JPH08119984A

JPH08119984A - ストレプトミセス属放線菌及びこの菌由来のＴＧＦ−β 阻害剤

Info

Publication number: JPH08119984A
Application number: JP7209783A
Authority: JP
Inventors: Mayumi Shimizu; 真由美清水; Katsumasa Iijima; 克昌飯島; Takashi Suzuki; 隆鈴木; Haruto Yokota; 治人横田; Takeshi Yago; 毅矢後; Yasuko Yao; 泰子八尾
Original assignee: NKK Corp; Nippon Kokan Ltd
Current assignee: JFE Engineering Corp
Priority date: 1994-08-31
Filing date: 1995-08-17
Publication date: 1996-05-14

Abstract

(57)【要約】【課題】ＴＧＦ−β阻害活性物質を産生する放線菌を
提供し、同時にこの微生物を培養した培養物から安価で
効率的にＴＧＦ−β阻害活性物質を得る方法を提供し、
各種のＴＧＦ−β阻害剤を提供する。【解決手段】ストレプトミセス属に属しＴＧＦ−β阻
害物質産生能を有する放線菌ストレプトミセスｓｐ．Ｎ
ＫＫ−９０８（Streptomyces sp. NKK-908）。この菌株
を培養してＴＧＦ−β阻害活性物質を生成蓄積させ、該
培養物、特に培養液から採取する方法。この方法で得ら
れたＴＧＦ−β阻害活性物質を有効成分として含有する
ＴＧＦ−β阻害剤。【効果】本発明の医薬は、ＴＧＦ−βが発症に関連す
る糖尿病性腎症、糸球体腎炎、肝硬化、肺繊維症、増殖
性硝子体網膜症などの治療薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ストレプトミセス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、ＴＧＦ−β阻
害物質産生能を有する放線菌、及びその放線菌の培養物
から得られるＴＧＦ−β阻害活性作用をもつ物質の製造
方法に関する。更に本発明は、得られた物質を有効成分
とするＴＧＦ−β阻害剤に関する。ＴＧＦ−β阻害剤
は、ＴＧＦ−βが関与する疾病、例えば糖尿病性腎症、
糸球体腎炎、肝硬化、肺繊維症、増殖性硝子体網膜症な
どの治療薬として有用である。

【０００２】

【従来の技術】ＴＧＦ−β（Transforming Growth Fact
or−β）は、生体内ペプチドホルモンの一種であり、細
胞の接着性を高め、コラーゲン、フィブロネクチン、デ
コリンなどの細胞外マトリックスの調節を介して細胞の
増殖や分化を制御する。ＴＧＦ−βの細胞増殖、分化に
対する作用は、細胞の種類によって促進的にも阻害的に
も作用する。生体（in vivo ）におけるＴＧＦ−βの作
用は、主に創傷治癒や血管新生の促進である。しかし、
一方でＴＧＦ−βは、種々の臓器の繊維化を伴う疾患、
例えば、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、肝硬化、肺繊維
症、増殖性硝子体網膜症の原因ともなっている。従っ
て、ＴＧＦ−βを阻害することで、上記の疾患の治療が
可能となる。

【０００３】これまで、ＴＧＦ−β阻害物質として、抗
ＴＧＦ−β抗体（Nature;1990, vol.346, p371-374）及
び生体由来のタンパク質であるデコリン（Nature;1990,
vol.346, p281-284）及びＴＧＦ−βレセプター（Cel
l; 1992, vol.69, p1067-1070）が知られている。この
うち、デコリンは、ＴＧＦ−βで産生が促進される、分
子量は約１２０キロダルトン（ｋＤ）のプロテオグリカ
ン（ムコ多糖の結合したタンパク質）の一種である。デ
コリンは、ＴＧＦ−βと結合することができ、ＴＧＦ−
βを不活性化する作用を有する。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記従来の技術におけ
るＴＧＦ−β阻害物質は、いずれも動物及び動物細胞由
来であり、且つ高分子タンパク質であるため、取扱も煩
雑で安定性に欠ける。

【０００５】更に、動物体から、微量のタンパク質を抽
出、精製するのは、時間や費用がかかり、経済的に実用
化が困難である。また、動物細胞を使用する場合にも、
培地に血清を使用すること、培養時間が長いことから経
済的に不利である。

【０００６】本発明は、以上のような事情に鑑みてなさ
れたもので、高分子タンパク質以外のＴＧＦ−β阻害物
質を提供することを目的とする。更に詳しくは、本発明
は、質素な培地で生育可能で、ＴＧＦ−β阻害活性物質
を産生する放線菌を提供し、同時にこの微生物を培養し
た培養物から安価で効率的にＴＧＦ−β阻害作用物質を
得る方法を提供することを目的とする。その結果、各種
のＴＧＦ−β阻害剤が提供されうる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】請求項１に記載の発明
は、ストレプトミセス属に属し、基生菌系の色が灰色系
で、気菌系の胞子柄に鍵状又はらせん状の長い胞子連鎖
を形成し、胞子の表面が平滑であり、プリドハム・ゴト
リーブ寒天培地上でＬ−アラビノース、Ｄ−キシロー
ス、Ｄ−フラクトース、Ｌ−ラムノース、シュークロー
ス、ラフィノースを資化し、かつＴＧＦ−β阻害物質産
生能を有する放線菌である。

【０００８】請求項２に記載の発明は、上記に加え、前
記ストレプトミセス属に属し、ＴＧＦ−β阻害物質産生
能を有する放線菌が、ストレプトミセスｓｐ．ＮＫＫ−
９０８（Streptomyces sp. NKK-908）である放線菌であ
る。

【０００９】請求項３の発明は、ストレプトミセス属に
属し、ＴＧＦ−β阻害物質産生能を有する菌株、特に
は、ストレプトミセスｓｐ．ＮＫＫ−９０８を培養して
ＴＧＦ−β阻害活性物質を生成蓄積させ、該培養物から
分離、採取することを特徴とするＴＧＦ−β阻害活性物
質の製造方法である。

【００１０】請求項４に記載の発明は、上記請求項第３
項に記載の方法で得られたＴＧＦ−β阻害活性物質を有
効成分として含有するＴＧＦ−β阻害剤である。

【００１１】以下に、本発明の詳細を説明する。＜菌株＞本発明に用いられるＮＫＫ−９０８株は、静岡
県南伊豆町富戸の浜の土壌より下記の培地を用いて常法
により分離されたものである。具体的には、分離培地
（％Ｗ／Ｖ）：グリセリン0.1 、グルコース0.1 、Ｌ−
アルギニン0.03、K₂ HPO₄0.03、NaCl 0.03 、MgSO₄ ・7H
₂O 0.02、寒天1.5 、Fe(SO₄)₃ 0.001、CuSO₄ ・5H ₂O 0.
0001 、ZnSO₄・7H₂O 0.0001 （pH 6.4）で２８℃７日
間培養後、コロニーを次の寒天培地（％Ｗ／Ｖ）：酵母
エキス 0.1、肉エキス 0.1、N.Z.アミンA 0.2 、グルコ
ース 1.0、寒天 1.5（pH 7.3）で２８℃７日間培養し、
得られたコロニーをＩＳＰ（International Streptomyc
es Project) Ｎｏ．２培地にて分離した。

【００１２】NKK-908 株は、以下に示すような菌体学的
性質を有する。（ａ）形態的性質基生菌糸はイースト・麦芽寒天培地、オートミール寒天
培地、スターチ・無機塩寒天培地、又はグリセリン・ア
スパラギン寒天培地等でよく発達し、分断は観察されな
い。気菌糸は上記の培地で豊富に着生し、色調は灰色系
を呈し、分断は観察されない。顕微鏡下の観察では、気
菌糸上の胞子柄に鍵状または不完全ならせん状をした１
０個以上の胞子連鎖の形成が認められる。胞子の大きさ
は直径0.7-1.0 μm 、長さ0.6-1.2 μm であり、表面は
平滑で、運動性、鞭毛は認められない。なお、胞子の
う、菌核、遊走子などは観察されない。

【００１３】（ｂ）培養的性質 NKK-908 株のイースト・麦芽寒天培地（ISP No2 ）、オ
ートミール寒天培地（ISP No3 ）、スターチ・無機塩寒
天培地（ISP No4 ）、又はグリセリン・アスパラギン寒
天培地（ISP No5 ）上での生育状態は表１に示す通りで
ある。

【００１４】

【表１】

【００１５】色の記載に付いては、A. Kornerup and J.
H. Wanscher, "Methuen handbookof colour" third ed
ition; 1978, Eyre Methuenに記載された方法を参考に
し、色標名と共にそのコードを併せて記した。観察は３
０℃で７〜１４日間培養後に行った。

【００１６】なお、表１ではNKK-908 株と共に、ストレ
プトミセス・ガードネリ(Streptomyces gardneri IFO
12865 ^T）及びストレプトミセス・ナーボネンシス(Str
eptomyces narbonensis IFO 12801^T) の各種培地上で
の特徴も参考のために示す。

【００１７】（ｃ）生理学的性質（１）生育温度範囲：イースト・麦芽寒天培地（ISP No
2 ）において１１〜３５℃で生育した。また、生育至適
温度は２３〜３１℃であった。（２）メラニン様色素の生成：認められない（３）炭素源の利用：炭素の資化性はプリドハム・ゴト
リーブ寒天培地（ISP No9 ）を使用して行われた。以下
にその結果を示す。利用する：L-アラビノース、D-キシロース、D-フラクト
ース、L-ラムノース、シュークロース、ラフィノース利用しない：イノシトール、D-マンニトール

【００１８】（ｄ）化学分類学的性質（１）細胞壁組成 Beckerらの方法( B. Becker, et. al., Appl. Microbio
l.;1964, vol.12, p421-423 )に従って、細胞壁組成成
分を分析した。なお、アラビノース、ガラクトースの存
在は、全菌体の硫酸加水分解物を用いて推定した。結果
は表２に示す通りである。

【００１９】

【表２】

【００２０】（２）菌体脂質の種類菌体内のキノン系はメナキノンで、その側鎖のイソプレ
ン単位数と水素飽和度はMK-9(H8)、MK-9(H6)であった。

【００２１】（３）DNA の塩基組成菌体内DNA のGC含量を薮内英子他、新しい分類学に伴走
する細菌同定法；1987に記載された細菌同定法を参考に
決定した。結果を表３に示す。

【００２２】

【表３】

【００２３】（４）近縁菌種とのDNA-DNA 相同性マイクロプレートを用いたフォトビオチン標識方法（江
崎孝行他、日本細菌学雑誌；1990, vol 45、p851）によ
るDNA-DNA ハイブリダイゼーション試験を結果を表４に
示す。

【００２４】

【表４】

【００２５】以上、NKK-908 株の菌体学的性質を詳しく
記載したが、要約すると、細胞壁中のジアミノピメリン
酸がLL型で、基生菌糸を形成し、気菌糸の胞子柄に長い
胞子連鎖を形成するのが特徴である。栄養上の諸性質と
しては、基生菌糸は灰色系の色調を呈し、気菌糸も灰色
系の色調を呈する。なお、本菌はメラニン色素は産生し
ない。

【００２６】以上の結果から、本菌株は放線菌中でスト
レプトミセス属に属すると考えるのが妥当である。Nono
muraの文献(H. Nonomura, J. Ferment. Technol.; 197
4, vol 52, p78)を参考にして種の検索を行ったが、本
菌体の性状と完全に一致する菌種の記載はなかった。

【００２７】そこで、集落表面の色調と資化性のみに注
目して検索したところ、ストレプトミセス・ガードネリ
(Streptomyces gardneri IFO 12865 ^T) やストレプト
ミセス・ナーボネンシス(Streptomyces narbonensis I
FO 12801^T) に比較的近いと考えられたので、この２菌
を基準菌として選び、培養性状、菌体内DNA のGC含量、
DNA-DNA ハイブリダイゼーション試験を行って比較検討
した。その結果、表に示すように、本菌株は基準菌と集
落の色調等が異なった。GC含量は近い値を示したが、DN
A 相同性試験では基準菌との相同性は低かった。よっ
て、NKK-908 株を新種と同定するのが妥当であると考え
る。

【００２８】以上の結果から、本菌株は放線菌中でスト
レプトミセス属に属する菌種であり、ストレプトミセス
・ガードネリやストレプトミセス・ナーボネシスとは異
なる新菌種である。尚、本菌体NKK-908 株は通産省工業
技術院生命工学工業技術研究所に、寄託番号 FERM P-14
410 として寄託されている。

【００２９】本発明のNKK-908 株は、他のストレプトミ
セス属の菌株で見られるように、その性状が変化しやす
く、例えばX 線、紫外線、放射線等の照射処理、例えば
ナイトロジェン・マスタード、アゼセリン、亜硝酸、２
−アミノプリン、N −メチル−N ’−ニトロ−N −ニト
ロソグアニジン等の変異誘起剤、ファージ接触、形質転
換、形質導入、接合等の通常用いられる菌種変異処理法
により変異しやすく、自然的、人工的いずれの変異株
も、TGF −β阻害活性物質の生産能を有する菌株は全て
本発明の方法に使用することができる。

【００３０】＜培養方法＞本発明のＴＧＦ−β阻害剤の
有効成分となるＴＧＦ−β阻害活性物質を得るにあた
り、まず、ＮＫＫ−９０８株を栄養源含有培地に接種し
て好気的に培養する。栄養源としては、放線菌の栄養源
として公知のものが使用できる。例えば、炭素源として
は、市販されているグルコース、グリセリン、マルトー
ス、デンプン、サッカロース、糖蜜又はデキストリンな
どが単独又は混合物として使用できる。窒素源として
は、市販されているコーンスティープリカー、ソイビー
ンミール、肉エキス、酵母エキス、綿実粉、ペプトン、
小麦胚芽、魚粉、無機アンモニウム塩、又は硝酸ナトリ
ウムなどが単独又は混合物として使用できる。無機塩と
しては、市販されている塩化ナトリウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸マンガ
ン、塩化コバルト、硫酸鉄、塩化カリウムなどを使用す
ることができる。その他、必要に応じて、コバルト、モ
リブデンなどの金属塩を微量添加することもできる。以
下に目的のＴＧＦ−β阻害活性物質の生産に好ましい培
地の１例を挙げる。

【００３１】培養用培地１％グルコース０．５％コットンシードオイル１．５％コーンスティープリカー１％ソイビーンミール０．２％ＣａＣＯ₃ １００μｌトレースソルトソリューション^* （ｐＨ７．０）＊：トレースソルトソリューション組成（単位：ｇ／
ｌ）ＮａＯＨ１５ＥＤＴＡＮａ６０ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ２０ＣａＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ５ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ２ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ２ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ０．５ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ０．０５ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１０（あらかじめ1.75mlの硫
酸で溶解）Ｈ₃ＢＯ₄ ０．０３１Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ０．００２ＫＣｌ７５

【００３２】培養方法としては、一般の微生物代謝産物
の生産方法と同様に行えばよく、特に液体培養が好まし
い。液体培養の場合は、静置培養、攪拌培養、振盪培養
又は通気培養などのいずれも行えるが、特に振盪培養ま
たは深部通気攪拌培養が好ましい。培養温度は、低温側
で２５℃以上、好ましくは２７℃以上、高温側で３７℃
以下、好ましくは３０℃以下である。培地のｐＨは６〜
８が適当であるが、ｐＨ６．５〜７．５が好ましい。培
養時間は、２４時間〜１０日間、好ましくは３〜７日間
である。

【００３３】＜分離・精製方法＞培養物から目的とする
ＴＧＦ−β阻害活性物質を採取するには、微生物の培養
物から採取するのに通常使用される分離手段が適宜利用
される。本発明の医薬の有効成分となるＴＧＦ−β阻害
活性物質は、培養液中及び菌体中に蓄積されるが、分
離、精製の効率を考慮すると、培養液中から採取するこ
とが好ましい。前記で得られた培養液は、遠心分離又は
ろ過などによって菌体と分離する。例えば、２０００ｒ
ｐｍで２０〜３０分間遠心分離する。得られた培養上清
のＴＧＦ−βの阻害活性は、後述のＴＧＦ−β阻害活性
試験を用いて測定する。

【００３４】実施例１＜ii＞に示した通り、培養上清
は、ＴＧＦ−β阻害活性を有する。この培養上清及びそ
の凍結乾燥物を本活性物質Ａとし、更に以下のＳＴＥＰ
に沿って分離、精製する。

【００３５】ＳＴＥＰ１まず、前記培養上清を有機溶媒で抽出して水層を得る。
有機溶媒としては、例えば、ヘキサン、酢酸エチル、ク
ロロホルムが使用できる。抽出の方法としては、例え
ば、培養上清と等容量のヘキサンで２回抽出し、その水
層を更に等容量の酢酸エチルで２回抽出し、得られた水
層をクロロホルムで２回抽出するのが好ましい。

【００３６】溶媒抽出を終えた水層を凍結乾燥し、適量
の水に溶解する。適量とは、培養上清の１／２０〜１／
２、好ましくは１／１０程度の量である。この溶解液を
イオン交換クロマトグラフィーで分画する。例えば、合
成樹脂イオン交換体の１つであるＤＩＡＩＯＮＷＡ−
３０（商品名、三菱化成工業社製、内径１cm×２５cm）
カラムを使用し、上記溶解液を供した後、約３倍容の水
で洗浄して非吸着物質を取り除き、１Ｍ−ＮＨ₄Ｃｌで
溶出する。溶出した各画分は、後述する方法でＴＧＦ−
β阻害活性の測定を行う。

【００３７】実施例１に例示した通り、溶出画分のＴＧ
Ｆ−β阻害活性は１ピークを示す。この活性画分を集
め、そのまま又はその凍結乾燥物を本活性物質Ｂとし、
下記のＳＴＥＰ２に進める。

【００３８】ＳＴＥＰ２ＳＴＥＰ１で得られた本活性物質Ｂの画分を、エタノー
ル等の有機溶媒で沈澱を生じさせ、生じた沈澱を遠心分
離で集める。例えば、ＴＧＦ−β阻害活性画分４０ｍｌ
に８０ｍｌのエタノールを加えて沈澱を生じさせ、５０
ｍｌ容の遠沈管を用いて１５０００ｒｐｍで遠心分離す
るのが好ましい。得られた沈澱を水で溶解し、ろ過によ
り不溶物を除く。その後、この溶解液を、セルロースイ
オン交換体カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）に供する。次に、ＮａＣｌの濃度勾配を漸
増する同緩衝液で溶出する。例えば２０ｍＭＨＥＰＥＳ
（N-(2- ヒドロキシエチル) ピペラジン-N'-2-エタンス
ルホン酸）緩衝液で平衡化したＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ
−２ＳＷ（商品名、東ソー社製、内径２．１５cm×２５
cm）カラムに、前記溶解液を供し、０Ｍ〜１ＭのＮａＣ
ｌの濃度勾配で溶出するのが好ましい。溶出した各画分
は、後述するＴＧＦ−β阻害活性測定を行う。活性画分
又はその凍結乾燥物を、本活性物質Ｃとする。

【００３９】実施例１にも示した通り、本活性物質Ｃ
は、後述するＴＧＦ−β阻害活性試験であるＭｖ１ｌｕ
細胞試験系において、そのＴＧＦ−β阻害活性が３つの
ピークに別れる。３ピークの画分は、それぞれ、つぎの
濃度範囲のＮａＣｌで溶出される。即ち、０．３５〜
０．５Ｍ（本活性物質Ｃ−Ｉ）、０．５〜０．６Ｍ（本
活性物質Ｃ−II）、０．６〜０．９Ｍ（本活性物質Ｃ−
III）である。このうち、後述する第二のＴＧＦ−β阻
害活性試験においても、ＴＧＦ−β阻害活性を示したの
は本活性物質Ｃ−IIIの画分であり、これを下記のＳＴ
ＥＰ３に進める。

【００４０】ＳＴＥＰ３本活性物質Ｃ−IIIの画分を集め、凍結乾燥により数ｍ
ｌに濃縮した後、ゲルろ過ＨＰＬＣに供する。例えば、
ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＰＸ_XLカラム（商品名、東ソ
ー社製、内径０．７８×３０ｃｍ）にて２０ｍＭＨＥＰ
ＥＳ緩衝液で溶出すると、分子量２０００の付近の分画
にＴＧＦ−β阻害活性が確認できる。この画分を集め、
そのまま又は凍結乾燥して、本活性物質Ｄとする。

【００４１】実施例１に示す通り、本活性物質Ｄは、分
子量約２０００である。本活性物質ＤのＴＧＦ−βに対
する阻害活性は、還元剤の存在下（例えば、１Ｍのジチ
オトレイトールで一夜処理）で安定で、熱、酸、アルカ
リによって失活する。例えば、１００℃で１０分間保温
した場合、１ＮＨＣｌ中で２２℃において３時間処理
した場合、及び１０％アンモニア存在下、２２℃にて３
時間処理した場合、試料ＤのＴＧＦ−βに対する阻害活
性は失われる。

【００４２】＜ＴＧＦ−β阻害活性の測定法＞ＴＧＦ−
β阻害活性は、次の２つの試験系で測定することができ
る。

【００４３】第一の試験系は、ミンク肺上皮細胞（Ｍｖ
１ｌｕ細胞）を用いる試験系である。Ｍｖ１ｌｕ細胞に
は、例えば、ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ６４を用いること
ができる。ＴＧＦ−βは、Ｍｖ１ｌｕ細胞の増殖を抑制
する効果を持っている。そこで、ＴＧＦ−β阻害活性を
もつ物質を添加すれば、ＴＧＦ−β存在下でもＭｖ１ｌ
ｕ細胞の増殖は阻害されない。細胞はクリスタルバイオ
レットによって染色できるので、クリスタルバイオレッ
トの吸光である４１５ｎｍの吸光度は、細胞数を反映す
る。従って、本活性物質の効果は、ＴＧＦ−β存在下で
Ｍｖ１ｌｕ細胞を増殖させたとき、４１５ｎｍの吸光度
が薬剤無添加群よりも大きいことによって確認できる。

【００４４】第二の試験系は、ラット骨格筋筋芽細胞
（Ｌ６細胞）を用いる試験系である。Ｌ６細胞には、例
えば、ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１４５８を用いることが
できる。ＴＧＦ−βは、Ｌ６細胞に対し、細胞外マトリ
ックス合成を促進する作用をもっている。前述したデコ
リンは、その糖鎖の構造がコンドロイチン硫酸であるた
め、ＴＧＦ−βと³⁵Ｓ−ＳＯ₄ ^2-をＬ６細胞培養系に添
加すれば、デコリンに〔 ³⁵Ｓ〕−ＳＯ₄ ^2-が取り込まれ
る。培養上清をポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
け、オートラジオグフィーを行うと、デコリンの位置、
即ち分子量約１２０ｋＤの位置にバンドが出現する。従
って、本活性物質の効果は、ＴＧＦ−β存在下でＬ６細
胞を培養し、その上清から上記のごとく検出する分子量
約１２０ｋＤのバンドが、小さくなるか出現しなくなる
ことにより、確認することが可能である。尚、対照実験
としては、培養上清を添加せずに、ＴＧＦ−βを添加
（＋）又は添加しない（−）系を同様に測定する。細胞
内にも内因性のＴＧＦ−βが存在するので、この対照実
験（−）においても、このＴＧＦ−βの作用で生じる分
子量１００ｋＤ付近の薄いバンドが観察される。

【００４５】実施例１表１に示す通り、本発明の菌株の
培養物から得られた実施例物質Ａ〜Ｄは、上記の２つの
試験系のいずれか又は両方において、ＴＧＦ−β阻害活
性を有していた。

【００４６】＜毒性＞本活性物質の毒性は、４〜５週齢
のＩＣＲ系雄性マウスに５００ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与す
ることで評価できる。実施例２に示す通り、実施例１で
調製した実施例物質では、すべての投与群において死亡
例は認められなかった。

【００４７】また、これらの実施例物質には、上記２つ
の試験系によるＴＧＦ−β阻害活性試験において細胞毒
性は観察されなかった。

【００４８】＜用法（製剤を含む）、容量＞本発明のＴ
ＧＦ−β阻害剤は、本活性物質を有効成分として含有す
る。その投与経路は、特に限定されず、経口投与または
非経口投与（例えば、筋注、静注、皮下注、直腸投与、
粘膜吸収、経皮投与、点眼）することができる。また、
投与形態（剤型）については、製薬上許容される補助剤
を配合して、注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散
剤、丸剤、細粒剤、直腸投与剤、坐剤、点眼剤、噴霧
剤、塗布剤、局所組織内投与剤とすることができる。製
薬上許容される補助剤としては、例えば希釈剤、賦形
剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、緩衝剤、保存剤、溶解補
助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、着色
剤が挙げられ、これらを常法により、適宜組み合わせて
使用することができる。

【００４９】希釈剤の例としては、無菌水、無菌生理的
食塩水が挙げられる。賦形剤の例としては、乳糖、白
糖、ブドウ糖、ソルビット、コーンスターチ、結晶セル
ロースが挙げられる。結合剤の例としては、セルロース
誘導体、アラビアゴム、ゼラチン、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルエーテルが挙げられる。崩壊剤の例とし
ては、カルボキシメチルセルロースカルシウムが挙げら
れる。滑沢剤の例としては、タルク、ステアリン酸マグ
ネシウム、ポリエチレングリコールが挙げられる。緩衝
剤の例としては、ホウ酸、ホウ酸−亜硫酸ナトリウム、
リン酸二水素ナトリウム−リン酸水素ナトリウムなどが
挙げられる。保存剤の例としては、パラオキシ安息香酸
メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェ
ノール、クレゾール、クロロクレゾールなどが挙げられ
る。溶解補助剤の例としては、ポリオキシエチレン硬化
ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴ
ールが挙げられる。防腐剤の例としては、グリセリンが
挙げられる。矯味矯臭剤の例としては、ココア末、ハッ
カ油、桂皮末が挙げられる。無痛化剤の例としては、ベ
ンジルアルコールが挙げられる。安定化剤の例として
は、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、エーテ
ルが挙げられる。着色剤の例としては、タール色素、三
二酸化鉄、酸化チタン、β−カロチン、クロロフィルが
挙げられる。

【００５０】実施例３に、実施例１で調製した実施例物
質を用いた本活性物質の製剤例を示した。

【００５１】本発明のＴＧＦ−β阻害剤の投与量は、年
齢、体重、性別、症状、投与方法、投与期間等によって
異なるが、本抽出画分の量に換算して、通常１日当たり
大人では０．５〜５０００ｍｇ、小人では０．５〜１０
００ｍｇであり、これを１日１〜５回に分けて投与すれ
ばよい。

【００５２】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例の限定されるもので
はない。

【００５３】

【実施例】

実施例１：本活性物質の採取、ＴＧＦ−β阻害活性試験＜ｉ＞菌株の培養前述の培養用培地１００ｍｌを、５００ｍｌ容のフラス
コに入れ、１２１℃にて１５分間、高温高圧蒸気滅菌を
行った。このフラスコに寒天培地で培養した放線菌ＮＫ
Ｋ−９０８菌株を植菌し、２８℃の恒温にて、ロータリ
ーシェーカー（回転数：１２０ｒｐｍ）上で５日間培養
を行った。

【００５４】＜ii＞分離・精製と各分画のＴＧＦ−β阻
害活性図３に、本活性物質を、培養液から採取する方法のスキ
ームを示した。

【００５５】＜ii-1＞培養上清の分離上記＜ｉ＞で得られた培養液を、５０ｍｌの遠沈管に分
注し、２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、菌体を除
いた。

【００５６】図１に、この培養上清を、下記＜iii-1 ＞
のＴＧＦ−β阻害活性試験系に１０μｌずつ添加した結
果を示した。図１に示すとおり、ＮＫＫ−９０８株の培
養上清は、ＴＧＦ−βのＭｖ１ｌｕ細胞の増殖抑制作用
を阻害し、ＴＧＦ−β無添加対照と同等の細胞増殖が確
認された。この培養上清及びその乾燥物を本活性物質Ａ
とした。

【００５７】図２に、この培養上清を、下記＜iii-2 ＞
のＴＧＦ−β阻害活性試験系に１０μｌずつ添加した結
果を示した。図２に示すとおり、ＮＫＫ−９０８株の培
養上清は、ＴＧＦ−βが促進するＬ６細胞のデコリン産
生を抑制した。

【００５８】＜ii-2＞STEP１：溶媒抽出とイオン交換ク
ロマトグラフィー上記＜ii-1＞で得られた培養上清３００ｍｌに対し、溶
媒抽出を行い水層を得た。溶媒抽出は、ヘキサン２回、
酢酸エチル２回、クロロホルム２回の順で行い、各々３
００ｍｌの有機溶媒を使用した。

【００５９】得られた水層を、常法により凍結乾燥し
た。この凍結乾燥物に３０ｍｌの水を加え、１０倍濃縮
液とした。ＤＩＡＩＯＮＷＡ−３０（商品名、三菱化
成工業社製、内径１cm×２５cm）カラムを水で平衡化
し、前記１０倍濃縮液を供した。約１００ｍｌの水で洗
浄して非吸着物を除いた後、１Ｍ−ＮＨ₄Ｃｌで溶出し
た。分画のサイズは、５ｍｌとした。尚、溶出パターン
は、２８０ｎｍの吸光度で検出した。

【００６０】図４に、上記カラムから得た画分を、下記
＜iii-1 ＞のＴＧＦ−β阻害活性試験系に１０μｌずつ
添加した結果を示した。図４に示すとおり、ＴＧＦ−β
阻害活性は、１つのピークとして溶出された。この活性
画分４０ｍｌ（フラクションＮｏ．２６〜３２）及びこ
の凍結乾燥物を本活性物質Ｂとした。

【００６１】＜ii-3＞STEP２：エタノール沈澱とＤＥＡ
Ｅ−ＨＰＬＣ本活性物質Ｂの画分４０ｍｌに、２倍容のエタノール
（８０ｍｌ）を加えると白い沈澱物を生じた。この懸濁
液を５０ｍｌの遠沈管に入れ、１５０００ｒｐｍにて遠
心分離して沈澱物を集めた。上清を捨て、沈澱物を３０
ｍｌの水で溶解した後、０．２μｍのフィルターでろ過
した。

【００６２】２０ｍＭＨＥＰＥＳ（N-(2- ヒドロキシエ
チル) ピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸）緩衝液（ｐ
Ｈ７．２）で平衡化したＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ−２Ｓ
Ｗ（商品名、東ソー社製、内径２．１５cm×２５cm）カ
ラムに、前記溶解液を供した。流速５ｍｌ／分で２０分
間２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で流した
後、８０分かけてＮａＣｌの濃度勾配を０〜１Ｍに直線
的に漸増する同緩衝液で溶出した。画分のサイズは５ｍ
ｌとした。

【００６３】図５に、上記カラムから得た画分を、下記
＜iii-1 ＞のＭｖ１ｌｕ細胞試験系に１０μｌずつ添加
した結果を示した。図５に示す通り、活性を示す画分
（本活性物質Ｃ）は、そのＴＧＦ−β阻害活性が３つの
ピークに別れ、それぞれ、次の濃度範囲のＮａＣｌで溶
出された。即ち、０．３５〜０．５Ｍ（本活性物質Ｃ−
Ｉ）、０．５〜０．６Ｍ（本活性物質Ｃ−II）、０．６
〜０．９Ｍ（本活性物質Ｃ−III）である。

【００６４】図６に、活性物質Ｃ−Ｉ、Ｃ−II、Ｃ−II
Iを、後述する＜iii-2 ＞のＬ６細胞における試験系に
１０μｌずつ添加し、ＴＧＦ−β阻害活性を測定した結
果を示した。図６の通り、本活性物質Ｃのうち、Ｃ−II
Iのみに、ＴＧＦ−βが促進するＬ６細胞のデコリン産
生を抑制する作用が認められた。

【００６５】＜ii-4＞STEP３：ゲルろ過−ＨＰＬＣ本活性物質Ｃ−IIIの画分２０ｍｌを、常法により凍結
乾燥し、水１ｍｌに溶解した。この濃縮液を、ＴＳＫｇ
ｅｌＧ３０００ＰＸ_XLカラム（商品名、東ソー社製、
内径０．７８×３０ｃｍ）を用いるゲルろ過ＨＰＬＣに
供した。２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に
て、流速１ｍｌ／分、分画サイズ１ｍｌで溶出した。

【００６６】図７に、上記カラムから得た画分を、下記
＜iii-1 ＞のＴＧＦ−β阻害活性試験系に１０μｌずつ
添加した結果を示した。図７に示すとおり、ＴＧＦ−β
阻害活性は、分子量２０００の付近の分画に１つのピー
クとして溶出された。この活性画分又はその凍結乾燥物
を本活性物質Ｄとした。

【００６７】＜iii ＞薬理活性試験方法＜iii-1 ＞ミンク肺上皮細胞（Ｍｖ１ｌｕ細胞）を用い
る試験系培地に浮遊させたＭｖ１ｌｕ細胞（ＡＴＣＣＮｏ．Ｃ
ＣＬ６４）を、９６穴マイクロプレートに細胞数が３０
００／ウエルになるよう、５０μｌずつ分注した。培地
には、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有したＤＭＥＭ
（Dulbecco's Modified Eagle Media 、商品名、GIBCO
BRL 製カタログNo.12800-017）を使用した。上記の細胞
を、３７℃、５％ＣＯ₂／９５％ａｉｒの条件下で２時
間培養した後、同培地に１ｎｇ／ｍｌになるよう溶解し
たＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β ＋）又は培地のみ（ＴＧＦ
−β無添加対照：ＴＧＦ−β −）を各々５０μｌ／ウ
エル添加した。ここに、被験物質の培地溶解液（化合物
添加）又は培地（化合物無添加対照：図中ではＣｏｎｔ
ｒｏｌと表示）を各々１０μｌ／ウエル添加した後、上
記と同様の条件下で４日間培養した。

【００６８】培養後、クリスタルバイオレットにより次
のように細胞染色を行った。まず、培養上清を捨て、
０．２％クリスタルバイオレットの２０％メタノール溶
液を１００μｌ／ウエルずつ添加した。２０分後、染色
液を捨て、水で２回洗浄してから0.1N NaH₂PO₄／メタノ
ール（１：１）液を各ウエル１００μｌ添加した。１時
間放置後、マイクロプレート検出器（東ソー社製）にて
４１５ｎｍの吸光度を測定した。

【００６９】＜iii-2 ＞ラット骨格筋筋芽細胞（Ｌ６細
胞）を用いる試験系＜iii-1 ＞で用いた培地と同様の培地に浮遊させたＬ６
細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１４５８）を、９６穴
マイクロプレートに細胞数が５×１０⁵／ウエルになる
よう１００μｌずつ分注した。＜iii-1 ＞の培養条件下
で、３時間培養した後、培地を無血清培地に換えた。無
血清培地には、ＲＰＭＩ−１６４０（三光純薬社製カ
タログＮｏ．ＳＳ６１０−０１０１）を使用した。ＴＧ
Ｆ−βを、ＳＯ₄ ^2--free ＲＰＭＩ−１６４０培地（日
研生物医学研究所製）に１００ｎｇ／ｍｌとなるよう溶
解し、各ウエルに１０μｌずつ添加した。ＴＧＦ−β無
添加対照としては、ＳＯ₄ ^2--free ＲＰＭＩ−１６４０
培地のみを添加した。ここに、被験物質の培地溶解液
（化合物添加）又は培地（化合物無添加対照：図中では
Ｃｏｎｔｒｏｌと表示）を各々１０μｌ／ウエル添加し
た後、更に〔³⁵Ｓ〕−Ｎａ₂ＳＯ₄を２０μＣｉ／ウェ
ル添加し、上記と同様の培養条件下で１６時間培養し
た。

【００７０】培養後、各ウェルに１０μｌのプロテアー
ゼインヒビター混合液（１％ロイペプチン、１％アンチ
パイン、１０％トリプシンインヒビター）を添加した。
培養上清をマイクロチューブに回収し、１２００ｒｐｍ
にて３分間遠心分離した。この上清９０μｌとサンプル
バッファー（１２５μＭＴｒｉｓ（トリヒドロキシメ
チルアミノメタン）−ＨＣｌ、４％ＳＤＳ（ドデシル硫
酸ナトリウム）、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、
２５％グリセロール、ｐＨ６．８）３０μｌを混合し
て、４〜２０％の勾配をかけたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動）を行った。

【００７１】泳動後、オートラジオグフィーを行い、〔
³⁵Ｓ〕−ＳＯ₄ ^2-の取込みを、分子量約１２０ｋＤの位
置にバンドの出現で検出した。尚、対照実験（ＴＧＦ−
β−）において、内因性ＴＧＦ−β由来の分子量１００
ｋＤ付近の薄いバンドが観察された。

【００７２】以上、実施例１の結果をまとめると、表５
のようになる。

【００７３】

【表５】

【００７４】実施例２：毒性試験本活性物質を、４〜５週齢のＩＣＲ系雄性マウス（チャ
ールスリバー社）に５００ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。
各化合物につき１０匹のマウスを使用した。その結果、
実施例１で調製した実施例物質では、すべての投与群に
おいて死亡例は認められなかった。

【００７５】また、これらの実施例物質には、培養細胞
を用いた前述の２つの試験系による薬理試験において
も、細胞毒性は観察されなかった。

【００７６】実施例３：製剤例以下に、上記実施例１で得られた実施例物質Ａ〜Ｄを用
いて、これを有効成分として含有するＴＧＦ−β阻害剤
の例を示す。

【００７７】製剤例１実施例１本活性物質Ａ（凍結乾燥物）２０ｇ乳糖１００ｇトウモロコシデンプン３６ｇ微結晶セルロース３０ｇカルボキシメチルセルロースカルシウム１０ｇステアリン酸マグネシウム４ｇ上記組成の成分を均一に混合し、本活性物質として１錠
当たり２００ｍｇを含有する錠剤とした。

【００７８】製剤例２実施例１本活性物質Ｂ（凍結乾燥物）２０ｇ乳糖３１５ｇトウモロコシデンプン１２５ｇ微結晶セルロース２５ｇ上記組成の成分を均一に混合した後、顆粒化し、顆粒剤
とした。

【００７９】製剤例３実施例１本活性物質Ｃ−III（凍結乾燥物）２０ｇ乳糖１００ｇ微結晶セルロース７０ｇステアリン酸マグネシウム１０ｇ上記の成分を均一に混合後、顆粒化した。これを本活性
物質として１カプセル当たり２００ｍｇを含有するよう
にゼラチンカプセルに充填し、カプセル剤とした。

【００８０】製剤例４実施例１本活性物質Ｄ（凍結乾燥物）５ｇを全量１００
０ｍｌになるように注射用蒸留水に溶解した。これを１
ｍｌずつアンプルに封入し、本活性物質として５ｍｇを
含有する注射剤とした。

【００８１】

【発明の効果】以上述べた通り、本発明のＴＧＦ−β阻
害物質は、安全で優れたＴＧＦ−β阻害作用を有する。
従って、これらを有効成分として含有する本発明のＴＧ
Ｆ−β阻害剤は、取扱が容易で、安価なＴＧＦ−βが発
症及び病状の進行に関与している疾病、例えば糖尿病性
腎症の治療に有用である。

【００８２】また、本発明のＴＧＦ−β阻害物質は、ス
トレプトミセス属の放線菌由来の低分子物質である。従
って、高分子タンパク質に比べ取扱が容易で、放線菌の
培養物から得られることから安価で短時間に製造が可能
であり、経済的にも有利である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＮＫＫ−９０８株の培養上清がＴＧＦ−βに及
ぼす阻害効果を、Ｍｖ１ｌｕ細胞試験系で測定した415n
m の吸光度で示した図である。

【図２】ＮＫＫ−９０８株の培養上清がＴＧＦ−βに及
ぼす阻害効果を、Ｌ６細胞試験系で測定したときのオー
トラジオグラフで示した図である。

【図３】本発明のＴＧＦ−β阻害活性物質を、培養液か
ら採取する方法のスキームを示した図である。

【図４】ＮＫＫ−９０８株の培養上清を、有機溶媒抽出
後、ＷＡ−３０オープンカラムクロマトグラフィーにか
けた時の各溶出画分のＴＧＦ−β阻害効果を、Ｍｖ１ｌ
ｕ細胞試験系で測定した415nm の吸光度で示した図であ
る。

【図５】ＷＡ−３０オープンカラムクロマトグラフィー
においてＴＧＦ−β阻害活性が認められた画分を更にＤ
ＥＡＥ−ＨＰＬＣに供したときの、各溶出画分のＴＧＦ
−β阻害効果を、Ｍｖ１ｌｕ細胞試験系で測定した415n
m の吸光度で示した図である。

【図６】ＤＥＡＥ−ＨＰＬＣにおいてＭｖ１ｌｕ細胞試
験系でＴＧＦ−β阻害効果を示した３画分をＬ６細胞に
よる試験系に供したときのオートラジオグラフで示した
図である。

【図７】ＤＥＡＥ−ＨＰＬＣにおいて、Ｌ６細胞による
試験系でＴＧＦ−β阻害活性を示した画分を更にゲルろ
過−ＨＰＬＣに供したときの各溶出画分のＴＧＦ−β阻
害効果を、Ｍｖ１ｌｕ細胞試験系で測定した415nm の吸
光度で示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 35/74 ＡＣＳ 7431−4ＣＡＣＶＡＤＮＧ 7431−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 1/06 ＺＣ１２Ｒ 1:465） (72)発明者横田治人東京都千代田区丸の内一丁目１番２号日本鋼管株式会社内 (72)発明者矢後毅東京都千代田区丸の内一丁目１番２号日本鋼管株式会社内 (72)発明者八尾泰子東京都千代田区丸の内一丁目１番２号日本鋼管株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ストレプトミセス属に属し、基生
菌系の色が灰色系で、気菌系の胞子柄に鍵状又はらせん
状の長い胞子連鎖を形成し、胞子の表面が平滑であり、
プリドハム・ゴトリーブ寒天培地上でＬ−アラビノー
ス、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−ラムノー
ス、シュークロース、ラフィノースを資化し、かつＴＧ
Ｆ−β阻害物質産生能を有する放線菌。
【請求項２】ストレプトミセス属に属し、ＴＧ
Ｆ−β阻害物質産生能を有する放線菌が、ストレプトミ
セスｓｐ．ＮＫＫ−９０８（Streptomyces sp. NKK-90
8）である特許請求の範囲第１項に記載の放線菌。
【請求項３】特許請求の範囲第１項又は第２項
に記載の菌株を培養してＴＧＦ−β阻害活性物質を生成
蓄積させ、該培養物から分離、採取することを特徴とす
るＴＧＦ−β阻害活性物質の製造方法。
【請求項４】特許請求の範囲第３項に記載の方
法で得られたＴＧＦ−β阻害活性物質を有効成分として
含有するＴＧＦ−β阻害剤。