JPH08217800A - Determination of human promatrix metalloprotease-7 by immunological measuring method - Google Patents
Determination of human promatrix metalloprotease-7 by immunological measuring methodInfo
- Publication number
- JPH08217800A JPH08217800A JP5037595A JP5037595A JPH08217800A JP H08217800 A JPH08217800 A JP H08217800A JP 5037595 A JP5037595 A JP 5037595A JP 5037595 A JP5037595 A JP 5037595A JP H08217800 A JPH08217800 A JP H08217800A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mmp
- human
- monoclonal antibody
- pro
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、抗ヒトマトリックスメ
タロプロテアーゼ７（ＭＭＰ−７）モノクローナル抗
体、及びそのモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定
法、特には免疫組織染色、酵素免疫測定並びに該測定法
に基づき検体中に存在するヒトプロＭＭＰ−７を定量す
る方法に関する。The present invention relates to an anti-human matrix metalloprotease 7 (MMP-7) monoclonal antibody and an immunological assay method using the monoclonal antibody, particularly immunohistological staining, enzyme immunoassay and the assay. The present invention relates to a method for quantifying human proMMP-7 present in a sample based on the method.
【０００２】[0002]
【背景技術及び解決すべき課題】血管やリンパ管及び関
節軟骨の基底膜や結合組織の構成タンパク、いわゆる細
胞外マトリックスの分解には、マトリックスメタロプロ
テアーゼ類（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅ
ｉｎａｓｅｓ；ＭＭＰｓ）の作用が必須である。近年、
これらのＭＭＰｓについては、遺伝子がクローニングさ
れて遺伝子ファミリーとして存在することが報告されて
いる。一次構造と基質特異性の違いからそれぞれグルー
プ分けされており、その中でプロＭＭＰ−７と称される
マトリライシンは、カルボキシル末端のヘモペキスン様
ドメインを欠失しており、ＭＭＰ遺伝子ファミリーの中
で最も小さい分子種として存在している。Ｑｕａｎｔｉ
ｎｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，５
３２７−５３３４，１９８９）は、プロＭＭＰ−７の分
子量は２８，０００ダルトン（２８ｋＤａ）であり、４
−アミノフェニル酢酸水銀（ＡＰＭＡ）処理した場合
は、２１ｋＤａの中間体を経て１９ｋＤａ活性化型ＭＭ
Ｐ−７へと変換され、そして活性化されたＭＭＰ−７は
プロテオグリカン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、フィ
ブロネクチン分解能を有することを報告している。ま
た、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ．，３４５，１４−１６，１９９４）は、ＭＭＰ−７
が７２ｋＤａゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）を活性化する
ことを報告している。BACKGROUND ART Matrix metalloprotease (Matrix metalloprotease) is used for the degradation of so-called extracellular matrix, which is a component protein of basement membrane and connective tissue of blood vessels, lymph vessels and articular cartilage.
actions; MMPs) are essential. recent years,
It has been reported that the genes of these MMPs are cloned and exist as a gene family. Matrilysin, which is classified into groups according to the difference in primary structure and substrate specificity, among which is called proMMP-7, lacks the carboxyl-terminal hemopexun-like domain and is the most prominent in the MMP gene family. It exists as a small molecular species. Quanti
net al. (Biochemistry, 28, 5
327-5334, 1989), the molecular weight of pro-MMP-7 is 28,000 daltons (28 kDa) and 4
-When treated with mercury aminoaminoacetate (APMA), a 19-kDa activated MM via a 21-kDa intermediate
It has been reported that MMP-7 converted to P-7 and activated has proteoglycan, type IV collagen, laminin, and fibronectin degrading ability. See also Thomas et al. (FEBS Let
t. , 345, 14-16, 1994), MMP-7.
Report that it activates a 72 kDa gelatinase (MMP-2).
【０００３】Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０，７７５８−７７６４，１９９
０）は、ヒト直腸癌細胞の培養液からヒトＭＭＰ−７を
単離しこの酵素が広い基質特異性をもちＩＶ型コラーゲ
ンやフィブロネクチンなどに対して、非常に高い分解活
性を有していることを明らかにしている。ＭＭＰ−７は
直腸癌（Ｍ．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ
ｔ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５４，６１４−６１８，１９
８３）、結腸癌（Ｈ．Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍｕｎ．，２０１，６５７−６６４，１９９４）、前
立腺癌（Ｗ．Ｃ．Ｐｏｗｅｌｌｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．，５３，４１７−４２２，１９９３）、
胃癌（Ｓ．ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ
ｌ，Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，４，５２７−５３３，１９９
１）などで、高い頻度で発現している。しかし、未だに
ＭＭＰ−７タンパクを定性的及び定量的に測定すること
に成功していない。Miyazaki et al. (Can
cer Res. , 50, 7758-7764, 199
0) shows that human MMP-7 was isolated from the culture medium of human rectal cancer cells and that this enzyme has a wide substrate specificity and has a very high degrading activity for type IV collagen and fibronectin. Reveals. MMP-7 is a colorectal cancer (M. Yoshimoto et al. In.
t. , J. et al. Cancer, 54, 614-618, 19
83), colon cancer (H. Yamamoto et a.
l. , Biochem. Biophys. Res. Co
mmun. , 201, 657-664, 1994), prostate cancer (WC Powellet al., Canc.
er Res. , 53, 417-422, 1993),
Gastric cancer (S. McDonnell et al., Mo
1, Carcinog. , 4,527-533,199
1) etc., and is frequently expressed. However, the MMP-7 protein has not yet been successfully measured qualitatively and quantitatively.
【０００４】[0004]
【課題の解決】本発明者らは、ヒトＭＭＰ−７タンパク
を定性的及び定量的に測定するには、それを特異的に認
識しうるモノクローナル抗体、すなわちヒトＭＭＰ−７
に対するモノクローナル抗体を得るべきと考え、鋭意研
究の結果、ヒトＭＭＰ−７に対するモノクローナル抗体
を作製することに成功した。その結果、モノクローナル
抗体を用いて現在増加している直腸癌、前立腺癌を始め
とし各種癌疾患のマーカーもしくは診断法を提供するこ
とが可能となった。本発明は、ヒトＭＭＰ−７と特異的
に免疫反応することのできるモノクローナル抗体、その
モノクローナル抗体を測定試薬として用いたヒトＭＭＰ
−７の免疫学的測定法、さらにその測定法に用いる試薬
を提供する。本発明は、さらにヒトＭＭＰ−７に免疫交
差反応性を有するモノクローナル抗体及びそのモノクロ
ーナル抗体を用いるサンドイッチ法に基づくヒトＭＭＰ
−７の酵素免疫測定法をも提供するものである。本発明
の方法は、固相担体に結合させる抗体あるいは標識物を
付与する抗体として、それぞれヒトＭＭＰ−７の実質的
に異なる抗原決定基に対し特異的に結合するモノクロー
ナル抗体を使用することをも特徴とするものである。特
に本発明に従えばヒトＭＭＰ−７のＧＩＱＫＬＹＧＫＲ
ＳＮＳＲＫＫ（Ｒ２５３−２６７）のアミノ酸配列を含
むＣ末端領域あるいはそれと実質的に同等の領域を特異
的に認識し、プロ、中間体及び活性化型ＭＭＰ−７と免
疫反応するモノクローナル抗体とヒトプロＭＭＰ−７の
ＬＰＬＰＱＥＡＧＧＭＳＥＬＱＷＥＱ（Ｒ１８−３４）
のアミノ酸配列を含むＮ末端領域あるいはそれと実質的
に同等の領域を特異的に認識しプロＭＭＰ−７のみと免
疫反応するモノクローナル抗体とを組合わせて測定試薬
として用い、サンドイッチ法により、酵素免疫学的にヒ
トＭＭＰ−７の測定を行う方法及び試薬が提供される。[Means for Solving the Problems] To measure the human MMP-7 protein qualitatively and quantitatively, the present inventors have found that a monoclonal antibody capable of specifically recognizing the protein, that is, human MMP-7 protein is used.
As a result of earnest research, we succeeded in producing a monoclonal antibody against human MMP-7. As a result, it has become possible to provide a marker or diagnostic method for various cancer diseases including rectal cancer and prostate cancer, which are currently increasing in number, using monoclonal antibodies. The present invention relates to a monoclonal antibody capable of specifically immunoreacting with human MMP-7, and human MMP using the monoclonal antibody as a measuring reagent.
-7 provides an immunological assay method and a reagent used in the assay method. The present invention further provides a monoclonal antibody having immunological cross-reactivity with human MMP-7 and a human MMP based on a sandwich method using the monoclonal antibody.
It also provides an enzyme immunoassay method for -7. The method of the present invention may also use a monoclonal antibody that specifically binds to substantially different antigenic determinants of human MMP-7 as an antibody that binds to a solid phase carrier or an antibody that imparts a label. It is a feature. Particularly according to the invention, GIQKLYGKR of human MMP-7
A monoclonal antibody that specifically recognizes a C-terminal region containing the amino acid sequence of SNSRKK (R253-267) or a region substantially equivalent thereto and immunoreacts with pro, intermediate, and activated MMP-7, and human proMMP- 7 LPLPQEAGGMSELQWEQ (R18-34)
A monoclonal antibody that specifically recognizes the N-terminal region containing the amino acid sequence of Escherichia coli or a region substantially equivalent thereto and is used as a measurement reagent in combination with a monoclonal antibody that immunoreacts with proMMP-7 alone, and is subjected to enzyme immunoassay by the sandwich method. Methods and reagents for performing human MMP-7 measurement are provided.
【０００５】本発明で使用されるモノクローナル抗体
は、ケラー及びミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．＆
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４
９５，１９７５）などにより開示されたミエローマ細胞
を用いての細胞融合技術を利用して得られたモノクロー
ナル抗体であってもよいことはいうまでもない。本発明
で使用されるモノクローナル抗体は、次のような工程で
作製できる。 １．免疫原性抗原の調製 ２．免疫原性抗原による動物の免疫 ３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 ４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 ５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクロー
ン化 ６．モノクローナル抗体の製造The monoclonal antibodies used in the present invention are Keller and Milstein.
Milstein, C.I. , Nature, 256, 4
Needless to say, it may be a monoclonal antibody obtained by utilizing the cell fusion technique using myeloma cells disclosed in, for example, 95,1975). The monoclonal antibody used in the present invention can be produced by the following steps. 1. Preparation of immunogenic antigen 1. Immunization of animals with immunogenic antigens 3. Preparation of myeloma cells (myeloma cells) 4. Cell fusion of antibody-producing cells and myeloma cells 5. Selection of hybridomas (fused cells) and monocloning 6. Manufacture of monoclonal antibodies
【０００６】１．免疫原性抗原の調製 抗原としては、例えば培養ヒト直腸癌細胞株（ＣａＲ−
１細胞）から、Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．の方法（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１４２４５−１４２５
５，１９８６及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，
２１７１２−２１７１９，１９９２）に従い精製されて
得られたヒトプロＭＭＰ−７を用いることができる。特
に好ましくは精製ヒトプロＭＭＰ−７は、キレート化
剤、例えばＥＤＴＡなどを含有する緩衝液中に保存して
あるものが好ましい。こうして得られたヒトプロＭＭＰ
−７は、さらに免疫原性コンジュゲートなどにしてもよ
いが、そのまま適当なアジュバントと混合して動物を免
疫するのに使用できる。さらにヒトプロＭＭＰ−７は、
それを断片化したものを適当な縮合剤を介して種々の担
体タンパク質類と結合させてハプテン−タンパク質の如
き免疫原性コンジュゲートとし、これを用いて特定の配
列のみを認識できるモノクローナル抗体をデザインする
のに用いることもできる。例えば遺伝子組換え技術を適
用し、天然の細胞から分子クローニングにより得られた
ＤＮＡ配列あるいは既に知られたゲノム配列から、酵素
などを用いたり、化学合成により得られたＤＮＡ配列ま
たは修飾ＤＮＡ配列を、微生物あるいは動物、植物、昆
虫などで発現させて得られたリコビナント抗原や、それ
らの情報を利用し液相法や固相法として知られたペプチ
ド化学合成法により得られたペプチドまたは改変ペプチ
ドを用いることもできる。1. Preparation of Immunogenic Antigen Examples of the antigen include, for example, a cultured human rectal cancer cell line (CaR-
1 cell) from Okada et al. Method (J.
Biol. Chem. , 261, 14245-1425
5, 1986 and J. Biol. Chem. , 267,
21712-21719, 1992) and human proMMP-7 obtained by purification can be used. Particularly preferably, purified human pro-MMP-7 is preferably stored in a buffer solution containing a chelating agent such as EDTA. Human pro MMP thus obtained
-7 may be further used as an immunogenic conjugate or the like, but it can be used as it is by mixing with an appropriate adjuvant to immunize an animal. Furthermore, human pro MMP-7 is
The fragmented one is linked to various carrier proteins through an appropriate condensing agent to form an immunogenic conjugate such as a hapten-protein, and using this, a monoclonal antibody capable of recognizing only a specific sequence is designed. It can also be used to For example, by applying a gene recombination technique, a DNA sequence obtained by molecular cloning from a natural cell or a known genomic sequence is used, an enzyme or the like is used, or a DNA sequence obtained by chemical synthesis or a modified DNA sequence is Using recombinant antigens obtained by expression in microorganisms, animals, plants, insects, etc., and peptides obtained by peptide chemical synthesis known as liquid phase method or solid phase method using such information or modified peptides. You can also
【０００７】ペプチドの固相合成法は、一般的には自動
ペプチド合成装置により好適に行うことが出来、例えば
ミリジェン・バイオーチ社製（ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉ
ｏｓｅａｒｃｈ）モデル９０５０、モデル９５００、あ
るいはエクセル（Ｅｘｃｅｌｌ）、アプライド・バイオ
システムズ社製（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）モデル４３０Ａやモデル４３１Ａ、デュポン社製
（ＤｕＰｏｎｔ）アールエイエムピーエス（ＲａＭＰ
Ｓ）、国産化学株式会社製「コックさん」、アドバンス
ド・ケムテク社製（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃ
ｈ）モデル３５０などを用いて行うことができる。ヒト
ＭＭＰ−７のＧＩＱＫＬＹＧＫＲＳＮＳＲＫＫ（Ｒ２５
３−２６７）のアミノ酸配列を含むＣ末端領域、ヒトプ
ロＭＭＰ−７のＬＰＬＰＱＥＡＧＧＭＳＥＬＱＷＥＱ
（Ｒ１８−３４）のアミノ酸配列を含むＮ末端領域、あ
るいはそれら領域と実質的に同等の活性あるいは構造を
有するペプチドを合成して免疫原性コンジュゲートと
し、これを用いて特定の配列のみを認識できるモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。[0007] Generally, the solid phase synthesis method of peptides can be preferably carried out by an automatic peptide synthesizer, for example, MilliGen / Bi (MilliGen / Bi).
OSARCH model 9050, model 9500, or Excel, Applied Biosystems (Applied Biosystem)
s) Model 430A, Model 431A, DuPont RMP (RaMP)
S), "Cock-san" manufactured by Kokusan Kagaku Co., Ltd., Advanced ChemTec (Advanced ChemTec)
h) It can be performed using the model 350 or the like. GIQKLYGKRSNSRKK of human MMP-7 (R25
C-terminal region containing the amino acid sequence of 3-267), LPLPQEAMGGMSELQWEQ of human proMMP-7
An N-terminal region containing the amino acid sequence of (R18-34) or a peptide having substantially the same activity or structure as those regions is synthesized to form an immunogenic conjugate, and only a specific sequence is recognized using this. A monoclonal antibody capable of being obtained can be obtained.
【０００８】担体タンパク質類と結合させるにあたって
は、担体タンパク質類はまず活性化されることができ
る。こうした活性化にあたり活性化結合基を導入するこ
とが挙げられる。活性化結合基としては、（１）活性化
エステルあるいは活性化カルボキシ基、例えばニトロフ
ェニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル
基、１−ベンゾトリアゾールエステル基、Ｎ−スクシン
イミドエステル基など、（２）活性化ジチオ基、例えば
２−ピリジルジチオ基などが挙げられる。担体タンパク
質類としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン
（ＫＬＨ），牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブ
ミン、グロブリン、ポリリジンなどのポリペプタイド、
細菌菌体成分、例えばＢＣＧなどが挙げられる。In binding the carrier proteins, the carrier proteins can first be activated. For such activation, introduction of an activating linking group can be mentioned. Examples of the activated linking group include (1) activated ester or activated carboxy group such as nitrophenyl ester group, pentafluorophenyl ester group, 1-benzotriazole ester group, N-succinimide ester group, and (2) activated group. A dithio group, for example, a 2-pyridyldithio group and the like can be mentioned. Carrier proteins include keyhole limpet hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA), ovalbumin, globulin, polypeptides such as polylysine, and the like.
Examples include bacterial cell components such as BCG.
【０００９】２．免疫原性抗原による動物の免疫 動物を免疫するには、例えば村松繁、他編、実験生物学
講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日
本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究
法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生
化学実験講座１２、分子免疫学 III、抗原・抗体・補
体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じ
て行うことができる。抗原と共に用いられるアジュバン
トとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ
（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、
リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカ
などが挙げられる。免疫は、例えばＢＡＬＢ／ｃなどの
マウスをはじめとする動物を使用して行われる。抗原の
投与量は、例えばマウスに対して約１〜４００μｇ／動
物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後
１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔
内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜１０
回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはＢＡＬＢ
／ｃ系マウスの他、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと他系マウス
とのＦ１マウスなどを用いることもできる。必要に応
じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫
の程度を確認できる。2. Immunization of Animals with Immunogenic Antigens To immunize animals, for example, Shigeru Muramatsu, et al., Experimental Biology Course 14, Immunobiology, Maruzen Co., Ltd., 1985, Japan Biochemical Society, ed. 5. Immunobiochemistry research method, Tokyo Kagaku Dojin, 1986, edited by The Biochemical Society of Japan, New Chemistry Experimental Course 12, Molecular Immunology III, Antigen / Antibody / Complement, Tokyo Kagaku Dojin, 1992, etc. It can be carried out according to. Examples of the adjuvant used together with the antigen include Freund's complete adjuvant, Ribi adjuvant, pertussis vaccine, BCG,
Examples include lipid A, liposome, aluminum hydroxide, silica and the like. Immunization is performed using animals such as mice such as BALB / c. The dose of the antigen is, for example, about 1 to 400 μg / animal for a mouse, and it is generally injected intraperitoneally or subcutaneously into a host animal, and thereafter every 1 to 4 weeks, preferably every 1 to 2 weeks. , Subcutaneous, intravenous or intramuscular booster 2-10
Repeat about once. BALB as mouse for immunization
In addition to the / c mouse, an F1 mouse of BALB / c mouse and other mouse can also be used. If necessary, an antibody titer measuring system can be prepared and the antibody titer can be measured to confirm the degree of animal immunity.
【００１０】３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）と
しては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶこと
ができ、例えばＰ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−
１，Eur. J. Immunol., 6, 511〜519, 1976)、ＳＰ２／
０−Ａｇ１４（ＳＰ２，Nature, 276, 269〜270, 1978
) 、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１セルライン由来
のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１，Current to
pics in Microbiol. and Immunol., 81, 1〜7, 1978
）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３，Nature, 256, 49
5〜497, 1975 ) 、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ (６
５３，J. Immunol., 123, 1548〜1550, 1979) などを用
いることができる。８−アザグアニン耐性のマウスミエ
ローマ細胞株はダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培
地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地に、例え
ばペニシリン、アミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清
（ＦＣＳ）などを加え、さらに８−アザグアニン（例え
ば５〜４５μｇ／ｍｌ）を加えた培地で継代されるが、
細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代して所要数の細
胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結
保存株を約３７℃で完全に解凍したのちＲＰＭＩ−１６
４０培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地で
培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよ
い。3. Preparation of myeloma cells (myeloma cells) The infinitely proliferative strain (tumor cell line) used for cell fusion can be selected from cell lines that do not produce immunoglobulin, for example, P3-NS-1-Ag4-1 ( NS-
1, Eur. J. Immunol., 6, 511-519, 1976), SP2 /
0-Ag14 (SP2, Nature, 276, 269-270, 1978
), P3-X63-Ag8-U1 (P3U1, Current to derived from mouse myeloma MOPC-21 cell line)
pics in Microbiol. and Immunol., 81, 1-7, 1978
), P3-X63-Ag8 (X63, Nature, 256, 49
5 to 497, 1975), P3-X63-Ag8.653 (6)
53, J. Immunol., 123, 1548-1550, 1979) and the like. The 8-azaguanine-resistant mouse myeloma cell line is prepared by adding, for example, antibiotics such as penicillin and amikacin, fetal calf serum (FCS), etc. to a cell culture medium such as Dulbecco's MEM medium (DMEM medium) and RPMI-1640 medium. It is passaged in a medium supplemented with azaguanine (for example, 5-45 μg / ml),
The required number of cell lines can be prepared by subculturing in normal medium 2 to 5 days before cell fusion. The cell line used was RPMI-16 after thawing a cryopreserved strain completely at about 37 ° C.
After washing with a normal medium such as 40 medium three times or more, the cells may be cultured in the normal medium to prepare a required number of cell lines.
【００１１】４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細
胞融合 上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは
最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、脾細胞
懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を
得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうし
て得られた脾細胞懸濁液と上記４．の工程に従い得られ
たミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（ＭＥＭ培
地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細
胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリ
コールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当
該分野で知られたものを用いることができ、この様なも
のとしては不活性化したセンダイウイルス（ＨＶＪ：Ｈ
ｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ
Ｊａｐａｎ）などが挙げられる。好ましくは、例えば３
０〜６０％のポリエチレングリコールを０．５〜２ｍｌ
加えることができ、分子量が１，０００〜８，０００の
ポリエチレングリコールを用いることができ、さらに分
子量が１，０００〜４，０００のポリエチレングリコー
ルがより好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチ
レングリコールの濃度は、例えば３０〜６０％となるよ
うにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチル
スルホキシドなどを少量加え、融合を促進することもで
きる。融合に使用する脾細胞（リンパ球）：ミエローマ
細胞株の割合は、例えば１：１〜２０：１とすることが
挙げられるが、より好ましくは４：１〜１０：１とする
ことができる。融合反応を１〜１０分間行い、次にＲＰ
ＭＩ−１６４０培地などの細胞培地を加える。融合反応
処理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心
などにより細胞を分離した後選択用培地に移す。4. Cell fusion of antibody-producing cells and myeloma cells 2. The animal, for example, a mouse immunized according to the step of 1. is subjected to spleen extraction 2 to 5 days after the final immunization to obtain a splenocyte suspension. In addition to splenocytes, lymph node cells in various parts of the body can be obtained and used for cell fusion. The splenocyte suspension thus obtained and 4. The myeloma cell line obtained according to the step of 1. is placed in a cell culture medium such as a minimum essential medium (MEM medium), DMEM medium, RPMI-1640 medium, and a cell fusion agent such as polyethylene glycol is added. As the cell fusion agent, various other ones known in the art can be used. Examples of such cell fusion agents include inactivated Sendai virus (HVJ: H).
emagglutinating virus of
Japan) and the like. Preferably, for example 3
0.5 to 2 ml of 0 to 60% polyethylene glycol
Polyethylene glycol having a molecular weight of 1,000 to 8,000 can be added, and polyethylene glycol having a molecular weight of 1,000 to 4,000 can be more preferably used. The concentration of polyethylene glycol in the fusion medium is preferably 30 to 60%, for example. If necessary, a small amount of dimethyl sulfoxide or the like can be added to promote fusion. The ratio of spleen cells (lymphocytes): myeloma cell line used for fusion may be, for example, 1: 1 to 20: 1, and more preferably 4: 1 to 10: 1. Perform fusion reaction for 1-10 minutes, then RP
Add cell culture medium such as MI-1640 medium. The fusion reaction treatment can be performed multiple times. After the fusion reaction, the cells are separated by centrifugation or the like and then transferred to a selection medium.
【００１２】５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及
びモノクローン化 選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地などの培地、所謂ＨＡＴ培地が挙
げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレ
ートに分注した容量と当容量を翌日加え、その後１〜３
日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換するというようにす
ることができるが、適宜これに変更を加えて行うことも
できる。また融合後８〜１６日目には、アミノプテリン
を除いた、所謂ＨＴ培地で１〜４日ごとに培地交換をす
ることができる。フィーダーとして、例えばマウス胸腺
細胞を使用することもでき、それが好ましい場合があ
る。ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培養
上清を、例えば放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫分析
（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫分析（ＦＩＡ）などの測定
系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）など
で、ヒトＭＭＰ−７あるいはその断片ペプタイドなどを
抗原として用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用い
て目的抗体を測定するなどして、スクリーニングしたり
分離する。目的抗体を産生しているハイブリドーマをク
ローニングする。クローニングは、寒天培地中でコロニ
ーをピック・アップするか、あるいは限界希釈法により
なされうる。限界希釈法でクローニングがより好ましく
行うことができる。クローニングは複数回行うことが好
ましい。5. Selection of hybridoma (fused cell) and monocloning As a selection medium, for example, FCS-containing MEM medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine, R
A medium such as PMI-1640 medium, so-called HAT medium can be mentioned. In general, the selection medium is exchanged by adding the volume dispensed to the culture plate and the equivalent volume to the next day, and then adding 1 to 3
It is possible to change the amount of HAT medium by half each day, but it is also possible to change it appropriately. On the 8th to 16th days after the fusion, the so-called HT medium without aminopterin can be replaced every 1 to 4 days. Mouse thymocytes, for example, can also be used as a feeder, which may be preferred. The culture supernatant of the culture well in which the proliferation of the hybridoma is prominent, for example, a measurement system such as radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), or fluorescence-induced cell separation device (FACS) Then, human MMP-7 or a fragment peptide thereof is used as an antigen, or a target antibody is measured using a labeled anti-mouse antibody, and then screening or isolation is performed. The hybridoma producing the desired antibody is cloned. Cloning can be done by picking up colonies in agar or by limiting dilution. Cloning can be more preferably performed by the limiting dilution method. Cloning is preferably performed multiple times.
【００１３】６．モノクローナル抗体の製造 得られたハイブリドーマ株は、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、
ＲＰＭＩ−１６４０培地などの適当な増殖用培地中で培
養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得
ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリ
ドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエロ
ーマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に
各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、例えばヌー
ド・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖さ
せ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を
回収して得ることが出来る。ハイブリドーマの移植に先
立ち、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、ハイ
ブリドーマを増殖させ、腹水を採取すればよい。腹水液
はそのまま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アン
モニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによる
ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳
動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラ
フィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精
製してモノクローナル抗体として用いることができる。
好ましくは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫
安分画した後、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオ
ン交換ゲル及びプロテインＡカラムの如きアフィニティ
ーカラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好まし
くは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗
原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識す
る部位など）を固定化したアフィニティー・クロマトグ
ラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティー・
クロマトグラフィーなどが挙げられる。6. Production of Monoclonal Antibody The obtained hybridoma strain was prepared from FCS-containing MEM medium,
The desired monoclonal antibody can be obtained from the culture medium by culturing in an appropriate growth medium such as RPMI-1640 medium. In order to obtain a large amount of antibody, ascites of the hybridoma may be mentioned. In this case, each hybridoma is transplanted into the abdominal cavity of a histocompatibility animal of the same strain as the myeloma cell-derived animal and proliferated, or each hybridoma is transplanted into, for example, a nude mouse or the like, proliferated, and produced in the ascites of the animal. The obtained monoclonal antibody can be recovered and obtained. Prior to transplantation of the hybridoma, mineral oil such as pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) is intraperitoneally administered, and then the hybridoma is grown and ascites fluid is collected. The ascites fluid may be used as it is, or may be a conventionally known method, for example, salting out such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration using Sephadex, ion exchange chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, affinity chromatography. It can be purified by high performance liquid chromatography or the like and used as a monoclonal antibody.
Preferably, the ascitic fluid containing the monoclonal antibody can be purified and separated after being subjected to ammonium sulfate fractionation and then treated with an anion exchange gel such as DEAE-Sepharose and an affinity column such as a protein A column. Particularly preferably, affinity chromatography in which an antigen or an antigen fragment (eg, synthetic peptide, recombinant antigenic protein or peptide, site specifically recognized by an antibody, etc.) is immobilized, affinity in which protein A is immobilized
Examples include chromatography.
【００１４】こうして得られたモノクローナル抗体は、
市販のアイソタイプ特異的抗マウスＩｇ抗体、例えばア
イソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体などを用いて
その抗体構成鎖の重鎖及び軽鎖のタイプについて調べる
ことができる。ヒトプロＭＭＰ−７抗原を特異的に認識
できるモノクローナル抗体としては、重鎖のタイプとし
てγ鎖、特にはγ1 鎖、γ2a鎖、γ2b鎖などを持つも
の、αを持つもの、μ鎖を持つものが挙げられ、軽鎖の
タイプとしてκ鎖を持つものが挙げられる。ヒトＭＭＰ
−７ポリペプチド抗原を特異的に認識できるモノクロー
ナル抗体としては、重鎖のタイプとしてγ鎖、特にはγ
1 鎖、γ2a鎖、γ3 鎖などを持つもの、μ鎖を持つもの
が挙げられ、軽鎖のタイプとしてκ鎖を持つものが挙げ
られる。The monoclonal antibody thus obtained is
A commercially available isotype-specific anti-mouse Ig antibody, for example, an isotype-specific rabbit anti-mouse Ig antibody can be used to examine the type of heavy chain and light chain of the antibody constituent chains. Monoclonal antibodies capable of specifically recognizing human pro-MMP-7 antigen include those having a γ chain as the type of heavy chain, particularly those having γ1 chain, γ2a chain, γ2b chain, those having α, and those having μ chain. Examples of the type of light chain include those having a κ chain. Human MMP
As a monoclonal antibody capable of specifically recognizing the -7 polypeptide antigen, the type of heavy chain is γ chain, particularly γ chain.
Examples thereof include those having 1 chain, γ2a chain, γ3 chain and the like, those having μ chain, and examples of the type of light chain include those having κ chain.
【００１５】またこうして大量に得られた抗体の配列を
決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコー
ドする塩基配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗
体を作製することも可能である。さらにこれら抗体をト
リプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理し
て、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ
（ａｂ’）2 といった抗体フラグメントにして使用して
もよい。標識物を付与する抗体としては、ＩｇＧ画分、
例えば抗体含有物を硫安分画した後、ＤＥＡＥ−セファ
ロースの如き、陰イオン交換ゲルで処理して得られるＩ
ｇＧ画分など、更にはペプシン消化後還元して得られる
特異的結合部Ｆａｂ’などを用いることができる。これ
らの場合の標識物の例としては、下記するように酵素
（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼあるいは
β−Ｄ−ガラクトシダーゼなど）、化学物質、蛍光物質
あるいは放射性同位元素などがある。It is also possible to determine the sequence of the antibody thus obtained in large quantities, or to prepare the antibody by gene recombination technology using the nucleotide sequence encoding the antibody obtained from the hybridoma strain. Furthermore, Fab, Fab ′, F obtained by treating these antibodies with an enzyme such as trypsin, papain, pepsin, etc., and optionally reducing them
It may be used as an antibody fragment such as (ab ′) 2 . The antibody giving the labeled substance is an IgG fraction,
For example, I obtained by fractionating an antibody-containing substance with ammonium sulfate and then treating it with an anion exchange gel such as DEAE-Sepharose.
It is possible to use a gG fraction, and further, a specific binding portion Fab ′ obtained by digestion with pepsin followed by reduction. Examples of labeled substances in these cases include enzymes (peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, etc.), chemical substances, fluorescent substances, radioisotopes, etc., as described below.
【００１６】本発明の一つの態様では、ヒトＭＭＰ−７
と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体が提供され
る。より具体的にはこうしたモノクローナル抗体は、ヒ
トＭＭＰ−７のＧＩＱＫＬＹＧＫＲＳＮＳＲＫＫ（Ｒ２
５３−２６７）のアミノ酸配列を含むＣ末端領域を特異
的に認識し、プロＭＭＰ−７、中間体ＭＭＰ−７及び活
性化型ＭＭＰ−７と免疫反応するモノクローナル抗体で
ある。さらにはヒトプロＭＭＰ−７のＬＰＬＰＱＥＡＧ
ＧＭＳＥＬＱＷＥＱ（Ｒ１８−３４）のアミノ酸配列又
はその近傍を含むＮ末端領域を特異的に認識し、プロＭ
ＭＰ−７のみと免疫反応するモノクローナル抗体である
こともできる。またある場合には該モノクローナル抗体
は、ポリペプチドであるＬＰＬＰＱＥＡＧＧＭＳＥＬＱ
ＷＥＱ（Ｒ１８−３４）、ＬＮＭＷＧＫＥＩＰＬＨＦＲ
ＫＶＶＷＧ（Ｒ１３３−１５０）及びＧＩＱＫＬＹＧＫ
ＲＳＮＳＲＫＫ（Ｒ２５３−２６７）には反応せず、プ
ロＭＭＰ−７のみを認識するものである。In one aspect of the invention, human MMP-7
A monoclonal antibody that specifically immunoreacts with is provided. More specifically, such a monoclonal antibody is GIQKLYGKRSNSRKK (R2 of human MMP-7.
53-267), which specifically recognizes the C-terminal region containing the amino acid sequence and immunoreacts with pro-MMP-7, intermediate MMP-7 and activated MMP-7. Furthermore, human pro MMP-7 LPLPQEAG
GMSELQWEQ (R18-34) specifically recognizes the N-terminal region containing the amino acid sequence or its vicinity, and
It can also be a monoclonal antibody that immunoreacts only with MP-7. In some cases, the monoclonal antibody is the polypeptide LPLPQEAGGMSELQ.
WEQ (R18-34), LNMWGKEIPLHFR
KVVWG (R133-150) and GIQKLYGK
It does not react with RSNSRKK (R253-267) and recognizes only pro-MMP-7.
【００１７】本発明の更なる一つの態様では、ヒトプロ
ＭＭＰ−７のＲ１８−３４以外のアミノ酸領域（又は配
列）の一部を特異的に認識し、プロＭＭＰ−７のみと免
疫反応するモノクローナル抗体が提供される。本発明に
従えば「アミノ酸配列又はその近傍」の「その近傍」と
は、ヒトプロＭＭＰ−７のＲ１８−３４以外のアミノ酸
領域（又は配列）の一部であってよく、また実質的に表
８及び図３などで記載されたり、クローン１４１−７Ｂ
２で実質的に代表的に例示されるモノクローナル抗体の
認識部位を意味してよく、あるいはポリペプチドである
ヒトプロＭＭＰ−７のＲ１８−３４、同Ｒ１３３−１５
０及び同Ｒ２５３−２６７には反応せず、プロＭＭＰ−
７のみを認識するモノクローナル抗体の実質的な認識部
位を意味するものであることができる。本発明では、こ
うして得られたヒトＭＭＰ−７に対し特異的に結合する
モノクローナル抗体を用いて検体試料中のＭＭＰ−７を
免疫学的に定量する方法が提供される。特にヒトプロＭ
ＭＰ−７のみを特異的に認識するモノクローナル抗体、
ヒトプロＭＭＰ−７のＬＰＬＰＱＥＡＧＧＭＳＥＬＱＷ
ＥＱ（Ｒ１８−３４）のアミノ酸配列を含むＮ末端領域
あるいはそれと実質的に同等なアミノ酸配列を特異的に
認識し、プロＭＭＰ−７のみと免疫反応するモノクロー
ナル抗体及びヒトＭＭＰ−７のＧＩＱＫＬＹＧＫＲＳＮ
ＳＲＫＫ（Ｒ２５３−２６７）のアミノ酸配列を含むＣ
末端領域あるいはそれと実質的に同等なアミノ酸配列を
特異的に認識し、プロ、中間体及び活性化型ＭＭＰ−７
と免疫反応するモノクローナル抗体から成る群から選ば
れたものを使用したＭＭＰ−７を免疫学的に定量する方
法が提供される。さらにそれぞれヒトプロＭＭＰ−７の
うちの異なる領域に特異性を有するモノクローナル抗体
の少なくとも二つを組み合わせ、ＭＭＰ−７を免疫学的
に定量する方法も提供される。In a further embodiment of the present invention, a monoclonal antibody which specifically recognizes a part of an amino acid region (or sequence) other than R18-34 of human proMMP-7 and immunoreacts with proMMP-7 alone. Will be provided. According to the present invention, "the vicinity" of "the amino acid sequence or its vicinity" may be a part of the amino acid region (or sequence) other than R18-34 of human pro-MMP-7, and is substantially shown in Table 8. And the clone 141-7B described in FIG. 3 and the like.
2 may mean the recognition site of a monoclonal antibody substantially representatively exemplified by 2, or R18-34 and R133-15 of human proMMP-7 which is a polypeptide.
0 and R253-267 did not react with proMMP-
It can mean the substantial recognition site of a monoclonal antibody that recognizes only 7. The present invention provides a method for immunologically quantifying MMP-7 in a specimen sample using the thus obtained monoclonal antibody that specifically binds to human MMP-7. Especially human pro M
A monoclonal antibody that specifically recognizes only MP-7,
LPLPQEAMGGMSELQW of human pro MMP-7
GIQKLYGKRSN of human MMP-7 and monoclonal antibody specifically recognizing N-terminal region containing amino acid sequence of EQ (R18-34) or amino acid sequence substantially equivalent thereto and immunoreactive with only pro-MMP-7
C containing the amino acid sequence of SRKK (R253-267)
It specifically recognizes the terminal region or an amino acid sequence substantially equivalent to the terminal region, and pro, intermediate and activated MMP-7
There is provided a method for immunologically quantifying MMP-7 using one selected from the group consisting of monoclonal antibodies immunoreactive with. Further provided is a method for immunologically quantifying MMP-7 by combining at least two monoclonal antibodies having specificities for different regions of human proMMP-7.
【００１８】本発明の測定は、イムノアッセイ、例えば
競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで
行うことができ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡなどを用いること
ができ、Ｂ−Ｆ分離を行ってもあるいは行わないでその
測定を行うこともできる。好ましくは酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）であり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙
げられる。さらにはまた標識モノクローナル抗体試薬を
用いた免疫細胞染色あるいは免疫組織染色を行うことが
できる。測定は直接法でも間接法でもよい。また間接法
の変法、例えばＰＡＰ法（ペルオキシダーゼ・アンチペ
ルオキシダーゼ法）、ＡＢＣ法（アビジン・ビオチン・
コンプレックス法）、プロテインＡ法などを用いること
もできる。例えばサンドイッチ型アッセイでは、ＭＭＰ
−７に対する抗体の一方を検出可能に標識化する。同じ
抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化する。検体と
標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ順次反応させる
ためインキュベーション処理し、ここで非結合抗体を分
離後、標識物を測定する。測定された標識の量は抗原、
すなわちＭＭＰ−７の量と比例する。このアッセイで
は、不溶化抗体や、標識化抗体の添加の順序に応じてワ
ンステップサンドイッチ型アッセイ、フォワード（forw
ard)サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型
アッセイなどと呼ばれる。例えば洗浄、撹拌、震盪、ろ
過あるいは抗原の予備抽出等は、特定の状況のもとでそ
れら測定工程の中で適宜採用される。特定の試薬、緩衝
液等の濃度、温度あるいはインキュベーション処理時間
などのその他の測定条件は、検体中の抗原の濃度、検体
試料の性質等の要素に従い変えることができる。当業者
は通常の実験法を用いながら各測定に対して有効な最適
の条件を適宜選定して測定を行うことが出来る。The measurement of the present invention can be carried out by an immunoassay, for example, a competitive immunoassay or a non-competitive immunoassay, RIA, ELISA or the like can be used, and the measurement can be carried out with or without BF separation. You can also do Enzyme immunoassay (EIA) is preferable, and a sandwich type assay is also included. Furthermore, immune cell staining or immunohistological staining using a labeled monoclonal antibody reagent can be performed. The measurement may be a direct method or an indirect method. Further, modified indirect methods such as PAP method (peroxidase / antiperoxidase method) and ABC method (avidin / biotin /
Complex method), protein A method and the like can also be used. For example, in a sandwich type assay, MMP
One of the antibodies to -7 is detectably labeled. Another antibody capable of recognizing the same antigen is immobilized on the solid phase. Incubation treatment is performed in order to sequentially react the sample with the labeled antibody and the immobilized antibody, if necessary, and after separating the unbound antibody, the labeled substance is measured. The amount of label measured is the antigen,
That is, it is proportional to the amount of MMP-7. In this assay, depending on the order of addition of insolubilized antibody and labeled antibody, one-step sandwich type assay, forward (forw
ard) It is called a sandwich type assay or an inverse sandwich type assay. For example, washing, stirring, shaking, filtration, pre-extraction of antigen, etc. are appropriately adopted in those measuring steps under specific circumstances. Other measurement conditions such as the concentration of a specific reagent or buffer solution, temperature or incubation treatment time can be changed according to factors such as the concentration of the antigen in the sample and the properties of the sample. Those skilled in the art can appropriately select the optimum conditions effective for each measurement and perform the measurement while using a normal experimental method.
【００１９】抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担
体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用
いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに
使用されるものが種々知られており、本発明においても
勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。特
に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例え
ば活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−
アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材
料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、
ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリ
レート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合
体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ス
チレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタ
クリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタ
クリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲ
ン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロ
ース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチ
ルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または
変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポ
リアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機
高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたも
の、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリ
ング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられ
る。Many carriers are known which can solidify an antigen or an antibody, and in the present invention, they can be appropriately selected and used. As the carrier, various carriers used for antigen-antibody reaction and the like are known, and of course in the present invention, it can be selected from these known carriers and used. Particularly preferably used are, for example, glass, such as activated glass, porous glass, silica gel, silica-
Inorganic materials such as alumina, alumina, magnetized iron, magnetized alloys, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride,
Polyvinylidene fluoride, polyvinyl acetate, polymethacrylate, polystyrene, styrene-butadiene copolymer, polyacrylamide, crosslinked polyacrylamide, styrene-methacrylate copolymer, polyglycidyl methacrylate, acrolein-ethylene glycol dimethacrylate copolymer, etc. Albumin, collagen, gelatin, dextran, agarose, cross-linked agarose, cellulose, microcrystalline cellulose, carboxymethyl cellulose, natural or modified cellulose such as cellulose acetate, cross-linked dextran, polyamide such as nylon, polyurethane, polyepoxy resin and other organic polymers Substances, those obtained by emulsion polymerization of them, cells, erythrocytes, etc., and if necessary, functional groups such as silane coupling agents. Which are introduced are mentioned.
【００２０】さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、
例えば試験管、タイタープレート、タイターウェル、ガ
ラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセ
ル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたり
あるいは細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたり
あるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの
固体物質（物体）の表面などが挙げられる。これら担体
へは、抗体を結合させることができ、好ましくは本発明
で得られるヒトマトリックスメタロプロテアーゼ７に対
し特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させるこ
とができる。担体とこれら抗原抗体反応に関与するもの
との結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤
などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりする
化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用
した手法などにより行うことが出来る。Further, filter paper, beads, inner wall of test container,
For example, test tubes, titer plates, titer wells, glass cells, cells made of synthetic materials such as synthetic resin cells, glass rods, rods made of synthetic material, rods with thick or thin ends, and rounded protrusions at the ends. The surface of a solid substance (object) such as a stick or a flat projection, or a thin plate-like stick may be mentioned. An antibody can be bound to these carriers, preferably a monoclonal antibody that specifically binds to human matrix metalloproteinase 7 obtained in the present invention. The binding between the carrier and those involved in these antigen-antibody reactions may be carried out by a physical method such as adsorption, a chemical method using a condensing agent or the like, or an activated method, or the mutual method. It can be performed by a method utilizing a chemical bonding reaction.
【００２１】標識としては、酵素、酵素基質、酵素イン
ヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵
素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、
発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コ
ロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵
素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸
化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル
基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転
移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテ
ル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵
素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げるこ
とができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に
利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利
用することもできる。As the label, an enzyme, an enzyme substrate, an enzyme inhibitor, a prosthetic group, a coenzyme, an enzyme precursor, an apoenzyme, a fluorescent substance, a pigment substance, a chemiluminescent compound,
Examples thereof include a luminescent substance, a coloring substance, a magnetic substance, metal particles such as gold colloid, and a radioactive substance. Examples of the enzyme include dehydrogenase, reductase, oxidoreductase such as oxidase, for example, amino group, carboxyl group, methyl group, acyl group, transferase that catalyzes transfer of phosphate group, for example, ester bond, Examples thereof include hydrolases that hydrolyze glycoside bonds, ether bonds, peptide bonds and the like, lyases, isomerases and ligases. Enzymes can also be used for detection by using multiple enzymes in combination. For example, enzymatic cycling can be utilized.
【００２２】代表的な酵素標識としては、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ
−ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、マレエー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォスフェー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラー
ゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリ
ホスファターゼなどのアルカリ・フォスファターゼなど
が挙げられる。アルカリホスファターゼを用いた場合、
４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウン
ベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなど
のリン酸化フェノール誘導体、ＮＡＤＰを利用した酵素
的サイクリング系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン
誘導体などの基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光
などにより測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ
系を利用したりすることもできる。カタラーゼを用いた
場合、過酸化水素と反応して酸素を生成するので、その
酸素を電極などで検知することもできる。電極としては
ガラス電極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電
極、高分子膜電極などであることもできる。酵素標識
は、ビオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトア
ビジン）に置き換えることも可能である。標識は、複数
の異なった種類の標識を使用することもできる。こうし
た場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、
そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすること
もできる。As a typical enzyme label, peroxidase such as horseradish peroxidase, E. coli β-D
-Galactosidases such as galactosidase, maleate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucose oxidase, glucoamylase, acetylcholinesterase, catalase, bovine intestinal alkaline phosphatase, and alkaline phosphatase such as Escherichia coli alkaline phosphatase. When using alkaline phosphatase,
Produced by using umbelliferone derivatives such as 4-methylumbelliferyl phosphate, phosphorylated phenol derivatives such as nitrophenyl phosphate, enzymatic cycling systems utilizing NADP, luciferin derivatives, dioxetane derivatives, etc. It can be measured by fluorescence or luminescence. The luciferin and luciferase system can also be used. When catalase is used, it reacts with hydrogen peroxide to generate oxygen, and the oxygen can be detected by an electrode or the like. The electrode may be a glass electrode, an ion electrode using a poorly soluble salt film, a liquid film type electrode, a polymer film electrode, or the like. The enzyme label can be replaced with a biotin label and an enzyme-labeled avidin (streptavidin). The label can also use a plurality of different types of labels. In such cases, multiple measurements can be made continuously or non-continuously.
It can also be possible to do it simultaneously or separately.
【００２３】本発明においては、信号の形成に４−ヒド
ロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミン、テ
トラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオキシダ
ーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニル
ガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダーゼ、グルコ
ース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の
組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾ
キノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合
物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェ
ノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの作用
により形成しうるものが使用できる。In the present invention, 4-hydroxyphenylacetic acid, 1,2-phenylenediamine, tetramethylbenzidine, etc. and horseradish peroxidase, umbelliferylgalactoside, nitrophenylgalactoside, etc., and β-D-galactosidase are used for signal formation. A combination of enzyme reagents such as glucose-6-phosphate / dehydrogenase can also be used, and quinol compounds such as hydroquinone, hydroxybenzoquinone and hydroxyanthraquinone, thiol compounds such as lipoic acid and glutathione, phenol derivatives, ferrocene derivatives, etc. What can be formed by the action of can be used.
【００２４】蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合
物としては、フルオレセインイソチオシアネート、例え
ばローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルロー
ダミンイソチオシアネートなどのローダミン誘導体、ダ
ンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスカミ
ン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルミフ
ェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどのルミノー
ル、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類キレート
化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。標識するに
は、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスル
フィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基
の反応などを利用して行うことができ、公知の方法ある
いは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらには
それらを修飾した方法の中から適宜選択して適用でき
る。また上記免疫原性コンジュゲート作製に使用される
ことのできる縮合剤、担体との結合に使用されることの
できる縮合剤などを用いることができる。Examples of the fluorescent substance or chemiluminescent compound include fluorescein isothiocyanate, rhodamine derivatives such as rhodamine B isothiocyanate and tetramethylrhodamine isothiocyanate, dansyl chloride, dansyl fluoride, fluorescamine, phycobiliprotein, acridinium salt, Examples thereof include luminol such as lumiferin, luciferase, and equalin, imidazole, oxalate ester, rare earth chelate compound, and coumarin derivative. The labeling can be carried out by utilizing a reaction between a thiol group and a maleimide group, a reaction between a pyridyl disulfide group and a thiol group, a reaction between an amino group and an aldehyde group, etc. It can be applied by appropriately selecting from among the methods that can be applied to the above, and methods that have modified them. Further, a condensing agent that can be used for producing the immunogenic conjugate, a condensing agent that can be used for binding to a carrier, and the like can be used.
【００２５】縮合剤としては、例えばグルタルアルデヒ
ド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレン
ジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨ
ードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミ
ド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネー
ト、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミ
ジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓ
ＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト、Ｎ−スクシンイミジル （４−ヨードアセチル）ア
ミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（１−
マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミ
ドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ），イ
ミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水
物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオン
イミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデー
ト、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ
−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテー
トなどが挙げられる。Examples of the condensing agent include glutaraldehyde, hexamethylene diisocyanate, hexamethylene diisothiocyanate, N, N'-polymethylene bisiodoacetamide, N, N'-ethylene bismaleimide, ethylene glycol bissuccinimidyl succinate. Nate, bisdiazobenzidine, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (S
PDP), N-succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (S
MCC), N-sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, N-succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate, N-succinimidyl 4- (1-
Maleimidophenyl) butyrate, N- (ε-maleimidocaproyloxy) succinimide (EMCS), iminothiolane, S-acetylmercaptosuccinic anhydride, methyl-3- (4′-dithiopyridyl) propionimidate, methyl- 4-mercaptobutyryl imidate, methyl-3-mercaptopropion imidate, N
-Succinimidyl-S-acetylmercaptoacetate and the like.
【００２６】本発明の測定法によれば、測定すべき物質
を酵素などで標識したモノクローナル抗体試薬と、担体
に結合された抗体とを順次反応させることもできるし、
同時に反応させることもできる。試薬を加える順序は選
ばれた担体系の型により異なる。感作されたプラスチッ
クなどのビーズを用いた場合には、酵素などで標識した
モノクローナル抗体試薬を測定すべき物質を含む検体試
料と共に最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後該感
作されたプラスチックなどのビーズを加えることにより
測定を行うことができる。本発明の定量法においては、
免疫学的測定法が用いられるが、その際の固相の担体と
しては抗体等タンパク質を良く吸着するポリスチレン
製、ポリカーボナイト製、ポリプロピレン製あるいはポ
リビニル製のボール、マイクロプレート、スティック、
微粒子あるいは試験管等の種々の材料および形態を任意
に選択し使用することができる。測定にあたっては至適
ｐＨ、例えばｐＨ約４〜９に保つように適当な緩衝液系
中で行うことができる。特に適切な緩衝剤としては、例
えばアセテート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェ
ート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝
剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、
トリス−塩酸緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに
任意の割合で混合して用いることができる。抗体抗原反
応は約０℃〜６０℃の間の温度で行うことが好ましい。According to the measuring method of the present invention, the monoclonal antibody reagent in which the substance to be measured is labeled with an enzyme and the antibody bound to the carrier can be sequentially reacted,
It is possible to react at the same time. The order of adding the reagents depends on the type of carrier system chosen. When beads such as sensitized plastic are used, the monoclonal antibody reagent labeled with an enzyme or the like is first put together with an analyte sample containing a substance to be measured in a suitable test tube, and then the sensitized The measurement can be performed by adding beads such as plastic. In the quantitative method of the present invention,
Immunological measurement method is used, as the solid-phase carrier in that case polystyrene, which is well adsorbed proteins such as antibodies, polycarbonate, polypropylene or polyvinyl balls, microplates, sticks,
Various materials and forms such as fine particles or test tubes can be arbitrarily selected and used. The measurement can be carried out in an appropriate buffer system so as to maintain the optimum pH, for example, about pH 4-9. Particularly suitable buffers include, for example, acetate buffer, citrate buffer, phosphate buffer, Tris buffer, triethanolamine buffer, borate buffer, glycine buffer, carbonate buffer,
Examples include Tris-hydrochloric acid buffer. The buffering agents can be used as a mixture with each other in an arbitrary ratio. The antibody-antigen reaction is preferably carried out at a temperature between about 0 ° C and 60 ° C.
【００２７】酵素などで標識されたモノクローナル抗体
試薬及び担体に結合せしめられた抗体試薬、さらには測
定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達す
るまで行うことができるが、抗体抗原反応の平衡が達成
されるよりもずっと早い時点で固相と液相とを分離して
限定されたインキュベーション処理の後に反応を止める
ことができ、液相又は固相のいずれかにおける酵素など
の標識の存在の程度を測ることができる。測定操作は、
自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、
ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクターなど
を使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シ
グナルを検知して測定することもできる。抗体抗原反応
においては、それぞれ用いられる試薬、測定すべき物
質、さらには酵素などの標識を安定化したり、抗体抗原
反応自体を安定化するように適切な手段を講ずることが
できる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻害的に働
く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性化したり
するため、タンパク質、安定化剤、界面活性化剤、キレ
ート化剤などをインキュベーション溶液中に加えること
もできる。当該分野で普通に採用されていたりあるいは
当業者に知られた非特異的結合反応を防ぐためのブロッ
キング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正
常血清タンパク質、アルブミン、スキムミルク、乳発酵
物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができ
る。非特異的結合反応を防ぐ目的である限り、それらの
方法は特に限定されず用いることが出来る。The incubation treatment of the monoclonal antibody reagent labeled with an enzyme, the antibody reagent bound to the carrier, and the substance to be measured can be carried out until equilibrium is reached, but the equilibrium of the antibody-antigen reaction is achieved. It is possible to separate the solid phase and the liquid phase at a much earlier time to stop the reaction after a limited incubation treatment, and to determine the extent of the presence of a label such as an enzyme in either the liquid or solid phase. It can be measured. The measurement operation is
It is possible to use an automated measuring device,
It is also possible to detect and measure the display signal generated by converting the substrate by the action of the enzyme using a luminescence detector, a photo detector or the like. In the antibody-antigen reaction, appropriate means can be taken to stabilize the reagents, substances to be measured, labels such as enzymes, or the antibody-antigen reaction itself. In addition, proteins, stabilizers, surfactants, chelating agents, etc. should be added to the incubation solution to remove non-specific reactions, reduce inhibitory effects, or activate measurement reactions. It can also be added. It may be subjected to a blocking treatment which is commonly used in the art or is known to those skilled in the art to prevent a nonspecific binding reaction, for example, normal serum protein of mammals, albumin, skim milk, milk fermented substances. , Collagen, gelatin and the like. As long as the purpose is to prevent non-specific binding reaction, those methods can be used without particular limitation.
【００２８】本発明の測定方法で測定される試料として
は、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液などが使用しう
るが、好ましくは生物由来の流体試料、例えば血液、血
漿、、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、尿、その他の体
液、細胞培養液、組織培養液、生検検体、例えば細胞、
組織、臓器、腫瘍組織などが挙げられる。特に好ましく
は血漿、血清などが挙げられる。本発明の標識モノクロ
ーナル抗体試薬を用いた免疫細胞染色あるいは免疫組織
染色では、生検検体、例えば細胞、組織、臓器、腫瘍組
織などが好適に用いられ、それら試料は染色前に必要に
応じ固定化することができる。組織の固定化には当該分
野で広く使用されているものあるいはそれから誘導され
たものを使用できる。例えばペリオデイト−リジン−パ
ラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ブアン、ホ
ルマリン、パラホルムアルデヒド、ザンボニー、アクロ
レインなどが使用できる。またパラフィンなどで固定化
することもできる。The sample to be measured by the measuring method of the present invention may be any form of solution or colloidal solution, but preferably a biological fluid sample such as blood, plasma, joint fluid, cerebrospinal fluid. , Saliva, amniotic fluid, urine and other body fluids, cell culture medium, tissue culture medium, biopsy specimens such as cells,
Examples include tissues, organs and tumor tissues. Particularly preferred are plasma and serum. In immunocyte staining or immunohistochemical staining using the labeled monoclonal antibody reagent of the present invention, biopsy specimens such as cells, tissues, organs, tumor tissues, etc. are preferably used, and those samples are immobilized as necessary before staining. can do. Those widely used in the art or those derived therefrom can be used for the immobilization of tissues. For example, periodate-lysine-paraformaldehyde, glutaraldehyde, bouin, formalin, paraformaldehyde, zambony, acrolein and the like can be used. It can also be fixed with paraffin or the like.
【００２９】[0029]
【実施例】以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されず、様々な実
施形態が可能であり、本発明は本明細書及び図面に開示
の思想に従ったものであるかぎり、すべての実施形態を
包含することは理解されるべきである。 実施例１ 抗原の作製 （ａ）ヒト直腸癌細胞由来プロＭＭＰ−７の調製 ＣａＲ−１細胞をダルベッコ変法イーグル／Ｆ１２培地
（ライフテックオリエンタル製）で培養した。まず、１
０％ＦＣＳ、ペニシリン及びストレプトマイシンを含む
ダルベッコ変法イーグル／Ｆ１２培地中で、ＣａＲ−１
細胞をコンフルエントまで培養した。次に、０．２％ラ
クトアルブミン水酸化物を含み無血清としたＢＴ５６３
培地（バイオテスト製、ドイツ）で１４日間培養し、そ
の培養液を回収した。得られた培養液から、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１４２４５−１４２５５，１
９８６及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１７
１２−２１７１９，１９９２に記載のＯｋａｄａ ｅｔ
ａｌ．の方法に従いヒトＭＭＰ−７を精製した。培養
液をＹＭ−１０メンブラン（Ａｍｉｃｏｎ製）を用いて
濃縮し、その濃縮液を０．１５Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ
ＣａＣｌ2 ，０．０２％ ＮａＮ3 含有５０ｍＭ トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−
セルロースカラムに供し、グリコサアミノグリカンを取
り除いた。次に、非吸着画分を同緩衝液で平衡化したＧ
ｒｅｅｎ Ａ Ｄｙｅｍａｔｒｉｘ ｇｅｌ（Ａｍｉｃ
ｏｎ製）カラムに供した。ＭＭＰ−７の大部分は吸着し
上記緩衝液に０．０５％ Ｂｒｉｊ３５を加え、ＮａＣ
ｌ濃度０．１５Ｍ〜２．０Ｍの濃度勾配で溶出させた。
溶出画分を分取し、５ｍＭ ＣａＣｌ2 ，０．０５％
Ｂｒｉｊ３５，０．０２％ ＮａＮ3 含有１０ｍＭ ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対し透析後、同緩衝
液にて平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラムに供し
た。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples, and various embodiments are possible, and the present invention is described in this specification and the drawings. It should be understood to include all embodiments as long as they are in accordance with the spirit of the disclosure. Example 1 Preparation of Antigen (a) Preparation of Human Rectal Cancer Cell-Derived Pro MMP-7 CaR-1 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle / F12 medium (manufactured by Lifetech Oriental). First, 1
CaR-1 in Dulbecco's modified Eagle / F12 medium containing 0% FCS, penicillin and streptomycin.
The cells were grown to confluence. Next, serum-free BT563 containing 0.2% lactalbumin hydroxide
The cells were cultured in a medium (Biotest, Germany) for 14 days, and the culture solution was collected. From the obtained culture solution, J. Bio
l. Chem. , 261, 14245-14255, 1
986 and J. Biol. Chem. , 267, 217
12-21719, 1992, Okada et.
al. Human MMP-7 was purified according to the method described in 1. The culture solution was concentrated using a YM-10 membrane (manufactured by Amicon), and the concentrated solution was 0.15M NaCl, 5 mM.
DEAE-equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing CaCl 2 and 0.02% NaN 3.
It was applied to a cellulose column to remove glycosaminoglycan. Next, the non-adsorbed fraction was equilibrated with the same buffer G
reen A Dyematrix gel (Amic
on) column. Most of MMP-7 was adsorbed and 0.05% Brij35 was added to the above buffer solution to obtain NaC.
The elution was performed with a concentration gradient of 0.15M to 2.0M.
The elution fraction was collected and 5 mM CaCl 2 , 0.05%
Brij35,0.02% NaN 3 containing 10mM Tris - dialyzed against HCl buffer (pH 8.0), was subjected to DEAE- cellulose column equilibrated with the same buffer.
【００３０】非吸着画分にあるＭＭＰ−７を分取し０．
１５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ2 ，０．０５％Ｂ
ｒｉｊ３５，０．０２％ ＮａＮ3 含有２５ｍＭ ホウ
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に対し透析し、その
透析液を亜鉛キレートセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ製）カラムに供した。プロＭＭＰ−７と活性化型であ
るＭＭＰ−７を１ｍＭ ＣａＣｌ2 ，０．０５％ Ｂｒ
ｉｊ３５，０．０２％ＮａＮ3 含有２５ｍＭ カコジル
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解したＮａＣｌ
の濃度勾配により分離した。活性化型ＭＭＰ−７は０．
１５Ｍ ＮａＣｌ含有同緩衝液で溶出され、プロＭＭＰ
−７は１Ｍ ＮａＣｌ含有同緩衝液にて溶出された。プ
ロＭＭＰ−７画分をＹＭ−１０メンブランにて濃縮し、
０．４ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ2 ，０．０
５％ Ｂｒｉｊ３５，０．０２％ ＮａＮ3含有５０ｍ
Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したウ
ルトロゲルＡｃＡ４４（ＩＢＦ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃ
ｓ製）カラムによりゲルろ過し、高分子側の不純物を除
去した。得られた精製ヒトプロＭＭＰ−７に２０ｍＭ
ＥＤＴＡを加え、室温で３時間静置した後、０℃で保存
した。また精製ヒトプロＭＭＰ−７をデドシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）に供したところ、分子量２８ｋＤａの単一バン
ドを示した。MMP-7 in the non-adsorbed fraction was collected, and
15M NaCl, 1 mM CaCl 2 , 0.05% B
rij35, dialyzed against 25 mM sodium borate buffer (pH 8.0) containing 0.02% NaN 3 , and the dialyzed solution was treated with zinc chelate sepharose (Pharmaci).
a) column. ProMMP-7 and activated MMP-7 were treated with 1 mM CaCl 2 , 0.05% Br.
ij35, NaCl dissolved in 25 mM sodium cacodylate buffer (pH 6.5) containing 0.02% NaN 3
Were separated by a concentration gradient of. Activated MMP-7 was 0.
Elution with the same buffer containing 15 M NaCl gave pro-MMP
-7 was eluted with the same buffer containing 1 M NaCl. The proMMP-7 fraction was concentrated on a YM-10 membrane,
0.4 mM NaCl, 10 mM CaCl 2 , 0.0
5m Brij 35, 0.02% NaN 3 containing 50m
Ultrogel AcA44 (IBF Biotechnic) equilibrated with M Tris-HCl buffer (pH 7.4).
s) column to perform gel filtration to remove impurities on the polymer side. 20 mM to the obtained purified human pro MMP-7
EDTA was added and the mixture was allowed to stand at room temperature for 3 hours and then stored at 0 ° C. Purified human pro MMP-7 was also subjected to sodium dedosyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-P
When subjected to AGE), it showed a single band with a molecular weight of 28 kDa.
【００３１】（ｂ）ヒトＭＭＰ−７ポリペプチドの調製 ヒトＭＭＰ−７ポリペプチドとして、Ｍｕｌｌｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５３，１８７−
１９２，１９８８に記載のアミノ酸配列を用いた。ヒト
ＭＭＰ−７ Ｃ末端領域ポリペプチド（Ｃ−ＧＩＱＫＬ
ＹＧＫＲＳＮＳＲＫＫ，Ｒ２５３−２６７）をペプチド
シンセサイザー９６００（ミリジエン／バイオサーチ
製）で合成した。なお、ペプチドＮ末端にシステインを
導入した。次に１２．２ｍｇＫＬＨを１．９５ｍｌの
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したもの
と、１１．６ｍｇ ＥＭＣＳ １７６．１μｌのジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したものとを混合し、
３０℃，３０分間インキュベーションした。次に、上記
の混合液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡
化したＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）でゲ
ルろ過し、マレイミドが結合されたＫＬＨを分取し、
１．５ｍｌに濃縮した。マレイミドが結合されたＫＬＨ
に対し５０倍モル量の合成ヒトＭＭＰ−７ポリペプチド
３．５ｍｇを０．５４７ｍｌ ０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に溶解したものを混合した。４℃、２０
時間インキュベーションし、ＭＭＰ−７ポリペプチド−
ＫＬＨ複合体を調製した。(B) Preparation of human MMP-7 polypeptide As a human MMP-7 polypeptide, Muller e was used.
t al. , Biochem. J. , 253,187-
The amino acid sequence described in 192,1988 was used. Human MMP-7 C-terminal region polypeptide (C-GIQKL
YGKRSNSRKK, R253-267) was synthesized on a peptide synthesizer 9600 (manufactured by Millidiene / Biosearch). In addition, cysteine was introduced into the N-terminal of the peptide. Next, 12.2 mg KLH dissolved in 1.95 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) and 11.6 mg EMCS 176.1 μl of dimethylformamide (DMF) were mixed,
Incubated at 30 ° C for 30 minutes. Next, the above mixed solution was subjected to gel filtration with a PD-10 column (manufactured by Pharmacia) equilibrated with a 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) to separate maleimide-bound KLH,
Concentrated to 1.5 ml. KLH bound with maleimide
A 50-fold molar amount of synthetic human MMP-7 polypeptide (3.5 mg) dissolved in 0.547 ml 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) was mixed. 4 ° C, 20
Incubate for a period of time to allow MMP-7 polypeptide-
The KLH complex was prepared.
【００３２】実施例２ 抗ヒトプロＭＭＰ−７モノクロ
ーナル抗体の作製 （ａ）抗体産生細胞の調製 実施例１（ａ）に記載の方法により調製したヒトプロＭ
ＭＰ−７ ２６μｇをフロイント完全アジュバントと共
に６週令 ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス２匹にそれぞれ腹腔内
投与し初回免疫とした。その後１７日目に１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した２６μｇヒト
プロＭＭＰ−７で追加免疫した。最終免疫として５２日
目に追加免疫時と同様にヒトプロＭＭＰ−７ ２６μｇ
を静脈内投与し、３日後にマウス脾臓を取り出し脾臓細
胞を調製した。Example 2 Preparation of anti-human pro-MMP-7 monoclonal antibody (a) Preparation of antibody-producing cells Human pro-M prepared by the method described in Example 1 (a)
26 μg of MP-7 together with Freund's complete adjuvant was intraperitoneally administered to each of two 6-week-old BALB / c female mice for primary immunization. Then, on the 17th day, booster immunization with 26 µg human proMMP-7 dissolved in 10 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.4) was performed. On the 52nd day as the final immunization, human proMMP-7 (26 μg) was used as in the booster immunization.
Was intravenously administered, and 3 days later, the mouse spleen was taken out to prepare spleen cells.
【００３３】（ｂ）細胞融合 （１）以下の材料及び方法を用いる。 ＲＰＭＩ−１６４０培地：ＲＰＭＩ−１６４０（ＪＲＨ
Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ製）に重炭酸ナトリウム（２４
ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン
Ｇカリウム（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン
（５０μｇ／ｍｌ）及び硫酸アミカシン（１００μｇ／
ｍｌ）を加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．
２２μｍミリポアフィルターで除菌ろ過する。 ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ−１６４０培地に除菌ろ過
したＦＣＳ（ＪＲＨＢｉｏｓｉｅｎｃｅｓ製）を１５％
（ｖ／ｖ）の濃度に加える。 ＰＥＧ４０００溶液：ＲＰＭＩ−１６４０培地にポリエ
チレングリコール４０００（ＰＥＧ ４０００，Ｍｅｒ
ｃｋ ａｎｄ ＣＯ．，Ｉｎｃ．製）５０％（ｗ／ｗ）
無血清溶液を調製する。８−アザグアニン耐性ミエロー
マ細胞ＳＰ２（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）との融合は、Ｓ
ｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａ
ｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈ
ｅｌｌ ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｗ．Ｈ．Ｆ
ｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）、
３５１〜３７２に記載のＯｉ ａｎｄ Ｈｅｒｚｅｎｂ
ｅｒｇ法を若干改変して行った。(B) Cell fusion (1) The following materials and methods are used. RPMI-1640 medium: RPMI-1640 (JRH
Biosciences) with sodium bicarbonate (24
mM), sodium pyruvate (1 mM), penicillin G potassium (50 U / ml), streptomycin sulfate (50 μg / ml) and amikacin sulfate (100 μg / ml).
ml), and the pH was adjusted to 7.2 with dry ice.
Sterilize and filter with a 22 μm Millipore filter. NS-1 medium: 15% of FCS (manufactured by JRH Biosciences) obtained by sterilizing and filtering the above RPMI-1640 medium
Add to the concentration of (v / v). PEG 4000 solution: Polyethylene glycol 4000 (PEG 4000, Mer in RPMI-1640 medium)
ck and CO. , Inc. Made) 50% (w / w)
Prepare a serum-free solution. Fusion with 8-azaguanine-resistant myeloma cells SP2 (SP2 / 0-Ag14) resulted in S
elected Method in Cellula
r Immunology (eds. BB Mish
ell and S. M. Shiigi), W.W. H. F
reeman and Company (1980),
Oi and Herzenb described in 351 to 372.
The erg method was slightly modified.
【００３４】（２）前記（ａ）項で調製した有核脾臓細
胞（生細胞率１００％）とミエローマ細胞（生細胞率１
００％）とを６：１の割合で融合した。脾臓細胞とミエ
ローマ細胞をそれぞれ前記ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗
浄した。次に、融合させるためにそれぞれ同じ培地に懸
濁させた有核脾臓細胞６×１０8 とミエローマ細胞１×
１０8 を混合した。次に、１，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１
０分間の遠心分離により細胞を沈殿させ上清を完全に吸
引除去した。沈殿した細胞に３７℃に加温したＰＥＧ
４，０００溶液３．３ｍｌを穏やかに攪拌しながら１分
間で滴下し、１分間攪拌し細胞を再懸濁、分散させた。
次に３７℃に加温したＲＰＭＩ−１６４０培地３．３ｍ
ｌを１分間で滴下した。この操作をさらに１回繰り返し
た後、同培地２３．１ｍｌを２〜３分間で常に攪拌しな
がら滴下し、細胞を分散させた。これを１，０００ｒ．
ｐ．ｍ．で７分間遠心分離し上清を完全に吸引除去し
た。次にこの沈殿細胞に３７℃に加温したＮＳ−１培地
３３ｍｌを速やかに加え、大きい細胞塊を注意深くピッ
ペティングで分散させた。さらに同培地６６ｍｌを加え
て希釈しポリスチレン製９６穴マイクロウエル（岩城硝
子製）にウエルあたり６×１０5 個／０．１ｍｌの細胞
を加えた。このマイクロウエルを７％炭酸ガス／９３％
空気中で温度３７℃、湿度１００％下で培養した。(2) Nucleated spleen cells (live cell ratio 100%) and myeloma cells (live cell ratio 1) prepared in the above (a).
00%) was fused at a ratio of 6: 1. Spleen cells and myeloma cells were washed with the RPMI-1640 medium. Next, 6 × 10 8 nucleated spleen cells and 1 × myeloma cells suspended in the same medium for fusion were used.
10 8 were mixed. Next, 1,000 r. p. m. In 1
The cells were precipitated by centrifugation for 0 minutes and the supernatant was completely removed by suction. PEG heated at 37 ° C to the precipitated cells
3.3 ml of 4,000 solution was added dropwise over 1 minute with gentle stirring, and stirred for 1 minute to resuspend and disperse the cells.
Next, RPMI-1640 medium 3.3m heated to 37 ° C
1 was added dropwise for 1 minute. After repeating this operation once more, 23.1 ml of the same medium was added dropwise over 2 to 3 minutes with constant stirring to disperse the cells. This is 1,000 r.
p. m. After centrifugation for 7 minutes, the supernatant was completely removed by suction. Next, 33 ml of NS-1 medium heated to 37 ° C. was immediately added to the precipitated cells, and large cell clusters were carefully dispersed by pipetting. Further, 66 ml of the same medium was added to dilute, and 6 × 10 5 cells / 0.1 ml of cells were added per well to 96-well microwells made of polystyrene (made by Iwaki Glass). This microwell is 7% carbon dioxide / 93%
The cells were cultured in air at a temperature of 37 ° C and a humidity of 100%.
【００３５】（ｃ）選択培地によるハイブリドーマの選
択的増殖 （１）使用する培地は以下のとおりである。 ＨＡＴ培地：前記（ｃ）項で述べたＮＳ−１培地にさら
にヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン
（０．４μＭ）及びチミジン（１６μＭ）を加える。 ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。 （２）前記（ｂ）項の培養開始後翌日（１日目）、細胞
にピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｍｌ）を加え
た。２，３，５，８日目に培地の半分（約０．１ｍｌ）
を新しいＨＡＴ培地で置き換えた。１１日目に培地の半
分を新しいＨＴ培地に置き換えた。１５日目にハイブリ
ドーマの充分な生育が観察された全ウエルについて、次
項（ｄ）記載のＥＬＩＳＡにより陽性ウエルを調べた。
次に、フィーダーとして１０7 個のマウス胸腺細胞を含
むＨＴ培地１ｍｌをポリスチレン製２４穴セルウエル
（住友ベークライト製）の各ウエルに加え、上記で検出
された各陽性ハイブリドーマの充分生育した時点でＥＬ
ＩＳＡにより陽性を再確認し、それぞれについて次項
（ｅ）記載の限界希釈法によるクローニングを行った。(C) Selective growth of hybridoma by selective medium (1) The following medium is used. HAT medium: Hypoxanthine (100 μM), aminopterin (0.4 μM) and thymidine (16 μM) are further added to the NS-1 medium described in the above (c). HT medium: HAT described above except that aminopterin was removed
It has the same composition as the medium. (2) On the next day (1st day) after the start of culture in the above item (b), 2 drops (about 0.1 ml) of HAT medium was added to the cells with a pipette. Half of the medium on day 2, 3, 5, and 8 (about 0.1 ml)
Was replaced with fresh HAT medium. On day 11, half of the medium was replaced with fresh HT medium. On the 15th day, all wells in which sufficient growth of hybridoma was observed were examined for positive wells by the ELISA described in the next item (d).
Next, 1 ml of HT medium containing 10 7 mouse thymocytes as a feeder was added to each well of a polystyrene 24-well cell well (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), and when each positive hybridoma detected above was fully grown, EL
The positivity was reconfirmed by ISA, and each was subjected to cloning by the limiting dilution method described in the following item (e).
【００３６】（ｄ）ＥＬＩＳＡによる抗ヒトプロＭＭＰ
−７抗体産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０４，２０５〜２１
４，１９８０に記載のＲｅｎｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．の
方法を若干改変した方法を用いて行った。前記実施例１
（ａ）で精製したヒトプロＭＭＰ−７ ５０ｎｇ／ウエ
ルで９６穴マイクロタイトレーションプレート（Ｆｌｏ
ｗ Ｌａｂ．製）をコートした。これに、前記（ｃ）で
得られたハイブリドーマ生育ウエルの上清の一部を加え
て、室温で約１時間静置した。２次抗体として西洋わさ
びペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウス免疫グ
ロブリン（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂ．製）を加え、さらに
室温で約１時間静置した。次に、基質である過酸化水素
とｏ−フェニレンジアミンを加え発色の程度をマイクロ
プレートリーダー（ＭＲＰ−Ａ４，東ソー製）を用いて
４９２ｎｍの吸光度で測定した。(D) Anti-human pro MMP by ELISA
-7 Search for antibody-producing hybridoma Anal. Biochem. , 104, 205-21
4, 1980, Renard et al. Was carried out using a method with a slight modification of the above method. Example 1
Human pro MMP-7 purified in (a) 50 ng / well in 96-well microtitration plate (Flo
w Lab. Manufactured). A part of the supernatant of the hybridoma growing well obtained in (c) above was added thereto, and the mixture was allowed to stand at room temperature for about 1 hour. Horseradish peroxidase (HRP) -labeled goat anti-mouse immunoglobulin (manufactured by Cappel Lab.) Was added as a secondary antibody, and the mixture was allowed to stand at room temperature for about 1 hour. Next, hydrogen peroxide as a substrate and o-phenylenediamine were added, and the degree of color development was measured by absorbance at 492 nm using a microplate reader (MRP-A4, manufactured by Tosoh Corporation).
【００３７】（ｅ）クローニング 前記（ｃ）の操作後、各ウエル中には２種以上のハイブ
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクローニングを行いモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地１ｍｌ当たりフイ
ーダーとして１０7 個のマウス胸腺細胞を含むクローニ
ング培地を調製し、９６穴マイクロウエルの３６ウエ
ル、３６ウエル、２４ウエルにウエル当たりそれぞれ５
個、１個及び０．５個のハイブリドーマを加える。５日
目に全ウエルに約０．１ｍｌのＮＳ−１培地を追加し
た。１１日目にハイブリドーマの充分な生育が認めら
れ、それらについてＥＬＩＳＡを行った。テストした全
ウエルが陽性でない場合、抗体陽性ウエル中のコロニー
数を確認し、ウエル中に１コロニーが確認されたウエル
を１個選び、再クローニングする。最終的にヒトプロＭ
ＭＰ−７に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ１７株が得られた。(E) Cloning Since two or more kinds of hybridomas may grow in each well after the operation of (c), cloning is performed by the limiting dilution method to obtain a monoclonal antibody-producing hybridoma. . A cloning medium containing 10 7 mouse thymocytes as a feeder per 1 ml of NS-1 medium was prepared, and 5 wells were added to each of 96 wells, 36 wells, 36 wells and 24 wells.
Add 1, 1 and 0.5 hybridomas. On the 5th day, about 0.1 ml of NS-1 medium was added to all wells. On the 11th day, sufficient growth of hybridomas was observed, and ELISA was performed on them. When all the tested wells are not positive, the number of colonies in the antibody positive wells is confirmed, and one well in which one colony is confirmed is selected and recloned. Finally human pro M
17 monoclonal antibody-producing hybridoma strains against MP-7 were obtained.
【００３８】（ｆ）ハイブリドーマによるモノクローナ
ル抗体の大量産生 ハイブリドーマの増殖は常法によって行う。すなわち、
得られた各ハイブリドーマをＮＳ−１培地などの適当な
培養液で培養し、その培養上清から１０〜１００μｇ／
ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を得ることができる。
一方、大量に抗体を得るためには脾臓細胞とミエローマ
細胞の由来マウスと同系のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に１
匹当たり０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤プリスタン（Ａｌ
ｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ．製）を腹腔内投与する。１〜３
週間後に、各ハイブリドーマ１×１０7 個を同じく腹腔
内投与し、さらに、その１〜２週間後に４〜７ｍｇ／ｍ
ｌのモノクローナル抗体を含む腹水を得ることができ
る。(F) Large-scale production of monoclonal antibody by hybridoma Proliferation of hybridoma is carried out by a conventional method. That is,
Each of the resulting hybridomas was cultured in an appropriate culture medium such as NS-1 medium, and 10-100 μg /
A concentration of ml of monoclonal antibody can be obtained.
On the other hand, in order to obtain a large amount of antibody, it is necessary to add 1 to a mouse (BALB / c) that is syngeneic with the mouse from which spleen cells and myeloma cells are derived.
0.5 ml per animal of tumor formation promoter pristane (Al
drich Chem. Manufactured) is intraperitoneally administered. 1-3
After 1 week, 1 × 10 7 of each hybridoma was intraperitoneally administered, and 1 to 2 weeks later, 4 to 7 mg / m 2 was administered.
Ascites fluid containing 1 monoclonal antibody can be obtained.
【００３９】（ｇ）モノクローナル抗体のアイソタイプ 前述したＥＬＩＳＡ法に従って、ヒトＭＭＰ−７をコー
トしたマイクロタイトレーションプレートに各モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清を加えた。
０．０５％ツイン２０含有ＰＢＳで洗浄した後、アイソ
タイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体（Ｚｙｍｅｄ．Ｌ
ａｂ．製）を加えた。０．０５％ツイン２０含有ＰＢＳ
による洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋
Ｌ）抗体を加え、基質として過酸化水素及び２，２′−
アジノ−ジ（３−エチルベンゾリン硫酸）を用いて検出
した。その結果、得られたプロヒトＭＭＰ−７に対する
モノクローナル抗体のうち、４個が免疫グロブリン鎖γ
1 ／κを、５個がγ2a／κを、１個がγ2b／κを、４個
がα／κを、３個がμ／κをそれぞれ有していた（表
１）。 （ｈ）モノクローナル抗体の精製 前記（ｆ）項で得られたＩｇＧ１抗体含有各腹水を４０
％飽和硫酸アンモニウム分画後、アフィゲル プロテイ
ンＡ ＭＡＰＳ−IIキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用い
て精製した。プロテインＡ アガロースカラム（φ２．
５×５ｃｍ）を０．５Ｍ ＮａＣｌ含有１．５Ｍグリシ
ン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化し、抗体含
有透析４０％飽和硫酸アンモニウム画分をそのカラムに
供し、０．１Ｍクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．０）で溶出した。溶出液４ｍｌ／フラクショ
ンに分画したところ、例えばクローン１４１−１５Ｃ６
（生工研受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４７３３）はフラ
クション２８〜３４に、クローン１４１−７Ｂ２（生工
研受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４７３４）はフラクショ
ン２６〜３３に溶出された。(G) Isotype of Monoclonal Antibody According to the above-mentioned ELISA method, the culture supernatant of each monoclonal antibody-producing hybridoma was added to a microtitration plate coated with human MMP-7.
After washing with PBS containing 0.05% Tween 20, isotype-specific rabbit anti-mouse Ig antibody (Zymed.L) was used.
ab. Manufactured) was added. PBS containing 0.05% Twin 20
After washing with HRP-labeled goat anti-rabbit IgG (H +
L) antibody is added, and hydrogen peroxide and 2,2'- are used as substrates.
It was detected using azino-di (3-ethylbenzoline sulfate). As a result, 4 of the obtained monoclonal antibodies against prohuman MMP-7 were immunoglobulin chain γ
1 / κ, 5 had γ2a / κ, 1 had γ2b / κ, 4 had α / κ, and 3 had μ / κ (Table 1). (H) Purification of Monoclonal Antibody 40 times ascites containing IgG1 antibody obtained in the above (f) was used.
After fractionation with% saturated ammonium sulfate, purification was performed using Affigel Protein A MAPS-II kit (manufactured by Bio-Rad). Protein A agarose column (φ2.
5 × 5 cm) was equilibrated with 1.5 M glycine-NaOH buffer (pH 8.0) containing 0.5 M NaCl, and the dialysis 40% saturated ammonium sulfate fraction containing antibody was applied to the column, and 0.1 M citric acid-citric acid was added. Elution was performed with sodium buffer (pH 5.0). When fractionated into 4 ml / fraction of eluate, for example, clone 141-15C6
(Seiko Accession number FERM P-14733) was eluted in fractions 28 to 34, and Clone 141-7B2 (Seiko Accession number FERM P-14734) was eluted in fractions 26 to 33.
【００４０】実施例３ 抗ヒトプロＭＭＰ−７ポリペプ
チドモノクローナル抗体の作製 （ａ）免疫方法および脾臓細胞の調製法 実施例１（ｂ）に記載の方法により調製したヒトＭＭＰ
−７ポリペプチド−ＫＬＨ複合体４５３μｇを完全フロ
イントアジュバンドと共に、６週令、ＢＡＬＢ／ｃ雌マ
ウス２匹にそれぞれに腹腔内投与し、初回免疫とした。
その後、１７日目に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）に溶解した２００μｇポリペプチド−ＫＬＨ複合体
を追加免疫した。最終免疫として５０日目に追加免疫時
と同様にポリペプチド−ＫＬＨ複合体６７μｇを静脈内
および１３３μｇを腹腔内投与し、３日後にマウス脾臓
を取り出し脾臓細胞を調製した。 （ｂ）細胞融合 前記（ａ）で調製した有核脾臓細胞（生細胞率１００
％）を用いて前記実施例２（ｂ）と同様に行った。 （ｃ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 前記（ｂ）の培養開始翌日より、前記実施例２（ｃ）に
記載した方法で行った。Example 3 Preparation of Anti-Human Pro MMP-7 Polypeptide Monoclonal Antibody (a) Immunization Method and Preparation of Spleen Cells Human MMP prepared by the method described in Example 1 (b)
453 μg of -7 polypeptide-KLH complex together with complete Freund's adjuvant was intraperitoneally administered to two BALB / c female mice at 6 weeks of age to give an initial immunization.
Then, on the 17th day, 0.1M phosphate buffer (pH 6.
200 μg polypeptide-KLH complex dissolved in 0) was boosted. On the 50th day as the final immunization, 67 μg of the polypeptide-KLH complex was administered intravenously and 133 μg was intraperitoneally administered in the same manner as in the booster immunization, and 3 days later, the mouse spleen was taken out to prepare spleen cells. (B) Cell fusion Nucleated spleen cells prepared in (a) above (viable cell rate: 100)
%) In the same manner as in Example 2 (b) above. (C) Selective growth of hybridomas in selective medium From the day after the start of culture in (b) above, the method was carried out by the method described in Example 2 (c) above.
【００４１】（ｄ）ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＭＭＰ−
７ポリペプチド抗体産生ハイブリドーマの検索 前記実施例２（ｄ）に記載した方法と同様に行った。こ
の方法においては、９６穴マイクロタイトレーションプ
レートをヒトＭＭＰ−７ポリペプチド １００ｎｇ／ウ
エルでコートした。 （ｅ）クローニング 前記実施例２（ｅ）に記載した方法と同様に行った。最
終的に表２に示したヒトＭＭＰ−７ポリペプチドに対す
るモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ１２株が得ら
れた。 （ｆ）ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の大量
産生 前記実施例２（ｆ）に記載した方法と同様に行った。 （ｇ）モノクローナル抗体のアイソタイプ 前述したＥＬＩＳＡ法に従ってヒトＭＭＰ−７ポリペプ
チド １００ｎｇ／ウエルをコートしたマイクロタイト
レーションプレートに前記（ｅ）で得られた各モノクロ
ーンの培養上清を加えて、前記実施例２（ｇ）に記載し
た方法と同様に行った。得られたモノクローナル抗体の
うち、９個が免疫グロブリン鎖γ1 ／κを、１個がγ2a
／κを、１個がγ3 ／κを、１個が、μ／κをそれぞれ
有していた（表２）。 （ｈ）モノクローナル抗体の精製 前記実施例２（ｈ）に記載した方法と同様に行った。抗
体含有各腹水を４０％飽和硫酸アンモニウム分画後、ア
フィゲル プロテインＡ ＭＡＰＳ−IIキット（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ製）を用いて精製した。(D) Anti-human MMP by ELISA method
Search for hybridoma producing 7 polypeptide antibody The same procedure as described in Example 2 (d) above was performed. In this method, 96-well microtitration plates were coated with 100 ng / well human MMP-7 polypeptide. (E) Cloning The same procedure as described in Example 2 (e) above was performed. Finally, 12 monoclonal antibody-producing hybridoma strains against the human MMP-7 polypeptide shown in Table 2 were obtained. (F) Large-scale production of monoclonal antibody by hybridoma The same procedure as described in Example 2 (f) was performed. (G) Isotype of monoclonal antibody According to the above-mentioned ELISA method, the culture supernatant of each of the monoclones obtained in (e) above was added to a microtitration plate coated with 100 ng / well of human MMP-7 polypeptide, and The procedure was as described in Example 2 (g). Of the monoclonal antibodies obtained, 9 were immunoglobulin chains γ1 / κ and 1 was γ2a
One had γ3 / κ and the other had μ / κ (Table 2). (H) Purification of monoclonal antibody The purification was carried out in the same manner as in the method described in Example 2 (h) above. After fractionating 40% saturated ammonium sulfate with each antibody-containing ascites, Affigel Protein A MAPS-II Kit (Bio
-Manufactured by Rad).
【００４２】実施例４ 抗ヒトプロＭＭＰ−７モノクロ
ーナル抗体および抗ヒトＭＭＰ−７ポリペプチドモノク
ローナル抗体の選択 （ａ）ヒトプロＭＭＰ−７と抗ヒトプロＭＭＰ−７モノ
クローナル抗体との反応性 前記実施例１（ａ）で得られたヒトプロＭＭＰ−７と前
記実施例２（ｈ）で得られた１７株の精製各モノクロー
ナル抗体との反応性を調べた。実施例１（ａ）で調製し
たＭＭＰ−７をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、細胞工学
１＆２，１０６１−１０６８，１９８３に記載の田部の
方法に従ってウエスタンブロッティングを行い、各モノ
クローンの培養上清と反応後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス
免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂ．製）を用い間
接法によりイムノブロッティングを行った。また、他の
ＭＭＰｓとの交差反応を調べるためにヒト新生児線維芽
細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）から精製したプロＭＭＰ−１
（Ｊ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉ
ｍ．Ａｃｔａ，２１９，１−１４，１９９３）、プロＭ
ＭＰ−２（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌ
ｉｎ，Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２１，９１−１０３，１
９９３）、プロＭＭＰ−３（Ｋ．Ｏｂａｔａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１１，５９−
７２，１９９２）及びヒト線維肉腫細胞（ＨＴ１０８
０）から精製したプロＭＭＰ−９（Ｎ． Ｆｕｊｉｍｏ
ｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ．Ａｃｔ
ａ，２３１，７９−８８，１９９４）を用い上記のイム
ノブロッティングもしくは前記（ｄ）で記述したＥＬＩ
ＳＡを行った。表３に示したように、これらのプロＭＭ
Ｐ−７モノクローナル抗体は、他のヒトプロＭＭＰｓと
反応せずヒトプロＭＭＰ−７に対して特異的に反応し
た。Example 4 Selection of Anti-Human Pro MMP-7 Monoclonal Antibody and Anti-Human MMP-7 Polypeptide Monoclonal Antibody (a) Reactivity of Human Pro MMP-7 with Anti-Human Pro MMP-7 Monoclonal Antibody Example 1 (a) ), The reactivity of the human pro-MMP-7 obtained in 1) with each purified monoclonal antibody of the 17 strains obtained in Example 2 (h) was examined. After subjecting MMP-7 prepared in Example 1 (a) to SDS-PAGE, Western blotting was performed according to the method of Tabe described in Cell Engineering 1 & 2, 1061-1068, 1983, and reacted with the culture supernatant of each monoclone. Then, immunoblotting was performed by an indirect method using HRP-labeled goat anti-mouse immunoglobulin (manufactured by Cappel Lab.). In addition, proMMP-1 purified from human neonatal fibroblasts (NB1RGB) to investigate cross-reactivity with other MMPs
(J. Zhang et al., Clin. Chi.
m. Acta, 219, 1-14, 1993), Pro M
MP-2 (N. Fujimoto et al., Cl
in, Chim. Acta, 221, 91-103, 1
993), pro MMP-3 (K. Obata et a.
l. , Clin. Chim. Acta, 211, 59-
72, 1992) and human fibrosarcoma cells (HT108
0) purified pro MMP-9 (N. Fujimo)
to et al. , Clin. Chim. Act
a, 231, 79-88, 1994), or the immunoblotting described above or the ELI described in (d) above.
SA was performed. As shown in Table 3, these pro-MM
The P-7 monoclonal antibody reacted specifically with human proMMP-7 without reacting with other human proMMPs.
【００４３】（ｂ）抗ヒトプロＭＭＰ−７ポリペプチド
モノクローナル抗体の選択 得られた１２個のポリペプチドモノクローナル抗体はす
べてヒトプロＭＭＰ−７を認識したが、抗ヒトプロＭＭ
Ｐ−７モノクローナル抗体よりも反応性は弱かった。し
かし、クローン１２５−２０Ｈ１１（生工研受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１４７３５）は実施例５記載の免疫組織
染色に使用可能であった。また、１２５−２０Ｈ１１と
他のＭＭＰｓとの交差反応を調べるために上記（ａ）項
で記載した培養細胞の培養液を用いてイムノブロッテン
グを行った。培養液中にはプロＭＭＰ−１，プロＭＭＰ
−２，プロＭＭＰ−３，プロＭＭＰ−９が共存するが、
イムノブロッテングではこれらＭＭＰｓに相当するバン
ドは検出されず、交差反応は認められなかった。(B) Selection of Anti-Human Pro MMP-7 Polypeptide Monoclonal Antibodies All 12 obtained polypeptide monoclonal antibodies recognized human pro-MMP-7, but anti-human pro-MMP-7
It was less reactive than the P-7 monoclonal antibody. However, clone 125-20H11 (Seiko Accession No.
FERM P-14735) could be used for the immunohistological staining described in Example 5. Further, in order to investigate the cross-reactivity of 125-20H11 with other MMPs, immunoblotting was performed using the culture medium of the cultured cells described in (a) above. ProMMP-1, proMMP in the culture solution
-2, pro MMP-3, pro MMP-9 coexist,
In immunoblotting, bands corresponding to these MMPs were not detected, and no cross reaction was observed.
【００４４】実施例５ 抗ヒトプロＭＭＰ−７モノクロ
ーナル抗体を用いた免疫組織染色 ヒト胃癌組織をペリオデイト−リジン−パラホルムアル
デヒド固定し、パラフィン切片を作製した。脱パラフィ
ンしたこれら組織切片中の内因性ＨＲＰを過酸化水素で
ブロックした後、実施例２（ｈ）及び３（ｈ）項で得ら
れたそれぞれの抗ヒトＭＭＰ−７モノクローナル抗体と
反応させた。次に、その切片をＰＢＳで充分洗浄しビオ
チン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）と反応させた後、
さらにアビジン−ビオチン−ＨＲＰ複合体（Ｖｅｃｔｏ
ｒ Ｌａｂ．製）と反応させた。上記のようにして得ら
れた切片を、ＰＢＳで洗浄した後、基質としてジアミノ
ベンチジン及び過酸化水素を用いて発色させた。抗プロ
ＭＭＰ−７モノクローナル抗体としてＩｇＧ（クローン
１２５−２０Ｈ１１：生工研受託番号 ＦＥＲＭＰ−１
４７３５，クローン１４１−７Ｂ２：生工研受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１４７３４及びクローン１４１−７３Ｃ
７）を用いたときの免疫組織染色では、ヒトＭＭＰ−７
はいずれも腺癌細胞中に染色された。従って、クローン
１２５−２０Ｈ１１，クローン１４１−７Ｂ２及び１４
１−７３Ｃ７はいずれも免疫組織染色に使用できること
が判明し、癌疾患マーカーとして利用できる可能性が示
唆された。Example 5 Immunohistological Staining Using Anti-Human Pro MMP-7 Monoclonal Antibody Human gastric cancer tissue was fixed with periodate-lysine-paraformaldehyde and paraffin sections were prepared. Endogenous HRP in these deparaffinized tissue sections was blocked with hydrogen peroxide and then reacted with the respective anti-human MMP-7 monoclonal antibodies obtained in Examples 2 (h) and 3 (h). Next, the section was thoroughly washed with PBS and reacted with biotinylated horse anti-mouse IgG (H + L),
Furthermore, avidin-biotin-HRP complex (Vecto
r Lab. Manufactured). The section obtained as described above was washed with PBS and then developed with diaminobenzidine and hydrogen peroxide as substrates. IgG as an anti-pro MMP-7 monoclonal antibody (clone 125-20H11: Seiko Accession No. FERMP-1)
4735, Clone 141-7B2: Seiko Accession No.
FERM P-14734 and clone 141-73C
Immunohistochemical staining using 7) showed that human MMP-7
All were stained in adenocarcinoma cells. Therefore, clone 125-20H11, clones 141-7B2 and 14
It was revealed that all of 1-73C7 can be used for immunohistological staining, suggesting the possibility of being used as a cancer disease marker.
【００４５】実施例６ ヒトＭＭＰ−７の定量法 （ａ）酵素標識抗体（ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体）の調製 （１）ＳＨ基標識ＩｇＧの調製 Ｊ．Ｉｍｍｎｏａｓｓａｙ，４，２０９〜３２７，１９
８３に記載のＩｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．の方法に
従って抗ヒトプロＭＭＰ−７ ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体を
調製した。実施例２（ｈ）項で得られ、ヒトプロＭＭＰ
−７に対し反応性が認められたモノクローナル抗体（Ｉ
ｇＧ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し透
析し、その溶液に含有されるＩｇＧに対して１００倍モ
ルのＳ−アセチルメルカプト無水コハク酸をＤＭＦ溶液
として加え、３０℃，３０分間インキュベーションし
た。次に、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）
１００μｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６．０）１
０μｌ、１Ｍヒドロキシルアミン溶液（ｐＨ７．０）１
００μｌを加え、３０℃、５分間静置後、５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化
したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５でゲルろ過し、ＳＨ基標
識抗ヒトプロＭＭＰ−７ ＩｇＧを得た。Example 6 Quantitative method for human MMP-7 (a) Preparation of enzyme labeled antibody (IgG-HRP complex) (1) Preparation of SH group labeled IgG Immunoassay, 4, 209 to 327, 19
83. Ishikawa et al. The anti-human pro MMP-7 IgG-HRP complex was prepared according to the method of 1. The human proMMP obtained in Example 2 (h)
A monoclonal antibody (I
gG) was dialyzed against 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5), 100 times mol of S-acetylmercaptosuccinic anhydride was added as a DMF solution to IgG contained in the solution, and the mixture was added at 30 ° C. Incubated for 30 minutes. Next, 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0)
100 μl, 0.1 M EDTA solution (pH 6.0) 1
0 μl, 1M hydroxylamine solution (pH 7.0) 1
After adding 00 μl and allowing to stand at 30 ° C. for 5 minutes, 5 mM ED
Gel filtration was performed using Sephadex G-25 equilibrated with 0.1 M phosphate buffer containing TA (pH 6.0) to obtain SH group-labeled anti-human pro-MMP-7 IgG.
【００４６】（２）マレイミド標識ＨＲＰの調製 ＨＲＰを１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＤＭＦに溶解したＥＭＣＳ
をＨＲＰ量に対して２５倍モル量加え、３０℃、３０分
間反応させた。この反応液を０．１Ｍ リン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２
５カラムでゲルろ過し、マレイミド標識ＨＲＰ画分を分
取した。 （３）ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体の調製 上記（１）で調製したＳＨ基標識ＩｇＧ １モルに上記
（２）で得られたマレイミド標識ＨＲＰ約５モルを加
え、４℃で約２０時間静置した。この混合液を０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したウルトロゲル
ＡｃＡ ４４（ＩＢＦ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ製）カ
ラムでゲルろ過し、抗ヒトプロＭＭＰ−７ＩｇＧ−ＨＲ
Ｐ複合体画分を分取した。(2) Preparation of maleimide-labeled HRP EMCS prepared by dissolving HRP in DMF in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) to a concentration of 10 mg / ml.
Was added 25 times the molar amount of HRP and reacted at 30 ° C. for 30 minutes. This reaction solution was equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) Sephadex G-2.
Gel filtration was performed using 5 columns to collect a maleimide-labeled HRP fraction. (3) Preparation of IgG-HRP complex About 5 mol of the maleimide-labeled HRP obtained in (2) above was added to 1 mol of the SH group-labeled IgG prepared in (1) above, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for about 20 hours. . This mixture is 0.1M
Gel filtration was performed using a Ultrogel AcA 44 (manufactured by IBF Biotechnics) column equilibrated with a phosphate buffer (pH 6.5), and anti-human pro MMP-7 IgG-HR was used.
The P complex fraction was collected.
【００４７】（ｂ）酵素標識抗体（Ｆａｂ’−ＨＲＰ）
の調製 （１）Ｆａｂ′画分の調製 実施例３（ｈ）項で得られた各精製モノクローナル抗体
（ＩｇＧ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解
し、その溶液を以下述べるようにしてペプシンで消化し
た。すなわち、上記ＩｇＧに対して２％（ｗ／ｗ）のペ
プシンを加え、３７℃、２４時間消化した。さらにその
消化物に、２Ｍトリス溶液を加えてｐＨを７．０に調整
することによって反応を停止させ、０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ４４
カラムを用いたゲルろ過により、Ｆ（ａｂ′）2 画分を
分取した。次に、このＦ（ａｂ′）2 画分を５ｍＭＥＤ
ＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で透析
し、最終濃度１０ｍＭとなるようにアミノエタンチオー
ルを加え３７℃で９０分間還元した後、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化し
たウルトロゲルＡｃＡ４４カラムを用いてゲルろ過し、
Ｆａｂ′画分を分取した。(B) Enzyme-labeled antibody (Fab'-HRP)
(1) Preparation of Fab ′ fraction Each purified monoclonal antibody (IgG) obtained in Example 3 (h) was dissolved in 0.1M acetate buffer (pH 4.2), and the solution is described below. Digested with pepsin in this way. That is, 2% (w / w) pepsin was added to the above IgG and digested at 37 ° C. for 24 hours. The digest was further stopped by adjusting the pH to 7.0 by adding 2M Tris solution, and Ultrogel AcA44 equilibrated with 0.1M phosphate buffer (pH 7.0).
The F (ab ') 2 fraction was collected by gel filtration using a column. Next, this F (ab ') 2 fraction was added to 5 mM ED
It was dialyzed in a 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) containing TA, aminoethanethiol was added to a final concentration of 10 mM and the mixture was reduced at 37 ° C. for 90 minutes, and then 5 mM EDT was added.
Gel filtration using a Ultrogel AcA44 column equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) containing A,
The Fab 'fraction was collected.
【００４８】（２）マレイミド標識ＨＲＰ画分の調製 上記（１）項の操作とは別に、以下に述べるようにして
ＨＲＰにマレイミドを標識した。すなわち、ＨＲＰを１
０ｍｇ／ｍｌの量で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に溶解し、そのＨＲＰに対して、２５倍モル量のＥ
ＭＣＳをＤＭＦ溶液として加え、３０分間反応させた。
これを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化し
たＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラムでゲルろ過し、マ
レイミド標識ＨＲＰ画分を分取した。 （３）Ｆａｂ′−ＨＲＰ複合体画分の調製 前記（１）項で調製した画分中のＦａｂ′に対して、上
記（２）項で得られた画分中のマレイミド標識ＨＲＰと
して等モルになるように両画分を混合し、さらにＦａ
ｂ′及びマレイミド標識ＨＲＰの最終濃度が１００μＭ
となるように、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６．０）で希釈した。この混合液を４℃、２
０時間反応後、Ｆａｂ′の１０倍モル量のＮ−エチルマ
レイミドで未反応のチオール基をブロックした。これを
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したウル
トロゲルＡｃＡ４４カラムを用いてゲルろ過し、Ｆａ
ｂ′−ＨＲＰ複合体画分を分取後、０．１％ＢＳＡ及び
０．００１％クロルヘキシジンを添加し、４℃で保存し
た。(2) Preparation of Maleimide-Labeled HRP Fraction HRP was labeled with maleimide as described below, apart from the operation of the above (1). That is, 1 for HRP
0.1M phosphate buffer (pH 7.
0) and 25 times the molar amount of E with respect to the HRP.
MCS was added as a DMF solution and reacted for 30 minutes.
This was subjected to gel filtration with a Sephadex G-50 column equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) to collect a maleimide-labeled HRP fraction. (3) Preparation of Fab′-HRP complex fraction Fab ′ in the fraction prepared in the above (1) is equimolar to the maleimide-labeled HRP in the fraction obtained in the above (2). Both fractions were mixed so that
The final concentration of b ′ and maleimide-labeled HRP is 100 μM
Was diluted with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) containing 5 mM EDTA. This mixture at 4 ° C for 2
After the reaction for 0 hour, unreacted thiol groups were blocked with N-ethylmaleimide in a molar amount 10 times that of Fab '. This was gel-filtered using a Ultrogel AcA44 column equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5) and Fa
The b'-HRP complex fraction was collected, 0.1% BSA and 0.001% chlorhexidine were added, and the mixture was stored at 4 ° C.
【００４９】（ｃ）モノクローナル抗体結合担体の調製 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，４，２０９〜３２７，１
９８３に記載のＩｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．の方法
に従って、実施例２（ｈ）項及び実施例３（ｈ）項で得
られた精製モノクローナル抗体を０．１％アジ化ナトリ
ウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解
し、その濃度を１００μｇ／ｍｌに調製した。このモノ
クローナル抗体溶液を９６穴マイクロプレートにウエル
当たり１００μｌずつ加え、４℃、２４時間静置した。
次にモノクローナル抗体溶液を除去し、１％ＢＳＡ，
０．１Ｍ塩化ナトリウム及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ含有３
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，緩衝液Ａ）を各ウエ
ルに３００μｌずつ加え、４℃で保存した。使用時０．
１％ ツイン ２０及び０．１Ｍ塩化ナトリウム含有１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，洗浄緩衝液）で３回
洗浄した。(C) Preparation of Monoclonal Antibody Binding Carrier Immunoassay, 4, 209 to 327, 1
983, Ishikawa et al. The purified monoclonal antibody obtained in Example 2 (h) and Example 3 (h) was dissolved in 0.1M phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.1% sodium azide according to the method of 1. , Its concentration was adjusted to 100 μg / ml. This monoclonal antibody solution was added to a 96-well microplate in an amount of 100 μl per well, and the mixture was left standing at 4 ° C. for 24 hours.
Next, the monoclonal antibody solution was removed, and 1% BSA,
Containing 0.1 M sodium chloride and 10 mM EDTA 3
300 μl of 0 mM phosphate buffer (pH 7.0, buffer A) was added to each well and stored at 4 ° C. When using 0.
1% Twin 20 and 0.1M Sodium Chloride included 1
The plate was washed 3 times with 0 mM phosphate buffer (pH 7.0, wash buffer).
【００５０】（ｄ）２ステップサンドイッチＥＩＡ法 （ヒトプロＭＭＰ−７の定量）緩衝液Ａで、精製ヒトプ
ロＭＭＰ−７（標準試料）あるいはヒトプロＭＭＰ−７
を含む検体を調製し９６穴マイクロプレート（ＩＣＮ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）に各々２５μｌ加えた。次
に緩衝液Ａを上記プレートに各々２２５μｌずつ加え混
和した。この混合液を前記（ｃ）で調製した抗体結合プ
レートに１００μｌ加え、室温で１時間反応させ、洗浄
緩衝液で３回洗浄した。次に、実施例６で調製した酵素
標識抗体を１μｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ａで希釈
し、上記プレートに１００μｌずつ加え室温で１時間反
応させ、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、０．０２％
過酸化水素含有０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ
４．９）に溶解した２ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジア
ミンをウエル当たり１００μｌ加え、室温で１５分間反
応後、２Ｎ硫酸１００μｌ添加し反応を停止させた。こ
の反応混液のＡ492 をマイクロプレートリーダーを用い
て測定し検量線より、検体中のヒトプロＭＭＰ−７濃度
を求めた。(D) Two-step sandwich EIA method (quantification of human proMMP-7) With buffer A, purified human proMMP-7 (standard sample) or human proMMP-7
96-well microplate (ICN
25 μl each was added to Biomedicals). Next, 225 μl of Buffer A was added to each plate and mixed. 100 μl of this mixed solution was added to the antibody-bound plate prepared in (c) above, reacted at room temperature for 1 hour, and washed 3 times with a washing buffer. Next, the enzyme-labeled antibody prepared in Example 6 was diluted with buffer A so that the concentration was 1 μg / ml, 100 μl of each was added to the plate, reacted at room temperature for 1 hour, and washed 3 times with the washing buffer. Next, 0.02%
Hydrogen peroxide-containing 0.1M citric acid-phosphate buffer (pH
100 μl of 2 mg / ml o-phenylenediamine dissolved in 4.9) was added to each well and reacted at room temperature for 15 minutes, and then 100 μl of 2N sulfuric acid was added to stop the reaction. A 492 of this reaction mixture was measured using a microplate reader, and the concentration of human proMMP-7 in the sample was determined from the calibration curve.
【００５１】モノクローナル抗体（クローン１２５−２
０Ｈ１１）を固相用抗体とし、モノクローナル抗体（ク
ローン１４１−７Ｂ２）を標識用抗体（ＩｇＧ−ＨＲ
Ｐ）として用いて得られた検量線を図１に示した。ただ
し、上記以外のモノクローナル抗体の組み合わせでもヒ
トＭＭＰ−７の定量は可能である。一方、実施例４
（ａ）及び（ｂ）項に記載したように、固相用抗体及び
標識用抗体はいずれも他のＭＭＰｓと反応しないので、
上記のアッセイ系においてはヒトプロＭＭＰ−７のみを
特異的に定量していると判断される。図１に示されてい
るように、ヒトプロＭＭＰ−７標準試料の濃度の上昇に
伴ってＡ492 は直線的に増加しており、定量感度（標準
プロＭＭＰ−７．０ｎｇ／ｍｌ時の平均値＋２ＳＤのＡ
492 値より算出）は５．０ｎｇ／ｍｌ（５０ｐｇ／ａｓ
ｓａｙ）であり、定量範囲は１０〜６４０ｎｇ／ｍｌ
（０．１−６．４ｎｇ／ａｓｓａｙ）であった。Monoclonal antibody (clone 125-2
0H11) as the solid phase antibody, and the monoclonal antibody (clone 141-7B2) as the labeling antibody (IgG-HR).
The calibration curve obtained as P) is shown in FIG. However, human MMP-7 can be quantified with a combination of monoclonal antibodies other than the above. On the other hand, Example 4
As described in (a) and (b), since neither the solid phase antibody nor the labeling antibody reacts with other MMPs,
In the above assay system, it is judged that only human proMMP-7 is specifically quantified. As shown in FIG. 1, A 492 increased linearly with an increase in the concentration of the human pro MMP-7 standard sample, and the quantitative sensitivity (average value at the time of standard pro MMP-7.0 ng / ml). + 2SD A
Calculated from 492 values is 5.0 ng / ml (50 pg / as)
Say) and the quantitative range is 10 to 640 ng / ml.
(0.1-6.4 ng / assay).
【００５２】（ｅ）１ステップサンドイッチＥＩＡ法 緩衝液Ａで、精製ヒトプロＭＭＰ−７（標準試料）ある
いはヒトプロＭＭＰ−７を含む検体を調製し９６穴マイ
クロプレートに各々２５μｌ加えた。次に、実施例６で
調製した酵素標識抗体を１．１μｇ／ｍｌとなるように
緩衝液Ａで希釈し、上記プレートに２２５μｌずつ加え
混和した。この混合液を前記実施例６（ｃ）で調製した
抗体結合プレートに１００μｌ加え４℃で２４時間反応
させ、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、０．０２％過
酸化水素含有０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ
４．９）に溶解した２ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジア
ミンをウエル当たり１００μｌ加え、室温で１５分間反
応後、２Ｎ硫酸１００μｌ添加し反応を停止させた。こ
の反応混液のＡ492 をマイクロプレートリーダーを用い
て測定し検量線より、検体中のヒトプロＭＭＰ−７濃度
を求めた。モノクローナル抗体（クローン１２５−２０
Ｈ１１）を固相用抗体とし、モノクローナル抗体（クロ
ーン１４１−１５Ｃ６：生工研受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ
−１４７３３）を標識用抗体（ＩｇＧ−ＨＲＰ）とした
場合の検量線を図２に示した。一方、実施例４（ａ）及
び（ｂ）項に記載したように、固相用抗体及び標識用抗
体はいずれも他のＭＭＰｓと交差しないので、上記のア
ッセイ系においてヒトプロＭＭＰ−７のみを特異的に定
量することができると判断された。図２に示したよう
に、ヒトプロＭＭＰ−７標準試料の濃度の上昇に伴って
Ａ492 は直線的に増加しており、定量感度（標準プロＭ
ＭＰ−７、０ｎｇ／ｍｌ時の平均値＋２Ｓ．Ｄ．値より
求めた）は０．１７ｎｇ／ｍｌ（１．７ｐｇ／ａｓｓａ
ｙ）であり、定量範囲は０．６２５〜４０ｎｇ／ｍｌ
（６．２５〜４００ｐｇ／ａｓｓａｙ）であった。(E) One-step sandwich EIA method A sample containing purified human pro-MMP-7 (standard sample) or human pro-MMP-7 was prepared with buffer A, and 25 μl of each was added to a 96-well microplate. Next, the enzyme-labeled antibody prepared in Example 6 was diluted with buffer solution A to a concentration of 1.1 μg / ml, and 225 μl each was added to the plate and mixed. 100 μl of this mixed solution was added to the antibody-bound plate prepared in the above Example 6 (c), reacted at 4 ° C. for 24 hours, and washed 3 times with a washing buffer. Next, 0.1M citric acid-phosphate buffer solution (pH: 0.02% hydrogen peroxide)
100 μl of 2 mg / ml o-phenylenediamine dissolved in 4.9) was added to each well and reacted at room temperature for 15 minutes, and then 100 μl of 2N sulfuric acid was added to stop the reaction. A 492 of this reaction mixture was measured using a microplate reader, and the concentration of human proMMP-7 in the sample was determined from the calibration curve. Monoclonal antibody (clone 125-20
H11) as a solid phase antibody, and a monoclonal antibody (clone 141-15C6: Seiko Accession No. FERM P)
The standard curve when (-14733) was used as the labeling antibody (IgG-HRP) is shown in FIG. On the other hand, as described in the paragraphs (a) and (b) of Example 4, since neither the solid phase antibody nor the labeling antibody crossed with other MMPs, only human pro MMP-7 was specific in the above assay system. It was judged that it can be quantitatively determined. As shown in FIG. 2, A 492 increased linearly with an increase in the concentration of the human pro MMP-7 standard sample, and the quantitative sensitivity (standard pro M
MP-7, mean value at 0 ng / ml + 2 S.M. D. The value obtained was 0.17 ng / ml (1.7 pg / assa).
y) and the quantitative range is 0.625-40 ng / ml
(6.25 to 400 pg / assay).
【００５３】（ｆ）ＥＩＡ法による他のＭＭＰｓ及び細
胞外分子との交差反応性 実施例４（ａ）に記載した各プロＭＭＰｓ（プロＭＭＰ
−１，プロＭＭＰ−２，プロＭＭＰ−３，プロＭＭＰ−
９）、ヒト白血球から精製したプロＭＭＰ−８（Ｖ．Ｋ
ｎａｕｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈ
ｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，３７１（Ｓｕｐｐ１．），２
９５−３０４，１９９０）及びヒト胎盤から精製したＩ
Ｖ型コラーゲン（Ｒ．Ｍａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒ
ｔｅｒｙ，７，２６２−２８０，１９８０）、ヒトラミ
ニン及びヒトフィブロネクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社
製）を６４０ｎｇ／ｍｌ及び４０ｎｇ／ｍｌに調整し前
記（ｄ）及び（ｅ）に記載した方法で、それぞれのプロ
ＭＭＰ−７抗体との交差反応性を調べた。プロＭＭＰ−
７の６４０ｎｇ／ｍｌ及び４０ｎｇ／ｍｌのＡ492 の値
を１００％として各々のＡ492 値を示した場合、これら
のＭＭＰｓ及び細胞外分子とは交差反応は２ステップ及
び１ステップＥＩＡ法において認められなかった（表４
及び表５）。(F) Cross-reactivity with other MMPs and extracellular molecules by EIA method Each pro-MMPs (pro-MMP) described in Example 4 (a)
-1, Pro MMP-2, Pro MMP-3, Pro MMP-
9), pro-MMP-8 (V.K.) purified from human leukocytes
nauper et al. , Biol. Chem. H
oppe-Seyler, 371 (Supp1.), 2
95-304, 1990) and I purified from human placenta.
V-type collagen (R. Mayne et al., Ar
tery, 7, 262-280, 1980), human laminin and human fibronectin (manufactured by Chemicon) were adjusted to 640 ng / ml and 40 ng / ml, and the respective pro-MMP-s were prepared by the methods described in (d) and (e) above. The cross reactivity with 7 antibody was investigated. Pro MMP-
When the A 492 values of 640 ng / ml and 40 ng / ml of 7 were taken as 100% and the respective A 492 values were shown, cross-reactivity with these MMPs and extracellular molecules was observed in the 2-step and 1-step EIA methods. There was not (Table 4
And Table 5).
【００５４】（ｇ）添加回収試験 前記（ｄ）に記載した方法において以下のように添加回
収試験を行った。健常者血清Ａ（プロＭＭＰ−７、４６
ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ（プロＭＭＰ−７、４８．５ｎｇ／ｍ
ｌ）各々２５μｌに標準試料液（０、４０、８０、１６
０及び３２０ｎｇ／ｍｌ）各２５μｌを添加したものを
検体とし、２００μｌの緩衝液Ａを加えた。この混合液
を抗体結合プレートに１００μｌ加え、前記（ｄ）に記
載した方法と同様にしてプロＭＭＰ−７濃度を測定し回
収率を算出した。標準プロＭＭＰ−７の平均回収率は健
常者血清Ａを用いた場合９３．９±２．９（Ｓ．Ｄ．）
％であり、健常者血清Ｂを用いた場合９３．３±３．２
（Ｓ．Ｄ．）％であった（表６）。次に、前記（ｅ）に
記載した方法において添加回収試験を行った。健常者血
清Ｃ（プロＭＭＰ−７、２．１ｎｇ／ｍｌ）２５μｌに
標準試料液（０、１．２５、２．５、５．０及び１０．
０ｎｇ／ｍｌ）各２５μｌを添加したものを検体とし、
２００μｌの酵素標識抗体（ＩｇＧ−ＨＲＰ）液を加え
た。この混合液を抗体結合プレートに１００μｌ加え、
前記（ｅ）に記載した方法と同様にしてプロＭＭＰ−７
量を測定し回収率を算出した。標準プロＭＭＰ−７の健
常者血清Ｃ中での回収率は１１４±４．３（Ｓ．Ｄ．）
％であった（表７）。これらのことより本測定系は、特
異的にプロＭＭＰ−７を認識していることが示唆され
る。(G) Addition recovery test An addition recovery test was carried out as follows in the method described in (d) above. Healthy person serum A (pro MMP-7, 46
ng / ml), B (proMMP-7, 48.5 ng / m)
l) 25 μl of standard sample solution (0, 40, 80, 16)
0 and 320 ng / ml) 25 μl each was used as a sample, and 200 μl of buffer solution A was added. 100 μl of this mixed solution was added to the antibody-bound plate, and the concentration of proMMP-7 was measured and the recovery rate was calculated in the same manner as in the method described in (d) above. The average recovery rate of standard pro-MMP-7 is 93.9 ± 2.9 (SD) when using serum A of a healthy subject.
%, And 93.3 ± 3.2 when using serum B of a healthy person.
It was (SD)% (Table 6). Next, an addition recovery test was conducted by the method described in (e) above. 25 μl of healthy person serum C (pro-MMP-7, 2.1 ng / ml) was added to the standard sample solution (0, 1.25, 2.5, 5.0 and 10.
0 ng / ml) 25 μl of each was used as a sample,
200 μl of enzyme-labeled antibody (IgG-HRP) solution was added. Add 100 μl of this mixture to the antibody binding plate,
Similar to the method described in (e) above, pro-MMP-7
The amount was measured and the recovery rate was calculated. The recovery rate of standard pro MMP-7 in serum C of healthy subjects is 114 ± 4.3 (SD).
% (Table 7). These facts suggest that this assay system specifically recognizes pro-MMP-7.
【００５５】実施例７ ヒトプロＭＭＰ−７モノクロー
ナル抗体の特異性 （ａ）ヒト活性化型ＭＭＰ−７と抗ヒトプロＭＭＰ−７
モノクローナル抗体との反応性 前記実施例１（ａ）で得られたヒトプロＭＭＰ−７を１
ｍＭ ＡＰＭＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で２３℃、１０
分間反応させることにより、プロＭＭＰ−７は中間型Ｍ
ＭＰ−７（２１ｋＤａ）及び活性化型ＭＭＰ−７（１９
ｋＤａ）に変換されることがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより認
められた。そこでこの反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し
た後、ウエスタンブロッティングを行いヒトプロＭＭＰ
−７モノクローナル抗体（クローン１２５−２０Ｈ１
１、１４１−７Ｂ２及び１４１−１５Ｃ６）を用いてイ
ムノブロッティングを行った。モノクローナル抗体（ク
ローン１２５−２０Ｈ１１）はプロＭＭＰ−７（２８ｋ
Ｄａ）、中間型ＭＭＰ−７（２１ｋＤａ）及び活性化型
ＭＭＰ−７（１９ｋＤａ）を認識したが、モノクローナ
ル抗体（クローン１４１−７Ｂ２及び１４１−１５Ｃ
６）はプロＭＭＰ−７（２８ｋＤａ）のみを認識した
（図３）。Example 7 Specificity of human pro-MMP-7 monoclonal antibody (a) Human activated MMP-7 and anti-human pro-MMP-7
Reactivity with Monoclonal Antibody The human proMMP-7 obtained in Example 1 (a) above was
23 ° C. with mM APMA (manufactured by Aldrich), 10
By reacting for minutes, pro-MMP-7 is an intermediate type M
MP-7 (21 kDa) and activated MMP-7 (19
It was confirmed by SDS-PAGE that it was converted to KDa). Therefore, after subjecting this reaction solution to SDS-PAGE, Western blotting was carried out to obtain human proMMP.
-7 monoclonal antibody (clone 125-20H1
1, 141-7B2 and 141-15C6) were used for immunoblotting. The monoclonal antibody (clone 125-20H11) was used for pro-MMP-7 (28k
Da), intermediate MMP-7 (21 kDa) and activated MMP-7 (19 kDa) were recognized, but monoclonal antibodies (clones 141-7B2 and 141-15C) were recognized.
6) recognized only pro-MMP-7 (28 kDa) (Fig. 3).
【００５６】（ｂ）ヒトＭＭＰ−７ポリペプチドと抗ヒ
トプロＭＭＰ−７モノクローナル抗体との反応性 前記実施例１（ｂ）で調製したヒトＭＭＰ−７のＣ末端
領域ポリペプチド（ＧＩＱＫＬＹＧＫＲＳＮＳＲＫＫ，
Ｒ２５３−２６７，ｐｅｐｔｉｄｅ＃３）と同様に中間
領域ポリペプチド（ＬＮＭＷＧＫＥＩＰＬＨＦＲＫＶＶ
ＷＧ，Ｒ１３３−１５０，ｐｅｐｔｉｄｅ＃２）及びＮ
末端領域ポリペプチド（ＬＰＬＰＱＥＡＧＧＭＳＥＬＱ
ＷＥＱ，Ｒ１８−３４，ｐｅｐｔｉｄｅ＃１）をペプチ
ドシンセサイザー９６００で合成した。これら３種のポ
リペプチドを各々１００ｎｇ／ウエルで９６穴マイクロ
タイトレーションプレートをコートした。これに、抗ヒ
トＭＭＰ−７抗体（クローン１４１−１５Ｃ６、１４１
−７Ｂ２及び１２５−２０Ｈ１１）を加えて前記実施例
２（ｄ）に記載したＥＬＩＳＡを行った。４９２ｎｍの
吸光度よりクローン１４１−１５Ｃ６はｐｅｐｔｉｄｅ
＃１をクローン１２５−２０Ｈ１１はｐｅｐｔｉｄｅ＃
３を確認した（表８）。上記（ａ）で記載したイムノブ
ロッティング及びポリペプチドとのＥＬＩＳＡの結果よ
りクローン１４１−１５Ｃ６はヒトプロＭＭＰ−７のＬ
ＰＬＰＱＥＡＧＧＭＳＥＬＱＷＥＱ（＃１）のアミノ酸
配列を含むＮ末端領域を特異的に認識し、プロＭＭＰ−
７のみと免疫反応するモノクローナル抗体であり、クロ
ーン１２５−２０Ｈ１１はヒトＭＭＰ−７のＧＩＱＫＬ
ＹＧＫＲＳＮＳＲＫＫ（＃３）のアミノ酸配列を含むＣ
末端領域を特異的に認識し、プロ、中間体及び活性化型
ＭＭＰ−７と免疫反応するモノクローナル抗体であるこ
とが判明した。なお、クローン１４１−７Ｂ２は、ｐｅ
ｐｔｉｄｅ＃１，２，３のいずれとも反応しなかった。
しかし、実施例７（ａ）の結果から判断してｐｅｐｔｉ
ｄｅ＃１近傍のアミノ酸配列を含むＮ末端領域を特異的
に認識するモノクローナル抗体と推定された。(B) Reactivity of Human MMP-7 Polypeptide with Anti-Human Pro MMP-7 Monoclonal Antibody The human MMP-7 C-terminal region polypeptide (GIQKLYGKRSNSRKK, prepared in Example 1 (b) above.
R253-267, peptide # 3) and the intermediate region polypeptide (LNMWGKEIPLHFRKVV)
WG, R133-150, peptide # 2) and N
Terminal region polypeptide (LPLPQEAGGMSELQ
WEQ, R18-34, peptide # 1) was synthesized on a peptide synthesizer 9600. A 96-well microtitration plate was coated with 100 ng / well of each of these three polypeptides. In addition to this, anti-human MMP-7 antibody (clones 141-15C6, 141
-7B2 and 125-20H11) were added and the ELISA described in Example 2 (d) above was performed. Based on the absorbance at 492 nm, clone 141-15C6 is a peptide
# 1 clone 125-20H11 is a peptide #
3 was confirmed (Table 8). From the results of the immunoblotting described in (a) above and the ELISA with the polypeptide, clone 141-15C6 was L of human pro MMP-7.
It specifically recognizes the N-terminal region containing the amino acid sequence of PLPQEAGGMSELQWEQ (# 1), and proMMP-
Clone 125-20H11 is a monoclonal antibody that immunoreacts only with GIQKL of human MMP-7.
C containing the amino acid sequence of YGKRSNSRKK (# 3)
It was found to be a monoclonal antibody that specifically recognizes the terminal region and immunoreacts with pro, intermediate, and activated MMP-7. The clone 141-7B2 was pe
It did not react with any of ptide # 1, 2, and 3.
However, judging from the results of Example 7 (a), pepti
It was presumed to be a monoclonal antibody that specifically recognizes the N-terminal region containing the amino acid sequence near de # 1.
【００５７】実施例８ サンドイッチＥＩＡ法による血
清中ヒトプロＭＭＰ−７量の測定 前記実施例６（ｄ）項に記載した２ステップサンドイッ
チＥＩＡ法により検体として各種疾患の血清プロＭＭＰ
−７を測定した（図４）。健常者血清（ｎ＝２２）の平
均プロＭＭＰ−７値は７１．２±３５．４（Ｓ．Ｄ．）
ｎｇ／ｍｌであり、結腸癌患者血清（ｎ＝２０）の平均
プロＭＭＰ−７値は３１．５±１５．３（Ｓ．Ｄ．）ｎ
ｇ／ｍｌでありこの値は健常者血清に比較して有意に低
かった（ｐ＜０．００１）。また、前記実施例６（ｅ）
項に記載した１ステップサンドイッチＥＩＡ法により結
腸癌患者の血清プロＭＭＰ−７濃度を測定した（表
９）。健常者血清（ｎ＝１６）の平均プロＭＭＰ−７濃
度は２．７５±１．６９（Ｓ．Ｄ．）ｎｇ／ｍｌであっ
た。一方、結腸癌患者血清（ｎ＝１１）の平均プロＭＭ
Ｐ−７濃度は１．１５±１．２２（Ｓ．Ｄ．）ｎｇ／ｍ
ｌであり、この値は健常者血清プロＭＭＰ−７濃度に比
較して有意に低かった（ｐ＜０．０５）。こうして本発
明のモノクローナル抗体は、腫瘍などの診断剤としても
有用であると考えられる。Example 8 Measurement of Human ProMMP-7 Level in Serum by Sandwich EIA Method Serum proMMP of various diseases as a sample by the two-step sandwich EIA method described in the above Example 6 (d).
-7 was measured (Figure 4). The average pro-MMP-7 value of healthy person serum (n = 22) was 71.2 ± 35.4 (SD).
ng / ml, and the mean pro-MMP-7 value of colon cancer patient serum (n = 20) was 31.5 ± 15.3 (SD) n.
The value was g / ml, which was significantly lower than that of the serum of healthy subjects (p <0.001). In addition, the above-mentioned Example 6 (e)
The serum proMMP-7 concentration of the colon cancer patient was measured by the one-step sandwich EIA method described in the section (Table 9). The mean pro-MMP-7 concentration of the serum of healthy subjects (n = 16) was 2.75 ± 1.69 (SD) ng / ml. On the other hand, mean proMM of serum of colon cancer patients (n = 11)
P-7 concentration is 1.15 ± 1.22 (SD) ng / m
1, which was significantly lower than the serum pro-MMP-7 concentration in healthy subjects (p <0.05). Thus, the monoclonal antibody of the present invention is considered to be useful as a diagnostic agent for tumors and the like.
【００５８】[0058]
【発明の効果】本発明では、ヒト直腸癌細胞株（ＣａＲ
−１細胞）由来プロＭＭＰ−７抗原を用いて動物を免疫
後細胞融合法を適用してヒトＭＭＰ−７と特異的に免疫
反応するモノクローナル抗体が得られる。さらに、例え
ばヒトＭＭＰ−７ Ｃ末端領域ポリペプチド（ＧＩＱＫ
ＬＹＧＫＲＳＮＳＲＫＫ，Ｒ２５３−２６７）を用いて
ヒトＭＭＰ−７と特異的に免疫反応するモノクローナル
抗体が得られる。特にヒトＭＭＰ−７のＧＩＱＫＬＹＧ
ＫＲＳＮＳＲＫＫ（Ｒ２５３−２６７）のアミノ酸配列
を含むＣ末端領域あるいはそれと実質的に同等の領域を
特異的に認識しうるモノクローナル抗体、プロ、中間体
及び活性化型ＭＭＰ−７と免疫反応することのできるモ
ノクローナル抗体と、ヒトプロＭＭＰ−７のＬＰＬＰＱ
ＥＡＧＧＭＳＥＬＱＷＥＱ（Ｒ１８−３４）のアミノ酸
配列を含むＮ末端領域あるいはそれと実質的に同等の領
域を特異的に認識しうるモノクローナル抗体、プロＭＭ
Ｐ−７のみと免疫反応することのできるモノクローナル
抗体とを、それぞれ組合わせて測定試薬として用い、特
にはサンドイッチ酵素免疫学的にヒトＭＭＰ−７の測定
を行う方法及び試薬が提供され、それらはヒトプロＭＭ
Ｐ−７の測定及び検知、さらには定量に、より有効なも
のであることが期待できる。これらモノクローナル抗体
を用いることにより現在増加している直腸癌、前立腺癌
を始めとし各種癌疾患に見いだされるＭＭＰ−７を検
出、測定でき、さらに定量できる。これらモノクローナ
ル抗体はさらに組織や細胞の免疫学的染色のための試薬
としても有用で、直腸癌、前立腺癌を始めとし各種癌疾
患のためのマーカー診断剤として有用である。したがっ
てＭＭＰ−７と関連性を有する各種疾患、疾病、症状、
病気の診断薬として有用である。INDUSTRIAL APPLICABILITY In the present invention, a human rectal cancer cell line (CaR
-1 cell) -derived pro-MMP-7 antigen is used to apply a cell fusion method after immunizing an animal to obtain a monoclonal antibody that specifically immunoreacts with human MMP-7. Furthermore, for example, human MMP-7 C-terminal region polypeptide (GIQK
LYGKRSNSRKK, R253-267) can be used to obtain a monoclonal antibody that specifically immunoreacts with human MMP-7. Especially GIQKLYG of human MMP-7
It can immunoreact with a monoclonal antibody, pro, intermediate, and activated MMP-7 capable of specifically recognizing a C-terminal region containing the amino acid sequence of KRNSRRKK (R253-267) or a region substantially equivalent thereto. Monoclonal antibody and human pro-MMP-7 LPLPQ
Monoclonal antibody, proMM, capable of specifically recognizing the N-terminal region containing the amino acid sequence of EAGGMSELQWEQ (R18-34) or a region substantially equivalent thereto
There is provided a method and a reagent for using a monoclonal antibody capable of immunoreacting with P-7 alone as a measurement reagent in combination, and particularly for performing a sandwich enzyme immunoassay to measure human MMP-7. Human Pro MM
It can be expected to be more effective for the measurement and detection of P-7, and further for the quantification. By using these monoclonal antibodies, MMP-7 found in various cancer diseases including rectal cancer and prostate cancer, which are currently increasing in number, can be detected, measured, and further quantified. Further, these monoclonal antibodies are useful as reagents for immunological staining of tissues and cells, and are useful as marker diagnostic agents for various cancer diseases including rectal cancer and prostate cancer. Therefore, various diseases, diseases, symptoms associated with MMP-7,
It is useful as a diagnostic agent for diseases.
【００５９】[0059]
【表１】 [Table 1]
【００６０】[0060]
【表２】 [Table 2]
【００６１】[0061]
【表３】 [Table 3]
【００６２】[0062]
【表４】 [Table 4]
【００６３】[0063]
【表５】 [Table 5]
【００６４】[0064]
【表６】 [Table 6]
【００６５】[0065]
【表７】 [Table 7]
【００６６】[0066]
【表８】 [Table 8]
【００６７】[0067]
【表９】 [Table 9]
【図１】ヒトプロＭＭＰ−７の２ステップサンドイッチ
ＥＩＡ法による標準曲線を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing a standard curve of human pro MMP-7 by a two-step sandwich EIA method.
【図２】ヒトプロＭＭＰ−７の１ステップサンドイッチ
ＥＩＡ法による標準曲線を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing a standard curve of human pro MMP-7 by a one-step sandwich EIA method.
【図３】ヒトプロＭＭＰ−７をＡＰＭＡで活性化させた
時のイムノブロッティングの結果を示す図である。FIG. 3 shows the results of immunoblotting when human proMMP-7 was activated with APMA.
【図４】健常者と結腸癌血清のプロＭＭＰ−７測定結果
を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing the results of proMMP-7 measurement in healthy subjects and colon cancer sera.
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成８年２月６日[Submission date] February 6, 1996
【手続補正１】[Procedure Amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】特許請求の範囲[Name of item to be amended] Claims
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【特許請求の範囲】[Claims]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 東野 勲 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品工 業株式会社内 (72)発明者 吉田 真一 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品工 業株式会社内 (72)発明者 岩田 和士 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品工 業株式会社内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical display location G01N 33/577 9162-4B C12N 15/00 C // (C12P 21/08 C12R 1:91) ( 72) Inventor Isao Tono 530 Chokeiji Temple, Takaoka City, Toyama Prefecture, Fuji Pharmaceutical Co., Ltd. (72) Shinichi Yoshida 530, Chokeiji Temple, Takaoka City, Toyama Prefecture, Fuji Chemical Industry Co., Ltd. (72) Inventor, Kazushi Iwata Toyama Fuji Keiko Kogyo Co., Ltd. 530, Chokeiji Temple, Takaoka City, Japan
Claims (10)
（ヒトＭＭＰ−７）と特異的に免疫反応するモノクロー
ナル抗体。1. Human matrix metalloprotease 7
A monoclonal antibody that specifically immunoreacts with (human MMP-7).
ＮＳＲＫＫ（Ｒ２５３−２６７）のアミノ酸配列を含む
Ｃ末端領域を特異的に認識し、プロＭＭＰ−７、中間体
ＭＭＰ−７及び活性化型ＭＭＰ−７と免疫反応するモノ
クローナル抗体であることを特徴とする請求項１記載の
モノクローナル抗体。2. GIQKLYGKRS of human MMP-7
A monoclonal antibody that specifically recognizes the C-terminal region containing the amino acid sequence of NSRKK (R253-267) and immunoreacts with proMMP-7, intermediate MMP-7 and activated MMP-7. The monoclonal antibody according to claim 1.
ＧＭＳＥＬＱＷＥＱ（Ｒ１８−３４）のアミノ酸配列又
はその近傍を含むＮ末端領域を特異的に認識し、プロＭ
ＭＰ−７のみと免疫反応するモノクローナル抗体である
ことを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体。3. LPLPQEAG of human pro-MMP-7
GMSELQWEQ (R18-34) specifically recognizes the N-terminal region containing the amino acid sequence or its vicinity, and
The monoclonal antibody according to claim 1, which is a monoclonal antibody which immunoreacts only with MP-7.
のアミノ酸領域の一部を特異的に認識し、プロＭＭＰ−
７のみと免疫反応するモノクローナル抗体であることを
特徴とする請求項３記載のモノクローナル抗体。4. A part of amino acid region other than R18-34 of human proMMP-7 is specifically recognized, and proMMP-
The monoclonal antibody according to claim 3, which is a monoclonal antibody which immunoreacts only with 7.
モノクローナル抗体を測定試薬として用いることを特徴
とするヒトプロＭＭＰ−７を免疫学的に定量する方法。5. A method for immunologically quantifying human proMMP-7, which comprises using as a measurement reagent a monoclonal antibody that specifically immunoreacts with human MMP-7.
に異なる２つの抗原決定基に対し、それぞれ特異的に結
合するモノクローナル抗体の少なくとも二種を組合わせ
ることを特徴とする請求項５記載の方法。6. The measurement reagent according to claim 5, wherein at least two monoclonal antibodies that specifically bind to two substantially different antigenic determinants of human MMP-7 are combined. Method.
ＫＬＹＧＫＲＳＮＳＲＫＫ（Ｒ２５３−２６７）のアミ
ノ酸配列を含むＣ末端領域を特異的に認識し、プロ、中
間体及び活性化型ＭＭＰ−７と免疫反応するモノクロー
ナル抗体及びヒトプロＭＭＰ−７のＬＰＬＰＱＥＡＧＧ
ＭＳＥＬＱＷＥＱ（Ｒ１８−３４）のアミノ酸配列又は
その近傍を含むＮ末端領域を特異的に認識し、プロＭＭ
Ｐ−７のみと免疫反応するモノクローナル抗体とを少な
くとも用いることを特徴とする請求項５または６記載の
方法。7. GIQ of human MMP-7 as a measuring reagent
Monoclonal antibody that specifically recognizes the C-terminal region containing the amino acid sequence of KLYGKRSNSRKK (R253-267) and immunoreacts with pro, intermediate, and activated MMP-7, and LPLPQEAGG of human pro MMP-7
It specifically recognizes the N-terminal region containing the amino acid sequence of MSELQWEQ (R18-34) or its vicinity, and
7. The method according to claim 5, wherein at least a monoclonal antibody that immunoreacts with P-7 is used.
３−２６７のアミノ酸配列を含むＣ末端領域を特異的に
認識し、プロ、中間体及び活性化型ＭＭＰ−７と免疫反
応するモノクローナル抗体及びヒトプロＭＭＰ−７のＲ
１８−３４以外のアミノ酸領域の一部を特異的に認識
し、プロＭＭＰ−７のみと免疫反応するモノクローナル
抗体とを少なくとも用いることを特徴とする請求項７記
載の方法。8. Human MMP-7 R25 as a measuring reagent
A monoclonal antibody that specifically recognizes the C-terminal region containing the amino acid sequence of 3-267 and immunoreacts with pro, intermediate, and activated MMP-7, and R of human proMMP-7
The method according to claim 7, wherein at least a monoclonal antibody that specifically recognizes a part of the amino acid region other than 18-34 and immunoreacts with proMMP-7 alone is used.
学的に行うものであることを特徴とする請求項５〜８の
いずれか一記載の方法。9. The method according to any one of claims 5 to 8, wherein the measurement is carried out enzymatically by a sandwich method.
疫組織染色に使用可能であり、ヒト癌組織のＭＭＰ−７
と免疫反応性を有するモノクローナル抗体であることを
特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体。10. MMP-7 of human cancer tissue, which specifically recognizes human MMP-7 and can be used for immunohistological staining.
The monoclonal antibody according to claim 1, which is a monoclonal antibody having immunoreactivity with.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5037595A JP2949467B2 (en) | 1995-02-16 | 1995-02-16 | Determination of human promatrix metalloprotease 7 by immunoassay |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5037595A JP2949467B2 (en) | 1995-02-16 | 1995-02-16 | Determination of human promatrix metalloprotease 7 by immunoassay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08217800A true JPH08217800A (en) | 1996-08-27 |
| JP2949467B2 JP2949467B2 (en) | 1999-09-13 |
Family
ID=12857143
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5037595A Expired - Lifetime JP2949467B2 (en) | 1995-02-16 | 1995-02-16 | Determination of human promatrix metalloprotease 7 by immunoassay |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2949467B2 (en) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6906036B2 (en) | 2001-08-16 | 2005-06-14 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7041787B2 (en) | 2000-12-29 | 2006-05-09 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Design and use of advanced zinc chelating peptides to regulate matrix metalloproteinases |
| US7071164B2 (en) | 2001-08-16 | 2006-07-04 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-cancer and wound healing compounds |
| US7094754B2 (en) | 2001-08-16 | 2006-08-22 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7148194B2 (en) | 2002-12-30 | 2006-12-12 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Method to increase fibronectin |
| EP1757940A1 (en) | 2005-08-26 | 2007-02-28 | Cézanne S.A.S. | In vitro method for diagnosing and monitoring renal cell carcinoma (RCC) using MMP-7 as humoral biomarker for RCC |
| US7186693B2 (en) | 2001-08-16 | 2007-03-06 | Kimberly - Clark Worldwide, Inc. | Metalloproteinase inhibitors for wound healing |
| US7189700B2 (en) | 2003-06-20 | 2007-03-13 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-chrondrosarcoma compounds |
| EP1867995A1 (en) * | 2006-06-15 | 2007-12-19 | Cézanne S.A.S. | In vitro method for diagnosing and monitoring metastasized bladder cancer using the determination of MMP-7 in the circulation of patients |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108267585A (en) * | 2017-12-28 | 2018-07-10 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | Diagnosis of biliary atresia kit based on blood serum designated object MMP-7 |
-
1995
- 1995-02-16 JP JP5037595A patent/JP2949467B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7041787B2 (en) | 2000-12-29 | 2006-05-09 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Design and use of advanced zinc chelating peptides to regulate matrix metalloproteinases |
| US7196162B2 (en) | 2001-08-16 | 2007-03-27 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7094754B2 (en) | 2001-08-16 | 2006-08-22 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7071164B2 (en) | 2001-08-16 | 2006-07-04 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-cancer and wound healing compounds |
| US6906036B2 (en) | 2001-08-16 | 2005-06-14 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7186693B2 (en) | 2001-08-16 | 2007-03-06 | Kimberly - Clark Worldwide, Inc. | Metalloproteinase inhibitors for wound healing |
| US7148194B2 (en) | 2002-12-30 | 2006-12-12 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Method to increase fibronectin |
| US7189700B2 (en) | 2003-06-20 | 2007-03-13 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-chrondrosarcoma compounds |
| EP1757940A1 (en) | 2005-08-26 | 2007-02-28 | Cézanne S.A.S. | In vitro method for diagnosing and monitoring renal cell carcinoma (RCC) using MMP-7 as humoral biomarker for RCC |
| WO2007022940A1 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-01 | Cezanne S.A.S. | In vitro method for diagnosing and monitoring renal cell carcinoma (rcc) using mmp-7 as humoral biomarker for rcc |
| JP2009506307A (en) * | 2005-08-26 | 2009-02-12 | セザンヌ・エス・アー・エス | In vitro method for diagnosing and monitoring RCC, using MMP-7 as a humoral biomarker for renal cell carcinoma (RCC) |
| US7981621B2 (en) | 2005-08-26 | 2011-07-19 | Cezanne S.A.S. | In vitro method for diagnosing and monitoring renal cell carcinoma (RCC) using MMP-7 as humoral biomarker for RCC |
| EP1867995A1 (en) * | 2006-06-15 | 2007-12-19 | Cézanne S.A.S. | In vitro method for diagnosing and monitoring metastasized bladder cancer using the determination of MMP-7 in the circulation of patients |
| WO2007144144A1 (en) * | 2006-06-15 | 2007-12-21 | Cezanne S.A.S. | In vitro method for diagnosing and monitoring metastasized bladder cancer using the determination of mmp -7 in the circulation of patients |
| JP2009540308A (en) * | 2006-06-15 | 2009-11-19 | セザンヌ・エス・アー・エス | In vitro method for diagnosing and monitoring metastatic bladder cancer using measurement of MMP-7 in patient's circulating fluid |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2949467B2 (en) | 1999-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3517754B2 (en) | Anti-human soluble fibrin antibody, hybridoma and immunoassay | |
| JP2949467B2 (en) | Determination of human promatrix metalloprotease 7 by immunoassay | |
| JPH10287700A (en) | Antibody against active type matrilysin (mmp-7) and immunoassay using the same | |
| US5834212A (en) | Anti-human stromelysin monoclonal antibody and method for diagnosis of rheumatoid arthritis by enzyme immunoassay | |
| JP2867325B2 (en) | Anti-PIVKA-II antibody producing hybridoma and immunological assay method | |
| JPH08100000A (en) | Antibody against human iv type collagen and its utilization | |
| EP0401370B1 (en) | Enzyme immunoassay according to sandwich method of human iv-type collagen | |
| JPH09176199A (en) | Anti-factor xa-tissue factor pathway inhibitor complex moanoclonal antibody and its use | |
| JP2864219B2 (en) | Fractional determination of free active matrix metalloproteases | |
| JP3076640B2 (en) | Immunoassay for human 92kDa gelatinase | |
| JP3174492B2 (en) | Monoclonal antibody against rabbit MMP-3 and immunoassay using the same | |
| JPH10226700A (en) | Immunoassay for detecting mia | |
| WO1998029560A1 (en) | Monoclonal antibody against collagenase 3 and immunoassay method with the use of the same | |
| JPH05304953A (en) | Hybridoma capable of producing monoclonal antibody for anti-thrombin binding substance | |
| JP2742886B2 (en) | Immunoassay for neutrophil collagenase | |
| JP5840274B2 (en) | Monoclonal antibody that specifically reacts with strome lysin 1 | |
| JPH11318449A (en) | Antibody against stromelysin-2 (mmp-10) | |
| JP2006265138A (en) | Monoclonal antibody against feline trypsinogen and/or feline trypsin | |
| JPH0677017B2 (en) | A method for the immunoassay of human dehydrogenase type IV collagen | |
| JP3017591B2 (en) | Production method of anti-human TIMP-2 monoclonal antibody and use thereof | |
| JP2518602B2 (en) | Immunological assay reagent and kit using monoclonal antibody against human protein S | |
| JP2968538B2 (en) | Monoclonal antibody of human laminin, its preparation and use | |
| WO2000009739A1 (en) | Monoclonal antibody against canine trypsin | |
| JPH0772148A (en) | Reagent for sandwich enzyme immunological determination of human type iv collagen | |
| JP2520249B2 (en) | Quantitative determination of human prolyl hydroxylase by immunoassay |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090709 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100709 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110709 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110709 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120709 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130709 Year of fee payment: 14 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |