JPH08191689A - Polydeoxyribonucleotide for manifesting human/gamma/ interferon-like polypeptide - Google Patents
Polydeoxyribonucleotide for manifesting human/gamma/ interferon-like polypeptideInfo
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子工学によるヒト・
ガンマ・インターフェロン様ポリペプチド(以下γ−I
FNと略称する)の製造に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention
Gamma interferon-like polypeptide (hereinafter γ-I
FN).
【0002】本明細書に開示する化学合成DNA分子
は、アミノ酸順序と組成とがヒト・ガンマ・インターフ
ェロンと実質的に一致し、かつヒト・ガンマ・インター
フェロンの免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリ
ペプチドを暗号化するDNA順序を特徴とする。The chemically synthesized DNA molecules disclosed herein are substantially identical in amino acid sequence and composition to human gamma interferon and possess the immunological or biological activity of human gamma interferon. It is characterized by a DNA sequence that encodes the polypeptide.
【0003】[0003]
【従来の技術】インターフェロンは細胞に抗ビールス状
態を誘発し、また抗腫瘍性を示すといわれているたん白
質でアルファ,ベータ,ガンマの3群に分類されてい
る。2. Description of the Related Art Interferon induces antiviral activity in cells and is said to exhibit antitumor properties, and is classified into three groups, alpha, beta and gamma.
【0004】γ−IFNについては、メッセンジャーR
NAから逆転写酵素によって造った遺伝子を用いて遺伝
子工学的手法によりγ−IFNを生成させることが報告
されている(Nature 295,503,198
2)が遺伝子の配列がメッセンジャーRNAによって規
定されているため宿主細胞に適したコドンを選ぶことが
できないなどの欠点がある。For γ-IFN, Messenger R
It has been reported that γ-IFN is produced by a genetic engineering technique using a gene produced by reverse transcriptase from NA (Nature 295 , 503, 198).
2) has a drawback that the codon suitable for the host cell cannot be selected because the gene sequence is defined by the messenger RNA.
【0005】[0005]
【発明が解決しようとする課題】γ−IFN遺伝子を化
学的に合成すれば上記の欠点を克服でき、また任意に制
限酵素切断部位を付加することによりキメリックなポリ
ペプチドの造成も可能と考えられるが、該遺伝子は数百
塩基対で構成されるため合成が容易でない。It is considered that the above-mentioned drawbacks can be overcome by chemically synthesizing the γ-IFN gene, and a chimeric polypeptide can be constructed by arbitrarily adding a restriction enzyme cleavage site. However, since the gene is composed of several hundred base pairs, it is not easy to synthesize.
【0006】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らはこの困難に
挑んでγ−IFN遺伝子の合成に成功し、この遺伝子を
用いて遺伝子工学的手法によりγ−IFNの製造する方
法を開拓した。Means for Solving the Problems The present inventors have solved this difficulty and succeeded in synthesizing the γ-IFN gene, and have pioneered a method for producing γ-IFN using this gene by a genetic engineering technique.
【0007】本発明は下記ヌクレオチド配列を有するポ
リデオキシリボヌクレオチド 1 Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys TGC TAC TGC CAG GAC CCA TAC GTG AAG ACG ATG ACG GTC CTG GGT ATG CAC TTC 10 Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe GAA GCT GAA AAC CTG AAG AAA TAC TTC CTT CGA CTT TTG GAC TTC TTT ATG AAG 20 Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp AAC GCT GGT CAT TCT GAC GTT GCT GAC TTG CGA CCA GTA AGA CTG CAA CGA CTG 30 Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu AAC GGT ACT CTG TTC CTG GGT ATC CTG TTG CCA TGA GAC AAG GAC CCA TAG GAC 40 Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg AAA AAC TGG AAA GAA GAA TCT GAC CGT TTT TTG ACC TTT CTT CTT AGA CTG GCA 50 Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser AAA ATC ATG CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTT TAG TAC GTC AGA GTC TAG CAA AGA 60 Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe TTC TAC TTC AAG CTG TTC AAA AAC TTC AAG ATG AAG TTC GAC AAG TTT TTG AAG 70 Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser AAG GAC GAC CAG TCT ATC CAG AAA TCT TTC CTG CTG GTC AGA TAG GTC TTT AGA 80 Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn GTT GAA ACT ATC AAG GAA GAC ATG AAC CAA CTT TGA TAG TTC CTT CTG TAC TTG 90 Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys GTT AAG TTC TTC AAC TCT AAC AAG AAA CAA TTC AAG AAG TTG AGA TTG TTC TTT Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr AAG CGT GAC GAC TTC GAA AAG CTT ACT TTC GCA CTG CTG AAG CTT TTC GAA TGA 100 Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val AAC TAC TCT GTT ACT GAC CTT AAT GTA TTG ATG AGA CAA TGA CTG GAA TTA CAT 110 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile CAG CGT AAA GCT ATC CAT GAA CTG ATC GTC GCA TTT CGA TAG GTA CTT GAC TAG 120 Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala CAG GTT ATG GCT GAA CTG TCC CCG GCT GTC CAA TAC CGA CTT GAC AGG GGC CGA 130 Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser GCT AAA ACT GGT AAG CGT AAA AGA TCT CGA TTT TGA CCA TTC GCA TTT TCT AGA 140 Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala CAG ATG CTG TTC CGT GGT CGT CGT GCT GTC TAC GAC AAG GCA CCA GCA GCA CGA 146 Ser Gln TCT CAG AGA GTC およびそれが組み込まれたプラスミド、ならびにこのプ
ラスミドで形質転換されたエシエリシア・コリに属する
菌株に関する。[0007] The present invention relates to a polydeoxyribonucleotide having the following nucleotide sequence: 1 Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys TGC TAC TGC CAG GAC CCA TAC GTG AAG ACG ATG AGC TGC GTC GTC ATC GTC ATC GTC ATC tyr Phe GAA GCT GAA AAC CTG AAG AAA TAC TTC CTT CGA CTT TTG GAC TTC TTT ATG AAG 20 Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp AAC GCT GGT CAT TCT GAC GTT GCT GAC TTG CGA CCA GTA AGA CTG CAA CGA CTG 30 Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu AAC GGT ACT CTG TTC CTG GGT ATC CTG TTG CCA TGA GAC AAG GAC CCA TAG GAC 40 Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg AAA AAC TGG AAA GAA GAA TCT GAC CGT TTT TTG ACC TTT CTT CTT AGA CTG GCA 50 Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser AAA ATC ATG CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTT TAG TAC GTC AGA GTC TAG CAA AGA 60 Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe TTC TAC TTC AAG CTG TTC AAA AAC TTC AAG ATG AAG TTC GAC AAG TTT TTG AAG 70 Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser AAG GAC GAC CAG TCT ATC CAG AAA TCT TTC CTG CTG GTC AGA TAG GTC TTT AGA 80 Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn GTT GAA ACT ATC AAG GAA GAC ATG AAC CAA CTT TGA TAG TTC CTT CTG TAC TTG 90 Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys GTT AAG TTC TTC AAC TCT AAC AAG AAA CAA TTC AAG AAG TTG AGA TTG TTC TTT Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr AAG CGT GA GAC TTC GAA AAG CTT ACT TTC GCA CTG CTG AAG CTT TTC GAA TGA 100 Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val AAC TAC TCT GTT ACT GAC CTT AAT GTA TTG ATG AGA CAA TGA CTG GAA TTA CAT 110 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile CAG CGT AAA GCT ATC CAT GAA CTG ATC GTC GCA TTT CGA TAG GTA CTT GAC TAG 120 Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala CAG GTT ATG GCT GAA CTG TCC CCG GCT GTC CAA TAC CGA CTT GAC AGG GGC CGA 13 Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser GCT AAA ACT GGT AAG CGT AAA AGA TCT CGA TTT TGA CCA TTC GCA TTT TCT AGA 140 Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala CAG ATG CTG TTC CGT GGT CGT CGT GCT GTC TAC GAC AAG The present invention relates to GCA CCA GCA GCA CGA 146 Ser Gln TCT CAG AGA GTC and a plasmid incorporating the same, and a strain belonging to Escherichia coli transformed with the plasmid.
【0008】上記のポリデオキシリボヌクレオチドの好
ましい例としては、図2に示される1−146のアミノ
酸配列をコードする配列を有し、5′−末端にATGの
ような翻訳開始コード、3′末端にTAAのような翻訳
終止コードを有するものが挙げられる。A preferred example of the above polydeoxyribonucleotide has a sequence encoding the amino acid sequence of 1-146 shown in FIG. 2 and has a translation initiation code such as ATG at the 5'-terminal and a 3'-terminal Those having a translation termination code such as TAA are mentioned.
【0009】遺伝子操作の便宜上、翻訳開始および終止
コードの各末端に制限酵素により切断されるヌクレオチ
ド配列を付加するのがよく、その好ましい例は5′末側
にEcoRIで切断されるヌクレオチド配列、3′末側
にSalIで切断されるヌクレオチド配列を付加したも
のである。For convenience of genetic manipulation, it is preferable to add a nucleotide sequence cleaved by a restriction enzyme to each end of the translation initiation and termination codes, and a preferred example thereof is a nucleotide sequence cleaved with EcoRI at the 5'end. The nucleotide sequence to be cleaved with SalI is added to the ′ -terminal side.
【0010】上記のポリデオキシリボヌクレオチドは、
たとえば次のようにして合成することができる。先ず図
1に示される62個の遺伝子断片(オリゴデオキシリボ
ヌクレオチド)をそれ自体公知の改良トリエステル法お
よび固相法を用いて合成し、次にこれらの断片をT4リ
ガーゼを用いて結合し完全なγ−IFN遺伝子(図2参
照)とする。この合成遺伝子には図7に示すように制限
酵素切断部位が含まれている。これは活性部位構造の探
索やキメリックな遺伝子の造成を容易にするためであ
る。The above polydeoxyribonucleotides are
For example, they can be synthesized as follows. First, the 62 gene fragments (oligodeoxyribonucleotides) shown in FIG. 1 were synthesized using the modified triester method and the solid-phase method known per se, and then these fragments were ligated with T4 ligase to obtain complete DNA fragments. γ-IFN gene (see FIG. 2). This synthetic gene contains a restriction enzyme cleavage site as shown in FIG. This is to facilitate the search for the active site structure and the construction of chimeric genes.
【0011】次いで、上記の遺伝子をベクタープラスミ
ドに組み込む。その操作の一例は下記のようである。先
ずエシエリシア・コリのラクトースオペロンのプロモー
ター領域(9g塩基対)をpBR322のEcoRIお
よびClaI切断部位に挿入したプラスミドpKO70
3を造成し、該プラスミドのEcoRIとSalI切断
部位に図2に示される5′末側にEcoRI、3′末側
にSalI切断部位をもつ合成遺伝子を挿入してプラス
ミドpGIFを造成する(図9参照)。Next, the above gene is incorporated into a vector plasmid. An example of the operation is as follows. First, a plasmid pKO70 in which the promoter region (9 g base pairs) of the lactose operon of Escherichia coli was inserted into the EcoRI and ClaI cleavage sites of pBR322.
3 is constructed, and a synthetic gene having EcoRI at the 5'end and a SalI cleavage site at the 3'end shown in FIG. 2 is inserted into the EcoRI and SalI cleavage sites of the plasmid to construct the plasmid pGIF (FIG. 9). reference).
【0012】所望により、γ−IFN遺伝子以外の遺伝
子を上記切断部位に挿入したプラスミドを造成し、この
プラスミドで形質転換した宿主細胞を培養すれば、ラク
トースプロモーターの支配下に該遺伝子による生産物を
生成させることができるので有利である。If desired, a plasmid in which a gene other than the γ-IFN gene is inserted into the above-mentioned cleavage site is constructed, and a host cell transformed with this plasmid is cultured, whereby the product of the gene can be obtained under the control of the lactose promoter. Advantageously, it can be produced.
【0013】宿主細胞としては、エシエリシア・コリに
属する菌株が用いられる。前記のように得たプラスミド
pGIFを用いてエシエリシア属の菌株に形質転換す
る。菌株としてエシエリシア・コリWA802を用いた
場合、形質転換株WA802/pGIFが得られ、同株
はアンピシリン耐性(Ampr )およびテトラサイクリ
ン感受性(Tets )を有するので、それを利用して非
形質転換菌より分離することができる。As a host cell, a strain belonging to Escherichia coli is used. Using the plasmid pGIF obtained as described above, a strain of the genus Escherichia is transformed. When Escherichia coli WA802 is used as the strain, a transformed strain WA802 / pGIF is obtained, which has ampicillin resistance (Amp r ) and tetracycline sensitivity (Tet s ). Can be more separated.
【0014】この形質転換株をたとえばL−ブロスのよ
うな培地中でイソプロピル−β−D−チオガラクトピラ
ノシドを用いて誘導培養すると得られる菌体内にインタ
ーフェロン活性物質が生産される。When this transformant is induced and cultured in a medium such as L-broth using isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, an interferon active substance is produced in the cells obtained.
【0015】なお、エシエリシア・コリWA802/p
GIF4はSBMG105の識別表示を付して工業技術
院微生物工業研究所に寄託され、受託番号微工研菌寄第
6522号を付されている。In addition, Escherichia coli WA802 / p
GIF4 is deposited with the identification label of SBMG105 at the Institute of Microbial Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and has the accession number No. 6522 of the microbe lab.
【0016】[0016]
【実施例】以下実施例の形で本発明の態様を説明する
が、エシエリシア・コリは大腸菌と記載されている。EXAMPLES The embodiments of the present invention will be described below in the form of examples, in which Escherichia coli is described as Escherichia coli.
【0017】 実施例 γ−IFN遺伝子フラグメントの化学合成 図1に示したそれぞれF1 〜F62と名付けた62個のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドの化学合成は、以下に述
べる改良を除いては、基本的にはKen−ichi M
iyoshi等により報告されている固相法〔Ken−
ichi Miyoshi et al(1980)N
ucl.Acids Res.8 5507〕を用い
た。EXAMPLE Chemical Synthesis of γ-IFN Gene Fragment The chemical synthesis of 62 oligodeoxyribonucleotides, designated F 1 to F 62 , respectively, shown in FIG. Is Ken-ichi M
The solid-phase method reported by Iyoshi et al. [Ken-
Ichi Miyoshi et al (1980) N
ucl. Acids Res. 8 5507] was used.
【0018】この改良技術によるオリゴデオキシリボヌ
クレオチドの化学合成の概略は以下のごとくである。 a) 先ず図3に示す様にアミノメチル化ポリスチレン
樹脂に3′末端モノヌクレオシド、ユニットを固定化す
ることからはじめた。すなわち図3に示したアミノメチ
ル化ポリスチレン樹脂は1%ジビニルベンゼンで架橋
した樹脂を用い、この樹脂にβ−アラニンを2個連結し
た樹脂を合成した。この樹脂に3種類(Bはチミン,
N−ベンゾイルシトシン又はN−イソブチリルグアニ
ン)の化合物を作用させることにより、3種類の3′
末端ヌクレオサイドを樹脂に固定化した。ポリスチレン
樹脂を得た。The outline of the chemical synthesis of oligodeoxyribonucleotides according to this improved technique is as follows. a) First, as shown in FIG. 3, the procedure was started by immobilizing a 3 ′ terminal mononucleoside and a unit on an aminomethylated polystyrene resin. That is, a resin crosslinked with 1% divinylbenzene was used as the aminomethylated polystyrene resin shown in FIG. 3, and a resin in which two β-alanines were linked to this resin was synthesized. This resin has three types (B is thymine,
N-benzoylcytosine or N-isobutyrylguanine) to act on the 3 '
The terminal nucleoside was immobilized on the resin. A polystyrene resin was obtained.
【0019】この樹脂の合成法の例を図3中BはN−
イソブチリルグアニンの場合について示せば次の通りで
ある。アミノメチル化ポリスチレン・HCl(ジビニル
ベンゼン1%,100〜200メッシュ,NH2 :0.
63mmole/g)樹脂20gをCH2 Cl2 100
mlでよく膨潤させた後、N−t−BOC−β−アラニ
ン(1.34g,15.1mmole)を加え、DCC
(3.1l,15.1mmole)を用いて室温3時間
縮合した。樹脂をガラスフィルターでろ別した後、CH
2 Cl2 200mlで2回,DMF150mlで3回,
次いでピリジン100mlで3回洗う。次に25%の無
水酢酸−ピリジン100mlで1時間樹脂を処理するこ
とにより未反応アミノ基をアセチル化した。次の樹脂を
20%CF3 COOH−CH2 Cl2 120mlで室温
30分処理することによりt−BOC基を除去、次いで
5%トリエチルアミン−CH2 Cl2 200mlで樹脂
を洗浄し、さらにCH2 Cl2 100mlで4回樹脂を
洗った。同様の操作をもう一度くり返すことにより、図
32の樹脂すなわち、アミノメチル化ポリスチレン樹脂
にβ−alanineが2個連結した樹脂を得た。ここ
で得た樹脂(図3)10gをDMF60mlにけんだ
くし、図3化合物(BはN−イソブチリルグアニン)
11mmoleとトリエチルアミン1mlを加え室温1
2時間振盪した。反応後、樹脂をろ別し、DMF、続い
てピリジンで洗った後、10%フェニルイソシアナート
ピリジン150mlで3時間樹脂を処理することによ
り、未反応アミノ基を保護し、続いて樹脂をピリジン,
メタノールで洗った後P2 O5 存在下、減圧乾燥するこ
とにより、図3樹脂(BはN−イソブチリルグアニ
ン)を得た。An example of the method for synthesizing this resin is shown in FIG.
The case of isobutyrylguanine is as follows. Aminomethylated polystyrene.HCl (divinylbenzene 1%, 100 to 200 mesh, NH 2 : 0.
63 mmole / g) 20 g of resin was added to CH 2 Cl 2 100
After swelling well with mL, Nt-BOC-β-alanine (1.34 g, 15.1 mmole) was added, and DCC was added.
(3.1 l, 15.1 mmole) was used for condensation at room temperature for 3 hours. After separating the resin with a glass filter, CH
2 Cl 2 200 ml twice, DMF 150 ml 3 times,
It is then washed 3 times with 100 ml of pyridine. Next, unreacted amino groups were acetylated by treating the resin with 100 ml of 25% acetic anhydride-pyridine for 1 hour. Removing the t-BOC group by treatment at room temperature for 30 minutes the following resin 20% CF 3 COOH-CH 2 Cl 2 120ml, then the resin was washed with 5% triethylamine -CH 2 Cl 2 200ml, further CH 2 Cl 2 The resin was washed 4 times with 100 ml. By returning again repeated the same operation, the resin i.e. in Fig 3 2, beta-alanine to aminomethylated polystyrene resin was obtained two linked resin. 10 g of the resin obtained here (Fig. 3) was added to 60 ml of DMF to give the compound of Fig. 3 (B is N-isobutyrylguanine).
11 mmole and 1 ml of triethylamine were added and room temperature 1
Shake for 2 hours. After the reaction, the resin was filtered off, washed with DMF and then with pyridine, and then treated with 150 ml of 10% phenyl isocyanatopyridine for 3 hours to protect the unreacted amino groups.
After washing with methanol and drying under reduced pressure in the presence of P 2 O 5 , the resin in FIG. 3 (B is N-isobutyrylguanine) was obtained.
【0020】ここで得られた樹脂(図3、BはN−イ
ソブチリルグアニン)の一部をM.J.Gaitらの方
法〔M.J.Gait et al,(1980)Nu
cl.Acids Res.8 1081〕を用いて樹
脂1gに固定化されている3′末端ヌクレオサイドの量
を定量したところ、0.12mmoleであった。樹脂
(Bはチミン又はN−ベンゾイルシトシン)も上記合
成法と同様な方法で製造した。樹脂の1gに固定化さ
れている3′末端ヌクレオシドの量はBがチミンの場合
0.126mmole、BがN−ベンゾイルシトシンの
場合0.125mmoleであった。 b) ここで得られた3種類の樹脂と図4に示した
3′燐酸ジエステルダイマーブロック(図4nは0)及
び3′燐酸ジエステルトリマーブロック(図4nは1)
を用い、一定の塩基配列を持ったF1 〜F62からなる6
2個のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。即
ち、樹脂のジメトキシトリチル基(以下DMTrと
略)を10%トリクロル酢酸(以下TCAと略)−CH
Cl3 で処理することによりDMTr基を除去した後、
樹脂に固定化されている3′ヌクレオシドユニット1
当量に対し、3′燐酸ジエステルダイマー(図4nは
0)4当量、又は3′燐酸ジエステルトリマー(図4、
nは1)3当量を逐次、縮合剤メシチレンスルホニルテ
トラゾリド(MsTe)20〜50当量を用いて縮合し
た。過剰の3′燐酸ジエステルブロック及び縮合剤は、
ガラスフィルターで反応混合物をろ化することにより容
易に除去することができる。A portion of the resin obtained here (FIG. 3, B is N-isobutyrylguanine) was J. Gait et al. [M. J. Gait et al, (1980) Nu
cl. Acids Res. 8 1081] Quantitative determination of the amount of 3 'end Nukureosaido immobilized on resin 1g was used was 0.12 mmole. Resin (B is thymine or N-benzoylcytosine) was also produced in the same manner as in the above synthesis method. The amount of the 3'-terminal nucleoside immobilized on 1 g of the resin was 0.126 mmole when B was thymine, and 0.125 mmole when B was N-benzoylcytosine. b) The three types of resins obtained here and the 3'-phosphoric diester dimer block shown in FIG. 4 (0 in FIG. 4n) and the 3'-phosphoric diester trimer block (1 in FIG. 4n).
6 consisting of F 1 to F 62 having a fixed base sequence
Two oligodeoxyribonucleotides were synthesized. That is, a 10% trichloroacetic acid (hereinafter abbreviated as TCA) -CH
After removing the DMTr group by treating with Cl 3 ,
3 'nucleoside unit 1 immobilized on resin
4 equivalents of 3 'phosphoric acid diester dimer (0 in FIG. 4n) or 3' phosphoric acid diester trimer (FIG.
For n, 1) 3 equivalents were sequentially condensed using 20 to 50 equivalents of the condensing agent mesitylenesulfonyltetrazolide (MsTe). Excess 3 'phosphoric diester block and condensing agent
The reaction mixture can be easily removed by filtration with a glass filter.
【0021】次に未反応5′水酸基を保護する為に、樹
脂を10%無水酢酸−ピリジンで室温1時間処理するか
又は、10%無水酢酸−ピリジン10mlに対し、4−
ジメチルアミノピリジン(DMAP)20mgを加えた
溶液で室温30分処理することにより未反応5′水酸基
をアセチル化した。次に樹脂を10%TCAで処理する
ことにより5′末端DMTr基を除去し、次の縮合反応
を行った。このような操作を所望の長さが得られるまで
くり返した。Next, in order to protect the unreacted 5 'hydroxyl group, the resin is treated with 10% acetic anhydride-pyridine for 1 hour at room temperature, or the resin is treated with 10 ml of 10% acetic anhydride-pyridine in 10 ml.
The unreacted 5 'hydroxyl group was acetylated by treating with a solution containing 20 mg of dimethylaminopyridine (DMAP) at room temperature for 30 minutes. Next, the 5 ′ terminal DMTr group was removed by treating the resin with 10% TCA, and the following condensation reaction was performed. This operation was repeated until the desired length was obtained.
【0022】この一連の操作の例をF16フラグメントの
合成について示せば次の通りである。図3樹脂(Bは
N−イソブチリルグアニン)200mgを10%TCA
−CHCl3 20mlで30秒、3回処理することによ
り樹脂のDMTr基を除去した樹脂を得た。この樹
脂に3′燐酸ダイマーブロック、CA,(図4、n=
0,B1 はN−ベンゾイルシトシン、B3 はN−ベンゾ
イルアデニン)96μmoleを加えピリジン3mlと
3回共沸をくり返した後、ピリジン2mlにけんだくさ
せ、縮合剤MsTe 1mmoleを用いて室温2時間
縮合反応を行った。反応後、過剰の3′燐酸ダイマー及
び縮合剤は反応混合物をガラスフィルターを用いてろ別
した後、得られる樹脂をピリジンでよく洗うことにより
容易に除去できる。次に未反応5′水酸基を保護する為
に樹脂を10%無水酢酸−ピリジン20mlにけんだく
させ室温1時間振盪した。反応後、樹脂をグラスフィル
ターを用いてろ別し、ピリジン、続いてCHCl3 でよ
く洗う。次に樹脂を10%TCA−CHCl3 20ml
で30秒、3回処理することにより樹脂よりDMTr基
を除去した。次に樹脂をCHCl3 続いてピリジンでよ
く洗った後、同様にして所望の長さが得られるまでブロ
ック縮合を繰り返した。すなわちF−16のオリゴデオ
キシリボヌクレオチドを合成する為には、ひきつづき次
の3′燐酸ダイマーブロック、CC,TA,GA,T
C,を順次用い、縮合反応をくり返すことによりF−1
6の塩基配列をもつ完全保護したオリゴデオキシリボヌ
クレオチド樹脂を得た。同様にして他のフラグメントF
1 〜F15及びF17〜F62の各フラグメントもヌクレオチ
ドの組合せを変えるほかは上記と同様な方法を用いて製
造した。An example of this series of operations for synthesizing the F 16 fragment is as follows. Figure 3 200 mg of resin (B is N-isobutyrylguanine) was added to 10% TCA
-CHCl 3 20 ml in 30 seconds, to obtain a resin to remove the DMTr group of the resin by treating three times. This resin has 3'phosphate dimer block, CA, (Fig. 4, n =
0, B 1 is N- benzoyl cytosine, B 3 after was repeated N- benzoyl adenine) 96Myumole was added pyridine 3ml azeotroped three times, Kusase's Ken pyridine 2 ml, 2 hours at room temperature using a condensing agent MsTe 1 mmole A condensation reaction was performed. After the reaction, the excess 3'phosphate dimer and the condensing agent can be easily removed by filtering the reaction mixture with a glass filter and washing the resulting resin well with pyridine. Next, in order to protect the unreacted 5'hydroxyl group, the resin was suspended in 20 ml of 10% acetic anhydride-pyridine and shaken at room temperature for 1 hour. After the reaction, the resin is filtered off using a glass filter, and washed thoroughly with pyridine and then with CHCl 3 . Next, the resin was added to 20 ml of 10% TCA-CHCl 3
The DMTr group was removed from the resin by treating with a resin for 3 seconds for 30 seconds. The resin was then washed well with CHCl 3 followed by pyridine, and the block condensation was repeated in the same manner until the desired length was obtained. That is, in order to synthesize the oligodeoxyribonucleotide of F-16, the following 3 ′ phosphate dimer block, CC, TA, GA, T
C-1 is sequentially used, and F-1 is obtained by repeating the condensation reaction.
A completely protected oligodeoxyribonucleotide resin having a base sequence of 6 was obtained. Similarly, the other fragment F
1 to F 15 and F 17 each fragment to F 62 also other changing the combination of the nucleotides were prepared using the same way as described above.
【0023】c) この様にして得た一定の塩基配列を
もって完全保護したオリゴデオキシリボヌクレオチドの
樹脂からの切り出し及び完全脱保護反応は、樹脂を濃ア
ンモニア水−ピリジン(2:1v/v)で55℃10時
間、つづいて80%酢酸で室温10分処理することによ
り得た(方法A)。しかしながらフラグメント、F2 ,
F3 ,F5 ,F7 〜F10,F22〜F24,F26,F29,F
30,F33〜F42,F53〜F55,F57〜F62,はこの脱保
護条件では得ることができなかった。そこで、これらの
フラグメントについてReeseらの方法〔C.B.R
eese,etal,(1981),Nucl.Aci
ds Res.9,4611〕を用いて完全脱保護した
(方法B)。C) Cleavage of the oligodeoxyribonucleotide completely protected with a certain base sequence thus obtained from the resin and the complete deprotection reaction, the resin is treated with concentrated aqueous ammonia-pyridine (2: 1 v / v) to 55%. It was obtained by treating at 10 ° C. for 10 hours, then at room temperature for 10 minutes with 80% acetic acid (method A). However, the fragment, F 2 ,
F 3, F 5, F 7 ~F 10, F 22 ~F 24, F 26, F 29, F
30 , F 33 to F 42 , F 53 to F 55 , and F 57 to F 62 could not be obtained under this deprotection condition. Therefore, these fragments were used for the method of Reese et al. [C. B. R
eese, et al, (1981), Nucl. Aci
ds Res. 9 , 4611] (Method B).
【0024】これらの脱保護反応操作をフラグメントF
16及びF26について記せば次のごとくである。These deprotection reactions were carried out using fragment F
If Write down the 16 and F 26 are as follows.
【0025】方法A:フラグメントF16の樹脂50mg
をピリジン1mlと濃アンモニア水2mlで封管中55
℃,10時間振盪した後、樹脂をろ別、ろ液を減圧下濃
縮する。得られた残渣にトルエンを加え共沸をくり返す
ことによりピリジンを除く。次に、残渣に80%酢酸2
mlを加え室温10分処理することにより完全脱保護し
たオリゴデオキシリボヌクレオチドを得た。Method A: 50 mg of fragment F 16 resin
In a sealed tube with 1 ml of pyridine and 2 ml of concentrated ammonia water.
After shaking at ℃ for 10 hours, the resin is filtered off and the filtrate is concentrated under reduced pressure. Toluene is added to the obtained residue and azeotropic distillation is repeated to remove pyridine. Next, 80% acetic acid 2 was added to the residue.
The resulting mixture was treated at room temperature for 10 minutes to obtain oligodeoxyribonucleotides completely deprotected.
【0026】方法B:フラグメントF26の樹脂50mg
をジオキサン−水(7:1v/v)3.5mlに溶かし
た0.3Mの1,1,4,4,−テトラメチルグアニジ
ウム 2−ピリジンアルドキシメートで40℃48時間
処理した後、濃アンモニア水−ピリジン(2:1v/
v)3mlで封管中55℃,10時間処理した。続いて
80%酢酸2mlで室温20分処理することにより、完
全脱保護したオリゴデオキシリボヌクレオチドを得た。[0026] Method B: resin 50mg of fragments F 26
Was treated with 0.3 M 1,1,4,4, -tetramethylguanidinium 2-pyridinealdoximate dissolved in 3.5 ml of dioxane-water (7: 1 v / v) at 40 ° C. for 48 hours, Concentrated aqueous ammonia-pyridine (2: 1 v /
v) Treated with 3 ml in a sealed tube at 55 ° C. for 10 hours. Subsequently, treatment with 2 ml of 80% acetic acid at room temperature for 20 minutes gave oligodeoxyribonucleotides completely deprotected.
【0027】d) 最終産物の分離、精製は高性能液体
クロマトグラフィー(HPLC)を用いて行った。この
HPLCはALTEX model 110A液体クロ
マトグラフを使用し、溶媒A(20%CH3 CN−1m
MKH2 PO4 ,pH6.5)と溶媒B(20%CH
3 CN−500m MKH2 PO4 ,pH6.5)によ
る直線濃度勾配法を用い、Partisil 10 S
AX(Whatman)カラム(φ4.6×250m
m)で化合物を分離、精製した。溶媒Aから開始し、1
分毎に3%の溶媒Bを加えることにより、勾配をつけ
た。溶出は58℃で、1分当り2mlの流速で行った。
目的とするピークのものを集め、透析により脱塩し、凍
結乾燥した。この様にして得たF1 〜F62の62個の完
全脱保護したオリゴデオキシリボヌクレオチドの均一性
(homogeneity)は、T4ポリヌクレオチド
キナーゼを用い、〔γ−32P〕ATPで5′末端を標識
した後、20%ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動
によりチェックした。又、各々のオリゴデオキシリボヌ
クレオチドの塩基配列は、T4 ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用い、〔γ−32P〕ATPで5′末端を標識した
後、ヌクレアーゼを用いて部分水解したものを、セルロ
ーズアセテートを用いるpH3.5の電気泳動とDEA
E−セルローズによるホモクロマトグラフィーを行って
得られる二次元マッピング法で確認した〔Bambar
a,J.E.et al(1974)Nucl.Aci
des.Res.1881〕。D) Separation and purification of the final product was carried out using high performance liquid chromatography (HPLC). This HPLC uses an ALTEX model 110A liquid chromatograph, and uses a solvent A (20% CH 3 CN-1m
MKH 2 PO 4 , pH 6.5 and solvent B (20% CH)
Partisil 10 S using a linear concentration gradient method with 3 CN-500m MKH 2 PO 4 , pH 6.5).
AX (Whatman) column (φ4.6 × 250m
The compound was separated and purified in m). Starting with solvent A, 1
A gradient was added by adding 3% solvent B every minute. Elution was performed at 58 ° C. with a flow rate of 2 ml per minute.
The target peak was collected, desalted by dialysis, and freeze-dried. The homogeneity of the thus obtained 62 completely deprotected oligodeoxyribonucleotides F 1 to F 62 was determined by labeling the 5 ′ end with [γ- 32 P] ATP using T4 polynucleotide kinase. After that, it was checked by electrophoresis on a 20% polyacrylamide gel. The base sequence of each oligodeoxyribonucleotide is T4 After labeling the 5 'end with [γ- 32 P] ATP using polynucleotide kinase, the partially hydrolyzed product using nuclease was subjected to pH 3.5 electrophoresis using cellulose acetate and DEA.
It was confirmed by a two-dimensional mapping method obtained by performing homochromatography using E-cellulose [Bambar
a, J. E. FIG. et al (1974) Nucl. Aci
des. Res. 1 881].
【0028】γ−IFN遺伝子フラグメントのリゲーシ
ョン 化学合成した前記の62のオリゴデオキシリボヌクレオ
チドのフラグメント(1〜62)を図5に示したリゲー
ション計画に従って450塩基対からなるγ−IFNに
相当する遺伝子(図2)をリゲーションした。以下詳細
に示す。 Ligase of γ-IFN gene fragment
The chemically synthesized 62 oligodeoxyribonucleotide fragments (1-62) were ligated with a gene corresponding to γ-IFN consisting of 450 base pairs (FIG. 2) according to the ligation plan shown in FIG. Details are shown below.
【0029】〔A〕から〔F〕ブロックの合成を行っ
た。各ブロックの5′末端にあるフラグメント(1,1
4,15,24,25,32,33,44,45,5
4,55,62)を除く残りの50フラグメントそれぞ
れ1nmolを22μlの蒸留水に溶解し、90℃で2
分間加熱後、直ちに0℃に冷却した。この水溶液に5μ
Ciの〔γ−32P〕ATP(5100Ci/mmol)
を加え、溶液を70mMトリス塩酸(pH7.5)10
mM MgCl2 キナーゼ緩衝液となる様に調整し、3
単位のポリヌクレオチドキナーゼを加え全容量を30μ
lとした。37℃で15分間反応することにより5′末
端を32Pでラベルした。次にすべての5′末端をリン酸
化する為に4nmolのATPと3単位のポリヌクレオ
チドキナーゼを追加し37℃で45分間反応させ、90
℃で5分間加熱することにより反応を止めた。上記のリ
ン酸化した2から13及びリン酸化していない1及び1
4(Aブロック),リン酸化した16から23及びリン
酸化していない15及び24(Bブロック),リン酸化
した26から31及びリン酸化していない25及び32
(Cブロック),リン酸化した34から43及びリン酸
化していない33及び44(Dブロック),リン酸化し
た46から53及びリン酸化していない45及び54
(Eブロック),リン酸化した56から61及びリン酸
化していない55及び62(Fブロック)をそれぞれ
2.1μgを混合し透析チューブに入れ蒸留水に対して
4℃で16時間透析し、未反応ATP及びキナーゼ緩衝
液成分を除いた。この各A〜Fブロックの透析したDN
A溶液を濃縮乾固し、14.5μlのリガーゼ緩衝液
(20mMトリス塩酸,pH7.6,10mM MgC
l2 )に溶解した。Blocks [A] to [F] were synthesized. The fragment (1,1) at the 5 'end of each block
4,15,24,25,32,33,44,45,5
(4, 55, 62), 1 nmol of each of the remaining 50 fragments was dissolved in 22 μl of distilled water, and dissolved at 90 ° C. for 2 minutes.
After heating for 1 minute, it was immediately cooled to 0 ° C. 5μ in this aqueous solution
[Γ- 32 P] ATP of Ci (5100 Ci / mmol)
Was added, and the solution was treated with 10 mM 70 mM Tris-HCl (pH 7.5).
Adjust to be mM MgCl 2 kinase buffer,
Add a unit of polynucleotide kinase to a total volume of 30μ
l. The 5 'end was labeled with 32 P by reacting at 37 ° C. for 15 minutes. Next, in order to phosphorylate all 5'ends, 4 nmol of ATP and 3 units of polynucleotide kinase were added and reacted at 37 ° C for 45 minutes.
The reaction was stopped by heating at 5 ° C. for 5 minutes. Phosphorylated 2 to 13 above and unphosphorylated 1 and 1
4 (A block), phosphorylated 16 to 23 and unphosphorylated 15 and 24 (B block), phosphorylated 26 to 31 and unphosphorylated 25 and 32
(C block), phosphorylated 34 to 43 and unphosphorylated 33 and 44 (D block), phosphorylated 46 to 53 and unphosphorylated 45 and 54
(E block), phosphorylated 56 to 61 and non-phosphorylated 55 and 62 (F block) were mixed in an amount of 2.1 μg each and placed in a dialysis tube and dialyzed against distilled water at 4 ° C. for 16 hours. Reaction ATP and kinase buffer components were removed. The dialyzed DN of each of the A to F blocks
The A solution was concentrated to dryness and 14.5 μl of ligase buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgC
I 2 ).
【0030】この溶液を40μlガラス細管に入れ両端
を封管した後、20mlの水の入った16.5mm試験
管に入れ95℃で2分間加熱した。次に試験管ごと室温
に2時間放置し、DNAフラグメントをアニールさせた
後0℃に置いた。このDNA溶液をガラス細管より取り
出し、0.4mM ATP,10mM DTTを含むリ
ガーゼ緩衝溶液とし30単位のT4DNAリガーゼを加
え、全容量を80μlとして15℃で16時間反応させ
た。反応溶液を一部取り出し、7M尿素を含む14%ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行いラジオオートグラ
フでリゲーションの検討をした。その結果リゲーション
反応物の最大の大きさのものがそれぞれAからFの6ブ
ロックの目的物の大きさと一致した。次に上記のリゲー
ション反応物全量を7M尿素を含む14%ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により分離した。ラジオオートグラ
フによりAからFのそれぞれの位置を確認した後、その
部分のゲル片を切り出し、透析チューブに入れ、9mM
トリスほう酸(pH8.3,0.25mM EDTAを
含む)緩衝液(溶出緩衝液)を満たし、チューブの両端
をとじた後、溶出緩衝液中で200Vの定電圧で3時間
電気泳動することによりゲル中のDNAを溶出させた。
次にDNAを透析チューブより取り出し、凍結乾燥し
た。乾燥物を100μlの0.3M酢酸ナトリウム(p
H7.0)に溶解後2倍量のエタノールを加え−80℃
に30分間置いた後、遠心分離によりDNAを沈澱とし
て回収した。AからFブロックのDNA沈澱を20μl
の蒸留水に溶解後、その1μlを7M尿素を含む14%
ポリアクリルアミド電気泳動で検討した。その結果図1
0に示すように〔A〕から〔F〕までの各ブロックのD
NAの大きさに相当したほぼ均一のバンドが得られた。
A〜F各ブロックのDNA溶液をキナーゼ緩衝液の組成
となる様に調整し、2nmol ATP及び6単位のポ
リヌクレオチドキナーゼを加え37℃で1時間反応させ
各ブロックの5′末端をリン酸化した。〔A〕,
〔B〕,〔C〕各ブロックのDNA各20pmolを混
合し、リガーゼ緩衝液組成となる様に調整し、0.4m
M ATP,10mM DTTとなる様にATP及びD
TTを加え、全量を50μlとして、8単位のT4DN
Aリガーゼを用い15℃で16時間反応を行った。
〔D〕,〔E〕,〔F〕各ブロックのDNAも同様にそ
れぞれ5pmolを混合し、15℃で16時間リゲーシ
ョンを行った。反応終了後それぞれ反応物の一部をと
り、7M尿素を含む8%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動でリゲーションの検討をした。This solution was placed in a 40 μl glass capillary tube, which was sealed at both ends, then placed in a 16.5 mm test tube containing 20 ml of water, and heated at 95 ° C. for 2 minutes. Then, the test tube was left at room temperature for 2 hours to anneal the DNA fragment, and then placed at 0 ° C. The DNA solution was taken out from the glass tube, and a ligase buffer solution containing 0.4 mM ATP and 10 mM DTT was added. 30 units of T4 DNA ligase was added thereto, and the total volume was 80 μl, and the mixture was reacted at 15 ° C. for 16 hours. A part of the reaction solution was taken out, subjected to 14% polyacrylamide gel electrophoresis containing 7 M urea, and examined for ligation by radioautograph. As a result, the maximum size of the ligation reaction product was in agreement with the size of the 6-block target product of A to F, respectively. Next, the entire amount of the ligation reaction was separated by 14% polyacrylamide gel electrophoresis containing 7 M urea. After confirming each position from A to F by radio autograph, cut out the gel piece from that portion and put it in a dialysis tube.
After filling with Tris boric acid (pH 8.3, containing 0.25 mM EDTA) buffer (elution buffer), binding both ends of the tube, the gel was electrophoresed in the elution buffer at a constant voltage of 200 V for 3 hours. The DNA in was eluted.
Next, the DNA was taken out of the dialysis tube and freeze-dried. The dried product was added to 100 μl of 0.3 M sodium acetate (p
H7.0), add 2 volumes of ethanol, and add -80 ° C.
After 30 minutes, the DNA was recovered as a precipitate by centrifugation. 20 μl of DNA precipitates from blocks A to F
After dissolving in 1 ml of distilled water, 1 μl of the solution was
It was examined by polyacrylamide electrophoresis. As a result,
As shown in 0, D of each block from [A] to [F]
An almost uniform band corresponding to the size of NA was obtained.
The DNA solution of each of the blocks A to F was adjusted to have the composition of the kinase buffer, 2 nmol ATP and 6 units of polynucleotide kinase were added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour to phosphorylate the 5 ′ end of each block. [A],
[B], [C] 20 pmol of each DNA of each block were mixed, and adjusted so as to have a ligase buffer composition.
ATP and D to give M ATP, 10 mM DTT
Add TT to bring the total volume to 50 μl and add 8 units of T4DN
The reaction was performed at 15 ° C. for 16 hours using A ligase.
Similarly, 5 pmol of each of the DNAs of the blocks [D], [E] and [F] were mixed and ligated at 15 ° C. for 16 hours. After completion of the reaction, a part of each reaction product was taken, and the ligation was examined by 8% polyacrylamide gel electrophoresis containing 7 M urea.
【0031】その結果図11に示したように225bp
に相当する〔I〕及び〔II〕ブロックが合成されている
ことが判った。次に上記の反応溶液全量を7M尿素を含
む8%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し
た。ラジオオートグラフにより、225塩基対DNAを
確認した後、その部分のゲル片を切り出し、前述の電気
泳動溶出法にてDNAを溶出させた。DNA溶液を凍結
乾燥したのち、100μlの0.3M酢酸ナトリウム
(pH7.0)溶液に溶解後2.5倍量のエタノールを
加えてDNAを沈澱させた。得られたDNAに前述と同
様に0.5nmolATP及び3単位のポリヌクレオチ
ドキナーゼを加え、37℃で1時間反応させた。〔I〕
〔II〕各ブロックのDNA 1pmolを混合し、リガ
ーゼ緩衝液組成となる様に調整し0.4mM ATP,
10mM DTTとなる様にATP及びDTTを加え、
全量を20μlとして5単位のT4DNAリガーゼを用
い15℃で16時間反応を行った。反応終了後、反応物
の一部をとり7M尿素を含む6%ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動でリゲーションの検討をした。その結果を図
12に示す。同図のI,IIはそれぞれ〔I〕,〔II〕ブ
ロックの分離精製したものを示す。As a result, as shown in FIG. 11, 225 bp
It was found that [I] and [II] blocks corresponding to the above were synthesized. Next, the whole amount of the above reaction solution was separated by 8% polyacrylamide gel electrophoresis containing 7 M urea. After confirming the DNA of 225 base pairs by radioautograph, a gel piece of that portion was cut out, and the DNA was eluted by the above-mentioned electrophoretic elution method. After freeze-drying the DNA solution, the DNA solution was dissolved in 100 μl of a 0.3 M sodium acetate (pH 7.0) solution, and then 2.5 times the amount of ethanol was added to precipitate the DNA. To the obtained DNA, 0.5 nmol ATP and 3 units of polynucleotide kinase were added in the same manner as described above, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. [I]
[II] 1 pmol of the DNA of each block was mixed and adjusted so as to have a ligase buffer composition, and 0.4 mM ATP,
Add ATP and DTT to 10 mM DTT,
The reaction was carried out at 15 ° C. for 16 hours using 5 units of T4 DNA ligase in a total volume of 20 μl. After the reaction was completed, a part of the reaction product was taken and examined for ligation by 6% polyacrylamide gel electrophoresis containing 7 M urea. The result is shown in FIG. In the figure, I and II indicate the separated and purified blocks of [I] and [II], respectively.
【0032】また、Gはγ−IFN全遺伝子のリゲーシ
ョンの結果を示したもので450塩基対に相当するDN
A分子が得られていることが判った。G shows the result of ligation of all the γ-IFN genes, and DN corresponds to 450 base pairs.
It turned out that A molecule was obtained.
【0033】次に上記の反応溶液全量に1/10量の3
M酢酸ナトリウムを加え2.5倍量のエタノールを加え
ることによりDNAを沈澱として回収した。沈澱を10
0μlのTA緩衝液(33mMトリス酢酸,pH7.
9,66mM酢酸カリ,10mM酢酸マグネシウム,
0.5mM DTT)に溶解し、20単位の制限酵素E
coRI,20単位の制限酵素SalIを加え、37℃
で1時間反応させた。反応液に10μlの3M酢酸ナト
リウムを加え2.5倍量のエタノールを加えることによ
りDNAを沈澱として回収した。DNAを80%ホルム
アミド,10mMNaOH,1mM EDTAを含む溶
液に溶かし、7M尿素を含む6%ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分離した。ラジオオートグラフによ
り、450塩基対を確認したのち、その部分のゲル片を
切り出し、透析チューブに入れ、溶出緩衝液を満たし、
シールした後同緩衝液中で200Vの定電圧で3時間電
気泳動することによりゲル中のDNAを溶出させた。次
にDNA溶液を透析チューブより取り出し、凍結乾燥し
た。乾固物を100μlの0.3M酢酸ナトリウム(p
H7.0)に溶解後2.5倍量のエタノールを加え、D
NAを沈澱として回収した。約0.05pmolのγ−
IFN遺伝子が得られた。このDNAをキナーゼ緩衝液
10μlに溶解し2単位のポリヌクレオチドキナーゼ及
び0.1nmolATPを加え37℃で1時間反応を行
い形質転換用のDNAとした。Next, 1/10 amount of 3 of the above reaction solution was added.
DNA was recovered as a precipitate by adding M sodium acetate and adding 2.5 volumes of ethanol. 10 precipitates
0 μl of TA buffer (33 mM Tris acetic acid, pH 7.
9,66 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate,
0.5 mM DTT) and 20 units of restriction enzyme E
coRI, 20 units of restriction enzyme SalI were added, and 37 ° C.
And reacted for 1 hour. DNA was recovered as a precipitate by adding 10 μl of 3M sodium acetate to the reaction solution and adding 2.5-fold amount of ethanol. DNA was dissolved in a solution containing 80% formamide, 10 mM NaOH, and 1 mM EDTA, and separated by 6% polyacrylamide gel electrophoresis containing 7 M urea. After checking 450 base pairs by radio-autograph, cut out the gel piece from that portion, put it in a dialysis tube, and fill it with elution buffer,
After sealing, the DNA in the gel was eluted by electrophoresis in the same buffer at a constant voltage of 200 V for 3 hours. Next, the DNA solution was taken out from the dialysis tube and freeze-dried. The dried product was washed with 100 µl of 0.3 M sodium acetate (p.
After dissolving in H7.0), 2.5 times amount of ethanol was added, and D
NA was recovered as a precipitate. About 0.05 pmol of γ-
The IFN gene was obtained. This DNA was dissolved in 10 μl of a kinase buffer, 2 units of polynucleotide kinase and 0.1 nmol ATP were added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour to obtain a DNA for transformation.
【0034】pGIFプラスミドの造成 化学合成したγ−IFN遺伝子を、大腸菌内で完全な蛋
白質として発現させる為、大腸菌ラクトースオペロンの
UV5プロモーターオペレーター領域の下流にγ−IF
N遺伝子を挿入できる大腸菌プラスミドpKO703の
造成を行い、γ−IFN遺伝子をこのpKO703プラ
スミドにクローニングした。In order to express the chemically synthesized γ-IFN gene as a complete protein in Escherichia coli, γ-IFN was inserted downstream of the UV5 promoter operator region of the lactose operon of Escherichia coli.
An E. coli plasmid pKO703 into which the N gene can be inserted was constructed, and the γ-IFN gene was cloned into this pKO703 plasmid.
【0035】以下に本実験に用いた一連のプラスミドの
造成を詳述する(図9参照)。The construction of a series of plasmids used in this experiment will be described below in detail (see FIG. 9).
【0036】(1) pKO703プラスミドの造成 大腸菌ラクトースオペロンのUV5プロモーターオペレ
ーター領域を含むプラスミドpKO703の造成を以下
に述べる方法で行った。[0036] (1) pKO703 plasmid the Construction of plasmid PKO703 including UV5 promoter operator region of the Construction of E. coli lactose operon was performed by the following method.
【0037】(A) 制限酵素EcoRI,ClaI切
断部位をうめたpBR322プラスミドの調整 pBR322 DNA1.5μgを20μl中の1×T
A反応液(33mMトリス酢酸緩衝液pH7.6,66
mM酢酸カリウム,10mM酢酸マグネシウムおよび
0.5mMジチオスレイトール)中で制限酵素EcoR
I,ClaIそれぞれ5単位を用いて、37℃,60分
間切断した。反応液を65℃,30分間加熱し、酵素を
不活化した後、2.5倍量の冷エタノールを加えてDN
Aを沈澱物として得た。得られたDNA沈澱物をT4D
NAポリメラーゼ反応液40μlに結局懸濁し、65
℃,10分間加熱後、dATP,dCTP,dGTP各
々4mM溶液より各々5μlずつと100mM β−メ
ルカプトエタノール5μlを加えた後、T4DNAポリ
メラーゼ1単位を用いて、37℃,60分間反応させ
た。反応液を65℃,30分間加熱し、酵素を不活化し
た後、エタノール沈澱を行い、最終的に15μlの蒸留
水にDNA沈澱を溶解した。(A) Restriction enzyme EcoRI, ClaI cut
Preparation of pBR322 plasmid filled with cleavage sites 1.5 μg of pBR322 DNA was added to 1 × T in 20 μl.
A reaction solution (33 mM Tris acetate buffer pH 7.6, 66
restriction enzyme EcoR in mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate and 0.5 mM dithiothreitol)
Cleavage was performed at 37 ° C. for 60 minutes using 5 units each of I and ClaI. The reaction solution was heated at 65 ° C. for 30 minutes to inactivate the enzyme.
A was obtained as a precipitate. The obtained DNA precipitate is subjected to T4D
After suspending in 40 μl of NA polymerase reaction solution,
After heating at 0 ° C for 10 minutes, 5 µl each of 4 mM solutions of dATP, dCTP and dGTP and 5 µl of 100 mM β-mercaptoethanol were added, and then reacted with 1 unit of T4 DNA polymerase for 60 minutes at 37 ° C. The reaction solution was heated at 65 ° C. for 30 minutes to inactivate the enzyme, followed by ethanol precipitation, and finally the DNA precipitate was dissolved in 15 μl of distilled water.
【0038】(B) 制限酵素EcoRI切断部位をう
めたLacUV5プロモーターオペレーター領域DNA
の調整 ラクトースオペロンのUV5プロモーターオペレーター
領域を分離する為に以下の実験を行った。プラスミドp
KO601は2ケ所の制限酵素EcoRI切断部位間に
ラクトースオペロンのプロモーターオペレーター領域を
有するプラスミドである。このプラスミドpKO601
80μgを500μl中の1×TA反応液中で、制限
酵素EcoRI 150単位を用い、37℃60分間反
応した。反応液を10%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行い、制限酵素EcoRI粘着部位コヘシブエンド
を持つ95塩基対のプロモーターオペレーター領域DN
A断片をゲルより電気泳動により分離した(分離法につ
いては特願昭56−163303号実施例参照)。(B) Restriction site for restriction enzyme EcoRI
Meta LacUV5 promoter operating record over Tar region DNA
The following experiment was performed to separate the UV5 promoter operator region of the lactose operon. Plasmid p
KO601 is a plasmid having a lactose operon promoter operator region between two restriction enzyme EcoRI cleavage sites. This plasmid pKO601
80 μg was reacted at 37 ° C. for 60 minutes in a 1 × TA reaction solution in 500 μl using 150 units of a restriction enzyme EcoRI. The reaction solution was subjected to 10% polyacrylamide gel electrophoresis, and a 95 bp promoter operator region DN having a restriction enzyme EcoRI adhesion site cohesive end was used.
The A fragment was separated from the gel by electrophoresis (see Example of Japanese Patent Application No. 56-163303 for the separation method).
【0039】エタノール沈澱後、DNA沈澱を40μl
のT4DNAポリメラーゼ反応液40μlに溶解し、6
5℃30分間加熱後急冷し、dATP,dTTP,dC
TP,dGTP各々4mM溶液より各々5μlずつと1
00mMβ−メルカプトエタノール5μlを加えた後、
T4DNAポリメラーゼ10単位を用いて、37℃60
分間反応させた。反応液を65℃30分間加熱し、酵素
を不活化した後エタノール沈澱を行い、最終的に20μ
lの蒸留水にDNAを溶解した。After ethanol precipitation, 40 μl of the DNA precipitate was
Dissolved in 40 μl of T4 DNA polymerase reaction solution of
After heating at 5 ° C for 30 minutes, it is cooled rapidly, and dATP, dTTP, dC
5 μl each from 4 mM solution of TP and dGTP and 1
After adding 5 μl of 00 mM β-mercaptoethanol,
37 ° C., 60 units using 10 units of T4 DNA polymerase.
Let react for minutes. The reaction solution is heated at 65 ° C for 30 minutes to inactivate the enzyme, and then ethanol precipitation is performed.
The DNA was dissolved in 1 liter of distilled water.
【0040】(C) (A)および(B)で調整したプ
ラスミドとラクトースUV5プロモーターオペレーター
領域DNAのリゲーション、並びに大腸菌への形質転換 (A)で調整した制限酵素EcoRI、ClaI切断部
位を埋めたpBR322DNA0.8μgと(B)で調
整したラクトースオペレーターのUV5プロモーターオ
ペレーター領域DNA0.8μgを、T4DNAリガー
ゼ2.5単位を用いて16℃,20時間リゲーションを
行った。(リゲーションの方法は特願昭56−1633
03号実施例に記されている方法に従った。)(C) The process adjusted in (A) and (B)
Rasmid and lactose UV5 promoter operators
Ligation of region DNA and transformation of Escherichia coli (A) with 0.8 μg of restriction enzyme EcoRI and pBR322 DNA filled with ClaI cleavage site, and 0.8 μg of UV5 promoter operator region DNA of lactose operator prepared with (B), Ligation was performed at 16 ° C. for 20 hours using 2.5 units of T4 DNA ligase. (The ligation method is described in Japanese Patent Application No. 56-1633.
The method described in Example No. 03 was followed. )
【0041】リゲーション後エタノール沈澱を行いDN
A沈澱物を10μlの蒸留水に溶解し、大腸菌12・W
A802の形質転換を行った。(形質転換の方法は特願
昭56−163303号実施例に記されている方法に従
った。)形質転換株はアンピシリン40μg 1mlを
含有するM9S−Xgal培地〔NaCl5g,NH4
Cl1g,Na2 HPO4 5.94g,KH2 PO4 3
g(pH7.0)MgSO4 0.2g,カザミノ酸2
g,グルコース5g,5−ブロモ−4−クロロ−3−イ
ンドイル−β−D−ガラクトピラノシド400mg,寒
天15g,水1000ml:以下M9S−Xgal培地
と略す〕上で培養し、アンピシリン耐性かつ濃青色のコ
ロニーを10個選びWA802/pKO701〜WA8
02/pKO710と命名した。After ligation, ethanol precipitation was performed and DN
A precipitate was dissolved in 10 μl of distilled water, and E. coli 12 · W was dissolved.
Transformation of A802 was performed. (The method of transformation was according to the method described in Example of Japanese Patent Application No. 56-163303.) The transformant was M9S-Xgal medium [NaCl 5 g, NH 4 containing 40 μg of ampicillin 1 ml.
Cl1g, Na 2 HPO 4 5.94g, KH 2 PO 4 3
g (pH 7.0) MgSO 4 0.2 g, casamino acid 2
g, glucose 5 g, 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside 400 mg, agar 15 g, water 1000 ml: hereinafter abbreviated as M9S-Xgal medium], ampicillin-resistant and concentrated Choose 10 blue colonies WA802 / pKO701-WA8
02 / pKO710.
【0042】制限酵素ClaIのプラスミドpBR32
2上の認識部位はテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモ
ーター領域内にあり、pBR322プラスミドの制限酵
素EcoRI−ClaI認識部位間に他のDNA断片が
挿入されれば、そのプラスミドを持つ大腸菌はテトラサ
イクリン感受性となる。しかしラクトースオペロンのU
V5プロモーターオペレーター領域のDNA断片が望ま
れる方向性に挿入されればそのプラスミドを持った形質
転換株はテトラサイクリン非感受性となることが期待で
きる。Restriction enzyme ClaI plasmid pBR32
2 is within the promoter region of the tetracycline resistance gene, and if another DNA fragment is inserted between the EcoRI-ClaI restriction sites of the pBR322 plasmid, E. coli harboring the plasmid becomes tetracycline sensitive. However, the lactose operon U
If the DNA fragment of the V5 promoter operator region is inserted in the desired orientation, it can be expected that the transformant carrying the plasmid becomes insensitive to tetracycline.
【0043】そこで得られたWA802/pKO701
〜WA802/pKO710株をテトラサイクリン10
μg/mlを含む普通栄養寒天培地上にシングルコロニ
ーを行い、テトラサイクリン感受性を調べた。その結果
WA802/pKO701,WA802/pKO70
3,WA802/pKO706,WA802/pKO7
09がテトラサイクリン非感受性であった。そこでこれ
らの菌株よりプラスミドDNAを分離し、DNA2μg
を20μlの1×TA反応液中で、制限酵素EcoR
I,HpaII各々5単位を用いて37℃60分間反応
し、10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ラ
クトースオペロンのプロモーターオペレーター領域の方
向性を調べた。その結果WA802/pKO703,W
A802/pKO709は望まれる方向にプロモーター
オペレーター領域が挿入されていた。The thus obtained WA802 / pKO701
~ WA802 / pKO710 strain was treated with tetracycline 10
A single colony was formed on a normal nutrient agar medium containing μg / ml, and tetracycline sensitivity was examined. As a result, WA802 / pKO701, WA802 / pKO70
3, WA802 / pKO706, WA802 / pKO7
09 was tetracycline insensitive. Therefore, plasmid DNA was isolated from these strains and 2 μg of DNA was isolated.
Restriction enzyme EcoR in 20 μl of 1 × TA reaction solution
Reaction was carried out at 37 ° C. for 60 minutes using 5 units each of I and HpaII, and the orientation of the promoter operator region of the lactose operon was examined by 10% polyacrylamide gel electrophoresis. As a result, WA802 / pKO703, W
A802 / pKO709 had a promoter operator region inserted in the desired orientation.
【0044】このpKO703プラスミドをγ−IFN
遺伝子のクローニングに用いた。プラスミドpKO70
3はEcoRI制限酵素認識部位が1ケ所プロモーター
からのトランスクリプションの方向の下流にあり、pB
R322のテトラサイクリン耐性遺伝子はそのままプラ
スミド上に残っている為、化学的又はプラスミドより得
たEcoRIとSalI,BamHlのようなテトラサ
イクリン耐性構造遺伝子内を切断する制限酵素のコヘシ
ブエンドを持つ遺伝子をライゲーション反応を用いて、
プラスミドpKO703に容易に導入可能で、目的とす
るクローンをアンピシリン耐性テトラサイクリン感受性
菌として容易に選択することができる。This pKO703 plasmid was transformed into γ-IFN
Used for gene cloning. Plasmid pKO70
No. 3 has an EcoRI restriction enzyme recognition site at one position downstream in the direction of transcription from the promoter, and pB
Since the tetracycline resistance gene of R322 remains on the plasmid as it is, a gene having a restriction enzyme cohesive end that cleaves inside the tetracycline resistance structural gene such as EcoRI and SalI or BamHI obtained chemically or from the plasmid was used for the ligation reaction. hand,
It can be easily introduced into the plasmid pKO703, and the target clone can be easily selected as an ampicillin-resistant tetracycline-sensitive bacterium.
【0045】(2) プラスミドpGIF4 の造成 プラスミドpKO703の15μgを制限酵素EcoR
I,SalI各々10単位用いて30μlの100mM
トリス塩酸緩衝液(pH7.3)5mM MgCl2 お
よび50mM NaCl溶液中で37℃60分反応を行
った。反応液を65℃30分間加熱し、酵素を不活化し
た後0.7%アガロースゲル電気泳動を行い3.8kb
のDNA断片をゲルより電気泳動法を行って分離した。
エタノール沈澱後4.5μlの蒸留水にDNAを溶解し
た。このようにして得られたpKO703の制限酵素E
coRI,SalI制限酵素断片DNA0.3μgと先
に得た5′−OH末端をリン酸化したγ−IFN遺伝子
29ngを24μlのT4DNAリガーゼ反応液中に溶
解し、65℃10分間加熱後、氷冷し100mMDTT
3μlおよび4mMのATP3μlを加え次いでT4D
NAリガーゼ3単位を用いて16℃,20時間リゲーシ
ョンを行った。リゲーション反応液に2.5倍量の冷エ
タノールを加え、DNAをエタノール沈澱とした後、得
られたDNA沈澱に10μlの蒸留水を加え、大腸菌W
A802の形質転換を行った。形質転換株はアンピシリ
ン40μg/mlを含有するM9S−Xgal培地上で
培養し、アンピシリン耐性かつ濃青色のコロニーを選択
し、テトラサイクリン10μg/mlを含む普通栄養寒
天培地上にシングルコロニーを行い、テトラサイクリン
感受性を示すコロニーを選びWA802/pGIF1〜
WA802/pGIF5と命名した。[0045] (2) limit the 15μg of Construction plasmid pKO703 of plasmid pGIF 4 enzyme EcoR
30 μl of 100 mM using 10 units each of I and SalI
The reaction was performed at 37 ° C. for 60 minutes in a solution of 5 mM MgCl 2 and 50 mM NaCl in a Tris-HCl buffer (pH 7.3). The reaction solution was heated at 65 ° C for 30 minutes to inactivate the enzyme, and then 0.7% agarose gel electrophoresis was performed to obtain 3.8 kb.
Was separated from the gel by electrophoresis.
After ethanol precipitation, the DNA was dissolved in 4.5 μl of distilled water. Restriction enzyme E of pKO703 thus obtained
0.3 μg of the coRI and SalI restriction enzyme fragment DNA and 29 ng of the γ-IFN gene phosphorylated at the 5′-OH end obtained above were dissolved in 24 μl of a T4 DNA ligase reaction solution, heated at 65 ° C. for 10 minutes, and cooled on ice. 100 mM DTT
Add 3 μl and 3 μl of 4 mM ATP then add T4D
Ligation was performed at 16 ° C. for 20 hours using 3 units of NA ligase. A 2.5-fold amount of cold ethanol was added to the ligation reaction solution to convert the DNA into an ethanol precipitate. Then, 10 μl of distilled water was added to the obtained DNA precipitate, and E. coli W
Transformation of A802 was performed. The transformant was cultured on an M9S-Xgal medium containing 40 μg / ml of ampicillin, an ampicillin-resistant and dark blue colony was selected, and a single colony was formed on a normal nutrient agar medium containing 10 μg / ml of tetracycline, and the resulting mixture was sensitized to tetracycline sensitivity. Is selected and WA802 / pGIF1
It was named WA802 / pGIF5.
【0046】プラスミドDNAを分離後、制限酵素Ec
oRIとSalI,EcoRIとHindIII , 及びE
coRIとBglIIを用いて、プラスミドDNAを切断
し、アガロース電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法によりDNA断片の大きさを測定して、目的の
γ−IFN遺伝子がクローニングされているWA802
/pGIF4,WA802/pGIF5を確認した。こ
れらpGIF4,pGIF5プラスミドでは、ラクトー
スオペロンのUV5プロモーター領域のShine−D
algano DNA塩基配列より10塩基対下流にγ
−IFN遺伝子の開始コドンATGが位置している。After separating the plasmid DNA, the restriction enzyme Ec
oRI and SalI, EcoRI and HindIII, and E
WA802 in which the target γ-IFN gene has been cloned is obtained by cleaving the plasmid DNA with coRI and BglII, measuring the size of the DNA fragment by agarose electrophoresis and polyacrylamide gel electrophoresis.
/ PGIF4, WA802 / pGIF5. In these pGIF4 and pGIF5 plasmids, Shine-D in the UV5 promoter region of the lactose operon was used.
γ 10 base pairs downstream from the algano DNA base sequence
-The start codon ATG of the IFN gene is located.
【0047】[0047]
【表3】 [Table 3]
【0048】γ−IFN遺伝子の塩基配列決定 pGIF4プラスミドDNAの制限酵素EcoRI,制
限酵素SalI分解で得られる450塩基対のγ−IF
N遺伝子に相当する領域の塩基配列を図6に示した計画
に従って決定した。塩基配列の決定はMaxam−Gi
lbert法(Proc.Nat.Acad.Sci.
USA.74,560−564,1977)に準じて行
った。その結果450塩基対すべて最初のデザイン(図
2)通りであることを確認した。 Determination of base sequence of γ-IFN gene 450 bp γ-IF obtained by digesting pGIF4 plasmid DNA with restriction enzymes EcoRI and SalI
The nucleotide sequence of the region corresponding to the N gene was determined according to the plan shown in FIG. The determination of the base sequence was performed using Maxam-Gi
lbert method (Proc. Nat. Acad. Sci.
USA. 74, 560-564, 1977). As a result, it was confirmed that all 450 base pairs were in the original design (FIG. 2).
【0049】(3) ヒト・ガンマ・インタ−フェロン
様ポリペプチドの大腸菌体内での発現及び同定 E.coliWA802/pGIF4およびWA802
/pGIF5において、γ−IFN遺伝子はラクトース
オペロンのプロモーター領域の下流に挿入されている。
この為、ラクトースオペロンの支配下にγ−IFNは発
現されることが期待される。そこで以下に詳述する方法
によりE.coliWA802/pGIF4,WA80
2/pGIF5菌体内でのγ−IFNの発現及び固定を
行った。菌株E.coliWA802/pGIF4とW
A802/pGIF5をアンピシリン40μg/mlを
含むM9S−グリセロール培地(NaCl 5g,NH
4 Cl 1g,Na2 HPO4 5.94g,KH2 PO
4 3g,MgSO4 ・7H2 O0.2g,グリセロール
2.5g,カザミノ酸2g,水1000ml)2.0m
lに各々接種し、37℃一夜培養した。この培養液をア
ンピシリン40μg/mlを含む5mlのM9S−グリ
セロール培地4本に吸光度OD660nmが0.1にな
るように各々接種した後、37℃で培養を行い、OD6
60nmが0.8に達した時、ラクトースオペロンの誘
導物質であるイソプロピル−β−D−チオ−ガラクトピ
ラノシド(以下IPTGと略称)を最終濃度1mMにな
るように4本の培養試験管の内2本に加え、37℃,
2.5時間さらに培養した。残り2本はIPTGを加え
ずに37℃,2.5時間さらに培養した。これらの培養
液5mlを3,000rpmで10min遠心後、菌体
を沈澱物として得た。IPTG添加、非添加の2本の菌
体沈澱物に1mg/mlの牛血清アルブミンを含む1×
PBS(10mMリン酸緩衝液pH7.0,150mM
NaCl)0.5mlを各々加え、菌体を超音波処理
した。又、IPTG添加、非添加の2本の菌体沈澱物に
1mg/mlの卵白リゾチームを含む1×PBS0.5
mlを加え、0℃,40分間リゾチーム処理後、超音波
処理した。超音波処理した菌体0.5mlを25,00
0rpmで30分間、4℃に於いて遠心を行い、上清を
γ−IFNの活性測定に用いた。(3) Human gamma interferon
And identification of E. coli-like polypeptide in E. coli coli WA802 / pGIF4 and WA802
In / pGIF5, the γ-IFN gene is inserted downstream of the promoter region of the lactose operon.
Therefore, γ-IFN is expected to be expressed under the control of the lactose operon. Therefore, E. coli is obtained by the method described in detail below. coliWA802 / pGIF4, WA80
The expression and fixation of γ-IFN in 2 / pGIF5 cells were performed. Strain E. E. coli WA802 / pGIF4 and W
A802 / pGIF5 was added to M9S-glycerol medium containing 40 μg / ml of ampicillin (NaCl 5 g, NH
4 Cl 1g, Na 2 HPO 4 5.94g, KH 2 PO
4 3g, MgSO 4 · 7H 2 O0.2g, glycerol 2.5g, casamino acid 2g, water 1000 ml) 2.0 m
1 and inoculated at 37 ° C. overnight. This culture solution was inoculated into four 5 ml M9S-glycerol mediums each containing 40 μg / ml of ampicillin so that the absorbance OD 660 nm became 0.1, followed by culturing at 37 ° C.
When 60 nm reached 0.8, the lactose operon inducer isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside (hereinafter abbreviated as IPTG) was added to four culture tubes so that the final concentration was 1 mM. 37 ° C,
It was further cultured for 2.5 hours. The remaining two were further cultured at 37 ° C. for 2.5 hours without adding IPTG. After 5 ml of these cultures were centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, the cells were obtained as a precipitate. 1 × containing 1 mg / ml bovine serum albumin in the two cell pellets with and without IPTG
PBS (10 mM phosphate buffer pH 7.0, 150 mM
NaCl) was added, and the cells were sonicated. In addition, 1 × PBS0.5 containing 1 mg / ml egg white lysozyme in two cell pellets with and without IPTG addition
After lysozyme treatment at 0 ° C. for 40 minutes, the mixture was sonicated. 0.5 ml of the sonicated cells was added for 25,000
Centrifugation was performed at 0 rpm for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant was used for measuring the activity of γ-IFN.
【0050】[0050]
【表2】 インターフェロンの活性の測定 コースター製プラスチック96穴マルチプレート上で5
%新生仔牛血清を含むイーグル最少培地を用いてインタ
ーフェロンサンプルをマルチピペットにより希釈列をつ
くった。次に、各穴に100μlのFL細胞(5×10
5 細胞/ml)を加え、一夜37℃,5%CO2 下で培
養した。培養上清を捨て、TCID50の100倍濃い濃
度のシンドビスウイルスを100μl各穴に加え、37
℃,5%CO2 下で一夜培養した。約17時間後上清を
捨て、20%エタノールを含む1%クリスタル紫溶液で
染色した。インターフェロンの力価は、ウイルスを加え
なかった穴と、インターフェロンを加えずウイルスのみ
を加えた穴との染色度の差の半分の染色度を示したイン
ターフェロンサンプルの希釈度をラボ単位/mlとし
た。この検定系は国際標準のあるα型インターフェロン
と比較すると7〜25倍の感度を示す。[Table 2] Measurement of interferon activity 5 on Coaster plastic 96-well multiplate
Interferon samples were serially diluted with multipipettes using Eagle's minimal medium containing% neonatal calf serum. Next, 100 μl of FL cells (5 × 10
5 cells / ml) and cultured overnight at 37 ° C. under 5% CO 2 . The culture supernatant was discarded, and 100 μl of Sindbis virus having a concentration 100 times higher than TCID 50 was added to each well.
The cells were cultured overnight at 5 ° C. and 5% CO 2 . After about 17 hours, the supernatant was discarded and stained with a 1% crystal purple solution containing 20% ethanol. The titer of the interferon was determined by setting the dilution of the interferon sample that showed half the difference in staining between the wells to which no virus was added and the wells to which only the virus was added without adding the interferon as the lab unit / ml. . This assay system is 7 to 25 times more sensitive than α-interferon with international standards.
【0051】インターフェロン活性が確かにヒト・ガン
マ・インターフェロン活性であるかどうかは、抗ヒト・
ガンマ・インターフェロン抗体を用いた免疫学的手法に
よって確かめられた。この場合、50μlインターフェ
ロン活性サンプルに10μlの抗ヒト・ガンマ・インタ
ーフェロン抗体(2,000単位μl/mlのヒト・ガ
ンマ・インターフェロン活性を失活させる活性をもつ)
を加え、室温で3時間放置後、遠沈(10,000回
転、5分)し、その上清をサンプルとした。Whether the interferon activity is indeed human gamma interferon activity depends on the anti-human
It was confirmed by an immunological technique using a gamma interferon antibody. In this case, 10 μl of anti-human gamma interferon antibody (having an activity of inactivating human gamma interferon activity of 2,000 units μl / ml) is added to a 50 μl interferon activity sample.
Was left at room temperature for 3 hours, followed by centrifugation (10,000 rotations, 5 minutes), and the supernatant was used as a sample.
【0052】[0052]
【表1】 表1に示すように、本発明において得られた形質転換
E.coliWA802/pGIF4およびWA802
/pGIF5は、明らかにラクトースオペロン支配下に
ヒト・ガンマ・インターフェロン様物質を生産している
ことが認められ、非形質転換菌(WA802/pKO7
03)にはヒト・ガンマ・インターフェロン活性が認め
られなかった。[Table 1] As shown in Table 1, the transformed E. coli obtained in the present invention was used. coli WA802 / pGIF4 and WA802
/ PGIF5 was found to produce a human gamma interferon-like substance under the control of the lactose operon, and the non-transformed bacterium (WA802 / pKO7
No. 03) showed no human gamma interferon activity.
【0053】上記の実施例の中でインターフェロン活性
を示したエシエリシア・コリの細胞破砕超遠心分離上清
をウルトロゲルACA54(直径0.7cm×高さ47
cm)に添加し、ゲルパーミエーションクロマトグラフ
ィによる分子量の推定を行った。生理的平衡塩類溶液
(1×PBS)を用い0.7mlずつ分画した。標準蛋
白としては、リボヌクレアーゼA(分子量13,70
0),キモトリプシノーゲンA(分子量25,00
0),オボアルブミン(分子量43,000)を用い
た。インターフェロン活性は、キモトリプシノーゲンA
とオボアルブミンの間に溶出され、この条件下でのイン
ターフェロン活性の主ピークの分子量は約30,000
と推定された(図13参照)。The cell disruption ultracentrifugation supernatant of Escherichia coli which showed interferon activity in the above-mentioned Examples was subjected to Ultrogel ACA54 (diameter 0.7 cm × height 47).
cm), and the molecular weight was estimated by gel permeation chromatography. Using a physiologically balanced salt solution (1 × PBS), fractionation was performed in 0.7 ml portions. As a standard protein, ribonuclease A (molecular weight 13,70
0), chymotrypsinogen A (molecular weight 25,000)
0), ovalbumin (molecular weight 43,000) was used. Interferon activity is chymotrypsinogen A
The molecular weight of the main peak of interferon activity under this condition is about 30,000.
Was estimated (see FIG. 13).
【図1】γ−IFN遺伝子合成に用いた62個の各オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドの配列を示す。FIG. 1 shows the sequence of each of 62 oligodeoxyribonucleotides used for γ-IFN gene synthesis.
【図2】合成γ−IFNのアミノ酸配列および遺伝子の
ヌクレオチド配列を示す。FIG. 2 shows the amino acid sequence of synthetic γ-IFN and the nucleotide sequence of the gene.
【図3】オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成反応工
程を示す。FIG. 3 shows an oligodeoxyribonucleotide synthesis reaction step.
【図4】オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成反応工
程を示す。FIG. 4 shows a synthesis reaction step of an oligodeoxyribonucleotide.
【図5】オリゴデオキシリボヌクレオチドのリゲーショ
ン計画を示す。FIG. 5 shows a ligation scheme for oligodeoxyribonucleotides.
【図6】合成γ−IFN遺伝子の塩基配列の決定計画を
示す。FIG. 6 shows a scheme for determining the nucleotide sequence of a synthetic γ-IFN gene.
【図7】合成γ−IFN遺伝子の制限酵素地図で、括弧
中の数字はEcoRI認識切断部位を起点とした場合の
塩基対で表わされる距離を示すFIG. 7 is a restriction map of a synthetic γ-IFN gene, and the numbers in parentheses indicate distances expressed in base pairs with the EcoRI recognition cleavage site as a starting point.
【図8】プラスミドpKO703の制限酵素切断地図
で、括弧中の数字はEcoRI認識切断部位を起点とし
た場合の塩基対で表わされる距離を示す。FIG. 8 is a restriction map of plasmid pKO703, in which the numbers in parentheses indicate the distance expressed in base pairs from the EcoRI recognition cleavage site as a starting point.
【図9】pGIFプラスミドの造成工程を示す。FIG. 9 shows a construction step of a pGIF plasmid.
【図10】合成したポリデオキシリボヌクレオチドA,
B,C,D,E,Fブロックおよび分子量マーカーM
(φ×174RFをHinfIで分解したもの)の14
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるマッピング示
す。FIG. 10. Synthesized polydeoxyribonucleotide A,
B, C, D, E, F block and molecular weight marker M
(Φ × 174RF decomposed with HinfI) 14
Mapping by polyacrylamide gel electrophoresis is shown.
【図11】図5に従ってリゲーションした〔I〕,〔I
I〕各ブロックおよび分子量マーカーM(φ×174R
FをHpaIIで分解したもの)の8%ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によるマッピングを示す。11] [I] and [I] ligated according to FIG.
I] Each block and molecular weight marker M (φ × 174R
8 shows the mapping of F obtained by decomposing F with HpaII) by 8% polyacrylamide gel electrophoresis.
【図12】上記の〔I〕,〔II〕各ブロック,合成γ
−IFN遺伝子および分子量マーカーM(pBR322
DNAをHpaIIで分解したもの)の6%ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によるマッピングを示す。FIG. 12 shows the above [I] and [II] blocks and the composite γ
-IFN gene and molecular weight marker M (pBR322
Mapping of DNA digested with HpaII) by 6% polyacrylamide gel electrophoresis is shown.
【図13】インターフェロン活性を示したエシエリシア
・コリ細胞破砕遠沈上清のゲル濾過して得られた各分画
の分子量のグラフである。FIG. 13 is a graph of the molecular weight of each fraction obtained by gel filtration of the supernatant of a centrifuged E. coli coli cell showing interferon activity.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI technical display location C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19)
Claims (11)
キシリボヌクレオチド。 1 Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys TGC TAC TGC CAG GAC CCA TAC GTG AAG ACG ATG ACG GTC CTG GGT ATG CAC TTC 10 Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe GAA GCT GAA AAC CTG AAG AAA TAC TTC CTT CGA CTT TTG GAC TTC TTT ATG AAG 20 Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp AAC GCT GGT CAT TCT GAC GTT GCT GAC TTG CGA CCA GTA AGA CTG CAA CGA CTG 30 Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu AAC GGT ACT CTG TTC CTG GGT ATC CTG TTG CCA TGA GAC AAG GAC CCA TAG GAC 40 Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg AAA AAC TGG AAA GAA GAA TCT GAC CGT TTT TTG ACC TTT CTT CTT AGA CTG GCA 50 Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser AAA ATC ATG CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTT TAG TAC GTC AGA GTC TAG CAA AGA 60 Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe TTC TAC TTC AAG CTG TTC AAA AAC TTC AAG ATG AAG TTC GAC AAG TTT TTG AAG 70 Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser AAG GAC GAC CAG TCT ATC CAG AAA TCT TTC CTG CTG GTC AGA TAG GTC TTT AGA 80 Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn GTT GAA ACT ATC AAG GAA GAC ATG AAC CAA CTT TGA TAG TTC CTT CTG TAC TTG 90 Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys GTT AAG TTC TTC AAC TCT AAC AAG AAA CAA TTC AAG AAG TTG AGA TTG TTC TTT Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr AAG CGT GAC GAC TTC GAA AAG CTT ACT TTC GCA CTG CTG AAG CTT TTC GAA TGA 100 Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val AAC TAC TCT GTT ACT GAC CTT AAT GTA TTG ATG AGA CAA TGA CTG GAA TTA CAT 110 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile CAG CGT AAA GCT ATC CAT GAA CTG ATC GTC GCA TTT CGA TAG GTA CTT GAC TAG 120 Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala CAG GTT ATG GCT GAA CTG TCC CCG GCT GTC CAA TAC CGA CTT GAC AGG GGC CGA 130 Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser GCT AAA ACT GGT AAG CGT AAA AGA TCT CGA TTT TGA CCA TTC GCA TTT TCT AGA 140 Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala CAG ATG CTG TTC CGT GGT CGT CGT GCT GTC TAC GAC AAG GCA CCA GCA GCA CGA 146 Ser Gln TCT CAG AGA GTC1. A polydeoxyribonucleotide having the following nucleotide sequence: 1 Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys TGC TAC TGC CAG GAC CCA TAC GTG AAG ACG ATG ACG GTC CTG GGT ATG CAC TTC 10 Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe GAA GCT GAA AAC CTG AAG AAA TAC TTC CTT CGA CTT TTG GAC TTC TTT ATG AAG 20 Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp AAC GCT GGT CAT TCT GAC GTT GCT GAC TTG CGA CCA GTA AGA CTG CAA CGA CTG 30 Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu AAC GGT ACT CTG TTC CTG GGT A C CTG TTG CCA TGA GAC AAG GAC CCA TAG GAC 40 Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg AAA AAC TGG AAA GAA GAA TCT GAC CGT TTT TTG ACC TTT CTT CTT AGA CTG GCA 50 Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser AAA ATC ATG CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTT TAG TAC GTC AGA GTC TAG CAA AGA 60 Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe TTC TAC TTC AAG CTG TTC AAA AAC TTC AAG ATG AAG TTC GAC AAG TTT TTG AAG 70 Lys Asp Asp Gln Ser Il Gln Lys Ser AAG GAC GAC CAG TCT ATC CAG AAA TCT TTC CTG CTG GTC AGA TAG GTC TTT AGA 80 Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn GTT GAA ACT ATC AAG GAA GAC ATG AAC CAA CTT TGA TAG TTC CTT CTG TAC TTG 90 Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys GTT AAG TTC TTC AAC TCT AAC AAG AAA CAA TTC AAG AAG TTG AGA TTG TTC TTT Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr AAG CGT GAC GAC TTC GAA AAG CTT ACT TTC GCA CTG CTG AAG C TT TTC GAA TGA 100 Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val AAC TAC TCT GTT ACT GAC CTT AAT GTA TTG ATG AGA CAA TGA CTG GAA TTA CAT 110 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile CAG CGT AAA GCT ATC CAT GAA CTG ATC GTC GCA TTT CGA TAG GTA CTT GAC TAG 120 Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala CAG GTT ATG GCT GAA CTG TCC CCG GCT GTC CAA TAC CGA CTT GAC AGG GGC CGA 130 Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser GCT AAA A CT GGT AAG CGT AAA AGA TCT CGA TTT TGA CCA TTC GCA TTT TCT AGA 140 Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala CAG ATG CTG TTC CGT GGT CGT CGT GCT GTC TAC GAC AAG GCA CCA GCA GCA CGA 146 Ser Gln TCT CAG AGA GTC
に翻訳終止コードを有する請求項1記載のポリデオキシ
リボヌクレオチド。2. The polydeoxyribonucleotide according to claim 1, which has a translation initiation code at the 5 'end and a translation termination code at the 3' end.
レオチド配列を付加し、好ましくは5′末端がEcoR
I、3′末端がSalIで切断されるようにした請求項
1または2記載のポリデオキシリボヌクレオチド。3. A nucleotide sequence which is cleaved by a restriction enzyme is added to both ends, and preferably, the 5 'end is EcoR
3. The polydeoxyribonucleotide according to claim 1, wherein the I and 3 'ends are cleaved with SalI.
オキシリボヌクレオチド 1 Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys TGC TAC TGC CAG GAC CCA TAC GTG AAG ACG ATG ACG GTC CTG GGT ATG CAC TTC 10 Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe GAA GCT GAA AAC CTG AAG AAA TAC TTC CTT CGA CTT TTG GAC TTC TTT ATG AAG 20 Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp AAC GCT GGT CAT TCT GAC GTT GCT GAC TTG CGA CCA GTA AGA CTG CAA CGA CTG 30 Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu AAC GGT ACT CTG TTC CTG GGT ATC CTG TTG CCA TGA GAC AAG GAC CCA TAG GAC 40 Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg AAA AAC TGG AAA GAA GAA TCT GAC CGT TTT TTG ACC TTT CTT CTT AGA CTG GCA 50 Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser AAA ATC ATG CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTT TAG TAC GTC AGA GTC TAG CAA AGA 60 Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe TTC TAC TTC AAG CTG TTC AAA AAC TTC AAG ATG AAG TTC GAC AAG TTT TTG AAG 70 Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser AAG GAC GAC CAG TCT ATC CAG AAA TCT TTC CTG CTG GTC AGA TAG GTC TTT AGA 80 Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn GTT GAA ACT ATC AAG GAA GAC ATG AAC CAA CTT TGA TAG TTC CTT CTG TAC TTG 90 Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys GTT AAG TTC TTC AAC TCT AAC AAG AAA CAA TTC AAG AAG TTG AGA TTG TTC TTT Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr AAG CGT GAC GAC TTC GAA AAG CTT ACT TTC GCA CTG CTG AAG CTT TTC GAA TGA 100 Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val AAC TAC TCT GTT ACT GAC CTT AAT GTA TTG ATG AGA CAA TGA CTG GAA TTA CAT 110 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile CAG CGT AAA GCT ATC CAT GAA CTG ATC GTC GCA TTT CGA TAG GTA CTT GAC TAG 120 Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala CAG GTT ATG GCT GAA CTG TCC CCG GCT GTC CAA TAC CGA CTT GAC AGG GGC CGA 130 Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser GCT AAA ACT GGT AAG CGT AAA AGA TCT CGA TTT TGA CCA TTC GCA TTT TCT AGA 140 Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala CAG ATG CTG TTC CGT GGT CGT CGT GCT GTC TAC GAC AAG GCA CCA GCA GCA CGA 146 Ser Gln TCT CAG AGA GTC が組み込まれたプラスミド。4. A polydeoxyribonucleotide 1 Cys Tyr having the nucleotide sequence of the following Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys TGC TAC TGC CAG GAC CCA TAC GTG AAG ACG ATG ACG GTC CTG GGT ATG CAC TTC 10 Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys tyr Phe GAA GCT GAA AAC CTG AAG AAA TAC TTC CTT CGA CTT TTG GAC TTC TTT ATG AAG 20 Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp AAC GCT GGT CAT TCT GAC GTT GCT GAC TTG CGA CCA GTA AGA CTG CAA CGA CTG 30 Asn Gly Thr Leu Phe Le Gly Ile Leu AAC GGT ACT CTG TTC CTG GGT ATC CTG TTG CCA TGA GAC AAG GAC CCA TAG GAC 40 Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg AAA AAC TGG AAA GAA GAA TCT GAC CGT TTT TTG ACC TTT CTT CTT AGA CTG GCA 50 Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser AAA ATC ATG CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTT TAG TAC GTC AGA GTC TAG CAA AGA 60 Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe TTC TAC TTC AAG CTG TTC AAA AAC TTC AAG ATG AAG TTC GA AAG TTT TTG AAG 70 Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser AAG GAC GAC CAG TCT ATC CAG AAA TCT TTC CTG CTG GTC AGA TAG GTC TTT AGA 80 Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn GTT GAA ACT ATC AAG GAA GAC ATG AAC CAA CTT TGA TAG TTC CTT CTG TAC TTG 90 Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys GTT AAG TTC TTC AAC TCT AAC AAG AAA CAA TTC AAG AAG TTG AGA TTG TTC TTT Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr AAG CGT GAC GA C TTC GAA AAG CTT ACT TTC GCA CTG CTG AAG CTT TTC GAA TGA 100 Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val AAC TAC TCT GTT ACT GAC CTT AAT GTA TTG ATG AGA CAA TGA CTG GAA TTA CAT 110 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile CAG CGT AAA GCT ATC CAT GAA CTG ATC GTC GCA TTT CGA TAG GTA CTT GAC TAG 120 Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala CAG GTT ATG GCT GAA CTG TCC CCG GCT GTC CAA TAC CGA CTT GAC AGG GGC CGA 130 Al a Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser GCT AAA ACT GGT AAG CGT AAA AGA TCT CGA TTT TGA CCA TTC GCA TTT TCT AGA 140 Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala CAG ATG CTG TTC CGT GGT CGT CGT GCT GTC TAC GAC AAG A plasmid in which GCA CCA GCA GCA CGA 146 Ser Gln TCT CAG AGA GTC has been incorporated.
5′末端にEcoRI、3′側にSalI切断部位が付
加され、プラスミドpKO703のEcoRIとSal
I切断部の間に組み込まれた請求項4のプラスミド。5. A polydeoxyribonucleotide having EcoRI at the 5 'end and a SalI cleavage site at the 3' end, and EcoRI and Sal of plasmid pKO703.
5. The plasmid of claim 4 integrated between the I cuts.
ミド。6. The plasmid according to claim 5, which comprises pGIF.
スミド。7. The plasmid according to claim 6, comprising pGIF4.
オキシリボヌクレオチド。 1 Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys TGC TAC TGC CAG GAC CCA TAC GTG AAG ACG ATG ACG GTC CTG GGT ATG CAC TTC 10 Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe GAA GCT GAA AAC CTG AAG AAA TAC TTC CTT CGA CTT TTG GAC TTC TTT ATG AAG 20 Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp AAC GCT GGT CAT TCT GAC GTT GCT GAC TTG CGA CCA GTA AGA CTG CAA CGA CTG 30 Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu AAC GGT ACT CTG TTC CTG GGT ATC CTG TTG CCA TGA GAC AAG GAC CCA TAG GAC 40 Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg AAA AAC TGG AAA GAA GAA TCT GAC CGT TTT TTG ACC TTT CTT CTT AGA CTG GCA 50 Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser AAA ATC ATG CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTT TAG TAC GTC AGA GTC TAG CAA AGA 60 Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe TTC TAC TTC AAG CTG TTC AAA AAC TTC AAG ATG AAG TTC GAC AAG TTT TTG AAG 70 Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser AAG GAC GAC CAG TCT ATC CAG AAA TCT TTC CTG CTG GTC AGA TAG GTC TTT AGA 80 Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn GTT GAA ACT ATC AAG GAA GAC ATG AAC CAA CTT TGA TAG TTC CTT CTG TAC TTG 90 Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys GTT AAG TTC TTC AAC TCT AAC AAG AAA CAA TTC AAG AAG TTG AGA TTG TTC TTT Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr AAG CGT GAC GAC TTC GAA AAG CTT ACT TTC GCA CTG CTG AAG CTT TTC GAA TGA 100 Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val AAC TAC TCT GTT ACT GAC CTT AAT GTA TTG ATG AGA CAA TGA CTG GAA TTA CAT 110 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile CAG CGT AAA GCT ATC CAT GAA CTG ATC GTC GCA TTT CGA TAG GTA CTT GAC TAG 120 Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala CAG GTT ATG GCT GAA CTG TCC CCG GCT GTC CAA TAC CGA CTT GAC AGG GGC CGA 130 Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser GCT AAA ACT GGT AAG CGT AAA AGA TCT CGA TTT TGA CCA TTC GCA TTT TCT AGA 140 Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala CAG ATG CTG TTC CGT GGT CGT CGT GCT GTC TAC GAC AAG GCA CCA GCA GCA CGA 146 Ser Gln TCT CAG AGA GTC が組み込まれたプラスミドで形質転換されたエシエリシ
ア・コリに属する菌株。8. A polydeoxyribonucleotide having the following nucleotide sequence: 1 Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys TGC TAC TGC CAG GAC CCA TAC GTG AAG ACG ATG ACG GTC CTG GGT ATG CAC TTC 10 Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe GAA GCT GAA AAC CTG AAG AAA TAC TTC CTT CGA CTT TTG GAC TTC TTT ATG AAG 20 Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp AAC GCT GGT CAT TCT GAC GTT GCT GAC TTG CGA CCA GTA AGA CTG CAA CGA CTG 30 Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu AAC GGT ACT CTG TTC CTG GGT A C CTG TTG CCA TGA GAC AAG GAC CCA TAG GAC 40 Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg AAA AAC TGG AAA GAA GAA TCT GAC CGT TTT TTG ACC TTT CTT CTT AGA CTG GCA 50 Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser AAA ATC ATG CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTT TAG TAC GTC AGA GTC TAG CAA AGA 60 Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe TTC TAC TTC AAG CTG TTC AAA AAC TTC AAG ATG AAG TTC GAC AAG TTT TTG AAG 70 Lys Asp Asp Gln Ser Il Gln Lys Ser AAG GAC GAC CAG TCT ATC CAG AAA TCT TTC CTG CTG GTC AGA TAG GTC TTT AGA 80 Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn GTT GAA ACT ATC AAG GAA GAC ATG AAC CAA CTT TGA TAG TTC CTT CTG TAC TTG 90 Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys GTT AAG TTC TTC AAC TCT AAC AAG AAA CAA TTC AAG AAG TTG AGA TTG TTC TTT Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr AAG CGT GAC GAC TTC GAA AAG CTT ACT TTC GCA CTG CTG AAG C TT TTC GAA TGA 100 Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val AAC TAC TCT GTT ACT GAC CTT AAT GTA TTG ATG AGA CAA TGA CTG GAA TTA CAT 110 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile CAG CGT AAA GCT ATC CAT GAA CTG ATC GTC GCA TTT CGA TAG GTA CTT GAC TAG 120 Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala CAG GTT ATG GCT GAA CTG TCC CCG GCT GTC CAA TAC CGA CTT GAC AGG GGC CGA 130 Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser GCT AAA A CT GGT AAG CGT AAA AGA TCT CGA TTT TGA CCA TTC GCA TTT TCT AGA 140 Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala CAG ATG CTG TTC CGT GGT CGT CGT GCT GTC TAC GAC AAG GCA CCA GCA GCA CGA 146 Ser Gln TCT CAG AGA A strain belonging to Escherichia coli transformed with a plasmid incorporating GTC.
れた請求項8記載の菌株。9. The strain according to claim 8, which has been transformed with the plasmid according to claim 5.
2/pGIFよりなる請求項9記載の菌株。10. Escherichia coli K12 WA80
The strain according to claim 9, which comprises 2 / pGIF.
2/pGIF4よりなる請求項10記載の菌株。11. Escherichia coli K12 WA80
The strain of claim 10, comprising 2 / pGIF4.
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---|---|---|---|
JP9458895A JP2599111B2 (en) | 1995-03-27 | 1995-03-27 | Polydeoxyribonucleotides for expression of human gamma interferon-like polypeptide |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (2)
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JP (1) | JP2599111B2 (en) |
-
1995
- 1995-03-27 JP JP9458895A patent/JP2599111B2/en not_active Expired - Lifetime
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