JPH0798000B2 - ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン - Google Patents
ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリンInfo
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- JPH0798000B2 JPH0798000B2 JP62126687A JP12668787A JPH0798000B2 JP H0798000 B2 JPH0798000 B2 JP H0798000B2 JP 62126687 A JP62126687 A JP 62126687A JP 12668787 A JP12668787 A JP 12668787A JP H0798000 B2 JPH0798000 B2 JP H0798000B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫グロブリン生産能を有するヒトB−セル
と免疫グロブリン生産能を実質的に欠損しているヒトB
−セルとの新しいタイプのヒト/ヒト融合細胞クローン
が生産する抗原特異的ヒト免疫グロブリンに関する。
と免疫グロブリン生産能を実質的に欠損しているヒトB
−セルとの新しいタイプのヒト/ヒト融合細胞クローン
が生産する抗原特異的ヒト免疫グロブリンに関する。
更に詳しくは、本発明はヒト肝癌患者のヒトB−セルと
ヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとのヒト/ヒト融
合細胞株であって、抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産
能を有するヒト/ヒトハイブリドーマが生産する抗原特
異的ヒト免疫グロブリンに関する。
ヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとのヒト/ヒト融
合細胞株であって、抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産
能を有するヒト/ヒトハイブリドーマが生産する抗原特
異的ヒト免疫グロブリンに関する。
該抗原特異的免疫グロブリンは、例えばヒト肝癌などの
予防、治療、診断の如き医学及び薬学分野、生化学的試
薬、生体高分子の精製試薬などの薬学分野、さらには、
癌抗原の精製などの生化学的分野の研究等の広い分野に
おいて有用である。
予防、治療、診断の如き医学及び薬学分野、生化学的試
薬、生体高分子の精製試薬などの薬学分野、さらには、
癌抗原の精製などの生化学的分野の研究等の広い分野に
おいて有用である。
従来、癌その他の抗原によって感作されたマウスB−セ
ルと骨髄性白血病(myeloma)マウスからのマウスB−
セルとの融合細胞をマウス体外で形成し、上記抗原に対
するマウス免疫グロブリン生産能を有し、且つ自己増殖
性を有するマウス/マウス融合細胞を形成した報告は知
られている[例えば、ケーラ・ジー、ミルスタイン・シ
ー、ネイチャ“Khler G.,Milstein C.,Nature),2
56、495(1975);デイポールド・イー・ジー、ロイド
・ケー・オー・リー・エル・ティー・シー、イケダ・エ
イチ、エットゲン、エイチ・エフ、オールド・エル・ジ
ェイ、プロシーディング オブ ナショナル アカデミ
イ オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッドステー
ト オブ アメリカ(Dippold,E.G.,Lloyd,K.O.,Li,L.
T.C.,Ikeda,H.,Oettgen,H.F.& OId,L.J.,Pore.Nat.Aca
d.Sci.U.S.A.)、77、6114(1980);等]。
ルと骨髄性白血病(myeloma)マウスからのマウスB−
セルとの融合細胞をマウス体外で形成し、上記抗原に対
するマウス免疫グロブリン生産能を有し、且つ自己増殖
性を有するマウス/マウス融合細胞を形成した報告は知
られている[例えば、ケーラ・ジー、ミルスタイン・シ
ー、ネイチャ“Khler G.,Milstein C.,Nature),2
56、495(1975);デイポールド・イー・ジー、ロイド
・ケー・オー・リー・エル・ティー・シー、イケダ・エ
イチ、エットゲン、エイチ・エフ、オールド・エル・ジ
ェイ、プロシーディング オブ ナショナル アカデミ
イ オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッドステー
ト オブ アメリカ(Dippold,E.G.,Lloyd,K.O.,Li,L.
T.C.,Ikeda,H.,Oettgen,H.F.& OId,L.J.,Pore.Nat.Aca
d.Sci.U.S.A.)、77、6114(1980);等]。
又、抗原によって感染されたヒトB−セルと骨髄性白血
病マウスからのマウスB−セルとの融合細胞を体外で形
成し、上記抗原に対するヒト、免疫グロブリン生産能を
有し且つ自己増殖性を有するヒト/マウス融合細胞を形
成した報告も知られている[例えばシュローム・ジュ
イ、ワンダーリッヒ・デイー、アンド テラモト・ワイ
・エイプロシーディング オブ ナショナル アカデミ
イ オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッド ステ
ート オブ アメリカ(Schlom J.,Wunderrich P.,and
Teramoto Y.A.Proc.Nat.Acad.Sci.,U.S.A.)、77(1
1)、6841(1980)]。
病マウスからのマウスB−セルとの融合細胞を体外で形
成し、上記抗原に対するヒト、免疫グロブリン生産能を
有し且つ自己増殖性を有するヒト/マウス融合細胞を形
成した報告も知られている[例えばシュローム・ジュ
イ、ワンダーリッヒ・デイー、アンド テラモト・ワイ
・エイプロシーディング オブ ナショナル アカデミ
イ オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッド ステ
ート オブ アメリカ(Schlom J.,Wunderrich P.,and
Teramoto Y.A.Proc.Nat.Acad.Sci.,U.S.A.)、77(1
1)、6841(1980)]。
しかしながら、ヒト免疫グロブリン生産能を有する融合
細胞を取得しようという上記後者の試みにおいては、経
時的に染色体欠落を伴い、前記ヒト免疫グロブリン生産
能が、経時的に喪失し、免疫グロブリン生産能が極めて
不安定である致命的な欠陥を有する。
細胞を取得しようという上記後者の試みにおいては、経
時的に染色体欠落を伴い、前記ヒト免疫グロブリン生産
能が、経時的に喪失し、免疫グロブリン生産能が極めて
不安定である致命的な欠陥を有する。
ヒト免疫グロブリン生産能を有するヒト/ヒト融合細胞
を形成する試みとして、抗原としてハシカ・ビールス又
はハプテン(hapten)[2,4−ジニトロフェニル]によ
って感作されたヒトB−セルをドナーとして使用し、こ
れと骨髄性白血病患者からのヒト免疫グロブリン生産能
を有するセルライン(ヒトB−セル、親株)との融合細
胞をヒト体外で形成し、上記抗原に対するヒト免疫グロ
ブリン生産能を有し、且つ自己増殖性を有するヒト/ヒ
ト融合細胞を形成した報告が知られている[例えば、ク
ロッチェ・シー・エム、ライネンバッハ・エイ、ホール
・ダブリュ、ステプレスキー・ゼット、コプロウスキー
・エイチ、ネイチャー(Croce,C.M,Linnenbach,A.,Hal
l,W.,Steplowski,Z & Koprpwski,H,Nature、288、48
8(1980);オルソン・エル、カプラン・エイチ・エ
ス、プロシーディング オブ ナショナルアカデミイ
オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッド ステート
オブ アメリカ(Olsson,L & Kaplan,H.,S.,Proc.
Nat.Acad.Sci.U.S.U.A.)、7(9)、5429(1980);
等]。
を形成する試みとして、抗原としてハシカ・ビールス又
はハプテン(hapten)[2,4−ジニトロフェニル]によ
って感作されたヒトB−セルをドナーとして使用し、こ
れと骨髄性白血病患者からのヒト免疫グロブリン生産能
を有するセルライン(ヒトB−セル、親株)との融合細
胞をヒト体外で形成し、上記抗原に対するヒト免疫グロ
ブリン生産能を有し、且つ自己増殖性を有するヒト/ヒ
ト融合細胞を形成した報告が知られている[例えば、ク
ロッチェ・シー・エム、ライネンバッハ・エイ、ホール
・ダブリュ、ステプレスキー・ゼット、コプロウスキー
・エイチ、ネイチャー(Croce,C.M,Linnenbach,A.,Hal
l,W.,Steplowski,Z & Koprpwski,H,Nature、288、48
8(1980);オルソン・エル、カプラン・エイチ・エ
ス、プロシーディング オブ ナショナルアカデミイ
オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッド ステート
オブ アメリカ(Olsson,L & Kaplan,H.,S.,Proc.
Nat.Acad.Sci.U.S.U.A.)、7(9)、5429(1980);
等]。
しかしながら、上述の方法のうちマウス/マウスハイブ
リドーマを用いる方法は、マウスの免疫グロブリンを作
製する方法であり、又、マウス/ヒトハイブリドーマを
用いる方法は、マウス由来の生産物が細胞培養中に生成
されることは避けられないし、さらにヒト染色体の欠失
に伴いヒト免疫グロブリン生産の消失が起こる場合もあ
る。これがヒト/ヒト融合細胞から採取されるヒト型免
疫グロブリンの生産が望まれる理由である。しかしなが
ら、上記のヒト/ヒトハイブリドーマから生産されるヒ
ト免疫グロブリンに関する報告は癌細胞に対する結合性
についてはなんら実証例を提示していない。とくに肝癌
細胞及び肝癌組織への結合性についての記載はない。
リドーマを用いる方法は、マウスの免疫グロブリンを作
製する方法であり、又、マウス/ヒトハイブリドーマを
用いる方法は、マウス由来の生産物が細胞培養中に生成
されることは避けられないし、さらにヒト染色体の欠失
に伴いヒト免疫グロブリン生産の消失が起こる場合もあ
る。これがヒト/ヒト融合細胞から採取されるヒト型免
疫グロブリンの生産が望まれる理由である。しかしなが
ら、上記のヒト/ヒトハイブリドーマから生産されるヒ
ト免疫グロブリンに関する報告は癌細胞に対する結合性
についてはなんら実証例を提示していない。とくに肝癌
細胞及び肝癌組織への結合性についての記載はない。
本発明者らの一人によって、ヒト子宮癌患者のヒトB−
セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとのヒト/
ヒト融合細胞株であって抗原特異的ヒト免疫グロブリン
生産能を有するヒト/ヒトハイブリドーマが創製された
(特開昭59−137497号)。そして、該免疫グロブリンは
子宮頸部扁平上皮癌細胞、該細胞由来の株化細胞Hela及
びCaSkiに対し、正常繊維芽細胞(WI−38)に対する結
合力に比してより強い結合力を示したことが報告され
た。しかしながら、ヒト肝癌細胞、ヒト肝癌組織などへ
の結合性に関して言及していない。
セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとのヒト/
ヒト融合細胞株であって抗原特異的ヒト免疫グロブリン
生産能を有するヒト/ヒトハイブリドーマが創製された
(特開昭59−137497号)。そして、該免疫グロブリンは
子宮頸部扁平上皮癌細胞、該細胞由来の株化細胞Hela及
びCaSkiに対し、正常繊維芽細胞(WI−38)に対する結
合力に比してより強い結合力を示したことが報告され
た。しかしながら、ヒト肝癌細胞、ヒト肝癌組織などへ
の結合性に関して言及していない。
又、特開昭61−44900号には、膵臓癌、大腸癌及び肝臓
癌関連抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗
体に関して記載され、それを生産する融合細胞は、抗体
産生細胞と骨髄細胞の融合によって得られるが、それら
は同種動物由来のものであることが好ましいと記載して
いる。しかしながら、この提案において具体的に開示さ
れているのはマウス/マウス融合細胞株のみである。
癌関連抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗
体に関して記載され、それを生産する融合細胞は、抗体
産生細胞と骨髄細胞の融合によって得られるが、それら
は同種動物由来のものであることが好ましいと記載して
いる。しかしながら、この提案において具体的に開示さ
れているのはマウス/マウス融合細胞株のみである。
更に又、特開昭61−167699号、特開昭62−36398号に
は、食道癌、肺癌、胃癌、肝癌に対して特異的に反応す
るモノクローナル抗体に関して記載され、それを生産す
る融合細胞は、抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合によっ
て得られるが、この提案において具体的に開示されてい
るのはマウス/マウス融合細胞株のみである。さらにこ
こで肝癌細胞との結合性について具体的に示された例で
は、マウス/マウス融合細胞株についてのヒト肝癌細胞
(HEK)に対する結合性のみしか示されておらず、他の
肝癌細胞やヒト肝癌組織との結合性については全く言及
されていないし且つヒト/ヒトハイブリドーマ株の生産
するモノクロナール抗体及びそのヒト肝癌細胞もしくは
組織に対する結合性については、何も示されていない。
は、食道癌、肺癌、胃癌、肝癌に対して特異的に反応す
るモノクローナル抗体に関して記載され、それを生産す
る融合細胞は、抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合によっ
て得られるが、この提案において具体的に開示されてい
るのはマウス/マウス融合細胞株のみである。さらにこ
こで肝癌細胞との結合性について具体的に示された例で
は、マウス/マウス融合細胞株についてのヒト肝癌細胞
(HEK)に対する結合性のみしか示されておらず、他の
肝癌細胞やヒト肝癌組織との結合性については全く言及
されていないし且つヒト/ヒトハイブリドーマ株の生産
するモノクロナール抗体及びそのヒト肝癌細胞もしくは
組織に対する結合性については、何も示されていない。
本発明者等は、ヒト/ヒトハイブリドーマの創製研究を
行ってきた。その結果、ヒト肝癌患者のヒトB−セルと
ヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとのヒト/ヒト融
合細胞株であって、抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産
能を有するヒト/ヒトハイブリドーマの創製に成功し
た。
行ってきた。その結果、ヒト肝癌患者のヒトB−セルと
ヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとのヒト/ヒト融
合細胞株であって、抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産
能を有するヒト/ヒトハイブリドーマの創製に成功し
た。
本発明の該ヒト/ヒトハイブリドーマの一種は、ヒト肝
癌患者のヒトB−セルの免疫学的性質を有し且つそのよ
うな形質を安定に持続し得ること及び該ヒト/ヒトハイ
ブリドーマは、ヒト免疫グロブリンA(IgA)生産能を
有し且つ生産された抗体はヒト肝癌細胞に結合性を示す
抗原特異的モノクロナール抗体であることを発見し且つ
そのような抗原特異的ヒト免疫グロブリンの製造に成功
した。
癌患者のヒトB−セルの免疫学的性質を有し且つそのよ
うな形質を安定に持続し得ること及び該ヒト/ヒトハイ
ブリドーマは、ヒト免疫グロブリンA(IgA)生産能を
有し且つ生産された抗体はヒト肝癌細胞に結合性を示す
抗原特異的モノクロナール抗体であることを発見し且つ
そのような抗原特異的ヒト免疫グロブリンの製造に成功
した。
又更に、上記の新しいタイプのヒト/ヒトハイブリドー
マは、ヒト肝癌患者のヒトB−セルを含有するヒト細胞
群とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン[ヒトB−セ
ル]を含有するヒト細胞群とを、人間体外で融合してヒ
トB−セルとヒトB−セルとの融合細胞を産生し、常法
のHATO培地中で培養して融合細胞クローンを取得するこ
とにより産生できることを発見し且つそのような手法で
上記ヒト/ヒトハイブリドーマ(たとえば、TOH/B9)を
創製することに成功した。
マは、ヒト肝癌患者のヒトB−セルを含有するヒト細胞
群とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン[ヒトB−セ
ル]を含有するヒト細胞群とを、人間体外で融合してヒ
トB−セルとヒトB−セルとの融合細胞を産生し、常法
のHATO培地中で培養して融合細胞クローンを取得するこ
とにより産生できることを発見し且つそのような手法で
上記ヒト/ヒトハイブリドーマ(たとえば、TOH/B9)を
創製することに成功した。
又更に、本発明の該ヒト/ヒトハイブリドーマの他の一
種は、ヒト肝癌患者のヒトB−セルの免疫学的形質を有
し且つそのような形質を安定に持続し得ること及び該ヒ
ト/ヒトハイブリドーマはヒト免疫グロブリンG(Ig
G)生産能を有し且つ生産されたこれらの抗体はヒト肝
癌組織のホルマリン固定後パラフイン包埋切片に結合性
を示す抗原特異的モノクロナール抗体であることを発見
し且つそのような抗原特異的ヒト免疫グロブリンの製造
に成功した。
種は、ヒト肝癌患者のヒトB−セルの免疫学的形質を有
し且つそのような形質を安定に持続し得ること及び該ヒ
ト/ヒトハイブリドーマはヒト免疫グロブリンG(Ig
G)生産能を有し且つ生産されたこれらの抗体はヒト肝
癌組織のホルマリン固定後パラフイン包埋切片に結合性
を示す抗原特異的モノクロナール抗体であることを発見
し且つそのような抗原特異的ヒト免疫グロブリンの製造
に成功した。
更に、上記の新しいタイプのヒト/ヒトハイブリドーマ
は、ヒト肝癌患者のヒトB−セルを含有するヒト細胞群
とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン[ヒトB−セ
ル]を含有するヒト細胞群とを、人間体外で融合してヒ
ト−B−セルとヒトB−セルとの融合細胞を産生し、常
法のHATO培地中で培養して融合細胞クローンを取得する
ことにより産生できることを発見し且つそのような手法
で上記ヒト/ヒトハイブリドーマ(たとえば、TOH/D5)
を創製することに成功した。
は、ヒト肝癌患者のヒトB−セルを含有するヒト細胞群
とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン[ヒトB−セ
ル]を含有するヒト細胞群とを、人間体外で融合してヒ
ト−B−セルとヒトB−セルとの融合細胞を産生し、常
法のHATO培地中で培養して融合細胞クローンを取得する
ことにより産生できることを発見し且つそのような手法
で上記ヒト/ヒトハイブリドーマ(たとえば、TOH/D5)
を創製することに成功した。
従って、本発明の目的はヒト肝癌患者のヒトB−セルと
ヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン[ヒトB−セル]
とのヒト/ヒト融合細胞株であって、抗原特異的ヒト免
疫グロブリン生産能を有するヒト/ヒトハイブリドーマ
を提供するにある。
ヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン[ヒトB−セル]
とのヒト/ヒト融合細胞株であって、抗原特異的ヒト免
疫グロブリン生産能を有するヒト/ヒトハイブリドーマ
を提供するにある。
本発明の他の目的は、上記ヒト/ヒトハイブリドーマを
用いて、ヒト肝癌細胞或いはヒト肝癌組織などに結合性
を示す癌関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン(モノクロ
ーナル抗体)を製造する方法及び該ヒト免疫グロブリン
を提供するにある。
用いて、ヒト肝癌細胞或いはヒト肝癌組織などに結合性
を示す癌関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン(モノクロ
ーナル抗体)を製造する方法及び該ヒト免疫グロブリン
を提供するにある。
本発明の上記目的及び更に多くの目的ならびに利点は、
以下の記載から一層明らかとなるであろう。
以下の記載から一層明らかとなるであろう。
本発明のヒト/ヒトハイブリドーマはヒト肝癌患者のヒ
トB−セルたとえば該患者の血中、リンパ節、脾臓、骨
髄などから得ることのできるヒトB−セルとヒトリンパ
芽球細胞株のサブクローン[ヒトB−セル]、たとえば
HIH/TO1株(微工研受託番号FERM BP−1884)とのヒト
/ヒト融合細胞株であって、ヒト肝癌細胞或いはヒト肝
癌組織などに結合性を示す抗原特異的ヒト免疫グロブリ
ン生産能(モノクローナル抗体生産能)を有する。
トB−セルたとえば該患者の血中、リンパ節、脾臓、骨
髄などから得ることのできるヒトB−セルとヒトリンパ
芽球細胞株のサブクローン[ヒトB−セル]、たとえば
HIH/TO1株(微工研受託番号FERM BP−1884)とのヒト
/ヒト融合細胞株であって、ヒト肝癌細胞或いはヒト肝
癌組織などに結合性を示す抗原特異的ヒト免疫グロブリ
ン生産能(モノクローナル抗体生産能)を有する。
本発明者等の研究により、ヒト肝癌患者のヒトB−セル
を用い、これを免疫グロブリン生産能を実質的に欠損し
ているヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン[ヒトB−
セル]と人間の体外で融合させ、肝癌などの癌関連抗原
に特異的に結合するヒト免疫グロブリン生産能を有する
ヒト/ヒトハイブリドーマが始めて産生された。
を用い、これを免疫グロブリン生産能を実質的に欠損し
ているヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン[ヒトB−
セル]と人間の体外で融合させ、肝癌などの癌関連抗原
に特異的に結合するヒト免疫グロブリン生産能を有する
ヒト/ヒトハイブリドーマが始めて産生された。
この融合細胞を産生する融合操作はそれ自体は、公知の
如何なる方法で行ってもよい。例えば、融合操作は液媒
中で融合促進剤の存在下に、ヒト肝癌患者のヒトB−セ
ルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとを接触させ
ることにより行うことができる。
如何なる方法で行ってもよい。例えば、融合操作は液媒
中で融合促進剤の存在下に、ヒト肝癌患者のヒトB−セ
ルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとを接触させ
ることにより行うことができる。
この際、融合操作を行なうに先立って、ヒト肝癌患者の
ヒトB−セルを、ヒトBセル増殖因子(ヒトBCGF;B−Ce
ll growfh factor)及び抗ヒトIgM抗体(anti−μ)
の存在下で予備培養処理することが望ましい。予備培養
処理は、たとえば、上記ヒトBCGF及びanti−μを含有す
る適当な基礎培地やその改質培地を利用し、たとえば5
%CO2雰囲気下で約37℃±3℃の如き条件下、約5〜約
7日の培養条件で行なうことができる。利用する基礎培
地やその改質培地の例としては、特開昭62−51983号に
例示されているような公知の基礎培地及びその改質培地
を挙げることができる。また、それ自体公知の他の培地
用成長因子、アミノ酸類、ビタミン類もしくはミネラル
類、該酸誘導体類、糖類、補酵素類、脂肪酸類を更に含
有することができる。上記ヒトBCGF及びanti−μは市場
で入手可能であり、その調製法も知られており、前者に
ついては例えば、ABBY MAIZEL et al.Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA vol.79、5998−6002(1982)に、又、後者
については、例えば「免疫化学」(右田俊介編)中山書
店(1972)pp51−63に記載されている。その使用量は実
験的に容易に選択できるが、たとえば培地容量に対して
約5〜約20容量%のヒトBCGF及び約5〜約100μg/ml−
培地のanti−μの如き使用量を例示できる。
ヒトB−セルを、ヒトBセル増殖因子(ヒトBCGF;B−Ce
ll growfh factor)及び抗ヒトIgM抗体(anti−μ)
の存在下で予備培養処理することが望ましい。予備培養
処理は、たとえば、上記ヒトBCGF及びanti−μを含有す
る適当な基礎培地やその改質培地を利用し、たとえば5
%CO2雰囲気下で約37℃±3℃の如き条件下、約5〜約
7日の培養条件で行なうことができる。利用する基礎培
地やその改質培地の例としては、特開昭62−51983号に
例示されているような公知の基礎培地及びその改質培地
を挙げることができる。また、それ自体公知の他の培地
用成長因子、アミノ酸類、ビタミン類もしくはミネラル
類、該酸誘導体類、糖類、補酵素類、脂肪酸類を更に含
有することができる。上記ヒトBCGF及びanti−μは市場
で入手可能であり、その調製法も知られており、前者に
ついては例えば、ABBY MAIZEL et al.Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA vol.79、5998−6002(1982)に、又、後者
については、例えば「免疫化学」(右田俊介編)中山書
店(1972)pp51−63に記載されている。その使用量は実
験的に容易に選択できるが、たとえば培地容量に対して
約5〜約20容量%のヒトBCGF及び約5〜約100μg/ml−
培地のanti−μの如き使用量を例示できる。
本発明に於て、融合細胞を産生する融合操作それ自体
は、たとえば、液媒中で融合促進剤の存在下にヒト肝癌
患者のヒトB−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクロ
ーンを接触させることにより行なうことができる。この
ような融合方法の例としては、仙台ビールス(HVJ)、
ポリエチレングリコールなどの融合促進剤を用いる方法
や高電圧で電気的に融合する方法などを例示することが
できる。
は、たとえば、液媒中で融合促進剤の存在下にヒト肝癌
患者のヒトB−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクロ
ーンを接触させることにより行なうことができる。この
ような融合方法の例としては、仙台ビールス(HVJ)、
ポリエチレングリコールなどの融合促進剤を用いる方法
や高電圧で電気的に融合する方法などを例示することが
できる。
例えば、水性媒体中、上記例示の如き融合促進剤の存在
下、所望によりおだやかな攪拌を加えて系を均一にし、
次いで、前記ヒトB−セルの1ケと前記サブクローン
(ヒトB−セル)の1ケから成る融合細胞が産生される
時間、たとえば数分間のオーダーで静置することによ
り、所望の融合細胞が産生できる。溶媒の例としては、
水、生理食塩水、5%ジメチルスルホキシド水溶液、5
%グリセロース水溶液などを例示することができる。
下、所望によりおだやかな攪拌を加えて系を均一にし、
次いで、前記ヒトB−セルの1ケと前記サブクローン
(ヒトB−セル)の1ケから成る融合細胞が産生される
時間、たとえば数分間のオーダーで静置することによ
り、所望の融合細胞が産生できる。溶媒の例としては、
水、生理食塩水、5%ジメチルスルホキシド水溶液、5
%グリセロース水溶液などを例示することができる。
所望の融合細胞が産生された系を、例えば、遠心分離し
て細胞群を採取し、再び適当な培地に、たとえば10%仔
牛もしくは牛胎児血清含有RPMI−1640液体培地中にHATO
試薬を加えた培地に、採取した該細胞群を分散させ、こ
の分散液を例えばマイクロ・タイター・プレートの穴
に、夫々、一定量づつ分散注入し、例えば、5%CO2の
存在下、37℃で培養を行うことができる。上記RPMI−16
40培地に代えて、RPMI−1640:DME;F−12=2:1:1の混合
培地(RDF)を利用することもできる。各穴中の培養液
を例えば3日毎に新しい培養液と取りかえ、例えば2週
間培養を続けたのち、顕微鏡下で融合細胞の有無を調
べ、コロニーの認められた試料の培養液を採取し、ヒト
免疫グロブリンの有無を例えば125Iを用いたラジオ・イ
ムノ・アツセイや酵素抗体法により検出することができ
る。
て細胞群を採取し、再び適当な培地に、たとえば10%仔
牛もしくは牛胎児血清含有RPMI−1640液体培地中にHATO
試薬を加えた培地に、採取した該細胞群を分散させ、こ
の分散液を例えばマイクロ・タイター・プレートの穴
に、夫々、一定量づつ分散注入し、例えば、5%CO2の
存在下、37℃で培養を行うことができる。上記RPMI−16
40培地に代えて、RPMI−1640:DME;F−12=2:1:1の混合
培地(RDF)を利用することもできる。各穴中の培養液
を例えば3日毎に新しい培養液と取りかえ、例えば2週
間培養を続けたのち、顕微鏡下で融合細胞の有無を調
べ、コロニーの認められた試料の培養液を採取し、ヒト
免疫グロブリンの有無を例えば125Iを用いたラジオ・イ
ムノ・アツセイや酵素抗体法により検出することができ
る。
このようにして、ヒト免疫グロブリンの生産の認められ
たコロニーを、新しい培養液に移して培養し、融合細胞
を増殖させることにより融合細胞クローンを取得するこ
とができる。更に、必要に応じてサブ・クローニングし
て、所望のヒト肝癌などの癌関連抗原に結合するヒト免
疫グロブリン生産性クローンを得ることができる。
たコロニーを、新しい培養液に移して培養し、融合細胞
を増殖させることにより融合細胞クローンを取得するこ
とができる。更に、必要に応じてサブ・クローニングし
て、所望のヒト肝癌などの癌関連抗原に結合するヒト免
疫グロブリン生産性クローンを得ることができる。
この態様の実施に際しては例えば下記文献により公知の
手法を利用することができる。グラツシイ・エム・シー
・ハンドレイ・エイチ・エイチ、ハギワラ・エイチ,ア
ンド ロイストン・アイ,プロシーディング オブ ナ
ショナル アカデミイ オブ サイエンス オブ ザ
ユナイテッドステート オブ アメリカ(Glassy,M.C.,
Handley,H.H.,Hagiwara,H.,and Royston,I.,Proc.Nat.A
cad.Sci.U.S.A.),80,6327(1983)及び「酵素抗体
法」(編集渡辺慶一)学際企画p33−118(1956)。
手法を利用することができる。グラツシイ・エム・シー
・ハンドレイ・エイチ・エイチ、ハギワラ・エイチ,ア
ンド ロイストン・アイ,プロシーディング オブ ナ
ショナル アカデミイ オブ サイエンス オブ ザ
ユナイテッドステート オブ アメリカ(Glassy,M.C.,
Handley,H.H.,Hagiwara,H.,and Royston,I.,Proc.Nat.A
cad.Sci.U.S.A.),80,6327(1983)及び「酵素抗体
法」(編集渡辺慶一)学際企画p33−118(1956)。
たとえば、上記文献に記載の手法を利用して健康なヒト
脾臓からバイオプシー(Biopsy)により、リンパ芽球、
骨髄性白血病患者のリンパ球などの如きリンパ系細胞を
とり、その中の免疫グロブリン生産能を実質的に有しな
いBセルリンパ球を選別分離し、たとえば6−チオグア
ニン及びウワバイン耐性でHATO培地中では死滅する感受
性を有するヒトB−セルを得ることができる。例えば後
記実施例で利用したヒトBセルHIH/TO1(微工研受託第
号FERM BP−1884)は、後記参考例1に示したように、
上記リンパ芽球を用いて6−チオグアニン、ウワバイン
含有培地で培養して得ることができる。
脾臓からバイオプシー(Biopsy)により、リンパ芽球、
骨髄性白血病患者のリンパ球などの如きリンパ系細胞を
とり、その中の免疫グロブリン生産能を実質的に有しな
いBセルリンパ球を選別分離し、たとえば6−チオグア
ニン及びウワバイン耐性でHATO培地中では死滅する感受
性を有するヒトB−セルを得ることができる。例えば後
記実施例で利用したヒトBセルHIH/TO1(微工研受託第
号FERM BP−1884)は、後記参考例1に示したように、
上記リンパ芽球を用いて6−チオグアニン、ウワバイン
含有培地で培養して得ることができる。
前述の手法により、ヒト肝癌患者のヒトB−セルとヒト
リンパ芽球細胞株のサブクローンHIH/TO1株[微工研受
託番号FERM BP−1884]から産生された抗原特異的免疫
グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリドーマ(Human Hy
bridoma)TOH/B9[微工研受託番号FERM BP−1883]及
びTOH/D5[微工研受託番号FERM BP−1882]の細胞生化
学的性質を以下に示す。
リンパ芽球細胞株のサブクローンHIH/TO1株[微工研受
託番号FERM BP−1884]から産生された抗原特異的免疫
グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリドーマ(Human Hy
bridoma)TOH/B9[微工研受託番号FERM BP−1883]及
びTOH/D5[微工研受託番号FERM BP−1882]の細胞生化
学的性質を以下に示す。
ヒト/ヒトハイブリドーマTOH/B9(FERM BP−1883): (1) ヒト免疫グロブリン(IgA)分泌(生産)、 (2) 倍加時間(ダブリング・タイム)約37時間、 (3) DNA含量が正常ヒトリンパ球の約2倍、たとえ
ば1.5〜2.5倍、 (4) 上記(1)のIgAはヒト株化細胞株PLC/PRF/5
(Alexander cells)(肝癌)に対して結合性を示す、 (5) HATO含有培地(ヒポキサンチン、アメソプテリ
ン、チミジン、ウワバイン含有培地)中で***増殖可能
である。
ば1.5〜2.5倍、 (4) 上記(1)のIgAはヒト株化細胞株PLC/PRF/5
(Alexander cells)(肝癌)に対して結合性を示す、 (5) HATO含有培地(ヒポキサンチン、アメソプテリ
ン、チミジン、ウワバイン含有培地)中で***増殖可能
である。
ヒト/ヒトハイブリドーマTOH/D5(FERM BP−1882): (1) ヒト免疫グロブリンG(IgA)分泌(生産)、 (2) 倍加時間(ダブリング・タイム)約37時間、 (3) DNA含量が正常ヒトリンパ球の約2倍、たとえ
ば1.5〜2.5倍、 (4) 上記(1)のIgGはヒト肝癌組織のホルマリン
固定パラフィン包埋切片に対して結合性を示す、 (5) HATO含有培地(ヒポキサンチン、アメソプテリ
ン、チミジン、ウワバイン含有培地)中で***増殖可能
である。
ば1.5〜2.5倍、 (4) 上記(1)のIgGはヒト肝癌組織のホルマリン
固定パラフィン包埋切片に対して結合性を示す、 (5) HATO含有培地(ヒポキサンチン、アメソプテリ
ン、チミジン、ウワバイン含有培地)中で***増殖可能
である。
尚、相対DNA含量(正常ヒトリンパ球のDNA含量に対する
比率)は、ハイブリドーマをプロビシユウムアイオダイ
ドで染色したのち、flow cytometerで分離分析する方法
によって決定された。
比率)は、ハイブリドーマをプロビシユウムアイオダイ
ドで染色したのち、flow cytometerで分離分析する方法
によって決定された。
本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリンは、ヒト肝癌患
者のヒトB−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクロー
ン[ヒトB−セル]とのヒト/ヒト融合細胞株であって
抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産能を有する細胞株を
培地に培養し、その培養物より抗原特異的ヒト免疫グロ
ブリンを採取することにより製造できる。
者のヒトB−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクロー
ン[ヒトB−セル]とのヒト/ヒト融合細胞株であって
抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産能を有する細胞株を
培地に培養し、その培養物より抗原特異的ヒト免疫グロ
ブリンを採取することにより製造できる。
例えば前述のようにして産生できるヒト/ヒトハイブリ
ドーマを適当な培地、たとえば10%仔牛血清含有RPMI−
1640培地で培養し、培養液を採取することによりヒト肝
癌などのガン関連抗原に特異的に結合する免疫グロブリ
ン含有物質を得ることができる。上記ヒト/ヒトハイブ
リドーマの培養に際して、無血清培地を用いることもで
き、得られる免疫グロブリンの精製が容易となるので有
利である。このような無血清培地の例として、同一出願
人の出願に係わる特開昭62−51983号(特願昭60−19214
5号)に提案された無血清培地を挙げることができる。
更に、所望により精製して精製免疫グロブリンとするこ
ともできる。精製はたとえば、硫安分画法、アフイニテ
イークロマトグラフィー、ゲル濾過、イオン交換クロマ
トグラフィー、電気泳動法などの如き生体液から免疫グ
ロブリンを採取、精製する際に利用できると同様な精製
手段を適宜に利用することができる。
ドーマを適当な培地、たとえば10%仔牛血清含有RPMI−
1640培地で培養し、培養液を採取することによりヒト肝
癌などのガン関連抗原に特異的に結合する免疫グロブリ
ン含有物質を得ることができる。上記ヒト/ヒトハイブ
リドーマの培養に際して、無血清培地を用いることもで
き、得られる免疫グロブリンの精製が容易となるので有
利である。このような無血清培地の例として、同一出願
人の出願に係わる特開昭62−51983号(特願昭60−19214
5号)に提案された無血清培地を挙げることができる。
更に、所望により精製して精製免疫グロブリンとするこ
ともできる。精製はたとえば、硫安分画法、アフイニテ
イークロマトグラフィー、ゲル濾過、イオン交換クロマ
トグラフィー、電気泳動法などの如き生体液から免疫グ
ロブリンを採取、精製する際に利用できると同様な精製
手段を適宜に利用することができる。
上記ヒト/ヒトハイブリドーマの培養に利用できる培地
の他の例としては、10%ウシ胎児血清含有PRMI−1640培
地、Dulbeco培地及びHAM培地の三者混合培地(混合比2:
1:1)であるRDF培地、及びトランスフェリン、インシュ
リン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン並びに
β−メルカプトエタノール添加のRDF培地などを例示す
ることができる。又、培養条件としては、たとえば5%
CO2の存在下、37℃の条件を例示できる。
の他の例としては、10%ウシ胎児血清含有PRMI−1640培
地、Dulbeco培地及びHAM培地の三者混合培地(混合比2:
1:1)であるRDF培地、及びトランスフェリン、インシュ
リン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン並びに
β−メルカプトエタノール添加のRDF培地などを例示す
ることができる。又、培養条件としては、たとえば5%
CO2の存在下、37℃の条件を例示できる。
上述のようにして得ることのできる本発明のガン関連抗
原特異的ヒト免疫グロブリンとして、前述したヒト/ヒ
トハイブリドーマTOH/B9(FERM BP−1883)或いは前述
したヒト/ヒトハイブリドーマTOH/D5(FERM BP−188
2)を用いて下記の本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブ
リンを生産することができる。その特性を以下に示す。
原特異的ヒト免疫グロブリンとして、前述したヒト/ヒ
トハイブリドーマTOH/B9(FERM BP−1883)或いは前述
したヒト/ヒトハイブリドーマTOH/D5(FERM BP−188
2)を用いて下記の本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブ
リンを生産することができる。その特性を以下に示す。
ヒト/ヒトハイブリドーマTOH/B9(FERM BP−1883)の
生産するガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン: (イ) ヒト免疫グロブリンA(IgA)であって、 (ロ) ヒト株化細胞PLC/PRF/5(Alexander cells)
(肝癌)に対して結合力を有する、 (ハ) 分子量約6万のH鎖(heavy chain)、分子量
約2万のL鎖(light chain)を含有する。
生産するガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン: (イ) ヒト免疫グロブリンA(IgA)であって、 (ロ) ヒト株化細胞PLC/PRF/5(Alexander cells)
(肝癌)に対して結合力を有する、 (ハ) 分子量約6万のH鎖(heavy chain)、分子量
約2万のL鎖(light chain)を含有する。
ヒト/ヒトハイブリドーマTOH/D5(FERM BP−1882)の
生産するガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン: (イ) ヒト免疫グロブリンG(IgG)であって、 (ロ) ヒト肝癌組織に対して結合性を示す、 (ハ) H鎖(heavy chain)及びL鎖(light chain)
より成り、分子量が約15万である。
生産するガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン: (イ) ヒト免疫グロブリンG(IgG)であって、 (ロ) ヒト肝癌組織に対して結合性を示す、 (ハ) H鎖(heavy chain)及びL鎖(light chain)
より成り、分子量が約15万である。
上記ヒト株化細胞PLC/PRF/5(Alexander cells)(肝
癌)は、ATCC CRL 8024としてATCC(アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション)から自由に入手する
ことができる。
癌)は、ATCC CRL 8024としてATCC(アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション)から自由に入手する
ことができる。
本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリンはたとえばヒト
肝癌の如き、ヒト癌への作用抗体或いはそれ自体の作用
でこれら癌細胞の増殖抑制、癌細胞の死滅を行わせた
り、ヒト体外で量産されたこれらの癌組織認識抗体に補
体もしくは、T−リンパ球の助けをかりて癌細胞の増殖
抑制や癌細胞死滅のはたらきをさせたりすることができ
る。更にまた、ヒト体外で量産された癌特異的抗体をキ
ヤリヤーとして利用して例えば化学療法剤結合−ヒト・
モノクローナル抗体、インターフエロン結合/ヒトモノ
クローナル抗体、高分子毒素結合−ヒト・モノクローナ
ル抗体、薬物入りリポゾーム結合−ヒト・モノクローナ
ル抗体などの形で癌細胞の増殖抑制や死滅のはたらきを
させたりするのに有用である。また、本発明方法で得ら
れるヒト・モノクローナル抗体をキヤリヤーとして利用
し、これに放射線感受性物質を結合させて患者に投与
し、癌細胞に選択的に集まる性質を利用して患部を検知
し放射線療法に利用することができる。このような癌に
対する利用に際しては、ヒト・モノクローナル抗体とし
て完全な抗体を用いてもよいし、抗体を化学的な手法で
特異的抗原認識部位を含むより小さな分子に切断して用
いたり、或いは、そのような小さな分子もしくは特異的
抗原認識部位のみを他の抗体の非特異的抗原認識部分と
結合させて、より有効性のある修飾ヒト・モノクローナ
ル抗体を化学的手法で創製して用いることもできる。
肝癌の如き、ヒト癌への作用抗体或いはそれ自体の作用
でこれら癌細胞の増殖抑制、癌細胞の死滅を行わせた
り、ヒト体外で量産されたこれらの癌組織認識抗体に補
体もしくは、T−リンパ球の助けをかりて癌細胞の増殖
抑制や癌細胞死滅のはたらきをさせたりすることができ
る。更にまた、ヒト体外で量産された癌特異的抗体をキ
ヤリヤーとして利用して例えば化学療法剤結合−ヒト・
モノクローナル抗体、インターフエロン結合/ヒトモノ
クローナル抗体、高分子毒素結合−ヒト・モノクローナ
ル抗体、薬物入りリポゾーム結合−ヒト・モノクローナ
ル抗体などの形で癌細胞の増殖抑制や死滅のはたらきを
させたりするのに有用である。また、本発明方法で得ら
れるヒト・モノクローナル抗体をキヤリヤーとして利用
し、これに放射線感受性物質を結合させて患者に投与
し、癌細胞に選択的に集まる性質を利用して患部を検知
し放射線療法に利用することができる。このような癌に
対する利用に際しては、ヒト・モノクローナル抗体とし
て完全な抗体を用いてもよいし、抗体を化学的な手法で
特異的抗原認識部位を含むより小さな分子に切断して用
いたり、或いは、そのような小さな分子もしくは特異的
抗原認識部位のみを他の抗体の非特異的抗原認識部分と
結合させて、より有効性のある修飾ヒト・モノクローナ
ル抗体を化学的手法で創製して用いることもできる。
以下、実施例により、本発明方法実施の一態様をさらに
詳しく述べる。
詳しく述べる。
参考例1 ヒトBセル・リンパ芽球細胞株HIH/TO1。
ヒトBセル・リンパ芽球細胞WI−L2(微工研寄託受託拒
否通知書、通知番号:60微寄分第1621号)を、基礎培地R
DF中にインシユリン、トランスフエリン、セレニウム、
エタノールアミン、β−メルカプトタノール及び牛血清
アルブミンの適量を含有する無血清培地で培養適応させ
る。該無血清培地をを分注した96穴マイクロタイタープ
レートに1cell/wellとなるように植えこみ、5%CO2、3
7℃の条件下で限界希釈法によりクローニング操作を行
なう。約1ケ月経過後、増殖してきた50穴より免疫グロ
ブリンIgG及びIgMを実質的に培地中に生産していないク
ローンを1つ選び出した。
否通知書、通知番号:60微寄分第1621号)を、基礎培地R
DF中にインシユリン、トランスフエリン、セレニウム、
エタノールアミン、β−メルカプトタノール及び牛血清
アルブミンの適量を含有する無血清培地で培養適応させ
る。該無血清培地をを分注した96穴マイクロタイタープ
レートに1cell/wellとなるように植えこみ、5%CO2、3
7℃の条件下で限界希釈法によりクローニング操作を行
なう。約1ケ月経過後、増殖してきた50穴より免疫グロ
ブリンIgG及びIgMを実質的に培地中に生産していないク
ローンを1つ選び出した。
このクローンを、まず0.1μMの6−チオグアニンを含
む前記と同様な無血清培地中で培養適応させる。培養は
5%CO2、37℃の条件下で、継代培養をくり返すごと
に、6−チオグアニン濃度を0.25μM、0.5μM、1μ
M、2μM、4μM、10μM、15μM、20μMと段階的
に上げて行ない、最終的に20μMの6−チオグアニン含
有無血清培地中で増殖可能な単クローンを、前記と同様
な限界希釈法によるクローニング操作で選別する。
む前記と同様な無血清培地中で培養適応させる。培養は
5%CO2、37℃の条件下で、継代培養をくり返すごと
に、6−チオグアニン濃度を0.25μM、0.5μM、1μ
M、2μM、4μM、10μM、15μM、20μMと段階的
に上げて行ない、最終的に20μMの6−チオグアニン含
有無血清培地中で増殖可能な単クローンを、前記と同様
な限界希釈法によるクローニング操作で選別する。
この細胞を、1μg/mlの突然変異剤MNNG(N−メチル−
N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン)を含有する基
礎培地RDF中で、5%CO2、37℃の条件下で3時間培養し
た後、前記と同様な無血清培地で洗浄し、洗浄した細胞
を20μMの6−チオグアニン及びウワバインを含む前記
と同様な無血清培地中で培養適応させる。培養は5%CO
2、37℃の条件下で、継代培養をくり返すごとに、ウワ
バインの濃度を0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、
5μMと段階的に上げて行ない、最終的に20μMの6−
チオグアニン及び5μMのウワバインを含む無血清培地
中で増殖可能な単クローンを、前記と同様な限界希釈法
によるクローニング操作で選別し、HIH/TO1(FERM BP
−1884)株を得た。
N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン)を含有する基
礎培地RDF中で、5%CO2、37℃の条件下で3時間培養し
た後、前記と同様な無血清培地で洗浄し、洗浄した細胞
を20μMの6−チオグアニン及びウワバインを含む前記
と同様な無血清培地中で培養適応させる。培養は5%CO
2、37℃の条件下で、継代培養をくり返すごとに、ウワ
バインの濃度を0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、
5μMと段階的に上げて行ない、最終的に20μMの6−
チオグアニン及び5μMのウワバインを含む無血清培地
中で増殖可能な単クローンを、前記と同様な限界希釈法
によるクローニング操作で選別し、HIH/TO1(FERM BP
−1884)株を得た。
実 施 例 1 肝癌患者から手術の際に癌組織周辺のリンパ節を入手し
た。リンパ節をハサミで細かく切りきざみ、内部のリン
パ球を培地RDF(RPMI1640:DME:F−12=2:1:1)中に分散
させ、続いて2重のガーゼを用いて、過を行い、脂肪
層を除いた後に、液中の細胞(リンパ球>80%)を遠
心法によつて集める[ヒトB−セルドナーを含むヒトリ
ンパ球分画(ドナーB−セル)]。その後、このリンパ
球分画を20%牛胎児血清および、10%ジメチルスルホオ
キサイド(DMS)を含むRDF培地中で凍結(−130℃)
し、細胞融合を行う日まで保存した。1.0×107個のドナ
ーB−セルを5%ヒトBCGF(B cell growth facto
r)(Cellular Products,Inc and Biotech Researc
h Labs社製)および20μg/mlヤギ抗ヒトIgM(cappel社
製)抗体を含有するRDF培地で37℃5%CO2条件下で培養
し、7日後100G、15分間の遠心処理を行いドナーBセル
を集め、RDF培地で1度洗浄する。
た。リンパ節をハサミで細かく切りきざみ、内部のリン
パ球を培地RDF(RPMI1640:DME:F−12=2:1:1)中に分散
させ、続いて2重のガーゼを用いて、過を行い、脂肪
層を除いた後に、液中の細胞(リンパ球>80%)を遠
心法によつて集める[ヒトB−セルドナーを含むヒトリ
ンパ球分画(ドナーB−セル)]。その後、このリンパ
球分画を20%牛胎児血清および、10%ジメチルスルホオ
キサイド(DMS)を含むRDF培地中で凍結(−130℃)
し、細胞融合を行う日まで保存した。1.0×107個のドナ
ーB−セルを5%ヒトBCGF(B cell growth facto
r)(Cellular Products,Inc and Biotech Researc
h Labs社製)および20μg/mlヤギ抗ヒトIgM(cappel社
製)抗体を含有するRDF培地で37℃5%CO2条件下で培養
し、7日後100G、15分間の遠心処理を行いドナーBセル
を集め、RDF培地で1度洗浄する。
その後ドナーリンパ球と免疫グロブリン生産能を実質的
に欠損している親ヒトB−セル(HIH/TO1)のそれぞれ
を1.0×107および1.0×107個混合し、50%ポリエチレン
グリコール1500の存在下に融合を完了させる。その後、
30G、15分間の遠心処理を行ってポリエチレングリコー
ルを除き、新たに、10%牛胎児血清および、ヒポキサン
チン、アメソプテリン、チミジン、ウワバイン(HATO)
を含むRDF培地を加える。この細胞群を含む培養液200μ
l(この中には1.5×105個のセルを含む)づつを96個の
穴をもつミクロプレートに分注し、約4週間、37℃、5
%CO2条件下のインキユベーターで培養した。この間、H
ATO及び10%牛胎児血清を含むRDF培地を4〜5日に1度
交換した。親B−セル[HIH/TO1(FERM BP−1884)]
はアメソプテリン存在ではヒポキサンチンホスホリボシ
ールトランスフエラーゼを欠損しているために、生きる
ことが出来ない。またリンパ球は通常の培地たとえばRD
F+10%牛胎児血清中では永続的に増殖し生きのびるこ
とができないのに加えてウアバイン存在下で死滅する。
よつてHATOを含む培地で永続的に増殖した細胞はリンパ
球と親B−セルの融合した細胞である。4週間培養の
後、5個のハイブリドーマが得られ、これらのハイブリ
ドーマがヒト免疫グロブリンを産出しているかどうかを
酵素抗体法を用いて調べた。以下、その方法を説明す
る。
に欠損している親ヒトB−セル(HIH/TO1)のそれぞれ
を1.0×107および1.0×107個混合し、50%ポリエチレン
グリコール1500の存在下に融合を完了させる。その後、
30G、15分間の遠心処理を行ってポリエチレングリコー
ルを除き、新たに、10%牛胎児血清および、ヒポキサン
チン、アメソプテリン、チミジン、ウワバイン(HATO)
を含むRDF培地を加える。この細胞群を含む培養液200μ
l(この中には1.5×105個のセルを含む)づつを96個の
穴をもつミクロプレートに分注し、約4週間、37℃、5
%CO2条件下のインキユベーターで培養した。この間、H
ATO及び10%牛胎児血清を含むRDF培地を4〜5日に1度
交換した。親B−セル[HIH/TO1(FERM BP−1884)]
はアメソプテリン存在ではヒポキサンチンホスホリボシ
ールトランスフエラーゼを欠損しているために、生きる
ことが出来ない。またリンパ球は通常の培地たとえばRD
F+10%牛胎児血清中では永続的に増殖し生きのびるこ
とができないのに加えてウアバイン存在下で死滅する。
よつてHATOを含む培地で永続的に増殖した細胞はリンパ
球と親B−セルの融合した細胞である。4週間培養の
後、5個のハイブリドーマが得られ、これらのハイブリ
ドーマがヒト免疫グロブリンを産出しているかどうかを
酵素抗体法を用いて調べた。以下、その方法を説明す
る。
ミクロタイタープレートの中に抗ヒト免疫グロブリン抗
体(抗ヒトIg抗体)を滴下(50nl)し、37℃で1時間プ
レートに吸着させる。0.3%のゼラチンを含む10mM PBS
(ゼラチン緩衝液)で3回洗浄した後、5%牛血清アル
ブミン溶液を滴下(200μl)し、37℃で0.5時間吸着さ
せる。ゼラチン緩衝液で3回洗浄し、未吸着のものを除
去する。次に検液(培養上清)を滴下(50μl)して、
37℃で1時間反応後、ゼラチン緩衝液で3回洗浄する。
ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIg抗体を滴下(50μ
l)して、37℃で30分間反応させ、培養上清中のヒトIg
と結合させる(酵素抗体法)。ゼラチン緩衝液で3回洗
浄後、過酸化水素とo−フエニレンジアミンを含む基質
溶液を加え、暗室で10分間反応させる。5N−H2SO4(50
μ)を加えて反応を止める。もしミクロプレート上に
ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIg抗体が残っている場
合、すなわちそれに結合されるヒトIgが残っている場合
には490nmに吸収をもつ黄色の基質反応物が生産され
る。この量を吸光度計を用いて測定し、ハイブリドーマ
培養上清中に含まれるヒトIgの量を知る。ハイブリドー
マ培養上清中にヒトIgが存在しない場合には、ペルオキ
シダーゼ結合ヤギ抗ヒトIg抗体は洗浄の段階で洗い流さ
れる。
体(抗ヒトIg抗体)を滴下(50nl)し、37℃で1時間プ
レートに吸着させる。0.3%のゼラチンを含む10mM PBS
(ゼラチン緩衝液)で3回洗浄した後、5%牛血清アル
ブミン溶液を滴下(200μl)し、37℃で0.5時間吸着さ
せる。ゼラチン緩衝液で3回洗浄し、未吸着のものを除
去する。次に検液(培養上清)を滴下(50μl)して、
37℃で1時間反応後、ゼラチン緩衝液で3回洗浄する。
ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIg抗体を滴下(50μ
l)して、37℃で30分間反応させ、培養上清中のヒトIg
と結合させる(酵素抗体法)。ゼラチン緩衝液で3回洗
浄後、過酸化水素とo−フエニレンジアミンを含む基質
溶液を加え、暗室で10分間反応させる。5N−H2SO4(50
μ)を加えて反応を止める。もしミクロプレート上に
ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIg抗体が残っている場
合、すなわちそれに結合されるヒトIgが残っている場合
には490nmに吸収をもつ黄色の基質反応物が生産され
る。この量を吸光度計を用いて測定し、ハイブリドーマ
培養上清中に含まれるヒトIgの量を知る。ハイブリドー
マ培養上清中にヒトIgが存在しない場合には、ペルオキ
シダーゼ結合ヤギ抗ヒトIg抗体は洗浄の段階で洗い流さ
れる。
以上の測定方法を用いて結果、5個のうち3個のハイブ
リドーマのクローンが抗体を産生しており、そのうちヒ
トIgAを産生するものをTOH/B9(FERM BP−1883)、ヒ
トIgGを産生するものをTOH/D5(FERM BP−1882)と命
名した。
リドーマのクローンが抗体を産生しており、そのうちヒ
トIgAを産生するものをTOH/B9(FERM BP−1883)、ヒ
トIgGを産生するものをTOH/D5(FERM BP−1882)と命
名した。
4週間後にそれぞれのハイブリドーマを24個の穴をもつ
ミクロプレート(2ml/穴)に植え替えた後、さらに1週
間培養を続けた。培養液の上清を採取、種々の株化細胞
或いは癌組織に対するヒトハイブリドーマから生産され
るIgの特異性を調べた(一定の形質をもつIgまたは特定
の形質をもつIg)。その方法を以下に説明する。
ミクロプレート(2ml/穴)に植え替えた後、さらに1週
間培養を続けた。培養液の上清を採取、種々の株化細胞
或いは癌組織に対するヒトハイブリドーマから生産され
るIgの特異性を調べた(一定の形質をもつIgまたは特定
の形質をもつIg)。その方法を以下に説明する。
ヒトの種々の株化培養細胞(これらはATCCより入手可
能)をDF培地(DME:F−12=1:1)に10%牛胎児血清を加
えた培地で培養する。細胞の数が5×16〜1×107にな
つた段階で、トリプシンを用いて細胞をシヤーレの底面
から剥がし、遠心法を用いて細胞を集め、培地でよく洗
浄する。96個の穴を持つミクロタイタープレートの各穴
に細胞を一定数(105×100μ)ずつ分注し、37℃で1
晩、プレートに吸着させる。次に、3%グルタルアルデ
ヒド溶液を滴下(50μ)し、37℃で20分間、細胞の固
定を行う。遠心法(200g,10分間)で細胞をおとし、ゼ
ラチン緩衝液で3回洗浄した後、1%牛血清アルブミン
溶液を滴下(200μ)し、37℃で1時間プレートに吸
着させる。ゼラチン緩衝液で3回洗浄し、未吸着のもの
を除去する。その後、検液(培養上清)を細胞の上に滴
下(50μ)し、37℃で1時間反応させ、ゼラチン緩衝
液で3回洗浄する。続いてペルオキシダーゼ結合抗ヒト
Ig抗体を滴下(50μ)し、37℃で30分間反応させる。
ゼラチン緩衝液で3回洗浄を行った後、先述の酵素抗体
法で述べた方法によつて細胞に結合する培養液中のヒト
Igの量を測定することによつて株化細胞に対する特異性
をみた。又、癌組織をホルマリン固定後パラフイン包埋
した切片をエタノール溶液を用いて脱パラフイン処理を
行つた後検液(培養上清)を加え、市販のキツト(VECT
OR LABORATORIES社製[ベクタステインABCキツト」)
を用いてハイブリドーマから生産されるIgの特異性をみ
た。以上の結果、TOH/B9(FERM BP−1883)の生産する
IgAはヒト肝癌由来の株化細胞、PLC/PRF/5(ATCC CRL
8024)に対して結合力を有することがわかつた。また
TOH/D5(FERM BP−1882)の生産するIgGはヒト肝癌組
織に対して結合力を有することがわかつた。
能)をDF培地(DME:F−12=1:1)に10%牛胎児血清を加
えた培地で培養する。細胞の数が5×16〜1×107にな
つた段階で、トリプシンを用いて細胞をシヤーレの底面
から剥がし、遠心法を用いて細胞を集め、培地でよく洗
浄する。96個の穴を持つミクロタイタープレートの各穴
に細胞を一定数(105×100μ)ずつ分注し、37℃で1
晩、プレートに吸着させる。次に、3%グルタルアルデ
ヒド溶液を滴下(50μ)し、37℃で20分間、細胞の固
定を行う。遠心法(200g,10分間)で細胞をおとし、ゼ
ラチン緩衝液で3回洗浄した後、1%牛血清アルブミン
溶液を滴下(200μ)し、37℃で1時間プレートに吸
着させる。ゼラチン緩衝液で3回洗浄し、未吸着のもの
を除去する。その後、検液(培養上清)を細胞の上に滴
下(50μ)し、37℃で1時間反応させ、ゼラチン緩衝
液で3回洗浄する。続いてペルオキシダーゼ結合抗ヒト
Ig抗体を滴下(50μ)し、37℃で30分間反応させる。
ゼラチン緩衝液で3回洗浄を行った後、先述の酵素抗体
法で述べた方法によつて細胞に結合する培養液中のヒト
Igの量を測定することによつて株化細胞に対する特異性
をみた。又、癌組織をホルマリン固定後パラフイン包埋
した切片をエタノール溶液を用いて脱パラフイン処理を
行つた後検液(培養上清)を加え、市販のキツト(VECT
OR LABORATORIES社製[ベクタステインABCキツト」)
を用いてハイブリドーマから生産されるIgの特異性をみ
た。以上の結果、TOH/B9(FERM BP−1883)の生産する
IgAはヒト肝癌由来の株化細胞、PLC/PRF/5(ATCC CRL
8024)に対して結合力を有することがわかつた。また
TOH/D5(FERM BP−1882)の生産するIgGはヒト肝癌組
織に対して結合力を有することがわかつた。
すなわち、ドナーB−セルは体内に肝癌をもつ患者から
採取されたものであるので、細胞融合法によつて作り出
された自己増殖性をもつハイブリドーマのクローンから
はドナーB−セルと同形質のかつ特定の抗原結合部位を
もつモノクロナール(単一)抗体を生産していることを
示している。これらが、ハイブリドーマであることをさ
らに確認するために細胞内、DNA含量を調べた。その方
法を以下に説明する。
採取されたものであるので、細胞融合法によつて作り出
された自己増殖性をもつハイブリドーマのクローンから
はドナーB−セルと同形質のかつ特定の抗原結合部位を
もつモノクロナール(単一)抗体を生産していることを
示している。これらが、ハイブリドーマであることをさ
らに確認するために細胞内、DNA含量を調べた。その方
法を以下に説明する。
遠心管の中に培養細胞液を入れ遠心処理により上清を除
去する。70%エタノール溶液で4℃30分以上固定を行
う。遠心処理により上清を除き、RNA分解酵素(RNase)
溶液を加え、静かに振盪し、RNAを分解する。37℃で30
分間反応させた後、再び蒸留水で2度洗浄する。プロピ
ジウムイオダイド(PI)を加え、室温で20分間、染色し
た後、さらに蒸留水で2度洗浄する。蒸留水で再希釈
し、セルソーターを用いて分析した結果、TOH/D5(FERM
BP−1882)、TOH/B9(FERM BP−1883)ともに親ヒト
Bセル[HIH/TO1(FERM BP−1884)]の約2倍量のDNA
含量が認められ、これにの細胞がハイブリドーマである
ことが確認された。
去する。70%エタノール溶液で4℃30分以上固定を行
う。遠心処理により上清を除き、RNA分解酵素(RNase)
溶液を加え、静かに振盪し、RNAを分解する。37℃で30
分間反応させた後、再び蒸留水で2度洗浄する。プロピ
ジウムイオダイド(PI)を加え、室温で20分間、染色し
た後、さらに蒸留水で2度洗浄する。蒸留水で再希釈
し、セルソーターを用いて分析した結果、TOH/D5(FERM
BP−1882)、TOH/B9(FERM BP−1883)ともに親ヒト
Bセル[HIH/TO1(FERM BP−1884)]の約2倍量のDNA
含量が認められ、これにの細胞がハイブリドーマである
ことが確認された。
約3週間後に、それぞれのハイブリドーマの培地からHA
TOを除きRDF+10%牛胎児血清で培養を行った。1.0×10
6個/ml細胞が培地で生育する時、TOH/B9(FERM BP−18
83)は約1.3μg/mlの量のヒトIgAを、TOH/D5(FERM BP
−1882)は約0.15μg/mlのIgGを生産した。
TOを除きRDF+10%牛胎児血清で培養を行った。1.0×10
6個/ml細胞が培地で生育する時、TOH/B9(FERM BP−18
83)は約1.3μg/mlの量のヒトIgAを、TOH/D5(FERM BP
−1882)は約0.15μg/mlのIgGを生産した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:91)
Claims (2)
- 【請求項1】ヒト/ヒト融合細胞TOH/B9(FERM BP−18
83)によって生産されるものであって、かつ、 (a) ヒト免疫グロブリンA(IgA)であり、 (b) ヒト株化細胞PLC/PRF/5(Alexander cells)又
はヒト肝癌組織に対して結合する 生化学的性質を有することを特徴とする抗原特異的ヒト
免疫グロブリン。 - 【請求項2】ヒト/ヒト融合細胞TOH/D5(FERM BP−18
82)によって生産されるものであって、かつ、 (a) ヒト免疫グロブリンG(IgG)であり、 (b) ヒト株化細胞PLC/PRF/5(Alexander cells)又
はヒト肝癌組織に対して結合する 生化学的性質を有することを特徴とする抗原特異的ヒト
免疫グロブリン。
Priority Applications (9)
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---|---|---|---|
JP62126687A JPH0798000B2 (ja) | 1987-05-23 | 1987-05-23 | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン |
US07/196,610 US5093261A (en) | 1987-05-23 | 1988-05-20 | Cancer-related antigen-specific human immunoglobulins and human/human hybridomas having the ability to produce said human immunoglobulins |
IL8645788A IL86457A (en) | 1987-05-23 | 1988-05-20 | Immunoglobulins AGI and GGI of human-specific cancer-related vectors produced by human-human hybridomas using B cells in liver cancer and lineage |
KR1019880006037A KR930012104B1 (ko) | 1987-05-23 | 1988-05-21 | 암-관련 항원-특이적 인간 면역 글로불린 및 인간 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖는 인간/인간 하이브리도마 |
EP88304654A EP0293155B1 (en) | 1987-05-23 | 1988-05-23 | Cancer-related antigen-specific human immunoglobulins and human/human hybridomas having the ability to produce said human immunoglobulins |
DE3851571T DE3851571T2 (de) | 1987-05-23 | 1988-05-23 | Krebsbezügliche antigenspezifische menschliche Immunoglobuline und menschliche-menschliche Hybridome, die diese menschlichen Immunoglobuline produzieren können. |
ES88304654T ES2064349T3 (es) | 1987-05-23 | 1988-05-23 | Inmunoglobulinas humanas especificas del antigeno relacionado con el cancer e hibridomas humanos-humanos que pueden producir estas inmunoglobulinas humanas. |
AU16545/88A AU628288B2 (en) | 1987-05-23 | 1988-05-23 | Cancer-related antigen-specific human immunoglobulins and human/human hybridomas having the ability to produce said human immunoglobulins |
CA000567515A CA1340880C (en) | 1987-05-23 | 1988-05-24 | Cancer-related antigen-specific human immunoglobulins and human/human hybridomas having the ability to produce said human immunoglobulins |
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---|---|---|---|
JP62126687A JPH0798000B2 (ja) | 1987-05-23 | 1987-05-23 | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン |
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JP3334472A Division JPH0829078B2 (ja) | 1991-11-25 | 1991-11-25 | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリドーマ |
JP4083113A Division JPH05268988A (ja) | 1992-03-05 | 1992-03-05 | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン |
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JPS63290898A JPS63290898A (ja) | 1988-11-28 |
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JP62126687A Expired - Fee Related JPH0798000B2 (ja) | 1987-05-23 | 1987-05-23 | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン |
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EP (1) | EP0293155B1 (ja) |
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KR (1) | KR930012104B1 (ja) |
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US7223842B1 (en) | 1986-08-11 | 2007-05-29 | Massachusetts Eye And Ear Infirmary | Detection of proteins whose absence is associated with a neoplasm |
JPH0798000B2 (ja) * | 1987-05-23 | 1995-10-25 | 萩原 義秀 | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン |
CA2072249C (en) * | 1991-06-28 | 2003-06-17 | Saiko Hosokawa | Human monoclonal antibody specifically binding to surface antigen of cancer cell membrane |
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US6197582B1 (en) * | 1998-03-18 | 2001-03-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Development of human monoclonal antibodies and uses thereof |
US7060802B1 (en) * | 2000-09-18 | 2006-06-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Tumor-associated marker |
AUPR177400A0 (en) * | 2000-11-29 | 2000-12-21 | Cancerprobe Pty Ltd | Probes for identifying cancer-specific antigens |
TW200303919A (en) | 2001-12-05 | 2003-09-16 | Hiroyuki Ohno | Cytotoxic protein and the use |
DE10311248A1 (de) * | 2003-03-14 | 2004-09-30 | Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. | Humaner monoklonaler Antikörper |
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- 1987-05-23 JP JP62126687A patent/JPH0798000B2/ja not_active Expired - Fee Related
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1988
- 1988-05-20 US US07/196,610 patent/US5093261A/en not_active Expired - Lifetime
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- 1988-05-24 CA CA000567515A patent/CA1340880C/en not_active Expired - Fee Related
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