JPH08160046A - アンジオテンシン転換酵素（ａｃｅ）活性測定法 - Google Patents
アンジオテンシン転換酵素（ａｃｅ）活性測定法Info
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- JPH08160046A JPH08160046A JP29966094A JP29966094A JPH08160046A JP H08160046 A JPH08160046 A JP H08160046A JP 29966094 A JP29966094 A JP 29966094A JP 29966094 A JP29966094 A JP 29966094A JP H08160046 A JPH08160046 A JP H08160046A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 夾雑物質によるノイズの影響なしに、低濃度
レベルでのＡＣＥ活性測定法を提供する。 【構成】 検体中のアンジオテンシン転換酵素（ＡＣ
Ｅ）活性測定に際して、不溶性担体上に固定化された抗
ＡＣＥ抗体と検体中のＡＣＥを反応させ、洗浄操作によ
り夾雑物質を除去した後に酵素活性測定を行うことを特
徴とするＡＣＥの活性測定法。
レベルでのＡＣＥ活性測定法を提供する。 【構成】 検体中のアンジオテンシン転換酵素（ＡＣ
Ｅ）活性測定に際して、不溶性担体上に固定化された抗
ＡＣＥ抗体と検体中のＡＣＥを反応させ、洗浄操作によ
り夾雑物質を除去した後に酵素活性測定を行うことを特
徴とするＡＣＥの活性測定法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アンジオテンシン転換
酵素（ＡＣＥ）の活性測定法に関し、更に詳しくは、低
値レベルでのＡＣＥの活性測定法に関する。
酵素（ＡＣＥ）の活性測定法に関し、更に詳しくは、低
値レベルでのＡＣＥの活性測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】よく知られているように、ＡＣＥは、生
体内でアンジオテンシン−Ｉに作用し、Ｃ末端のジペプ
チド即ち、L-ヒスチジル-L-ロイシンを遊離させて、血
圧上昇作用のあるアンジオテンシン−IIを生成する酵素
である。この酵素は、レニン・アンジオテンシン系ある
いはキニン・カリクレイン系と関連して生体内で重要な
役割をしているが、この酵素の血中でのレベルを測定す
ることによってサルコイドーシス等のＡＣＥを指標とす
る疾患の診断や病態の正確な把握ができる。
体内でアンジオテンシン−Ｉに作用し、Ｃ末端のジペプ
チド即ち、L-ヒスチジル-L-ロイシンを遊離させて、血
圧上昇作用のあるアンジオテンシン−IIを生成する酵素
である。この酵素は、レニン・アンジオテンシン系ある
いはキニン・カリクレイン系と関連して生体内で重要な
役割をしているが、この酵素の血中でのレベルを測定す
ることによってサルコイドーシス等のＡＣＥを指標とす
る疾患の診断や病態の正確な把握ができる。
【０００３】従って、上記ＡＣＥの活性を測定すること
は、生理的あるいは臨床的に有意義であり、従来その測
定法として、 1) 放射線同位元素を用いる方法 2) 蛍光を用いる方法 3) 液体クロマトグラフィーを用いる方法 4) 笠原等の提案した、p-ヒドロキシヒプリル-L-ヒスチ
ジル-L-ロイシン、ヒプリカーゼ、p-ヒドロキシ安息香
酸水酸化酵素、ニコチンアミドアデニン-ジヌクレオチ
ドリン酸還元型を含む緩衝溶液を、ＡＣＥを含有する液
に加え、一定温度で一定時間反応させた後、吸光度の減
少を測定する方法、等が挙げられる。
は、生理的あるいは臨床的に有意義であり、従来その測
定法として、 1) 放射線同位元素を用いる方法 2) 蛍光を用いる方法 3) 液体クロマトグラフィーを用いる方法 4) 笠原等の提案した、p-ヒドロキシヒプリル-L-ヒスチ
ジル-L-ロイシン、ヒプリカーゼ、p-ヒドロキシ安息香
酸水酸化酵素、ニコチンアミドアデニン-ジヌクレオチ
ドリン酸還元型を含む緩衝溶液を、ＡＣＥを含有する液
に加え、一定温度で一定時間反応させた後、吸光度の減
少を測定する方法、等が挙げられる。
【０００４】上記、笠原等が提案したＡＣＥ活性測定法
は、他の方法に較べ簡便な装置で迅速に測定できるの
で、汎用されているが、被検体からＡＣＥを分離するこ
となく測定していたため、被検体中に共存しているＡＣ
Ｅ様活性物質や活性阻害物質、反応中間生成物の影響を
受け、これらのノイズを含めてＡＣＥ活性を測定してい
た。特に低値レベルでの再現性や添加回収試験での実測
値と理論値との乖離が大きかった。
は、他の方法に較べ簡便な装置で迅速に測定できるの
で、汎用されているが、被検体からＡＣＥを分離するこ
となく測定していたため、被検体中に共存しているＡＣ
Ｅ様活性物質や活性阻害物質、反応中間生成物の影響を
受け、これらのノイズを含めてＡＣＥ活性を測定してい
た。特に低値レベルでの再現性や添加回収試験での実測
値と理論値との乖離が大きかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に挙げ
られたノイズの影響を除去して、被検体中のＡＣＥの活
性のみを精度よく測定することを目的とする。特に低濃
度レベルでの再現性の向上を目的とする。
られたノイズの影響を除去して、被検体中のＡＣＥの活
性のみを精度よく測定することを目的とする。特に低濃
度レベルでの再現性の向上を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は下記
の構成により達成された。
の構成により達成された。
【０００７】１）検体中のＡＣＥ活性測定に際して、不
溶性担体上に固定化された抗ＡＣＥ抗体と検体中のＡＣ
Ｅを反応させ、洗浄操作により夾雑物質を除去した後に
酵素活性測定を行うことを特徴とするＡＣＥの活性測定
法。
溶性担体上に固定化された抗ＡＣＥ抗体と検体中のＡＣ
Ｅを反応させ、洗浄操作により夾雑物質を除去した後に
酵素活性測定を行うことを特徴とするＡＣＥの活性測定
法。
【０００８】２）検体中にてＡＣＥと抗ＡＣＥ抗体を反
応させた後に、不溶性担体上に固定化された抗ＡＣＥ抗
体に対する抗体と反応させ、洗浄操作により夾雑物質を
除去、分離した後に、酵素活性測定を行うことを特徴と
するＡＣＥの活性測定法。
応させた後に、不溶性担体上に固定化された抗ＡＣＥ抗
体に対する抗体と反応させ、洗浄操作により夾雑物質を
除去、分離した後に、酵素活性測定を行うことを特徴と
するＡＣＥの活性測定法。
【０００９】３）前記抗ＡＣＥ抗体が、モノクローナル
抗体であることを特徴とする上記１又は２記載のＡＣＥ
の活性測定法。
抗体であることを特徴とする上記１又は２記載のＡＣＥ
の活性測定法。
【００１０】本発明において、抗原である精製ヒトＡＣ
Ｅ（プロトーゲン社）は、フロイント完全アジュバント
(Difco社製)、リビアジュバント（Ribi社製）、ＢＣ
Ｇ、水酸化アルミニウムなどのアジュバントと混合した
後、動物に免疫する。免疫する動物としては、ウサギ、
ヤギ、Ｂａｌｂ／ｃ・ＮＺＢなどのマウス、ラット、ア
ルメニアハムスター、ヒツジなどがあげられる。免疫原
の投与量はウサギの場合、初回は約100μg／匹、追加免
疫では約50μg／匹であり、これを背部皮内に１〜４週
間間隔、好ましくは２週間間隔で２〜10回程度投与す
る。マウスの場合、免疫原性の投与量は25〜50μg／匹
であり、これを腹腔内、皮下に注射する。初回免疫にフ
ロイント完全アジュバントを用いた場合、２回目以降の
追加免疫ではフロイント不完全アジュバントと免疫原性
コンジュゲートを混合し、２週間ごとに２〜10回程度投
与する。
Ｅ（プロトーゲン社）は、フロイント完全アジュバント
(Difco社製)、リビアジュバント（Ribi社製）、ＢＣ
Ｇ、水酸化アルミニウムなどのアジュバントと混合した
後、動物に免疫する。免疫する動物としては、ウサギ、
ヤギ、Ｂａｌｂ／ｃ・ＮＺＢなどのマウス、ラット、ア
ルメニアハムスター、ヒツジなどがあげられる。免疫原
の投与量はウサギの場合、初回は約100μg／匹、追加免
疫では約50μg／匹であり、これを背部皮内に１〜４週
間間隔、好ましくは２週間間隔で２〜10回程度投与す
る。マウスの場合、免疫原性の投与量は25〜50μg／匹
であり、これを腹腔内、皮下に注射する。初回免疫にフ
ロイント完全アジュバントを用いた場合、２回目以降の
追加免疫ではフロイント不完全アジュバントと免疫原性
コンジュゲートを混合し、２週間ごとに２〜10回程度投
与する。
【００１１】初回免疫後２週間ごとに追加免疫し、得ら
れた抗血清中の目的の抗体価を測定する。以下に示すよ
うな酵素免疫測定法で測定することが好ましい。
れた抗血清中の目的の抗体価を測定する。以下に示すよ
うな酵素免疫測定法で測定することが好ましい。
【００１２】本発明において、ＡＣＥを含む体液又は検
体としては、血液、血清、血漿、***、髄液、尿等が挙
げられる。また、抗体を固定化する不溶性担体として
は、ポリエチレン製、キチン製、キトサン製、ＡＢＳ樹
脂製、有磁性等のビーズやゲルが挙げられるが、ポリエ
チレン製ビーズが好ましく用いられる。
体としては、血液、血清、血漿、***、髄液、尿等が挙
げられる。また、抗体を固定化する不溶性担体として
は、ポリエチレン製、キチン製、キトサン製、ＡＢＳ樹
脂製、有磁性等のビーズやゲルが挙げられるが、ポリエ
チレン製ビーズが好ましく用いられる。
【００１３】以下、本発明を実施例によってさらに具体
的に説明するが、本発明は、これに限定されるものでは
ない。
的に説明するが、本発明は、これに限定されるものでは
ない。
【００１４】
【実施例】 実施例１ 1) 抗体の作成 抗原である精製ヒトＡＣＥ（プロトーゲン社）100μｇ
をリン酸緩衝液（pＨ7.2）中に溶解し、フロイント完全
アジュバンドと共にウサギ（ニュージーランドホワイ
ト）に皮下注射した。２回目以降は抗原50μgを不完全
アジュバンドとともに同様に注射した。これを２〜３週
間毎に継続した後、４〜６ヶ月後にウサギの抗血清を集
めた。抗血清は50％硫酸アンモニウム塩析法及びプロテ
インＡカラムを用いて通常の方法により免疫グロブリン
画分を精製した。
をリン酸緩衝液（pＨ7.2）中に溶解し、フロイント完全
アジュバンドと共にウサギ（ニュージーランドホワイ
ト）に皮下注射した。２回目以降は抗原50μgを不完全
アジュバンドとともに同様に注射した。これを２〜３週
間毎に継続した後、４〜６ヶ月後にウサギの抗血清を集
めた。抗血清は50％硫酸アンモニウム塩析法及びプロテ
インＡカラムを用いて通常の方法により免疫グロブリン
画分を精製した。
【００１５】2) 抗体固定化ビーズの作成 ポリエチレン製のビーズ（積水化学社）に、前記のウサ
ギ抗ヒトＡＣＥ抗体、または、ヤギ抗ウサギ免疫グロブ
リン（ノルディック社）を炭酸緩衝液(pＨ5.0)中に20μ
g／mlになるように溶解した液を加え、４℃・一昼夜静
置した。抗体溶液を吸引除去後、加熱処理（56℃，30
分）した１w/v％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液
を添加し、37℃・15時間静置した。
ギ抗ヒトＡＣＥ抗体、または、ヤギ抗ウサギ免疫グロブ
リン（ノルディック社）を炭酸緩衝液(pＨ5.0)中に20μ
g／mlになるように溶解した液を加え、４℃・一昼夜静
置した。抗体溶液を吸引除去後、加熱処理（56℃，30
分）した１w/v％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液
を添加し、37℃・15時間静置した。
【００１６】3) 抗原抗体反応 ａ．反応１ 反応トレイのウェル中にリン酸緩衝液(pＨ7.2)100μlと
検体200μlを分注し、ここに前記ウサギ抗ヒトＡＣＥ抗
体を固定化したビーズを入れる。ウェル上部をシールに
て密封した後、37℃・２時間放置し抗原抗体反応させ
る。反応後、シールを除きリン酸緩衝液１mlにて３回洗
浄操作を行う。
検体200μlを分注し、ここに前記ウサギ抗ヒトＡＣＥ抗
体を固定化したビーズを入れる。ウェル上部をシールに
て密封した後、37℃・２時間放置し抗原抗体反応させ
る。反応後、シールを除きリン酸緩衝液１mlにて３回洗
浄操作を行う。
【００１７】ｂ．反応２ リン酸緩衝液(pＨ7.2)中に最終濃度が３μg／mlとなる
ようにウサギ抗ヒトＡＣＥ抗体を希釈する。あらかじめ
１w/v％ＢＳＡ溶液でブロッキングしておいた反応トレ
イのウェルに本抗体液100μlと検体200μlを分注し、シ
ールにて密封後37℃・1.5時間反応させる。ここに前記
ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体を固定化したビーズを
加え、再度密封後さらに37℃・1.5時間反応させる。反
応後、シールを除き同様に洗浄操作を行う。
ようにウサギ抗ヒトＡＣＥ抗体を希釈する。あらかじめ
１w/v％ＢＳＡ溶液でブロッキングしておいた反応トレ
イのウェルに本抗体液100μlと検体200μlを分注し、シ
ールにて密封後37℃・1.5時間反応させる。ここに前記
ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体を固定化したビーズを
加え、再度密封後さらに37℃・1.5時間反応させる。反
応後、シールを除き同様に洗浄操作を行う。
【００１８】4) 酵素活性測定 笠原法の測定試薬キット（富士レビオ社）を用い、その
変法により酵素活性測定を行った。測定方法は本キット
の操作方法に準じて行われるが、検体の代わりに検体と
反応させた前記ビーズを用い、ビーズと基質液との反応
条件を37℃・60分とした点が相違する。
変法により酵素活性測定を行った。測定方法は本キット
の操作方法に準じて行われるが、検体の代わりに検体と
反応させた前記ビーズを用い、ビーズと基質液との反応
条件を37℃・60分とした点が相違する。
【００１９】ＡＣＥの活性値は下式により求めた。
【００２０】 （Ａ−Ｂ）／12000×１／60×106 (単位：nmol／min) Ａ：検体の吸光度 Ｂ：検体ブランク、あるいは、試薬ブランクの吸光度 5) 検体測定：添加回収試験 ３濃度のプール血清（検体Ａ〜Ｃ）と５種ヒト血清（検
体１〜５）、及び、下表のようなそれらの１：１の混合
物を前記の方法及び笠原法によりＡＣＥ活性を測定し
た。測定は３回行い測定値はその平均から求めた。理論
値はプール血清とヒト血清のそれぞれの検体単体での測
定値の平均であり、回収率は下式から求めた。
体１〜５）、及び、下表のようなそれらの１：１の混合
物を前記の方法及び笠原法によりＡＣＥ活性を測定し
た。測定は３回行い測定値はその平均から求めた。理論
値はプール血清とヒト血清のそれぞれの検体単体での測
定値の平均であり、回収率は下式から求めた。
【００２１】 回収率＝（測定値−理論値）／理論値×100 （％） 得られた結果は表１に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】表１の結果より、本特許における２種の測
定系では現行の酵素活性測定法に比較して、理論値と測
定値との乖離が小さいことは明白である。現行法の乖離
の原因は被検体中に夾雑物質として存在する酵素様物質
や酵素活性阻害物質の影響を受けることにより、正確な
酵素量の定量性に欠けるためと考えられる。一方、本特
許に開示された方法によると検体の混合による夾雑物質
の量変化に無関係に正確に測定可能であるため、良好な
回収率が得られた。
定系では現行の酵素活性測定法に比較して、理論値と測
定値との乖離が小さいことは明白である。現行法の乖離
の原因は被検体中に夾雑物質として存在する酵素様物質
や酵素活性阻害物質の影響を受けることにより、正確な
酵素量の定量性に欠けるためと考えられる。一方、本特
許に開示された方法によると検体の混合による夾雑物質
の量変化に無関係に正確に測定可能であるため、良好な
回収率が得られた。
【００２４】
【発明の効果】本発明により、従来の笠原法やCushman
法等でみられる、被検体中の共存物質の影響がなく、か
つ、抗体を利用することで被検体中のＡＣＥを簡便に分
離し、そのＡＣＥの活性を測定することで夾雑物質によ
るノイズの影響なしに、低濃度レベルでの活性測定が可
能となった。
法等でみられる、被検体中の共存物質の影響がなく、か
つ、抗体を利用することで被検体中のＡＣＥを簡便に分
離し、そのＡＣＥの活性を測定することで夾雑物質によ
るノイズの影響なしに、低濃度レベルでの活性測定が可
能となった。
Claims (3)
- 【請求項１】 検体中のアンジオテンシン転換酵素（Ａ
ＣＥ）活性測定に際して、不溶性担体上に固定化された
抗ＡＣＥ抗体と検体中のＡＣＥを反応させ、洗浄操作に
より夾雑物質を除去した後に酵素活性測定を行うことを
特徴とするＡＣＥの活性測定法。 - 【請求項２】 検体中にてＡＣＥと抗ＡＣＥ抗体を反応
させた後に、不溶性担体上に固定化された抗ＡＣＥ抗体
に対する抗体と反応させ、洗浄操作により夾雑物質を除
去、分離した後に、酵素活性測定を行うことを特徴とす
るＡＣＥの活性測定法。 - 【請求項３】 前記抗ＡＣＥ抗体が、モノクローナル抗
体であることを特徴とする請求項１又は２記載のＡＣＥ
の活性測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29966094A JPH08160046A (ja) | 1994-12-02 | 1994-12-02 | アンジオテンシン転換酵素（ａｃｅ）活性測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29966094A JPH08160046A (ja) | 1994-12-02 | 1994-12-02 | アンジオテンシン転換酵素（ａｃｅ）活性測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08160046A true JPH08160046A (ja) | 1996-06-21 |
Family
ID=17875437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29966094A Pending JPH08160046A (ja) | 1994-12-02 | 1994-12-02 | アンジオテンシン転換酵素（ａｃｅ）活性測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08160046A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008046125A1 (de) * | 2006-10-19 | 2008-04-24 | Apeiron Biologics Forschungs- Und Entwicklungsgesellschaft M.B.H. | Verfahren zur bestimmung der aktivität von ace2 |
-
1994
- 1994-12-02 JP JP29966094A patent/JPH08160046A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008046125A1 (de) * | 2006-10-19 | 2008-04-24 | Apeiron Biologics Forschungs- Und Entwicklungsgesellschaft M.B.H. | Verfahren zur bestimmung der aktivität von ace2 |
| AT504443B1 (de) * | 2006-10-19 | 2008-11-15 | Apeiron Biolog Forschungs Und | Verfahren zur bestimmung der aktivität von ace2 |
| US8241864B2 (en) | 2006-10-19 | 2012-08-14 | Apeiron Biologics Forschungs-und Entwicklungsgesellschaft m.b.H. | Method for determining ACE2 activity |
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