JPH0815440B2 - ヘテロローガスタンパク質の分泌およびペリプラズムタンパク質の回収 - Google Patents

ヘテロローガスタンパク質の分泌およびペリプラズムタンパク質の回収

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JPH0815440B2
JPH0815440B2 JP60222621A JP22262185A JPH0815440B2 JP H0815440 B2 JPH0815440 B2 JP H0815440B2 JP 60222621 A JP60222621 A JP 60222621A JP 22262185 A JP22262185 A JP 22262185A JP H0815440 B2 JPH0815440 B2 JP H0815440B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本出願は、タンパク質を細菌内で製造する方法に関す
る。更に詳しくは、本発明は、形質転換された細菌のペ
リプラズムから、真核性タンパク質を、該タンパク質の
分解、並びに非ペリプラズム性タンパク質による汚染を
最少限に止めて単離する方法に関する。また、本出願
は、細菌宿主内で成熟真核性タンパク質を合成する方法
にも関する。さらに、本出願は、宿主細胞内で高収率に
ハイブリツドプレタンパク質を発現し、このプレタンパ
ク質からシグナル配列を切りとり、成熟真核性タンパク
質を宿主細胞のペリプラズム間隙に分泌せしめる様なベ
クターを提供せんとするものである。
従来技術 本出願に関して参照すべき文献は以下の通りである：
米国特許第4,375,514号および第4,411,994号；英国特許
出願第2,091,268A号（1982年公開）;I.パルバ（Palva）
ら、ジーン（Gene）22:229−235（1983）;H.イノウエ
ら、ジヤーナル・オブ・バクテリオロジイ（J.Bact.）1
48（２）:434−439（1983）;K.タルマツジ（Talmadge）
ら、プロシーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンスイズ、USA（P.N.A.S.USA）77
（７）:3988−3992（1980）;K.タルマツジら、P.N.A.S.
USA 77（６）:3369−3373（1980）；欧州特許出願第11
4,695号;R.ピツケン（Picken）ら、インフエクシヨン・
アンド・イムニテイ（Infection and Immunity）42
（１）:269−275（1983）;T.シルハビイ（Silhavy）
ら、マイクロバイオロジカル・レビユーズ（Microbiolo
gical Reviews）47（３）:313−344（1983年９月）;J.
カドナガら、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリイ（J.Biol.Chem）259（４）:2149−2154（1984
年２月）：国際PCT出願WO84/00774（1984年３月）;O.ゼ
メル−ドレーセン（O.Zemel−Dreasen）ら、ジーン27:3
15−322（1984）:S.ミハエリス（Michaelis）ら、ジヤ
ーナル・オブ・バクテリオロジイ154（１）:366−374
（1983年４月）；ヨーロツパ特許出願第114,695号（198
4年８月１日公開）；およびG.グレイ（Gray）ら、バイ
オテクノロジイpp161−165（1984年２月）。
大腸菌（E.coli）の如きグラム陰性菌のペリプラズム
に成熟真核性タンパク質を分泌させることは当該技術分
野における長年の目標であつた。ペリプラズムへの分泌
は、生産物が培養細胞の内膜と外層膜との間の間隙に区
切られる（とじこめられる）ことになり、細胞外媒質の
厳しい条件にさらされることがないので、望ましい目標
である。これらの厳しい条件（例えば、希釈、好ましく
ない塩類またはpH、およびタンパク分解酵素類等にさら
されること）が、バチルス（Bacillus）または酵母を用
いる非ペリプラズム分泌系の商業化を困難にしてきた。
本発明の方法によるペリプラズム内へのとじこめによつ
て、所望の成熟真核性タンパク質の精製が単純化される
ことになる。
多くの天然に生成される分泌タンパク質または膜タン
パク質は、まず、形成途中のプレタンパク質、あるいは
細胞内プレタンパク質として合成される。これらは、分
泌されたとき、成熟タンパク質のアミノ末端となるアミ
ノ酸残基に“シグナル”ポリペプチドが結合した形のタ
ンパク質である。このシグナルポリペプチドは、成熟タ
ンパク質の細胞膜通過を可能にするためのペプチド配列
である。このシグナルペプチドは、細胞膜を通過する際
に、目下研究中の機構により、切り離される、即ち“プ
ロセツシング（process）”される。もしも、このプロ
セツシングが適正に行なわれたならば、得られた成熟タ
ンパク質はアミノ末端に余分なシグナルアミノ酸残基を
有さず、適切なアミノ末端アミノ酸を持つことになる。
即ち、宿主であるグラム陰性細菌細胞により、シグナル
配列をコードしているDNAを含むヘテロローガス（異
質）な遺伝子が発現され、次いで、該宿主によつてシグ
ナルが適切に切り離されたならば、付加的なメチオニン
部分を含まない成熟タンパク質が宿主のペリプラズム間
隙（即ち、宿主の内膜または細胞膜と外層膜との間の間
隙）に分泌されることになる。また、シグナルタンパク
質と、通常このシグナルに付随している成熟タンパク質
の少くともアミノ末端部分が、ヘテロローガスなタンパ
ク質と結合したままで発現され、プロセツシングされる
ことにより、融合タンパク質が分泌される宿主−ベクタ
ー系が知られている。
大腸菌（E.coli）の如きグラム陰性菌のペリプラズム
に成熟真核性タンパク質を分泌させることは当該技術分
野における長年の目標であつた。ペリプラズム分泌は、
生産物が培養細胞の内膜と外層膜との間の間隙にとじこ
められることになり、細胞外媒質の厳しい条件にさらさ
れることがないので、望ましい目標である。これらの厳
しい条件（例えば、希釈、好ましくない塩類またはpH、
およびタンパク分解酵素類等にさらされること）がバチ
ルス（Bacillus）または酵母を用いる非ペリプラズム分
泌系の商業化を困難にしてきた。本発明の方法によるペ
リプラズム内へのとじこめによつて、所望の成熟真核性
タンパク質の精製が単純化されることになる。
本出願人の知る限り、これまで、グラム陰性菌におけ
るペリプラズム分泌のために採用されたベクター組立て
方法は、すべて、真核性シグナルを完全な形で、あるい
は部分的なハイブリツドの形で用いることを要件として
いた。２個の代表的な部分ハイブリツドをコードしてい
る組立て物を以下に図式化して示す。図中、分泌時に通
常起こる開裂の部位を矢印で示した。
式Ａで示される、部分的な細菌タンパク質−成熟真核
性タンパク質の融合物の如き組立て物によつて分泌され
るのは原核性タンパク質と真核性タンパク質との融合物
である。原核性DNAにコードされている余分なアミノ末
端アミノ酸を除去することは不都合であり、時には不可
能である。一方、式Ｂに示した組立て物によれば、成熟
タンパク質が分泌されることになるが、分泌される成熟
タンパク質の収量は希望する量よりも少い。従つて、以
下に示す様なハイブリツドベクター、即ち、原核性シグ
ナルと成熟真核性タンパク質の直結（直接）ハイブリツ
ドとして発現され、これが宿主によつてプロセツシング
され、ペリプラズムに分泌される様なベクターを組立て
ることが有用である。その様なベクターを以下に示す。
J.カドナガら（前掲）は、β−ラクタマーゼシグナル
がニワトリのトリオース・ホスフエート・イソメラーゼ
のためのDNAに直接結合している、直結ハイブリツド型
のベクターを調製した。しかしながら、イソメラーゼ
は、分泌もプロセツシングもされず、ハイブリツドの形
で、細胞質内に遊離した状態、並びに内膜の細胞質側に
付着した状態のままで残存している様であつた。著者ら
は、大腸菌の内膜を通過して分泌されるためには、分泌
された細菌性成熟タンパク質の少くともはじめの部分の
アミノ酸配列が絶対に必要であると結論している。
これまで、何故、直接ハイブリツド産物の分泌を達成
することが相当に困難なことであつたのかは分らない。
しかしながら、出願人は、分泌およびプロセツシングの
機構（組織）は細菌内に保持されているので（それ故、
真核性プレタンパク質がプロセツシングされた例がいく
つかある）、即ち、該機構は幾分融通性を有するので
（Ａ型の融合物のプロセツシングに認められる様に）、
分泌を特に困難にする障害は、細菌が、発現産物を完全
に人工的な開裂部位（即ち、加水分解の起きる位置のい
ずれかの側の約１〜３個の残基については原核性でも真
核性でもない部位）でプロセツシングしなければならな
いという組立て物の構造にあるのではないかと考えた。
この仮説、並びにこれまでの失敗および当該技術者達の
懐疑的態度に反して、本出願人は、ペリプラズム性細菌
が、原核性シグナルと成熟真核性タンパク質との直結融
合物を実際にプロセツシングし、しかもそのことによ
り、本出願人が以前に真核性プレタンパク質について得
た収率よりも高収率で成熟タンパク質を分泌し得る、と
いうことを見出した。このことは、特に哺乳類の成長ホ
ルモンの分泌に関して成功を収めた。
哺乳類成長ホルモンは脳下垂体の正常な生産物であ
る。今日では、哺乳類成長ホルモンは、ある程度、種間
の交差−特意性、似通つたアミノ酸配列の機能およびコ
ンフオメーシヨンを示すことが知られている。ヒト成長
ホルモン（hGH）は191個のアミノ酸からなり、分子量は
約21,500である。hGHは下垂体機能減退性小人症の治療
に臨床的に用いられている。それはまた、火傷、創傷の
治ゆ、発育異常、骨のゆ着、び慢性の胃出血および偽関
節の治療にも有効であることが提言されている。
最近、組換え宿主細胞内でhGHが合成された（例え
ば、米国特許第4,342,832号参照）。hGHは細菌細胞によ
つて著しく破壊されるわけではなく、適切な位置に開始
コドンを含んでいるhGH直接発現のための遺伝子を適当
なプロモーターと結合すれば、直接、生産させることが
できる。原核性生物は、生成したタンパク質からアミノ
末端のメチオニンを除去しないことが多いので、米国特
許第4,342,832号の例に示される如く、細菌性プロモー
ターの存在下でヘテロローガスなhGH−DNAを発現させる
と、第１番目のアミノ酸としてメチオニンを含んでいる
hGHが得られる。この原因は、DNAのATGコドン（開始コ
ドン）が最終的にメチオニンとして発現されることによ
る。hGHの大腸菌内での生産に関してこれまでに得られ
た結果から、この宿主細胞は、hGHからメチオニンを開
裂する細胞内機能をほんの僅かしか持つていない事がわ
かつており、また、インビトロで上記のことを行うため
の技術も限られたものであることが分つている。
欧州特許公開第127305号は、原核性宿主をプレhGH
（通常の、自身の真核性シグナル配列を有するhGH）で
形質転換することにより、該宿主内で成熟hGHを合成
し、分泌させることについて開示している。宿主細胞は
プレhGHを発現し、真核性シグナルを認識し、さらに、
そのプレタンパク質を適切にプロセツシングすることが
できた。次いで、ペリプラズムから成熟hGHを回収し
た。しかし、その収率は期待される程、高くなかつた。
ペリプラズムからタンパク質を回収するのに、これま
でよく用いられてきた方法の１つにスフエロプラスト法
がある〔H.ノイ（Neu）ら、“バイオケミカル・バイオ
フイジカル・リサーチ・コミユニケーシヨンズ（Bioche
m.Biophy.Res.Comm.）”17:215（1964）〕。この方法で
は、細胞壁を溶解するのにリゾチームを用いる必要があ
る。しかし、この方法は、ペリプラズム性抽出物中に別
の夾雑タンパク質が加わることを余儀なくさせるばかり
か、スフエロプラストが、機械的にも浸透圧的にももろ
く壊れ易いことから、特に、治療用のタンパク質を大規
模に回収する目的には不適当である。その上、リゾチー
ムはかなり高価である。
もう一つの方法は浸透性シヨツク法〔H.ノイら、ジヤ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリイ）240：
（９）:3685〜3692（1965）〕と呼ばれるものである。
この方法は、まず第一に生菌を高張液で処理し、次い
で、低張性の冷い洗浄水で処理してペリプラズムタンパ
ク質を放出させるという２工程を行う必要があるという
理由で不都合な方法である。
これらの方法は生菌を用いて行われた。しかし、生菌
の使用は、それらのタンパク分解酵素が完全に活性を有
していることから、望ましくない。出願人が、大腸菌の
生きている培養物中から、分泌されたhGHを回収しよう
としたところ、起源不明のタンパク分解的な切断によつ
て、hGHの約10〜20％から、アミノ末端フエニルアラニ
ンが除去されてしまつた。
本発明の目的は、ペリプラズムタンパク質の、改良さ
れた回収方法を提供することにある。本発明の改良法
は、回収の際の、タンパク分解酵素によるタンパク分解
的破壊を最少限に止めることができ、また、一般的にみ
て、ペリプラズムタンパク質の、細胞内タンパク質によ
る汚染を最少にするという点で、充分に精巧なものであ
る。また、本発明方法によれば、より商業化に適した操
作法でペリプラズムタンパク質を大量に回収することが
でき、従来利用し得た方法よりも大規模な使用が可能と
なり、さらに、汚染されたタンパク質製剤を用いる必要
がなくなるのである。
また本発明は、細菌性宿主内で、真核性タンパク質を
発現させ、ペリプラズムに多量に分泌させることを目的
とするものである。
さらに本発明は、ペリプラズム内に、成熟ヒト成長ホ
ルモンを多量に得ることを目的とするものである。
さらにまた本発明は、真核性タンパク質の発現および
分泌を容易ならしめる原核性シグナルポリペプチドを提
供することを目的とするものである。
要約 以下に示す方法によつて、真核性タンパク質を発現さ
せ、原核性生物のペリプラズム間隙に分泌させた： （ａ） 分泌され得る直結ハイブリツドを発現するため
のベクターであつて、原核性分泌シグナル配列をコード
しているDNAの３′末端と、成熟タンパク質をコードし
ているDNAの５′末端とが結合した配列を含むベクター
を組立て； （ｂ） （ａ）のベクターで原核性宿主生物を形質転換
し； （ｃ） （ｂ）で形質転換した宿主を培養し；そして、 （ｄ） 宿主のペリプラズムに成熟タンパク質を蓄積さ
せる。
ニワトリのトリオース・ホスフエート・イソメラーゼ
以外の成熟真核性タンパク質をコードしているDNAの
５′末端にその３′末端が結合している、ペリプラズム
性細菌の分泌シグナル配列をコードしているDNA配列が
提供される。この点に関し、大腸菌のエンテロトキシン
・シグナルをコードしているDNAが特に有用である。こ
のシグナルDNAは、（ａ）その３′末端が、成熟エンテ
ロトキシンをコードしているDNAの５′末端に、また、
（ｂ）その５′末端がエンテロトキシンプロモーターの
３′末端にいずれも結合していないという特徴を有して
いる。この配列は、エンテロトキシンシグナル含有ベク
ターの組立てに、１つのカセツトとして用いるのに便利
である。好ましいエンテロトキシンはST IIである。
ST IIシヤイン−ダルガノ（Shin−Dargano S.D.）配
列は、殊に強力なリボゾーム結合部位であり、このこと
が収率の向上に寄与する。それは、一般に、トリプトフ
アン（trp）プロモーターまたはアルカリ性ホスフアタ
ーゼ（AP）プロモーターの様な、原核性プロモーターと
結合しており、どの様なプロモーター系とでも用いるこ
とができる。
本発明の新規な原核細胞培養は、上記の方法を用いて
宿主細胞を形質転換し、培養することにより、生産され
る。これらの培養物は、（ａ）成熟真核性タンパク質
と、（ｂ）成熟真核性タンパク質と原核性分泌シグナル
配列との直結ハイブリツド融合タンパク質とを含む。通
常、成熟タンパク質と融合タンパク質との合計重量の約
25％以上、一般に約90％までの物質は、細胞のペリプラ
ズムに存在する成熟タンパク質である。
本発明の一般的な方法は、ヘテロローガスな、即ち真
核性のタンパク質を分泌する様に形質転換された細胞を
生きたまま、または死滅した形で得、タンパク質が外層
膜から外へ通過し得る様、凍結と解凍の如き処理によつ
て外層膜を透過性にし、次いで、分泌された真核性タン
パク質を含むペリプラズムタンパク質を細胞の残余部分
から分離することからなる。ペリプラズムタンパク質の
回収を促進する様な変化を細胞膜にもたらすために、ホ
スフエート（りん酸塩）制限条件下で細胞を培養するこ
とが有用である。
また、本発明は、形質転換した細胞をアルカノールと
接触させ、加熱することからなる新規な殺菌方法を提供
するものである。次いで、これらの細胞を、凍結と解凍
からなる冷シヨツク法で処理すれば、ペリプラズムタン
パク質を回収することができる。
これらの方法は、大腸菌ST IIエンテロトキシンシグ
ナルと成熟hGHとの直結ハイブリツド融合物を発現し得
るグラム陰性菌から、hGHを回収するに際し、特に便利
な方法である。
図面の説明 第１図は、ST II遺伝子、並びにその翻訳および非翻
訳領域のヌクレオチド配列を示す模式図である。そのS.
D.配列中、基本的な部分はヌクレオチド155−161のオー
バーラインを付した部分である。ST IIシグナルの推定
のアミノ酸配列は残基−23〜−１、成熟ST IIエンテロ
トキシンのそれは残基１〜48に示されている。第１図に
はまた、ST IIのプロセツシングサイト（“開裂部位”
と称する）並びに様々な制限酵素の作用部位が示されて
いる。星印は、ST IIプロモーターがオーバーラインを
付した84−89位および108−114位の構造を含むとしたと
きの、mRNA合成開始点と思われる部位を示している。
第2a図−第2d図は、trpプロモーターのコントロール
下において分泌可能なST II−hGH融合タンパク質をコー
ドすると共に、ST II S.D.配列を含有しているベクター
（ptrp−ST II−hGH）の組立て模式図である。
第3b図はプラスミドtrp−ST II−hGHの詳細な構造を
示す模式図である。
第3a図はptrp−ST II−hGHのtrpプロモーター領域、S
T IIシグナルおよびhGH遺伝子のヌクレオチド配列を示
す模式図である。
第4a図−第4c図は、APプロモーターのコントロール下
において分泌可能なAP−hGHおよびST II−hGH融合タン
パク質をコードしているベクターであるpAP−１およびp
AP−ST II−hGH（ただし後者のベクターは、ST II S.D.
配列をもコードしている）の組立て模式図である。
第５図はpAP−ST II−hGHのAPプロモーター領域、ST
IIシグナルおよびhGH遺伝子のヌクレオチド配列を示す
模式図である。
第６図はpAP−１のAPプロモーター領域、APシグナル
およびhGH遺伝子のヌクレオチド配列を示す模式図であ
る。
詳しい記述 ヘテロローガスなタンパク質とは、通常は、細菌性細
胞が分泌しないタンパク質を指す。このヘテロローガス
なタンパク質は、該ヘテロローガスなタンパク質を分泌
する様に処理された形質転換細胞にとつて正常な細胞内
タンパク質であつてもよく、あるいは他の微生物由来の
DNAにコードされているタンパク質であつてもよいが、
通常は、それは真核性タンパク質、そのフラグメント、
あるいは真核性タンパク質と原核性タンパク質またはそ
のフラグメントとの融合物である。好ましいペリプラズ
ムタンパク質は成熟真核性タンパク質、例えばhGHの如
きホルモン、インターフエロンまたはリンホカインであ
る。
本発明において処理される細胞は、通常の培地あるい
は、ベクターまたはヘテロローガスなタンパク質を分泌
させるのに使用される突然変異宿主形質転換体のために
調整された培地、で増殖させた形質転換細菌の培養物か
ら得られる。
本出願人らは、宿主ベクター系が、プレタンパク質の
合成レベルおよび分泌レベルに関して複雑であるにもか
かわらず、原核性シグナルと所望の真核性タンパク質と
の直結ハイブリツド融合物を分泌させることに成功し
た。種々の直接結合した原核性シグナル配列と真核性タ
ンパク質配列を用い、trpまたはAPプロモーターを用い
てプラスミドを組立てた。これらのプラスミドの各々を
用いて適当な宿主を形質転換し、ペリプラズムと細胞質
とにおける生成物の量および分布状況を調べた。これら
の実験の結果、直結ハイブリツド融合タンパク質によ
り、生物のペリプラズム間隙へ成熟真核性タンパク質が
分泌され、適切にプロセツシングされていることが証明
された。この成功した実験結果を以下の表１に示す。通
常のhGH真核性シグナルを用いて得られた結果を比較の
ために示した。
1. 無機りん酸塩を含有しない培地。
2. 大腸菌ATCC31446。
3. 実験結果相互の間に、通常、変動が認められた。関
係のあるパラメーターには、培養物の密度、分泌された
タンパク質が回収された時期、その他の変動値が含まれ
る。成熟および融合真核性タンパク質の総量は、ペリプ
ラズムにおける割合（％）と同じく、概略値と考えるべ
きである。レベルは、g/550nmにおけるOD＝50と同等の
培養物／として求めた。培養物は、振盪フラスコを用
い、10mlまたは20mlの量で培養した。
4. 適正なプロセツシングとは、分泌されたタンパク質
が、天然起源のものから単離された場合に見られるもの
と同じアミノ末端を有していることを意味する。
5. NDとは、実施しなかつたことを意味する。
6. ヒト白血球インターフエロン−Ａ。
7. ネズミモノクローナル抗−CEAイムノグロブリンの
軽鎖。
8. 大腸菌ATCC27325。
出願人は、当初、前記の構造式中の原核性シグナルを
用いていくつかの成熟真核性タンパク質を分泌させるこ
とを試みた。その結果、ある例ではタンパク質が合成さ
れず、また他の例では発現しても分泌が伴なわなかつ
た。ネズミ−イムノグロブリン重鎖（ST IIシグナルを
利用）、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（APプロ
モーターおよびシグナルを利用）またはウシ−プロレニ
ン（大腸菌宿主中、trpプロモーターおよびST IIシグナ
ルを利用）、あるいはhGH〔シユードモーナスアエルギ
ノーサ（Pseudomonas aeruginosa）エンテロトキシンＡ
シグナルを利用〕のためのベクターを用いて形質転換し
た培養物は、プレタンパク質または分泌された成熟タン
パク質を極めて少量、あるいは検出不可能な量、合成し
ていることが分つた。その他の形質転換培養物では、ウ
シ−ガンマーインターフエロン、プロレラキシン、イン
ターロイキン−２あるいはウシ−プロレニンとST IIシ
グナルとの融合物をプロセツシングしなかつた。これら
の結果は、限定的かつ予備的な実験により、得られたも
のである。
この研究から、原核性シグナルと成熟真核性タンパク
質との直結ハイブリツド融合物は、細菌細胞によつて認
識される（即ち、プロセツシングされ、ペリプラズムに
移行する）ということが明らかになつた。この様な知見
を得、本発明者らは、機能的な構造（組立て物）を決定
するために努力を重ねた。
上記の努力は、まず第１に、様々なペリプラズム性細
菌タンパク質（例えば酵素やエンテロトキシン）から得
たシグナルとの直接（直結）ハイブリツド融合物をコー
ドしているベクターをスクリーニングすることに向けて
払われた。もしも、その様な組立て物で大腸菌を形質転
換し、培養しても成熟真核性タンパク質が分泌されなか
つたならば、他の属のグラム陰性菌について、成熟タン
パク質を分泌する能力を有するか否かをスクリーンしな
ければならない。最終的には、シグナルペプチドのプロ
セツシングに関する性質を強化したり、改良したりする
ために、シグナルペプチドに突然変異を誘発することも
できる。
本発明方法は、グラム陰性菌がST IIエンテロトキシ
ンシグナルペプチドとの直接（直結）融合物を認識し得
ることを見出した結果、可能となつた。さらにまた本発
明は、ST II S.D.配列の使用によつて収率を高めるこ
とができるという発見に基づくものでもある。
hGHおよびST IIエンテロトキシンプレタンパク質の部
分的なアミノ酸配列を以下に示す。式中、それぞれの、
成熟タンパク質の開始アミノ酸には下線を施した。
hGH…leu gln glu gly ser ala phe pro ala met ser l
eu… ST II…ala thr asn ala tyr ala ser thr gln ser asn
lys… 上の式から分る様に、これらの２個の配列の、シグナ
ル開裂部位の近辺には事実上、ホモロジイが認められな
い。従つて、宿主細胞がST II−hGHハイブリツド結合部
位を認識し、ST II−hGHプレタンパク質を正しくプロセ
ツシングしてhGHを分泌し得る、ということは驚ろくべ
きことである。
本発明に用いられる原核性シグナル配列は、細菌性
の、分泌タンパク質または細胞膜タンパク質、あるいは
それらの突然変異体からのシグナル配列である。適当な
シグナルの例には、ハイドロラーゼ、ホスフアターゼ、
タンパク分解酵素（プロテアーゼ）、抗生物質耐性酵素
類（例、β−ラクタマーゼ）、Mal E（マルトース結合
タンパク質）の如き結合タンパク質、並びにエンテロト
キシンに付随するシグナルを挙げることができる。β−
ラクタターゼシグナルは好ましくない。好ましいもの
は、大腸菌の熱安定性（ST）および熱不安定性（LT）エ
ンテロトキシン類に見出される。STエンテロトキシンの
内、ST IIが最も好ましい。
ピツケンら（前掲）によると、ST IIシグナルポリペ
プチドのアミノ酸配列は、NH2−met lys lys asn ile a
la phe leu leu ala ser met phe val phe ser ile ala
thr asn alaか、あるいは上記配列のカルボキシ末端に
tyr alaが付加したものである。実際、大腸菌は、この
シグナルをtyr alaの後方で切断する。従つて、本明細
書中、以後に述べるベクターに用いられるST IIシグナ
ルDNAは、別にtyr alaをコードしているものも含む。
分泌される真核性タンパク質の割合を増加させるため
に原核性シグナルに突然変異を誘発してもよい。一般
に、シグナルの疎水性核以外の位置のアミノ酸（例え
ば、残基−１、−２または−３）をコードしているコド
ンに突然変異をもたらすと、シグナルの開裂についてよ
り顕著な効果を発揮する様である。突然変異したDNA
は、突然変異の起きた位置に、野生型のシグナルとは異
るアミノ酸を発現させる。特定の位置で、各々異なるア
ミノ酸をコードしている複数個のコドンを置換するのが
最も便利である。このことは、当業者既知の方法で行う
ことができる。例えば、アリカリ性ホスフアターゼに関
して行つたS.ミハエリスの報告がある（前掲）。次い
で、個々の組立て物を、発現ベクター内において成熟ヒ
トタンパク質をコードしているDNAとライゲートし、こ
のベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転
換体を培養し、後に詳述する様に、各突然変異体毎に分
泌レベルを測定する。最適なレベル（濃度）の所望のタ
ンパク質を分泌した形質転換体を同定し、それに関与し
ている組立て物を選出する。ST IIシグナルに関する限
り、疎水性領域（第１図において、残基−５から−17ま
で）におけるアミノ酸の置換は、置換されたアミノ酸が
電荷をもたず、さらに好ましくは疎水性であれば、シグ
ナルの効力に不利な影響を及ぼさないと予測される。ま
た、この領域内での１または２個程度の欠失あるいは挿
入も容認し得る。リーダー中、最も感受性の高い領域
は、残基−１および−21から−22の領域である（第１
図）。これらの残基における突然変異（挿入または欠失
を含む）は、一般に破壊的であるが、時には、収率また
は分泌に関して好結果を与えることもある。本明細書で
定義している原核性シグナル突然変異は、発現されたシ
グナルが所望のタンパク質、またはその他の真核性タン
パク質に通常付随している真核性シグナルに変つてしま
う、という程、広範囲に及ぶものではない。
突然変異による適正化は、実質上同じシグナルを含む
ベクターを用い、宿主をある宿主から他の宿主に切り換
える場合に特に望ましい。その理由は、シグナル−真核
性タンパク質融合物の開裂および成熟タンパク質の移送
に関与している細菌酵素系におけるアレル変異体は、適
切に修飾された原核性シグナルを、より容易に認識し得
ると思われるからである。
本発明によれば、適当なグラム陰性宿主とシグナルと
が選択されたなら、どの様な真核性タンパク質、突然変
異体または誘導体をも分泌させることができる（勿論、
そのタンパク質自体がグラム陰性菌内で発現され得るこ
とを条件とする）。その様な真核性タンパク質には、リ
ンホカイン、イムノグロブリンおよびホルモンが含まれ
る。本明書書中に用いる真核性タンパク質は通常、ウ
シ、ブタおよびヒト起源の哺乳類タンパク質である。ヒ
ト成長ホルモンの様な成長ホルモンに関して、特に優れ
た結果が得られる。
直結ハイブリツド融合物を発現させるために、宿主の
形質転換に用いられるベクターは、当業者に一般的に知
られている常法によつて組立てられる。それらのベクタ
ー内で、原核性シグナルをコードしているDNAは所望の
タンパク質をコードしているDNAと、直接結合してい
る。このことは、正常な細菌性開裂部位の直ぐ上流のア
ミノ酸をコードしているシグナルDNAと、所望の成熟真
核性タンパク質の最初のアミノ酸をコードしているDNA
とが直結しており、その間には、成熟原核性タンパク質
または正常な真核性プレ配列に由来する介在残基配列が
全く存在していないことを意味する。その様な直接結合
は、実施例中に示したM13欠失性突然変異誘発法等の既
知の手法で行うことができる。別法として、シグナルお
よび開裂部位の領域をコードしているDNAを化学合成す
ることもできる。このDNAを、残りの真核性タンパク質
をコードしているDNAと、平滑末端ライゲーシヨンによ
り、あるいは適宜な制限酵素部位を介してライゲートす
る。
アルカリ性ホスフアターゼシグナルまたはST IIシグ
ナルをコードしているDNAは、所望の成熟真核性タンパ
ク質をコードしているDNAと、以下に示すいずれかの形
で直接的に結合する。真核性タンパク質が成長ホルモン
である場合、５′側の最初の２個のコドンとして、少く
とも、hGHのアミノ末端の最初の２個のアミノ酸（即
ち、NH2−phe pro）をコードしているコドン、さらに好
ましくは、hGHの最初の15アミノ末端アミノ酸をコード
しているコドンを含有しているDNAに、シグナルを結合
する。この配列は、一般に、hGH、ウシ成長ホルモン
（アミノ末端配列pro ala met ser leuを有する）また
はブタ成長ホルモン（アミノ末端配列phe pro ala met
pro leuを有する）等の成長ホルモン、並びにそのアレ
ル変異体をコードしているDNA配列の一部を構成してい
る。
本発明に用いるのに適したベクターは、直結ハイブリ
ツド融合物のDNAを、複製および翻訳を行わせる配列
と、機能的（operably）に結合させることにより、組立
てられる。mRNAの翻訳を有効ならしめる配列には、原核
性シグナルの上流に位置するS.D.配列が含まれる。本発
明に用いるには、そのS.D.配列がST II由来のものであ
つて、ST II遺伝子中に存在する天然の介在配列（TTT
T）により、原核性シグナルの開始コドンと隔てられて
いることが好ましい。この様な構造物は、以下に述べる
ように、S.D.配列と、ST II遺伝子起源の正常な介在配
列とを完備しているST IIシグナルを単離することによ
り、最も容易に得ることができる。しかしながら、ST I
I遺伝子のこの部分の長さは80bpにしかすぎないので、
既知の化学的手法でその必要な配列を単純に合成するこ
とも実際的な方法である。この方法は、広範な変異をシ
グナルにもたらそうと計画している場合には特に好まし
い。第3a図に示した組立て物は、２個のS.D.配列を含有
しており、１つは上流にあつてtrpプロモーターから与
えられたS.D.配列であり、もう１つは、ST IIシグナルD
NAと正常な関係にあるST II S.D.である。出願人は、上
流の非−ST II S.D.配列は不要であると考えている。AP
シグナルの如きその他の原核性シグナル配列も、長さが
100bpより短い傾向があるので、化学的に合成すること
ができる。
前記のS.D.−シグナル−タンパク質配列はプロモータ
ーのコントロール下で転写される。そのプロモーター
は、選択された原核性シグナルに通常伴なつているプロ
モーター以外の、原核性プロモーターであることが好ま
しい。具体的に好ましいのはAPプロモーターであるが、
tac、trpまたはラクトース〔D.ゲツデル（Goeddel）
ら、ネイチヤー（Nature）281:544（1979）〕プロモー
ターの様な他のプロモーターでもよい。これらが最も普
通に用いられるプロモーターであるが、その他の微生物
プロモーターも発見されて使用されており、それらの詳
しいヌクレオチド配列に関する報告もあるので、当業者
はそれらをプラスミドベクターと機能的にライゲートす
ることができる〔シーベンリスト（Siebenlist）ら、セ
ル（Cell）20:269（1980）〕。プロモーターは、分泌さ
れる真核性タンパク質の割合には影響を及ぼさない様で
ある。しかしながら、プロモーターとシグナル配列の両
要素の相互作用が発現レベルに影響するので、発現に最
適なこれら両要素の組合わせをスクリーンすることが望
ましい。例えば、表１において、APプロモーターとの組
合わせにおいて、APシグナルをST IIシグナルで置換し
た場合の結果を比較されたい。
プロモーター−S.D.−シグナル配列は、宿主細胞に適
合し得るレプリコン配列を含有しているベクター内に存
在している。このベクターは、通常、フアージではな
く、プラスミドである。ベクターは、複製部位と共に、
形質転換された細胞の同定を容易ならしめるために、表
現型標識配列を含んでいる。例えば、大腸菌は一般に、
アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に係る遺伝子
を含有しているプラスミドであるpBR322〔ボリバー（Bo
livar）ら、ジーン、2:95（1977）〕誘導体によつて形
質転換される。
DNA配列が他の配列に“機能的に、または操作可能に
ライゲートまたは結合している”ということは、特定の
DNAが他のDNA配列に影響を及ぼすことを意味する。この
ことは、一般に、第１のDNAが、そのものが機能的にラ
イゲートしているDNAの転写または最終的な翻訳をコン
トロールしているか、あるいは、翻訳されたタンパク質
のプロセツシングに影響していることを意味する。例え
ば、プロモーターは、それが、プレタンパク質mRNAの翻
訳速度に影響を及ぼしている場合には、該プレタンパク
質をコードしているDNAを機能的にライゲートしている
ことになる。また、シグナルポリペプチドは、それが、
所望のタンパク質をコードしているDNAと解読相内にあ
り、かつ該DNAと直接ライゲートしている場合には、該
タンパク質をコードしているDNAと機能的にライゲート
していることになる。ある組成物について、“ライゲー
トしている”という語句は、その組成物がライゲーシヨ
ンによつて製造され得るという意味においてのみ定義さ
れると解釈すべきでない。そうではなく、プラスミド内
で機能的にライゲートしている要素を、一体のものとし
て化学的に合成することができる。
前記のベクターによつて形質転換される宿主細胞は、
（ａ） ２つの細胞膜の間にペリプラズム間隙を有し、
（ｂ） 細胞内部でベクターが複製可能であり、さらに
（ｃ） 細胞内部でプレタンパク質が発現されると共
に、プロセツシングされ得る細菌である。本発明に係る
宿主は通常グラム陰性の生物、とりわけ、腸内細菌（En
terobacteriaceae）またはシユードモナス（Pseudomona
s）に属する生物またはその突然変異体である。宿主ベ
クター系（ベクターで形質転換された宿主）として好ま
しいのは、ハイブリツド融合物の発現をコントロールす
るプロモーターが構成的に活性化され、あるいは抑制さ
れる様な系である。組織的な突然変異体とは、特定のタ
ンパク質（本明細書においては、プロモート（促進）さ
れた直接ハイブリツド融合物であり、ある場合には、通
常の状態でプロモートされるタンパク質）を、プロモー
ターの抑制または活性化を想定した、誘導その他培養条
件の変化をもたらすことなしに分泌させ得る様な突然変
異を指す。宿主−ベクター系が組織的にプロモートされ
る様、宿主および／またはプロモーターに突然変異を誘
発させることができる。ベクター内に使用するプロモー
ターに、それが、もはやリプレツサータンパク質によつ
て抑制され得ない様な突然変異をもたらすことができ
る。その様な突然変異は知られている。別法として、宿
主細胞に、それが野生型または突然変異を起こしていな
いプロモーターのコントロール下で組織的なものとなる
様な突然変異を誘発することができる。その様な宿主
は、突然変異体アレルを含む、一般に入手可能な菌株か
ら、形質導入を介して都合良く調製することができる。
pho Tまたはpho R突然変異体アレルを担つているAPプロ
モーター含有ベクターで宿主細胞を形質転換することが
好ましい。前者は、りん酸イオン輸送タンパク質の暗号
遺伝子における、不能化突然変異体と思われている。ま
た、pho R突然変異体は、リプレツサータンパク質の暗
号遺伝子における、不能化突然変異体である。これらの
突然変異体アレルは当該技術分野で広く知られており、
入手することができ、既知の技術によつて宿主内に導入
することができる。驚ろくべきことに、組織的な宿主
は、ホスフエート欠失法によつて誘導された野生型の宿
主よりも高い比率（％）で発現産物をプロセシングし
た。
宿主細胞は、直結ハイブリツド融合物のDNAの転写を
コントロールするために用いたプロモーターによつて正
常にプロモートされた宿主タンパク質を発現する（必ず
しも構成的である必要はない）。例えば、大腸菌pho A
欠失突然変異体（これは活性なAPを発現し得ない）また
はAP−合成細胞を宿主として用いることができる；細胞
からのAPの活性な分泌は、必ずしも真核性タンパク質の
分泌を妨げない。通常、宿主細菌はシグナルの起源であ
る菌と同じ種のものを用いる。
宿主細胞の培養に通常用いられるあらゆる培地が形質
転換体の培養に適するが、野生型の宿主（W3110phoA、p
hoTまたはpho A、pho R以外）による真核性タンパク質
の分泌には、宿主培地の組成が強い影響を及ぼす。酵母
エキス含有培地は、トリプトン（カゼインのトリプシン
消化物）または19アミノ酸の合成混合物を含む培地に比
べて分泌を改善させた。酵母エキスの１またはそれ以上
の成分が分泌の活性化に役立つ様に思われる。
好ましい態様では、細胞を培地から収穫する前にホス
フエート制限条件下で培養するべきである。このこと
は、その生物が、ホスフエートのプロセシングに係るタ
ンパク質のためのプロモーターのコントロール下にある
真核性タンパク質をコードしているベクターで形質転換
されたか否か、あるいは、その細胞がりん酸栄養物の輸
送または異化作用に関する能力を欠いているかどうかに
関係なくいえる。驚ろくべきことに、発酵の最終段階に
おいて、細胞を収穫する前にホスフエート制限培地を用
いることにより、形質転換されたグラム陰性生物の機械
的特性が大きく改良される。この様な特性の改良は、下
記の冷シヨツク抽出法の効果を増進する。例えば、培地
からホスフエートを沈殿させるか、培養物中に制限され
た投与速度でホスフエートを加えるか、あるいは、予定
の細胞密度以上に培養物を増殖させるのに適する量より
も少量のホスフエートを最初に加えておく、等の方法に
より、培地をホスフエート制限状態にする。最初の供給
量は、発酵の初期の細胞増殖を最適に行わせる（例えば
指数増殖を行わせる、あるいはOD550を約45にする）の
に充分な量とする。ホスフエートの量は、培養物中に用
いた他の栄養物や菌株に応じて修正される。通常、大腸
菌W3110（ATCC 27325）に用いられる培地には2.5g/の
割合でりん酸カリウム／ナトリウム塩を使用するが、ph
o T突然変異体の如きホスフエート代謝欠損株の場合に
はより多量（約4.0g/）を用いる。この値は、非制限
的な場合のホスフエート量（約9.0g/）と対照的であ
る。培養物がホスフエート制限状態に至つた時点での、
制限培地中のりん酸イオン濃度は約1mM以下である。一
般に、この様な制限状態において、収穫前約１時間、細
胞を培養する。
好ましくは、以下に示す処理を開始する前に、通常、
指数増殖期に続く増殖期間中に、細胞がペリズム性のヘ
テロローガスなタンパク質を最高のレベルにまで蓄積す
る様にしておく。この時点に達するや否や、あるいはそ
の直後に、細胞を殺すべきである。“殺す”という語句
は、少くとも、細胞が複製し得ない状態にあることを意
味する。しかしながら、以下に示すアルカノールおよび
熱による処理によつては、複製とは直接関係のない代謝
機能が差し止めされる、または破壊される様に思われ
る。しかしながら、ペリプラズム内にあるhGHに対して
有害な、大腸菌のタンパク分解活性が消失されることの
外に、代謝機能がどの様な影響を受けたかは不明であ
る。殺菌方法は、それによつて宿主生物の細胞内膜が破
裂、溶解または弱体化するものであつてはならない。
細胞が所望の増殖時点に達したら、即座に、細胞をア
ルカノールと接触させ、加熱して殺すことが好ましい。
用いるアルカノールは、例えば、１−オクタールの様
な、細胞膜溶解性のものであつてはならない。一般に、
適当なアルカノール類には、１−ブタノールやエタノー
ルの如き低級（C2〜C4）モノヒドロキシアルカノール類
が含まれ、中でも１−ブタノールが好ましい。アルコー
ルと細胞との接触は、アルカノールを連続的に攪拌しな
がら発酵培養物中に加えることにより、行われる。
加えるアルコールの量は、培養物中のアルカノール濃
度が0.5％〜10％（v/v）になる様な量であり、１−ブタ
ノールを約1.5％（v/v）用いることが好ましい。ブタノ
ールは、約0.5％という低濃度でも使用できる点で、好
ましい；プロパノールまたはエタノールを用いて同等の
不活化を行うためには、もつと高濃度にしなければなら
ない。
細胞培養へのアルカノールの添加と同時に、あるいは
その後に、アルカノールの作用に共同して細胞を殺すの
に充分な高さまで培養物の温度を上げ、その温度に保
つ。この処理は、通常、約55℃〜35℃の温度で約0.5〜2
0分間行うが、温度が高くなる程、作用時間を短かくす
る。アルカノールの添加により、それがない場合に必要
とされる加熱温度よりも低い温度で操作することができ
るので、回収すべきタンパク質の活性の保存に有益であ
る。
細胞を殺すことは臨界的な要件ではない。もしも、細
胞を素早く処理することができ、組換え細胞の取扱いに
おける調整上必要な点が、他の方法でも容認し得るなら
ば、生産物の破壊を防止または遅延させるのに有用であ
るため、細胞を殺す操作をなしにすませることもでき
る。しかしながら、生産物の回収量は、回収された上清
中の生成物タンパク質の純度を減少することなく、約２
倍に達することが分つた。
細胞を培養した後、そして／または殺した後、ペリプ
ラズムタンパク質を回収する。この方法には、一般に、
細胞ペーストを形成し、細胞を凍結し、細胞を解凍し、
それをバツフアーに懸濁し、細胞片からペリプラズムタ
ンパク質を分離する（例えば、低速遠心により）工程が
必要である。分泌された真核性タンパク質をも含めて、
ペリプラズムタンパク質は上清に存在している。この方
法によれば、真核性ペリプラズムタンパク質の比活性
（即ち、純度）は、浸透圧シヨツク法によつて達成され
る値よりも高い。従つて、20％シユクロース等の高張性
物質による処理は必要でないが、ペリプラズムタンパク
質に関して細胞の外層膜を透過性にする様な、あらゆる
方法を、殺した細胞に適用することができる。
凍結用の細胞ペーストは、細胞培養を遠心または過
して細胞塊を回収することにより調製される。このペー
ストには、普通、残存量の発酵培地、例えばLB〔ルリア
・ブロス（Luria Broth）〕培地が含まれている；次の
工程に進む前に、細胞を凍結用の溶媒で洗う必要はな
い。本発明における冷シヨツク抽出法で形成されたペー
ストが細胞の濃度と殆んど関係がない、ということは大
きい問題ではない。しかしながら、大量の物質の凍結と
解凍における経済性から、ペースト容量が小さい方が好
ましい。
細胞凍結は、可能な限り早く行うべきである。一般
に、室温のペーストを、−20℃のフリーザー内で凍結さ
せ、次いで、以後の処理が必要になるまで、−80℃で保
存する。
凍結したペーストを解凍し、数倍の容量の水または水
性バツフアー（約３倍またはそれ以上の容量の10mMトリ
ス−HClバツフアー、pH8が好ましい）によつて希釈す
る。このバツフアーは、宿主生物の細胞内液に比べて低
張性である。以下の工程は約４℃で行う。希釈に用いる
バツフアーの種類、濃度およびpHは回収すべきペリプラ
ズムタンパク質によつて変動するが、バツフアーで約３
倍に希釈して行う。
細胞をバツフアーに、完全に懸濁する。この工程は、
ホモジナイザー装置を用い、実質的な溶菌が起こらない
様なスピードで、細胞を懸濁させることにより、簡単に
行える。
懸濁した細胞を約10分〜60分間、通常は約30分間、静
かに攪拌する。次いで、遠心（一般に、12,000×ｇで30
分間）または過することにより、細胞片と細胞（細胞
質タンパク質を含有）を除く、上清には、ペリプラズム
タンパク質、可溶化された外層膜タンパク質、残存性培
地および細胞外タンパク質、並びに少量の可溶性細胞内
タンパク質が含まれている。所望の真核性タンパク質
は、以後の方法に従つて、上清から望み通り、精製する
ことができる。
上記の凍結−解凍抽出法は、殺したままの、あるいは
殺していない生の形質転換体のいずれの場合でも、バツ
フアーだけで抽出する方法に比べて、収量並びに、驚ろ
くべきことに純度において、相当に優れている。凍結し
た、殺していない細胞からは、凍結されていず、かつ殺
されていない細胞のバツフアー抽出に比べて約５〜26倍
多量のhGHが回収された。殺され、凍結された細胞の上
清中の全タンパク質の19重量％がhGHであつたが、殺さ
れたままの細胞に関しては、約16％しかhGHは含まれて
いなかつた。
上記の方法を、以下の実施例において、大腸菌熱安定
性エンテロトキシンST IIシグナルペプチドとの直接ハ
イブリツド融合物として、成熟hGHを発現させるベクタ
ーで形質転換された大腸菌からhGHを回収するのに用い
た。しかしながら、本明細書に示した回収方法は、形質
転換された細菌細胞からペリプラズムタンパク質を分離
するのに、一般的に適用することができる〔米国特許第
4,411,994号および第4,375,514号;K.タルマツジ（K.Tal
madge）ら（前掲）;O.ゼメルードレーセン（O.Zemel−D
reasen）ら（前掲）並びにG.グレイ（G.Gray）ら（前
掲）〕。
実施例を簡単にするため、組換え法による組立てに関
し、しばしば現われ、また用いられるいくつかの事柄を
短い語句または記号で表わす。
プラスミドは、小文字のｐで始まり、ついで／または
大文字、そして／または数字を続けて表わす。本発明に
用いる出発物質のプラスミドまたはDNA供給源は市販品
から入手できるか、あるいは、何ら制限のない施設から
誰でも入手することができ、または、公開された方法に
従い、入手したプラスミドまたはポリヌクレオチドから
組立てることができる。加えて、一般に、プラスミドは
プレタンパク質のための複製ビヒクルおよびそのコント
ロール配列として、あるいは、中間体組立てにおける要
素としてのみ機能するのであるから、その他の等価なプ
ラスミドも当業界で知られており、通常の技術者にとつ
ては自明である。
DNAの“消化”とは、DNAのある位置にのみ作用する酵
素で該DNAを触媒的に開裂することを意味する。その様
な酵素は、制限酵素と呼ばれており、酵素にとつて、核
酵素に特異的な部位を制限部位と称する。“部分”消化
とは、制限酵素による不完全消化、即ち、あるDNA基質
中の、特定の制限エンドヌクレアーゼの作用部位の全て
ではなく、いくつかが開裂される様な条件を選んで行う
消化を指す。
本発明に用いる様々な制限酵素類は市販品から入手可
能であり、その反応条件、コフアクター類およびその他
必要なものは酵素供給者により確立された指示に従つ
た。一般に、制限酵素類は、各制限酵素の最初の供給源
である微生物を表わす大文字、次いで他の文字、さら
に、通常数字の順に、略語で示される。一般に、約20μ
のバツフアー中で、プラスミドまたはDNAフラグメン
ト約１μｇと酵素約１単位とを用いる。特定の制限酵素
にとつて適当なバツフアーおよび基質の量は製造者によ
つて規定されている。通常、37℃で１時間インキユベー
シヨンするが、供給者の指示によつて変動し得る。イン
キユベーシヨンの後、フエノールおよびクロロホルムで
抽出してタンパク質を除去し、水性フラクシヨンからエ
タノール沈殿によつて消化された核酸を回収する。時た
ま、制限酵素による消化の後、５′末端のホスフエート
を細菌性アルカリホスフアターゼで加水分解することが
ある。これはDNAフラグメントの２つの制限的開裂末端
がライゲーシヨン（後述）に際して“閉環（サーキユラ
イデイング）”したり、閉じたループを形成することに
より、該制限部位に他のDNAフラグメントが挿入されに
くくなるのを防止するためである。しかし明示しない限
り、プラスミドの消化の後、５′末端の脱りん酸反応は
行なわないものとする。脱りん酸の方法および試薬は常
法に従う〔T.マニアテイス（T.Maniatis）ら、1982、モ
レキユラー・クローニング（Molecular Cloning）pp.13
3−134〕。
制限酵素による消化によつて得られたDNAフラグメン
トの“回収”または“単離”とは、この消化物をポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけて分離し、フラグメン
トの移動度を分子量既知のマーカーDNAフラグメントの
それと比較して所望のフラグメントを同定し、該フラグ
メントを含むゲルの部分を取り除き、該ゲルから通常、
電気溶離法でDNAを分離することを意味する。この方法
は一般的に知られている。例、R.ローン（R.Lawn）ら、
1981、“ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ”９:6103
−6114およびD.ゲツデル（D.Goeddel）ら、1980“ヌク
レイツク・アシツズ・リサーチ"8:4057参照。
“サザーン分析”とは、消化物またはDNA含有組成物
中のDNA配列の存在を、既知の、標識したオリゴヌクレ
オチドまたはDNAフラグメントとのハイブリダイゼーシ
ヨンによつて確認する方法である。本明細書中では、特
に断らない限り、サザーン分析という時は、E.サザーン
（E.Southern）、1975“ジヤーナル・オブ・モレキユラ
ー・バイオロジイ（J.Mol.Biol.）”98:503−517、の方
法に従つて、消化物を１％アガロース上で分離し、変性
し、そしてニトロセルロース上に移し、T.マニアテイス
らの方法（1978、“セル”15:687−701）に従つてハイ
ブリダイゼーシヨンを行なうことを意味する。
“形質転換”とは、DNAを生物内に導入することを意
味し、その結果DNAが染色体外成分として、あるいは染
色体内に組込まれて複製されることを意味する。特に明
示しない限り、本発明における大腸菌の形質転換法には
マンデル（Mandel）らのCaCl2法（1970、“ジヤーナル
・オブ・モレキユラー・バイオロジイ”53:154）を採用
する。
“ライゲーシヨン（結合）”とは、２個の二重鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する工
程を言う（T.マニアテイスら、前掲p146）。特に明示し
ない限り、ライゲーシヨンは既知の緩衝液と条件を使用
し、略等モル量のライゲートすべきDNAフラグメント0.5
μｇ当たりT4DNAリガーゼ（“リガーゼ”）10単位を用
いて行う。
形質転換体からDNAを“調製する”とは、プラスミドD
NAを微生物培養物中から単離することを意味する。明示
しない限り、マニアテイスらのアルカリ性/SDS法（同上
p.90）を採用する。
“オリゴヌクレオチド”とは、短かい一本鎖または二
本鎖ポリデオキシヌクレオチドであつて、既知方法によ
つて化学的に合成され、次いでポリアクリルアミドゲル
上で精製されたものである。
引用した文献は全て参照例として示した。
実施例１ 大腸菌熱安定性エンテロトキシン（ST II）
遺伝子シグナルペプチド配列をコードしているプラスミ
ドの組立て 以下の組立ては第2a図に示されている。プラスミドpW
M501（ピツケンら、前掲）は熱安定性エンテロトキシン
（ST II）遺伝子を含有している。以下の工程により、p
WM501（１）からST II遺伝子をコードしているDNAの部
分（第2a図中、点描法で示した部分）を回収した。pWM5
01をRsa Iで消化し、550bp DNAフラグメント（２）を単
離した。この遺伝子フラグメントを、予めSma I消化さ
れたフアージM13mp8〔J.メツシング（J.Messing）ら、
サード・クリーブランド・シンポジウム・オン・マクロ
モレキユールス：リコンビナント・DNA（Third Clevela
nd Symposium on Macromolecules:Recombinant DNA）A.
ウオルトン編、エルセビエ（Elsevier）、アムステルダ
ム（Amsterdam）（1981）pp143−153〕にライゲートし
た。ライゲートしたDNAを用いて、M13フアージ用に市販
されている菌株である大腸菌JM101を形質転換した。澄
明なプラークを回収した。標準的な方法（J.メツシング
ら、前掲）を用いて、このフアージに感染した大腸菌JM
101から二本鎖M13mp8 ST II Rsa誘導体（３）を単離し
た。上で述べたM13mp8サブクローニング法を用いて、ST
IIリーダー遺伝子を含有している約550bpフラグメント
（２）を、フアージから提供される一連の異る制限エン
ドヌクレアーゼ部位で囲む。次いで、M13mp8 ST II Rsa
誘導体（３）をEcoR IとPst Iで消化し、フラグメント
（２）よりやや大きいDNAフラグメント（４）を単離し
た。
EcoR I−Pst Iフラグメント（４）をpBR322にサブク
ローンした。これは、pBR322をEcoR IとPst Iで消化
し、ベクター（５）を単離することにより、行つた。こ
うして単離したベクター（５）とEcoR I−Pst I DNAフ
ラグメント（４）とをライゲートした。このDNA混合物
を用いて大腸菌294を形質転換し、テトラサイクリン耐
性コロニーを選択した。耐性大腸菌コロニーからプラス
ミド（６）を単離し、これをPst II部分（Pst II parti
al）と命名した。
実施例２ TrPプロモーターのコントロール下にある、S
T IIシグナルペプチドをコードしているプラスミドの組
立て この組立て方法は第2b図に示されている。実施例１で
得たpST II部分をMnl IとBamHIで消化し、ST II S.D.配
列、ST IIシグナル配列、および成熟ST II遺伝子の最初
の30コドンを含有する180bpフラグメント（７）を単離
した。このDNAフラグメント（７）をtrpプロモーター含
有プラスミドにライゲートした。その様なプラスミドの
１つであるプラスミドpHGH207−１（８）は既に報告さ
れている〔H.ド・ボエー（H.de Boer）ら、1982、プロ
モーターズ：ストラクチユアー・アンド・フアンクシヨ
ン、R.ロドレゲツツ（R.Rodreguez）ら編、チヤンバー
リン、プレーガー（Chamberlin,Praeger）出版、ニユー
ヨーク、NY、pp462−481〕。このプラスミドの誘導体で
あるpHGH207−１＊〔trpプロモーター側の５′側EcoRI
部位をDNAポリメラーゼＩ（DNA pol I）で埋め（filli
n）、次いで、得られた平滑末端をライゲーシヨンする
ことにより、EcoRI＊に変換したもの。S.キヤビリイ
（S.Cabilly）ら、1984、プロシーデイングス・オブ・
ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンスイズ、
USA、81:3273−3277〕を、この実施例では用いた。この
trpプロモーター含有プラスミドをXba Iで消化し、DNA
pul Iと４種のdNTP全てを用いて突出した配列を埋める
様、処理した。このDNA調製物をBamHIで消化し、フラグ
メント（９）を含むベクターを単離した。次いで、ベク
ターフラグメント（９）を、上で単離した180bpST IIシ
グナル含有DNAフラグメント（７）にライゲートした。
このライゲーシヨン混合物を用いて、大腸菌294をアン
ピシリン耐性に形質転換した。アンピシリン耐性コロニ
ーから、プラスミドを単離し、ST IIリーダー（10）と
命名した。このプラスミドは、trpプロモーターのコン
トロール下にある、ST IIシグナル配列と成熟ST IIの暗
号遺伝子の一部とを含有している。以下の実施例では、
trp−ST IIシグナル配列の下流に、成熟hGHをコードし
ているDNA配列を機能的にライゲートした。
実施例３ hGHのための、発現および分泌プラスミドの
組立て この組立て方法については、第2c−2d図を参照された
い。ST IIリーダー（10）をBgl IIで消化し、次いで、P
ol Iと４種のNTP全てを用いて突出した末端を埋め、Bam
HI消化に付した。ベクター含有フラグメント（11）を単
離した。実施例２で得たプラスミドpHGH207−１をEcoRI
で消化し、DNA pol Iと４種のNTP全てを用いて突出した
末端を埋め、次いで、BamHI消化に付した。このBamHI消
化により、約920bpのhGH遺伝子含有フラグメント（12）
を単離した。これらの２個のフラグメントをライゲート
し、得られたDNA混合物を用いて大腸菌294をテトラサイ
クリン耐性に形質転換した。耐性を示す大腸菌コロニー
からプラスミドを単離し、ptrpST II−HGH−融合（13）
と命名した。このプラスミドはまだ、ST IIリーダーペ
プチド配列とhGH構造遺伝子との間にST II成熟タンパク
質の一部をコードしている余分のヌクレオチドを含有し
ている。これらのヌクレオチドを、M13部位特異的突然
変異誘発法で欠失させた〔J.P.アデルマン（J.P.Adelma
n）ら、1983、DNA、2:183−193〕。
ptrpST II HGH融合（13）から得た遺伝子を一本鎖フ
アージM13 mp10に挿入した（J.メツシングらおよびJ.ア
デルマンら、共に前掲）。M13突然変異誘発フアージお
よび大腸菌株は市販品から入手可能である。突然変異の
誘発には、まずプラスミド（13）をXba IとBamHIで消化
し、フラグメント（14）を回収した。また、M13mp 10は
Xba IとBamHIで消化し、フアージフラグメント（図示せ
ず）を単離した。フラグメント（14）をフアージフラグ
メントにライゲートし、得られたライゲーシヨン混合物
を用いてJM101を形質転換した。形質転換された培養物
をプレート（平板培養）し、インキユベートした。フラ
グメント（14）を有するフアージは、大腸菌色素原イン
ジケーターローン中で、青色のプラークでなく、澄明な
プラークとして同定された。それに相当するフアージを
大腸菌JM101上で増殖させ、培養物を遠心した。一本鎖
フアージ（15）は上清中に存在していた。一本鎖フアー
ジ（15）DNAを調製し、合成オリゴヌクレオチドプライ
マー５′pCAAATGCCTATGCATTCCCAACTATACC−OH3′とアニ
ールし、DNA Dol Iと４種のNTPとを用いてプライマーを
延長して二本鎖DNA（これらの鎖の内、一本は、欠失を
有している）を得、T4リガーゼ処理に付し、抽出して大
腸菌JM101の形質転換に用いた（J.アデルマン、前
掲）。上記プライマーの前方の14ヌクレオチドはST II
シグナルの３′末端の暗号配列であり、後方の14ヌクレ
オチドは成熟hGH遺伝子の５′末端の暗号配列であるこ
とに注目されたい。形質転換されたJM101の細胞内容物
から二本鎖フアージを得、平板培養した大腸菌JM101に
形質導入し、転移フイルター印象を平板からとり、プラ
イマーと同じDNA配列を有する５′−32P−標識オリゴヌ
クレオチドを用いたサザーン分析法により、フイルター
上で、欠失を含んでいる二本鎖フアージを同定した。二
本鎖DNA（17）は、欠失のある遺伝子を含有しているM13
mp10により感染させた大腸菌から調製した。このDNAをX
ba IとBamHIで消化し、DNAフラグメント（17）を単離し
た。これを、pHGH207−１を同様に消化し、単離したフ
ラグメント（18）の存在下でライゲートした。このライ
ゲーシヨン混合物を用いて大腸菌294をテトラサイクリ
ン耐性に形質転換した。プラスミドptrpST II−HGH（1
9）を回収し、そのヌクレオチド配列を決定した。この
プラスミドの詳しい制限地図を第３図に示す。このプラ
スミドのhGH遺伝子近辺のDNA配列を第3a図に示す。
実施例４ hGHの発現と分泌 実施例３で得たプラスミド（19）を用い、振盪培養法
でhGHを合成した。プラスミド（19）で大腸菌294を形質
転換し、50または125mlの振盪フラスコ内に入れたテト
ラサイクリン５μg/ml含有LB培地10−20mlに接種した。
このフラスコを、それ以上培地を加えることなく、37℃
で12−24時間培養し、次いで、遠心して細胞を回収し
た。超音波処理した細胞のラジオイムノアツセイによ
り、全細胞中のhGHを測定した。分泌されたhGHを浸透圧
シヨツク法によつて回収し、SDS−PAGEおよびＮ−末端
アミノ酸の末端配列決定に基づいて、これが成熟hGHで
あることを確認した。回収量は、trpプロモーターのコ
ントロール下にあるヒトhGHシグナルを用いて発現させ
た場合の約10倍であつた。
実施例５ APプロモーターおよびシグナル配列のコント
ロール下でヒト成長ホルモン（hGH）を発現、分泌する
ためのプラスミドpAP−１の組立て この組立て方法は第4a−4c図に示されている。AP遺伝
子の一部を含有しているDNAフラグメントをプラスミドp
HI−１（20）から単離した〔イノウエ,H.ら、ジヤーナ
ル・オブ・バクテリオロジイ、146:668−675（198
1）〕。これは、AP遺伝子およびプロモーター配列の
５′側にEcoRI部位を導入するための数段階の工程を用
いて行つた。プラスミド（20）をHpa Iで消化した後、
２個のEcoRI部位を直列に含んでいるリンカー分子にラ
イゲートした。リガーゼ酵素を熱的に不活化した後、DN
AをEcoRIで消化し、1200bpのフラグメントを単離した。
次いで、このDNAフラグメントをHpa IIで処理し、464bp
フラグメント（21）を単離した。ヒト成長ホルモンmRNA
から調製されたcDNAを含有しているプラスミド（22）の
組立ては、マーシヤルら〔Martial et.al.、サイエンス
205・602−606（1979）〕およびロスケムら〔Roskem e
t.al.、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ、７:305−3
20（1979）〕の方法によつた（欧州特許公開第127305号
をも参照）。プラスミド（22）をHpa IIで消化し、461b
pフラグメントを単離した。この461bpフラグメントをさ
らにPst Iで消化し、次いで、hGH遺伝子の一部を含有し
ている200bpフラグメント（23）を単離した。DNAフラグ
メント（21）とDNAフラグメント（23）とを、pBR322のE
coRIおよびPst I消化により単離した3609bp DNAフラグ
メントにライゲートした。このDNAライゲーシヨン混合
物を用いて大腸菌294をテトラサイクリン耐性に形質転
換した。形質転換体コロニーからプラスミド（24）を単
離し、pcHGHppsと命名した。
プラスミド（24）内では、APプロモーターの暗号遺伝
子と、pcHGHpps内のシグナル配列とが同じ解読フレーム
内で、hGHに結合している。しかしながら、シグナル配
列と成熟hGH遺伝子の開始位置との間には多数の余分な
ヌクレオチドが存在している。この余分なヌクレオチド
配列を、突然変異誘発により、欠失させた。即ち、pcHG
HppsをEcoRIおよびPst I消化に付し、663bpフラグメン
ト（25）を単離した。フラグメント（25）を、Pst Iお
よびEcoRIで消化しておいたM13mp9に導入した。これを
ライゲートし、大腸菌JM101の形質転換に用いた。澄明
なプラークを選択し、誘導体フアージ（26）、M13mp9−
cHGHppsを同定し、単離した。フアージ（26）を合成オ
リゴヌクレオチドプライマー５′PCTGTGACAAAAGCCTTCCC
AACCATTCC−OH3′にアニーリングした。このプライマー
の最初の14ヌクレオチドはAPシグナルペプチドの３′末
端の配列に対応し、後方の14ヌクレオチドは成熟hGH暗
号配列の５′末端に対応している。実施例３で示した如
くにして（J.アデルマンら、前掲をも参照）、部位特異
的、欠失性突然変異誘発を行つた。所望の欠失を含むプ
ラークを、この実施例に示した５′−32P−標識オリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いたサザーン分析法によ
り、検出した。所望の遺伝型のための強化をすることな
しに、スクリーンしたプラークの９％が標識プライマー
とハイブリダイズした。陽性なプラークの１つ、フアー
ジM13mp9−AP−１（27）は、ジデオキシ鎖末端ヌクレオ
チド配列決定法に基づき、予測される配列を有している
ことが確認された。次いで、APプロモーターおよびシグ
ナル遺伝子と正しく融合している部分的hGH遺伝子を、p
HGH207（28）（H.ド．ボエアら、前掲）に導入した。即
ち、pHGH207をPst IおよびNde I消化に付し、次いで、2
750bpフラグメントを単離した。もう一つのpHGH207標本
をNde IおよびEcoRI消化に付し、2064bpフラグメントを
単離した。M13mp9−AP−１フアージをEcoRIおよびPst I
で消化し、602bp AP hGH部分遺伝子（29）を単離した。
上記の2750bpフラグメントと2064bpフラグメントとを、
フラグメント（29）との３成分ライゲーシヨンでライゲ
ートし、得られたライゲーシヨン混合物を用いて大腸菌
294をアンピシリン耐性に形質転換した。耐性コロニー
からpAP−１を単離し、制限酵素マツピング法およびヌ
クレオチド配列決定法によつて特性化した。
実施例６ APプロモーターのコントロール下でhGHを発
現、分泌させるためのプラスミド（pAP−ST II−hGH）
の組立て ptrp−ST II−hGH（実施例３で調製）をHpa IおよびE
coRI消化に付し、ベクターフラグメント（31）を単離し
た。プラスミドpAP−１をEcoRI消化し、Rsa Iで部分消
化して420bpのAPプロモーターフラグメント（32）を単
離した。フラグメント（31）と（32）をライゲートし、
これを用いて大腸菌294をアンピシリン耐性に形質転換
した。プラスミドpAP−ST II−hGHを単離し、制限酵素
マツピング法およびヌクレオチド配列決定法によつて特
性化した。AP−ST II−hGH組立て物のヌクレオチド配列
および翻訳されたアミノ酸配列を第５図に示す。
実施例７ プラスミドpAP−ST II−hGHを含有している
大腸菌からのhGHの回収 大腸菌W3110および294を、それぞれ、pAP−ST II−hG
HまたはpAP−１で形質転換し、りん酸欠損培地を用いる
外は実施例４と同様にして培養した。実施例４に記載し
た如くにして、hGHの合成量、並びにプロセシングされ
たhGHとされていないhGHの分布状況を決定した。結果は
表１に示した通りである。表１から分る様に、容量が少
い場合には、ptrp−ST II−hGHの方が良好な結果をもた
らすが、培養容量が10の場合には、trpでプロモート
された生物よりも、APでプロモートされた細胞の方が高
密度に増殖し得るので、プラスミドpAP−ST II−hGHの
方が好ましい。
実施例８ 大規模発酵およびhGHの回収 10での発酵の開始８時間前に500mlの接種培養を増
殖させる。pAP−ST II−hGHを含有している大腸菌W3110
形質転換体（ton A、pho A、pho T、実施例９で調製）
を、滅菌した２のフラスコに入れた、テトラサイクリ
ン0.5μg/mlを含むLB培地500mlに接種した。この培養物
をロータリー・シエーカー内で37℃において８時間イン
キユベートした。以下の成分を含有する滅菌した10の
発酵培地を調製した:K2HPO426g、NaH2PO4・2H2O13g、KC
l15g、（NH4）2SO450g、クエン酸ナトリウム10g、50％
グルコース50ml、10％NZ−アミンYT1000ml、1MMgSO4100
ml、2.7％FeCl35ml、微量金属5ml、5mg/mlテトラサイク
リン1ml、消泡剤5mlおよび水6.5。培地の開始pHを、H
2SO4を滴下して加えることにより7.5に調節し、10の
発酵装置（フアーメンター）に接種培養物500mlを播
き、実験作業を開始した。実験中、温度を37℃に維持
し、通気下で培養物を攪拌した。外部装置から、流速0.
5ml/分で、細胞にグルコース（50％）を与えた。OD550
が10−25に達したら、pH＝7.5、残留グルコースレベル
1/4（％）になる様、グルコースの投与速度を調節し
た。OD550が25に達したならば、グルコース投与速度を
調節してdo2レベルを30％にし、それ以後は、do2レベル
を30％に維持する様、グルコースの投与速度を定期的に
調節した。発酵開始から36時間後に細胞を殺し、収穫し
た。グルコースの供給と通気は止めたが、攪拌（速度65
0rpm）は維持した。フアーメンターに、直ぐに１−ブタ
ノールを加えて終濃度を1.5％にし、即座に、フアーメ
ンタージヤケツト内へ蒸気を導き入れ、タンク内の温度
を素早く50℃に昇温した。温度が50℃に達したら、この
温度のまま、10分間維持した。次いで、フアーメンター
を20℃以下に急冷し、フアーメンター内の細胞内容物を
遠心して収穫した。まず、細胞ペーストを−20℃で冷凍
してから、−80℃のフリーザーに移した。
−80℃で凍結されている細胞ペーストを、４℃で一夜
解凍し、以後の工程を４℃で行つた。このペーストを４
倍量の10mMトリス−HCl（pH＝8.0）と混合し、ウルトラ
−タレツクス（Ultra−Turrex）ホモジナイザー中で30
秒間、懸濁した。この懸濁液を30秒間攪拌した後、12,0
00×ｇで30分間遠心することにより、細胞を除去した。
上清中のペリプラズムタンパク質は、0.5〜1g//100
（OD550）の成熟hGHを含んでおり、全hGHの約95％がプ
ロセシングされてペリプラズムに含有されていた（ペル
オキシダーゼ−結合抗hGHを用いたイムノブロツト（免
疫ブロツテイング法）により見積つた。全細胞性hGHの
約50−60％を上清中に回収した。この上清に含まれるタ
ンパク質重量の約20％はhGHであつた。
実施例９ 宿主生物W3110tonA、phoA、phoTの組立て 発酵のための宿主生物は、P1から導かれたフアージを
用いた、形質導入を含む標準的な手法により、いくつか
の工程で組立てた〔J.ミラー（J.Miller）、エクスペリ
メンツ・イン・モレキユラー・ジエネテツクス（Experi
ments in Molecular Genetics）〕、phoTおよびphoA突
然変異を、遺伝的に結合した抗生物質耐性トランスポゾ
ンを利用して、順次、大腸菌からW3110tonA株に、共形
質導入（コトランスジユース）した。最初に導入された
phoT突然変異の存在は、これらの形質導入体が高ホスフ
エート、ホスホクロモゲン−含有プレート（５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドイル−ホスフエート）上で青
色のコロニーを形成することにより、確認された。phoA
突然変異の導入は、その形質導入体が、低ホスフエー
ト、ホスホクロモゲン上で白色のコロニーを形成するこ
とにより確認された。このphoT突然変異体、または同様
にして組立てられたphoR突然変異体をpAP−ST II−hGH
で形質転換すると、それらは、発酵の全過程を通じて、
全hGHの90％以上をペリプラズム間隙に分泌する。他
方、W3110の様な、非組織的な細菌は、ペリプラズムに
約50％のhGHしか分泌せず、また、いくつかの例では全h
GHの発現レベルも幾分低かつた。phoA突然変異体の存在
または不存在は、ヘテロローガスなタンパク質の収量
に、殆んど、または全く変化をもたらさなかつた。しか
しながら、phoA突然変異体はAPを分泌しないので、phoA
突然変異体からペリプラズム性hGHを調製する工程にお
いて、APの分離が必要でない。
【図面の簡単な説明】
第１図はST II遺伝子の翻訳および非翻訳領域を含めた
ヌクレオチド配列および、推定のアミノ酸配列の模式
図、第2a〜2d図はプラスミドptrp−ST II−hGHの組立て
模式図、第3b図はプラスミドptrp−ST II−hGHの制限サ
イトおよび機能地図の模式図、第3a図はプラスミドptrp
−ST II−hGHのhGH遺伝子の近辺のヌクレオチド配列を
示す模式図、第4a−4c図はプラスミドpAP1およびpAP−S
T II−hGHの組立て模式図、第５図はプラスミドpAP−ST
II−hGHの、APプロモーター領域、ST IIシグナルおよ
びhGH遺伝子部分のヌクレオチド配列を示す模式図、第
６図はpAP−１のAPプロモーター領域、APシグナルおよ
びhGH遺伝子部分のヌクレオチド配列を示す模式図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 グレゴリー・ローレンス・グレイ アメリカ合衆国カリフオルニア94080、サ ウス・サン・フランシスコ、エルム・コー ト 530番 (72)発明者 ヘルベルト・ルイス・ハイネカー アメリカ合衆国カリフオルニア94010、ヒ ルズボロウ、ローハンプトン・ロード 501番 (72)発明者 ナンシー・シヤドウイツク・マクフアーラ ンド アメリカ合衆国カリフオルニア94070、サ ン・カーロス、ホワイトオーク・ウエイ 2019番 (72)発明者 ケネス・チヤールズ・オルソン アメリカ合衆国カリフオルニア94010、バ ーリンゲイム、ヒルサイド・ドライブ 3036番 (72)発明者 ロン‐チヤン・ペイ アメリカ合衆国カリフオルニア94404、フ オスター・シテイ、ブライス・ストリート 1136番 (72)発明者 マイケル・ウイラード・レイ アメリカ合衆国カリフオルニア94403、サ ン・マテオ、エイ・プロスペクト・ロウ 611番

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】細菌細胞からペリプラズムタンパク質を回
    収する方法であって、 （ａ）該細胞の内膜を破壊することなく該細胞を死滅さ
    せるに十分な時間、かつ十分な温度で該細胞を炭素数２
    〜４の低級アルカノールの有効量と接触させ、 （ｂ）該細胞を約20℃以下の温度にまで冷却し、 （ｃ）該細胞の残留物からペリプラズムタンパク質を回
    収する、ことからなる方法。
  2. 【請求項２】該細胞を、タンパク質を分泌する様に形質
    転換する第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】タンパク質が真核性タンパク質である第２
    項に記載の方法。
  4. 【請求項４】該細胞を0.5〜20分間、約35℃〜55℃で加
    熱する第１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】アルカノールの濃度が約0.5〜10容量％に
    なるまで、該アルカノールを該細胞の水性懸濁液と混合
    する第１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】該細胞が大腸菌であり、該タンパク質が成
    熟ヒト成長ホルモンである第２項に記載の方法。
  7. 【請求項７】該細胞を、凍結するに十分な温度にまで冷
    却する第１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】工程（ｂ）の細胞の冷却前に、該細胞を高
    張性溶液に懸濁しない第１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】真核性タンパク質を分泌する様に形質転換
    された細菌細胞のペリプラズム間隙からタンパク質を回
    収する方法であって、 （ａ）該細胞の内膜を破壊することなく該細胞を死滅さ
    せるに十分な時間、かつ十分な温度で該細胞を炭素数２
    〜４の低級アルカノールの有効量と接触させ、 （ｂ）タンパク質が細胞外へ通過し得る様に細胞の外層
    膜を透過性にし、 （ｃ）該細胞の残留物から真核性タンパク質を含むペリ
    プラズムタンパク質を回収する、ことからなる方法。
  10. 【請求項１０】該細胞をホスフェート制限普通培地で培
    養する第９項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】該培地が約1mMを越えないホスフェート
    を含んでいる第10項に記載の方法。
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Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0196864A3 (en) * 1985-03-25 1988-03-23 Cetus Corporation Alkaline phosphatase-mediated processing and secretion of recombinant proteins, dna sequences for use therein and cells transformed using such sequences
JPS6255087A (ja) * 1985-03-25 1987-03-10 シタス　オンコロジー　コーポレイション 融合蛋白質をコ−ドする組換ｄｎａ配列
IL78775A (en) * 1985-05-15 1992-06-21 Biotech Australia Pty Ltd Oral vaccines
US6103243A (en) * 1985-05-15 2000-08-15 Biotechnology Australia Pty, Ltd Oral vaccines
IL83003A (en) 1986-07-01 1995-07-31 Genetics Inst Factors that soak bone formation
GR871029B (en) 1986-07-14 1987-11-02 Genetics Inst Novel osteoinductive factors
US4933288A (en) * 1986-11-21 1990-06-12 Cetus Corporation Use of a modified soluble Pseudomonas exotoxin A in immunoconjugates
CN1030255A (zh) * 1987-04-14 1989-01-11 路明尼斯有限公司 转移基因的动物
US5573933A (en) * 1987-04-14 1996-11-12 Luminis Pty, Ltd. Transgenic pigs
DE3716957A1 (de) * 1987-05-20 1988-12-01 Boehringer Mannheim Gmbh Expressionsvektor zur regulierbaren expression von fremdgenen in prokaryonten
FR2636643B1 (fr) * 1988-08-24 1990-12-28 Sanofi Sa Peptide-signal, sequences d'adn codant pour celui-ci, vecteurs d'expression portant l'une de ces sequences et procede de production periplasmique d'un polypeptide
US5223407A (en) * 1988-08-31 1993-06-29 Allelix Inc. Excretion of heterologous proteins from e. coli
US5646015A (en) * 1988-08-31 1997-07-08 Astra Ab Excretion of heterologous proteins from E. coli
CA2034385A1 (en) * 1990-01-18 1991-07-19 Goutam Das Vector to produce biologically important peptides
CA2072375C (en) * 1990-11-08 2000-01-11 Satoru Misawa Hirudin analog, method of manufacturing thereof and anti-coagulant composition, and secretion vector, transformed microorganisms containing saidvector and manufacturing method of products which is produced from said microorganism
WO1993009229A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 Genetics Institute, Inc. Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use
ATE258984T1 (de) 1993-05-12 2004-02-15 Inst Genetics Llc Bmp-11 zusammensetzungen
EP0626448A3 (de) * 1993-05-26 1998-01-14 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Verfahren zur Herstellung und Reinigung von alpha-Interferon
ES2255059T3 (es) 1993-12-07 2006-06-16 Genetics Institute, Llc Bmp-12, bmp-13 y composiciones suyas inductoras de tendon.
US6027919A (en) 1993-12-07 2000-02-22 Genetics Institute, Inc. BMP-12 and BMP-13 proteins and DNA encoding them
US5747662A (en) * 1995-03-01 1998-05-05 Genentech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US6242177B1 (en) 1995-03-01 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US6331431B1 (en) * 1995-11-28 2001-12-18 Ixsys, Inc. Vacuum device and method for isolating periplasmic fraction from cells
US6179193B1 (en) 1997-03-07 2001-01-30 Nagai Works Co., Ltd. Stapler
US6103495A (en) 1997-04-16 2000-08-15 Unigene Laboratories, Inc. Direct expression of peptides into culture media
SE9702401D0 (sv) 1997-06-19 1997-06-19 Astra Ab Pharmaceutical use
US6165748A (en) 1997-07-11 2000-12-26 Genetics Institute, Inc. Frazzled nucleotide sequences and expression products
US6506595B2 (en) 1998-03-31 2003-01-14 Itoham Foods Inc. DNAs encoding new fusion proteins and processes for preparing useful polypeptides through expression of the DNAs
KR100316347B1 (ko) * 1998-09-15 2002-08-27 한미약품(주) 대장균엔테로톡신ⅱ신호펩티드의변형체와인체성장호르몬의융합단백질을발현하는재조합미생물및그를이용한인체성장호르몬의제조방법
KR100360594B1 (ko) 2000-01-19 2002-11-13 한미약품공업 주식회사 인간 인터페론 알파의 발현 분비벡터 및 이를 이용한인터페론 알파의 생산 방법
US6689599B1 (en) 2000-10-20 2004-02-10 Genetics Institute, Llc Aggrecanase molecules
US7083945B1 (en) 2000-10-27 2006-08-01 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Isolation of binding proteins with high affinity to ligands
AU2002319703A1 (en) 2001-07-27 2003-02-17 Wyeth Aggrecanase molecules
US6989265B2 (en) 2002-01-23 2006-01-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Bacteria with reduced genome
US8765408B2 (en) 2002-01-23 2014-07-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Prophage element-free bacteria
US8119365B2 (en) 2002-01-23 2012-02-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Insertion sequence-free bacteria
US8039243B2 (en) 2002-01-23 2011-10-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Insertion sequence-free bacteria
WO2003064622A2 (en) 2002-01-31 2003-08-07 Wyeth Aggrecanase molecules
PL373396A1 (en) 2002-02-05 2005-08-22 Wyeth Truncated aggrecanase molecules
US7611866B2 (en) 2002-07-15 2009-11-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Selection of bacterial inner-membrane anchor polypeptides
AU2003261269A1 (en) 2002-07-29 2004-02-16 Wyeth Modified adamts4 molecules and method of use thereof
US7303906B2 (en) 2002-09-06 2007-12-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Competent bacteria
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
WO2005017174A2 (en) * 2003-08-13 2005-02-24 Sandoz Ag Process for the purification of recombinant polypeptides
GB0319601D0 (en) * 2003-08-20 2003-09-24 Sandoz Ag Production process
CA2537735C (en) 2003-09-12 2018-07-24 Wyeth Injectable calcium phosphate solid rods and pastes for delivery of osteogenic proteins
AU2004317306B2 (en) 2003-11-21 2010-09-02 Pelican Technology Holdings, Inc. Improved expression systems with Sec-system secretion
US8227241B2 (en) 2004-03-12 2012-07-24 Unigene Laboratories, Inc. Bacterial host cell for the direct expression of peptides
EP2412816B1 (en) 2004-07-26 2014-12-03 Pfenex Inc. Process for improved protein expression by strain engineering
ZA200704934B (en) * 2004-12-22 2010-09-29 Genentech Inc Methods for producing soluble multi-membrane-spanning proteins
JP4899436B2 (ja) * 2005-11-18 2012-03-21 マックス株式会社 ステープラ
US7618799B2 (en) 2007-01-31 2009-11-17 Dow Global Technologies Inc Bacterial leader sequences for increased expression
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
MX2009011523A (es) 2007-04-27 2009-11-09 Dow Global Technologies Inc Metodo para clasificar rapidamente huespedes microbianos para identificar ciertas cepas con rendimiento y/o calidad mejorados en la expresion de proteinas heterologas.
GB201106225D0 (en) * 2011-04-13 2011-05-25 Glaxosmithkline Biolog Sa Fermentation process
PL2968470T3 (pl) 2013-03-12 2021-05-31 The General Hospital Corporation Zmodyfikowane białka stanowiące substancję hamującą rozwój przewodów müllera (mis) i ich zastosowania do leczenia chorób
JP2017504589A (ja) 2013-12-11 2017-02-09 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 避妊および卵巣予備能の保存のためのミュラー管抑制物質（ｍｉｓ）タンパク質の使用
CN109219662A (zh) 2016-03-02 2019-01-15 龙沙有限公司 改进的发酵工艺

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5869897A (ja) * 1981-10-20 1983-04-26 Gakuzo Tamura Ｄｎａ遺伝子

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4342832A (en) * 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
DK582381A (da) * 1981-01-02 1982-07-03 Univ New York Remkombinat plasmid til anvendelse ved bakteriel kloning
SE8204811L (sv) * 1982-08-23 1984-02-24 Sven Lofdahl Dna-fragment innefattande en signalsekvens
AU2092983A (en) * 1982-11-08 1984-05-17 Genentech Inc. Porcine growth hormone produced by recombinant dna technology
ZA837173B (en) * 1982-11-08 1984-05-30 Univ Case Western Reserve Genomic bovine growth hormone
JPS59135892A (ja) * 1983-01-25 1984-08-04 Kunio Yamane シグナルアミノ酸配列をコードするｄｎａ
US4711844A (en) * 1983-03-09 1987-12-08 Cetus Corporation Modified signal peptides

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5869897A (ja) * 1981-10-20 1983-04-26 Gakuzo Tamura Ｄｎａ遺伝子

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