JPH08198873A - スルフヒドリル基を有する化合物選択性蛍光標識試薬 - Google Patents
スルフヒドリル基を有する化合物選択性蛍光標識試薬Info
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- JPH08198873A JPH08198873A JP7031864A JP3186495A JPH08198873A JP H08198873 A JPH08198873 A JP H08198873A JP 7031864 A JP7031864 A JP 7031864A JP 3186495 A JP3186495 A JP 3186495A JP H08198873 A JPH08198873 A JP H08198873A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 高い蛍光量子効果を有し、位置選択的で、被
標識化合物の性質を変化させず、且つ簡便に標識できる
スルフヒドリル基を有する化合物選択性蛍光標識試薬。 【構成】 次の一般式 【化１】 （式中、Ｒ1 、Ｒ2 はそれぞれ独立に水素原子、アルキ
ル基、アルコキシル基又はスルホネート基であり、Ｒ3
はアルキル基、スルホン酸アルキル基又はアンモニオア
ルキル基であり、ｎは 1〜3 の整数で、Ｘはアニオン種
であり、Ｙは炭素数が 1〜10のアルキル鎖又は酸素原
子、窒素原子及び硫黄原子のいずれか 1種以上を含む炭
素数が 1〜10のアルキル鎖である。）で示される水溶性
インドシアニン化合物からなるスルフヒドリル基を有す
る化合物選択性蛍光標識試薬。 【効果】 分子内に一つのマレイミド基を有し、タンパ
ク等のスルフヒドリル基と反応して高感度の蛍光標識体
とする。被標識体を架橋させず、且つタンパクの特性を
損なわない。
標識化合物の性質を変化させず、且つ簡便に標識できる
スルフヒドリル基を有する化合物選択性蛍光標識試薬。 【構成】 次の一般式 【化１】 （式中、Ｒ1 、Ｒ2 はそれぞれ独立に水素原子、アルキ
ル基、アルコキシル基又はスルホネート基であり、Ｒ3
はアルキル基、スルホン酸アルキル基又はアンモニオア
ルキル基であり、ｎは 1〜3 の整数で、Ｘはアニオン種
であり、Ｙは炭素数が 1〜10のアルキル鎖又は酸素原
子、窒素原子及び硫黄原子のいずれか 1種以上を含む炭
素数が 1〜10のアルキル鎖である。）で示される水溶性
インドシアニン化合物からなるスルフヒドリル基を有す
る化合物選択性蛍光標識試薬。 【効果】 分子内に一つのマレイミド基を有し、タンパ
ク等のスルフヒドリル基と反応して高感度の蛍光標識体
とする。被標識体を架橋させず、且つタンパクの特性を
損なわない。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はスルフヒドリル基と反応
することにより蛍光ラベル化された化合物を高感度に検
出することのできるスルフヒドリル基を有する化合物選
択性蛍光標識試薬に関するものである。
することにより蛍光ラベル化された化合物を高感度に検
出することのできるスルフヒドリル基を有する化合物選
択性蛍光標識試薬に関するものである。
【０００２】本発明の蛍光標識試薬はタンパクや核酸な
どの高分子の蛍光検出や高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）による低分子化合物の検出に用いられる。
どの高分子の蛍光検出や高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）による低分子化合物の検出に用いられる。
【０００３】
【従来の技術】スルフヒドリル基と反応できる蛍光標識
試薬は数多く知られており、マレイミド基、ヨードアセ
トアミドあるいはブロモアセトアミドが代表的な反応基
である。
試薬は数多く知られており、マレイミド基、ヨードアセ
トアミドあるいはブロモアセトアミドが代表的な反応基
である。
【０００４】蛍光標識化合物としては、フルオレセイン
イソシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソ
チオシアネート（TRITC ）などがよく知られており、タ
ンパク分析や核酸分析の分野で広く用いられている。核
酸分析では、自動ＤＮＡシーケンサーでその塩基配列を
解析する際に、FITCやTRITC を標識したＤＮＡオリゴマ
ーを用いたり、ＤＮＡの動的解析を行なう場合に使用し
たりしている。塩基配列解析の場合には、一般に電気泳
動後の各バンドに含まれるＤＮＡ断片の分子の数は約 1
×10-16 〜 1×10-18 であり、レーザーを光源とする光
学系を組合わせて検出できる限界である。
イソシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソ
チオシアネート（TRITC ）などがよく知られており、タ
ンパク分析や核酸分析の分野で広く用いられている。核
酸分析では、自動ＤＮＡシーケンサーでその塩基配列を
解析する際に、FITCやTRITC を標識したＤＮＡオリゴマ
ーを用いたり、ＤＮＡの動的解析を行なう場合に使用し
たりしている。塩基配列解析の場合には、一般に電気泳
動後の各バンドに含まれるＤＮＡ断片の分子の数は約 1
×10-16 〜 1×10-18 であり、レーザーを光源とする光
学系を組合わせて検出できる限界である。
【０００５】特開平2-191674号明細書にはインドシアニ
ン型の高蛍光性化合物が記載されているが、芳香環に直
接スルホン酸基を付加することによって水溶性を付与し
たものであるが、化合物内に複数個の反応性基を持って
おり、標識に際して架橋によって被標識化合物の変性を
起こし易い。
ン型の高蛍光性化合物が記載されているが、芳香環に直
接スルホン酸基を付加することによって水溶性を付与し
たものであるが、化合物内に複数個の反応性基を持って
おり、標識に際して架橋によって被標識化合物の変性を
起こし易い。
【０００６】また、特開平5-40097 号明細書に蛍光標識
用色素として記載されている化合物もやはり架橋の問題
があり、さらに、それ自体では各種官能基各種官能基と
反応できないため、あらかじめ活性化する操作が必要
で、目的標識体を得るまでに余分なステップを要する。
用色素として記載されている化合物もやはり架橋の問題
があり、さらに、それ自体では各種官能基各種官能基と
反応できないため、あらかじめ活性化する操作が必要
で、目的標識体を得るまでに余分なステップを要する。
【０００７】近年、ある系の中でのタンパクや核酸等の
微小な成分の挙動を、蛍光顕微鏡を用いて解析しようと
する試みが行なわれるようになってきた。そのために
は、 1分子を検出する必要があり、これは従来の蛍光標
識試薬では感度的に達成不可能なレベルである。また、
血清や試料抽出物中のウイルスや菌体の種類を特定する
場合に、現在では遺伝子増幅技術（PCR ）で特定の遺伝
子だけを数千〜数万倍に増幅できるようになってきた
が、増幅の過程でノイズが入ることもあり、PCR を用い
ずに解析する必要性が出てきた。
微小な成分の挙動を、蛍光顕微鏡を用いて解析しようと
する試みが行なわれるようになってきた。そのために
は、 1分子を検出する必要があり、これは従来の蛍光標
識試薬では感度的に達成不可能なレベルである。また、
血清や試料抽出物中のウイルスや菌体の種類を特定する
場合に、現在では遺伝子増幅技術（PCR ）で特定の遺伝
子だけを数千〜数万倍に増幅できるようになってきた
が、増幅の過程でノイズが入ることもあり、PCR を用い
ずに解析する必要性が出てきた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】タンパクや核酸などの
微量な生体成分の検出には、蛍光や化学発光などの高感
度な分析法が適用されているが、通常はアトモレベル
で、 1〜数分子を計測するには現在の蛍光標識試薬では
感度的に不十分であり、モル吸光係数及び蛍光量子庫収
率の高い蛍光剤が必要となる。また、水系での使用が一
般的であるので、高い水溶性も要求される。加えて、表
紙前後で被標識体の性質が変化しないように位置選択性
な標識が必要であり、アミノ基よりもスルフヒドリル基
へ修飾できるラベル化剤であること及び被標識体同志を
架橋しないように分子内に一つのマレイミド基を持つこ
とが要求される。
微量な生体成分の検出には、蛍光や化学発光などの高感
度な分析法が適用されているが、通常はアトモレベル
で、 1〜数分子を計測するには現在の蛍光標識試薬では
感度的に不十分であり、モル吸光係数及び蛍光量子庫収
率の高い蛍光剤が必要となる。また、水系での使用が一
般的であるので、高い水溶性も要求される。加えて、表
紙前後で被標識体の性質が変化しないように位置選択性
な標識が必要であり、アミノ基よりもスルフヒドリル基
へ修飾できるラベル化剤であること及び被標識体同志を
架橋しないように分子内に一つのマレイミド基を持つこ
とが要求される。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決する本
発明の化合物は、次の一般式で示される水溶性インドシ
アニン化合物よりなるスルフヒドリル基を有する化合物
選択性蛍光標識試薬である。
発明の化合物は、次の一般式で示される水溶性インドシ
アニン化合物よりなるスルフヒドリル基を有する化合物
選択性蛍光標識試薬である。
【化３】 （式中、Ｒ1 、Ｒ2 はそれぞれ独立に水素原子、アルキ
ル基、アルコキシル基又はスルホネート基であり、Ｒ3
はアルキル基、スルホン酸アルキル基又はアンモニオア
ルキル基であり、ｎは 1〜3 の整数で、Ｘはアニオン種
であり、Ｙは炭素数が 1〜10のアルキル鎖又は酸素原
子、窒素原子及び硫黄原子のいずれか 1種以上を含む炭
素数が 1〜10のアルキル鎖である。）
ル基、アルコキシル基又はスルホネート基であり、Ｒ3
はアルキル基、スルホン酸アルキル基又はアンモニオア
ルキル基であり、ｎは 1〜3 の整数で、Ｘはアニオン種
であり、Ｙは炭素数が 1〜10のアルキル鎖又は酸素原
子、窒素原子及び硫黄原子のいずれか 1種以上を含む炭
素数が 1〜10のアルキル鎖である。）
【００１０】本発明の化合物では、上記一般式のＸはハ
ロゲン、酢酸、過塩素酸、炭酸などのアニオン種であ
る。
ロゲン、酢酸、過塩素酸、炭酸などのアニオン種であ
る。
【００１１】本発明の化合物は被標識体のスルフヒドリ
ル基と反応し、被標識体にモル吸光係数及び蛍光量子収
率の高いインドシアニンの分光学的特性を付加させるこ
とができ、励起波長 550〜780nm 、蛍光波長 560〜800n
m の蛍光特性を持つ化合物とすることができる。
ル基と反応し、被標識体にモル吸光係数及び蛍光量子収
率の高いインドシアニンの分光学的特性を付加させるこ
とができ、励起波長 550〜780nm 、蛍光波長 560〜800n
m の蛍光特性を持つ化合物とすることができる。
【００１２】本発明の化合物のスペクトル特性は、Ｒ
1 、Ｒ2 が水素原子、Ｒ3 がエチル基、Ｙが炭素数 5の
アルキル鎖、Ｘが塩素イオンの場合、ｎが 1〜3 のもの
のスペクトル特性を示せば表１のとおりである。
1 、Ｒ2 が水素原子、Ｒ3 がエチル基、Ｙが炭素数 5の
アルキル鎖、Ｘが塩素イオンの場合、ｎが 1〜3 のもの
のスペクトル特性を示せば表１のとおりである。
【００１３】
【表１】
【００１４】本発明の化合物は、いずれも文献未載の新
規化合物で、側鎖に水溶性基を含むもので、タンパクな
どを標識する場合に、そのタンパクが持つ水溶性を損な
うことなく標識できる。また、ピペラジノ環を側鎖に有
することにより側鎖が剛直になり、タンパクと標識した
色素部分とが疎水的な相互作用をせず、標識の前後でタ
ンパクの性質はそのまま維持される。さらに、マレイミ
ド基が一つの非対称化合物であるので、タンパク同志を
架橋しない。
規化合物で、側鎖に水溶性基を含むもので、タンパクな
どを標識する場合に、そのタンパクが持つ水溶性を損な
うことなく標識できる。また、ピペラジノ環を側鎖に有
することにより側鎖が剛直になり、タンパクと標識した
色素部分とが疎水的な相互作用をせず、標識の前後でタ
ンパクの性質はそのまま維持される。さらに、マレイミ
ド基が一つの非対称化合物であるので、タンパク同志を
架橋しない。
【００１５】本発明の化合物は、2,3,3-トリメチルイン
ドレニン又はそれらの誘導体を原料として合成される。
これらの原料はフィッシャーの合成法（E. Fischer and
O.Hess: Berichte, 17, 559(1883) など）に従って合
成するか、又は市販品を購入することで入手できる。原
料の窒素にアルキル基を導入した後、オルトぎ酸トリエ
チルなどと反応させてシアニン色素とし、その後ピペラ
ジノマレイミドと反応させてスルフヒドリル基選択性蛍
光標識試薬とする。
ドレニン又はそれらの誘導体を原料として合成される。
これらの原料はフィッシャーの合成法（E. Fischer and
O.Hess: Berichte, 17, 559(1883) など）に従って合
成するか、又は市販品を購入することで入手できる。原
料の窒素にアルキル基を導入した後、オルトぎ酸トリエ
チルなどと反応させてシアニン色素とし、その後ピペラ
ジノマレイミドと反応させてスルフヒドリル基選択性蛍
光標識試薬とする。
【００１６】このようにして得られた化合物の代表例と
して化合物（Ａ）〜（Ｈ）を以下に示す。
して化合物（Ａ）〜（Ｈ）を以下に示す。
【００１７】
【化４】
【００１８】
【化５】
【００１９】
【化６】
【００２０】
【化７】
【００２１】
【化８】
【００２２】
【化９】
【００２３】
【化１０】
【００２４】
【化１１】
【００２５】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、本発明はその要旨を満たす限り、以下の実施
例によって制約されるものではない。
明するが、本発明はその要旨を満たす限り、以下の実施
例によって制約されるものではない。
【００２６】実施例１ 化合物（Ａ）の合成 2,3,3-トリメチルインドレニン5.0g（31.4ミリモル）を
アセトニトリル100mlに溶解し、ヨードエタン5.9g（37.
8ミリモル）を加え一夜加熱還流した。反応液を減圧下
濃縮し、残渣にエーテルを加え、N-エチル- 2,3,3-トリ
メチルインドレニウム沃素塩の結晶を濾取した。灰赤色
結晶で、収量は9.1g、収率は92％であった。
アセトニトリル100mlに溶解し、ヨードエタン5.9g（37.
8ミリモル）を加え一夜加熱還流した。反応液を減圧下
濃縮し、残渣にエーテルを加え、N-エチル- 2,3,3-トリ
メチルインドレニウム沃素塩の結晶を濾取した。灰赤色
結晶で、収量は9.1g、収率は92％であった。
【００２１】別に、2,3,3-トリメチルインドレニン5.0g
（31.4ミリモル）をジメチルホルムアミド100ml に溶か
し、6-ブロモヘキサン酸エチル8.4g（37.6ミリモル）を
加え100℃で一夜加熱した。反応液を減圧下濃縮し、残
渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（溶媒：メタノー
ル／クロロホルム）で分離精製し、 N-(5-エチルオキシ
カルボニルペンチル）- 2,3,3-トリメチルインドレニウ
ム臭素塩を得た。赤褐色オイルで、収量は3.4g、収率は
40％であった。
（31.4ミリモル）をジメチルホルムアミド100ml に溶か
し、6-ブロモヘキサン酸エチル8.4g（37.6ミリモル）を
加え100℃で一夜加熱した。反応液を減圧下濃縮し、残
渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（溶媒：メタノー
ル／クロロホルム）で分離精製し、 N-(5-エチルオキシ
カルボニルペンチル）- 2,3,3-トリメチルインドレニウ
ム臭素塩を得た。赤褐色オイルで、収量は3.4g、収率は
40％であった。
【００２２】N-エチル- 2,3,3-トリメチルインドレニン
沃素塩2.0g（6.3 ミリモル）及び N-(5-エチルオキシペ
ンチル）- 2,3,3-トリメチルインドレニウム臭素塩1.8g
（6.3 ミリモル）をピリジン10mlに溶解し、 110℃に加
熱した後、オルトぎ酸トリエチル1.6 ml（10.0ミリモ
ル）を加え、30分加熱した。反応液を減圧下濃縮し、ク
ロロホルムに溶解し、水洗を 3回繰返した。クロロホル
ム溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフ（溶
媒：メタノール／クロロホルム）で分離精製し、N-エチ
ル- N'-(5-カルボキシペンチル)-3,3,3',3'-テトラメチ
ル- トリメチンインドシアニンを得た。緑色金属光沢結
晶で、収量は860mg 、収率は29％であった。
沃素塩2.0g（6.3 ミリモル）及び N-(5-エチルオキシペ
ンチル）- 2,3,3-トリメチルインドレニウム臭素塩1.8g
（6.3 ミリモル）をピリジン10mlに溶解し、 110℃に加
熱した後、オルトぎ酸トリエチル1.6 ml（10.0ミリモ
ル）を加え、30分加熱した。反応液を減圧下濃縮し、ク
ロロホルムに溶解し、水洗を 3回繰返した。クロロホル
ム溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフ（溶
媒：メタノール／クロロホルム）で分離精製し、N-エチ
ル- N'-(5-カルボキシペンチル)-3,3,3',3'-テトラメチ
ル- トリメチンインドシアニンを得た。緑色金属光沢結
晶で、収量は860mg 、収率は29％であった。
【００２３】この化合物 160mg（0.34ミリモル）をジメ
チルホルムアミド 2mlに溶かし、ピペラジノエチルマレ
イミド 100mg（0.35ミリモル）及びトリエチルアミン49
μl（0.36（ミリモル）を加え、 0℃に冷却しながらジ
シクロヘキシルカルボジイミド75mg（0.36ミリモル）を
加えた後、室温で一夜反応させた。反応液を濾過し、、
濾液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト
グラフ（溶媒：メタノール／クロロホルム）で分離精製
して化合物（Ａ）を得た。黒赤色粉末で、収量は120mg
、収率は51％であった。
チルホルムアミド 2mlに溶かし、ピペラジノエチルマレ
イミド 100mg（0.35ミリモル）及びトリエチルアミン49
μl（0.36（ミリモル）を加え、 0℃に冷却しながらジ
シクロヘキシルカルボジイミド75mg（0.36ミリモル）を
加えた後、室温で一夜反応させた。反応液を濾過し、、
濾液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト
グラフ（溶媒：メタノール／クロロホルム）で分離精製
して化合物（Ａ）を得た。黒赤色粉末で、収量は120mg
、収率は51％であった。
【００２４】得られた化合物（Ａ）をpH7.4 の PBSバッ
ファー（NaCl:8.0g, KCl:0.2g, Na2HPO4:11.5g, KH2PO4
／水1LL ）に溶かした溶液の蛍光スペクトルを図１に示
す。
ファー（NaCl:8.0g, KCl:0.2g, Na2HPO4:11.5g, KH2PO4
／水1LL ）に溶かした溶液の蛍光スペクトルを図１に示
す。
【００２５】実施例２ 化合物（Ｂ）の合成 N-エチル-N'-（5-カルボキシペンチル）-3,3,3',3'- テ
トラメチル- トリメチンインドシアニン 320mg（0.68ミ
リモル）を 5mlの30％発煙硫酸中へ少しづつ加えた。そ
のまま 1時間撹拌した後、炭酸水素ナトリウムを含む水
中へ注ぎ、析出してきた硫酸ナトリウムを濾過で除き、
濾液を減圧下濃縮した。残っている硫酸ナトリウムはメ
タノールに懸濁させ、濾過して除き、セファデックスLH
20／水を用いて分離精製し、N-エチル- N'-(5-カルボキ
シペンチル)-3,3,3',3'-テトラメチル- トリメチンイン
ドシアニン-5,5'-ジスルホン酸を得た。黒赤色固体で、
収量は310mg 、収率は70％であった。
トラメチル- トリメチンインドシアニン 320mg（0.68ミ
リモル）を 5mlの30％発煙硫酸中へ少しづつ加えた。そ
のまま 1時間撹拌した後、炭酸水素ナトリウムを含む水
中へ注ぎ、析出してきた硫酸ナトリウムを濾過で除き、
濾液を減圧下濃縮した。残っている硫酸ナトリウムはメ
タノールに懸濁させ、濾過して除き、セファデックスLH
20／水を用いて分離精製し、N-エチル- N'-(5-カルボキ
シペンチル)-3,3,3',3'-テトラメチル- トリメチンイン
ドシアニン-5,5'-ジスルホン酸を得た。黒赤色固体で、
収量は310mg 、収率は70％であった。
【００２６】N-エチル- N'-(5-カルボキシペンチル)-3,
3,3',3'-テトラメチル- トリメチンインドシアニン-5,
5'-ジスルホン酸 120mg（0.19ミリモル）を水／テトラ
ヒドロフラン（ＴＨＦ）混合溶媒に溶かし、ピペラジノ
エチルマレイミド65mg（0.22ミリモル）を加え、炭酸水
素ナトリウムで溶液のpHを6.5 に調整した後、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド48mg（0.23ミリモル）をＴＨＦ
に溶かして加え、室温で一夜撹拌した。析出したジシク
ロヘキシル尿素を濾過で除き、濾液を減圧下濃縮し、セ
ファデックスLH20／水で分離精製して化合物（Ｂ）を得
た。黒赤色固体で、収量は 145mg、収率は92％であっ
た。
3,3',3'-テトラメチル- トリメチンインドシアニン-5,
5'-ジスルホン酸 120mg（0.19ミリモル）を水／テトラ
ヒドロフラン（ＴＨＦ）混合溶媒に溶かし、ピペラジノ
エチルマレイミド65mg（0.22ミリモル）を加え、炭酸水
素ナトリウムで溶液のpHを6.5 に調整した後、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド48mg（0.23ミリモル）をＴＨＦ
に溶かして加え、室温で一夜撹拌した。析出したジシク
ロヘキシル尿素を濾過で除き、濾液を減圧下濃縮し、セ
ファデックスLH20／水で分離精製して化合物（Ｂ）を得
た。黒赤色固体で、収量は 145mg、収率は92％であっ
た。
【００２７】実施例３ 化合物（Ｃ）の合成 N-エチル- 2,3,3-トリメチルインドレニン沃素塩2.0g
（6.3 ミリモル）及び N-(5-エチルオキシカルボニルペ
ンチル）- 2,3,3-トリメチルインドレニウム臭素塩1.8g
（6.3 ミリモル）をピリジン10mlに溶解し、 110℃に加
熱した後、1,3,3-トリメトキシプロペン1.3g（9.8 ミリ
モル）を加え 1時間加熱した。反応液を減圧下濃縮し、
クロロホルムに溶解し水洗を 3回繰返した。クロロホル
ム溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフ（溶
媒：メタノール／クロロホルム）で分離精製し、N-エチ
ル- N'-(5-カルボキシペンチル)-3,3,3',3'-テトラメチ
ル-ペンタメチンインドシアニンを得た。緑色金属光沢
結晶で、収量は710mg 、収率は23％であった。
（6.3 ミリモル）及び N-(5-エチルオキシカルボニルペ
ンチル）- 2,3,3-トリメチルインドレニウム臭素塩1.8g
（6.3 ミリモル）をピリジン10mlに溶解し、 110℃に加
熱した後、1,3,3-トリメトキシプロペン1.3g（9.8 ミリ
モル）を加え 1時間加熱した。反応液を減圧下濃縮し、
クロロホルムに溶解し水洗を 3回繰返した。クロロホル
ム溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフ（溶
媒：メタノール／クロロホルム）で分離精製し、N-エチ
ル- N'-(5-カルボキシペンチル)-3,3,3',3'-テトラメチ
ル-ペンタメチンインドシアニンを得た。緑色金属光沢
結晶で、収量は710mg 、収率は23％であった。
【００２８】化合物（Ａ）の合成時と同様に、N-エチル
- N'-(5-カルボキシペンチル)-3,3,3',3'-テトラメチル
- ペンタメチンインドシアニン200mg （0.43ミリモル）
とピペラジノエチルマレイミドとを反応させ、シリカゲ
ルカラムクロマトグラフで単離生成して化合物（Ｃ）を
得た。黒青色固体で、収量は180mg 、収率は58％であっ
た。
- N'-(5-カルボキシペンチル)-3,3,3',3'-テトラメチル
- ペンタメチンインドシアニン200mg （0.43ミリモル）
とピペラジノエチルマレイミドとを反応させ、シリカゲ
ルカラムクロマトグラフで単離生成して化合物（Ｃ）を
得た。黒青色固体で、収量は180mg 、収率は58％であっ
た。
【００２９】実施例４ 化合物（Ａ）を用いたタンパクの標識 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）12.5mgをpH8 の0.1Mリン酸
緩衝液2.5ml に溶かし、0.3Mのジチオスレイトール水溶
液10mlを加え、30℃で 5時間放置した。ファルマシアの
パックドカラムPD-10 を用いてpH7.4 の PBSバッファー
（NaCl:8.0g, KCl:0.2g, Na2HPO4:11.5g, KH2PO4／水1L
L ）で分離精製した。得られた還元ＢＳＡ溶液3.0ml に
化合物（Ａ）の100mM 水溶液50mlを加え、25℃で一夜放
置した。標識されたタンパク画分を PD-10カラムを用
い、 PBSバファーで分離した。得られた3.0ml の画分を
凍結乾燥した。
緩衝液2.5ml に溶かし、0.3Mのジチオスレイトール水溶
液10mlを加え、30℃で 5時間放置した。ファルマシアの
パックドカラムPD-10 を用いてpH7.4 の PBSバッファー
（NaCl:8.0g, KCl:0.2g, Na2HPO4:11.5g, KH2PO4／水1L
L ）で分離精製した。得られた還元ＢＳＡ溶液3.0ml に
化合物（Ａ）の100mM 水溶液50mlを加え、25℃で一夜放
置した。標識されたタンパク画分を PD-10カラムを用
い、 PBSバファーで分離した。得られた3.0ml の画分を
凍結乾燥した。
【００３０】化合物（Ａ）を標識したＢＳＡをpH7.4 の
PBSバッファーに溶かした溶液の蛍光スペクトルを図２
に示す。
PBSバッファーに溶かした溶液の蛍光スペクトルを図２
に示す。
【００３１】標識タンパクの細胞内導入及び蛍光観察 ダルベッコ改変ＭＥＭ培地（以下、DMEMと略記する）で
培養したNIH3T3細胞を用い、メリディアン社製のグラス
ボトムディシュのガラス上に細胞を付着させた。化合物
（Ａ）を標識したＢＳＡ 1mgを PBSバッファー10mlに溶
かし、0.2 μmのフィルターを通し減菌水で 1／10に希
釈した。
培養したNIH3T3細胞を用い、メリディアン社製のグラス
ボトムディシュのガラス上に細胞を付着させた。化合物
（Ａ）を標識したＢＳＡ 1mgを PBSバッファー10mlに溶
かし、0.2 μmのフィルターを通し減菌水で 1／10に希
釈した。
【００３２】化合物（Ａ）をＢＳＡに標識し、pH7.4 の
PBSバッファーに溶かした溶液の吸収スペクトルを図２
に示す。
PBSバッファーに溶かした溶液の吸収スペクトルを図２
に示す。
【００３３】この溶液を再び0.2 μm のフィルターを通
した後、マイクロインジェクション用のシリカキャピラ
リーに入れ、 2kg/cm2程度の圧力を加えながら細胞に色
素標識ＢＳＡを導入した。この操作により 1細胞当り0.
1pl すなわち15ゼプトモルの色素ＢＳＡを導入したこと
になる。
した後、マイクロインジェクション用のシリカキャピラ
リーに入れ、 2kg/cm2程度の圧力を加えながら細胞に色
素標識ＢＳＡを導入した。この操作により 1細胞当り0.
1pl すなわち15ゼプトモルの色素ＢＳＡを導入したこと
になる。
【００３４】DMEMを捨て、PBS で線状を 4回繰返した
後、PBS バッファー中で落射蛍光顕微鏡（オリンパスOM
T-2 ）を用い、蛍光観察した。蛍光はＧ励起のフィルタ
ーを通し、高感度ＣＣＤカメラを用いて検出した。その
結果、ＢＳＡをマイクロインジェクションした細胞のみ
を検出できた。
後、PBS バッファー中で落射蛍光顕微鏡（オリンパスOM
T-2 ）を用い、蛍光観察した。蛍光はＧ励起のフィルタ
ーを通し、高感度ＣＣＤカメラを用いて検出した。その
結果、ＢＳＡをマイクロインジェクションした細胞のみ
を検出できた。
【００３５】
【発明の効果】本発明の蛍光標識試薬はインドシアニン
を母核に持ちゼプトモルレベルの検出が可能であり、分
子内一つのマレイミド基を有するため、被標識体のスル
フヒドリル基と選択性に反応し、被標識体同志を架橋さ
せない。また、側鎖中のピペラジノ基は化合物に酸性〜
中性域で水溶性を与え、且つ側鎖を硬直にして色素とタ
ンパクの相互作用を低く押えてタンパクの特性を損なわ
ない。
を母核に持ちゼプトモルレベルの検出が可能であり、分
子内一つのマレイミド基を有するため、被標識体のスル
フヒドリル基と選択性に反応し、被標識体同志を架橋さ
せない。また、側鎖中のピペラジノ基は化合物に酸性〜
中性域で水溶性を与え、且つ側鎖を硬直にして色素とタ
ンパクの相互作用を低く押えてタンパクの特性を損なわ
ない。
【図１】本発明の化合物（Ａ）をpH7.4 の PBSバッファ
ーに溶かした溶液の吸収スペクトルを示す。
ーに溶かした溶液の吸収スペクトルを示す。
【図２】本発明の化合物（Ａ）をＢＳＡに標識し、pH7.
4 の PBSバッファーに溶かした溶液の吸収スペクトルを
示す。
4 の PBSバッファーに溶かした溶液の吸収スペクトルを
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 207:448 209:10）
Claims (2)
- 【請求項１】 次の一般式で示される水溶性インドシア
ニン化合物よりなるスルフヒドリル基を有する化合物選
択性蛍光標識試薬。 【化１】 （式中、Ｒ1 、Ｒ2 はそれぞれ独立に水素原子、アルキ
ル基、アルコキシル基又はスルホネート基であり、Ｒ3
はアルキル基、スルホン酸アルキル基又はアンモニオア
ルキル基であり、ｎは 1〜3 の整数で、Ｘはアニオン種
であり、Ｙは炭素数が 1〜10のアルキル鎖又は酸素原
子、窒素原子及び硫黄原子のいずれか 1種以上を含む炭
素数が 1〜10のアルキル鎖である。） - 【請求項２】 次の一般式、 【化２】 （式中、Ｒ1 、Ｒ2 はそれぞれ独立に水素原子、アルキ
ル基、アルコキシル基又はスルホネート基であり、Ｒ3
はアルキル基、スルホン酸アルキル基又はアンモニオア
ルキル基であり、ｎは 1〜3 の整数で、Ｘはアニオン種
であり、Ｙは炭素数が 1〜10のアルキル鎖又は酸素原
子、窒素原子及び硫黄原子のいずれか 1種以上を含む炭
素数が 1〜10のアルキル鎖である。）で示される水溶性
インドシアニン化合物を対象物のスルフヒドリル基と反
応させ蛍光検出により高感度で測定する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7031864A JPH08198873A (ja) | 1995-01-30 | 1995-01-30 | スルフヒドリル基を有する化合物選択性蛍光標識試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7031864A JPH08198873A (ja) | 1995-01-30 | 1995-01-30 | スルフヒドリル基を有する化合物選択性蛍光標識試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08198873A true JPH08198873A (ja) | 1996-08-06 |
Family
ID=12342922
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7031864A Withdrawn JPH08198873A (ja) | 1995-01-30 | 1995-01-30 | スルフヒドリル基を有する化合物選択性蛍光標識試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08198873A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007032363A1 (ja) * | 2005-09-13 | 2007-03-22 | The University Of Tokyo | 新規マレイミド誘導体 |
| US7705150B2 (en) * | 2004-02-04 | 2010-04-27 | Biosearch Technologies, Inc. | Cyanine dyes |
-
1995
- 1995-01-30 JP JP7031864A patent/JPH08198873A/ja not_active Withdrawn
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7705150B2 (en) * | 2004-02-04 | 2010-04-27 | Biosearch Technologies, Inc. | Cyanine dyes |
| US8436153B2 (en) | 2004-02-04 | 2013-05-07 | Biosearch Technologies, Inc. | Cyanine dyes |
| US9435796B2 (en) | 2004-02-04 | 2016-09-06 | Biosearch Technologies, Inc. | Cyanine dyes |
| WO2007032363A1 (ja) * | 2005-09-13 | 2007-03-22 | The University Of Tokyo | 新規マレイミド誘導体 |
| JP5292570B2 (ja) * | 2005-09-13 | 2013-09-18 | 国立大学法人 東京大学 | 新規マレイミド誘導体 |
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Legal Events
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| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
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| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20051115 |
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| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20060130 |