JPH0825901B2 - IgG monomer - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、静注可能なIgGに関する。さらに詳しく
は、ヒト由来IgGを、特定条件下で酸処理することによ
ってIgGの二量体および／または重合体（以下、これら
をIgG凝集型と総称することもある）を除去して得られ
る静脈投与可能なIgGに関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to intravenously injectable IgG. More specifically, a vein obtained by treating human-derived IgG with an acid under specific conditions to remove IgG dimers and / or polymers (hereinafter, these may be collectively referred to as IgG-aggregated type) Administerable IgG.

冷エタノール分画法や硫安分画法等で製造されたIgG
製剤中には、7SIgGの他に10〜40％のIgG凝集型が含まれ
ている。このものは、抗補体活性化作用や、ときには抗
原性を示すために静脈内投与を行うことはできない。静
注用IgGを製するためにはこれらIgG凝集型を除く必要が
ある。IgG produced by cold ethanol fractionation or ammonium sulfate fractionation
In addition to 7S IgG, the formulation contains 10 to 40% of IgG aggregate type. This compound cannot be administered intravenously because of its anti-complement activating effect and sometimes antigenicity. In order to produce intravenous IgG, it is necessary to exclude these IgG aggregation types.

IgG凝集型を除去する方法に関して、酸処理法に関す
る先行技術としては以下のものがある。Regarding the method for removing the IgG agglutination type, the following are prior arts related to the acid treatment method.

ミエローマIgGの凝集型が、pH4処理で解離することは
Kochwaら（1966）により観察されているが、ミエローマ
IgGであるためか、又はpH調整時の界面変性によるもの
か、中性に戻すと再重合すると報告されている。Aggregation type of myeloma IgG is not dissociated by pH4 treatment
As observed by Kochwa et al. (1966), myeloma
It is reported that it is due to IgG or due to interfacial modification during pH adjustment, or repolymerization occurs when the pH is returned to neutral.

Hansson（1968）は、正常人のIgGを透析しながらpH3.
0に調整すると、そこに含まれていたIgG凝集型は解離す
るが、再度中性に戻すと不溶物が生じると報告してい
る。このように酸処理でIgG凝集型が解離することは知
られていたが、特に単量体IgGを効率よく得る方法につ
いての詳細な報告はみられない。Hansson (1968) dialyzed IgG from normal humans to pH 3.
It is reported that when adjusted to 0, the IgG aggregate type contained therein dissociates, but insoluble matter occurs when the IgG aggregate type is returned to neutral. Although it was known that the IgG aggregation type was dissociated by the acid treatment as described above, no detailed report on a method for efficiently obtaining monomer IgG was found.

他方ヒトIgGの酸変性については、Jirgensonら（195
4）やDoiら（1970）による旋光性や円偏光二色性等の観
察報告はあるが、その他の生物学的性状がどのように変
化しているかに関しては報告されていない。一方、Stol
larら（1976）やWinkelhakeら（1980）はウサギIgGを用
いて酸変性の研究を行い、IgGの重要な生物活性の一つ
である補体結合能がpH3.5より酸性側で減弱すること、
抗原結合能はpH2.5〜3.0でも安定であること等の成績を
報告した。しかし、ウサギIgGはヒトIgGと性状が異なる
ため、かかる知見がヒトIgGにも適用されるとは言い難
い。On the other hand, regarding acid denaturation of human IgG, Jirgenson et al.
4) and Doi et al. (1970) have reported observations of optical activity and circular dichroism, but none of the other biological properties have changed. On the other hand, Stol
lar et al. (1976) and Winkelhake et al. (1980) conducted a study on acid denaturation using rabbit IgG, and found that one of the important biological activities of IgG, the ability to fix complement, is attenuated at pH 3.5 or below. ,
The results that the antigen-binding ability is stable even at pH 2.5 to 3.0 were reported. However, since the properties of rabbit IgG are different from those of human IgG, it is hard to say that such findings apply to human IgG.

ヒトIgG凝集型を、ヒト単量体を変性させることな
く、解離させる方法を見いだすことができれば、従来の
筋注用グロブリンから単量体richの静注用グロブリンを
効率よく製造することが可能となる。If we could find a method to dissociate human IgG agglutinated form without denaturing human monomers, it would be possible to efficiently produce monomer-rich intravenous globulins from conventional intramuscular globulins. Become.

従って、本発明の第一の目的は静注可能なヒトIgGを
提供することである。Therefore, a first object of the present invention is to provide an intravenously injectable human IgG.

本発明の第二の目的は重合型IgGの含量が可及的に少
ないヒトIgGの製造方法を提供することである。A second object of the present invention is to provide a method for producing human IgG containing as little polymerized IgG as possible.

本発明の第三の目的は中性においてもIgG凝集型の生
じることのないヒトIgGを提供することである。A third object of the present invention is to provide human IgG which does not cause IgG aggregation type even in neutral.

本発明の第四の目的は安定な、静注可能ヒトIgGを提
供することである。A fourth object of the present invention is to provide stable, injectable human IgG.

本発明は、ヒトIgG重合体を含有するヒトIgGの0.2〜2
0w/v％溶液を特定の安定化剤の存在下にpH3.7〜4.3で30
分〜20時間処理してヒトIgG重合体を単量体へ解離させ
た後、中和して得られた静脈投与可能なIgGからなる。The present invention relates to human IgG containing human IgG 0.2-2.
30% 0 w / v% solution in the presence of certain stabilizers at pH 3.7-4.3
It consists of intravenously administrable IgG obtained by neutralizing the human IgG polymer dissociated into monomers by treating for 20 minutes to 20 hours.

原料となるヒトIgGは、IgG凝集型を含むものが選ばれ
る。高度精製されたものであれば本発明処理後ただちに
医薬品として調製できるし、又、粗製段階であれば既知
の精製法と組合せられる。原料ヒトIgGの調製法として
は、冷エタノールによるアルコール分画法が好適に利用
される（ジャーナル オブ クリニカル インベスチゲ
イション，23,417,1944年）（ジャーナル オブ ジ
アメリカン ケミカル ソサイエティ，68,479,1946
年）。The human IgG used as a raw material is selected from those containing an IgG aggregation type. If it is highly purified, it can be prepared as a pharmaceutical product immediately after the treatment of the present invention, and if it is a crude stage, it can be combined with a known purification method. As a method for preparing the raw human IgG, the alcohol fractionation method using cold ethanol is preferably used (Journal of Clinical Investigation, 23 , 417, 1944) (Journal of
American Chemical Society, 68 , 479,1946
Year).

酸処理は、原料をpH3.7〜4.3に保ち行う。処理温度は
１〜10℃、好ましくは３〜６℃であり、処理時間は30分
〜20時間、好ましくは60分〜４時間、更に好ましくは12
0分〜200分である。ここでpH調整に用いられる酸として
は、上記pHに調整可能なもので、かつIgGに悪影響を及
ぼさないものであればよく、たとえば塩酸などの無機
酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸などの有機酸があげられ
る。酸処理時におけるIgGの濃度は、0.2〜20w/v％、好
ましくは10〜18w/v％である。The acid treatment keeps the raw material at pH 3.7 to 4.3. The treatment temperature is 1 to 10 ° C, preferably 3 to 6 ° C, and the treatment time is 30 minutes to 20 hours, preferably 60 minutes to 4 hours, more preferably 12
0 to 200 minutes. The acid used for pH adjustment here may be one that can be adjusted to the above pH and does not adversely affect IgG, for example, an inorganic acid such as hydrochloric acid, an acetic acid, citric acid, an organic acid such as oxalic acid. The acid is given. The concentration of IgG at the time of acid treatment is 0.2 to 20 w / v%, preferably 10 to 18 w / v%.

この酸処理に際し、IgGの変性を防ぐためには無機
塩、糖類および蛋白質から選ばれる化合物の単独、又は
複数を添加することが好ましい。無機塩としては塩化ナ
トリウム、塩化カリウムなどのハロゲンとアルカリ金属
との塩およびリン酸ナトリウムなど、糖類としてはグル
コース、フラクトース、ソルビトール、マンニット、サ
ッカロースなど、蛋白質としてはアルブミン、ゼラチン
などが好適に例示される。その添加量は総量として0.5
〜20w/v％である。At the time of this acid treatment, in order to prevent denaturation of IgG, it is preferable to add one or more compounds selected from inorganic salts, saccharides and proteins. Suitable examples of inorganic salts include salts of halogen and alkali metals such as sodium chloride and potassium chloride and sodium phosphate, examples of sugars include glucose, fructose, sorbitol, mannitol, sucrose, and examples of proteins include albumin and gelatin. To be done. The total amount added is 0.5
It is ~ 20w / v%.

当該安定化剤は、本発明IgG製造後もそのまま存在さ
せておくことがIgGの保存安定性の観点から、好まし
い。From the viewpoint of storage stability of IgG, it is preferable that the stabilizer is left as it is after the production of the IgG of the present invention.

かくして得られる酸処理IgGは、医薬品製造の常套手
段に準じて、除菌濾過及び凍結乾燥処理などを行うこと
により、凍結乾燥製剤とすることも可能である。The acid-treated IgG thus obtained can be made into a freeze-dried preparation by subjecting it to sterilization filtration and freeze-drying treatment, etc., according to a conventional method for producing pharmaceutical products.

本発明によって特定条件下に調整された静脈投与可能
IgGは、IgG単量体が変性されておらず、またこれを中性
に戻してもIgG凝集型が生ずることがないので、極めて
有用なものである。The present invention allows intravenous administration adjusted under specific conditions
IgG is extremely useful because the IgG monomer is not denatured and the IgG aggregate type does not occur even if the IgG monomer is returned to neutral.

以下に本発明の実施例等を示す。 Examples of the present invention are shown below.

参考実験例 5.7mg/mlのIgG凝集型を含む水溶液を各種pHに調整
し、28℃で60分間incubate後、NaOHを加え中和した。更
にリン酸緩衝液を等量加え、高速液体クロマトグラフィ
ーによる残存IgG凝集型の量およびプラスミン消化の程
度を測定した。ここで用いた試料溶液中には7Sが38％、
二量体が61％および１％の重合体が含まれていた。この
ものを酸処理すると、pH3.8の処理において7Sの量がピ
ークになった。二量体IgGも処理pHの低下とともに減少
したが、pH3.8以下での処理では重合体の量が増加し
た。Reference Experimental Example An aqueous solution containing 5.7 mg / ml of IgG aggregation type was adjusted to various pH values, incubated at 28 ° C. for 60 minutes, and then neutralized by adding NaOH. Further, an equal amount of phosphate buffer was added, and the amount of residual IgG agglutination type and the extent of plasmin digestion were measured by high performance liquid chromatography. 38% of 7S in the sample solution used here,
The dimer contained 61% and 1% polymer. When this was treated with acid, the amount of 7S peaked in the treatment at pH 3.8. Dimeric IgG also decreased with decreasing treatment pH, but the amount of polymer increased with treatment at pH 3.8 or lower.

プラスミン消化の程度は、pH4付近の処理の場合に最
もおそく、重合体の増加する処理領域および二量体が残
存する処理領域では、プラスミンによる消化が早かっ
た。The degree of plasmin digestion was the slowest in the case of treatment near pH 4, and the digestion by plasmin was faster in the treatment region where the polymer increased and the treatment region where the dimer remained.

以上のことから、pH4付近の処理によって得られたも
のは単量体の含量が多く、中和にすることによってIgG
凝集型に戻ることがないことが明らかである。From the above, the product obtained by the treatment at around pH 4 has a high content of monomers, and IgG
It is clear that it does not return to the aggregated form.

実施例 1.4mg/mlのIgG凝集型を含む水溶液（7Sが38％、二量
体が61％、重合体が１％）に各種安定剤を添加し、pHを
3.8に調整し、28℃で60分間incubate後、中和した。そ
の後、IgGの麻疹抗体価をHemagglutination inhibition
test法により測定し、国際単位（IU/100mg）で表し、
安定剤の効果をみた。その結果は次の通りである。Example 1 Various stabilizers were added to an aqueous solution containing 1.4 mg / ml of IgG aggregation type (38% of 7S, 61% of dimer, 1% of polymer) to adjust pH.
It was adjusted to 3.8, incubated at 28 ° C. for 60 minutes, and then neutralized. After that, the measles antibody titer of IgG was changed to Hemagglutination inhibition.
Measured by the test method and expressed in international units (IU / 100mg),
The effect of the stabilizer was observed. The results are as follows.

参考例 アルコール分画法で得たヒトIgGの15w/v％溶液をマン
ニトール5w/v％の存在下で、0.1M酢酸緩衝液（pH3.5）
を用いてpH4.0に調整し、４℃で３時間静置した。その
後、1Mグリシン緩衝液（pH9.5）を用いてpH6.5に修正し
た。その後、アルブミンを1w/v％、NaClを3w/v％および
グルコースを5w/v％濃度になるように加え、除菌濾過し
て静注用グロブリンとした。 Reference example A 15 w / v% solution of human IgG obtained by the alcohol fractionation method in the presence of 5 w / v% mannitol was added to 0.1 M acetate buffer (pH 3.5).
The pH was adjusted to 4.0 by using and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 3 hours. Then, it was corrected to pH 6.5 with 1 M glycine buffer (pH 9.5). Then, albumin was added at a concentration of 1 w / v%, NaCl at a concentration of 3 w / v% and glucose at a concentration of 5 w / v%, and sterile filtration was performed to obtain an intravenous globulin.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−127320（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−176215（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−43914（ＪＰ，Ａ) 特公 昭57−6404（ＪＰ，Ｂ２) Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ．ｅｘｐ．Ｍｅｄ．, 1983，141Ｐ．337−349 ─────────────────────────────────────────────────── --- Continuation of the front page (56) References JP-A-56-127320 (JP, A) JP-A-59-176215 (JP, A) JP-A-58-43914 (JP, A) JP-B 57- 6404 (JP, B2) Tohoku J. exp. Med. 1983, 141P. 337-349

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】ヒトIgGの二量体および／または重合体が
夾雑するヒトIgGの0.2〜20w/v％溶液を、サッカロース
の安定化剤0.5〜20w/v％濃度の存在下に、pH3.7〜4.3で
30分〜20時間処理してヒトIgG二量体および重合体を単
量体へ解離させて得られた静脈投与可能なIgG。1. A 0.2 to 20 w / v% solution of human IgG, which is contaminated with human IgG dimers and / or polymers, in the presence of a saccharose stabilizer at a concentration of 0.5 to 20 w / v% and a pH of 3. 7 to 4.3
An intravenously administrable IgG obtained by dissociating a human IgG dimer and a polymer into monomers by treating for 30 minutes to 20 hours.