JPS60120823A - Igg monomer - Google Patents

Abstract

PURPOSE:An IgG, obtained by treating an IgG derived from humans with an acid under specific conditions, and removing IgG and/or polymer, and capable of intravenous injection. CONSTITUTION:An IgG monomer obtained by oxidizing 0.2-20wt%/vol% solution of human IgG containing human IgG dimer and/or polymer (IgG agglutination type) as an impurity at 3.7-4.3pH and 1-10 deg.C for 30min-20hr with an acid, e.g. an inorganic acid such as hydrochloric acid or an organic acid such as acetic acid. In the treatement with the acid, an inorganic salt, saccharide, protein and an organic acid salt, etc. alone or plural may be preferably added to prevent the denaturation of the IgG. The resultant IgG treated with the acid is subjected to germ-free filtration and freeze drying, etc. to afford the aimed IgG pharmaceutical capable of intravenous injection. The pharmaceutical contains undenatured IgG monomer, and is very useful due to no formation of IgG agglutination type even on returning to the neutral state.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、静注可能なＩｇＧに関する。さらに詳しくは
、ヒト由来１ｇＧを、特定条件下で酸処理することによ
ってＩｇＧの二量体および／または重合体（以下、これ
らをＩｇＧ凝集型と総称することもある）を除去して得
られる静脈没１ｊ可能なＩｇＧに関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to intravenously injectable IgG. More specifically, a vein obtained by treating human-derived 1gG with acid under specific conditions to remove IgG dimers and/or polymers (hereinafter, these may be collectively referred to as IgG aggregates) Concerning IgG that can be used.

冷エタノール分画法や硫安分画法等で製造されたＩｇＧ
製剤中には、７ＳＩｇＧ（７）他に１０〜４０％の■ｇ
Ｇ凝集型が含まれている。このものは、抗補体活性化作
用や、ときには抗原性を示すために静脈内投与を行うこ
とはできない。静注用■ｇＧを製するためにはこれらＩ
ｇＧ凝集型を除く必要がある。IgG produced by cold ethanol fractionation, ammonium sulfate fractionation, etc.
In addition to 7SIgG (7), the preparation contains 10-40% ■g
Contains G-aggregated type. This substance cannot be administered intravenously because it exhibits anti-complement activating effects and sometimes antigenicity. In order to produce ■gG for intravenous injection, these I
It is necessary to remove the gG aggregate type.

ＴｇＧ凝集型を除去する方法に関して、酸処理法に関す
る先行技術としては以下のものがある。Regarding the method of removing aggregated TgG, there are the following prior art techniques regarding acid treatment.

ミエローマｒｇＧの凝策型が、ｐＨ４処理で解離するこ
とはＫｏｃｈｗａら（１９６６）により観察されている
が、ミエローマＩｇＧであるためが、又はｐｉ調整時の
界面変性によるものが、中性に戻すと再重合すると報告
されている。It has been observed by Kochwa et al. (1966) that the rigid form of myeloma RGG dissociates upon pH 4 treatment. Reported to repolymerize.

１１ａｎｓｓｏｎ　（１９６Ｂ　）は、正常人のＩｇＧ
を透析しなからｐｌ＋３．０に調整すると、そこに含ま
れていたＩｇＧ凝集型は解離するが、再度中性に戻すと
不溶物が生しると報告している。このように酸処理でＩ
ｇＧ凝集型が解離することは知られてし）たが、特に単
量体１ｇＧを効率よく得る方法についての詳細な報告は
みられない。11ansson (196B) is a normal human IgG
It has been reported that when the IgG is adjusted to pl+3.0 without dialysis, the aggregated IgG contained therein dissociates, but when it is returned to neutrality, insoluble matter is formed. In this way, I
Although it has been known that aggregated gG dissociates, there have been no detailed reports on a method for efficiently obtaining monomeric 1gG.

他方ヒトＩｇＧの酸変性については、Ｊｉｒｇｅｎｓｏ
ｎら（］　９５４）やＤｏｉら（１９７０）による旋光
性や円偏光二色性等の観察報告はあるが、その他の生物
学的性状がどのように変化しているかに関しては報告さ
れていない。一方、５ｔｏｌ１１１ｒら（１９７６）や
−４ｎｋｅｌｈａｋｅら（１９８０）はウサギ１［Ｇを
用いて酸変性の研究を行い、ＩｇＧの重要な生物活性の
一つである補体結合能がｐｌ＋３．５より酸性側でｌＳ
、弱すること、抗原結合能はｐＨ２，５〜３．０でも安
定であること等の成績を報告した。しかし、ウサギＩｇ
ＧはヒトＩｇＧと性状が異なるため、かかる知見がヒト
ＩｇＧにも適用されるとは言い難い。On the other hand, regarding acid denaturation of human IgG, Jirgenso
Although there are reports of observations of optical rotation, circular dichroism, etc. by N. et al. (954) and Doi et al. (1970), there are no reports on how other biological properties change. On the other hand, 5tol111r et al. (1976) and 4nkelhake et al. (1980) conducted research on acid denaturation using rabbit 1[G. lS on the side
, and that the antigen binding ability was stable even at pH 2.5 to 3.0. However, rabbit Ig
Since G has different properties from human IgG, it is difficult to say that such knowledge applies to human IgG.

ヒトＩｇＣ，凝集型を、ヒト単量体を変性さ七ることな
く、解離さゼる方法を見いだすことができれば、従来の
筋注用グロブリンから単量体ｒｉｃｈの静注用グロブリ
ンを効率よ（製造することが可能となる。If we could find a way to dissociate the aggregated form of human IgC without denaturing the human monomer, it would be possible to efficiently produce monomeric rich intravenous globulin from conventional intramuscular globulin ( It becomes possible to manufacture.

従って、本発明の第一の目的は静注可能なヒトＩｇＧを
提供することである。Therefore, the first object of the present invention is to provide human IgG that can be injected intravenously.

本発明の第二の目的は重合型１ｇＧの含量が可及的に少
ないヒトＩｇＧの製造方法を提供することである。A second object of the present invention is to provide a method for producing human IgG containing as little polymerized 1gG as possible.

本発明の第三の目的は中性においてもＩｇＧａ＆集型の
生じることのないヒトＩｇＧを提供することである。The third object of the present invention is to provide human IgG that does not cause IgG&aggregation even in neutral conditions.

本発明の第四の目的は安定な、静注可能ヒ）ＩｇＧを提
供することである。A fourth object of the present invention is to provide a stable, intravenously injectable human IgG.

本発明は、ヒトＩｇＧ重合体を含有するヒト１ｇＧの０
．２〜２０　ｗ　／　ｖ％温溶液ｐＨ３，７〜Ｉ１．３
で３０分〜２０時間処理してヒ）ＩｇＧｉｌｊ合体を中
量体へ解離させて得られた静脈投与可能なＩｇＧからな
る。The present invention provides a method for preparing human 1gG containing human IgG polymers.
．． 2-20 w/v% warm solution pH 3,7-I1.3
It consists of an IgG that can be administered intravenously and is obtained by dissociating the IgG conjugate into an intermediate form by treating it for 30 minutes to 20 hours.

原料となるヒトＩｇＧは、ｒｇＧ凝巣型巣型むものが選
ばれる。高度精製されたものであれば本発明処理後ただ
ちに医薬品として調製できるし、又、粗製段階であれば
既知のＩｆｉ製法と組合せられる。原料ヒトＩｇＧの調
製法としては、冷エタノールによるアルコール分画法が
好適に利用される（ジャーナル　オブ　クリニカル　イ
ンベスチゲイション、Ｌ屯、４１７．１９４４年）　（
ジャーナル　オブ　ジ　アメリカン　ケミカル　ソサイ
エティ、エエ、４７９．１９４６年）。The human IgG used as the raw material is selected from rgG condensed nest type. If it is highly purified, it can be prepared as a drug immediately after the treatment of the present invention, and if it is in the crude stage, it can be combined with the known Ifi production method. As a method for preparing raw human IgG, an alcohol fractionation method using cold ethanol is suitably used (Journal of Clinical Investigation, L. Tun, 417.1944).
Journal of the American Chemical Society, AE, 479.1946).

酸処理は、原料をｐＨ３，７〜４．３に保ち行う。処理
温度は１〜ｌＯ℃、好ましくは３〜６℃であり、処理時
間は３０分〜２０時間、好ましくは６０分〜４時間、更
に好ましくは１２０分〜２００分である。ここでｐｏｇ
ｌ＆Ｉ整に用いられる酸としては、上記ρ１１に調整可
能なもので、かつｒｇｃに悪影響を及ぼさないものであ
ればよく、たとえば塩酸などの無機酸、酢酸などの有機
酸があげられる。酸処理時におけるＩｇＧの濃度は、０
．２〜２０ｗ／ｖ％、好ましくは１０〜１８Ｗ／ｖ％で
ある。The acid treatment is performed while keeping the raw material at pH 3.7 to 4.3. The treatment temperature is 1 to 10°C, preferably 3 to 6°C, and the treatment time is 30 minutes to 20 hours, preferably 60 minutes to 4 hours, and more preferably 120 minutes to 200 minutes. pog here
The acid used for the I&I adjustment may be any acid that can be adjusted to ρ11 and does not adversely affect RGC, such as inorganic acids such as hydrochloric acid and organic acids such as acetic acid. The concentration of IgG during acid treatment was 0.
．． It is 2 to 20 w/v%, preferably 10 to 18 w/v%.

この酸処理に際し、ＩｇＧの変性を防ぐためには無機塩
、糖類、蛋白質および有ｉ酸塩から選ばれる化合物の単
独、又は複数を添加することが好ましい。無機塩として
は塩化ナトリウム、塩化カリウムなどのハロゲンとアル
カリ金属との塩など、糖類としてはグルコース、フラク
ト−ス、ンルビトール、マンニット、サッカロースなど
、蛋白質としてはアルブミン、ゼラチンなど、有機酸塩
としてはシュウ酸塩、クエン酸塩（特にこれらイｊ機酸
のナトリウム塩、カリウＪ、塩などのアルカリ金属塩）
等が好適に例示される。その添加量は総量として５〜２
０Ｗ／Ｖ％である。In order to prevent denaturation of IgG during this acid treatment, it is preferable to add one or more compounds selected from inorganic salts, saccharides, proteins, and ionic acid salts. Inorganic salts include salts of halogens and alkali metals such as sodium chloride and potassium chloride; sugars include glucose, fructose, nlubitol, mannitol, and saccharose; proteins include albumin and gelatin; organic acid salts include oxalates, citrates (especially alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts of these organic acids)
etc. are suitably exemplified. The total amount added is 5 to 2
It is 0W/V%.

当該安定化剤は、本発明１ｇＧ製造後もそのまま存在さ
せておくことがＩｇＧの保存安定性の観点から、好まし
い。From the viewpoint of storage stability of IgG, it is preferable that the stabilizer is allowed to exist as it is even after the production of 1gG of the present invention.

かくして得られる酸処理１ｇＧは、医薬品型造の常套手
段に準じて、除菌濾過及び凍結乾燥処理などを行うこと
により、凍結乾燥製剤とすることも可能である。The acid-treated 1gG thus obtained can also be made into a freeze-dried preparation by performing sterilization filtration and freeze-drying according to conventional methods for pharmaceutical mold manufacturing.

本発明によって特定条件下に調整された静脈投与可能１
［Ｇは、ＩｇＧ単量体が変性されておらず、またこれを
中性に戻してもＩｇＧ凝集凝集化ずることがないので、
極めて有用なものである。Intravenous administration adjusted under specific conditions according to the present invention 1
[G is because the IgG monomer is not denatured, and even if it is returned to neutrality, IgG aggregation will not occur.
It is extremely useful.

以下に本発明の実験例と実施例を示す。Experimental examples and examples of the present invention are shown below.

実験例１ ５、７　ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ凝集凝集化む水溶液を各種
ｐ＋１に調整し、２８℃で６０分間１ｎｃｕｂａｔｅ後
、Ｎａ０１＋を加え中和した。更にリン酸緩衝液を等量
加え、高速液体クロマトグラフィーによる残存１ｇＧ凝
集型の量およびプラスミン消化の程度を測定した。ここ
で用いた試料溶液中には７Ｓが３８％、二量体が６１％
および１％の重合体が含まれていた。このものを酸処理
すると、ｐＨ３，８の処理において７８のｍがピークに
なった。二量体１ｇＧも処理ｐＨの低下とともに減少し
たが、ρ１１３．８１ｆｆ下での処理では重合体の量が
増加した。Experimental Example 1 5 and 7 mg/ml IgG aggregation aggregation aqueous solutions were adjusted to various p+1, incubated at 28° C. for 1 minute, and then neutralized by adding Na01+. Furthermore, an equal volume of phosphate buffer was added, and the amount of residual 1gG aggregate and the degree of plasmin digestion were measured by high performance liquid chromatography. The sample solution used here contained 38% 7S and 61% dimer.
and 1% polymer. When this material was treated with an acid, m became a peak of 78 in the treatment at pH 3 and 8. Dimer 1gG also decreased with decreasing treatment pH, but the amount of polymer increased in treatment under ρ 113.81ff.

プラスミン消化の程度は、ｐＨ４付近の処理の場合に最
もおそく、重合体の増加する処理領域および二量体が残
存する処理領域では、プラスミンによる消化が早かった
。The extent of plasmin digestion was slowest for treatments near pH 4, and digestion by plasmin was faster in treated areas where polymer increased and where dimer remained.

以上のことから、本発明の処理によって得られたものは
単量体の含量が多く、中和にすることによってＩｇＧ凝
集凝集化ることがないことが明らかである。From the above, it is clear that the product obtained by the treatment of the present invention has a high monomer content and that IgG aggregation does not occur through neutralization.

実験例２ １．４＋ｎｇ／ｍｌのＩｇＧ凝ｍ型を含む水溶液（７Ｓ
が３８％、二量体が６１％、重合体が１％）に各種安定
剤を添加し、ｐｌ＋を３．８に調整し、２８℃で６０分
間１ｎｃｕｂａｔｅ後、Ｎａ０ＩＩを加え中和した。そ
の後、ＩｇＧの麻疹抗体価をＨｅｍａｇｇｌｕｔｉ＋＋
＋＋ｌ　ｉｏｎ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ法に
より測定し、国際単位（ＩＵ／１００ｍｇ）で表し、安
定剤の効果をみた。その結果は次の通りである。Experimental Example 2 Aqueous solution containing 1.4+ng/ml of IgG aggregate type (7S
(38% dimer, 61% dimer, 1% polymer), various stabilizers were added, pl+ was adjusted to 3.8, and after 1 incubation at 28° C. for 60 minutes, Na0II was added to neutralize. Then, the measles antibody titer of IgG was measured using Hemaggluti++.
It was measured by the ++lion 1nhibition test method and expressed in international units (IU/100mg) to examine the effect of the stabilizer. The results are as follows.

：　Ｗ　ｖ％　−」Ｌ唐１ばト価− す　シ　７ アルブミン　：］５　１０ 同上　：　１　ｌＯ ゼラチン　：１０　１Ｏ ＮａＣＩ　：１５　１０ 同上　＝１９ グルコース　、　１５　１０ 同上　：１９ サッカロース８ｔ０　１０ マンニトール：１５　ｔ。:　W　v%　-”L kara 1 bat price- Su 7 Albumin: ] 5 10 Same as above: 1 lO Gelatin: 10 1O NaCI: 15 10 Same as above = 19 Glucose, 15 10 Same as above: 19 Saccharose 8t0 10 Mannitol: 15t.

１司」二　：　１　１０ クエン酸Ｎａ：１５　１０ 同」二　：　１　９ ＮａＣ１：５ 十　フルクトース＝５　１０ 実施例１ アルコール分画法で得たヒｌ−１ｇ　Ｇの１５Ｗ／Ｖ％
溶液を、０．１規定塩酸を用いてｐＨ４，０に調整し、
４℃で３時間静置した。その後、０．１規定カセイソー
ダを用いて１１１６．５に修正した。その後、ＮａＣｌ
をＩＯＷ／Ｖ％およびグルコースを５ｗ／ｖ％濃度にな
るように加え、除菌濾過して静注用グロブリンとした。1 1 10 Na citrate: 15 10 1 9 NaC 1:5 10 Fructose = 5 10 Example 1 15 W/V% of 1g G of HiL-1 obtained by alcohol fractionation
The solution was adjusted to pH 4.0 using 0.1N hydrochloric acid,
It was left standing at 4°C for 3 hours. Thereafter, it was corrected to 1116.5 using 0.1N caustic soda. Then NaCl
IOW/V% and glucose were added to the mixture to give a concentration of 5w/v%, and the mixture was sterilized and filtered to obtain globulin for intravenous injection.

特許出願人　株式会社　ミドリ十字 手　続　ネＴｉｔ　正　辺：　（自発）１、事件の表示 昭和５８年特許願第２２８６３８号 ２、発明の名称 ＴｇＧ単量体 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 ４、代理人　■５４１ 住　所　大阪市東区平野町４丁１′−１５３ｆｌｒ地３
ニューライフ平野町４０（５号 電話（０６）　２２７−１１５６ ６、補正の対象 明細書の「特許請求の範囲」の欄 および「発明の詳細な説明」の欄 ７、補正の内容 （１）明細書の「特許請求の範囲１を別紙の通りに訂正
する。Patent Applicant: Midori Juji Procedure Co., Ltd. NeTit Positive Side: (Voluntary) 1. Indication of the case: Patent Application No. 228638, filed in 1982. 2. Name of the invention: TgG monomer. 3. Person making the amendment. Relationship with the case: Patent Applicant name (name) Midori Juji Co., Ltd. 4, agent ■541 Address 4-1'-153 FLR, Hirano-cho, Higashi-ku, Osaka-shi 3
New Life Hirano-cho 40 (No. 5 Telephone (06) 227-1156 6. "Claims" column and "Detailed description of the invention" column 7 of the specification to be amended, Contents of the amendment (1) Specification ``Claim 1 is amended as shown in the attached sheet.''

（２）明細書第５頁、第１９行の「酢酸」の次に「、ク
エン酸、シュウ酸」を加入する。(2) Add "citric acid, oxalic acid" next to "acetic acid" on page 5, line 19 of the specification.

（３）同書第６頁、第６行の１金属との塩」の次に「お
よびリン酸ナトリウム」を加入する。(3) In the same book, page 6, line 6, add ``and sodium phosphate'' next to ``salt with a metal.''

（４）同書第８頁、第１０行のｒＮａＯｌｌを加え」を
削除する。(4) Delete "Add rNaOll" on page 8, line 10 of the same book.

（５）同書第８頁、第１７行の「アルブミン：１５」を
「アルブミン；５」に訂正する。(5) "Albumin: 15" on page 8, line 17 of the same book is corrected to "albumin: 5".

（６）同書第９頁、第５行の「マンニト−ル；１５」を
「マンニトール：５」に訂正する。(6) "Mannitol: 15" on page 9, line 5 of the same book is corrected to "mannitol: 5."

（７）同書第９頁、第１０行と第１−１行の間に［アル
ブミン；１ １−　グリシン：２．５　１０Ｊ を加入する。(7) Add [albumin; 1 1-glycine: 2.5 10J] between line 10 and line 1-1 on page 9 of the same book.

（８）同書第９頁、節１３行の「０，１規定塩酸」をｒ
Ｏ，ＩＭ酢＃ｉ緩１壷ｉ液（ａｌｌ　３．５　）　Ｊに
訂正する。(8) “0,1N hydrochloric acid” on page 9, line 13 of the same book is r
O, IM vinegar #i loose 1 pot i liquid (all 3.5) Correct to J.

（９）間書第９頁、第１４〜１５行の「０．１規定カセ
イソーダ」をｒ１Ｍグリシン緩衝液（ａｌｌ　９．５　
）　Ｊに訂正する。(9) Add "0.1N caustic soda" on page 9, lines 14-15 to r1M glycine buffer (all 9.5
) Correct to J.

（１０）同書第９頁、第１５行の「その後、」の次に［
アルブミンを１ｗ／ｖ％、」を加入する。(10) On page 9 of the same book, line 15, after “after that,” [
Add albumin at 1 w/v%.

（工１）同書第９頁、第１６行のｒｊＯｗ／ｖ％」をｒ
　３　ｗ　／　ｖ％」に訂正する。(Eng. 1) "rjOw/v%" on page 9, line 16 of the same book is r
Corrected to 3 w/v%.

特許請求の範囲 ＋１．ｌ　ヒ！−１ｇＧの二量体および／またＩＦ　）
重合体を夾雑するヒ）ＴｇＧの０．２〜２Ｑ　ｗ　／　
ｖ％溶液をｐＨ３，７〜４．３で３０分〜２０時間処理
してヒ］・［ｇＧ二量体および重合体を小量体へ解１ｆ
ｉｌｌさ〜Ｕて得られた静脈投与可能なＩｇＧ。Scope of claims +1. l Hi! -1gG dimer and/or IF)
0.2-2Q of TgG w/
% solution at pH 3.7 to 4.3 for 30 minutes to 20 hours to decompose H] and [gG dimers and polymers into small molecules.
Intravenously administrable IgG obtained by illumination.

（２）無機塩、糖類、蛋白質及び有機酸塩から選ばれる
少なくとも一種の安定化剤０，５〜２０ｗ／Ｖ％濃度の
存在下に解離されたことを特徴とする特許請求の範囲第
（１１項記載の静脈投与可能な１ｇ０ （３）　無機塩が塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムま
たは塩化カリウムであり、ｔｉ７　ｋＢがグルコース、
フラクトース、ザソカロース、ソルビトールまたはマン
ニトールであり、蛋白質がアルブミンまたはゼラチンで
あり、有機酸塩がシュウ酸塩、クエン酸塩であることを
特徴とする特許請求の範囲第（２）項記載の静脈投与可
能なｒｇＧ。(2) Claim No. 11 characterized in that the stabilizer selected from inorganic salts, sugars, proteins, and organic acid salts is dissociated in the presence of a concentration of 0.5 to 20 w/v%. (3) The inorganic salt is sodium chloride, sodium phosphate, or potassium chloride, and the ti7 kB is glucose,
The intravenously administrable product according to claim (2), which is fructose, zasocalose, sorbitol or mannitol, the protein is albumin or gelatin, and the organic acid salt is oxalate or citrate. NargG.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 ｆｉｌ　ヒトＩｇＧの二量体および／または重合体を夾
雑するヒト■ｇＧの０．２〜２０ｗ／ｖ％溶液をｐＨ３
，７〜４．３で３０分〜２０時間処理してヒト１ｇＧ二
量体および重合体を単量体へ解離させて得られた静脈投
与可能なＩｇＧ。 （２）無機塩、糖類、蛋白質及び有機酸塩から選ばれる
少なくとも一種の安定化剤０．５〜２０Ｗ／■％濃度の
存在下に解離されたことを特徴とする特許請求の範囲第
ｆｉ１項記載の静脈投与可能なＩｇＧ０ （３）無機塩が塩化ナトリウムまたは塩化カリウムであ
り、糖類がグルコース、フラクトース、サッカロース、
ソルビトールまたはマンニトールであり、蛋白質がアル
ブミンまたはゼラチンであり、有機酸塩がシュウ酸塩、
クエン酸塩であることを特徴とする特許請求の範囲第ｉ
１１項記載の方法。[Claims] fil A 0.2 to 20 w/v% solution of human IgG contaminated with human IgG dimers and/or polymers was prepared at pH 3.
, 7-4.3 for 30 minutes to 20 hours to dissociate human 1gG dimers and polymers into monomers, which can be administered intravenously. (2) Dissociated in the presence of at least one stabilizer selected from inorganic salts, saccharides, proteins, and organic acid salts at a concentration of 0.5 to 20 W/■% Claim fi1 Intravenously administrable IgG0 (3) The inorganic salt is sodium chloride or potassium chloride, and the saccharide is glucose, fructose, sucrose,
Sorbitol or mannitol, the protein is albumin or gelatin, and the organic acid salt is oxalate,
Claim i, characterized in that it is a citrate salt.
The method according to item 11.