JPH0798000B2

JPH0798000B2 - ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン

Info

Publication number: JPH0798000B2
Application number: JP62126687A
Authority: JP
Inventors: 秀昭萩原; 純三永尾
Original assignee: 萩原義秀
Priority date: 1987-05-23
Filing date: 1987-05-23
Publication date: 1995-10-25
Anticipated expiration: 2010-10-25
Also published as: KR930012104B1; IL86457A; AU628288B2; AU1654588A; ES2064349T3; EP0293155A3; DE3851571D1; CA1340880C; EP0293155B1; US5093261A; JPS63290898A; IL86457A0; EP0293155A2; DE3851571T2; KR880014109A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、免疫グロブリン生産能を有するヒトＢ−セル
と免疫グロブリン生産能を実質的に欠損しているヒトＢ
−セルとの新しいタイプのヒト／ヒト融合細胞クローン
が生産する抗原特異的ヒト免疫グロブリンに関する。

更に詳しくは、本発明はヒト肝癌患者のヒトＢ−セルと
ヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとのヒト／ヒト融
合細胞株であって、抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産
能を有するヒト／ヒトハイブリドーマが生産する抗原特
異的ヒト免疫グロブリンに関する。

該抗原特異的免疫グロブリンは、例えばヒト肝癌などの
予防、治療、診断の如き医学及び薬学分野、生化学的試
薬、生体高分子の精製試薬などの薬学分野、さらには、
癌抗原の精製などの生化学的分野の研究等の広い分野に
おいて有用である。

従来、癌その他の抗原によって感作されたマウスＢ−セ
ルと骨髄性白血病（myeloma）マウスからのマウスＢ−
セルとの融合細胞をマウス体外で形成し、上記抗原に対
するマウス免疫グロブリン生産能を有し、且つ自己増殖
性を有するマウス／マウス融合細胞を形成した報告は知
られている［例えば、ケーラ・ジー、ミルスタイン・シ
ー、ネイチャ“Ｋhler G.,Milstein C.,Nature）,2
56、495（1975）；デイポールド・イー・ジー、ロイド
・ケー・オー・リー・エル・ティー・シー、イケダ・エ
イチ、エットゲン、エイチ・エフ、オールド・エル・ジ
ェイ、プロシーディングオブナショナルアカデミ
イオブサイエンスオブザユナイテッドステー
トオブアメリカ（Dippold,E.G.,Lloyd,K.O.,Li,L.
T.C.,Ikeda,H.,Oettgen,H.F.＆ OId,L.J.,Pore.Nat.Aca
d.Sci.U.S.A.）、77、6114（1980）；等］。

又、抗原によって感染されたヒトＢ−セルと骨髄性白血
病マウスからのマウスＢ−セルとの融合細胞を体外で形
成し、上記抗原に対するヒト、免疫グロブリン生産能を
有し且つ自己増殖性を有するヒト／マウス融合細胞を形
成した報告も知られている［例えばシュローム・ジュ
イ、ワンダーリッヒ・デイー、アンドテラモト・ワイ
・エイプロシーディングオブナショナルアカデミ
イオブサイエンスオブザユナイテッドステ
ートオブアメリカ（Schlom J.,Wunderrich P.,and
Teramoto Y.A.Proc.Nat.Acad.Sci.,U.S.A.）、77（1
1）、6841（1980）］。

しかしながら、ヒト免疫グロブリン生産能を有する融合
細胞を取得しようという上記後者の試みにおいては、経
時的に染色体欠落を伴い、前記ヒト免疫グロブリン生産
能が、経時的に喪失し、免疫グロブリン生産能が極めて
不安定である致命的な欠陥を有する。

ヒト免疫グロブリン生産能を有するヒト／ヒト融合細胞
を形成する試みとして、抗原としてハシカ・ビールス又
はハプテン（hapten）［2,4−ジニトロフェニル］によ
って感作されたヒトＢ−セルをドナーとして使用し、こ
れと骨髄性白血病患者からのヒト免疫グロブリン生産能
を有するセルライン（ヒトＢ−セル、親株）との融合細
胞をヒト体外で形成し、上記抗原に対するヒト免疫グロ
ブリン生産能を有し、且つ自己増殖性を有するヒト／ヒ
ト融合細胞を形成した報告が知られている［例えば、ク
ロッチェ・シー・エム、ライネンバッハ・エイ、ホール
・ダブリュ、ステプレスキー・ゼット、コプロウスキー
・エイチ、ネイチャー（Croce,C.M,Linnenbach,A.,Hal
l,W.,Steplowski,Z ＆ Koprpwski,H,Nature、288、48
8（1980）；オルソン・エル、カプラン・エイチ・エ
ス、プロシーディングオブナショナルアカデミイ
オブサイエンスオブザユナイテッドステート
オブアメリカ（Olsson,L ＆ Kaplan,H.,S.,Proc.
Nat.Acad.Sci.U.S.U.A.）、７（９）、5429（1980）；
等］。

しかしながら、上述の方法のうちマウス／マウスハイブ
リドーマを用いる方法は、マウスの免疫グロブリンを作
製する方法であり、又、マウス／ヒトハイブリドーマを
用いる方法は、マウス由来の生産物が細胞培養中に生成
されることは避けられないし、さらにヒト染色体の欠失
に伴いヒト免疫グロブリン生産の消失が起こる場合もあ
る。これがヒト／ヒト融合細胞から採取されるヒト型免
疫グロブリンの生産が望まれる理由である。しかしなが
ら、上記のヒト／ヒトハイブリドーマから生産されるヒ
ト免疫グロブリンに関する報告は癌細胞に対する結合性
についてはなんら実証例を提示していない。とくに肝癌
細胞及び肝癌組織への結合性についての記載はない。

本発明者らの一人によって、ヒト子宮癌患者のヒトＢ−
セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとのヒト／
ヒト融合細胞株であって抗原特異的ヒト免疫グロブリン
生産能を有するヒト／ヒトハイブリドーマが創製された
（特開昭59−137497号）。そして、該免疫グロブリンは
子宮頸部扁平上皮癌細胞、該細胞由来の株化細胞Hela及
びCaSkiに対し、正常繊維芽細胞（WI−38）に対する結
合力に比してより強い結合力を示したことが報告され
た。しかしながら、ヒト肝癌細胞、ヒト肝癌組織などへ
の結合性に関して言及していない。

又、特開昭61−44900号には、膵臓癌、大腸癌及び肝臓
癌関連抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗
体に関して記載され、それを生産する融合細胞は、抗体
産生細胞と骨髄細胞の融合によって得られるが、それら
は同種動物由来のものであることが好ましいと記載して
いる。しかしながら、この提案において具体的に開示さ
れているのはマウス／マウス融合細胞株のみである。

更に又、特開昭61−167699号、特開昭62−36398号に
は、食道癌、肺癌、胃癌、肝癌に対して特異的に反応す
るモノクローナル抗体に関して記載され、それを生産す
る融合細胞は、抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合によっ
て得られるが、この提案において具体的に開示されてい
るのはマウス／マウス融合細胞株のみである。さらにこ
こで肝癌細胞との結合性について具体的に示された例で
は、マウス／マウス融合細胞株についてのヒト肝癌細胞
（HEK）に対する結合性のみしか示されておらず、他の
肝癌細胞やヒト肝癌組織との結合性については全く言及
されていないし且つヒト／ヒトハイブリドーマ株の生産
するモノクロナール抗体及びそのヒト肝癌細胞もしくは
組織に対する結合性については、何も示されていない。

本発明者等は、ヒト／ヒトハイブリドーマの創製研究を
行ってきた。その結果、ヒト肝癌患者のヒトＢ−セルと
ヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとのヒト／ヒト融
合細胞株であって、抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産
能を有するヒト／ヒトハイブリドーマの創製に成功し
た。

本発明の該ヒト／ヒトハイブリドーマの一種は、ヒト肝
癌患者のヒトＢ−セルの免疫学的性質を有し且つそのよ
うな形質を安定に持続し得ること及び該ヒト／ヒトハイ
ブリドーマは、ヒト免疫グロブリンＡ（IgA）生産能を
有し且つ生産された抗体はヒト肝癌細胞に結合性を示す
抗原特異的モノクロナール抗体であることを発見し且つ
そのような抗原特異的ヒト免疫グロブリンの製造に成功
した。

又更に、上記の新しいタイプのヒト／ヒトハイブリドー
マは、ヒト肝癌患者のヒトＢ−セルを含有するヒト細胞
群とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン［ヒトＢ−セ
ル］を含有するヒト細胞群とを、人間体外で融合してヒ
トＢ−セルとヒトＢ−セルとの融合細胞を産生し、常法
のHATO培地中で培養して融合細胞クローンを取得するこ
とにより産生できることを発見し且つそのような手法で
上記ヒト／ヒトハイブリドーマ（たとえば、TOH/B9）を
創製することに成功した。

又更に、本発明の該ヒト／ヒトハイブリドーマの他の一
種は、ヒト肝癌患者のヒトＢ−セルの免疫学的形質を有
し且つそのような形質を安定に持続し得ること及び該ヒ
ト／ヒトハイブリドーマはヒト免疫グロブリンＧ（Ig
G）生産能を有し且つ生産されたこれらの抗体はヒト肝
癌組織のホルマリン固定後パラフイン包埋切片に結合性
を示す抗原特異的モノクロナール抗体であることを発見
し且つそのような抗原特異的ヒト免疫グロブリンの製造
に成功した。

更に、上記の新しいタイプのヒト／ヒトハイブリドーマ
は、ヒト肝癌患者のヒトＢ−セルを含有するヒト細胞群
とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン［ヒトＢ−セ
ル］を含有するヒト細胞群とを、人間体外で融合してヒ
ト−Ｂ−セルとヒトＢ−セルとの融合細胞を産生し、常
法のHATO培地中で培養して融合細胞クローンを取得する
ことにより産生できることを発見し且つそのような手法
で上記ヒト／ヒトハイブリドーマ（たとえば、TOH/D5）
を創製することに成功した。

従って、本発明の目的はヒト肝癌患者のヒトＢ−セルと
ヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン［ヒトＢ−セル］
とのヒト／ヒト融合細胞株であって、抗原特異的ヒト免
疫グロブリン生産能を有するヒト／ヒトハイブリドーマ
を提供するにある。

本発明の他の目的は、上記ヒト／ヒトハイブリドーマを
用いて、ヒト肝癌細胞或いはヒト肝癌組織などに結合性
を示す癌関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン（モノクロ
ーナル抗体）を製造する方法及び該ヒト免疫グロブリン
を提供するにある。

本発明の上記目的及び更に多くの目的ならびに利点は、
以下の記載から一層明らかとなるであろう。

本発明のヒト／ヒトハイブリドーマはヒト肝癌患者のヒ
トＢ−セルたとえば該患者の血中、リンパ節、脾臓、骨
髄などから得ることのできるヒトＢ−セルとヒトリンパ
芽球細胞株のサブクローン［ヒトＢ−セル］、たとえば
HIH/TO1株（微工研受託番号FERM BP−1884）とのヒト
／ヒト融合細胞株であって、ヒト肝癌細胞或いはヒト肝
癌組織などに結合性を示す抗原特異的ヒト免疫グロブリ
ン生産能（モノクローナル抗体生産能）を有する。

本発明者等の研究により、ヒト肝癌患者のヒトＢ−セル
を用い、これを免疫グロブリン生産能を実質的に欠損し
ているヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン［ヒトＢ−
セル］と人間の体外で融合させ、肝癌などの癌関連抗原
に特異的に結合するヒト免疫グロブリン生産能を有する
ヒト／ヒトハイブリドーマが始めて産生された。

この融合細胞を産生する融合操作はそれ自体は、公知の
如何なる方法で行ってもよい。例えば、融合操作は液媒
中で融合促進剤の存在下に、ヒト肝癌患者のヒトＢ−セ
ルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとを接触させ
ることにより行うことができる。

この際、融合操作を行なうに先立って、ヒト肝癌患者の
ヒトＢ−セルを、ヒトＢセル増殖因子（ヒトBCGF;B−Ce
ll growfh factor）及び抗ヒトIgM抗体（anti−μ）
の存在下で予備培養処理することが望ましい。予備培養
処理は、たとえば、上記ヒトBCGF及びanti−μを含有す
る適当な基礎培地やその改質培地を利用し、たとえば５
％CO₂雰囲気下で約37℃±３℃の如き条件下、約５〜約
７日の培養条件で行なうことができる。利用する基礎培
地やその改質培地の例としては、特開昭62−51983号に
例示されているような公知の基礎培地及びその改質培地
を挙げることができる。また、それ自体公知の他の培地
用成長因子、アミノ酸類、ビタミン類もしくはミネラル
類、該酸誘導体類、糖類、補酵素類、脂肪酸類を更に含
有することができる。上記ヒトBCGF及びanti−μは市場
で入手可能であり、その調製法も知られており、前者に
ついては例えば、ABBY MAIZEL et al.Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA vol.79、5998−6002（1982）に、又、後者
については、例えば「免疫化学」（右田俊介編）中山書
店（1972）pp51−63に記載されている。その使用量は実
験的に容易に選択できるが、たとえば培地容量に対して
約５〜約20容量％のヒトBCGF及び約５〜約100μg/ml−
培地のanti−μの如き使用量を例示できる。

本発明に於て、融合細胞を産生する融合操作それ自体
は、たとえば、液媒中で融合促進剤の存在下にヒト肝癌
患者のヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクロ
ーンを接触させることにより行なうことができる。この
ような融合方法の例としては、仙台ビールス（HVJ）、
ポリエチレングリコールなどの融合促進剤を用いる方法
や高電圧で電気的に融合する方法などを例示することが
できる。

例えば、水性媒体中、上記例示の如き融合促進剤の存在
下、所望によりおだやかな攪拌を加えて系を均一にし、
次いで、前記ヒトＢ−セルの１ケと前記サブクローン
（ヒトＢ−セル）の１ケから成る融合細胞が産生される
時間、たとえば数分間のオーダーで静置することによ
り、所望の融合細胞が産生できる。溶媒の例としては、
水、生理食塩水、５％ジメチルスルホキシド水溶液、５
％グリセロース水溶液などを例示することができる。

所望の融合細胞が産生された系を、例えば、遠心分離し
て細胞群を採取し、再び適当な培地に、たとえば10％仔
牛もしくは牛胎児血清含有RPMI−1640液体培地中にHATO
試薬を加えた培地に、採取した該細胞群を分散させ、こ
の分散液を例えばマイクロ・タイター・プレートの穴
に、夫々、一定量づつ分散注入し、例えば、５％CO₂の
存在下、37℃で培養を行うことができる。上記RPMI−16
40培地に代えて、RPMI−1640:DME;F−12＝2:1:1の混合
培地（RDF）を利用することもできる。各穴中の培養液
を例えば３日毎に新しい培養液と取りかえ、例えば２週
間培養を続けたのち、顕微鏡下で融合細胞の有無を調
べ、コロニーの認められた試料の培養液を採取し、ヒト
免疫グロブリンの有無を例えば¹²⁵Iを用いたラジオ・イ
ムノ・アツセイや酵素抗体法により検出することができ
る。

このようにして、ヒト免疫グロブリンの生産の認められ
たコロニーを、新しい培養液に移して培養し、融合細胞
を増殖させることにより融合細胞クローンを取得するこ
とができる。更に、必要に応じてサブ・クローニングし
て、所望のヒト肝癌などの癌関連抗原に結合するヒト免
疫グロブリン生産性クローンを得ることができる。

この態様の実施に際しては例えば下記文献により公知の
手法を利用することができる。グラツシイ・エム・シー
・ハンドレイ・エイチ・エイチ、ハギワラ・エイチ，ア
ンドロイストン・アイ，プロシーディングオブナ
ショナルアカデミイオブサイエンスオブザ
ユナイテッドステートオブアメリカ（Glassy,M.C.,
Handley,H.H.,Hagiwara,H.,and Royston,I.,Proc.Nat.A
cad.Sci.U.S.A.），80,6327（1983）及び「酵素抗体
法」（編集渡辺慶一）学際企画p33−118（1956）。

たとえば、上記文献に記載の手法を利用して健康なヒト
脾臓からバイオプシー（Biopsy）により、リンパ芽球、
骨髄性白血病患者のリンパ球などの如きリンパ系細胞を
とり、その中の免疫グロブリン生産能を実質的に有しな
いＢセルリンパ球を選別分離し、たとえば６−チオグア
ニン及びウワバイン耐性でHATO培地中では死滅する感受
性を有するヒトＢ−セルを得ることができる。例えば後
記実施例で利用したヒトＢセルHIH/TO1（微工研受託第
号FERM BP−1884）は、後記参考例１に示したように、
上記リンパ芽球を用いて６−チオグアニン、ウワバイン
含有培地で培養して得ることができる。

前述の手法により、ヒト肝癌患者のヒトＢ−セルとヒト
リンパ芽球細胞株のサブクローンHIH/TO1株［微工研受
託番号FERM BP−1884］から産生された抗原特異的免疫
グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリドーマ（Human Hy
bridoma）TOH/B9［微工研受託番号FERM BP−1883］及
びTOH/D5［微工研受託番号FERM BP−1882］の細胞生化
学的性質を以下に示す。

ヒト／ヒトハイブリドーマTOH/B9（FERM BP−1883）：（１）ヒト免疫グロブリン（IgA）分泌（生産）、（２）倍加時間（ダブリング・タイム）約37時間、（３） DNA含量が正常ヒトリンパ球の約２倍、たとえ
ば1.5〜2.5倍、（４）上記（１）のIgAはヒト株化細胞株PLC/PRF/5
（Alexander cells）（肝癌）に対して結合性を示す、（５） HATO含有培地（ヒポキサンチン、アメソプテリ
ン、チミジン、ウワバイン含有培地）中で***増殖可能
である。

ヒト／ヒトハイブリドーマTOH/D5（FERM BP−1882）：（１）ヒト免疫グロブリンＧ（IgA）分泌（生産）、（２）倍加時間（ダブリング・タイム）約37時間、（３） DNA含量が正常ヒトリンパ球の約２倍、たとえ
ば1.5〜2.5倍、（４）上記（１）のIgGはヒト肝癌組織のホルマリン
固定パラフィン包埋切片に対して結合性を示す、（５） HATO含有培地（ヒポキサンチン、アメソプテリ
ン、チミジン、ウワバイン含有培地）中で***増殖可能
である。

尚、相対DNA含量（正常ヒトリンパ球のDNA含量に対する
比率）は、ハイブリドーマをプロビシユウムアイオダイ
ドで染色したのち、flow cytometerで分離分析する方法
によって決定された。

本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリンは、ヒト肝癌患
者のヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクロー
ン［ヒトＢ−セル］とのヒト／ヒト融合細胞株であって
抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産能を有する細胞株を
培地に培養し、その培養物より抗原特異的ヒト免疫グロ
ブリンを採取することにより製造できる。

例えば前述のようにして産生できるヒト／ヒトハイブリ
ドーマを適当な培地、たとえば10％仔牛血清含有RPMI−
1640培地で培養し、培養液を採取することによりヒト肝
癌などのガン関連抗原に特異的に結合する免疫グロブリ
ン含有物質を得ることができる。上記ヒト／ヒトハイブ
リドーマの培養に際して、無血清培地を用いることもで
き、得られる免疫グロブリンの精製が容易となるので有
利である。このような無血清培地の例として、同一出願
人の出願に係わる特開昭62−51983号（特願昭60−19214
5号）に提案された無血清培地を挙げることができる。
更に、所望により精製して精製免疫グロブリンとするこ
ともできる。精製はたとえば、硫安分画法、アフイニテ
イークロマトグラフィー、ゲル濾過、イオン交換クロマ
トグラフィー、電気泳動法などの如き生体液から免疫グ
ロブリンを採取、精製する際に利用できると同様な精製
手段を適宜に利用することができる。

上記ヒト／ヒトハイブリドーマの培養に利用できる培地
の他の例としては、10％ウシ胎児血清含有PRMI−1640培
地、Dulbeco培地及びHAM培地の三者混合培地（混合比2:
1:1）であるRDF培地、及びトランスフェリン、インシュ
リン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン並びに
β−メルカプトエタノール添加のRDF培地などを例示す
ることができる。又、培養条件としては、たとえば５％
CO₂の存在下、37℃の条件を例示できる。

上述のようにして得ることのできる本発明のガン関連抗
原特異的ヒト免疫グロブリンとして、前述したヒト／ヒ
トハイブリドーマTOH/B9（FERM BP−1883）或いは前述
したヒト／ヒトハイブリドーマTOH/D5（FERM BP−188
2）を用いて下記の本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブ
リンを生産することができる。その特性を以下に示す。

ヒト／ヒトハイブリドーマTOH/B9（FERM BP−1883）の
生産するガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン：（イ）ヒト免疫グロブリンＡ（IgA）であって、（ロ）ヒト株化細胞PLC/PRF/5（Alexander cells）
（肝癌）に対して結合力を有する、（ハ）分子量約６万のＨ鎖（heavy chain）、分子量
約２万のＬ鎖（light chain）を含有する。

ヒト／ヒトハイブリドーマTOH/D5（FERM BP−1882）の
生産するガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン：（イ）ヒト免疫グロブリンＧ（IgG）であって、（ロ）ヒト肝癌組織に対して結合性を示す、（ハ）Ｈ鎖（heavy chain）及びＬ鎖（light chain）
より成り、分子量が約15万である。

上記ヒト株化細胞PLC/PRF/5（Alexander cells）（肝
癌）は、ATCC CRL 8024としてATCC（アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション）から自由に入手する
ことができる。

本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリンはたとえばヒト
肝癌の如き、ヒト癌への作用抗体或いはそれ自体の作用
でこれら癌細胞の増殖抑制、癌細胞の死滅を行わせた
り、ヒト体外で量産されたこれらの癌組織認識抗体に補
体もしくは、Ｔ−リンパ球の助けをかりて癌細胞の増殖
抑制や癌細胞死滅のはたらきをさせたりすることができ
る。更にまた、ヒト体外で量産された癌特異的抗体をキ
ヤリヤーとして利用して例えば化学療法剤結合−ヒト・
モノクローナル抗体、インターフエロン結合／ヒトモノ
クローナル抗体、高分子毒素結合−ヒト・モノクローナ
ル抗体、薬物入りリポゾーム結合−ヒト・モノクローナ
ル抗体などの形で癌細胞の増殖抑制や死滅のはたらきを
させたりするのに有用である。また、本発明方法で得ら
れるヒト・モノクローナル抗体をキヤリヤーとして利用
し、これに放射線感受性物質を結合させて患者に投与
し、癌細胞に選択的に集まる性質を利用して患部を検知
し放射線療法に利用することができる。このような癌に
対する利用に際しては、ヒト・モノクローナル抗体とし
て完全な抗体を用いてもよいし、抗体を化学的な手法で
特異的抗原認識部位を含むより小さな分子に切断して用
いたり、或いは、そのような小さな分子もしくは特異的
抗原認識部位のみを他の抗体の非特異的抗原認識部分と
結合させて、より有効性のある修飾ヒト・モノクローナ
ル抗体を化学的手法で創製して用いることもできる。

以下、実施例により、本発明方法実施の一態様をさらに
詳しく述べる。

参考例１ヒトＢセル・リンパ芽球細胞株HIH/TO1。

ヒトＢセル・リンパ芽球細胞WI−L2（微工研寄託受託拒
否通知書、通知番号:60微寄分第1621号）を、基礎培地R
DF中にインシユリン、トランスフエリン、セレニウム、
エタノールアミン、β−メルカプトタノール及び牛血清
アルブミンの適量を含有する無血清培地で培養適応させ
る。該無血清培地をを分注した96穴マイクロタイタープ
レートに1cell/wellとなるように植えこみ、５％CO₂、3
7℃の条件下で限界希釈法によりクローニング操作を行
なう。約１ケ月経過後、増殖してきた50穴より免疫グロ
ブリンIgG及びIgMを実質的に培地中に生産していないク
ローンを１つ選び出した。

このクローンを、まず0.1μＭの６−チオグアニンを含
む前記と同様な無血清培地中で培養適応させる。培養は
５％CO₂、37℃の条件下で、継代培養をくり返すごと
に、６−チオグアニン濃度を0.25μＭ、0.5μＭ、１μ
Ｍ、２μＭ、４μＭ、10μＭ、15μＭ、20μＭと段階的
に上げて行ない、最終的に20μＭの６−チオグアニン含
有無血清培地中で増殖可能な単クローンを、前記と同様
な限界希釈法によるクローニング操作で選別する。

この細胞を、１μg/mlの突然変異剤MNNG（Ｎ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を含有する基
礎培地RDF中で、５％CO₂、37℃の条件下で３時間培養し
た後、前記と同様な無血清培地で洗浄し、洗浄した細胞
を20μＭの６−チオグアニン及びウワバインを含む前記
と同様な無血清培地中で培養適応させる。培養は５％CO
₂、37℃の条件下で、継代培養をくり返すごとに、ウワ
バインの濃度を0.1μＭ、0.2μＭ、0.5μＭ、１μＭ、
５μＭと段階的に上げて行ない、最終的に20μＭの６−
チオグアニン及び５μＭのウワバインを含む無血清培地
中で増殖可能な単クローンを、前記と同様な限界希釈法
によるクローニング操作で選別し、HIH/TO1（FERM BP
−1884）株を得た。

実施例１肝癌患者から手術の際に癌組織周辺のリンパ節を入手し
た。リンパ節をハサミで細かく切りきざみ、内部のリン
パ球を培地RDF（RPMI1640:DME:F−12＝2:1:1）中に分散
させ、続いて２重のガーゼを用いて、過を行い、脂肪
層を除いた後に、液中の細胞（リンパ球＞80％）を遠
心法によつて集める［ヒトＢ−セルドナーを含むヒトリ
ンパ球分画（ドナーＢ−セル）］。その後、このリンパ
球分画を20％牛胎児血清および、10％ジメチルスルホオ
キサイド（DMS）を含むRDF培地中で凍結（−130℃）
し、細胞融合を行う日まで保存した。1.0×10⁷個のドナ
ーＢ−セルを５％ヒトBCGF（Ｂ cell growth facto
r）（Cellular Products,Inc and Biotech Researc
h Labs社製）および20μg/mlヤギ抗ヒトIgM（cappel社
製）抗体を含有するRDF培地で37℃５％CO₂条件下で培養
し、７日後100G、15分間の遠心処理を行いドナーＢセル
を集め、RDF培地で１度洗浄する。

その後ドナーリンパ球と免疫グロブリン生産能を実質的
に欠損している親ヒトＢ−セル（HIH/TO1）のそれぞれ
を1.0×10⁷および1.0×10⁷個混合し、50％ポリエチレン
グリコール1500の存在下に融合を完了させる。その後、
30G、15分間の遠心処理を行ってポリエチレングリコー
ルを除き、新たに、10％牛胎児血清および、ヒポキサン
チン、アメソプテリン、チミジン、ウワバイン（HATO）
を含むRDF培地を加える。この細胞群を含む培養液200μ
ｌ（この中には1.5×10⁵個のセルを含む）づつを96個の
穴をもつミクロプレートに分注し、約４週間、37℃、５
％CO₂条件下のインキユベーターで培養した。この間、H
ATO及び10％牛胎児血清を含むRDF培地を４〜５日に１度
交換した。親Ｂ−セル［HIH/TO1（FERM BP−1884）］
はアメソプテリン存在ではヒポキサンチンホスホリボシ
ールトランスフエラーゼを欠損しているために、生きる
ことが出来ない。またリンパ球は通常の培地たとえばRD
F＋10％牛胎児血清中では永続的に増殖し生きのびるこ
とができないのに加えてウアバイン存在下で死滅する。
よつてHATOを含む培地で永続的に増殖した細胞はリンパ
球と親Ｂ−セルの融合した細胞である。４週間培養の
後、５個のハイブリドーマが得られ、これらのハイブリ
ドーマがヒト免疫グロブリンを産出しているかどうかを
酵素抗体法を用いて調べた。以下、その方法を説明す
る。

ミクロタイタープレートの中に抗ヒト免疫グロブリン抗
体（抗ヒトIg抗体）を滴下（50nl）し、37℃で１時間プ
レートに吸着させる。0.3％のゼラチンを含む10mM PBS
（ゼラチン緩衝液）で３回洗浄した後、５％牛血清アル
ブミン溶液を滴下（200μｌ）し、37℃で0.5時間吸着さ
せる。ゼラチン緩衝液で３回洗浄し、未吸着のものを除
去する。次に検液（培養上清）を滴下（50μｌ）して、
37℃で１時間反応後、ゼラチン緩衝液で３回洗浄する。
ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIg抗体を滴下（50μ
ｌ）して、37℃で30分間反応させ、培養上清中のヒトIg
と結合させる（酵素抗体法）。ゼラチン緩衝液で３回洗
浄後、過酸化水素とｏ−フエニレンジアミンを含む基質
溶液を加え、暗室で10分間反応させる。5N−H₂SO₄（50
μ）を加えて反応を止める。もしミクロプレート上に
ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIg抗体が残っている場
合、すなわちそれに結合されるヒトIgが残っている場合
には490nmに吸収をもつ黄色の基質反応物が生産され
る。この量を吸光度計を用いて測定し、ハイブリドーマ
培養上清中に含まれるヒトIgの量を知る。ハイブリドー
マ培養上清中にヒトIgが存在しない場合には、ペルオキ
シダーゼ結合ヤギ抗ヒトIg抗体は洗浄の段階で洗い流さ
れる。

以上の測定方法を用いて結果、５個のうち３個のハイブ
リドーマのクローンが抗体を産生しており、そのうちヒ
トIgAを産生するものをTOH/B9（FERM BP−1883）、ヒ
トIgGを産生するものをTOH/D5（FERM BP−1882）と命
名した。

４週間後にそれぞれのハイブリドーマを24個の穴をもつ
ミクロプレート（2ml/穴）に植え替えた後、さらに１週
間培養を続けた。培養液の上清を採取、種々の株化細胞
或いは癌組織に対するヒトハイブリドーマから生産され
るIgの特異性を調べた（一定の形質をもつIgまたは特定
の形質をもつIg）。その方法を以下に説明する。

ヒトの種々の株化培養細胞（これらはATCCより入手可
能）をDF培地（DME:F−12＝1:1）に10％牛胎児血清を加
えた培地で培養する。細胞の数が５×1⁶〜１×10⁷にな
つた段階で、トリプシンを用いて細胞をシヤーレの底面
から剥がし、遠心法を用いて細胞を集め、培地でよく洗
浄する。96個の穴を持つミクロタイタープレートの各穴
に細胞を一定数（10⁵×100μ）ずつ分注し、37℃で１
晩、プレートに吸着させる。次に、３％グルタルアルデ
ヒド溶液を滴下（50μ）し、37℃で20分間、細胞の固
定を行う。遠心法（200g,10分間）で細胞をおとし、ゼ
ラチン緩衝液で３回洗浄した後、１％牛血清アルブミン
溶液を滴下（200μ）し、37℃で１時間プレートに吸
着させる。ゼラチン緩衝液で３回洗浄し、未吸着のもの
を除去する。その後、検液（培養上清）を細胞の上に滴
下（50μ）し、37℃で１時間反応させ、ゼラチン緩衝
液で３回洗浄する。続いてペルオキシダーゼ結合抗ヒト
Ig抗体を滴下（50μ）し、37℃で30分間反応させる。
ゼラチン緩衝液で３回洗浄を行った後、先述の酵素抗体
法で述べた方法によつて細胞に結合する培養液中のヒト
Igの量を測定することによつて株化細胞に対する特異性
をみた。又、癌組織をホルマリン固定後パラフイン包埋
した切片をエタノール溶液を用いて脱パラフイン処理を
行つた後検液（培養上清）を加え、市販のキツト（VECT
OR LABORATORIES社製［ベクタステインABCキツト」）
を用いてハイブリドーマから生産されるIgの特異性をみ
た。以上の結果、TOH/B9（FERM BP−1883）の生産する
IgAはヒト肝癌由来の株化細胞、PLC/PRF/5（ATCC CRL
8024）に対して結合力を有することがわかつた。また
TOH/D5（FERM BP−1882）の生産するIgGはヒト肝癌組
織に対して結合力を有することがわかつた。

すなわち、ドナーＢ−セルは体内に肝癌をもつ患者から
採取されたものであるので、細胞融合法によつて作り出
された自己増殖性をもつハイブリドーマのクローンから
はドナーＢ−セルと同形質のかつ特定の抗原結合部位を
もつモノクロナール（単一）抗体を生産していることを
示している。これらが、ハイブリドーマであることをさ
らに確認するために細胞内、DNA含量を調べた。その方
法を以下に説明する。

遠心管の中に培養細胞液を入れ遠心処理により上清を除
去する。70％エタノール溶液で４℃30分以上固定を行
う。遠心処理により上清を除き、RNA分解酵素（RNase）
溶液を加え、静かに振盪し、RNAを分解する。37℃で30
分間反応させた後、再び蒸留水で２度洗浄する。プロピ
ジウムイオダイド（PI）を加え、室温で20分間、染色し
た後、さらに蒸留水で２度洗浄する。蒸留水で再希釈
し、セルソーターを用いて分析した結果、TOH/D5（FERM
BP−1882）、TOH/B9（FERM BP−1883）ともに親ヒト
Ｂセル［HIH/TO1（FERM BP−1884）］の約２倍量のDNA
含量が認められ、これにの細胞がハイブリドーマである
ことが確認された。

約３週間後に、それぞれのハイブリドーマの培地からHA
TOを除きRDF＋10％牛胎児血清で培養を行った。1.0×10
⁶個/ml細胞が培地で生育する時、TOH/B9（FERM BP−18
83）は約1.3μg/mlの量のヒトIgAを、TOH/D5（FERM BP
−1882）は約0.15μg/mlのIgGを生産した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト／ヒト融合細胞TOH/B9（FERM BP−18
83）によって生産されるものであって、かつ、（ａ）ヒト免疫グロブリンＡ（IgA）であり、（ｂ）ヒト株化細胞PLC/PRF/5（Alexander cells）又
はヒト肝癌組織に対して結合する生化学的性質を有することを特徴とする抗原特異的ヒト
免疫グロブリン。
【請求項２】ヒト／ヒト融合細胞TOH/D5（FERM BP−18
82）によって生産されるものであって、かつ、（ａ）ヒト免疫グロブリンＧ（IgG）であり、（ｂ）ヒト株化細胞PLC/PRF/5（Alexander cells）又
はヒト肝癌組織に対して結合する生化学的性質を有することを特徴とする抗原特異的ヒト
免疫グロブリン。