JPH08122334A - Specific measuring agent and measuring method for endotoxin - Google Patents

Abstract

PURPOSE: To enable the measuring of endotoxin in a specimen handily and specifically by making a polycarbonate derivative or a glycelyl derivative of (1→3)-β-D-glucan coexist with a horseshoe amebocyte lysate reagent. CONSTITUTION: In the measuring of endotoxin in a specimen using a horseshoe amebocyte lysate (abbreviated as lysate) reagent, sometimes, a correct result can not be obtained because a G factor based reaction proceeds by a β-glucan sensitive factor possibly contained in the specimen. To solve this problem, a polycarbonate derivative or a glycelyl derivative of (1→3)-β-D-glucan is made to coexist with the lysate to block the G reactor based reaction so strongly by a selection system so that a C factor based reaction by the endotoxin is not inhibited in substance. Thus, a G factor in the lysate is removed by adsorption thereby enabling the measuring of the endotoxin accurately only under the C factor based reaction.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、カブトガニ・アメボサ
イト・ライセート試薬を用いるエンドトキシンの特異的
測定剤、エンドトキシンの測定法およびＧ因子活性化阻
害剤に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a specific measuring agent for endotoxin using a horseshoe crab amebocyte lysate reagent, a measuring method for endotoxin and a factor G activation inhibitor.

【０００２】[0002]

【従来の技術】カブトガニ・アメボサイト・ライセート
（以下単にライセートともいう）を使用して、エンドト
キシン（以下Ｅｔともいう）を測定する一般的に「リム
ルステスト」と呼ばれる方法が従来から知られており、
検出感度が非常に高いため、医薬品、水などの汚染試
験、臨床検査など多方面に汎用されている。なお、この
測定に関与するライセートの反応は「リムルス反応」と
呼ばれている。この方法は、微量のＥｔによりライセー
トが凝固することに基づいているが、その後の生化学的
解明により、該反応はいくつかの凝固因子の段階的活性
化より成ることが明らかにされている（J. Protein Che
m., 5, 255-268(1986)) 。2. Description of the Related Art A method generally called "limulus test" for measuring endotoxin (hereinafter also referred to as Et) using horseshoe crab, amebosite lysate (hereinafter also simply referred to as lysate) has been known,
Because of its extremely high detection sensitivity, it is widely used in various fields such as pharmaceuticals, water contamination tests, and clinical tests. The lysate reaction involved in this measurement is called the "Limulus reaction". This method is based on the coagulation of lysates with trace amounts of Et, but subsequent biochemical elucidation reveals that the reaction consists of stepwise activation of several coagulation factors ( J. Protein Che
m., 5, 255-268 (1986)).

【０００３】この反応を、例えば日本産カブトガニ（Ta
chypleus tridentatus）から得られるライセートによ
り、図１を用いて説明すると、ライセートにＥｔが加わ
ると、ライセート中に存在するＣ因子（Ｅｔ感受性因
子、分子量１２３，０００）が活性化され、生成した活
性型Ｃ因子がＢ因子（分子量６４，０００）の特定箇所
を限定水解して活性型Ｂ因子を生成し、活性型Ｂ因子は
プロクロッティングエンザイム（分子量５４，０００）
を活性化してクロッティングエンザイムに変換し、クロ
ッティングエンザイムはコアギュローゲン（凝固タンパ
ク、分子量１９，７２３）のジスルフィド結合で架橋さ
れたループ内の特定箇所、すなわち…Ａｒｇ¹⁸−Ｔｈｒ
¹⁹…の間および…Ａｒｇ⁴⁶−Ｇｌｙ⁴⁷…の間を限定水解
してＨ−Ｔｈｒ¹⁹…Ａｒｇ⁴⁶−ＯＨで表されるペプチド
Ｃ（アミノ酸２８残基）を遊離しつつ残余の部分がコア
ギュリンゲルに変換される、という一連の反応（カスケ
ード反応とも呼ばれる）である。以下Ｅｔによる活性化
に起因するカスケード反応をＣ因子系反応という。This reaction is performed, for example, by Japanese horseshoe crab (Ta
lysate obtained from chypleus tridentatus) will be described with reference to FIG. 1. When Et is added to the lysate, the C factor (Et sensitive factor, molecular weight 123,000) present in the lysate is activated and the active form thus produced is obtained. Factor C hydrolyzes a specific part of factor B (molecular weight 64,000) to produce active factor B, which is a proclotting enzyme (molecular weight 54,000).
Is converted to clotting enzyme, which is a specific site in the loop cross-linked by disulfide bond of coagulogen (coagulation protein, molecular weight 19,723), namely ... Arg ¹⁸ -Thr
¹⁹ ... is between and ... Arg ⁴⁶ -Gly ⁴⁷ ... free while remaining portions of the peptide C represented by limited hydrolysis to ^{H-Thr 19 ... Arg 46 -OH} ( amino 28 acid residues) between the Koagyu It is a series of reactions (also called a cascade reaction) of being converted into Ringer's. Hereinafter, the cascade reaction caused by the activation by Et is referred to as C factor reaction.

【０００４】一方、ライセートはＥｔだけでなく（１→
３）−β−Ｄ−グルカン類（以下β−グルカンともい
う）が加わっても凝固することが明らかになった。すな
わち、図１におけるＧ因子（β−グルカン感受性因子）
が活性化され、生成する活性型Ｇ因子がプロクロッティ
ングエンザイムをクロッティングエンザイムに活性化
し、コアギュリンゲルを生成するというカスケード反応
が起こる。以下β−グルカンによる活性化に起因するカ
スケード反応をＧ因子系反応という。On the other hand, the lysate is not only Et (1 →
3) It was revealed that coagulation occurs even when -β-D-glucans (hereinafter also referred to as β-glucan) are added. That is, factor G in FIG. 1 (β-glucan sensitivity factor)
Is activated, and the resulting activated factor G activates the pro-clotting enzyme into a clotting enzyme, thereby generating a coagulin gel in a cascade reaction. Hereinafter, a cascade reaction resulting from activation by β-glucan is referred to as a factor G system reaction.

【０００５】また、上記の各カスケード反応により生成
するクロッティングエンザイムは、反応系に別に添加さ
れる合成基質、例えばｔ−ブトキシカルボニル−ロイシ
ル−グリシル−アルギニン−パラニトロアニリド（Ｂｏ
ｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）のアミド結合を
水解してパラニトロアニリンを遊離する。したがって、
生成した発色物質（パラニトロアニリン）の吸光度を測
定することによりＥｔまたはβ−グルカンを定量でき
る。The clotting enzyme produced by each of the above-mentioned cascade reactions is a synthetic substrate added separately to the reaction system, for example, t-butoxycarbonyl-leucyl-glycyl-arginine-paranitroanilide (Bo).
The amide bond of (c-Leu-Gly-Arg-pNA) is hydrolyzed to release para-nitroaniline. Therefore,
Et or β-glucan can be quantified by measuring the absorbance of the produced coloring substance (paranitroaniline).

【０００６】このように通常のライセート中にはＣ因子
系反応とＧ因子系反応の両方の反応に関与する成分が含
まれているため、これを用いて検体中のＥｔを測定する
際には検体に含まれる可能性のあるβ−グルカンによっ
てＧ因子系反応が進行して正しい結果が得られない場合
がある。このように、いわゆるリムルステストはＥｔに
特異的な測定法ではないことが明らかにされ、Ｅｔを特
異的に測定する方法が種々検討されている。[0006] As described above, since the usual lysate contains components involved in both the C-factor reaction and the G-factor reaction, when using this to measure Et in a sample, The β-glucan that may be contained in the sample may cause the factor G system reaction to proceed and the correct result may not be obtained. As described above, the so-called Limulus test has been clarified as not a measurement method specific to Et, and various methods for specifically measuring Et have been studied.

【０００７】例えば、カードラン、パキマン、スクレロ
タン、レンチナン、シゾフィラン、コリオラン、ラミナ
ラン、パラミロン、カルボキシメチル化カードランから
なる群から選ばれた水溶性多糖をライセートと共存させ
ることによって、Ｃ因子系反応に影響を与えることなく
Ｇ因子の活性化を阻害し、エンドトキシンを特異的に測
定できることが知られている（ＵＳＰ ５，１７９，０
０６）。For example, by allowing a water-soluble polysaccharide selected from the group consisting of curdlan, pakiman, sclerotan, lentinan, schizophyllan, choriolan, laminaran, paramylon, and carboxymethylated curdlan to coexist with a lysate, a C factor reaction can be carried out. It is known that the activation of factor G can be inhibited and the endotoxin can be specifically measured without affecting (USP 5,179,0).
06).

【０００８】しかし、これらの多糖は一般に水に対する
溶解度が非常に低いため、大量に用いる必要があり、経
済的とはいえない。このような溶解度の低い多糖を用い
た場合、最小有効添加量を正確に求めることはできな
い。また、(1→3)-β-D-グルコシド構造単位を連続して
特定個数結合したポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分
を含有するポリグリコシドを有効成分とするＧ因子活性
化阻害剤を利用する方法も報告されている（ＰＣＴ国際
公開ＷＯ ９０／０２９５１）が、高力価の阻害剤を得
るためには、分解、分画等の複雑な工程を経る必要があ
った。However, since these polysaccharides generally have very low solubility in water, they need to be used in a large amount, which is not economical. When such a polysaccharide having low solubility is used, the minimum effective addition amount cannot be accurately determined. In addition, factor G activity with polyglycoside containing a poly (1 → 3) -β-D-glucoside structure part in which a specific number of (1 → 3) -β-D-glucoside structure units are continuously bonded as an active ingredient A method of utilizing a glycation inhibitor has also been reported (PCT International Publication WO 90/02951), but in order to obtain a high titer of the inhibitor, it was necessary to go through complicated steps such as decomposition and fractionation. .

【０００９】[0009]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ライ
セート試薬を用いて検体中のＥｔを測定するに際し、ラ
イセートに含まれるＧ因子（β−グルカン感受性因子）
の影響を受けずに、Ｃ因子系反応のみを利用して、Ｅｔ
を簡便かつ特異的に測定することである。DISCLOSURE OF THE INVENTION An object of the present invention is to measure factor G (β-glucan sensitivity factor) contained in lysate when Et in a sample is measured using a lysate reagent.
Et, using only the C-factor reaction without being affected by
Is a simple and specific measurement.

【００１０】[0010]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために、ライセート中のＣ因子系反応を阻
害せずに、Ｇ因子系反応、すなわちβ−グルカンによる
Ｇ因子の活性化および／または活性型Ｇ因子の活性を選
択的に阻害し、かつ水に対する溶解度の高い物質につい
て検討した。その結果、ライセートに(1→3)-β-D-グル
カン類のポリカルボン酸誘導体またはグリセリル誘導体
を共存させることによってＥｔによるＣ因子系反応が実
質的に阻害されず、かつβ−グルカンによるＧ因子系反
応が強く阻害されることを見出した。さらにまた、該物
質を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に
ライセート試薬を接触させることによって、ライセート
中のＧ因子のみを特異的に吸着除去できることを見出し
た。[Means for Solving the Problems] In order to achieve the above-mentioned object, the present inventors have conducted a G-factor reaction, that is, a G-factor reaction by β-glucan, without inhibiting the C-factor reaction in lysate. A substance that selectively inhibits the activity of activated and / or activated factor G and has a high solubility in water was examined. As a result, coexistence of the (1 → 3) -β-D-glucan polycarboxylic acid derivative or the glyceryl derivative in the lysate did not substantially inhibit the factor C system reaction by Et, and the β-glucan G It was found that the factor system reaction was strongly inhibited. Furthermore, it was found that by contacting an insoluble immobilized product obtained by immobilizing the substance on an insoluble carrier with a lysate reagent, only the G factor in the lysate can be specifically adsorbed and removed.

【００１１】本発明は、以下により構成される。 １）カブトガニ・アメボサイト・ライセート試薬に(1→
3)-β-D-グルカン類のポリカルボン酸誘導体またはグリ
セリル誘導体を共存させることを特徴とするエンドトキ
シンの特異的測定剤。 ２）カブトガニ・アメボサイト・ライセート試薬を用い
て検体中のエンドトキシンを測定するに際し、カブトガ
ニ・アメボサイト・ライセート試薬中および／または検
体中に(1→3)-β-D-グルカン類のポリカルボン酸誘導体
またはグリセリル誘導体を共存させ、該試薬中に含まれ
る成分のエンドトキシンに起因する変化を測定または判
定することを特徴とするエンドトキシンの特異的測定
法。 ３）検体とカブトガニ・アメボサイト・ライセート試薬
との混合物中の合成基質水解能を測定する、前記２）の
エンドトキシンの特異的測定法。 ４）検体とカブトガニ・アメボサイト・ライセート試薬
との混合物中のゲル形成能を判定または測定する、前記
２）のエンドトキシンの特異的測定法。 ５）(1→3)-β-D-グルカン類のポリカルボン酸誘導体ま
たはグリセリル誘導体を不溶性担体に固定化して得られ
る不溶性固定化物にカブトガニ・アメボサイト・ライセ
ート試薬を接触させることによって得られるエンドトキ
シンの特異的測定剤。 ６）前記不溶性担体が、セルロース、アガロース、架橋
デキストラン、ポリアクリルアミド、多孔質ガラスおよ
び親水性ポリビニル系合成ポリマーからなる群から選ば
れた担体のヒドラジン誘導体またはヒドラジド誘導体で
あることを特徴とする前記５）記載のエンドトキシンの
特異的測定剤。 ７）検体と前記５）または６）に記載の特異的測定剤を
混合し、該測定剤中に含まれる成分のエンドトキシンに
起因する変化を測定または判定することを特徴とするエ
ンドトキシンの特異的測定法。 ８）(1→3)-β-D-グルカン類のポリカルボン酸誘導体ま
たはグリセリル誘導体を有効成分として含有し、カブト
ガニ・アメボサイト中のＧ因子の（１→３）−β−Ｄ−
グルカンによる活性化を阻害する作用を有することを特
徴とするＧ因子活性化阻害剤。 以下、本発明を詳細に説明する。The present invention comprises the following: 1) For horseshoe crab, amebosite and lysate reagents (1 →
3) A specific measuring agent for endotoxin, which is characterized by coexisting a polycarboxylic acid derivative or a glyceryl derivative of -β-D-glucans. 2) When measuring endotoxin in a sample using a horseshoe crab amebosite lysate reagent, a polycarboxylic acid derivative of (1 → 3) -β-D-glucans in the horseshoe crab amebosite lysate reagent and / or the sample Alternatively, a specific assay method for endotoxin, which comprises coexisting with a glyceryl derivative and measuring or determining a change caused by endotoxin in a component contained in the reagent. 3) The specific assay method for endotoxin according to 2) above, which comprises measuring the hydrolytic ability of a synthetic substrate in a mixture of a sample and a horseshoe crab amebocyte lysate reagent. 4) The specific assay method for endotoxin according to 2) above, which comprises determining or measuring the gel-forming ability in a mixture of a sample and a horseshoe crab amebocyte lysate reagent. 5) The endotoxin obtained by contacting a horseshoe crab amebocyte lysate reagent with an insoluble immobilization product obtained by immobilizing a polycarboxylic acid derivative or glyceryl derivative of (1 → 3) -β-D-glucan on an insoluble carrier Specific measuring agent. 6) The insoluble carrier is a hydrazine derivative or a hydrazide derivative of a carrier selected from the group consisting of cellulose, agarose, crosslinked dextran, polyacrylamide, porous glass and hydrophilic polyvinyl synthetic polymer. ) A specific measuring agent for endotoxin as described above. 7) A specific measurement of endotoxin, which comprises mixing a sample with the specific measurement agent according to 5) or 6) above, and measuring or determining a change of a component contained in the measurement agent due to endotoxin. Law. 8) A polycarboxylic acid derivative or a glyceryl derivative of (1 → 3) -β-D-glucan is contained as an active ingredient, and (1 → 3) -β-D-of Factor G in horseshoe crab amebosite is contained.
A factor G activation inhibitor, which has an action of inhibiting activation by glucan. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

【００１２】本発明で使用される多糖誘導体は、(1→3)
-β-D-グルカン類のポリカルボン酸誘導体またはグリセ
リル誘導体である。(1→3)-β-D-グルカン類とは、(1→
3)-β-D-グルコシド結合のみから構成されるポリ(1→3)
-β-D-グルコシドの他、このポリ(1→3)-β-D-グルコシ
ドを主鎖とし、この主鎖中あるいは分岐構造中に(1→6)
-β-D-グルコシドや(1→4)-β-D-グルコシドなどの構造
部分を包含する化合物を意味する。該化合物のグルコー
ス残基の任意の水酸基（−ＯＨ）は、−ＯＲとしてして
化学修飾されていてもよい。ここで、Ｒはメチル基、ヒ
ドロキシメチル基、カルボキシメチル基、アセチル基、
ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、スルホプ
ロピル基、硫酸基、リン酸基等もしくはそれらの塩（金
属塩、アンモニウム塩及び有機アミン塩等）を表す。本
発明に使用されるポリカルボン酸誘導体の製法は、特に
制限はないが、(1→3)-β-D-グルカン類の(1→3)-β-D-
グルコシド以外のグルコース残基を開裂および酸化する
ことにより、そのグルコース残基１個当たり２個のカル
ボキシル基を形成する方法が挙げられる。開裂する方法
としては、過ヨウ素酸またはその塩を用いる方法が、開
裂により生じたジアルデヒドを酸化する方法としては、
亜塩素酸またはその塩を用いる方法が例示される。ポリ
カルボン酸誘導体の製造に用いられる(1→3)-β-D-グル
カン類は、上記開裂および酸化によりジカルボン酸を与
えるグルコース残基を必要とする。このような(1→3)-
β-D-グルカン類としては、(1→6)(1→3)-β-D-グルカ
ン類および(1→4)(1→3)-β-D-グルカン類が挙げられ
る。ここで、(1→6)(1→3)-β-D-グルカン類は、ポリ(1
→3)-β-D-グルコシドからなる主鎖に(1→6)-β-D-グル
コシル分岐を有するものであり、その分岐構造は、ポリ
(1→3)-β-D-グルコシドのグルコース残基の６位の水酸
基と(1→6)-β-結合したグルコース残基を少なくとも１
個含む構造である。従って、この分岐構造はポリ(1→6)
-β-D-グルコシド構造を含む。また、該ポリ(1→6)-β-
D-グルコシド構造に主鎖以外のポリ(1→3)-β-D-グルコ
シド構造が連結していてもよい。また、(1→4)(1→3)-
β-D-グルカン類はポリ(1→4)-β-D-グルコシド構造と
ポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造が交互に連結して主鎖
を成すものである。例えば、(1→6)-β-D-グルコシル分
岐(1→3)-β-D-グルカン類〔(1→6)(1→3)-β-D-グルカ
ン類〕のポリカルボキシル化は基本的にはHofreiterら
の方法（J.Am. Chem. Soc., 7, 6457-6460 (1957）) に
より達成される。すなわち、過ヨウ素酸またはその塩
（ナトリウム塩、カリウム塩等）により、該(1→6)-β-
D-グルコシル分岐(1→3)-β-D-グルカン類の(1→3)-β-
D-グルコシドを除く過ヨウ素酸酸化が可能なグルコース
残基（即ち、隣接して水酸基がある結合）、例えば、(1
→6)-β-D-グルコシドの場合は、２位と３位、３位と４
位の各結合を酸化開裂し、蟻酸の生成と共に２，４−ジ
アルデヒド体とした後、亜塩素酸塩で更に酸化すること
により該グルコース１残基あたり次式（１）で表される
２個のカルボキシル基をもつ基を有したポリカルボン酸
誘導体が得られる。The polysaccharide derivative used in the present invention is (1 → 3)
It is a polycarboxylic acid derivative or a glyceryl derivative of -β-D-glucan. What is (1 → 3) -β-D-glucans?
3) Poly (1 → 3) composed only of β-D-glucoside bonds
In addition to -β-D-glucoside, this poly (1 → 3) -β-D-glucoside has a main chain, and (1 → 6) in the main chain or branched structure.
It means a compound including structural parts such as -β-D-glucoside and (1 → 4) -β-D-glucoside. Any hydroxyl group (-OH) of the glucose residue of the compound may be chemically modified as -OR. Here, R is a methyl group, a hydroxymethyl group, a carboxymethyl group, an acetyl group,
It represents a hydroxyethyl group, a hydroxypropyl group, a sulfopropyl group, a sulfuric acid group, a phosphoric acid group or the like or a salt thereof (a metal salt, an ammonium salt, an organic amine salt or the like). The method for producing the polycarboxylic acid derivative used in the present invention is not particularly limited, but (1 → 3) -β-D-glucans (1 → 3) -β-D-
A method of forming two carboxyl groups per glucose residue by cleaving and oxidizing a glucose residue other than glucoside can be mentioned. As a method for cleavage, a method using periodate or a salt thereof, as a method for oxidizing a dialdehyde generated by cleavage,
A method using chlorous acid or a salt thereof is exemplified. The (1 → 3) -β-D-glucans used for producing the polycarboxylic acid derivative require a glucose residue which gives a dicarboxylic acid by the above cleavage and oxidation. Like this (1 → 3)-
Examples of β-D-glucans include (1 → 6) (1 → 3) -β-D-glucans and (1 → 4) (1 → 3) -β-D-glucans. Here, (1 → 6) (1 → 3) -β-D-glucans are poly (1
→ 3) -β-D-glucoside has a (1 → 6) -β-D-glucosyl branch in the main chain, the branch structure is poly
At least 1 glucose residue that is (1 → 6) -β-bonded to the 6th hydroxyl group of the glucose residue of (1 → 3) -β-D-glucoside
It is a structure that includes individual pieces. Therefore, this branched structure is poly (1 → 6)
Includes -β-D-glucoside structure. In addition, the poly (1 → 6) -β-
A poly (1 → 3) -β-D-glucoside structure other than the main chain may be linked to the D-glucoside structure. Also, (1 → 4) (1 → 3)-
β-D-glucans are poly (1 → 4) -β-D-glucoside structures and poly (1 → 3) -β-D-glucoside structures that are alternately linked to form a main chain. For example, polycarboxylation of (1 → 6) -β-D-glucosyl branched (1 → 3) -β-D-glucans [(1 → 6) (1 → 3) -β-D-glucans] Basically, it is achieved by the method of Hofreiter et al. (J. Am. Chem. Soc., 7, 6457-6460 (1957)). That is, the period (1 → 6) -β-
D-glucosyl branched (1 → 3) -β-D-glucans (1 → 3) -β-
A glucose residue capable of periodic acid oxidation (ie, a bond having a hydroxyl group adjacent to it) excluding D-glucoside, for example, (1
→ 6) -β-D-glucoside, 2nd and 3rd, 3rd and 4th
By oxidatively cleaving each bond at the position to form a 2,4-dialdehyde with the formation of formic acid, the glucose is further oxidized with chlorite to give 2 per glucose residue represented by the following formula (1): A polycarboxylic acid derivative having a group with 4 carboxyl groups is obtained.

【００１３】[0013]

【化１】 Embedded image

【００１４】本発明に使用されるポリカルボン酸誘導体
の原料の(1→3)-β-D-グルカン類は、ＰＣＴ国際公開Ｗ
Ｏ９０／０２９５１に記載された如く、１分子中に分岐
構造あるいは修飾基（式（１）の基を含む）を有さない
(1→3)-β-D-グルコシドが、特定個数（２〜３７０個）
連結した部分を、少なくとも１ヶ所有したものであれば
良い。その分子量には特に制限はないが、通常、４００
〜１，０００，０００の範囲のものが用いられる。本発
明に使用されるポリカルボン酸誘導体の式（１）の基が
導入可能なグルコール残基（即ち、隣接して水酸基をも
つグルコース残基）当たりの置換度（ＤＳ）は通常、
０．００１〜１、好ましくは、０．０１〜１である。本
発明に使用される(1→6)-β-D-グルコシル分岐(1→3)-
β-D-グルカン類は、天然にはサルノコシカケ科等に属
する担子菌類から得られ、具体例としてはSclerotinia
属由来のスクレロタン、Schizophyllum属（スエヒロタ
ケ）由来のシゾフィラン、Sclerotium属, Corticium属,
Stromatinia属等に由来するスクレログルカン類、Lent
inus属（シイタケ）由来のレンチナン等が挙げられる。
例えば、化２に示すシゾフィランおよびそれを過ヨウ素
酸酸化を通して得られるシゾフィランのポリカルボン酸
誘導体（化３に示す）の構造式は次で示される。The (1 → 3) -β-D-glucans, which are the raw materials of the polycarboxylic acid derivative used in the present invention, are available in PCT International Publication W
As described in O90 / 02951, it does not have a branched structure or a modifying group (including the group of formula (1)) in one molecule.
Specific number of (1 → 3) -β-D-glucosides (2-370)
It is sufficient if at least one connected part is owned. The molecular weight is not particularly limited, but usually 400
Those in the range of up to 1,000,000 are used. In the polycarboxylic acid derivative used in the present invention, the substitution degree (DS) per glucose residue (that is, glucose residue having a hydroxyl group adjacent to it) to which the group of formula (1) can be introduced is usually
It is 0.001-1, preferably 0.01-1. (1 → 6) -β-D-glucosyl branched (1 → 3) -used in the present invention
β-D-glucans are naturally obtained from basidiomycetes belonging to the family Asteraceae and the like, and specific examples include Sclerotinia
Genus-derived sclerotane, Schizophyllum-derived schizophyllan, Sclerotium genus, Corticium genus,
Lent, a scleroglucan derived from the genus Stromatinia
Examples include lentinan derived from genus inus (Shiitake mushroom).
For example, the structural formulas of schizophyllan shown in Chemical formula 2 and a polycarboxylic acid derivative of schizophyllan obtained by oxidizing it with periodic acid (shown in Chemical formula 3) are shown below.

【００１５】[0015]

【化２】 Embedded image

【００１６】[0016]

【化３】 Embedded image

【００１７】また、(1→4)(1→3)-β-D-グルカン類とし
ては、天然に存在するCetraria属、Usnea属、Evernia属
等に由来するリケナンやオオムギ胚乳中に含まれるβ-
グルカン等が挙げられる。Further, (1 → 4) (1 → 3) -β-D-glucans include β contained in lichenan and barley endosperm derived from naturally-occurring genus Cetraria, Usnea, Evernia, etc. -
Examples include glucan and the like.

【００１８】本発明のグリセリル誘導体は、前記(1→3)
-β-D-グルカン類のグルコース残基の水酸基がグリセリ
ル化されたものであり、次式（２）で表すことができ
る。 （Ｄ）_p Ｃ （２） （ここで、Ｄは−Ｏ−ＣＨ₂ −ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂ Ｏ
Ｈを表し、Ｃは(1→3)-β-D-グルカン類中のグルコース
残基であり、該残基中ｐ個の水酸基がＤで置換されてい
る。ここで、p は０〜３の整数を表わす。） 本発明に使用されるグリセリル誘導体は、ＰＣＴ国際公
開ＷＯ９０／０２９５１に記載の方法、即ち、Ｇ因子活
性化物質、Ｇ因子、凝固酵素前駆体、及び凝固酵素が水
解しうる発色合成基質を含有する反応混液に検体あるい
は蒸留水を添加し、一定時間加温した後、遊離する発色
物質（パラニトロアニリン等）を比色定量し、比較する
ことにより、検体のＧ因子活性化阻害能を測定する方
法、で定義、測定されるＧ因子活性化阻害力価が１００
単位／ｍｇ以上になるように置換度を調節して修飾基を
導入することにより得られる。この際置換基Ｄの置換度
（ＤＳ：(1→3)-β-D-グルコシド１残基当たりのＤの
数）は通常、０．００１〜１、好ましくは、０．０１〜
０．９である。本発明のグリセリル誘導体の分子量に
は、制限はないが、通常４００〜１，０００，０００の
範囲である。該(1→3)-β-D-グルカン類のグリセリル化
は、Kishidaらの方法（Carbohydr.Polym., 17, 89-95
(1992）) により達成される。すなわち、該グルカン類
を0.4-0.5Nのアルカリ性水溶液に溶解後、エピクロルヒ
ドリンを5％(v/v)程度加えて30〜50℃で1〜5時間加温し
てエポキシ化誘導体とした後、蒸留水に対して透析す
る。得られたエポキシ化誘導体を0.1Nのアルカリ性水溶
液に溶かし、55℃で5〜7時間攪拌する。室温まで冷却
後、蒸留水に対して透析することによりグリセリル誘導
体が得られる。以上の反応を式で示すと以下の通りとな
る。ただし、Ｃ⁶ はグルコース残基を示す。The glyceryl derivative of the present invention has the above-mentioned (1 → 3)
The hydroxyl group of the glucose residue of -β-D-glucan is glycerylated and can be represented by the following formula (2). (D) _p C (2) (where D is —O—CH ₂ —CH (OH) —CH ₂ O
Representing H, C is a glucose residue in (1 → 3) -β-D-glucans, in which p hydroxyl groups are substituted with D. Here, p represents an integer of 0 to 3. The glyceryl derivative used in the present invention contains the method described in PCT International Publication WO90 / 02951, that is, a factor G activator, a factor G, a coagulation enzyme precursor, and a chromogenic synthetic substrate that can be hydrolyzed by the coagulation enzyme. After the sample or distilled water is added to the reaction mixture, and the sample is heated for a certain period of time, the color-developing substances (paranitroaniline etc.) released are colorimetrically determined and compared to measure the factor G activation inhibitory ability of the sample. The factor G activation inhibitory titer defined and measured by
It is obtained by adjusting the degree of substitution so that the unit / mg or more and introducing a modifying group. At this time, the substitution degree of the substituent D (DS: (1 → 3) -β-D-glucoside, the number of D per residue) is usually 0.001-1, preferably 0.01-
It is 0.9. The molecular weight of the glyceryl derivative of the present invention is not limited, but is usually in the range of 400 to 1,000,000. Glycerylation of the (1 → 3) -β-D-glucans is performed by the method of Kishida et al. (Carbohydr. Polym., 17, 89-95
(1992)). That is, the glucans were dissolved in an alkaline aqueous solution of 0.4-0.5N, epichlorohydrin was added at about 5% (v / v), and the mixture was heated at 30 to 50 ° C for 1 to 5 hours to give an epoxidized derivative, and then distilled. Dialyze against water. The obtained epoxidized derivative is dissolved in 0.1N alkaline aqueous solution and stirred at 55 ° C. for 5 to 7 hours. After cooling to room temperature, the glyceryl derivative is obtained by dialyzing against distilled water. The above reaction is expressed by the following equation. However, C ⁶ represents a glucose residue.

【００１９】[0019]

【化４】 [Chemical 4]

【００２０】式（２）において、Ｄの置換度は、オキシ
ラン基導入反応のｐＨ、温度、時間および該グルカン類
に対するエピクロルヒドリンの使用量を調整することに
より可能である。グリセリル化される(1→3)-β-D-グル
カン類のうち、天然から得られるものとしては、Alcali
genes属、Rhizobium属等の土壌細菌から細胞外に分泌さ
れるカードランおよび類似グルカン、鞭毛藻（Euglena
属）由来のパラミロン、高等植物の繊維組織由来のβ-
グルカン、高等植物の篩管から抽出されるカロース、褐
藻類由来のラミナラン等が挙げられる。またこれらのグ
ルカン類を酸あるいは酵素分解し、低分子化した後用い
てもよい。In the formula (2), the substitution degree of D can be adjusted by adjusting the pH, temperature, time of the oxirane group introduction reaction and the amount of epichlorohydrin used for the glucans. Among the (1 → 3) -β-D-glucans that are glycerylated, those obtained from nature include Alcali
Curdlan and similar glucans secreted extracellularly from soil bacteria such as gene gene and Rhizobium gene, and flagella (Euglena)
Genus), β- derived from higher plant fibrous tissue
Examples include glucan, callose extracted from the phloem of higher plants, and laminaran derived from brown algae. Further, these glucans may be acid- or enzymatically decomposed to reduce the molecular weight thereof and then used.

【００２１】本発明で使用されるカブトガニ・アメボサ
イト・ライセート試薬（以下、単にライセート試薬とも
いう）としては、リムルス・ポリフェムス（Limulus p
olyphemus）、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypl
eus tridentatus）、タキプレウス・ギガス（T. giga
s）、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carci
noscorpius rotundicauda）等のカブトガニ血リンパ液
から、通常の方法（例えば、J. Biochem., 80, 1011-10
21(1976)参照）により調製した血球抽出物を挙げること
ができる。また、これらの抽出物にＣ因子の活性化に有
効な二価金属塩〔例えば、マグネシウム、カルシウム、
ストロンチウムなどのアルカリ土類金属のハロゲン化水
素酸塩（塩化物など）、硫酸塩等〕、クロッティングエ
ンザイムの基質（例えば、前記のＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡのような合成基質）、ｐＨ調整剤
（トリス−塩酸緩衝液などの緩衝剤）を必要に応じて添
加したものであってもよい。さらに、ライセート試薬と
しては、市販のものも使用することができる。なお、こ
のようなライセート試薬は液体、粉末、固形物等のいず
れの形態であってもよい。The horseshoe crab amebosite lysate reagent (hereinafter also simply referred to as lysate reagent) used in the present invention is Limulus polyphemus (Limulus p).
olyphemus), Tachyplus tridentatus (Tachypl
eus tridentatus), T. giga (T. giga
s), Carcino Scorpius Rotundikauda (Carci
noscorpius rotundicauda) etc. from the horseshoe crab hemolymph fluid and the usual method (eg, J. Biochem., 80, 1011-10
21 (1976)). In addition, divalent metal salts effective for the activation of factor C in these extracts [eg, magnesium, calcium,
Alkaline earth metal hydrohalides (chlorides, sulfates, etc.) such as strontium], substrates for clotting enzymes (eg, Boc-Leu-Gl described above).
A synthetic substrate such as y-Arg-pNA) or a pH adjuster (buffer such as Tris-HCl buffer) may be added as necessary. Furthermore, as the lysate reagent, a commercially available product can be used. It should be noted that such a lysate reagent may be in any form such as liquid, powder or solid.

【００２２】本発明の目的を達成するためには、（Ａ）
ライセート試薬に該多糖誘導体を共存させ、Ｇ因子系反
応に関与する成分が不活化されたライセート試薬（以下
「多糖誘導体含有ライセート試薬」ということもある）
として測定に供する方法、（Ｂ）検体中に該多糖誘導体
を添加することによって共存させ、通常のライセート試
薬を使用してこの該多糖誘導体添加検体を測定する際に
ライセート試薬中のＧ因子系反応に関与する成分の活性
化を阻害する方法、（Ｃ）（Ａ）および（Ｂ）の併用、
すなわちライセート試薬と検体双方に該多糖誘導体を共
存させる方法、または（Ｄ）該多糖誘導体を不溶性担体
に固定化して得られる不溶性固定化物にライセート試薬
を接触させ、ライセート試薬中のＧ因子を吸着除去する
ことにより、エンドトキシンに特異的に反応する測定剤
であるライセート試薬（以下、「Ｇ因子不含ライセート
試薬」ということもある）を得、これを測定に供する方
法等が採用される。To achieve the object of the present invention, (A)
A lysate reagent in which the polysaccharide derivative is allowed to coexist in the lysate reagent, and the components involved in the factor G system reaction are inactivated (hereinafter also referred to as "polysaccharide derivative-containing lysate reagent").
And (B) adding the polysaccharide derivative to the sample so that they coexist and using a normal lysate reagent to measure this polysaccharide derivative-added sample, the G factor-based reaction in the lysate reagent A method of inhibiting the activation of components involved in (C), (A) and (B) in combination,
That is, a method of allowing the polysaccharide derivative to coexist in both the lysate reagent and the specimen, or (D) contacting an insoluble immobilized product obtained by immobilizing the polysaccharide derivative on an insoluble carrier and adsorbing and removing the G factor in the lysate reagent As a result, a lysate reagent (hereinafter, also referred to as “factor G-free lysate reagent”), which is a measuring agent that reacts specifically with endotoxin, is obtained, and a method of providing this for measurement or the like is adopted.

【００２３】ここで、ライセート試薬中のＧ因子系反応
を完全に阻害するのに必要な該多糖誘導体の量は、例え
ば、次のようにして決定することができる。氷冷下、一
定量のライセート試薬に、該多糖誘導体（Ｅｔを含有し
ないもの）の量を変えて加え、それらに通常の測定条件
下においてライセート試薬を充分に活性化する一定量の
β−グルカン（Ｅｔを含有しないもの）を加えて、通常
のライセート試薬使用時と同条件で反応させる。この条
件下でβ−グルカンによるライセート試薬の活性化を完
全に阻害する該多糖誘導体の量を求める。Here, the amount of the polysaccharide derivative necessary to completely inhibit the factor G system reaction in the lysate reagent can be determined, for example, as follows. Under ice-cooling, the amount of the polysaccharide derivative (without Et) was added to a certain amount of lysate reagent, and a certain amount of β-glucan that sufficiently activated the lysate reagent under normal measurement conditions was added to them. (Not containing Et) is added and the reaction is carried out under the same conditions as when using a normal lysate reagent. The amount of the polysaccharide derivative that completely inhibits the activation of the lysate reagent by β-glucan under these conditions is determined.

【００２４】Ｅｔを測定する方法において該多糖誘導体
をライセート試薬および／または検体中に共存させる方
法としては、例えば、下記〜等が挙げられる。 ライセート試薬の抽出調製時に該多糖誘導体を添加
して調製した多糖誘導体含有ライセート試薬を使用する
方法。 抽出したライセート試薬に該多糖誘導体を添加した
多糖誘導体含有ライセート試薬を使用する方法。 ライセート試薬の凍結乾燥品を該多糖誘導体含有溶
液で溶解した多糖誘導体含有ライセート試薬を使用する
方法。 ライセート試薬の凍結乾燥品を適当な溶解液で溶解
した溶液に該多糖誘導体を添加して調製した多糖誘導体
含有ライセート試薬を使用する方法。 該多糖誘導体を添加して抽出調製したライセート試
薬またはライセート試薬中に予め必要量の該多糖誘導体
を共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当な溶解液で溶解
した多糖誘導体含有ライセート試薬を使用する方法。 ライセート試薬と合成基質の凍結乾燥品を該多糖誘
導体含有溶液で溶解するかまたは適当な溶液で溶解して
調製した溶液に、該多糖誘導体を添加する方法。 ライセート試薬と合成基質の混合液中に予め必要量
の該多糖誘導体を共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当
な溶解液で溶解して用いる方法。 必要量の該多糖誘導体を検体に添加する方法。In the method of measuring Et, examples of the method of allowing the polysaccharide derivative to coexist in the lysate reagent and / or sample include the following. A method of using a polysaccharide derivative-containing lysate reagent prepared by adding the polysaccharide derivative during extraction and preparation of a lysate reagent. A method of using a polysaccharide derivative-containing lysate reagent in which the polysaccharide derivative is added to the extracted lysate reagent. A method using a lysate reagent containing a polysaccharide derivative, which is obtained by dissolving a lyophilized lysate reagent in a solution containing the polysaccharide derivative. A method of using a polysaccharide derivative-containing lysate reagent prepared by adding the polysaccharide derivative to a solution prepared by dissolving a freeze-dried lysate reagent with an appropriate solution. Use is made of a lysate reagent containing the polysaccharide derivative, which is extracted and prepared, or a lysate reagent containing a polysaccharide derivative prepared by dissolving a reagent obtained by freeze-drying the lysate reagent in the presence of a necessary amount of the polysaccharide derivative in advance by lyophilization. Method. A method of adding the polysaccharide derivative to a solution prepared by dissolving a freeze-dried product of a lysate reagent and a synthetic substrate in the polysaccharide derivative-containing solution or a solution prepared by dissolving it in an appropriate solution. A method in which a necessary amount of the polysaccharide derivative is allowed to coexist in a mixed solution of a lysate reagent and a synthetic substrate in advance and lyophilized to obtain a reagent, which is dissolved in an appropriate solution to be used. A method of adding a necessary amount of the polysaccharide derivative to a sample.

【００２５】要するに、本発明を使用したＥｔの測定法
においては、ライセート試薬中のＣ因子系反応が目的に
合った感度及び測定範囲で機能し、Ｅｔの定量もしくは
定性的測定が可能であれば、該多糖誘導体の使用法は任
意である。また、該多糖誘導体を固定化するために用い
られる不溶性担体としては、水酸基やカルバモイル基な
どの親水性の基を有する不溶性担体であれば何れも使用
可能である。これらの不溶性担体としては、セルロース
（例えば、セルロースパウダー（アドバンテック東洋販
売）、セルロファイン（生化学工業（株）販売）、アビ
セル（フナコシ薬品販売）、セレックス（バイオラッド
販売）など）、アガロース（例えば、セファロース（フ
ァルマシア販売）、バイオゲルＡ（バイオラッド販
売）、クロマゲルＡ（同仁化学販売）、サガバック（セ
ラバックラボラトリーズ販売）、ゲラロース（リテック
ス販売）、Ｐ−Ｌアガロース（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ
販売）など）、架橋デキストラン（例えば、セファデッ
クスＧ、セファクリル（ファルマシア販売）、Ｐ−Ｌデ
ックス（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ販売）など）、ポリア
クリルアミド（例えば、バイオゲルＰ（バイオラッド販
売）、クロマゲルＰ（同仁化学販売）など）、多孔質ガ
ラス（例えば、バイオグラス（バイオラッド販売）な
ど）、親水性ポリビニル系合成ポリマー（例えば、トヨ
パール（東ソー販売）など）などが挙げられる。これら
の不溶性担体に該多糖誘導体を固定化するためには不溶
性担体を活性化する必要がある。この方法としては、種
々のものがあり、例えば、水酸基を有する担体に対して
は、臭化シアンによる方法（R. Axen. J. Porath., and
S. Ernback, Nature, 214, 1302(1967)) やオキシラン
類による方法(J. Porath and N.Fornstedt, J. Chromat
ogr., 51, 479(1970)およびL. Sundberg and J. Porat
h,J. Chromatogr., 90, 87(1974) 、又、カルバモイル
基を有する担体に対しては、アルキルジアミンを用いて
アミノアルキルアミン誘導体とする方法やヒドラジンを
用いてヒドラジド誘導体とする方法( 共にJ. K. Inman
and H. M. Dintzis,Biochemistry, 8, 4074(1969)) な
どが挙げられるが、安定でかつ非特異的吸着の少ない方
法としては、エピクロルヒドリンやビスオキシラン類を
用いてエポキシ活性化し、得られたエポキシ活性化不溶
性担体を更に抱水ヒドラジンあるいはジヒドラジド化合
物と反応させて得たヒドラジン誘導体またはヒドラジド
誘導体を活性化体として用いる方法（松本勲武ら、特公
平５−５３８０２）が優れている。本発明の測定剤を用
いてＥｔを測定するには、図１のカスケード反応によっ
て生成するクロッティングエンザイムの活性を公知の方
法で測定すればよい。In summary, in the method for measuring Et using the present invention, if the factor C system reaction in the lysate reagent functions with a sensitivity and a measuring range suitable for the purpose, and quantitative or qualitative measurement of Et is possible. The method of using the polysaccharide derivative is arbitrary. Further, as the insoluble carrier used for immobilizing the polysaccharide derivative, any insoluble carrier having a hydrophilic group such as a hydroxyl group or a carbamoyl group can be used. Examples of these insoluble carriers include cellulose (for example, cellulose powder (sold by Advantech Toyo), cellulofine (sold by Seikagaku Corporation), Avicel (sold by Funakoshi Chemical Co., Ltd.), SELEX (sold by Bio-Rad), agarose (for example, , Sepharose (Pharmacia sales), Biogel A (BioRad sales), Chromagel A (Dojindo sales), Sagavac (Ceraback Laboratories sales), Gerarose (Litex sales), PL agarose (PL Biochemicals sales), etc. ), Cross-linked dextran (for example, Sephadex G, Sephacryl (marketed by Pharmacia), P-Ldex (marketed by PL Biochemicals), etc.), polyacrylamide (for example, Biogel P (marketed by Bio-Rad), Chromagel P (Dojindo Chemical Co., Ltd.) Sale Etc.), porous glass (e.g., bioglass (BioRad sold), etc.), hydrophilic polyvinyl synthetic polymer (e.g., Toyopearl (Tosoh sold), etc.) and the like. In order to immobilize the polysaccharide derivative on these insoluble carriers, it is necessary to activate the insoluble carriers. There are various methods, for example, for a carrier having a hydroxyl group, a method using cyanogen bromide (R. Axen. J. Porath., And
S. Ernback, Nature, 214, 1302 (1967)) and methods using oxiranes (J. Porath and N. Fornstedt, J. Chromat
ogr., 51, 479 (1970) and L. Sundberg and J. Porat
h, J. Chromatogr., 90, 87 (1974), or for a carrier having a carbamoyl group, a method of using an alkyldiamine to form an aminoalkylamine derivative or a method of forming a hydrazide derivative using hydrazine (both. JK Inman
and HM Dintzis, Biochemistry, 8, 4074 (1969)), etc., but a stable and less nonspecific adsorption method is epoxy activation using epichlorohydrin or bisoxiranes, and the obtained epoxy activation A method in which a hydrazine derivative or a hydrazide derivative obtained by further reacting an insoluble carrier with a hydrazine hydrate or dihydrazide compound is used as an activator (Matsumoto Nobutake et al., Japanese Patent Publication No. 5-53802) is excellent. To measure Et using the measuring agent of the present invention, the activity of the clotting enzyme produced by the cascade reaction of FIG. 1 may be measured by a known method.

【００２６】クロッティングエンザイムのアミダーゼ活
性の測定には、基質として、例えば前記のｐ−ニトロア
ニリンのような発色性残基を有するペプチド合成基質も
しくは発色性残基を有するこれと類似の配列のペプチド
合成基質、またはこれと同一もしくは類似の配列のペプ
チドであって、Ｃ末端のアミノ酸のカルボキシル基に前
記発色性残基の代わりに公知の発蛍光性残基、発光性残
基、アンモニアなどがアミド結合により置換したペプチ
ド合成基質を使用することができる。クロッティングエ
ンザイムがこれらの合成基質に作用して生成する反応生
成物を測定することによって、アミダーゼ活性の測定を
行うことができる。具体的には、本発明の測定剤とＥｔ
を含む反応系に上記ペプチド合成基質を共存させ、反応
（カスケード反応および必要に応じて生成物の他色素等
への変換反応）によって生成する色素、蛍光物質または
アンモニアをそれぞれ分光光度計、蛍光光度計、化学発
光測定装置、アンモニア検出用電極（特開昭６２−１４
８８６０）等によって測定する方法を例示することがで
きる。To measure the amidase activity of the clotting enzyme, for example, a peptide synthetic substrate having a chromogenic residue such as p-nitroaniline mentioned above as a substrate or a peptide having a sequence similar to this having a chromogenic residue is used. A synthetic substrate, or a peptide having the same or similar sequence to the synthetic substrate, wherein a known fluorogenic residue, a luminescent residue, ammonia, etc. is an amide at the C-terminal amino acid carboxyl group instead of the chromogenic residue. Peptide synthetic substrates displaced by conjugation can be used. The amidase activity can be measured by measuring the reaction product produced by the clotting enzyme acting on these synthetic substrates. Specifically, the measuring agent of the present invention and Et
The above-mentioned peptide synthesis substrate is allowed to coexist in a reaction system containing a dye, a fluorescent substance or ammonia produced by the reaction (a cascade reaction and a conversion reaction of the product to another dye etc. if necessary), respectively, by a spectrophotometer and a fluorophotometer. Meter, chemiluminescence measuring device, ammonia detection electrode (Japanese Patent Laid-Open No. 62-14
8860) and the like.

【００２７】クロッティングエンザイムのプロテアーゼ
活性の測定には、本発明の測定剤中に含まれる（もしく
は別途添加した）コアギュローゲン（基質）にクロッテ
ィングエンザイムが作用してコアギュリンゲルが生成す
る際のゲル形成反応を、例えば適当な機器（例えば、濁
度測定装置、粘度測定装置等）で測定するか、または肉
眼で判定する方法を採用することができる。The clotting enzyme's protease activity can be measured by measuring the clotting enzyme acting on the coagulogen (substrate) contained in the measuring agent of the present invention (or added separately) to produce a coagulin gel. The method for measuring the gel forming reaction of (1) can be adopted, for example, by measuring with an appropriate device (for example, turbidity measuring device, viscosity measuring device, etc.) or visually determining.

【００２８】本発明を使用する際には、リムルス反応に
際し、前記カスケード反応系の活性化に有効な２価金属
塩を共存させる必要がある。このような２価金属塩とし
ては、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウムなど
のアルカリ土類金属のハロゲン化水素酸塩（塩化物
等）、硫酸塩等が例示される。また、本発明の測定剤に
おいては、上記金属塩をリムルス反応時に別に添加して
もよいが、通常ライセート試薬に上記２価金属塩を共存
させた状態で、非加熱条件下での乾燥処理（例えば、凍
結乾燥）を行って固体状態にしたものが望ましい。さら
に、上記アミダーゼ活性を測定するための測定剤は、２
価金属塩のほかに前記ペプチド合成基質を共存させたも
のであることが好ましく、これを乾燥処理したものであ
ってもよい。When using the present invention, it is necessary to coexist with a divalent metal salt effective for activation of the cascade reaction system in the Limulus reaction. Examples of such divalent metal salts include hydrohalides (chlorides and the like) of alkaline earth metals such as magnesium, calcium and strontium, and sulfates. Further, in the measuring agent of the present invention, the above metal salt may be added separately during the Limulus reaction, but usually, in the state where the above divalent metal salt coexists in the lysate reagent, a drying treatment under non-heating conditions ( For example, it is desirable that the solid state be obtained by freeze-drying. Furthermore, the measuring agent for measuring the amidase activity is 2
It is preferable that the peptide synthesis substrate coexists in addition to the valent metal salt, and it may be dried.

【００２９】本発明によりＥｔが測定される検体として
は、基本的には特に制限なく、Ｅｔ定量の必要があるも
のあるいはその存否を確認する必要があるものであれば
よい。例えば、生体試料、医薬品、医療分野で使用する
水等を挙げることができる。The sample for which Et is to be measured according to the present invention is basically not particularly limited as long as it needs to be quantified for Et or the presence or absence of its presence needs to be confirmed. Examples thereof include biological samples, pharmaceuticals, water used in the medical field, and the like.

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.

【００３０】調製例１：グリセリルカードランの調製 グリセリルカードランは、Kishidaらの方法（Carbohyd
r. Polym., 17, 89-95(1992）) に従い調製した。すな
わち、カードラン（和光純薬工業(株)販売）200mgを0.5
MNaOH、100mLに溶解し、これにエピクロルヒドリン4.2m
Lを加え、攪拌しながら40℃で２時間加温した後、Etお
よびβ-グルカンを含まない蒸留水（以下DWともいう）
に対して透析した。透析内液を凍結乾燥し、エポキシ化
カードラン（カードランエポキシド）を得た（185m
g）。カードランエポキシドの150mgを0.1MNaOH、40mLに
溶かし、55℃で6時間攪拌した。室温まで冷却後、反応
混液をDWに対して透析し、透析内液を凍結乾燥して、グ
リセリルカードラン138mgを得た。得られたグリセリル
カードランの置換度（ＤＳ）は、SundbergとPorathの方
法（J. Chromatogr., 90, 87-98 (1974）) から0.14と
推定された。Preparation Example 1: Preparation of glyceryl curdlan Glyceryl curdlan was prepared according to the method of Kishida et al. (Carbohyd
r. Polym., 17, 89-95 (1992)). That is, curdlan (sold by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 200 mg 0.5
Dissolve in 100 mL of MNaOH and add 4.2 m of epichlorohydrin to it.
After adding L and heating at 40 ° C for 2 hours with stirring, distilled water without Et and β-glucan (hereinafter also referred to as DW)
It was dialyzed against. The dialysis solution was freeze-dried to obtain epoxidized curdlan (curdlan epoxide) (185m
g). 150 mg of curdlan epoxide was dissolved in 40 mL of 0.1 M NaOH and stirred at 55 ° C. for 6 hours. After cooling to room temperature, the reaction mixture was dialyzed against DW, and the dialyzed solution was freeze-dried to obtain 138 mg of glyceryl curdlan. The degree of substitution (DS) of the obtained glyceryl curdlan was estimated to be 0.14 from the method of Sundberg and Porath (J. Chromatogr., 90, 87-98 (1974)).

【００３１】調製例２：ポリカルボキシル化シゾフィラ
ンの調製 ポリカルボキシル化シゾフィランは、Hofreiterらの方
法に従い調製した。すなわち、スエヒロタケ由来のシゾ
フィラン（科研製薬販売、商品名ソニフィランをDWに対
して透析後、凍結乾燥したもの）100mgを90mLのDWに溶
かし、0.1M過ヨウ素酸ナトリウム10mLを加えて、遮光下
4℃で170時間反応させ、酸化した。過ヨウ素酸塩の消費
はAvigadの方法（Carbohydr. Res., 11, 119 (1969）)
で追跡した。過剰のエチレングリコールを加えて反応停
止した後、DWに対して透析し、その透析内液に亜塩素酸
ナトリウム（酢酸により、pH4.0に調整したもの、終濃
度40mM）を加え、25℃で12時間反応させ酸化し、DWに対
して透析した後、透析内液を凍結乾燥し、ＤＳ０．８３
のポリカルボキシル化シゾフィラン（Na塩）を得た（収
率93.3％）。Preparation Example 2: Preparation of polycarboxylated schizophyllan Polycarboxylated schizophyllan was prepared according to the method of Hofreiter et al. That is, 100 mg of Schizophyllan derived from Suehirotake (Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., brand name Sonifiran dialyzed against DW and freeze-dried) was dissolved in 90 mL of DW, and 10 mL of 0.1 M sodium periodate was added to it under light shielding.
The mixture was reacted at 4 ° C. for 170 hours and oxidized. Periodate consumption is Avigad's method (Carbohydr. Res., 11, 119 (1969)).
Tracked in. After stopping the reaction by adding excess ethylene glycol, dialyzing against DW, adding sodium chlorite (adjusted to pH 4.0 with acetic acid, final concentration 40 mM) to the dialysate, and at 25 ° C After reacting for 12 hours to oxidize and dialyzing against DW, the dialyzed solution is freeze-dried and DS0.83
Polycarboxylated schizophyllan (Na salt) was obtained (yield 93.3%).

【００３２】上記の各試料のＧ因子活性化阻害力価を出
発原料であるカードランおよびソニフィランと比較した
結果を表１に示す。なお、Ｇ因子活性化阻害力価はPCT
国際公開WO 90/029511に記載の方法により測定した。Table 1 shows the results of comparison of the factor G activation inhibitory potency of each of the above-mentioned samples with the starting materials curdlan and sonifiran. The inhibitory potency of factor G activation is PCT
It was measured by the method described in International Publication WO 90/029511.

【００３３】[0033]

【表１】 ――――――――――――――――――――――――――――――― 試料番号 物質名 Ｇ因子活性化阻害力価 （単位／ｍｇ） ――――――――――――――――――――――――――――――― １ カードラン １０ ２ グリセリルカードラン １，１５０ ３ シゾフィラン（商品名：ソニフィラン） １０ ４ ポリカルボキシル化シゾフィラン ４６８，０００ ―――――――――――――――――――――――――――――――[Table 1] ――――――――――――――――――――――――――――――― Sample No. Substance Name Factor G activation inhibitory potency (Unit / mg ) ――――――――――――――――――――――――――――――― 1 Card run 10 2 Glyceryl card run 1,150 3 Schizophyllan (Product name: Sonifiran ) 10 4 Polycarboxylated schizophyllan 468,000 ―――――――――――――――――――――――――――――――

【００３４】上記表１から、両誘導体はそれぞれ出発原
料に比べ著しく高い(10²〜10⁵ 倍)Ｇ因子活性化阻害力
価を有するようになったことがわかる。From Table 1 above, it can be seen that both derivatives have significantly higher (10 ² to 10 ⁵ times) inhibitory potency of factor G activation than the starting materials.

【００３５】調製例３：ポリカルボキシル化シゾフィラ
ン固定化セルロースの調製 セルロース（セルロファイン、ＧＣ−７００−ｍ、生化
学工業（株）販売）２０ｇ（湿重量）をグラスフィルタ
ー上でDWでよく洗浄後、吸引濾過した後、フラスコに入
れ、DW３００mL、２Ｍ ＮａＯＨ水溶液１３０mLおよび
エピクロルヒドリン３０mLを順次加えて得られる懸濁液
を４０℃で２時間振盪した後、グラスフィルター上で充
分洗浄してエポキシ活性化セルロファインを得た。得ら
れたエポキシ活性化セルロファイン１容（４０mL）に８
０％ヒドラジン水化物水溶液１．５容（６０mL）を加
え、４０℃で１．５時間振盪した。反応後、グラスフィ
ルター上でDWで充分に洗浄してヒドラジノセルロファイ
ンを得た。得られたヒドラジノセルロファインのうち２
ｇ（湿重量）に調製例２で得たポリカルボキシル化シゾ
フィラン５０mgと水素化シアノホウ素ナトリウム２６mg
とを０．２Ｍ Ｋ₂ ＨＰＯ₄ 水溶液１．５mLに溶解した
ものを加え、室温で３日間振盪した。反応後、グラスフ
ィルター上でDW１０mLおよび０．２Ｍ酢酸ナトリウム水
溶液１０mLで順次洗浄した。このものに無水酢酸５mLを
加え、０℃で３０分間反応させた後、更に無水酢酸５mL
を加え、室温で３０分間処理して未反応のヒドラジン残
基をアセチル化した。反応後、DW、０．１Ｍ ＮａＯＨ
水溶液、DW、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で順次
洗浄して、ポリカルボキシル化シゾフィラン固定化セル
ロファインを得た。Preparation Example 3: Preparation of Polycarboxylated Schizophyllan-Immobilized Cellulose 20 g (wet weight) of cellulose (Cellulofine, GC-700-m, sold by Seikagaku Corporation) was thoroughly washed with DW on a glass filter. After suction filtration, put it in a flask and add 300 mL of DW, 130 mL of 2M NaOH aqueous solution and 30 mL of epichlorohydrin in that order, and shake the resulting suspension at 40 ° C for 2 hours, then wash it thoroughly on a glass filter and wash with epoxy activated cellulose. Got fine. 8 per 1 volume (40 mL) of the obtained epoxy activated cellulofine
1.5 volume (60 mL) of 0% hydrazine hydrate aqueous solution was added, and the mixture was shaken at 40 ° C. for 1.5 hours. After the reaction, the product was thoroughly washed with DW on a glass filter to obtain hydrazinocellulofine. 2 of the hydrazinocellulofines obtained
g (wet weight) 50 mg of polycarboxylated schizophyllan obtained in Preparation Example 2 and 26 mg of sodium cyanoborohydride
What was dissolved in 1.5 mL of 0.2 M K ₂ HPO ₄ aqueous solution was added, and the mixture was shaken at room temperature for 3 days. After the reaction, 10 mL of DW and 10 mL of 0.2M sodium acetate aqueous solution were sequentially washed on the glass filter. To this product, add 5 mL of acetic anhydride, react at 0 ° C for 30 minutes, and then add 5 mL of acetic anhydride.
Was added and treated at room temperature for 30 minutes to acetylate the unreacted hydrazine residue. After the reaction, DW, 0.1M NaOH
An aqueous solution, DW, and phosphate buffered saline (PBS) were sequentially washed to obtain polycarboxylated schizophyllan-immobilized cellulofine.

【００３６】実施例１：ポリカルボキシル化シゾフィラ
ンをライセート試薬の抽出調製時に添加する例 日本産カブトガニ(T.tridentatus) 血リンパ液１．０Ｌ
を４℃、１，５００rpm で１０分間遠心し、その沈殿部
分（アメボサイト）約２１gにポリカルボキシル化シゾ
フィランを5.25 mg含有する０．０２Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）２１０ｍＬを加え、ポリトロンＲ
ＰＴ１０にて均一に破砕および抽出し、１０，０００×
Ｇで３０分間冷却遠心し、上澄液（ポリカルボキシル化
シゾフィラン含有ライセート試薬）１９０ｍＬを得た。Example 1: Example in which polycarboxylated schizophyllan is added during extraction and preparation of a lysate reagent 1.0 L of Japanese horseshoe crab (T. tridentatus) hemolymph
Was centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and about 21 g of the precipitated portion (amebosite) was added with 210 mL of 0.02 M Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) containing 5.25 mg of polycarboxylated schizophyllan, and Polytron R was added.
Crush and extract evenly with PT10, 10,000 ×
After centrifugal cooling for 30 minutes at G, 190 mL of a supernatant (polycarboxylated schizophyllan-containing lysate reagent) was obtained.

【００３７】このポリカルボキシル化シゾフィラン含有
ライセート試薬（本発明例）と上記においてポリカルボ
キシル化シゾフィランを添加しないで調製したライセー
ト試薬（比較例）各々０．０４ｍＬに２Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０）０．０１ｍＬ、０．４Ｍ塩化マグ
ネシウム（ＭｇＣｌ₂ ）０．０３ｍＬ、３．０ｍＭ合成
基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）０．
０２ｍＬを加え、さらに検体としてＤＷ（ブランク）、
Ｅｔ（大腸菌O111:B4株由来、シグマ社販売のWestphal
type）またはβ−グルカン（後述により調製）を別々に
０．１ｍＬ加えた。また、それぞれ２倍濃度のＥｔとβ
−グルカンを０．０５ｍＬずつ同時に添加した。それら
を３７℃、３０分間加温して反応させ、０．６Ｍ酢酸
０．４ｍＬを加えて反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光
度を測定して、生じたパラニトロアニリンを定量し、反
応性を比較検討した。ブランクとの差（Δ値）を反応性
として、その結果を表２に示した。この結果から、カブ
トガニ血リンパ液からライセート試薬を抽出する際にポ
リカルボキシル化シゾフィランを添加して調製したポリ
カルボキシル化シゾフィラン含有ライセート試薬を用い
れば、β−グルカンの影響を受けずに、Ｅｔを特異的に
測定できることがわかる。言い換えれば、本発明による
測定においては、Ｃ因子系反応は影響されることなくＧ
因子系反応が実質的に阻害されていることが証明され
た。This polycarboxylated schizophyllan-containing lysate reagent (example of the present invention) and the lysate reagent prepared without adding the polycarboxylated schizophyllan (comparative example) to 0.04 mL of 2 M Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0), respectively. ) 0.01 mL, 0.4 M magnesium chloride (MgCl ₂ ) 0.03 mL, 3.0 mM synthetic substrate (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA) 0.
02 mL was added, and DW (blank) was added as a sample.
Et (derived from E. coli O111: B4 strain, Westphal sold by Sigma)
type) or β-glucan (prepared as described below) was added separately in an amount of 0.1 mL. In addition, Et and β of double concentration respectively
-0.05 ml of glucan was added simultaneously. React them by heating at 37 ° C for 30 minutes, stop the reaction by adding 0.4 mL of 0.6M acetic acid, measure the absorbance at 405 nm, quantify the produced para-nitroaniline, and compare the reactivity. investigated. The results are shown in Table 2 with the difference (Δ value) from the blank taken as the reactivity. From this result, when using a polycarboxylated schizophyllan-containing lysate reagent prepared by adding polycarboxylated schizophyllan when extracting the lysate reagent from horseshoe crab hemolymph, specific Et was not affected by β-glucan. You can see that it can be measured. In other words, in the measurement according to the present invention, the factor C system reaction is not affected and G
It was proved that the factor system reaction was substantially inhibited.

【００３８】[0038]

【表２】 ―――――――――――――――――――――――――― 反応性（ΔＡ４０５ｎｍ） 検体 本発明例 比較例 ―――――――――――――――――――――――――― Ｅｔ* ０．３２１ ０．３５３ β−グルカン** ０．０００ ０．１９４ Ｅｔ＋β−グルカン ０．３２１ ０．５４５ ―――――――――――――――――――――――――― * Ｅｔ濃度： ３．０ｐｇ／０．１ｍＬ検体 ** β−グルカン濃度：５．０ｐｇ／０．１ｍＬ検体[Table 2] ―――――――――――――――――――――――――― Reactive (ΔA405nm) sample Sample of the present invention Comparative example ―――――――――― ――――――――――――――――― Et * 0.321 0.353 β-Glucan ** 0.000 0.194 Et + β-Glucan 0.321 0.545 ――――― ――――――――――――――――――――― * Et concentration: 3.0 pg / 0.1 mL sample ** β-glucan concentration: 5.0 pg / 0.1 mL sample

【００３９】（β−グルカンの調製法）ＰＣＴ国際公開
Ｗ０９０／０２９５１に記載の方法に準じ、カードラン
（和光純薬工業（株）販売）の１ｇを約１００ｍＬの５
ｍＭ ＮａＯＨ水溶液に懸濁し、氷冷下で音波発生機、
ソニケーター^TM（大岳製作所、形式５２０２ＰＺＴ、東
京）により２０ｋＨ_Z、８０Ｗで１２分間音波処理によ
る低分子化を行った。処理液を５Ｍ ＮａＯＨ水溶液を
用い、最終０．３Ｍ水溶液とし、ゲルパーミエーション
クロマトグラフィー（ＧＰＣカラム：ＴＳＫ ｇｅｌ
Ｇ３０００ＰＷ_XL２本、Ｇ２５００ＰＷ_XL １本、移動
相：０．３Ｍ ＮａＯＨ水溶液、流速０．５ｍＬ／ｍｉ
ｎ）により分画採取し、再クロマトグラフィーにより分
子量２１６，０００画分を分画採取し、ＧＰＣ分画精製
標品（β−グルカン標品）を得た。(Preparation Method of β-Glucan) According to the method described in PCT International Publication W090 / 02951, 1 g of curdlan (sold by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to about 100 mL of 5
Suspend in a mM NaOH aqueous solution, sonic generator under ice cooling,
Sonicator ^TM (Ohtake Seisakusho, format 5202PZT, Tokyo) 20 kHz _Z, was depolymerized by 12 min sonication at 80W by. The treatment liquid was made into a final 0.3M aqueous solution by using a 5M NaOH aqueous solution, and gel permeation chromatography (GPC column: TSK gel).
G3000PW _XL 2 bottles, G2500PW _XL 1 bottle, mobile phase: 0.3 M NaOH aqueous solution, flow rate 0.5 mL / mi
n), and a fraction having a molecular weight of 216,000 was collected by re-chromatography to obtain a GPC fraction purified sample (β-glucan sample).

【００４０】実施例２：グリセリルカードランをライセ
ート試薬に添加する例 日本産カブトガニ(T. tridentatus) 血リンパ液１．０
Ｌを４℃、１，５００rpmで１０分間遠心し、その沈殿
部分（アメボサイト）約２１g に０．０２Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）２１０ｍＬを加え、ホモゲナイ
ザー（ポリトロンＲ ＰＴ１０（商品名）、Kinematica
社製造）にて均一に破砕および抽出し、１０，０００×
ｇで３０分間冷却遠心し、上澄液（ライセート試薬）１
９０ｍＬを得た。Example 2: Example of adding glyceryl curdlan to a lysate reagent Japanese horseshoe crab (T. tridentatus) hemolymph fluid 1.0
L was centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and 210 mL of 0.02 M Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) was added to about 21 g of the precipitated portion (amebosite), and a homogenizer (Polytron R PT10 (trade name), Kinematica
Crushed and extracted evenly at 10,000)
Centrifuge with cooling at 30g for 30 minutes, and supernatant (lysate reagent) 1
90 mL was obtained.

【００４１】このライセート試薬２．０ｍＬにグリセリ
ルカードラン１ｍｇを添加した後、更に０．４Ｍ塩化マ
グネシウム０．４ｍＬを添加混和した後、凍結乾燥して
本発明のＥｔ特異的測定剤を得た。また、ライセート試
薬２．０ｍＬと０．４Ｍ ＭｇＣｌ₂ ０．４ｍＬとを混
和後、凍結乾燥してグリセリルカードランを含まない比
較用の測定剤を得た。両凍結乾燥品をそれぞれＤＷ２．
０ｍＬに溶解し、その０．１ｍＬに検体として、ＤＷ
（ブランク）、Ｅｔまたはβ−グルカンを別々に０．１
ｍＬ加え、静かに混和後、３７℃、６０分間静置加温
し、１８０゜転倒してゲル形成の有無を肉眼で判定し、
本発明の測定剤の反応性を比較検討した。その結果を表
３に示した。表中＋はゲル化したことを、−はゲル化し
なかったことを表す。To 2.0 mL of this lysate reagent, 1 mg of glyceryl curdlan was added, and then 0.4 mL of 0.4 M magnesium chloride was further mixed and lyophilized to obtain an Et-specific measuring agent of the present invention. Further, 2.0 mL of the lysate reagent and 0.4 mL of 0.4 M MgCl ₂ were mixed and freeze-dried to obtain a comparative measuring agent containing no glyceryl curdlan. DW2.
Dissolve in 0 mL and use 0.1 mL of the sample as DW
(Blank), Et or β-glucan separately 0.1
After adding mL and gently mixing, incubate at 37 ° C. for 60 minutes, and invert by 180 ° to visually determine the presence or absence of gel formation.
The reactivity of the measuring agent of the present invention was comparatively examined. Table 3 shows the results. In the table, + means gelation, and-means not gelation.

【００４２】[0042]

【表３】 ―――――――――――――――――――――――――― 反応性 検体 本発明例 比較例 ―――――――――――――――――――――――――― ＤＷ（ブランク） − − Ｅｔ* ＋ ＋ β-グルカン** − ＋ ―――――――――――――――――――――――――― * Ｅｔ濃度： ４．０ｐｇ／０．１ｍＬ検体 ** β−グルカン濃度：４０．０ｎｇ／０．１ｍＬ検体[Table 3] ―――――――――――――――――――――――――― Reactive Sample Inventive Example Comparative Example ―――――――――――― ―――――――――――――― DW (blank) − − Et * ＋ + β-glucan ** − ＋ ―――――――――――――――――――― ――――――― * Et concentration: 4.0 pg / 0.1 mL sample ** β-glucan concentration: 40.0 ng / 0.1 mL sample

【００４３】この結果から、通常の方法で調製したライ
セート試薬にグリセリルカードランを添加して凍結乾燥
することによって、β−グルカンの影響を受けずに、Ｅ
ｔを特異的に測定できることがわかる。From this result, by adding glyceryl curdlan to the lysate reagent prepared by the usual method and freeze-drying it, E was obtained without being affected by β-glucan.
It can be seen that t can be specifically measured.

【００４４】実施例３：ポリカルボキシ化シゾフィラン
固定化セルロース（セルロファイン）を用いたライセー
ト試薬の調製 調製例３で得たポリカルボキシル化シゾフィラン固定化
セルロファイン湿体積０．４mLをグラスフィルター上
で、０．１Ｍ ＮａＯＨ１L およびDW１L で順次洗浄
後、DWを加えて４mLとし、このうち０．２mLにDW１．８
mLを加えた懸濁液をポリビニリデンフロライド膜（０．
２２μｍ、マイレクスＧＶフィルターユニット、日本ミ
リポア工業販売、Ｌｏｔ ＣＥｌｌ）で濾過し、ポリカ
ルボキシル化シゾフィラン固定化セルロファインが付着
したフィルターを得た。実施例２で得たライセート試薬
（グリセリルカードラン無添加）１mLを上記のポリカル
ボキシル化シゾフィラン固定化セルロファイン付着フィ
ルターで濾過し、濾液を得、このうち０．０４mLにＭｇ
Ｃｌ₂ １．５μｇおよび合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）４．０μｇを加えて凍結乾燥し
た。この凍結乾燥品に０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）０．１mLおよび検体（Ｅｔまたはβ−グルカ
ンの種々濃度の水溶液）０．１mLを加えて３７℃で３０
分間加温した後、０．６Ｍ酢酸０．４mLを加えて反応停
止し、４０５nmにおける吸光度を測定した結果、および
未処理ライセート試薬を用いて同様に測定した結果を図
２および図３に示す。図中○印は未処理ライセート試薬
を使用した場合の吸光度を、△印はポリカルボキシル化
シゾフィラン固定化セルロファインで処理したライセー
ト試薬を使用した場合の吸光度を示す。図から明らかな
ように、ポリカルボキシル化シゾフィラン固定化セルロ
ファインで処理したライセート試薬は、β−グルカンと
は反応せず、Ｅｔとのみ反応し、これを使用することに
よってＥｔの特異的測定が可能である。Example 3 Preparation of Lysate Reagent Using Polycarboxylated Schizophyllan-Immobilized Cellulose (Cellulofine) The polycarboxylated Schizophyllan-immobilized Cellulofine wet volume 0.4 mL obtained in Preparation Example 3 was put on a glass filter. After sequentially washing with 1 L of 0.1 M NaOH and 1 L of DW, DW was added to make 4 mL, and 0.2 mL of this was DW1.8.
The suspension containing mL was added to a polyvinylidene fluoride film (0.
22 μm, Millex GV filter unit, Japan Millipore Industrial Co., Ltd., Lot CEll) to obtain a filter to which polycarboxylated Schizophyllan-immobilized cellulofine was attached. 1 mL of the lysate reagent (without addition of glyceryl curdlan) obtained in Example 2 was filtered through the above polycarboxylated schizophyllan-immobilized cellulofine adhering filter to obtain a filtrate, 0.04 mL of which Mg was added.
Cl ₂ 1.5 μg and synthetic substrate (Boc-Leu-G
Ly-Arg-pNA) 4.0 μg was added and freeze-dried. A 0.2 M Tris-hydrochloric acid buffer solution (p
H8.0) 0.1 mL and a sample (aqueous solution of Et or β-glucan at various concentrations) 0.1 mL were added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
After heating for a minute, the reaction was stopped by adding 0.4 mL of 0.6 M acetic acid, and the results of measuring the absorbance at 405 nm and the results of the same measurement using the untreated lysate reagent are shown in FIGS. 2 and 3. In the figure, ◯ indicates the absorbance when the untreated lysate reagent was used, and Δ indicates the absorbance when the lysate reagent treated with polycarboxylated schizophyllan-immobilized cellulofine was used. As is clear from the figure, the lysate reagent treated with polycarboxylated schizophyllan-immobilized cellulofine does not react with β-glucan but only with Et, and by using this, specific measurement of Et is possible. Is.

【００４５】[0045]

【発明の効果】本発明は、Ｅｔ特異的測定剤をライセー
ト試薬と(1→3)-β-D-グルカン類のポリカルボン酸誘導
体またはグリセリル誘導体とを組み合わせるかあるい
は、これらの誘導体を不溶性担体に固定化した不溶性固
定化物にライセート試薬を接触させるのみで容易に製造
ができるので操作性および経済性において優れている。
このようなＥｔ特異的測定剤はＥｔの存在の有無が明確
でない感染症、敗血症を疑われている臨床検体を測定す
る時に特に有用であり、本発明は真のグラム陰性菌感染
症（エンドトキセミア）を的確に判別できる利点があ
る。INDUSTRIAL APPLICABILITY In the present invention, an Et-specific measuring agent is combined with a lysate reagent and a polycarboxylic acid derivative or glyceryl derivative of (1 → 3) -β-D-glucan, or these derivatives are used as an insoluble carrier. It is excellent in operability and economical efficiency because it can be easily produced by only bringing a lysate reagent into contact with the insoluble immobilization product immobilized on.
Such an Et-specific measuring agent is particularly useful for measuring an infectious disease in which the presence or absence of Et is not clear, or a clinical specimen suspected of sepsis, and the present invention is a true Gram-negative bacterial infectious disease (endotoxemia). Has the advantage that it can be accurately determined.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】リムルス反応の機構を説明する図。FIG. 1 is a diagram illustrating a mechanism of a Limulus reaction.

【図２】未処理のライセート試薬および本発明により処
理したライセート試薬と種々濃度のβ−グルカンとを反
応させたときの吸光度を示す図。FIG. 2 is a diagram showing the absorbance when an untreated lysate reagent and a lysate reagent treated according to the present invention are reacted with various concentrations of β-glucan.

【図３】未処理のライセート試薬および本発明により処
理したライセート試薬と種々濃度のエンドトキシンとを
反応させたときの吸光度を示す図。FIG. 3 is a diagram showing the absorbance when an untreated lysate reagent and a lysate reagent treated according to the present invention are reacted with various concentrations of endotoxin.

Claims (8)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 カブトガニ・アメボサイト・ライセート
試薬に(1→3)-β-D-グルカン類のポリカルボン酸誘導体
またはグリセリル誘導体を共存させることを特徴とする
エンドトキシンの特異的測定剤。1. A specific measuring agent for endotoxin, which comprises allowing a horseshoe crab amebocyte lysate reagent to coexist with a polycarboxylic acid derivative or a glyceryl derivative of (1 → 3) -β-D-glucan. 【請求項２】 カブトガニ・アメボサイト・ライセート
試薬を用いて検体中のエンドトキシンを測定するに際
し、カブトガニ・アメボサイト・ライセート試薬中およ
び／または検体中に(1→3)-β-D-グルカン類のポリカル
ボン酸誘導体またはグリセリル誘導体を共存させ、該試
薬中に含まれる成分のエンドトキシンに起因する変化を
測定または判定することを特徴とするエンドトキシンの
特異的測定法。2. When measuring endotoxin in a sample using a horseshoe crab amebosite lysate reagent, poly (1 → 3) -β-D-glucans are contained in the horseshoe crab amebosite lysate reagent and / or in the sample. A specific assay method for endotoxin, which comprises allowing a carboxylic acid derivative or a glyceryl derivative to coexist and measuring or determining a change caused by endotoxin in a component contained in the reagent. 【請求項３】 検体とカブトガニ・アメボサイト・ライ
セート試薬との混合物中の合成基質水解能を測定する、
請求項２のエンドトキシンの特異的測定法。3. A method for measuring hydrolytic ability of a synthetic substrate in a mixture of a sample and a horseshoe crab amebocyte lysate reagent,
The method for specifically measuring endotoxin according to claim 2. 【請求項４】 検体とカブトガニ・アメボサイト・ライ
セート試薬との混合物中のゲル形成能を判定または測定
する、請求項２のエンドトキシンの特異的測定法。4. The specific assay method for endotoxin according to claim 2, wherein the gel forming ability in a mixture of a sample and a horseshoe crab amebocyte lysate reagent is determined or measured. 【請求項５】 (1→3)-β-D-グルカン類のポリカルボン
酸誘導体またはグリセリル誘導体を不溶性担体に固定化
して得られる不溶性固定化物にカブトガニ・アメボサイ
ト・ライセート試薬を接触させることによって得られる
エンドトキシンの特異的測定剤。5. An insoluble immobilization product obtained by immobilizing a polycarboxylic acid derivative or a glyceryl derivative of a (1 → 3) -β-D-glucan on an insoluble carrier is obtained by contacting a horseshoe crab amebosite lysate reagent. A specific measuring agent for endotoxin. 【請求項６】 前記不溶性担体が、セルロース、アガロ
ース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、多孔質
ガラスおよび親水性ポリビニル系合成ポリマーからなる
群から選ばれた担体のヒドラジン誘導体またはヒドラジ
ド誘導体であることを特徴とする請求項５記載のエンド
トキシンの特異的測定剤。6. The insoluble carrier is a hydrazine derivative or a hydrazide derivative of a carrier selected from the group consisting of cellulose, agarose, crosslinked dextran, polyacrylamide, porous glass and hydrophilic polyvinyl synthetic polymer. The endotoxin specific assay agent according to claim 5. 【請求項７】 検体と請求項５または６に記載の特異的
測定剤を混合し、該測定剤中に含まれる成分のエンドト
キシンに起因する変化を測定または判定することを特徴
とするエンドトキシンの特異的測定法。7. A specificity of endotoxin, which comprises mixing a sample with the specific measuring agent according to claim 5 or 6 and measuring or determining a change of a component contained in the measuring agent due to endotoxin. Measurement method. 【請求項８】 (1→3)-β-D-グルカン類のポリカルボン
酸誘導体またはグリセリル誘導体を有効成分として含有
し、カブトガニ・アメボサイト中のＧ因子の（１→３）
−β−Ｄ−グルカンによる活性化を阻害する作用を有す
ることを特徴とするＧ因子活性化阻害剤。8. A (1 → 3) -factor (1 → 3) of factor G in horseshoe crab amebosite containing a polycarboxylic acid derivative or a glyceryl derivative of a (1 → 3) -β-D-glucan as an active ingredient.
-A factor G activation inhibitor, which has an action of inhibiting activation by β-D-glucan.