JPH08196272A - ハイブリドーマ２９ｄ３８ - Google Patents
ハイブリドーマ２９ｄ３８Info
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- JPH08196272A JPH08196272A JP7007819A JP781995A JPH08196272A JP H08196272 A JPH08196272 A JP H08196272A JP 7007819 A JP7007819 A JP 7007819A JP 781995 A JP781995 A JP 781995A JP H08196272 A JPH08196272 A JP H08196272A
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- Japan
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- monoclonal antibody
- antigen
- human
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 肺癌に対して特異性の高く、かつ肺癌細胞の
核膜抗原と反応するヒト型モノクローナル抗体を提供す
ることにある。 【構成】 工業技術院生命工学工業研究所に受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４１２２号で寄託された細胞の特性を有
するハイブリドーマ２９Ｄ３８、当該ハイブリドーマ２
９Ｄ３８が産生するヒト型モノクローナル抗体、そのヒ
ト型モノクローナル抗体若しくは該ヒト型モノクローナ
ル抗体断片を主成分とする癌検査薬およびそのヒト型モ
ノクローナル抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体
断片を成分とする癌治療薬である。
核膜抗原と反応するヒト型モノクローナル抗体を提供す
ることにある。 【構成】 工業技術院生命工学工業研究所に受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４１２２号で寄託された細胞の特性を有
するハイブリドーマ２９Ｄ３８、当該ハイブリドーマ２
９Ｄ３８が産生するヒト型モノクローナル抗体、そのヒ
ト型モノクローナル抗体若しくは該ヒト型モノクローナ
ル抗体断片を主成分とする癌検査薬およびそのヒト型モ
ノクローナル抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体
断片を成分とする癌治療薬である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、特に肺癌に対し特異的
に反応し、かつ肺癌細胞株の核膜抗原と反応するヒト型
モノクローナル抗体に関するものであり、詳しくは、工
業技術院生命工学工業研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１４１２２号で寄託された細胞の特性を有するハイブリ
ドーマ２９Ｄ３８、工業技術院生命工学工業研究所に受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１２２号で寄託された細胞の
特性を有するハイブリドーマ２９Ｄ３８が産生するヒト
型モノクローナル抗体、該ヒト型モノクローナル抗体若
しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を主成分とする
癌検査薬、該ヒト型モノクローナル抗体若しくは該ヒト
型モノクローナル抗体断片を成分とする癌治療薬に関す
る。
に反応し、かつ肺癌細胞株の核膜抗原と反応するヒト型
モノクローナル抗体に関するものであり、詳しくは、工
業技術院生命工学工業研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１４１２２号で寄託された細胞の特性を有するハイブリ
ドーマ２９Ｄ３８、工業技術院生命工学工業研究所に受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１２２号で寄託された細胞の
特性を有するハイブリドーマ２９Ｄ３８が産生するヒト
型モノクローナル抗体、該ヒト型モノクローナル抗体若
しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を主成分とする
癌検査薬、該ヒト型モノクローナル抗体若しくは該ヒト
型モノクローナル抗体断片を成分とする癌治療薬に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】抗体を用いた免疫学的診断・治療・予防
法は、臨床的に非常に望まれており、特に、自己免疫疾
患、癌、感染症などの疾患領域での臨床的価値は高い。
厚生省の人口動態統計資料によれば、日本における死因
の第１位は癌であり、癌による死亡者数は年々増加の傾
向にある。その中でも、肺癌・大腸癌による死亡者数は
著しい増加傾向にあり、それらに対する癌診断薬・癌治
療薬の開発が臨床の現場で強く望まれている。
法は、臨床的に非常に望まれており、特に、自己免疫疾
患、癌、感染症などの疾患領域での臨床的価値は高い。
厚生省の人口動態統計資料によれば、日本における死因
の第１位は癌であり、癌による死亡者数は年々増加の傾
向にある。その中でも、肺癌・大腸癌による死亡者数は
著しい増加傾向にあり、それらに対する癌診断薬・癌治
療薬の開発が臨床の現場で強く望まれている。
【０００３】癌に対する免疫学的治療薬として、マウス
型モノクローナル抗体（Ｄｉｐｐｏｌｄ、Ｗ．Ｇ他、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７
７、６１１４−６１１８，１９８０；Ｋｏｐｒｏｗｓｋ
ｉ，Ｈ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ．，８１，２１６−２１９，１９８４；Ｈｅｌｌｓ
ｔｒｏｍ，Ｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．，８２，１４９９−１５０２，１９８５）
あるいはヒト−マウス型キメラ抗体（Ｎｅｕｂｅｒｇｅ
ｒ，Ｍ．Ｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３１２，６０４−６０
８，１９８４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、２２９，１２０２−１２０７，１９８５）などを
用いた開発が行われている。
型モノクローナル抗体（Ｄｉｐｐｏｌｄ、Ｗ．Ｇ他、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７
７、６１１４−６１１８，１９８０；Ｋｏｐｒｏｗｓｋ
ｉ，Ｈ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ．，８１，２１６−２１９，１９８４；Ｈｅｌｌｓ
ｔｒｏｍ，Ｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．，８２，１４９９−１５０２，１９８５）
あるいはヒト−マウス型キメラ抗体（Ｎｅｕｂｅｒｇｅ
ｒ，Ｍ．Ｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３１２，６０４−６０
８，１９８４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、２２９，１２０２−１２０７，１９８５）などを
用いた開発が行われている。
【０００４】しかしながら、マウス型モノクローナル抗
体あるいはヒト−マウス型キメラ抗体など異種の抗体あ
るいは該抗体断片を含む体内診断薬あるいは治療薬はヒ
トに対して異物でありアナフィラキシ−ショックなどの
副作用を引き起こす可能性が高く（本田光世他、Ｂｉｏ
ｔｈｅｒａｐｙ，４，８４４−８４７，１９９０）、臨
床的実用性は非常に低い。
体あるいはヒト−マウス型キメラ抗体など異種の抗体あ
るいは該抗体断片を含む体内診断薬あるいは治療薬はヒ
トに対して異物でありアナフィラキシ−ショックなどの
副作用を引き起こす可能性が高く（本田光世他、Ｂｉｏ
ｔｈｅｒａｐｙ，４，８４４−８４７，１９９０）、臨
床的実用性は非常に低い。
【０００５】それらに対して、ヒト型モノクローナル抗
体を用いれば、ヒトに対する安全性は格段に向上し、体
内診断薬あるいは治療薬としては理想的な薬剤である。
しかしながら、ヒト型モノクローナル抗体を作製する技
術は非常に難しく、癌と反応するヒト型モノクローナル
抗体を安定的にかつ大量に取得する試みは種々行われて
いるが（Ｉｒｉｅ，Ｒ．Ｆ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７９，５６６６−５６７
０，１９８２；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ他、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８４，２４１
６−２４２０，１９８７；Ｒｉｃｈａｒｄ・Ｊ．Ｃｏｔ
ｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８０、２０２６−２０３０、１９８３；Ｓｕｓａｎ
・Ｐ．Ｃ．Ｃｏｌｅ他、Ｃａｎｃｅｒ・Ｒｅｓ．、４
４、２７５０−２７５３、１９８４；Ｍａｒｔｉｎ・
Ｖ．Ｈａｓｐｅｌ他、Ｃａｎｃｅｒ・Ｒｅｓ．、４５、
３９５１−３９６１、１９８５；Ｒｉｃｈａｒｄ・Ｊ．
Ｃｏｔｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、８３、２９５９−２９６３、１９８６；Ｔｈｏ
ｍａｓ・Ｂ．Ｋｊｅｌｄｓｅｎ他、Ｃａｎｃｅｒ・Ｒｅ
ｓ．、４８、３２０８−３２１４、１９８８）、臨床的
に実用化できた例はまだない。
体を用いれば、ヒトに対する安全性は格段に向上し、体
内診断薬あるいは治療薬としては理想的な薬剤である。
しかしながら、ヒト型モノクローナル抗体を作製する技
術は非常に難しく、癌と反応するヒト型モノクローナル
抗体を安定的にかつ大量に取得する試みは種々行われて
いるが（Ｉｒｉｅ，Ｒ．Ｆ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７９，５６６６−５６７
０，１９８２；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ他、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８４，２４１
６−２４２０，１９８７；Ｒｉｃｈａｒｄ・Ｊ．Ｃｏｔ
ｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８０、２０２６−２０３０、１９８３；Ｓｕｓａｎ
・Ｐ．Ｃ．Ｃｏｌｅ他、Ｃａｎｃｅｒ・Ｒｅｓ．、４
４、２７５０−２７５３、１９８４；Ｍａｒｔｉｎ・
Ｖ．Ｈａｓｐｅｌ他、Ｃａｎｃｅｒ・Ｒｅｓ．、４５、
３９５１−３９６１、１９８５；Ｒｉｃｈａｒｄ・Ｊ．
Ｃｏｔｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、８３、２９５９−２９６３、１９８６；Ｔｈｏ
ｍａｓ・Ｂ．Ｋｊｅｌｄｓｅｎ他、Ｃａｎｃｅｒ・Ｒｅ
ｓ．、４８、３２０８−３２１４、１９８８）、臨床的
に実用化できた例はまだない。
【０００６】また、癌の中でも肺癌による死亡者数が急
激に増加しており、かつ手術後の５年生存率も非常に低
く、肺癌の診断・治療法が臨床の現場で強く望まれてい
る。肺癌の癌マーカーとして、肺腺癌の場合はシアリル
ルイスＸ（ｓｉａｌｙｌ・Ｌｅｗｉｓ・Ｘ；ＳＬＸ）、
肺扁平上皮癌の場合はスクワマスセルカルシノーマ抗原
（ｓｑｕａｍｏｕｓ・ｃｅｌｌ・ｃａｒｃｉｎｏｍａ・
ａｎｔｉｇｅｎ；ＳＣＣ）、肺小細胞癌の場合はニュー
ロン特異的エノラーゼ（ｎｅｕｒｏｎ・ｓｐｅｃｉｆｉ
ｃ・ｅｎｏｌａｓｅ；ＮＳＥ）、肺癌全体としては癌胎
児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ・ａｎｔ
ｉｇｅｎ；ＣＥＡ）などが多く用いられているが（有吉
寛、モダン・フィジシャン、１２、９８１−９８５、１
９９２）、必ずしも満足のいくものではなく、しかもそ
れらの診断薬で用いられる抗体は、すべてマウス型モノ
クローナル抗体であり、体内診断薬や治療薬に使用する
ことは副作用の危険性から考えて好ましくはない。
激に増加しており、かつ手術後の５年生存率も非常に低
く、肺癌の診断・治療法が臨床の現場で強く望まれてい
る。肺癌の癌マーカーとして、肺腺癌の場合はシアリル
ルイスＸ（ｓｉａｌｙｌ・Ｌｅｗｉｓ・Ｘ；ＳＬＸ）、
肺扁平上皮癌の場合はスクワマスセルカルシノーマ抗原
（ｓｑｕａｍｏｕｓ・ｃｅｌｌ・ｃａｒｃｉｎｏｍａ・
ａｎｔｉｇｅｎ；ＳＣＣ）、肺小細胞癌の場合はニュー
ロン特異的エノラーゼ（ｎｅｕｒｏｎ・ｓｐｅｃｉｆｉ
ｃ・ｅｎｏｌａｓｅ；ＮＳＥ）、肺癌全体としては癌胎
児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ・ａｎｔ
ｉｇｅｎ；ＣＥＡ）などが多く用いられているが（有吉
寛、モダン・フィジシャン、１２、９８１−９８５、１
９９２）、必ずしも満足のいくものではなく、しかもそ
れらの診断薬で用いられる抗体は、すべてマウス型モノ
クローナル抗体であり、体内診断薬や治療薬に使用する
ことは副作用の危険性から考えて好ましくはない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、肺癌に対して
特異性の高く、かつ肺癌細胞の核膜抗原と反応するヒト
型モノクローナル抗体を開発し、肺癌の診断・治療に用
いることが本発明の目的である。
特異性の高く、かつ肺癌細胞の核膜抗原と反応するヒト
型モノクローナル抗体を開発し、肺癌の診断・治療に用
いることが本発明の目的である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、先に、肺
癌に反応し、肺癌細胞株細胞膜抗原と反応し、かつ、分
子量約５０万〜約８０万の抗原に反応し得る、抗体重鎖
および抗体軽鎖のアミノ末端がブロックされているヒト
型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ２８Ｋ２９
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１１９）および当該ヒト型モノク
ローナル抗体（特願平６−３０１８３６号明細書、平成
６年１２月６日出願日）、肺癌に反応し、肺癌細胞株細
胞膜抗原と反応し、かつ、分子量５００００±５０００
の抗原に反応し得る、抗体重鎖として配列番号２記載の
アミノ酸配列を含有し、かつ抗体軽鎖として配列番号３
記載のアミノ酸配列含有するヒト型モノクローナル抗体
産生ハイブリドーマＺＬＧ４０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１
２１）および当該ヒト型モノクローナル抗体（特願平６
−３１４４０７号明細書、平成６年１２月１９日出願
日）、肺癌に反応し、肺癌細胞株細胞膜抗原と反応し得
る、抗体重鎖として配列番号４記載のアミノ酸配列を含
有し、かつ抗体軽鎖として配列番号５記載のアミノ酸配
列含有するヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ２７Ｄ５７（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１２０）および当該
ヒト型モノクローナル抗体（特願平７−００１１３６号
明細書、平成７年１月９日出願日）を見いだした。
癌に反応し、肺癌細胞株細胞膜抗原と反応し、かつ、分
子量約５０万〜約８０万の抗原に反応し得る、抗体重鎖
および抗体軽鎖のアミノ末端がブロックされているヒト
型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ２８Ｋ２９
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１１９）および当該ヒト型モノク
ローナル抗体（特願平６−３０１８３６号明細書、平成
６年１２月６日出願日）、肺癌に反応し、肺癌細胞株細
胞膜抗原と反応し、かつ、分子量５００００±５０００
の抗原に反応し得る、抗体重鎖として配列番号２記載の
アミノ酸配列を含有し、かつ抗体軽鎖として配列番号３
記載のアミノ酸配列含有するヒト型モノクローナル抗体
産生ハイブリドーマＺＬＧ４０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１
２１）および当該ヒト型モノクローナル抗体（特願平６
−３１４４０７号明細書、平成６年１２月１９日出願
日）、肺癌に反応し、肺癌細胞株細胞膜抗原と反応し得
る、抗体重鎖として配列番号４記載のアミノ酸配列を含
有し、かつ抗体軽鎖として配列番号５記載のアミノ酸配
列含有するヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ２７Ｄ５７（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１２０）および当該
ヒト型モノクローナル抗体（特願平７−００１１３６号
明細書、平成７年１月９日出願日）を見いだした。
【０００９】本発明者らは、鋭意研究の結果、肺癌細胞
株の核膜抗原と反応し、免疫組織染色において肺癌組織
と反応し、かつ、担癌マウスを用いた、癌部への集積性
実験で陽性かつ癌部の縮退を引き起こすことを特徴と
し、前記のヒト型モノクローナル抗体とは理化学的性質
が異なるヒト型モノクローナル抗体を見いだし、本発明
を完成した。
株の核膜抗原と反応し、免疫組織染色において肺癌組織
と反応し、かつ、担癌マウスを用いた、癌部への集積性
実験で陽性かつ癌部の縮退を引き起こすことを特徴と
し、前記のヒト型モノクローナル抗体とは理化学的性質
が異なるヒト型モノクローナル抗体を見いだし、本発明
を完成した。
【００１０】すなわち、本発明によるヒト型モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマは、試験管内刺激したヒト
リンパ球とミエローマ細胞との細胞融合により作成され
たものである。このヒト型モノクローナル抗体は、肺腺
癌細胞株Ａ５４９の核膜抗原と反応し、肺腺癌・肺扁平
上皮癌組織切片と反応し、さらにインビボ（ｉｎ・ｖｉ
ｖｏ）実験で、すなわち肺癌細胞株Ａ５４９を移植し
て、腫瘍を形成せしめた重症複合免疫不全マウス（ｓｅ
ｖｅｒｅ・ｃｏｍｂｉｎｅｄ・ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃ
ｉｅｎｃｙ・ｍｏｕｓｅ；ＳＣＩＤ）を用いた体内動態
実験で、抗体の集積性が陽性かつ腫瘍の縮退を引き起こ
す性質を有し、抗原としてＳＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動上で主要なバンドとして分子量が非還元下で１
００万以上、還元下で２００００〜８００００の間の複
数の位置に反応し、抗体クラスおよび軽鎖はＩｇＭでλ
鎖であり、このような性状を有するヒト型モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマ２９Ｄ３８を見いだし、工業
技術院生命工学工業研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
４１２２号として寄託したもので、さらに当該ハイブリ
ドーマ２９Ｄ３８から産生された新規なヒト型モノクロ
ーナル抗体を見出した。
ナル抗体産生ハイブリドーマは、試験管内刺激したヒト
リンパ球とミエローマ細胞との細胞融合により作成され
たものである。このヒト型モノクローナル抗体は、肺腺
癌細胞株Ａ５４９の核膜抗原と反応し、肺腺癌・肺扁平
上皮癌組織切片と反応し、さらにインビボ（ｉｎ・ｖｉ
ｖｏ）実験で、すなわち肺癌細胞株Ａ５４９を移植し
て、腫瘍を形成せしめた重症複合免疫不全マウス（ｓｅ
ｖｅｒｅ・ｃｏｍｂｉｎｅｄ・ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃ
ｉｅｎｃｙ・ｍｏｕｓｅ；ＳＣＩＤ）を用いた体内動態
実験で、抗体の集積性が陽性かつ腫瘍の縮退を引き起こ
す性質を有し、抗原としてＳＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動上で主要なバンドとして分子量が非還元下で１
００万以上、還元下で２００００〜８００００の間の複
数の位置に反応し、抗体クラスおよび軽鎖はＩｇＭでλ
鎖であり、このような性状を有するヒト型モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマ２９Ｄ３８を見いだし、工業
技術院生命工学工業研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
４１２２号として寄託したもので、さらに当該ハイブリ
ドーマ２９Ｄ３８から産生された新規なヒト型モノクロ
ーナル抗体を見出した。
【００１１】本発明のヒト型モノクローナル抗体は該ヒ
ト型モノクローナル抗体、該ヒト型モノクローナル抗体
断片、または該ヒト型モノクローナル抗体あるいは該ヒ
ト型モノクローナル抗体断片に、例えば放射性同位元素
（ＲＩ）、常磁性物質、光感受性物質、毒素または抗癌
物質などを結合させた免疫複合体などを有効成分とする
肺癌治療法・肺癌診断法に用いることが可能となり、ヒ
トに対してより安全な治療薬・診断薬を提供し得るもの
であることを見出した。
ト型モノクローナル抗体、該ヒト型モノクローナル抗体
断片、または該ヒト型モノクローナル抗体あるいは該ヒ
ト型モノクローナル抗体断片に、例えば放射性同位元素
（ＲＩ）、常磁性物質、光感受性物質、毒素または抗癌
物質などを結合させた免疫複合体などを有効成分とする
肺癌治療法・肺癌診断法に用いることが可能となり、ヒ
トに対してより安全な治療薬・診断薬を提供し得るもの
であることを見出した。
【００１２】また、本発明のヒト型モノクローナル抗体
は、抗体重鎖としてアミノ末端がブロックされており、
かつ抗体軽鎖として配列番号１記載のアミノ酸配列を含
有するヒト型モノクローナル抗体であることを見出し
た。ただし、本明細書中、全てのアミノ酸配列の３文字
表示は当分野における標準表示に従っており、それらを
以下に列挙する。すなわち、Ａｌａはアラニン、Ａｒｇ
はアルギニン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｇｌｎはグル
タミン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｉ
ｌｅはイソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリシ
ン、Ｐｒｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレ
オニン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバリン、Ｘｘｘは
不明なアミノ酸の残基をそれぞれ表す。
は、抗体重鎖としてアミノ末端がブロックされており、
かつ抗体軽鎖として配列番号１記載のアミノ酸配列を含
有するヒト型モノクローナル抗体であることを見出し
た。ただし、本明細書中、全てのアミノ酸配列の３文字
表示は当分野における標準表示に従っており、それらを
以下に列挙する。すなわち、Ａｌａはアラニン、Ａｒｇ
はアルギニン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｇｌｎはグル
タミン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｉ
ｌｅはイソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリシ
ン、Ｐｒｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレ
オニン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバリン、Ｘｘｘは
不明なアミノ酸の残基をそれぞれ表す。
【００１３】本発明は、上記の知見に基づいて完成され
たもので、工業技術院生命工学工業研究所に受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４１２２号で寄託された細胞の特性を有
するハイブリドーマ２９Ｄ３８、工業技術院生命工学工
業研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１４１２２号で寄託さ
れた細胞の特性を有するハイブリドーマ２９Ｄ３８が産
生するヒト型モノクローナル抗体、当該ヒト型モノクロ
ーナル抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を
主成分とする癌検査薬、および当該ヒト型モノクローナ
ル抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を成分
とする癌治療薬である。
たもので、工業技術院生命工学工業研究所に受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４１２２号で寄託された細胞の特性を有
するハイブリドーマ２９Ｄ３８、工業技術院生命工学工
業研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１４１２２号で寄託さ
れた細胞の特性を有するハイブリドーマ２９Ｄ３８が産
生するヒト型モノクローナル抗体、当該ヒト型モノクロ
ーナル抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を
主成分とする癌検査薬、および当該ヒト型モノクローナ
ル抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を成分
とする癌治療薬である。
【００１４】特に好適には、以下の特性を有する抗原： （１）該抗原は上記ハイブリドーマ２９Ｄ３８が産生す
るヒト型モノクローナル抗体によって結合され得： （２）該抗原が肺腺癌細胞株Ａ５４９株の細胞抽出物中
に含まれ、かつＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動上
で主要なバンドとして、分子量が非還元下で１００万以
上、還元下で２００００〜１２００００の間の複数の位
置に存在し： （３）該抗原が肺腺癌細胞株Ａ５４９株の核膜上に存在
し： （４）該抗原が肺癌患者癌組織中に存在する： を認識してなるＩｇＭヒト型モノクローナル抗体産生能
を有するハイブリドーマ２９Ｄ３８である。
るヒト型モノクローナル抗体によって結合され得： （２）該抗原が肺腺癌細胞株Ａ５４９株の細胞抽出物中
に含まれ、かつＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動上
で主要なバンドとして、分子量が非還元下で１００万以
上、還元下で２００００〜１２００００の間の複数の位
置に存在し： （３）該抗原が肺腺癌細胞株Ａ５４９株の核膜上に存在
し： （４）該抗原が肺癌患者癌組織中に存在する： を認識してなるＩｇＭヒト型モノクローナル抗体産生能
を有するハイブリドーマ２９Ｄ３８である。
【００１５】以下に、本発明について詳しく説明する
が、特に限定されるものではない。本発明は、肺癌と反
応する新規なヒト型モノクローナル抗体を作製すること
にあり、たとえば、次のようにして得ることができる。
すなわち、肺癌患者所属リンパ節をハサミで細切し、ガ
ーゼで不溶部分を除去し、低速遠心することにより、患
者の体内で癌細胞に感作された抗体産生細胞（Ｂ細胞）
を含むリンパ球を集める。これらの回収されたリンパ球
を細胞活性化因子、たとえばリポ多糖、レクチンあるい
は黄色ブドウ球菌死菌とサイトカインを含む培養液中
で、５％炭酸ガス存在下、３７℃で約３日〜約８日間培
養を継続する。
が、特に限定されるものではない。本発明は、肺癌と反
応する新規なヒト型モノクローナル抗体を作製すること
にあり、たとえば、次のようにして得ることができる。
すなわち、肺癌患者所属リンパ節をハサミで細切し、ガ
ーゼで不溶部分を除去し、低速遠心することにより、患
者の体内で癌細胞に感作された抗体産生細胞（Ｂ細胞）
を含むリンパ球を集める。これらの回収されたリンパ球
を細胞活性化因子、たとえばリポ多糖、レクチンあるい
は黄色ブドウ球菌死菌とサイトカインを含む培養液中
で、５％炭酸ガス存在下、３７℃で約３日〜約８日間培
養を継続する。
【００１６】その後、活性化されたリンパ球と融合親
株、たとえばＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ・Ｃ
ＲＬ・１５８０）やＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ・
ＣＲＬ・１５８１）などのマウスミエローマ細胞親株あ
るいはＳＨＭ−Ｄ３３（ＡＴＣＣ・ＣＲＬ・１６６８）
やＳＨＭ−Ｄ３６などのヒトーマウスヘテロミエローマ
細胞親株との細胞融合、たとえば電気的細胞融合法、ポ
リエチレングリコール法あるいはセイダイウィルス法に
より、融合細胞すなわちハイブリドーマを作製する。即
ち、該リンパ球とミエローマ細胞との細胞融合を行う。
株、たとえばＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ・Ｃ
ＲＬ・１５８０）やＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ・
ＣＲＬ・１５８１）などのマウスミエローマ細胞親株あ
るいはＳＨＭ−Ｄ３３（ＡＴＣＣ・ＣＲＬ・１６６８）
やＳＨＭ−Ｄ３６などのヒトーマウスヘテロミエローマ
細胞親株との細胞融合、たとえば電気的細胞融合法、ポ
リエチレングリコール法あるいはセイダイウィルス法に
より、融合細胞すなわちハイブリドーマを作製する。即
ち、該リンパ球とミエローマ細胞との細胞融合を行う。
【００１７】例えば、該リンパ球とミエローマ細胞を、
１０：１〜１：１０、好ましくは、２：１〜１：１の比
率で混合し、等張液のソルビトール溶液（２８０ｍＭソ
ルビトール、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢
酸マグネシウム、０．１％牛血清アルブミン）で１回洗
浄した後、低張ソルビトール溶液（７０ｍＭソルビトー
ル、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢酸マグネ
シウム、０．１％牛血清アルブミン）に混合した細胞を
再浮遊させ、５分後に、１．０ＫＶ／ｃｍ、１５マイク
ロ秒の電気パルスを印加することにより、電気的細胞融
合（Ｆｏｕｎｇ，Ｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、１３４、３５−４２、１９９０；Ｚｉｍｍｅｒ
ｍａｎｎ，Ｕ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ、１３４、４３−５０、１９９０）を行えばよい。
１０：１〜１：１０、好ましくは、２：１〜１：１の比
率で混合し、等張液のソルビトール溶液（２８０ｍＭソ
ルビトール、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢
酸マグネシウム、０．１％牛血清アルブミン）で１回洗
浄した後、低張ソルビトール溶液（７０ｍＭソルビトー
ル、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢酸マグネ
シウム、０．１％牛血清アルブミン）に混合した細胞を
再浮遊させ、５分後に、１．０ＫＶ／ｃｍ、１５マイク
ロ秒の電気パルスを印加することにより、電気的細胞融
合（Ｆｏｕｎｇ，Ｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、１３４、３５−４２、１９９０；Ｚｉｍｍｅｒ
ｍａｎｎ，Ｕ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ、１３４、４３−５０、１９９０）を行えばよい。
【００１８】電気パルス印加後、５分後に、低速遠心に
より低張ソルビトール液を除去し、ヒポキサンチン−ア
ミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）選択培地に１０5 ｃ
ｅｌｌ〜１０×１０5 ｃｅｌｌ／ｍｌになるように再浮
遊させ、９６穴プレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ分注
する。当該９６穴プレートを３７℃、ＣＯ2 インキュベ
ーターで、適宜培養状態を観察して２〜６週間培養を継
続し（例えば、富山朔二・安東民衛編；単クローン抗体
実験マニュアル、講談社サイエンティフィック、１９８
７年）、この培養の間に、光学顕微鏡的あるいは肉眼的
に細胞の集落（コロニー）が観察できたウェルに関し
て、それらの培養上清液を採取し、培養上清液中のヒト
型抗体の活性の検定および癌細胞株、たとえば肺癌腺癌
株Ａ５４９（ＡＴＣＣ・ＣＣＬ・１８５）との反応性の
検定を、たとえば酵素免疫測定法により行い、さらに肺
癌細胞株を用いた蛍光抗体法および肺癌組織を用いた免
疫組織化学法により、陽性ウェルの選別をする。
より低張ソルビトール液を除去し、ヒポキサンチン−ア
ミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）選択培地に１０5 ｃ
ｅｌｌ〜１０×１０5 ｃｅｌｌ／ｍｌになるように再浮
遊させ、９６穴プレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ分注
する。当該９６穴プレートを３７℃、ＣＯ2 インキュベ
ーターで、適宜培養状態を観察して２〜６週間培養を継
続し（例えば、富山朔二・安東民衛編；単クローン抗体
実験マニュアル、講談社サイエンティフィック、１９８
７年）、この培養の間に、光学顕微鏡的あるいは肉眼的
に細胞の集落（コロニー）が観察できたウェルに関し
て、それらの培養上清液を採取し、培養上清液中のヒト
型抗体の活性の検定および癌細胞株、たとえば肺癌腺癌
株Ａ５４９（ＡＴＣＣ・ＣＣＬ・１８５）との反応性の
検定を、たとえば酵素免疫測定法により行い、さらに肺
癌細胞株を用いた蛍光抗体法および肺癌組織を用いた免
疫組織化学法により、陽性ウェルの選別をする。
【００１９】具体的には、増殖したウェルから再度培養
上清液を採取し、肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞との反応性
の検討を行う（Ｄｏｒｒｅｎの方法、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ、４５、４９１−４９７、１９８２）。すなわ
ち、１０％牛胎児血清添加ＲＤＦ培地（ＲＰＭＩ１６４
０培地：ダルベッコＭＥＭ培地：ハムＦ１２培地を２：
１：１の割合で混合した培地；Ｋ．Ａｉｈａｒａ他、Ｉ
ｎ・Ｖｉｔｒｏ・Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔａｌ・Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４，９５９−９６２，
１９８８）中で、９６穴の細胞培養用マイクロプレート
でサブコンフルエント状態に増殖した肺腺癌細胞株Ａ５
４９細胞をリン酸緩衝液生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ・ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ緩衝液）
で一回洗浄後、０．０５％グルタルアルデヒド添加ＰＢ
Ｓ緩衝液を１００μｌずつ分注し、室温、１５分間静置
する。
上清液を採取し、肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞との反応性
の検討を行う（Ｄｏｒｒｅｎの方法、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ、４５、４９１−４９７、１９８２）。すなわ
ち、１０％牛胎児血清添加ＲＤＦ培地（ＲＰＭＩ１６４
０培地：ダルベッコＭＥＭ培地：ハムＦ１２培地を２：
１：１の割合で混合した培地；Ｋ．Ａｉｈａｒａ他、Ｉ
ｎ・Ｖｉｔｒｏ・Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔａｌ・Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４，９５９−９６２，
１９８８）中で、９６穴の細胞培養用マイクロプレート
でサブコンフルエント状態に増殖した肺腺癌細胞株Ａ５
４９細胞をリン酸緩衝液生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ・ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ緩衝液）
で一回洗浄後、０．０５％グルタルアルデヒド添加ＰＢ
Ｓ緩衝液を１００μｌずつ分注し、室温、１５分間静置
する。
【００２０】１５分後、０．０５％ツイーン２０（Ｔｗ
ｅｅｎ２０）添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、３％牛血
清アルブミン添加ＰＢＳ緩衝液を２００μｌずつ加え
て、室温、一時間ブロッキングする。ブロッキング後、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄
し、培養上清液を５０μｌずつ分注する。室温、３時間
反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩
衝液で３回洗浄し、０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢ
Ｓ緩衝液で１０００倍に希釈したアルカリフォスファタ
ーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン
（タゴ社）を１００μｌずつ分注し、室温、一時間反応
させる。
ｅｅｎ２０）添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、３％牛血
清アルブミン添加ＰＢＳ緩衝液を２００μｌずつ加え
て、室温、一時間ブロッキングする。ブロッキング後、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄
し、培養上清液を５０μｌずつ分注する。室温、３時間
反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩
衝液で３回洗浄し、０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢ
Ｓ緩衝液で１０００倍に希釈したアルカリフォスファタ
ーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン
（タゴ社）を１００μｌずつ分注し、室温、一時間反応
させる。
【００２１】反応後、三回洗浄し、アルカリフォスファ
ターゼ発色基質液（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフ
ォスフェート、１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩
化マグネシウム、ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分注
し、室温、１０分間発色させた。発色後、１Ｎ水酸化ナ
トリウム液を１００μｌずつ添加して、反応を停止さ
せ、マイクロプレートリーダーにて、４０５ｎｍの吸光
度を測定し、肺癌細胞株Ａ５４９細胞との反応性を調べ
る。
ターゼ発色基質液（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフ
ォスフェート、１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩
化マグネシウム、ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分注
し、室温、１０分間発色させた。発色後、１Ｎ水酸化ナ
トリウム液を１００μｌずつ添加して、反応を停止さ
せ、マイクロプレートリーダーにて、４０５ｎｍの吸光
度を測定し、肺癌細胞株Ａ５４９細胞との反応性を調べ
る。
【００２２】また、肺癌組織を用いて、免疫組織化学的
検定をあわせて行う。すなわち、フォルマリン固定法、
アメックス（ＡＭｅＸ）包埋法（Ｓａｔｏ、Ｙ他、Ａ
ｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１２５、４３１−４３５、１
９８６；Ｓａｔｏ、Ｙ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、
１４０、７７５−７７９、１９９２）および新鮮凍結切
片法の３種の方法で作製した肺癌組織切片を用いた免疫
組織化学法でヒト型抗体の肺癌特異性の検討を行う。
検定をあわせて行う。すなわち、フォルマリン固定法、
アメックス（ＡＭｅＸ）包埋法（Ｓａｔｏ、Ｙ他、Ａ
ｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１２５、４３１−４３５、１
９８６；Ｓａｔｏ、Ｙ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、
１４０、７７５−７７９、１９９２）および新鮮凍結切
片法の３種の方法で作製した肺癌組織切片を用いた免疫
組織化学法でヒト型抗体の肺癌特異性の検討を行う。
【００２３】脱パラフィンは、フォルマリン固定組織切
片の場合はキシレン、エタノール系列で、ＡＭｅＸ包埋
法組織切片の場合はキシレン、アセトン系列で行った。
新鮮凍結組織切片および脱パラフィンしたＡＭｅＸ組織
切片は、ＰＢＳ緩衝液で一回洗浄後、４％パラフォルム
アルデヒド（０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で室
温２０分間固定をする。脱パラフィンしたフォルマリン
固定スライドおよびパラフォルムアルデヒド固定した新
鮮凍結切片スライドあるいはＡＭｅＸ組織切片スライド
はＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、１０％ヤギ正常血清で室
温１５分間ブロッキング操作を行い、間接法変法（曽山
信彦他、日消誌、８７、２６３５−２６４１；Ｓｏｙａ
ｍａ、Ｎ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｊｐｎ．、
２４、５８１、１９８９）により行う。
片の場合はキシレン、エタノール系列で、ＡＭｅＸ包埋
法組織切片の場合はキシレン、アセトン系列で行った。
新鮮凍結組織切片および脱パラフィンしたＡＭｅＸ組織
切片は、ＰＢＳ緩衝液で一回洗浄後、４％パラフォルム
アルデヒド（０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で室
温２０分間固定をする。脱パラフィンしたフォルマリン
固定スライドおよびパラフォルムアルデヒド固定した新
鮮凍結切片スライドあるいはＡＭｅＸ組織切片スライド
はＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、１０％ヤギ正常血清で室
温１５分間ブロッキング操作を行い、間接法変法（曽山
信彦他、日消誌、８７、２６３５−２６４１；Ｓｏｙａ
ｍａ、Ｎ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｊｐｎ．、
２４、５８１、１９８９）により行う。
【００２４】すなわち、予めヒト型抗体を含む培養上清
液サンプルと４００分の１量のパーオキシダーゼ標識ヤ
ギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン（カペル
社）を室温３時間反応させた後、フリーのパーオキシダ
ーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン
をブロッキングするため、７５分の１量のヒト正常血清
（カペル社）を加え、室温一時間さらに反応させる。こ
のヒト型抗体とパーオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）
2 抗ヒトイミュノグロブリンの結合体を含む反応液０．
２ｍｌを、脱パラフィンしたスライドあるいはパラフォ
ルムアルデヒド固定した新鮮凍結切片スライドにのせ、
４℃、１８時間静置し、ＰＢＳ緩衝液３回洗浄後、発色
基質液（０．０２％ジアミノベンジジン、０．００５％
過酸化水素水、５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．６）で
５分間発色させる。
液サンプルと４００分の１量のパーオキシダーゼ標識ヤ
ギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン（カペル
社）を室温３時間反応させた後、フリーのパーオキシダ
ーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン
をブロッキングするため、７５分の１量のヒト正常血清
（カペル社）を加え、室温一時間さらに反応させる。こ
のヒト型抗体とパーオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）
2 抗ヒトイミュノグロブリンの結合体を含む反応液０．
２ｍｌを、脱パラフィンしたスライドあるいはパラフォ
ルムアルデヒド固定した新鮮凍結切片スライドにのせ、
４℃、１８時間静置し、ＰＢＳ緩衝液３回洗浄後、発色
基質液（０．０２％ジアミノベンジジン、０．００５％
過酸化水素水、５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．６）で
５分間発色させる。
【００２５】発色後、水で洗浄し、３倍希釈のハリスヘ
マトキシレンで対染色を行い、さらに水で十分に洗浄を
行う。その後、脱水反応を７０％エタノール、８０％エ
タノール、９０％エタノール、１００％エタノール（２
回）、１００％キシレン（２回）の順序で行い、キシレ
ン系標本封入剤マウントクイック（大道産業株式会社）
で封入する。封入した組織切片スライドを光学顕微鏡的
な観察により、正常部位とは反応せず、肺癌組織と特異
的に反応するヒト型抗体の選別をする。
マトキシレンで対染色を行い、さらに水で十分に洗浄を
行う。その後、脱水反応を７０％エタノール、８０％エ
タノール、９０％エタノール、１００％エタノール（２
回）、１００％キシレン（２回）の順序で行い、キシレ
ン系標本封入剤マウントクイック（大道産業株式会社）
で封入する。封入した組織切片スライドを光学顕微鏡的
な観察により、正常部位とは反応せず、肺癌組織と特異
的に反応するヒト型抗体の選別をする。
【００２６】また、蛍光抗体法による選別は下記の如く
行えばよい。即ち、細胞培養用フラスコ（Ｆ７５）を用
いて、１０％牛胎児血清添加ダルベッコＭＥＭ培地中
で、サブコンフルエント状態まで増殖させた肺腺癌細胞
株Ａ５４９細胞を０．０２％エチレンジアミン４酢酸２
ナトリウム（ＥＤＴＡ）添加ＰＢＳ緩衝液で処理して、
付着細胞を遊離させて、１２００ＲＰＭ、１０分間の遠
心にて細胞を回収する。
行えばよい。即ち、細胞培養用フラスコ（Ｆ７５）を用
いて、１０％牛胎児血清添加ダルベッコＭＥＭ培地中
で、サブコンフルエント状態まで増殖させた肺腺癌細胞
株Ａ５４９細胞を０．０２％エチレンジアミン４酢酸２
ナトリウム（ＥＤＴＡ）添加ＰＢＳ緩衝液で処理して、
付着細胞を遊離させて、１２００ＲＰＭ、１０分間の遠
心にて細胞を回収する。
【００２７】回収したＡ５４９細胞２×１０5 個に対し
てハイブリドーマ培養上清液１５０μｌを４℃、２時間
反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心して、細
胞を沈澱させる。細胞を、ＰＢＳ緩衝液で２０倍に希釈
したＦＩＴＣ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒト免疫グロブ
リン抗体（カペル社）１００μｌに再懸濁し、４℃、１
時間反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心し
て、細胞を沈澱させる。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄
後、５０μｌのＰＢＳ緩衝液に懸濁し、蛍光顕微鏡的な
観察を行えばよい。
てハイブリドーマ培養上清液１５０μｌを４℃、２時間
反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心して、細
胞を沈澱させる。細胞を、ＰＢＳ緩衝液で２０倍に希釈
したＦＩＴＣ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒト免疫グロブ
リン抗体（カペル社）１００μｌに再懸濁し、４℃、１
時間反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心し
て、細胞を沈澱させる。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄
後、５０μｌのＰＢＳ緩衝液に懸濁し、蛍光顕微鏡的な
観察を行えばよい。
【００２８】このようにして肺癌と反応するヒト型モノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを容易に得る
ことができ、該ハイブリドーマは限界希釈法によるクロ
ーニングを２ないし３回繰り返すことにより、ヒト型モ
ノクローナル抗体を安定的に生産するハイブリドーマの
株として樹立できる。この際、ヒト型モノクローナル抗
体産生ハイブリドーマを選択するに当たって、用いる培
地としてはハイブリドーマが生育し、増殖し得る培地で
あれば特に限定されるものではなく、例えばＲＰＭＩ１
６４０培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ハムＦ１２培地、
イスコフ培地、ＧＩＴ培地（日本製薬）やＲＤＦ培地
（ＲＰＭＩ１６４０培地：ダルベッコＭＥＭ培地：ハム
Ｆ１２培地を２：１：１の割合で混合した培地；Ｋ．Ａ
ｉｈａｒａ他、Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏ・Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ・Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４，
９５９−９６２，１９８８）などに牛胎児血清を１〜２
０％添加した培地あるいは無血清培地、例えばＨＹＢＲ
ＩＤＯＭＡ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）、ノンセラム培
地（国際試薬）やＳＦＭ１０１培地（日水製薬）などが
挙げられる。
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを容易に得る
ことができ、該ハイブリドーマは限界希釈法によるクロ
ーニングを２ないし３回繰り返すことにより、ヒト型モ
ノクローナル抗体を安定的に生産するハイブリドーマの
株として樹立できる。この際、ヒト型モノクローナル抗
体産生ハイブリドーマを選択するに当たって、用いる培
地としてはハイブリドーマが生育し、増殖し得る培地で
あれば特に限定されるものではなく、例えばＲＰＭＩ１
６４０培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ハムＦ１２培地、
イスコフ培地、ＧＩＴ培地（日本製薬）やＲＤＦ培地
（ＲＰＭＩ１６４０培地：ダルベッコＭＥＭ培地：ハム
Ｆ１２培地を２：１：１の割合で混合した培地；Ｋ．Ａ
ｉｈａｒａ他、Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏ・Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ・Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４，
９５９−９６２，１９８８）などに牛胎児血清を１〜２
０％添加した培地あるいは無血清培地、例えばＨＹＢＲ
ＩＤＯＭＡ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）、ノンセラム培
地（国際試薬）やＳＦＭ１０１培地（日水製薬）などが
挙げられる。
【００２９】最終的には、工業的な抗体生産法に結び付
けるため、これらのハイブリドーマを無血清培地、例え
ば上記ハイブリドーマ−ＳＦＭ（商標名：ＨＹＢＲＩＤ
ＯＭＡ−ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ社）培地、ノンセラム培地
（国際試薬）やＳＦＭ１０１培地（日水製薬）などの無
血清培地に順化し、無血清培養が可能なハイブリドーマ
株とする。以上のような方法により、肺癌と反応するヒ
ト型モノクローナル抗体を取得することができる。
けるため、これらのハイブリドーマを無血清培地、例え
ば上記ハイブリドーマ−ＳＦＭ（商標名：ＨＹＢＲＩＤ
ＯＭＡ−ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ社）培地、ノンセラム培地
（国際試薬）やＳＦＭ１０１培地（日水製薬）などの無
血清培地に順化し、無血清培養が可能なハイブリドーマ
株とする。以上のような方法により、肺癌と反応するヒ
ト型モノクローナル抗体を取得することができる。
【００３０】上記の種々の選別法により選別したヒト型
モノクローナル抗体の中から、肺癌とより良く反応する
ヒト型モノクローナルを選び出し、該ヒト型モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを２９Ｄ３８（工業
技術院生命工学工業研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
４１２２号として寄託した）と命名した。該ハイブリド
ーマが産生するヒト型モノクローナル抗体の調製は以下
の手順に従って行えば良い。
モノクローナル抗体の中から、肺癌とより良く反応する
ヒト型モノクローナルを選び出し、該ヒト型モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを２９Ｄ３８（工業
技術院生命工学工業研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
４１２２号として寄託した）と命名した。該ハイブリド
ーマが産生するヒト型モノクローナル抗体の調製は以下
の手順に従って行えば良い。
【００３１】即ち、ヒト型モノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマを移植し上記した如くの常法の培地を用いて
培養するもので、例えば３７℃、５％ＣＯ2 インキュベ
ーターにいれて、１週間〜６週間培養する。次いで培養
物を回収し、適宜の吸着カラム、例えばハイドロキシア
パタイトカラムを用いて吸着、溶出して単離、回収し、
適宜、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトにて精製す
れば良い。
ブリドーマを移植し上記した如くの常法の培地を用いて
培養するもので、例えば３７℃、５％ＣＯ2 インキュベ
ーターにいれて、１週間〜６週間培養する。次いで培養
物を回収し、適宜の吸着カラム、例えばハイドロキシア
パタイトカラムを用いて吸着、溶出して単離、回収し、
適宜、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトにて精製す
れば良い。
【００３２】例えば、培養上清液をハイドロキシアパタ
イトカラム（ＰＥＮＴＡＸ−ＳＨ−２０１０Ｃ−直径２
１．５ｍｍ×１００ｍｍ、旭光学工業株式会社）に直接
負荷し、ヒト型モノクローナル抗体をカラムに吸着さ
せ、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で十分に洗浄
した後、４０ｍＭ〜４００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
６．８）の直線的濃度勾配溶出法により、抗体部分を約
３００ｍＭ付近で溶出させればよく、適宜安定化剤、例
えばグリセリンや糖類を添加して凍結乾燥品としてもよ
い。
イトカラム（ＰＥＮＴＡＸ−ＳＨ−２０１０Ｃ−直径２
１．５ｍｍ×１００ｍｍ、旭光学工業株式会社）に直接
負荷し、ヒト型モノクローナル抗体をカラムに吸着さ
せ、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で十分に洗浄
した後、４０ｍＭ〜４００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
６．８）の直線的濃度勾配溶出法により、抗体部分を約
３００ｍＭ付近で溶出させればよく、適宜安定化剤、例
えばグリセリンや糖類を添加して凍結乾燥品としてもよ
い。
【００３３】本発明によるヒト型モノクローナル抗体を
用いた癌検査薬としては、ＲＩＡ、ＥＩＡなどの免疫化
学的癌検査薬、病理組織標本を使用する病理診断薬など
の体外診断薬とともに、ＲＩ（放射性同位元素）や常磁
性物質などを結合標識させ患者の体内に投与し、例えば
γ−カメラあるいはＭＲＩ（核磁気共鳴イメージング）
装置などにて腫瘍部を描出する体内診断薬が含まれる。
用いた癌検査薬としては、ＲＩＡ、ＥＩＡなどの免疫化
学的癌検査薬、病理組織標本を使用する病理診断薬など
の体外診断薬とともに、ＲＩ（放射性同位元素）や常磁
性物質などを結合標識させ患者の体内に投与し、例えば
γ−カメラあるいはＭＲＩ（核磁気共鳴イメージング）
装置などにて腫瘍部を描出する体内診断薬が含まれる。
【００３４】ヒト型モノクローナル抗体は、例えばペプ
シン処理などにより抗体断片としたものでも良く、例え
ば以下の如く行えば容易に得ることができる。即ち、精
製したヒト型モノクローナル抗体液を０．１５Ｍ塩化ナ
トリウム添加０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４．０）に対して４℃、１６時間透析し、最終的に５０
μｇ／ｍｌ（５ｍｌ）の濃度に調製する。当該緩衝液に
溶解したペプシン（シグマ社）を重量比で抗体に対して
２５分の１の量比で添加し、３２℃、６０分間反応さ
せ、６０分後、酵素反応は０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．２）を体積比で反応液に対して５分の１量を
添加して停止させる。
シン処理などにより抗体断片としたものでも良く、例え
ば以下の如く行えば容易に得ることができる。即ち、精
製したヒト型モノクローナル抗体液を０．１５Ｍ塩化ナ
トリウム添加０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４．０）に対して４℃、１６時間透析し、最終的に５０
μｇ／ｍｌ（５ｍｌ）の濃度に調製する。当該緩衝液に
溶解したペプシン（シグマ社）を重量比で抗体に対して
２５分の１の量比で添加し、３２℃、６０分間反応さ
せ、６０分後、酵素反応は０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．２）を体積比で反応液に対して５分の１量を
添加して停止させる。
【００３５】ペプシン消化検体を５００μｌづつ、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ−ＫＷ２００３−ＧＦＣカラム（昭和電工、
直径２０ｍｍｘ３００ｍｍ）に負荷して、高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）にてゲル濾過分離を行う。
カラムの平衡緩衝液及び溶出緩衝液は例えば０．１５Ｍ
塩化ナトリウム添加０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．２）を用いて、２．５ｍｌ／ｍｉｎの条件で行い、
２８０ｎｍの吸光度にて蛋白の検出をする。
ｏｔｅｉｎ−ＫＷ２００３−ＧＦＣカラム（昭和電工、
直径２０ｍｍｘ３００ｍｍ）に負荷して、高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）にてゲル濾過分離を行う。
カラムの平衡緩衝液及び溶出緩衝液は例えば０．１５Ｍ
塩化ナトリウム添加０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．２）を用いて、２．５ｍｌ／ｍｉｎの条件で行い、
２８０ｎｍの吸光度にて蛋白の検出をする。
【００３６】ゲル濾過的分子量が約１３万付近のピーク
部分を集め、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動的に
非還元条件下で約１３．４万であることを確認し、ま
た、還元条件下では、約２．５万及び約４．２万の分子
量の２つのバンドを確認する。このゲル濾過的な分子量
で約１３万のピーク部分をプールして、精製Ｆ（ａ
ｂ’）2 として用いれば良い。
部分を集め、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動的に
非還元条件下で約１３．４万であることを確認し、ま
た、還元条件下では、約２．５万及び約４．２万の分子
量の２つのバンドを確認する。このゲル濾過的な分子量
で約１３万のピーク部分をプールして、精製Ｆ（ａ
ｂ’）2 として用いれば良い。
【００３７】例えば、癌検査薬、例えば病理組織標本を
使用する病理診断薬としては以下の如く行えば良い。す
なわち、肺癌組織を外科的に切除した後、フォルマリン
固定法、ＡＭｅＸ包埋法、新鮮凍結切片法などの方法で
肺癌組織切片プレパラート（約３μｍ〜約１０μｍ切
片）を作製する（例えば、細胞組織化学・１９９０、１
９９０年、日本組織細胞化学会編、学際企画；細胞組織
化学・１９９１、１９９１年、日本組織細胞化学会編、
学際企画）。脱パラフィンは、フォルマリン固定組織切
片の場合はキシレン、エタノール系列で、ＡＭｅＸ包埋
法組織切片の場合はキシレン、アセトン系列で行う。新
鮮凍結組織切片および脱パラフィンしたＡＭｅＸ組織切
片は、ＰＢＳ緩衝液で一回洗浄後、４％パラフォルムア
ルデヒド（０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で室温
２０分間固定をする。
使用する病理診断薬としては以下の如く行えば良い。す
なわち、肺癌組織を外科的に切除した後、フォルマリン
固定法、ＡＭｅＸ包埋法、新鮮凍結切片法などの方法で
肺癌組織切片プレパラート（約３μｍ〜約１０μｍ切
片）を作製する（例えば、細胞組織化学・１９９０、１
９９０年、日本組織細胞化学会編、学際企画；細胞組織
化学・１９９１、１９９１年、日本組織細胞化学会編、
学際企画）。脱パラフィンは、フォルマリン固定組織切
片の場合はキシレン、エタノール系列で、ＡＭｅＸ包埋
法組織切片の場合はキシレン、アセトン系列で行う。新
鮮凍結組織切片および脱パラフィンしたＡＭｅＸ組織切
片は、ＰＢＳ緩衝液で一回洗浄後、４％パラフォルムア
ルデヒド（０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で室温
２０分間固定をする。
【００３８】脱パラフィンしたフォルマリン固定スライ
ドおよびパラフォルムアルデヒド固定した新鮮凍結切片
スライドあるいはＡＭｅＸ組織切片スライドはＰＢＳ緩
衝液で３回洗浄後、１０％ヤギ正常血清で室温１５分間
ブロッキング操作を行い、例えば間接法変法（曽山信彦
他、日消誌、８７、２６３５−２６４１；Ｓｏｙａｍ
ａ，Ｎ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｊｐｎ．、２
４、５８１、１９８９）により行う。
ドおよびパラフォルムアルデヒド固定した新鮮凍結切片
スライドあるいはＡＭｅＸ組織切片スライドはＰＢＳ緩
衝液で３回洗浄後、１０％ヤギ正常血清で室温１５分間
ブロッキング操作を行い、例えば間接法変法（曽山信彦
他、日消誌、８７、２６３５−２６４１；Ｓｏｙａｍ
ａ，Ｎ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｊｐｎ．、２
４、５８１、１９８９）により行う。
【００３９】すなわち、予めヒト型モノクローナル抗体
あるいは当該ヒト型モノクローナル断片を含有するヒト
型抗体液（０．１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ）と４０
０分の１量のパーオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2
抗ヒトイミュノグロブリン（カペル社）を室温３時間反
応させた後、フリーのパーオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａ
ｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリンをブロッキングする
ため、７５分の１量のヒト正常血清（カペル社）を加
え、室温１時間さらに反応させる。このヒト型抗体とパ
ーオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノ
グロブリンの結合体を含む反応液０．２ｍｌを、脱パラ
フィンしたスライドあるいはパラフォルムアルデヒド固
定した新鮮凍結切片スライドにのせ、４℃、１８時間静
置し、ＰＢＳ緩衝液３回洗浄後、発色基質液（０．０２
％ジアミノベンジジン、０．００５％過酸化水素水、５
０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．６）で５分間発色させ
る。
あるいは当該ヒト型モノクローナル断片を含有するヒト
型抗体液（０．１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ）と４０
０分の１量のパーオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2
抗ヒトイミュノグロブリン（カペル社）を室温３時間反
応させた後、フリーのパーオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａ
ｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリンをブロッキングする
ため、７５分の１量のヒト正常血清（カペル社）を加
え、室温１時間さらに反応させる。このヒト型抗体とパ
ーオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノ
グロブリンの結合体を含む反応液０．２ｍｌを、脱パラ
フィンしたスライドあるいはパラフォルムアルデヒド固
定した新鮮凍結切片スライドにのせ、４℃、１８時間静
置し、ＰＢＳ緩衝液３回洗浄後、発色基質液（０．０２
％ジアミノベンジジン、０．００５％過酸化水素水、５
０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．６）で５分間発色させ
る。
【００４０】発色後、水で洗浄し、３倍希釈のハリスヘ
マトキシレンで対染色を行い、さらに水で十分に洗浄を
行う。その後、脱水反応を７０％エタノール、８０％エ
タノール、９０％エタノール、１００％エタノール（２
回）、１００％キシレン（２回）の順序で行い、キシレ
ン系標本封入剤マウントクイック（大道産業株式会社）
で封入する。封入した組織切片スライドを光学顕微鏡的
な観察により、肺癌組織部位あるいは正常部位との反応
性の検定を行う。以上のような方法にて、病理組織標本
を用いた病理診断としての癌診断が容易にできる。
マトキシレンで対染色を行い、さらに水で十分に洗浄を
行う。その後、脱水反応を７０％エタノール、８０％エ
タノール、９０％エタノール、１００％エタノール（２
回）、１００％キシレン（２回）の順序で行い、キシレ
ン系標本封入剤マウントクイック（大道産業株式会社）
で封入する。封入した組織切片スライドを光学顕微鏡的
な観察により、肺癌組織部位あるいは正常部位との反応
性の検定を行う。以上のような方法にて、病理組織標本
を用いた病理診断としての癌診断が容易にできる。
【００４１】また、例えばＲＩ標識ヒト型抗体を用いた
体内検査薬としては以下の如く行えば良い。ＲＩとして
は、例えばＩｎ−１１１、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉ−１３１や
Ｉ−１２３等が挙げられる。ＲＩによる抗体標識法とし
てはジエチレントリアミンペンタ酢酸（ｄｉｅｔｈｙｌ
ｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ・ａｃ
ｉｄ；ＤＴＰＡ）等のキレート化合物を用いるキレート
法やシュヴァルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）法（Ｊ．Ｎｕｃ
ｌ．Ｍｅｄ．、３１，６９２−６９７，１９９０）など
があるが特に限定されるものではなく、当業者にとり容
易で有れば何等問題はない。投与するＲＩ標識ヒト型モ
ノクローナル抗体の量は、患者の年齢、症状、体重等に
よって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、標識抗体
約０．１ｍｇ〜約４０ｍｇ、好ましくは非標識抗体０ｍ
ｇ〜１００ｍｇとともに、例えば静注投与すれば良い。
投与後、約１日〜約１０日目にγ−カメラにて、撮像
し、癌部を描出すれば良い。
体内検査薬としては以下の如く行えば良い。ＲＩとして
は、例えばＩｎ−１１１、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉ−１３１や
Ｉ−１２３等が挙げられる。ＲＩによる抗体標識法とし
てはジエチレントリアミンペンタ酢酸（ｄｉｅｔｈｙｌ
ｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ・ａｃ
ｉｄ；ＤＴＰＡ）等のキレート化合物を用いるキレート
法やシュヴァルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）法（Ｊ．Ｎｕｃ
ｌ．Ｍｅｄ．、３１，６９２−６９７，１９９０）など
があるが特に限定されるものではなく、当業者にとり容
易で有れば何等問題はない。投与するＲＩ標識ヒト型モ
ノクローナル抗体の量は、患者の年齢、症状、体重等に
よって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、標識抗体
約０．１ｍｇ〜約４０ｍｇ、好ましくは非標識抗体０ｍ
ｇ〜１００ｍｇとともに、例えば静注投与すれば良い。
投与後、約１日〜約１０日目にγ−カメラにて、撮像
し、癌部を描出すれば良い。
【００４２】本発明によるヒト型モノクローナル抗体を
用いた癌治療薬としては、ヒト癌細胞株Ａ５４９を移植
し、腫瘍を形成せしめたＳＣＩＤマウスで腫瘍の縮退が
観察されるため、単独投与でも良い。それ以外に、ヒト
型モノクローナル抗体またはその抗体断片を用いる場
合、毒性物質、例えば、毒素蛋白質、ＲＩ、抗癌剤等を
結合させた免疫複合体とした形態でも十分に有効であ
る。毒素蛋白質としては、例えばリシン、ジフテリア毒
素、腫瘍壊死因子等が挙げられ、ＲＩとしては、例えば
Ｉ−１３１、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８６等が挙げられ、抗
癌剤としては、例えばアドリアマイシン、ビンクリスチ
ン、ドクソルーブシン等がそれぞれ挙げられる。
用いた癌治療薬としては、ヒト癌細胞株Ａ５４９を移植
し、腫瘍を形成せしめたＳＣＩＤマウスで腫瘍の縮退が
観察されるため、単独投与でも良い。それ以外に、ヒト
型モノクローナル抗体またはその抗体断片を用いる場
合、毒性物質、例えば、毒素蛋白質、ＲＩ、抗癌剤等を
結合させた免疫複合体とした形態でも十分に有効であ
る。毒素蛋白質としては、例えばリシン、ジフテリア毒
素、腫瘍壊死因子等が挙げられ、ＲＩとしては、例えば
Ｉ−１３１、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８６等が挙げられ、抗
癌剤としては、例えばアドリアマイシン、ビンクリスチ
ン、ドクソルーブシン等がそれぞれ挙げられる。
【００４３】ヒト型モノクローナル抗体単独投与による
癌の治療は以下の如くにすれば良い。本発明のヒト型モ
ノクローナル抗体は、単独でまたは１種以上の製剤上許
容される補助剤とともに抗腫瘍剤として用いることがで
きる。例えば、ヒト型モノクローナル抗体を、生理食塩
水やマンニトール等の水溶液に溶解して適当な癌治療薬
とすれば良い。または、ヒト型モノクローナル抗体を常
法により粉末注射剤としても良い。
癌の治療は以下の如くにすれば良い。本発明のヒト型モ
ノクローナル抗体は、単独でまたは１種以上の製剤上許
容される補助剤とともに抗腫瘍剤として用いることがで
きる。例えば、ヒト型モノクローナル抗体を、生理食塩
水やマンニトール等の水溶液に溶解して適当な癌治療薬
とすれば良い。または、ヒト型モノクローナル抗体を常
法により粉末注射剤としても良い。
【００４４】投与するヒト型モノクローナル抗体の量
は、患者の年齢、症状、体重等によって異なるが、ヒト
を含む哺乳動物に対し、癌治療薬としてのヒト型モノク
ローナル抗体を約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日投
与する。投与は、常法に従って、１日１回（単回投与ま
たは連日投与）または間歇的に１週間に１〜３回、２、
３週間に１回静注や腫瘍内注射などにより行う。本癌治
療薬は、肺癌などの癌の治療に効果が期待される。
は、患者の年齢、症状、体重等によって異なるが、ヒト
を含む哺乳動物に対し、癌治療薬としてのヒト型モノク
ローナル抗体を約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日投
与する。投与は、常法に従って、１日１回（単回投与ま
たは連日投与）または間歇的に１週間に１〜３回、２、
３週間に１回静注や腫瘍内注射などにより行う。本癌治
療薬は、肺癌などの癌の治療に効果が期待される。
【００４５】
【実施例】つぎに実施例にもとづいて本発明を説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。
が、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４６】
【実施例１】 肺癌組織と特異的に反応するヒト型モノクローナル抗体 （１）ヒトリンパ球の調製及び細胞融合 肺癌患者所属リンパ節を外科的手術により無菌的に摘出
し、冷ＲＰＭＩ１６４０培地中に浸し、ハサミでリンパ
節を細切し、二重のガーゼで不溶部分を除き、低速遠心
機で１２００ＲＰＭ、１０分間遠心して、リンパ球部分
を沈澱として集める。集めたリンパ球をＰＢＳ緩衝液に
再懸濁し、再度低速遠心機で１２００ＲＰＭ、１０分間
遠心して、リンパ球部分を沈澱として集め、リンパ球を
洗浄する。洗浄したリンパ球を１５％牛胎児血清添加Ｒ
ＤＦ培地（ＲＰＭＩ１６４０培地：ダルベッコＭＥＭ培
地：ＨａｍＦ１２培地＝２：１：１の割合で混合した培
地）に再懸濁し、細胞密度を約３〜５×１０6 細胞／ｍ
ｌとして、リポ多糖（大腸菌０１２７：Ｂ８、シグマ
社、アメリカ）を２０μｇ／ｍｌの濃度、インターロイ
キン１βを５０ｕ／ｍｌの濃度、インターロイキン４を
１００ｕ／ｍｌの濃度、インターロイキン７を１００ｕ
／ｍｌの濃度、かつステムセルファクターを５０ｎｇ／
ｍｌの濃度で添加したリンパ球液２ｍｌを６穴プレート
に分注した。
し、冷ＲＰＭＩ１６４０培地中に浸し、ハサミでリンパ
節を細切し、二重のガーゼで不溶部分を除き、低速遠心
機で１２００ＲＰＭ、１０分間遠心して、リンパ球部分
を沈澱として集める。集めたリンパ球をＰＢＳ緩衝液に
再懸濁し、再度低速遠心機で１２００ＲＰＭ、１０分間
遠心して、リンパ球部分を沈澱として集め、リンパ球を
洗浄する。洗浄したリンパ球を１５％牛胎児血清添加Ｒ
ＤＦ培地（ＲＰＭＩ１６４０培地：ダルベッコＭＥＭ培
地：ＨａｍＦ１２培地＝２：１：１の割合で混合した培
地）に再懸濁し、細胞密度を約３〜５×１０6 細胞／ｍ
ｌとして、リポ多糖（大腸菌０１２７：Ｂ８、シグマ
社、アメリカ）を２０μｇ／ｍｌの濃度、インターロイ
キン１βを５０ｕ／ｍｌの濃度、インターロイキン４を
１００ｕ／ｍｌの濃度、インターロイキン７を１００ｕ
／ｍｌの濃度、かつステムセルファクターを５０ｎｇ／
ｍｌの濃度で添加したリンパ球液２ｍｌを６穴プレート
に分注した。
【００４７】このプレートを３７℃、５％炭酸ガス培養
器で、５日間培養した後、１２００ＲＰＭ、１０分間の
低速遠心によりリンパ球細胞を回収した。また、１０％
牛胎児血清添加ＲＤＦ培地で培養し、増殖フェーズにあ
る融合親株マウスミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３
（ＡＴＣＣ・ＣＲＬ・１５８０）も同様に遠心操作によ
り、細胞を回収した。
器で、５日間培養した後、１２００ＲＰＭ、１０分間の
低速遠心によりリンパ球細胞を回収した。また、１０％
牛胎児血清添加ＲＤＦ培地で培養し、増殖フェーズにあ
る融合親株マウスミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３
（ＡＴＣＣ・ＣＲＬ・１５８０）も同様に遠心操作によ
り、細胞を回収した。
【００４８】それぞれ回収したリンパ球細胞と融合親株
細胞を１：１の割合で混合し、電気的細胞融合法（Ｆｏ
ｕｎｇ，Ｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、
１３４、３５−４２、１９９０；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ
ｎ，Ｕ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３
４、４３−５０、１９９０）により細胞融合を行った。
すなわち、混合した細胞を３００Ｌ３液（２８０ｍＭｓ
ｏｒｂｉｔｏｌ、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍ
Ｍ酢酸マグネシウム及び１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミ
ン）で一度洗浄した後、細胞を遠心回収し、７５Ｌ３液
（７０ｍＭｓｏｒｂｉｔｏｌ、０．１ｍＭ酢酸カルシウ
ム、０．５ｍＭ酢酸マグネシウム及び１ｍｇ／ｍｌ牛血
清アルブミン）２．５ｍｌに再懸濁した。
細胞を１：１の割合で混合し、電気的細胞融合法（Ｆｏ
ｕｎｇ，Ｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、
１３４、３５−４２、１９９０；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ
ｎ，Ｕ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３
４、４３−５０、１９９０）により細胞融合を行った。
すなわち、混合した細胞を３００Ｌ３液（２８０ｍＭｓ
ｏｒｂｉｔｏｌ、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍ
Ｍ酢酸マグネシウム及び１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミ
ン）で一度洗浄した後、細胞を遠心回収し、７５Ｌ３液
（７０ｍＭｓｏｒｂｉｔｏｌ、０．１ｍＭ酢酸カルシウ
ム、０．５ｍＭ酢酸マグネシウム及び１ｍｇ／ｍｌ牛血
清アルブミン）２．５ｍｌに再懸濁した。
【００４９】５分後、島津製作所の電気的細胞融合装置
ＳＳＨ−１を用いて、１ＭＨｚ、１．００ｋＶ／ｃｍ、
１５μｓの条件下、０．８３ｍｌ／チェインバーづつ、
電気的パルスを加えた。パルス後、５分間静置し、細胞
浮遊液を３０ｍｌのハイブリドーマ選択培地（１００μ
Ｍヒポキサンチン、１６μＭチミジン、０．４μＭアミ
ノプテリン、５μｇ／ｍｌ牛インシュリン、５μｇ／ｍ
ｌヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナト
リウム、５０μＭの２−メルカプトエタノール、２０Ｕ
／ｍｌリコンビナントヒトインターロイキン−６、４０
％のバルブ／ｃマウス脾臓細胞培養上清液、１０％牛胎
児血清を含むＲＤＦ培地）に懸濁し、細胞懸濁液を０．
１ｍｌづつ９６穴細胞培養用マイクロプレートに分注し
た。マイクロプレートを３７℃、５％炭酸ガス培養器に
いれて、約２週間〜約４週間培養を継続した。 （２）肺癌細胞反応性ハイブリドーマの選択 約２週間〜約４週間培養を継続した９６穴マイクロープ
レートを光学顕微鏡的な観察により、コロニーが認めら
れたウェルに関して、培養上清液２５μｌを採取しヒト
型抗体の産生能を検定した。すなわち、抗ヒトイミュノ
グロブリンヤギ抗体（タゴ社、アメリカ）を０．１Ｍ重
炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）で１０００倍希釈し、ＥＬＩ
ＳＡ（酵素免疫法）用９６穴プレートに１００μｌずつ
分注し、４℃、１夜（１６時間）静置した後、ＰＢＳ緩
衝液で３回洗浄し、３％牛血清アルブミン含有ＰＢＳ緩
衝液でプレートを室温、一時間ブロッキンングした。
ＳＳＨ−１を用いて、１ＭＨｚ、１．００ｋＶ／ｃｍ、
１５μｓの条件下、０．８３ｍｌ／チェインバーづつ、
電気的パルスを加えた。パルス後、５分間静置し、細胞
浮遊液を３０ｍｌのハイブリドーマ選択培地（１００μ
Ｍヒポキサンチン、１６μＭチミジン、０．４μＭアミ
ノプテリン、５μｇ／ｍｌ牛インシュリン、５μｇ／ｍ
ｌヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナト
リウム、５０μＭの２−メルカプトエタノール、２０Ｕ
／ｍｌリコンビナントヒトインターロイキン−６、４０
％のバルブ／ｃマウス脾臓細胞培養上清液、１０％牛胎
児血清を含むＲＤＦ培地）に懸濁し、細胞懸濁液を０．
１ｍｌづつ９６穴細胞培養用マイクロプレートに分注し
た。マイクロプレートを３７℃、５％炭酸ガス培養器に
いれて、約２週間〜約４週間培養を継続した。 （２）肺癌細胞反応性ハイブリドーマの選択 約２週間〜約４週間培養を継続した９６穴マイクロープ
レートを光学顕微鏡的な観察により、コロニーが認めら
れたウェルに関して、培養上清液２５μｌを採取しヒト
型抗体の産生能を検定した。すなわち、抗ヒトイミュノ
グロブリンヤギ抗体（タゴ社、アメリカ）を０．１Ｍ重
炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）で１０００倍希釈し、ＥＬＩ
ＳＡ（酵素免疫法）用９６穴プレートに１００μｌずつ
分注し、４℃、１夜（１６時間）静置した後、ＰＢＳ緩
衝液で３回洗浄し、３％牛血清アルブミン含有ＰＢＳ緩
衝液でプレートを室温、一時間ブロッキンングした。
【００５０】ブロッキング後、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄
し、２５μｌの培養上清液と２５μｌのＰＢＳ緩衝液を
分注した。３７℃、一時間反応させた後、ＰＢＳ緩衝液
で３回洗浄し、０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩
衝液で２０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識ヤギＦ
（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン（カペル社、ア
メリカ）を１００μｌずつ分注し、３７℃、３０分間反
応させた。反応後、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、パーオ
キシダーゼ発色基質液（０．１Ｍクエン酸：０．２ＭＮ
ａ2 ＨＰＯ4 ：水＝５ｍｌ：５ｍｌ：１０ｍｌの緩衝液
に１０ｍｇオルトフェニレンジアミン／２０ｍｌと１０
μｌ３０％過酸化水素水／２０ｍｌを添加した液）を１
００μｌずつ分注し、室温、１０分間発色させた。発色
後、１Ｎ塩酸を１００μｌずつ加え、反応を停止させ、
４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測
定し、抗体産生能の検定評価を行った。
し、２５μｌの培養上清液と２５μｌのＰＢＳ緩衝液を
分注した。３７℃、一時間反応させた後、ＰＢＳ緩衝液
で３回洗浄し、０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩
衝液で２０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識ヤギＦ
（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン（カペル社、ア
メリカ）を１００μｌずつ分注し、３７℃、３０分間反
応させた。反応後、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、パーオ
キシダーゼ発色基質液（０．１Ｍクエン酸：０．２ＭＮ
ａ2 ＨＰＯ4 ：水＝５ｍｌ：５ｍｌ：１０ｍｌの緩衝液
に１０ｍｇオルトフェニレンジアミン／２０ｍｌと１０
μｌ３０％過酸化水素水／２０ｍｌを添加した液）を１
００μｌずつ分注し、室温、１０分間発色させた。発色
後、１Ｎ塩酸を１００μｌずつ加え、反応を停止させ、
４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測
定し、抗体産生能の検定評価を行った。
【００５１】また、抗体のクラスおよび軽鎖は、免疫酵
素測定法により行った。すなわち、一次抗体として、抗
ヒトイミュノグロブリンヤギ抗体（タゴ社、アメリカ）
を０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）で１０００倍希
釈し、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫法）用９６穴プレートに１
００μｌずつ分注し、４℃、１夜（１６時間）静置した
後、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、３％牛血清アルブミン
含有ＰＢＳ緩衝液でプレートを室温、１時間ブロッキン
ングした。
素測定法により行った。すなわち、一次抗体として、抗
ヒトイミュノグロブリンヤギ抗体（タゴ社、アメリカ）
を０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）で１０００倍希
釈し、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫法）用９６穴プレートに１
００μｌずつ分注し、４℃、１夜（１６時間）静置した
後、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、３％牛血清アルブミン
含有ＰＢＳ緩衝液でプレートを室温、１時間ブロッキン
ングした。
【００５２】ブロッキング後、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄
し、２５μｌの培養上清液と２５μｌのＰＢＳ緩衝液を
分注した。３７℃、一時間反応させた後、ＰＢＳ緩衝液
で３回洗浄し、０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩
衝液で１０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標
識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトＩｇＭ（タゴ社、アメリ
カ）、アルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）
2 抗ヒトＩｇＧ（タゴ社、アメリカ）、アルカリフォス
ファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトＩｇＡ（タゴ
社、アメリカ）、アルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ
（ａｂ’）2 抗ヒトＩｇλ鎖（タゴ社、アメリカ）あう
いはアルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2
抗ヒトＩｇκ鎖（タゴ社、アメリカ）を１００μｌずつ
分注し、３７℃、３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳ
緩衝液で３回洗浄し、アルカリフォスファターゼ発色基
質液（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフォスフェー
ト、１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩化マグネシ
ウム、ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分注し、室温、１
０分間発色させた。
し、２５μｌの培養上清液と２５μｌのＰＢＳ緩衝液を
分注した。３７℃、一時間反応させた後、ＰＢＳ緩衝液
で３回洗浄し、０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩
衝液で１０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標
識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトＩｇＭ（タゴ社、アメリ
カ）、アルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）
2 抗ヒトＩｇＧ（タゴ社、アメリカ）、アルカリフォス
ファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトＩｇＡ（タゴ
社、アメリカ）、アルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ
（ａｂ’）2 抗ヒトＩｇλ鎖（タゴ社、アメリカ）あう
いはアルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2
抗ヒトＩｇκ鎖（タゴ社、アメリカ）を１００μｌずつ
分注し、３７℃、３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳ
緩衝液で３回洗浄し、アルカリフォスファターゼ発色基
質液（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフォスフェー
ト、１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩化マグネシ
ウム、ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分注し、室温、１
０分間発色させた。
【００５３】発色後、１Ｎ・水酸化ナトリウム液を１０
０μｌずつ添加して、反応を停止させ、マイクロプレー
トリーダーにて、４０５ｎｍの吸光度を測定し、抗体の
クラスおよびＬ鎖を調べた。抗体産生能陽性のウェルに
関して、培養を拡大し、２４穴プレートを用いて、０．
５ｍｌのスケールで培養を継続した。増殖したウェルか
ら再度培養上清液を採取し、肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞
との反応性の検討をした（Ｄｏｒｒｅｎの方法、Ｂｒ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４５、４９１−４９７、１９８
２）。すなわち、１０％牛胎児血清添加ＲＤＦ培地中
で、９６穴の細胞培養用マイクロプレートでサブコンフ
ルエント状態に増殖した肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞をＰ
ＢＳ緩衝液で一回洗浄後、０．０５％グルタルアルデヒ
ド添加ＰＢＳ緩衝液を１００μｌずつ分注し、室温、１
５分間静置した。１５分後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、３％牛血清アルブミン
添加ＰＢＳ緩衝液を２００μｌずつ加えて、室温、１時
間ブロッキングした。
０μｌずつ添加して、反応を停止させ、マイクロプレー
トリーダーにて、４０５ｎｍの吸光度を測定し、抗体の
クラスおよびＬ鎖を調べた。抗体産生能陽性のウェルに
関して、培養を拡大し、２４穴プレートを用いて、０．
５ｍｌのスケールで培養を継続した。増殖したウェルか
ら再度培養上清液を採取し、肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞
との反応性の検討をした（Ｄｏｒｒｅｎの方法、Ｂｒ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４５、４９１−４９７、１９８
２）。すなわち、１０％牛胎児血清添加ＲＤＦ培地中
で、９６穴の細胞培養用マイクロプレートでサブコンフ
ルエント状態に増殖した肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞をＰ
ＢＳ緩衝液で一回洗浄後、０．０５％グルタルアルデヒ
ド添加ＰＢＳ緩衝液を１００μｌずつ分注し、室温、１
５分間静置した。１５分後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、３％牛血清アルブミン
添加ＰＢＳ緩衝液を２００μｌずつ加えて、室温、１時
間ブロッキングした。
【００５４】ブロッキング後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、培養上清液を５０μ
ｌずつ分注した。室温、３時間反応させた後、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、０．
２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩衝液で１０００倍に
希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ（ａ
ｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン（タゴ社）を１００
μｌずつ分注し、室温、１時間反応させた。反応後、三
回洗浄し、アルカリフォスファターゼ発色基質液（０．
６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフォスフェート、１Ｍジエ
タノールアミン、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ
９．６）を１００μｌずつ分注し、室温、１０分間発色
させた。
０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、培養上清液を５０μ
ｌずつ分注した。室温、３時間反応させた後、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、０．
２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩衝液で１０００倍に
希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ（ａ
ｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン（タゴ社）を１００
μｌずつ分注し、室温、１時間反応させた。反応後、三
回洗浄し、アルカリフォスファターゼ発色基質液（０．
６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフォスフェート、１Ｍジエ
タノールアミン、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ
９．６）を１００μｌずつ分注し、室温、１０分間発色
させた。
【００５５】発色後、１Ｎ・水酸化ナトリウム液を１０
０μｌずつ添加して、反応を停止させ、マイクロプレー
トリーダーにて、４０５ｎｍの吸光度を測定し、Ａ５４
９細胞との反応性を調べた。また、肺癌組織を用いて、
免疫組織化学的検定をあわせて行った。すなわち、フォ
ルマリン固定法、ＡＭｅＸ包埋法および新鮮凍結切片法
の３種の方法で作製した肺癌組織切片を用いた免疫組織
化学法でヒト型抗体の肺癌特異性の検討を行った。脱パ
ラフィンは、フォルマリン固定組織切片の場合はキシレ
ン、エタノール系列で、ＡＭｅＸ包埋法組織切片の場合
はキシレン、アセトン系列で行った。新鮮凍結組織切片
および脱パラフィンしたＡＭｅＸ組織切片は、ＰＢＳ緩
衝液で１回洗浄後、４％パラフォルムアルデヒド（０．
１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で室温２０分間固定を
した。
０μｌずつ添加して、反応を停止させ、マイクロプレー
トリーダーにて、４０５ｎｍの吸光度を測定し、Ａ５４
９細胞との反応性を調べた。また、肺癌組織を用いて、
免疫組織化学的検定をあわせて行った。すなわち、フォ
ルマリン固定法、ＡＭｅＸ包埋法および新鮮凍結切片法
の３種の方法で作製した肺癌組織切片を用いた免疫組織
化学法でヒト型抗体の肺癌特異性の検討を行った。脱パ
ラフィンは、フォルマリン固定組織切片の場合はキシレ
ン、エタノール系列で、ＡＭｅＸ包埋法組織切片の場合
はキシレン、アセトン系列で行った。新鮮凍結組織切片
および脱パラフィンしたＡＭｅＸ組織切片は、ＰＢＳ緩
衝液で１回洗浄後、４％パラフォルムアルデヒド（０．
１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で室温２０分間固定を
した。
【００５６】脱パラフィンしたフォルマリン固定スライ
ドおよびパラフォルムアルデヒド固定した新鮮凍結切片
スライドあるいはＡＭｅＸ組織切片スライドはＰＢＳ緩
衝液で３回洗浄後、１０％ヤギ正常血清で室温１５分間
ブロッキング操作を行い、間接法変法（曽山信彦他、日
消誌、８７、２６３５−２６４１；Ｓｏｙａｍａ，Ｎ
他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｊｐｎ．、２４、５
８１、１９８９）により行った。
ドおよびパラフォルムアルデヒド固定した新鮮凍結切片
スライドあるいはＡＭｅＸ組織切片スライドはＰＢＳ緩
衝液で３回洗浄後、１０％ヤギ正常血清で室温１５分間
ブロッキング操作を行い、間接法変法（曽山信彦他、日
消誌、８７、２６３５−２６４１；Ｓｏｙａｍａ，Ｎ
他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｊｐｎ．、２４、５
８１、１９８９）により行った。
【００５７】すなわち、予めヒト型抗体を含む培養上清
液サンプルと４００分の１量のパーオキシダーゼ標識ヤ
ギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン（カペル
社）を室温３時間反応させた後、フリーのパーオキシダ
ーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン
をブロッキングするため、７５分の１量のヒト正常血清
（カペル社）を加え、室温１時間さらに反応させる。こ
のヒト型抗体とパーオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）
2 抗ヒトイミュノグロブリンの結合体を含む反応液０．
２ｍｌを、脱パラフィンしたスライドあるいはパラフォ
ルムアルデヒド固定した新鮮凍結切片スライドにのせ、
４℃、１８時間静置し、ＰＢＳ緩衝液３回洗浄後、発色
基質液（０．０２％ ジアミノベンジジン、０．００５
％過酸化水素水、５０ｍＭ トリス−塩酸、ｐＨ７．
６）で５分間発色させた。
液サンプルと４００分の１量のパーオキシダーゼ標識ヤ
ギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン（カペル
社）を室温３時間反応させた後、フリーのパーオキシダ
ーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン
をブロッキングするため、７５分の１量のヒト正常血清
（カペル社）を加え、室温１時間さらに反応させる。こ
のヒト型抗体とパーオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）
2 抗ヒトイミュノグロブリンの結合体を含む反応液０．
２ｍｌを、脱パラフィンしたスライドあるいはパラフォ
ルムアルデヒド固定した新鮮凍結切片スライドにのせ、
４℃、１８時間静置し、ＰＢＳ緩衝液３回洗浄後、発色
基質液（０．０２％ ジアミノベンジジン、０．００５
％過酸化水素水、５０ｍＭ トリス−塩酸、ｐＨ７．
６）で５分間発色させた。
【００５８】発色後、水で洗浄し、３倍希釈のハリスヘ
マトキシレンで対染色を行い、さらに水で十分に洗浄を
行った。その後、脱水反応を７０％エタノール、８０％
エタノール、９０％エタノール、１００％エタノール
（２回）、１００％キシレン（２回）の順序で行い、キ
シレン系標本封入剤マウントクイック（大道産業株式会
社）で封入した。封入した組織切片スライドを光学顕微
鏡的な観察により、正常部位とは反応せず、肺癌組織と
特異的に反応するヒト型抗体の選別をした。このように
して選別したヒト型抗体を産生するハイブリドーマを３
回サブクローニングして、安定的に抗体を産生するハイ
ブリドーマを得た。
マトキシレンで対染色を行い、さらに水で十分に洗浄を
行った。その後、脱水反応を７０％エタノール、８０％
エタノール、９０％エタノール、１００％エタノール
（２回）、１００％キシレン（２回）の順序で行い、キ
シレン系標本封入剤マウントクイック（大道産業株式会
社）で封入した。封入した組織切片スライドを光学顕微
鏡的な観察により、正常部位とは反応せず、肺癌組織と
特異的に反応するヒト型抗体の選別をした。このように
して選別したヒト型抗体を産生するハイブリドーマを３
回サブクローニングして、安定的に抗体を産生するハイ
ブリドーマを得た。
【００５９】最終的には、このハイブリドーマを無血清
培地ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ−ＳＦＭ（ギブコ社、アメリ
カ）に順化させ、ヒト型モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ２９Ｄ３８を得た。このハイブリドーマ
２９Ｄ３８の培養上清液を用いて、再度上記に示した肺
癌細胞株Ａ５４９との反応性の検討および免疫組織化学
的検討を行った。検討を行うにあたって、本発明のヒト
型モノクローナル抗体の他に、肺癌組織と反応しないヒ
ト型抗体（カペル社）を用いて比較を行った。
培地ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ−ＳＦＭ（ギブコ社、アメリ
カ）に順化させ、ヒト型モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ２９Ｄ３８を得た。このハイブリドーマ
２９Ｄ３８の培養上清液を用いて、再度上記に示した肺
癌細胞株Ａ５４９との反応性の検討および免疫組織化学
的検討を行った。検討を行うにあたって、本発明のヒト
型モノクローナル抗体の他に、肺癌組織と反応しないヒ
ト型抗体（カペル社）を用いて比較を行った。
【００６０】下記の表１は免疫組織学的検討結果であ
り、図１は肺癌細胞株Ａ５４９との反応性の検討結果で
ある。図１は、ヒト型抗体の肺腺癌細胞株Ａ５４９との
反応性を４０５ｎｍの吸光度で示した図である。Ｎ＝３
で測定を行い、平均値と標準偏差を表した。ｈＩｇＭ
（カペル社）は陰性対照としてのヒト型抗体である。ま
た、表１中、Ｆｒｏｚｅｎは凍結肺癌組織切片を、ＡＭ
ｅＸはＡＭｅＸ固定肺癌組織切片を、Ｆｏｒｍａｌｉｎ
はＦｏｒｍａｌｉｎ固定肺癌組織切片を、Ａｄは肺腺癌
組織切片を、Ｓｑは肺扁平上皮癌組織切片を、それぞれ
表し、数値は陽性数／測定数を示した。
り、図１は肺癌細胞株Ａ５４９との反応性の検討結果で
ある。図１は、ヒト型抗体の肺腺癌細胞株Ａ５４９との
反応性を４０５ｎｍの吸光度で示した図である。Ｎ＝３
で測定を行い、平均値と標準偏差を表した。ｈＩｇＭ
（カペル社）は陰性対照としてのヒト型抗体である。ま
た、表１中、Ｆｒｏｚｅｎは凍結肺癌組織切片を、ＡＭ
ｅＸはＡＭｅＸ固定肺癌組織切片を、Ｆｏｒｍａｌｉｎ
はＦｏｒｍａｌｉｎ固定肺癌組織切片を、Ａｄは肺腺癌
組織切片を、Ｓｑは肺扁平上皮癌組織切片を、それぞれ
表し、数値は陽性数／測定数を示した。
【００６１】
【表１】
【００６２】この結果、ハイブリドーマ２９Ｄ３８が産
生するヒト型モノクローナル抗体は図１により肺癌細胞
株と反応することが明かとなり、表１により凍結肺癌組
織切片あるいはＡＭｅＸ固定肺癌組織切片を用いても良
好に反応することが判明した。すなわち、病理組織標本
を用いた病理診断薬としての有効性を示した。また、抗
体のクラスおよび軽鎖は、免疫酵素測定法により、Ｉｇ
Ｍでλ鎖であった。
生するヒト型モノクローナル抗体は図１により肺癌細胞
株と反応することが明かとなり、表１により凍結肺癌組
織切片あるいはＡＭｅＸ固定肺癌組織切片を用いても良
好に反応することが判明した。すなわち、病理組織標本
を用いた病理診断薬としての有効性を示した。また、抗
体のクラスおよび軽鎖は、免疫酵素測定法により、Ｉｇ
Ｍでλ鎖であった。
【００６３】
【実施例２】 精製ヒト型モノクローナル抗体を用いた担癌マウスへの
抗体集積性 （１）ヒト型モノクローナル抗体の精製 無血清培地ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ−ＳＦＭに順化したハイ
ブリドーマを２Ｌのスケールのスピナーフラスコ培養
（２５ＲＰＭ）により、３７℃、ＣＯ2 インキュベータ
ーで、７日間培養して、ハイブリドーマの無血清培養上
清液を得た。培養上清液には、防腐剤として、０．０５
％アジ化ナトリウムを添加し、ヒト型モノクローナル抗
体の精製を行った。すなわち、培養上清液をハイドロキ
シアパタイトカラム（ＰＥＮＴＡＸ−ＳＨ−２０１０Ｃ
−φ２１．５ｍｍ×１００ｍｍ、旭光学工業株式会社）
に直接負荷し、ヒト型モノクローナル抗体をカラムに吸
着させた。４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で十分
に洗浄した後、４０ｍＭから４００ｍＭのリン酸緩衝液
（ｐＨ６．８）の直線的濃度勾配溶出法により、抗体部
分を約３００ｍＭ付近で溶出させた。
抗体集積性 （１）ヒト型モノクローナル抗体の精製 無血清培地ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ−ＳＦＭに順化したハイ
ブリドーマを２Ｌのスケールのスピナーフラスコ培養
（２５ＲＰＭ）により、３７℃、ＣＯ2 インキュベータ
ーで、７日間培養して、ハイブリドーマの無血清培養上
清液を得た。培養上清液には、防腐剤として、０．０５
％アジ化ナトリウムを添加し、ヒト型モノクローナル抗
体の精製を行った。すなわち、培養上清液をハイドロキ
シアパタイトカラム（ＰＥＮＴＡＸ−ＳＨ−２０１０Ｃ
−φ２１．５ｍｍ×１００ｍｍ、旭光学工業株式会社）
に直接負荷し、ヒト型モノクローナル抗体をカラムに吸
着させた。４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で十分
に洗浄した後、４０ｍＭから４００ｍＭのリン酸緩衝液
（ｐＨ６．８）の直線的濃度勾配溶出法により、抗体部
分を約３００ｍＭ付近で溶出させた。
【００６４】肺癌細胞株Ａ５４９と反応し、かつヒト型
抗体活性がある分画（約３００ｍＭリン酸緩衝液付近）
を集めて、精製ヒト型モノクローナル抗体画分（２ｍｇ
蛋白／ｍｌ）１６ｍｌを得た。ＳＤＳ−電気泳動的に
は、シングルバンドとして確認できた。 （２）担癌マウスを用いたヒト型モノクローナル抗体の
体内集積性 重症複合免疫不全マウスＳＣＩＤ（６週令、♀、日本ク
レア社）に、対数増殖期にあるヒト肺癌腺癌細胞株Ａ５
４９細胞を１０7 個背側皮下注射し、８日後に、ヒト型
モノクローナル抗体を１００μｇを尾静注した。抗体投
与後７日目に血液、脳、心臓、肺、肝、胃、脾、腎およ
び腫瘍を摘出した。
抗体活性がある分画（約３００ｍＭリン酸緩衝液付近）
を集めて、精製ヒト型モノクローナル抗体画分（２ｍｇ
蛋白／ｍｌ）１６ｍｌを得た。ＳＤＳ−電気泳動的に
は、シングルバンドとして確認できた。 （２）担癌マウスを用いたヒト型モノクローナル抗体の
体内集積性 重症複合免疫不全マウスＳＣＩＤ（６週令、♀、日本ク
レア社）に、対数増殖期にあるヒト肺癌腺癌細胞株Ａ５
４９細胞を１０7 個背側皮下注射し、８日後に、ヒト型
モノクローナル抗体を１００μｇを尾静注した。抗体投
与後７日目に血液、脳、心臓、肺、肝、胃、脾、腎およ
び腫瘍を摘出した。
【００６５】摘出した各臓器は、ＰＢＳ緩衝液中に浸し
て脱血させ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液
中で、ホモジェナイズした後、４℃、２０時間放置し、
蛋白を抽出した。ホモジネートを１０，０００ＲＰＭ、
３０分間遠心し、上清を蛋白抽出試料とした。血液は室
温に３０分放置した後、２５００ＲＰＭ、２０分間遠心
し、上清を血清検体とした。
て脱血させ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液
中で、ホモジェナイズした後、４℃、２０時間放置し、
蛋白を抽出した。ホモジネートを１０，０００ＲＰＭ、
３０分間遠心し、上清を蛋白抽出試料とした。血液は室
温に３０分放置した後、２５００ＲＰＭ、２０分間遠心
し、上清を血清検体とした。
【００６６】血清および蛋白抽出試料中のヒト型モノク
ローナル抗体の量は酵素免疫測定法により算出した。す
なわち、３０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）に
て１０００倍に希釈したヤギ抗ヒト免疫グロブリン（カ
ペル社）を５０μｌづつウェルに分注した９６穴マイク
ロプレートを室温、２時間静置し、０．０２％Ｔｗｅｅ
ｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、５％スキムミル
クと０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ緩衝液
１００μｌを分注して、ウェルのブロッキングを行っ
た。
ローナル抗体の量は酵素免疫測定法により算出した。す
なわち、３０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）に
て１０００倍に希釈したヤギ抗ヒト免疫グロブリン（カ
ペル社）を５０μｌづつウェルに分注した９６穴マイク
ロプレートを室温、２時間静置し、０．０２％Ｔｗｅｅ
ｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、５％スキムミル
クと０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ緩衝液
１００μｌを分注して、ウェルのブロッキングを行っ
た。
【００６７】室温、２時間経過後、０．０２％Ｔｗｅｅ
ｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、５０μｌの２倍
づつ希釈した血清検体あるいは蛋白抽出試料を分注し
た。室温、３時間後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加Ｐ
ＢＳ緩衝液で５回洗浄し、５０μｌの０．０２％Ｔｗｅ
ｅｎ２０と０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩衝液
で１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識
ヤギＦ（ａｂ’）2抗ヒトＩｇＭ抗体を分注した。
ｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、５０μｌの２倍
づつ希釈した血清検体あるいは蛋白抽出試料を分注し
た。室温、３時間後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加Ｐ
ＢＳ緩衝液で５回洗浄し、５０μｌの０．０２％Ｔｗｅ
ｅｎ２０と０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩衝液
で１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識
ヤギＦ（ａｂ’）2抗ヒトＩｇＭ抗体を分注した。
【００６８】室温、２時間後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２
０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、アルカリフォスファ
ターゼ発色基質液（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフ
ォスフェート、１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩
化マグネシウム、ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分注
し、室温、１０分間発色させた。発色後、１Ｎ・水酸化
ナトリウム液を１００μｌずつ添加して、反応を停止さ
せ、マイクロプレートリーダーにて、４０５ｎｍの吸光
度を測定し、ＩｇＭ抗体量の定量を行った。
０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、アルカリフォスファ
ターゼ発色基質液（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフ
ォスフェート、１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩
化マグネシウム、ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分注
し、室温、１０分間発色させた。発色後、１Ｎ・水酸化
ナトリウム液を１００μｌずつ添加して、反応を停止さ
せ、マイクロプレートリーダーにて、４０５ｎｍの吸光
度を測定し、ＩｇＭ抗体量の定量を行った。
【００６９】検討を行うにあたって、本発明のヒト型モ
ノクローナル抗体の他に、肺癌組織と反応しないヒト型
抗体（ＩｇＭ、カペル社）を用いて比較を行った。ヒト
型抗体を用いて、担癌マウスの腫瘍部への抗体集積性の
結果を図２に示した。図２は、ヒト型抗体の担癌ＳＣＩ
Ｄマウス腫瘍部への集積性を腫瘍部への単位重量当たり
の集積量（Ｔ）の血液への単位重量当たりの集積量
（Ｂ）に対する比（Ｔ／Ｂ）で表した図である。Ｎ＝２
で測定を行い、平均値と標準偏差を表した。
ノクローナル抗体の他に、肺癌組織と反応しないヒト型
抗体（ＩｇＭ、カペル社）を用いて比較を行った。ヒト
型抗体を用いて、担癌マウスの腫瘍部への抗体集積性の
結果を図２に示した。図２は、ヒト型抗体の担癌ＳＣＩ
Ｄマウス腫瘍部への集積性を腫瘍部への単位重量当たり
の集積量（Ｔ）の血液への単位重量当たりの集積量
（Ｂ）に対する比（Ｔ／Ｂ）で表した図である。Ｎ＝２
で測定を行い、平均値と標準偏差を表した。
【００７０】その結果、ハイブリドーマ２９Ｄ３８が産
生するヒト型モノクローナル抗体の場合は、陰性対照
（カペル社ＩｇＭ）の抗体に比較しても腫瘍部への顕著
な抗体集積性が認められ、さらに、ハイブリドーマ２９
Ｄ３８が産生するヒト型モノクローナル抗体の場合は、
腫瘍の縮退が肉眼的に観察された。
生するヒト型モノクローナル抗体の場合は、陰性対照
（カペル社ＩｇＭ）の抗体に比較しても腫瘍部への顕著
な抗体集積性が認められ、さらに、ハイブリドーマ２９
Ｄ３８が産生するヒト型モノクローナル抗体の場合は、
腫瘍の縮退が肉眼的に観察された。
【００７１】
【実施例３】 蛍光抗体法による抗原局在の検討 細胞培養用フラスコ（Ｆ７５）を用いて、１０％牛胎児
血清添加ダルベッコＭＥＭ培地中で、サブコンフルエン
ト状態まで増殖させた肺癌腺癌細胞株Ａ５４９細胞を
０．０２％ＥＤＴＡ添加ＰＢＳ緩衝液で処理して、付着
細胞を遊離させて、１２００ＲＰＭ、１０分間の遠心に
て細胞を回収した。
血清添加ダルベッコＭＥＭ培地中で、サブコンフルエン
ト状態まで増殖させた肺癌腺癌細胞株Ａ５４９細胞を
０．０２％ＥＤＴＡ添加ＰＢＳ緩衝液で処理して、付着
細胞を遊離させて、１２００ＲＰＭ、１０分間の遠心に
て細胞を回収した。
【００７２】回収したＡ５４９細胞２×１０5 個に対し
てハイブリドーマ培養上清液１５０μｌを４℃、２時間
反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心して、細
胞を沈澱させた。細胞を、ＰＢＳ緩衝液で２０倍に希釈
したＦＩＴＣ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒト免疫グロブ
リン抗体（カペル社）１００μｌに再懸濁し、４℃、１
時間反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心し
て、細胞を沈澱させた。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄
後、５０μｌのＰＢＳ緩衝液に懸濁し、蛍光顕微鏡的な
観察を行った。
てハイブリドーマ培養上清液１５０μｌを４℃、２時間
反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心して、細
胞を沈澱させた。細胞を、ＰＢＳ緩衝液で２０倍に希釈
したＦＩＴＣ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒト免疫グロブ
リン抗体（カペル社）１００μｌに再懸濁し、４℃、１
時間反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心し
て、細胞を沈澱させた。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄
後、５０μｌのＰＢＳ緩衝液に懸濁し、蛍光顕微鏡的な
観察を行った。
【００７３】その結果、ハイブリドーマ２９Ｄ３８が産
生するヒト型モノクローナル抗体は肺癌腺癌細胞Ａ５４
９の核膜抗原と反応することが蛍光顕微鏡的に観察でき
た。
生するヒト型モノクローナル抗体は肺癌腺癌細胞Ａ５４
９の核膜抗原と反応することが蛍光顕微鏡的に観察でき
た。
【００７４】
【実施例４】 Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片を用いた担癌マウスへの抗体集
積性 （１）ペプシン処理によるＦ（ａｂ’）2 抗体断片の作
製 実施例２で示した方法により精製したヒト型モノクロー
ナル抗体液を０．１５Ｍ塩化ナトリウム添加０．０２Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に対して４℃、１
６時間透析し、最終的に５０μｇ／ｍｌ（５ｍｌ）の濃
度に調製した。当該緩衝液に溶解したペプシン（シグマ
社）を重量比で抗体に対して２５分の１の量比で添加
し、３２℃、６０分間反応させた。６０分後、酵素反応
は０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を体積比
で反応液に対して５分の１量を添加して停止した。
積性 （１）ペプシン処理によるＦ（ａｂ’）2 抗体断片の作
製 実施例２で示した方法により精製したヒト型モノクロー
ナル抗体液を０．１５Ｍ塩化ナトリウム添加０．０２Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に対して４℃、１
６時間透析し、最終的に５０μｇ／ｍｌ（５ｍｌ）の濃
度に調製した。当該緩衝液に溶解したペプシン（シグマ
社）を重量比で抗体に対して２５分の１の量比で添加
し、３２℃、６０分間反応させた。６０分後、酵素反応
は０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を体積比
で反応液に対して５分の１量を添加して停止した。
【００７５】ペプシン消化検体を５００μｌづつ、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ−ＫＷ２００３−ＧＦＣカラム（昭和電工、
直径２０ｍｍｘ３００ｍｍ）に負荷して、ゲル濾過分離
を行った。高速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣは、島
津ＬＣ−６Ａを用いた。カラムの平衡緩衝液及び溶出緩
衝液は０．１５Ｍ塩化ナトリウム添加０．０１Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて、２．５ｍｌ／ｍｉ
ｎの条件で行い、２８０ｎｍの吸光度にて蛋白の検出を
した。
ｏｔｅｉｎ−ＫＷ２００３−ＧＦＣカラム（昭和電工、
直径２０ｍｍｘ３００ｍｍ）に負荷して、ゲル濾過分離
を行った。高速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣは、島
津ＬＣ−６Ａを用いた。カラムの平衡緩衝液及び溶出緩
衝液は０．１５Ｍ塩化ナトリウム添加０．０１Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて、２．５ｍｌ／ｍｉ
ｎの条件で行い、２８０ｎｍの吸光度にて蛋白の検出を
した。
【００７６】ゲル濾過的分子量が約１３万付近のピーク
部分を集め、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動的に
非還元条件下で約１３．４万であることを確認した。ま
た、還元条件下では、約２．５万及び約４．２万の分子
量の２つのバンドが確認できた。従って、このゲル濾過
的な分子量で約１３万のピーク部分をプールして、精製
Ｆ（ａｂ’）2 として、以下の実験に用いた。 （２）精製Ｆ（ａｂ’）2 を用いた担癌ＳＣＩＤマウス
への抗体集積性 実施例２の（２）の実験と同様に、ヒト肺癌腺癌細胞株
Ａ５４９をＳＣＩＤマウスに背側皮下注射し、腫瘍を形
成させ、８日後に、精製Ｆ（ａｂ’）2 をそれぞれ５０
μｇづつ尾静注した。抗体投与後４日目に各種臓器を摘
出し、ＥＩＡ法にて各種臓器に集積したヒト型モノクロ
ーナル抗体Ｆ（ａｂ’）2 断片を定量した。
部分を集め、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動的に
非還元条件下で約１３．４万であることを確認した。ま
た、還元条件下では、約２．５万及び約４．２万の分子
量の２つのバンドが確認できた。従って、このゲル濾過
的な分子量で約１３万のピーク部分をプールして、精製
Ｆ（ａｂ’）2 として、以下の実験に用いた。 （２）精製Ｆ（ａｂ’）2 を用いた担癌ＳＣＩＤマウス
への抗体集積性 実施例２の（２）の実験と同様に、ヒト肺癌腺癌細胞株
Ａ５４９をＳＣＩＤマウスに背側皮下注射し、腫瘍を形
成させ、８日後に、精製Ｆ（ａｂ’）2 をそれぞれ５０
μｇづつ尾静注した。抗体投与後４日目に各種臓器を摘
出し、ＥＩＡ法にて各種臓器に集積したヒト型モノクロ
ーナル抗体Ｆ（ａｂ’）2 断片を定量した。
【００７７】検討を行うにあたって、本発明のヒト型モ
ノクローナル抗体の他に、肺癌組織と反応しないヒト型
抗体（ＩｇＭ、カペル社）を用いて比較を行った。その
結果、単位重量当たりの腫瘍部への集積量（Ｔ）の単位
重量当たりの血液への集積量（Ｂ）の比（Ｔ／Ｂ）は、
２９Ｄ３８−Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片の場合が４．５、
ｈＩｇＭ−Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片の場合が０．２であ
った。したがって、Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片を用いた場
合も腫瘍部への集積性が顕著に認められた。
ノクローナル抗体の他に、肺癌組織と反応しないヒト型
抗体（ＩｇＭ、カペル社）を用いて比較を行った。その
結果、単位重量当たりの腫瘍部への集積量（Ｔ）の単位
重量当たりの血液への集積量（Ｂ）の比（Ｔ／Ｂ）は、
２９Ｄ３８−Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片の場合が４．５、
ｈＩｇＭ−Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片の場合が０．２であ
った。したがって、Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片を用いた場
合も腫瘍部への集積性が顕著に認められた。
【００７８】
【実施例５】 対応抗原の生化学的解析 （１）肺癌細胞株からの細胞抽出物の調製 ハイブリドーマ２９Ｄ３８産生ヒト型モノクローナル抗
体が結合する物質を明らかにするため、肺癌細胞株Ａ５
４９の細胞抽出物を作製し、ウエスタンブロットによ
り、対応抗原の分子量をもとめた。７５ｃｍ2 の細胞培
養用フラスコ（４本）にて、Ａ５４９細胞を培養し、サ
ブコンフルエント状態になった時、細胞を集めた。すな
わち、付着細胞をＰＢＳ緩衝液にて１度洗浄した後、
０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳを１０ｍｌづつフラスコに
分注して、３７℃、１０分間静置した。
体が結合する物質を明らかにするため、肺癌細胞株Ａ５
４９の細胞抽出物を作製し、ウエスタンブロットによ
り、対応抗原の分子量をもとめた。７５ｃｍ2 の細胞培
養用フラスコ（４本）にて、Ａ５４９細胞を培養し、サ
ブコンフルエント状態になった時、細胞を集めた。すな
わち、付着細胞をＰＢＳ緩衝液にて１度洗浄した後、
０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳを１０ｍｌづつフラスコに
分注して、３７℃、１０分間静置した。
【００７９】その後、５％牛胎児血清添加ＲＤＦ培地を
５ｍｌ加え、セルスクレイパーにて細胞を集めた。１２
００ｒｐｍ、５分間の低速遠心にて、細胞を集め、細胞
抽出緩衝液（１％トライトンＸ１００、５μｇ／ｍｌの
ロイペプチン、５μｇ／ｍｌのキモスタチン、５μｇ／
ｍｌのペプスタチンＡ、１ｍＭのフェニルメチルスルフ
ォニルフルオライドを添加したＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．
４）１ｍｌを加え、細胞を懸濁し、０℃、４５分間、５
分毎に撹拌し、静置した。４５分後、２０００ｒｐｍ、
５分間遠心し、上清を新しい遠心管に移し、さらに１０
０００ｒｐｍ、３０分間遠心し、遠心上清液を集めた。
この上清液を細胞抽出物として、ウェスタンブロット実
験に用いた。 （２）ウェスタンブロット 細胞抽出物１０μｌをＳＤＳ電気泳動用緩衝液（０．０
６２５Ｍトリス塩酸ｐＨ６．８、１０％グリセロール、
２％ＳＤＳ、５％の２−メルカプトエタノール［還元下
条件時のみ添加］、０．００５％ブロモフェノールブル
ー色素）４０μｌで５倍に希釈し、９４℃，３分間熱処
理した。
５ｍｌ加え、セルスクレイパーにて細胞を集めた。１２
００ｒｐｍ、５分間の低速遠心にて、細胞を集め、細胞
抽出緩衝液（１％トライトンＸ１００、５μｇ／ｍｌの
ロイペプチン、５μｇ／ｍｌのキモスタチン、５μｇ／
ｍｌのペプスタチンＡ、１ｍＭのフェニルメチルスルフ
ォニルフルオライドを添加したＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．
４）１ｍｌを加え、細胞を懸濁し、０℃、４５分間、５
分毎に撹拌し、静置した。４５分後、２０００ｒｐｍ、
５分間遠心し、上清を新しい遠心管に移し、さらに１０
０００ｒｐｍ、３０分間遠心し、遠心上清液を集めた。
この上清液を細胞抽出物として、ウェスタンブロット実
験に用いた。 （２）ウェスタンブロット 細胞抽出物１０μｌをＳＤＳ電気泳動用緩衝液（０．０
６２５Ｍトリス塩酸ｐＨ６．８、１０％グリセロール、
２％ＳＤＳ、５％の２−メルカプトエタノール［還元下
条件時のみ添加］、０．００５％ブロモフェノールブル
ー色素）４０μｌで５倍に希釈し、９４℃，３分間熱処
理した。
【００８０】熱処理サンプルを氷冷し、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル（２−１５％、第１化学薬品社）のレ
ーンに５μｌづつアプライした。電気泳動は、電気泳動
緩衝液（トリス−ヒドロキシメチル−アミノメタン３．
０ｇ、グリシン１４．４ｇ、ＳＤＳ１ｇを蒸留水に溶解
し全量を１Ｌとした液）にて、２０ｍＡの定電流で約１
時間泳動した。泳動後、イモビロン−Ｐ（ＰＶＤＦ膜、
ミリポア社）に、２０％メタノール添加ＳＤＳ電気泳動
用緩衝液を用いて、セミドライ型のブロッティング装置
（バイオラッド社）で、１００ｍＡの定電流の条件下で
１時間ブロットした。
クリルアミドゲル（２−１５％、第１化学薬品社）のレ
ーンに５μｌづつアプライした。電気泳動は、電気泳動
緩衝液（トリス−ヒドロキシメチル−アミノメタン３．
０ｇ、グリシン１４．４ｇ、ＳＤＳ１ｇを蒸留水に溶解
し全量を１Ｌとした液）にて、２０ｍＡの定電流で約１
時間泳動した。泳動後、イモビロン−Ｐ（ＰＶＤＦ膜、
ミリポア社）に、２０％メタノール添加ＳＤＳ電気泳動
用緩衝液を用いて、セミドライ型のブロッティング装置
（バイオラッド社）で、１００ｍＡの定電流の条件下で
１時間ブロットした。
【００８１】ブロッティング後、５％スキンミルクで室
温、３０分間、膜をブロッキングした。その後、ビオチ
ン化標識抗体１μｇ／ｍｌ（０．５％スキンミルク／Ｐ
ＢＳ中）で、室温、１時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅ
ｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、ア
ルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン１μｇ
／ｍｌ（０．５％スキンミルク／ＰＢＳ中）で、室温、
０．５時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加Ｐ
ＢＳ緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ
発色キット（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ社、Ｎ
ｏ．５０−８１−００）にて発色させ、発色後、水洗し
反応を停止させた。
温、３０分間、膜をブロッキングした。その後、ビオチ
ン化標識抗体１μｇ／ｍｌ（０．５％スキンミルク／Ｐ
ＢＳ中）で、室温、１時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅ
ｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、ア
ルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン１μｇ
／ｍｌ（０．５％スキンミルク／ＰＢＳ中）で、室温、
０．５時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加Ｐ
ＢＳ緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ
発色キット（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ社、Ｎ
ｏ．５０−８１−００）にて発色させ、発色後、水洗し
反応を停止させた。
【００８２】この結果、ハイブリドーマ２９Ｄ３８が産
生するヒト型モノクローナル抗体を用いた場合、Ａ５４
９細胞抽出物において、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動上で主要なバンドとして、分子量が非還元下で１
００万以上、還元下で２００００〜１２００００の間の
複数の位置のバンドが認められた。従って、これらの対
応抗原は癌細胞株に顕著に発現されていることが確認で
きた。
生するヒト型モノクローナル抗体を用いた場合、Ａ５４
９細胞抽出物において、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動上で主要なバンドとして、分子量が非還元下で１
００万以上、還元下で２００００〜１２００００の間の
複数の位置のバンドが認められた。従って、これらの対
応抗原は癌細胞株に顕著に発現されていることが確認で
きた。
【００８３】
【実施例６】 ヒト型モノクローナル抗体のアミノ末端（Ｎ−末）アミ
ノ酸配列分析 （１）抗体のウェスタンブロッティング 基本的には実施例５と同様に、ウェスタンブロッティン
グにより、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動したヒト型モノクローナル抗体を膜に移した。た
だし、膜はイモビロン−ＰSQ（ミリポア社、アミノ酸分
析用）ＰＶＤＦ膜を使用し、ブロッティングは平野等の
方法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ１１，５７３−
５８０，１９９０）にならった。
ノ酸配列分析 （１）抗体のウェスタンブロッティング 基本的には実施例５と同様に、ウェスタンブロッティン
グにより、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動したヒト型モノクローナル抗体を膜に移した。た
だし、膜はイモビロン−ＰSQ（ミリポア社、アミノ酸分
析用）ＰＶＤＦ膜を使用し、ブロッティングは平野等の
方法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ１１，５７３−
５８０，１９９０）にならった。
【００８４】即ち、ヒト型モノクローナル抗体を２０μ
ｇを、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
（１２．５％）電気泳動し、イモビロンＰSQ（ＰＶＤ
Ｆ）膜にウェスタンブロッティングした。このＰＶＤＦ
膜をＣＢＢ染色液（２．０ｇのクーマッシーブリリアン
トブルーＲ２５０、４００ｍｌのメタノール、１００ｍ
ｌの酢酸を最終的に蒸留水で１Ｌにした後、濾紙にて濾
過した液）で蛋白部分を染色し、抗体の重鎖（Ｈ鎖）部
分と抗体の軽鎖（Ｌ鎖）部分をＰＶＤＦ膜から切り出し
た。 （２）ヒト型抗体のＮ−末分析 アミノ酸分析用ＰＶＤＦ膜にブロッティングした抗体の
Ｈ鎖及びＬ鎖を島津製作所のアミノ酸配列分析装置プロ
テインシーケンサーＰＳＱにて分析した。原理的には、
エドマン分解反応によって切断、転換反応されたＰＴＨ
−アミノ酸をオンライン化したＨＰＬＣで同定する方法
である。その結果、抗体重鎖（Ｈ鎖）はアミノ末端（Ｎ
末）がブロックされており、抗体軽鎖（Ｌ鎖）は配列表
１に示した。ただし、全てのアミノ酸配列の３文字表示
は当分野における標準表示に従っており、Ａｌａはアラ
ニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓｐはアスパラギン酸、
Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｇｌｙは
グリシン、Ｉｌｅはイソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、
Ｌｙｓはリシン、Ｐｒｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、
Ｔｈｒはスレオニン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバリ
ン、Ｘｘｘは不明のアミノ酸の残基をそれぞれ表した。
ｇを、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
（１２．５％）電気泳動し、イモビロンＰSQ（ＰＶＤ
Ｆ）膜にウェスタンブロッティングした。このＰＶＤＦ
膜をＣＢＢ染色液（２．０ｇのクーマッシーブリリアン
トブルーＲ２５０、４００ｍｌのメタノール、１００ｍ
ｌの酢酸を最終的に蒸留水で１Ｌにした後、濾紙にて濾
過した液）で蛋白部分を染色し、抗体の重鎖（Ｈ鎖）部
分と抗体の軽鎖（Ｌ鎖）部分をＰＶＤＦ膜から切り出し
た。 （２）ヒト型抗体のＮ−末分析 アミノ酸分析用ＰＶＤＦ膜にブロッティングした抗体の
Ｈ鎖及びＬ鎖を島津製作所のアミノ酸配列分析装置プロ
テインシーケンサーＰＳＱにて分析した。原理的には、
エドマン分解反応によって切断、転換反応されたＰＴＨ
−アミノ酸をオンライン化したＨＰＬＣで同定する方法
である。その結果、抗体重鎖（Ｈ鎖）はアミノ末端（Ｎ
末）がブロックされており、抗体軽鎖（Ｌ鎖）は配列表
１に示した。ただし、全てのアミノ酸配列の３文字表示
は当分野における標準表示に従っており、Ａｌａはアラ
ニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓｐはアスパラギン酸、
Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｇｌｙは
グリシン、Ｉｌｅはイソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、
Ｌｙｓはリシン、Ｐｒｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、
Ｔｈｒはスレオニン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバリ
ン、Ｘｘｘは不明のアミノ酸の残基をそれぞれ表した。
【００８５】
【発明の効果】本発明にかかるヒト型モノクローナル抗
体は、以上のように、肺癌の治療薬、体内診断薬あるい
は体外診断薬として利用することができるという効果を
奏する。
体は、以上のように、肺癌の治療薬、体内診断薬あるい
は体外診断薬として利用することができるという効果を
奏する。
【００８６】
配列番号：１ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ １ ５ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ １０ １５ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｘｘｘ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ ２０ ２５ Ｐｒｏ Ｌｙｓ ２９ 配列番号：２ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ １ ５ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｘｘｘ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ １０ １５ 配列番号：３ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｘｘｘ Ｇｌｎ Ｐｒｏ １ ５ 配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ １ ５ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ １０ １５ Ｌｙｓ Ｉｌｅ ２０ 配列番号：５ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ １ ５ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ １０
【図１】図１は、ヒト型抗体の肺腺癌細胞株Ａ５４９と
の反応性を４０５ｎｍの吸光度で示した図である。
の反応性を４０５ｎｍの吸光度で示した図である。
【図２】図２は、ヒト型抗体の担癌ＳＣＩＤマウス腫瘍
部への集積性を腫瘍部への単位重量当たりの集積量
（Ｔ）の血液への単位重量当たりの集積量（Ｂ）に対す
る比（Ｔ／Ｂ）で表した図である。
部への集積性を腫瘍部への単位重量当たりの集積量
（Ｔ）の血液への単位重量当たりの集積量（Ｂ）に対す
る比（Ｔ／Ｂ）で表した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/574 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (7)
- 【請求項１】 工業技術院生命工学工業研究所に受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１２２号で寄託された細胞の特性
を有するハイブリドーマ２９Ｄ３８。 - 【請求項２】 ハイブリドーマ２９Ｄ３８が、以下の特
性を有する抗原： （１）該抗原は上記ハイブリドーマ２９Ｄ３８が産生す
るヒト型モノクローナル抗体によって結合され得： （２）該抗原が肺腺癌細胞株Ａ５４９株の細胞抽出物中
に含まれ、かつＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動上
で主要なバンドとして、分子量が非還元下で１００万以
上、還元下で２００００〜１２００００の間の複数の位
置に存在し： （３）該抗原が肺腺癌細胞株Ａ５４９株の核膜上に存在
し： （４）該抗原が肺癌患者癌組織中に存在する： を認識してなるＩｇＭヒト型モノクローナル抗体産生能
を有する請求項１記載のハイブリドーマ２９Ｄ３８。 - 【請求項３】 工業技術院生命工学工業研究所に受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１２２号で寄託された細胞の特性
を有するハイブリドーマ２９Ｄ３８が産生するヒト型モ
ノクローナル抗体。 - 【請求項４】 ヒト型モノクローナル抗体が、以下の特
性を有する抗原： （１）該抗原は上記ハイブリドーマ２９Ｄ３８が産生す
るヒト型モノクローナル抗体によって結合され得： （２）該抗原が肺腺癌細胞株Ａ５４９株の細胞抽出物中
に含まれ、かつＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動上
で主要なバンドとして、分子量が非還元下で１００万以
上、還元下で２００００〜１２００００の間の複数の位
置に存在し： （３）該抗原が肺腺癌細胞株Ａ５４９株の核膜上に存在
し： （４）該抗原が肺癌患者癌組織中に存在する： を認識してなるＩｇＭヒト型モノクローナル抗体である
請求項３記載のヒト型モノクローナル抗体。 - 【請求項５】 ヒト型モノクローナル抗体が、抗体軽鎖
として配列番号１記載のアミノ酸配列を含有する請求項
３に記載のヒト型モノクローナル抗体。 - 【請求項６】 請求項３に記載のヒト型モノクローナル
抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を主成分
とする癌検査薬。 - 【請求項７】 請求項３に記載のヒト型モノクローナル
抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を成分と
する癌治療薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7007819A JPH08196272A (ja) | 1995-01-23 | 1995-01-23 | ハイブリドーマ２９ｄ３８ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7007819A JPH08196272A (ja) | 1995-01-23 | 1995-01-23 | ハイブリドーマ２９ｄ３８ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08196272A true JPH08196272A (ja) | 1996-08-06 |
Family
ID=11676207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7007819A Withdrawn JPH08196272A (ja) | 1995-01-23 | 1995-01-23 | ハイブリドーマ２９ｄ３８ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08196272A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004504615A (ja) * | 2000-07-20 | 2004-02-12 | ジラ・インク | 形成異常の上皮組織を検出するための改良された診断方法 |
| JP2013522604A (ja) * | 2010-03-19 | 2013-06-13 | ザ ユニヴァーシティー オブ メルボルン | 多孔質歯科ハイドロキシアパタイトを検出するためのキットおよび方法 |
-
1995
- 1995-01-23 JP JP7007819A patent/JPH08196272A/ja not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004504615A (ja) * | 2000-07-20 | 2004-02-12 | ジラ・インク | 形成異常の上皮組織を検出するための改良された診断方法 |
| JP2013522604A (ja) * | 2010-03-19 | 2013-06-13 | ザ ユニヴァーシティー オブ メルボルン | 多孔質歯科ハイドロキシアパタイトを検出するためのキットおよび方法 |
| US11400027B2 (en) | 2010-03-19 | 2022-08-02 | Incisive Technologies Pty Ltd | Kit and method for detecting porous dental hydroxyapatite |
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