Thr Ala Ala Leu Phe 155 160 165 CGG CGG GGC TCC AGC CAC TCA CTC TGT GAG GAG CCC GTC TGC ACA CCC 858 Arg Arg Gly Ser Ser His Ser Leu Cys Glu Glu Pro Val Cys Thr Pro 170 175 180 AGC CTC AAG AAG GTC TTT GAG AAG TAC CAC TGC AAG AAC CGC CGC TGC 906 Ser Leu Lys Lys Val Phe Glu Lys Tyr His Cys Lys Asn Arg Arg Cys 185 190 195 GGG CCT CTC AAC ATC ACG CTG GCA GCT GAA GCA TGC CGG CGC AAG CAG 954 Gly Pro Leu Asn Ile Thr Leu Ala Ala Glu Ala Cys Arg Arg Lys Gln 200 205 210 215 CAC ATG GCC TTG AAG ACG GTG CGC ATC CGG CAG CTG GAG TTC CTG CAG 1002 His Met Ala Leu Lys Thr Val Arg Ile Arg Gln Leu Glu Phe Leu Gln 220 225 230 CCC CTG GCC GAG GAC CCG CGG CTG GAC CTG CGC ATT ATC CAG CTG GTG 1050 Pro Leu Ala Glu Asp Pro Arg Leu Asp Leu Arg Ile Ile Gln Leu Val 235 240 245 CGG GAC CCA CGT GCC GTG CTG GTG TCG CGC ATG GTG GCC TTC TCG GGC 1098 Arg Asp Pro Arg Ala Val Leu Val Ser Arg Met Val Ala Phe Ser Gly 250 255 260 AAG TAC GAG AGC TGG AAG AAG TGG GCG GCC GAG GGG GAG GCC CCG CTG 1146 Lys Tyr Glu Ser Trp Lys Lys Trp Ala Ala Glu Gly Glu Ala Pro Leu 265 270 275 CAG GAG GAC GAG GTG CAA CGG CTG CGG GGC AAC TGC GAG AGC ATC CGG 1194 Gln Glu Asp Glu Val Gln Arg Leu Arg Gly Asn Cys Glu Ser Ile Arg 280 285 290 295 CTG TCG GCC GAG CTG GGA CTG CGG CAG CCG CGC TGG CTG CGA GGC CGT 1242 Leu Ser Ala Glu Leu Gly Leu Arg Gln Pro Arg Trp Leu Arg Gly Arg 300 305 310 TAC ATG CTG GTG CGC TAC GAG GAC GTG GCA CGG GCG CCG CTG CGC AAG 1290 Tyr Met Leu Val Arg Tyr Glu Asp Val Ala Arg Ala Pro Leu Arg Lys 315 320 325 GCG CTG GAG ATG TAC CGC TTC GCC GGC ATC CAC CCC ACG CCA CAG GTG 1338 Ala Leu Glu Met Tyr Arg Phe Ala Gly Ile His Pro Thr Pro Gln Val 330 335 340 GAG GAG TGG ATC CGC GCC AAC ACG CAG GCA CCA CAG GAC AGC AAC GGC 1386 Glu Glu Trp Ile Arg Ala Asn Thr Gln Ala Pro Gln Asp Ser Asn Gly 345 350 355 ATT TAC TCC ACG CAG AAG AAC TCC TCG GAG CAG TTT GAG AAG TGG CGG 1434 Ile Tyr Ser Thr Gln Lys Asn Ser Ser Glu Gln Phe Glu Lys Trp Arg 360 365 370 375 TTC AGC ATC CCC TTC AAG CTG GCG CAG GTG GTG CAG GAC GCC TGC GAG 1482 Phe Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ala Gln Val Val Gln Asp Ala Cys Glu 380 385 390 CCA GCC ATG AGG CTC TTT GGC TAC AAG CTG GCC AGC AGT GCC CAG GAG 1530 Pro Ala Met Arg Leu Phe Gly Tyr Lys Leu Ala Ser Ser Ala Gln Glu 395 400 405 CTG ACC AAC CGC TCG CTC AGC CTG CTG GAG GAG GGG CCC CCC ACA CGG 1578 Leu Thr Asn Arg Ser Leu Ser Leu Leu Glu Glu Gly Pro Pro Thr Arg 410 415 420 ATC ACG TAGTGTGGCA CCGCTGCCCC CGTATGCCCG GCCGGCCCGA GGTGACCCTG 1634 Ile Thr 425 TGCCATGGAC TAGGAACCGG GGTGTCCTCG CAATAGCGAT GGGTTCTTGG GAAGGGCGAT 1694 CAGGAGATGG CACAGGGATG CTGCGGCAGA GGGGTGAAGC TGTTTAGTTC CTCTCCCGAT 1754 GGAAGGATGA GACCCTGCGA TTGAAAACCC AAGCACAGTG GGTGCCCAGA GCCCTGAGCA 1814 CAACCTGACC CGTGTGCCAG CTCCAGCGGT GCCTTCTCAT TTCTGCAGAG GGCCATTGAG 1874 CGAAGCACAG GAGAACTGGA ATTTGCAGCC AGGAATCCAT AGCCACAACC AGGGGACAAT 1934 TTACTGGGAG TGTTCAGCGA TCTGGAGGTT TTCCAGTGCC ACCAAACACA ATGAGCACTC 1994 CTGGGTGGAC TCCAGCACGG GAAGCAGTGT CGTTGCCCCA TGGGCACATG CTCTCTGCGT 2054 TTTCCAGTGT TGTGCAACGA GTGCCAGCAG CATGGTGTGC CAGCACCAGC AGGGACTTCA 2114 ACCTCAAAGG CCTTCTGGTT TAGTGCCTTG GTACCAGCAC AGACTGGGAG CTGCCTGCAG 2174 CAGGACGAGG CGGCCCCTCA GTTATTGCTC TGCAGTGCTG ATTGTTGGGT GTGTGGGGGG 2234 GTCCTTTTGA TTTATTTTCT ACATTTTTCT CTGTGTACCG GGGTTGTGGA GCAAATTTAT 2294 TTATTTATTA TGTTTAAAAC AACAAAGGCA AAGGAGGGGG TGGGGGGAAG ATACATCAGG 2354

【０１０５】配列番号：２ 配列の長さ：458 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Arg Arg Ser Ala Leu Pro Gln Asp Phe Arg Glu Val Leu His -33 -30 -25 -20 Cys Leu Lys Met Arg Ser Lys Tyr Ala Val Leu Leu Val Phe Val Val -15 -10 -5 Gly Leu Val Ile Ile Glu Lys Glu Asn Asn Phe Ile Ser Arg Val Ser 1 5 10 15 Asp Lys Leu Lys Gln Ser Pro Gln Val Leu Pro Glu Ala Asn Glu Thr 20 25 30 Glu Ala Ser Pro Val Gln Ala Glu Asn Gly Ser Leu Ala Ser Leu Arg 35 40 45 Gln Leu Asp Thr Ala Phe Ser Gln Leu Arg Thr Arg Leu Arg Asn Val 50 55 60 Thr Leu Gln Leu Ala Gly Glu Leu Gly Ile Ala Ala Pro Glu Pro Arg 65 70 75 Arg His Val Leu Leu Met Ala Thr Thr Arg Thr Gly Ser Ser Phe Val 80 85 90 95 Gly Glu Phe Phe Asn Gln Gln Gly Asn Ile Phe Tyr Leu Phe Glu Pro 100 105 110 Leu Trp His Ile Glu Arg Thr Val Thr Phe Glu Pro Gly Gly Ala Asn 115 120 125 Ala Val Gly Ser Ala Leu Val Tyr Arg Asp Val Leu Gln Gln Leu Leu 130 135 140 Leu Cys Asp Leu Tyr Ile Leu Glu Ser Phe Ile Ser Pro Ala Pro Glu 145 150 155 Glu His Leu Thr Ala Ala Leu Phe Arg Arg Gly Ser Ser His Ser Leu 160 165 170 175 Cys Glu Glu Pro Val Cys Thr Pro Ser Leu Lys Lys Val Phe Glu Lys 180 185 190 Tyr His Cys Lys Asn Arg Arg Cys Gly Pro Leu Asn Ile Thr Leu Ala 195 200 205 Ala Glu Ala Cys Arg Arg Lys Gln His Met Ala Leu Lys Thr Val Arg 210 215 220 Ile Arg Gln Leu Glu Phe Leu Gln Pro Leu Ala Glu Asp Pro Arg Leu 225 230 235 Asp Leu Arg Ile Ile Gln Leu Val Arg Asp Pro Arg Ala Val Leu Val 240 245 250 255 Ser Arg Met Val Ala Phe Ser Gly Lys Tyr Glu Ser Trp Lys Lys Trp 260 265 270 Ala Ala Glu Gly Glu Ala Pro Leu Gln Glu Asp Glu Val Gln Arg Leu 275 280 285 Arg Gly Asn Cys Glu Ser Ile Arg Leu Ser Ala Glu Leu Gly Leu Arg 290 295 300 Gln Pro Arg Trp Leu Arg Gly Arg Tyr Met Leu Val Arg Tyr Glu Asp 305 310 315 Val Ala Arg Ala Pro Leu Arg Lys Ala Leu Glu Met Tyr Arg Phe Ala 320 325 330 335 Gly Ile His Pro Thr Pro Gln Val Glu Glu Trp Ile Arg Ala Asn Thr 340 345 350 Gln Ala Pro Gln Asp Ser Asn Gly Ile Tyr Ser Thr Gln Lys Asn Ser 355 360 365 Ser Glu Gln Phe Glu Lys Trp Arg Phe Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ala 370 375 380 Gln Val Val Gln Asp Ala Cys Glu Pro Ala Met Arg Leu Phe Gly Tyr 385 390 395 Lys Leu Ala Ser Ser Ala Gln Glu Leu Thr Asn Arg Ser Leu Ser Leu 400 405 410 415 Leu Glu Glu Gly Pro Pro Thr Arg Ile Thr 420 425

【０１０６】配列番号：３ 配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Val Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Asn Phe Ile Xaa Xaa Val 1 5 10

【０１０７】配列番号：４ 配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：ペプチド 配列 Xaa Val Ile Xaa Glu Xaa Xaa Asn Asn Phe Ile Xaa Xaa Val 1 5 10

【０１０８】L配列番号：５ 配列の長さ：24 配列の型：アミノ酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Val Ile Xaa Glu Lys Glu Asn Asn Phe Ile Ser Arg Val Ser Asp 1 5 10 15 Lys Leu Lys Xaa Xaa Pro Xaa Val 20

【０１０９】配列番号：６ 配列の長さ：13 配列の型：アミノ酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Phe Ile Ser Pro Ala Pro Glu Glu Xaa Leu Thr Ala 1 5 10

【０１１０】配列番号；７ 配列の長さ：28 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAAAGCTTGA RAARGARAAY AAYTTYAT 28

【０１１１】配列番号：８ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 MGKGTKWSKG AYAARCTNAA 20

【０１１２】配列番号：９ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AARTADWSKG GKCGKGGKCT TCTTAAGCT 29

【図面の簡単な説明】

【図１】 精製されたＣ６ＳＴ及びＮ−グリカナーゼ消
化したＣ６ＳＴの電気泳動写真。レーン１は完全なＣ６
ＳＴ、レーン２、３、４は、Ｎ−グリカナーゼでそれぞ
れ１時間、２時間、１２時間消化したＣ６ＳＴ。

【図２】 Ｃ６ＳＴ部分アミノ酸配列とＰＣＲ用プライ
マー配列を示す図。

【図３】 ＰＣＲにより増幅されたＣ６ＳＴ部分ｃＤＮ
Ａの電気泳動写真。レーン１、３はオリゴヌクレオチド
1s及び3aを、レーン２はオリゴヌクレオチド2s及び3aを
プライマーに用いた。、レーン１はポリ(A)⁺RNAを鋳型
としたものであり、レーン２、３はポリ(A)⁺RNAからオ
リゴヌクレオチド1s及び3aをプライマーとして増幅され
たＰＣＲ産物を鋳型としたものである。

【図４】 ｃＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列の
ヒドロパシープロット。

【図５】 無血清培地で培養した軟骨細胞培養液中のタ
ンパク質（レーン１、４）、精製したＣ６ＳＴ（レーン
２、５）及び22kDa融合ペプチド（レーン３、６）の電
気泳動写真。レーン１〜３は、イムノブロッティングに
よるものであり、レーン４〜６は、アミドブラック染色
である。タンパク質量は、レーン１、４：１２μｇ、レ
ーン２：０．４μｇ、レーン３：０．１μｇ、レーン
５：０．８μｇ、レーン６：０．５μｇである。

【図６】 ニワトリの軟骨細胞poly(A)RNA⁺のノーザン
ブロットの結果を示す電気泳動写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の性質を有するスルホトランスフェ
   ラーゼをコードするＤＮＡ。 作用：硫酸基供与体から硫酸基を、グリコサミノグリ
   カンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に転移す
   る。 基質特異性：コンドロイチン、ニワトリ胚軟骨由来の
   コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロ
   イチン硫酸Ｃには硫酸基を転移するが、コンドロイチン
   硫酸Ｅ、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸には硫酸基を実
   質的に転移しない。 至適反応ｐＨ：６．４付近。 阻害及び活性化 プロタミンおよびMnCl₂により活性化される。 分子量：還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド
   ゲル電気泳動により推定される分子量：約７５，００
   ０。 非還元条件下でのゲル濾過により推定される分子量：約
   １６０，０００。
2. 【請求項２】 配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、
   硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−
   アセチルガラクトサミン残基の６位に転移する活性を実
   質的に害さないアミノ酸残基の置換、欠失、挿入を有し
   ていてもよいスルホトランスフェラーゼの少なくとも一
   部をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号２においてアミノ酸番号−３３
   〜４２５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
   を有する請求項２記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号２においてアミノ酸番号−１４
   〜４２５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
   を有する請求項２記載のＤＮＡ
5. 【請求項５】 配列番号２においてアミノ酸番号１〜４
   ２５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有
   する請求項２記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 配列番号２においてアミノ酸番号５〜１
   ５４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有
   する請求項２記載のＤＮＡ
7. 【請求項７】 請求項１または２記載のＤＮＡによって
   コードされるスルホトランスフェラーゼの部分ペプチ
   ド。
8. 【請求項８】 配列番号２においてアミノ酸番号５〜１
   ５４で表されるアミノ酸配列を有する請求項７記載のペ
   プチド。
9. 【請求項９】 配列番号２に示すアミノ酸配列を有する
   スルホトランスフェラーゼまたはその部分ペプチドに反
   応する抗体。