JPH0783925A - 蛍光標識試薬および蛍光免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】一般式（１）または（２）により表されるシア
ニン色素により標識されたアビジン、プロテインＡ、ア
ミノグリカン、またはポリペプチド等の親水性多官能基
高分子よりなる蛍光標識試薬、およびかかる蛍光標識試
薬を用いる蛍光免疫測定法、並びにかかる蛍光標識試薬
と直接的または間接的に結合する生理活性物質よりなる
蛍光免疫測定キット。 【効果】本発明によれば、蛍光免疫測定において赤外域
の半導体レーザを励起光源として用いることができる。
また、本発明で用いるシアニン色素は水溶媒系での溶解
性に優れたものであるから、シアニン色素を用いた標識
試薬の作成が容易である。また、本発明により高感度
で、低価格の免疫測定が可能となり、測定装置の小型
化、低価格化が実現できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、蛍光免疫測定法による
生理活性物質等の測定に用いる蛍光標識試薬、それを用
いた蛍光免疫測定法および蛍光免疫測定キットに関す
る。さらに詳しくは、半導体レーザを励起光源とした場
合の蛍光標識試薬と蛍光免疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】従来、抗
原、抗体の濃度の測定方法としてはラジオアイソトープ
や酵素で抗原抗体を標識する方法が用いられてきたが、
これらの方法は感度、安全性などの面で問題があり、こ
れらの方法に代わって蛍光色素で抗原抗体を標識し、こ
れを用いて抗原抗体の濃度を測定する方法が種々研究さ
れている。

【０００３】例えば、特開昭５９−５０１８７３号（米
国特許番号４８５２８０９号）などでは、光ファイバー
の側面に抗原、抗体を結合させ、蛍光色素で標識した抗
体、抗原をこの光ファイバー表面で免疫反応させるとと
もに、この光ファイバーに励起光を導波することによ
り、光ファイバー上の蛍光色素を励起させ、生ずる蛍光
を光ファイバーの出射端面で反射させ、光ファイバーの
入射端面から蛍光と残余の励起光を取り出し、これをビ
ームスプリッターを経由することにより分光させ、蛍光
のみを測定する方法が記載されている。

【０００４】従来よりこのような蛍光免疫測定法におい
ては、標識物としてフルオレセインイソチオシアネー
ト、ローダミンイソチオシアネートなどの蛍光色素で修
飾された蛍光標識抗原や蛍光標識抗体が用いられてき
た。しかしながら、このような蛍光標識抗原や蛍光標識
抗体は、抗原又は抗体一つに結合する蛍光色素の量が一
つであるため，感度の改善が困難であった。また、ロー
ダミンやフルオレセイン等の蛍光色素は、励起波長が４
００ｎｍ付近であるため、励起光源が大型で、高価であ
るという欠点を持っていた。そのため、これらの蛍光色
素に代えて、６３０ｎｍ帯で励起するシアニン色素で修
飾されたアビジンをビオチン化抗原やビオチン化抗体で
標識することにより、Ｈｅ−Ｎｅレーザを光源として使
用可能な蛍光標識抗体が開発されている（ＷＯ９０／１
３０２９公報）。

【０００５】しかし、Ｈｅ−Ｎｅレーザは、小型化を図
ると低出力になり、高出力化を図ると大型でかつ高価格
なものとなってしまうという問題がある。一方、Ｈｅ−
Ｎｅレーザより小型のレーザとして半導体レーザが市販
されているが、６３０ｎｍ帯では、実用的で安価で高出
力な半導体レーザは市販されていない。また、従来の蛍
光色素は、水溶媒系で溶けにくく、また溶解しても加水
分解を生じるなど大変不安定であるため、反応試薬の作
成が困難であった。そのため、水溶媒系での反応機会
（時間）を減らす必要があること、アビジンと蛍光色素
がともに溶けた状態で反応させることが困難であるこ
と、さらにアビジンと蛍光色素の結合体の水溶解性が低
いこと等の問題点が指摘されていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、前
記の課題を解決するために鋭意検討した。その結果、小
型、低価格、高出力の光源として実用化されている、赤
外域の半導体レーザにより励起でき、しかも水溶媒系で
溶けやすくかつ安定であるため取り扱いの容易な蛍光色
素を見出し、これをアビジン等の親水性多官能基高分子
に結合させて測定試薬とすることにより、さらに高感度
で低価格な免疫測定を実現でき、また、測定装置の小型
化、低価格化が可能となることを見いだし、本発明を完
成するに至った。

【０００７】即ち、本発明の要旨は、（１）一般式
（１）または（２）により表されるシアニン色素により
標識された親水性多官能基高分子よりなる蛍光標識試
薬、

【０００８】

【化７】

【０００９】（式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌｉ⁺
等の金属イオンまたはＮ⁺ Ｈ（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ 、Ｎ
Ｈ₄ ⁺ 、ピリジニウムイオン等のアンモニウム化合物イ
オン等を表す。）

【００１０】

【化８】

【００１１】（式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌｉ⁺
等の金属イオンまたはＮ⁺ Ｈ（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ 、Ｎ
Ｈ₄ ⁺ 、ピリジニウムイオン等のアンモニウム化合物イ
オン等を表す。）（２）蛍光免疫測定において、前記
（１）に記載の蛍光標識試薬を用い、７５０〜８５０ｎ
ｍの半導体レーザを励起光源とすることを特徴とする蛍
光免疫測定法、（３）蛍光色素により標識された親水性
多官能基高分子と、該親水性多官能基高分子と直接的ま
たは間接的に結合する生理活性物質よりなる蛍光免疫測
定キットにおいて、該蛍光色素が一般式（１）または
（２）により表されるシアニン色素であることを特徴と
する蛍光免疫測定キット、並びに（４）一般式（１）ま
たは（２）により表される蛍光色素により直接的または
アミノグリカン及び／又はポリペプチドを介して間接的
に標識されたアビジン及び／又はプロテインＡよりなる
結合体、およびビオチン及び／又は免疫グロブリンが直
接的またはアミノグリカン及び／又はポリペプチドを介
して間接的に生理活性物質に結合した結合体より構成さ
れることを特徴とする蛍光免疫測定キットに関する。

【００１２】本発明の蛍光標識試薬は、一般式（１）ま
たは（２）により表されるシアニン色素により標識され
た親水性多官能基高分子よりなるものである。シアニン
色素としては、一般式（１）に示される構造式を有する
色素ＮＫ３７５９（日本感光色素研究所製）またはその
塩、一般式（２）に示される構造式を有する色素ＮＫ３
９４２（日本感光色素研究所製）またはその塩等が挙げ
られる。本発明で用いるこれらのシアニン色素は、赤外
域を吸収する蛍光色素であるため、小型で高出力かつ低
価格な半導体レーザを光源として使用することができ
る。従って、装置全体としても小型化、低価格化を実現
することができる。本発明におけるシアニン色素は水溶
性が高く、水溶媒系で親水性多官能基高分子と容易に反
応させることができ、また溶解液中で加水分解はみられ
ず安定である。

【００１３】

【化９】

【００１４】（式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌｉ⁺
等の金属イオンまたはＮ⁺ Ｈ（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ 、Ｎ
Ｈ₄ ⁺ 、ピリジニウムイオン等のアンモニウム化合物イ
オン等を表す。）

【００１５】

【化１０】

【００１６】（式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌｉ⁺
等の金属イオンまたはＮ⁺ Ｈ（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ 、Ｎ
Ｈ₄ ⁺ 、ピリジニウムイオン等のアンモニウム化合物イ
オン等を表す。）

【００１７】本発明の蛍光標識試薬においてシアニン色
素により標識される親水性多官能基高分子としては、特
に限定されるものではなく、例えばアビジン、プロテイ
ンＡ、アミノグリカン、またはポリペプチド等が好適に
使用される。アミノグリカンとしては、例えばキトサ
ン、ポリガラクトサミン、ポリノイラミン酸等が例示さ
れ、ポリペプチドとしては、ポリリジン等が挙げられ
る。

【００１８】シアニン色素により親水性多官能基高分子
を標識するには、公知の方法により容易に行われるが、
本発明におけるシアニン色素はカルボキシル基のほかに
強電解性のスルホン酸基を有するため水溶性が高く、水
溶媒系においてアビジン等の親水性多官能基高分子と反
応させることができる。即ち、本発明におけるシアニン
色素と親水性多官能基高分子の結合は、シアニン色素の
カルボキシル基と親水性多官能基高分子のアミノ基とを
脱イオン水、トリエチルアミン塩酸緩衝液、トリエタノ
ールアミン塩酸緩衝液等の水溶媒系中で、あるいはジメ
チルホルムアミドなどの両親媒性溶媒中で縮合剤を用い
て、常法により縮合させてアミド結合させることができ
る。シアニン色素と親水性多官能基高分子との反応終了
後、未反応物は除去することが好ましく、例えば透析
法、遠心分離法、ゲル濾過法又は限外濾過法などとアル
コール、水による洗浄等の併用によって除くことができ
る。ここで、縮合剤としては１−エチル−３−（３’−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジ−ｐ−ト
レオイルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルフォリノ
エチル）カルボジイミド メト−ｐ−トルエンスルホン
酸塩（ＣＨＭＣ）のようなカルボジイミド類や、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド等
が使用される。

【００１９】例えば、親水性多官能基高分子としてアビ
ジンを使用する場合について、さらに具体的な態様を例
示すると、通常５．０×１０^-6〜０．１Ｍのシアニン色
素を脱イオン水に溶解し、得られる水溶液１０ｍｌに
０．５〜２．０ｍｇのアビジンを加え、前記のような縮
合剤をシアニン色素に対してモル比で等倍〜１００倍量
加え、室温で一晩放置する。一晩放置後、反応液を限外
濾過し、メタノール、水等で洗浄し未反応色素を除去し
た後、限外濾過膜上の残留物を弱アルカリ性の緩衝液を
用いて分取し、乾燥したものをシアニン色素修飾アビジ
ンとする。乾燥方法としては種々あるが、好ましくは凍
結乾燥法である。この場合、１分子のアビジンの表面に
結合するシアニン色素の数が多い程効率が良いが、通常
のシアニン色素では結合数が多くなると使用時の水溶性
が問題となるため４分子程度に抑えざるを得ないが、本
発明におけるシアニン色素は水溶性が高いため５分子以
上結合しても使用に支障がない。

【００２０】次に、本発明の蛍光標識試薬を用いて蛍光
免疫測定を行う方法について、本発明のシアニン色素修
飾アビジンを使用する態様を例示して説明する。 工程Ａ：まず、測定対象物質（生理活性物質である抗
原）に対する抗体を光ファイバーのコア表面に固定す
る。次いで、該抗体の結合した光ファイバーと測定対象
物質（抗原）を特異的に反応させて、光ファイバーのコ
ア表面上に抗体と測定対象物質（抗原）の結合した免疫
複合体（光ファイバーのコア表面−抗体−測定対象物
質）を形成する。

【００２１】工程Ｂ：前記の測定対象物質（抗原）に対
して特異的な結合能を有する抗体の結合したビオチン化
アミノグリカン（抗体−アミノグリカン−ビオチン）と
本発明のシアニン色素修飾アビジン（アビジン−シアニ
ン色素）を反応させて、ビオチン−アビジンの結合を介
したシアニン色素標識抗体を調製する（抗体−アミノグ
リカン−ビオチン−アビジン−シアニン色素）。

【００２２】工程Ｃ：工程Ａで調製した免疫複合体と工
程Ｂで調製したシアニン色素標識抗体を特異的に反応さ
せて、光ファイバーのコア表面−抗体−測定対象物質−
抗体−アミノグリカン−ビオチン−アビジン−シアニン
色素の免疫複合体を形成し、７５０〜８５０ｎｍの半導
体レーザを励起光源とする蛍光測定装置を用いて光ファ
イバーのコア表面に固定されたシアニン色素の蛍光を測
定する。

【００２３】前記の説明においては、親水性多官能基高
分子としてアビジンを例としたものであるが、本発明に
おける親水性多官能基高分子は前記のようにアビジン以
外にもプロテインＡ、アミノグリカン、またはポリペプ
チド等が使用される。光ファイバーのコア表面にシアニ
ン色素を固定するために介在する化合物として、アビジ
ンの場合にはビオチンが使用されるように、使用する親
水性多官能基高分子と特異的に結合する化合物が選択さ
れる。具体的には、アビジンとビオチン、プロテインＡ
と抗体などが好ましく、特にアビジンとビオチンの組み
合わせが最適である。

【００２４】尚、本発明の測定方法における別の態様と
して、シアニン色素修飾アビジンを免疫反応後に反応さ
せて免疫複合体に結合させてもよい。即ち、予め光ファ
イバーのコア表面−抗体−測定対象物質−抗体−アミノ
グリカン−ビオチンからなる免疫複合体を形成させ、こ
れにシアニン色素修飾アビジンを反応させることによ
り、前記と同様に光ファイバーのコア表面にシアニン色
素を固定することができ、前記と同様にして蛍光を測定
する。

【００２５】本発明の免疫測定方法は、前記のように蛍
光免疫測定において、本発明の蛍光標識試薬を用い、７
５０〜８５０ｎｍの半導体レーザを励起光源とすること
に特徴を有するものであって、免疫測定の各手順は特に
限定されるものではなく、公知の方法をそのまま適用す
ることができる。また、前記の説明では光ファイバーの
コア表面上に測定対象物質を抗体でサンドイッチ状に結
合させてシアニン色素を固定する態様を示したが、測定
試料と本発明の蛍光標識試薬とを競合させて、光ファイ
バー表面に結合した抗原あるいは抗体と結合させて光フ
ァイバーのコア表面上にシアニン色素を固定する方法で
あってもよい。

【００２６】本発明の蛍光免疫測定キットには、次のよ
うな２つの態様がある。 （１）第１の態様 本発明の蛍光免疫測定キットの第１の態様としては、前
記のようなシアニン色素により標識された親水性多官能
基高分子と、該親水性多官能基高分子と直接的または間
接的に結合する生理活性物質よりなるものである。ここ
でいう生理活性物質とは、測定対象となる抗原、抗体等
に対して特異的に結合する抗体、抗原等を意味する。即
ち、シアニン色素により標識された親水性多官能基高分
子としては、前記のような例えばシアニン色素修飾アビ
ジン（アビジン−シアニン色素）やシアニン色素により
修飾されたプロテインＡ、シアニン色素により修飾され
たアミノグリカン、またはシアニン色素により修飾され
たポリペプチド等が挙げられる。

【００２７】一方、親水性多官能基高分子と直接的また
は間接的に結合する生理活性物質としては、例えば測定
対象となる抗原に対して特異的な結合能を有する生理活
性物質（例えば、抗体）の結合したビオチン化アミノグ
リカン（抗体−アミノグリカン−ビオチン）が親水性多
官能基高分子に間接的に結合する場合として例示され
る。この場合、生理活性物質である抗体は、親水性多官
能基高分子であるアビジンとアミノグリカン−ビオチン
を介して間接的に結合する。また、親水性多官能基高分
子に直接的に結合する場合としては、例えばシアニン色
素修飾アミノグリカン（アミノグリカン−シアニン色
素）、またはシアニン色素修飾ポリペプチド（ポリペプ
チド−シアニン色素）等が測定対象となる抗原や抗体に
対して特異的な結合能を有する生理活性物質（例えば、
抗体や抗原）と直接的に結合する態様が挙げられる。

【００２８】（２）第２の態様 本発明の蛍光免疫測定キットの第２の態様としては、前
記のようなシアニン色素により直接的またはアミノグリ
カン及び／又はポリペプチドを介して間接的に標識され
たアビジン及び／又はプロテインＡよりなる結合体（結
合体ａ）、およびビオチン及び／又は免疫グロブリンが
直接的またはアミノグリカン及び／又はポリペプチドを
介して間接的に測定対象物質に結合した結合体（結合体
ｂ）より構成されるものである。例えば、結合体ａとし
ては、アビジン−シアニン色素、プロテインＡ−シアニ
ン色素、アビジン−アミノグリカン−シアニン色素、プ
ロテインＡ−アミノグリカン−シアニン色素等の種々の
例が挙げられる。また、結合体ｂとしてはビオチン−測
定対象物質、免疫グロブリン−測定対象物質、ビオチン
−アミノグリカン−測定対象物質、免疫グロブリン−ア
ミノグリカン−測定対象物質等の種々の例が挙げられ
る。

【００２９】なお、本発明において用いる光ファイバー
は、樹脂製光ファイバーが用いられる。樹脂製光ファイ
バーを構成する樹脂としては、特に限定されるものでは
ないが、免疫物質を吸着しない材質で透光性のよいもの
であることが必要であり、例えば、ポリスチレン、ポリ
アクリル酸エステル、ポリエステル、ポリアクリルアミ
ド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンテレフタレー
ト、ポリカーボネート、あるいはこれらの共重合体等が
挙げられる。なかでもポリアクリル酸エステルが好まし
い。ポリアクリル酸エステルは、アクリル樹脂のうちエ
ステル構造を有するものであって、例えば、アクリル
酸、メタクリル酸などのエステル誘導体の重合体からな
る合成樹脂であり、具体的にはアクリル酸メチル、アク
リル酸エチル、メタクリル酸メチルなどの重合体が挙げ
られる。これらのポリアクリル酸エステルのうち、本発
明において特に好適に用いられるものは、ポリメタクリ
ル酸メチルである。これはポリメタクリル酸メチルが他
の樹脂に比べ、特に透光性がよいからである。また、本
発明において用いられる樹脂製光ファイバーは、例え
ば、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、メタクリル
酸メチルなどのモノマーとスチレンなどのモノマーとの
共重合体であってもよい。

【００３０】

【実施例】以下、実施例および比較例により本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によ
りなんら限定されるものではない。まず実施例にはいる
前に本発明において使用されるシアニン色素の水系溶媒
に対する溶解性を従来使用されてきたシアニン色素の水
系溶媒に対する溶解性と比較した。以下の実験には実施
例に使用されるシアニン色素の例としてＮＫ３７５９の
Ｎａ塩およびトリエチルアミン塩、並びにＮＫ３９４２
−トリエチルアミン塩を、比較例においては従来使用さ
れてきたシアニン色素の例として下記構造式（３）を有
するＮＫ１１６０（日本感光色素研究所製）を用いた。

【００３１】

【化１１】

【００３２】その結果、以下の実施例に使用されたＮＫ
３７５９−Ｎａ塩、ＮＫ３７５９−トリエチルアミン
塩、ＮＫ３９４２−トリエチルアミン塩、およびＮＫ１
１６０の水またはエタノールに対する室温における溶解
性は、次のとおりであった。まず、水に対する溶解性
は、ＮＫ３７５９−Ｎａ塩が２．６０ｇ／１００ｍｌ、
ＮＫ３７５９−トリエチルアミン塩が４．７８ｇ／１０
０ｍｌ、ＮＫ３９４２−トリエチルアミン塩が１０ｇ／
１００ｍｌ、そしてＮＫ１１６０が０．００００２ｇ／
１００ｍｌであり、エタノールに対する溶解性は、ＮＫ
３７５９−Ｎａ塩が０．１３４ｇ／１００ｍｌ、ＮＫ３
７５９−トリエチルアミン塩が３．０４ｇ／１００ｍ
ｌ、ＮＫ３９４２−トリエチルアミン塩が５ｍｇ／１０
０ｍｌ、そしてＮＫ１１６０が０．５ｍｇ／１００ｍｌ
であった。

【００３３】実施例１ （１）ＮＫ３７５９−Ｎａ塩１２．２ｍｇを脱イオン水
１０ｍｌに溶解した。 （２）アビジン１ｍｇを５００μｌの水に溶かして、前
記（１）の水溶液に加え、攪拌し、さらにＮ−シクロヘ
キシル−Ｎ’−（２−モルフォリノエチル）カルボジイ
ミド メト−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ＣＨＭＣ）
０．１ｇを加えて、一晩放置した。

【００３４】（３）前記（２）の溶液を限外濾過を用い
て、メタノールで３〜４回、ついで水で２〜３回洗浄し
て未反応色素を除去した。 （４）得られた沈殿を脱イオン水に溶解し、「ＮＫ３７
５９修飾アビジン液」（以下、Ｆ₁ アビジンと略す。）
とした。

【００３５】（５）別途、ウサギ由来抗ヒト膵アミラー
ゼ抗体（以下、ＲＨＡＡｂと略す）を光ファイバーに固
定し、これとヒト膵アミラーゼ（以下、ＨＡと略す）を
特異的に反応させて、「ウサギ由来抗ヒト膵アミラーゼ
抗体＋ヒト膵アミラーゼ」（以下、ＲＨＡＡｂ−ＨＡと
略す）とした。 （６）また多数のアミノ基をビオチン化したキトサン
（以下、Ｂ−Ｃと略す）に、ヒツジ由来抗ヒト膵アミラ
ーゼ抗体（以下、ＳＨＡＡｂと略す）を結合させ、「ビ
オチン化キトサン＋ヒツジ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗
体」（以下、Ｂ−Ｃ−ＳＨＡＡｂと略す）とした。

【００３６】（７）さらに前記（４）のＦ₁ アビジンと
前記（６）のＢ−Ｃ−ＳＨＡＡｂを反応させて、「ＮＫ
３７５９修飾アビジン＋ビオチン化キトサン＋ヒツジ由
来抗ヒト膵アミラーゼ抗体」（以下、Ｆ₁ アビジン−Ｂ
−Ｃ−ＳＨＡＡｂと略す）とした。 （８）前記（５）のＲＨＡＡｂ−ＨＡと前記（７）のＦ
₁ アビジン−Ｂ−Ｃ−ＳＨＡＡｂを特異的に反応させ、
「ウサギ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ヒト膵アミラー
ゼ＋ヒツジ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ビオチン化キ
トサン＋ＮＫ３７５９修飾アビジン」として、それを７
８０ｎｍＬＤ（３０ｍＷ）で励起させ、その蛍光を測定
した結果、ヒト膵アミラーゼは１．２×１０^-4ｍｇ／ｍ
ｌで検出でき、７８０ｎｍＬＤの素子は１０φ×１０
で、低価格になり、装置としても小型化低価格化が実現
できた。

【００３７】比較例１ （１）大過剰の２．５ｍｇのＮＫ１１６０を０．０１Ｍ
トリエチルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌに
懸濁した。（実際の溶解量は２．６μｇ／１０ｍｌであ
る。）

【００３８】（２）実施例１の（２）〜（３）と同様の
方法により得た沈澱をｐＨ８．０に調整したＫＯＨ溶液
に懸濁したところ、明らかに紫外、可視領域の吸収スペ
クトルに変化が見られ、有機溶媒を用いた場合のよう
に、標識試薬として用いることができる色素修飾アビジ
ンを得ることができなかった。

【００３９】比較例２ （１）２．０ｍｇのＮＫ１１６０をエタノール：トリエ
チルアミン＝４：１混合液１ｍｌに溶かした。

【００４０】（２）実施例１の（２）〜（４）において
縮合剤としてＣＨＭＣに代えてジシクロヘキシルカルボ
ジイミドを使用すること以外は、同様の操作を行い、
「ＮＫ１１６０修飾アビジン」（以下Ｆ^, アビジンと略
す）を作った。

【００４１】（３）実施例１の（５）〜（６）と同様に
反応させ、さらに前記（２）のＦ^, アビジンと実施例１
のＢ−Ｃ−ＳＨＡＡｂとを反応させ、「ＮＫ１１６０修
飾アビジン＋ビオチン化キトサン＋ヒツジ由来抗ヒト膵
アミラーゼ抗体」（以下、Ｆ^,アビジン−Ｂ−Ｃ−ＳＨ
ＡＡｂと略す）とした。 （４）実施例１のＲＨＡＡｂ−ＨＡと前記（３）のＦ^,
アビジン−Ｂ−Ｃ−ＳＨＡＡｂを特異的に反応させて、
「ウサギ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ヒト膵アミラー
ゼ＋ヒツジ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ビオチン化キ
トサン＋Ｆ^, アビジン」とし、これをＨｅ−Ｎｅレーザ
（６３３ｎｍ）で励起させ、その蛍光を測定したとこ
ろ、ヒト膵アミラーゼは１．９×１０^-4ｍｇ／ｍｌで検
出できたが、Ｈｅ−Ｎｅレーザは３０ｍＷのもので長さ
約１ｍで、高価格であるため、装置は大型で高価なもの
となってしまった。

【００４２】実施例２ （１）１３．２ｍｇのＮＫ３９４２−トリエチルアミン
塩を脱イオン水１０ｍｌに溶解した。 （２）実施例１の（２）〜（４）と同様の操作を行い、
Ｆ₁ アビジンを得た。

【００４３】（３）ヒト絨毛性腺刺激ホルモン（以下、
ｈＣＧと略す）と光ファイバーに固定したウサギ由来抗
ｈＣＧ抗体（以下、ＲｈＣＧＡｂと略す）を特異的に反
応させ、「ウサギ由来抗ｈＣＧ抗体＋ｈＣＧ」（以下、
ＲｈＣＧＡｂ−ｈＣＧと略す）とした。 （４）また多数のアミノ基をビオチン化したポリガラク
トサミン（以下、Ｂ−ｐＧと略す）に、ヤギ由来抗ｈＣ
Ｇ抗体（以下、ＧｈＣＧＡｂと略す）を結合させ、「ビ
オチン化ポリガラクトサミン＋ヤギ由来抗ｈＣＧ抗体」
（以下、Ｂ−ｐＧ−ＧｈＣＧＡｂと略す）とした。

【００４４】（５）さらに前記（２）のＦ₁ アビジンと
前記（４）のＢ−ｐＧ−ＧｈＣＧＡｂを反応させて、
「ＮＫ３９４２修飾アビジン＋ビオチン化ポリガラクト
サミン＋ヤギ由来抗ｈＣＧ抗体」（以下、Ｆ₁ アビジン
＋Ｂ−ｐＧ−ＧｈＣＧＡｂと略す）とした。 （６）前記（３）のＲｈＣＧＡｂ−ｈＣＧと前記（５）
のＦ₁ アビジン＋Ｂ−ｐＧ−ＧｈＣＧＡｂを特異的に反
応させ、「ウサギ由来抗ｈＣＧ抗体＋ｈＣＧ＋ヤギ由来
抗ｈＣＧ抗体＋ビオチン化ポリガラクトサミン＋ＮＫ３
９４２修飾アビジン」とした。これを７８０ｎｍＬＤで
励起させ、その蛍光を測定した結果、ｈＣＧは２．０×
１０^-4ｍｇ／ｍｌで検出でき、７８０ｎｍＬＤ素子は１
０φ×１０で低価格となり、小型化低価格化が実現でき
た。

【００４５】実施例３ （１）実施例１の（１）〜（４）と同様の操作を行い、
「ＮＫ３７５９修飾アビジン液」（Ｆ₁ アビジン）を作
成した。 （２）ヒト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）と光ファイバ
ーに固定したヤギ由来抗ｈＦＳＨ抗体（以下、ＧｈＦＳ
ＨＡｂと略す）を特異的に反応させ、「ヤギ由来抗ｈＦ
ＳＨ抗体＋ｈＦＳＨ」（以下、ＧｈＦＳＨＡｂ−ｈＦＳ
Ｈと略す）とした。

【００４６】（３）また多数のアミノ基をビオチン化し
たキトサン（Ｂ−Ｃ）にウサギ由来抗ｈＦＳＨ抗体（以
下、ＲｈＦＳＨＡｂと略す）を結合させ、「ビオチン化
キトサン＋ウサギ由来抗ｈＦＳＨ抗体」（以下、Ｂ−Ｃ
−ＲｈＦＳＨＡｂと略す）とした。 （４）さらに前記（１）のＦ₁ アビジンと前記（３）の
Ｂ−Ｃ−ＲｈＦＳＨＡｂを反応させて、「修飾アビジン
＋ビオチン化キトサン＋ウサギ由来抗ｈＦＳＨ抗体」
（以下、ＲｈＦＳＨＡｂ−Ｂ−Ｃ−Ｆ₁ アビジンと略
す）とした。

【００４７】（５）前記（２）のＧｈＦＳＨＡｂ−ｈＦ
ＳＨと前記（４）のＲｈＦＳＨＡｂ−Ｂ−Ｃ−Ｆ₁ アビ
ジンを特異的に反応させて、「ヤギ由来抗ｈＦＳＨ抗体
＋ｈＦＳＨ＋ウサギ由来抗ｈＦＳＨ抗体＋ビオチン化キ
トサン＋ＮＫ３７５９修飾アビジン」とし、これを７８
０ｎｍＬＤで励起させ、その蛍光を測定した結果、ｈＦ
ＳＨは５．２×１０^-4ｍｇ／ｍｌで検出でき、７８０ｎ
ｍＬＤは１０φ×１０で低価格となり、小型化低価格化
が実現できた。

【００４８】実施例４ （１）ＮＫ３７５９−Ｎａ塩１２．２ｍｇを脱イオン水
１０ｍｌに溶解した。 （２）アビジン２ｍｇを５００μｌの水に溶かして、前
記（１）の水溶液に加え、さらにＣＨＭＣ０．１ｇを加
えて、一晩放置した。 （３）実施例１の（４）まで同様の操作を行い、「ＮＫ
３７５９修飾アビジン液」（Ｆ₁ アビジン）を作成し
た。

【００４９】（４）ヤギ由来抗ヒトカルシトニン抗体
（以下、ＧＨＣＡｂと略す）を光ファイバーに固定し、
これとヒトカルシトニン（以下、ＨＣと略す）を特異的
に反応させて、「ヤギ由来抗ヒトカルシトニン抗体＋ヒ
トカルシトニン」（以下、ＧＨＣＡｂ−ＨＣと略す）と
した。 （５）また多数のアミノ基をビオチン化したポリノイラ
ミン酸（以下、Ｂ−ｐＮと略す）に、ウサギ由来抗ヒト
カルシトニン抗体を結合させ、「ウサギ由来抗ヒトカル
シトニン抗体＋ビオチン化ポリノイラミン酸」（以下、
ＲＨＣＡｂ−Ｂ−ｐＮと略す）とし、前記（４）のＧＨ
ＣＡｂ−ＨＣを特異的に反応させ、「ヤギ由来抗ヒトカ
ルシトニン抗体＋ヒトカルシトニン＋ウサギ由来抗ヒト
カルシトニン抗体＋ビオチン化ポリノイラミン酸」（以
下、ＧＨＣＡｂ−ＨＣ−ＲＨＣＡｂ−Ｂ−ｐＮと略す）
とした。

【００５０】（６）さらに前記（３）のＦ₁ アビジンと
前記（５）のＧＨＣＡｂ−ＨＣ−ＲＨＣＡｂ−Ｂ−ｐＮ
を反応させ、「ヤギ由来抗ヒトカルシトニン抗体＋ヒト
カルシトニン＋ウサギ由来抗ヒトカルシトニン抗体＋ビ
オチン化ポリノイラミン酸＋ＮＫ３７５９修飾アビジ
ン」とし、これを７８０ｎｍＬＤで励起させ、その蛍光
を測定したところ、ヒトカルシトニンは、４．３×１０
^-4ｍｇ／ｍｌで検出でき、７８０ｎｍＬＤ素子は１０φ
×１０で低価格となり、小型化低価格化が実現できた。

【００５１】実施例５ （１）１３．２ｍｇのＮＫ３７５９−トリエチルアミン
塩を脱イオン水１０ｍｌに懸濁した。 （２）キトサン１ｍｇを０．５ｍｌの水に溶解し、前記
（１）の懸濁液に加え、攪拌し、さらにＣＨＭＣ０．１
ｇを加えて、一晩放置した。 （３）前記（２）の溶液を限外濾過を用いて、メタノー
ルで３〜４回洗浄し、ついで水で２〜３回洗浄して未反
応色素を除去し、ＮＫ３７５９が結合したキトサン（以
下、３７５９キトサンと略す。）を得た。

【００５２】（４）得られた３７５９キトサンを０．０
１Ｍトリエチルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌ
に懸濁し、０．５ｍｌのプロテインＡ水溶液（濃度２ｍ
ｇ／ｍｌ）と混合、さらにＣＨＭＣ０．１ｇを加えて、
攪拌しながら一晩放置した。 （５）前記（４）の溶液を限外濾過を用いて、リン酸緩
衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ８．０で３〜４回洗浄し、
未反応プロテインＡを除去し、プロテインＡと３７５９
キトサンの結合体（以下、ＰｒＡ−３７５９キトサンと
略す。）を得た。

【００５３】（６）得られたＰｒＡ−３７５９キトサン
をＰＢＳ１ｍｌに懸濁し、１ｍｌのウサギ由来のＣ反応
性タンパク質（以下、ＣＲＰと略す。）に対する免疫グ
ロブリンＧ（以下、ウサギ由来抗ＣＲＰＩｇＧと略
す。）水溶液（濃度５ｍｇ／ｍｌ）と混合、攪拌しなが
ら、一晩放置した。 （７）前記（６）の溶液を限外濾過を用いて、ＰＢＳで
３〜４回洗浄し、未反応ウサギ由来抗ＣＲＰＩｇＧを除
去し、ウサギ由来抗ＣＲＰＩｇＧをＰｒＡ−３７５９キ
トサンの結合体（以下、抗ＣＲＰＩｇＧ−ＰｒＡ−３７
５９キトサンと略す。）を得、ＰＢＳに懸濁、溶解する
ことにより、抗ＣＲＰＩｇＧ−ＰｒＡ−３７５９キトサ
ン溶液とした。

【００５４】（８）別途、マウス由来抗ＣＲＰモノクロ
ーナル抗体を光ファイバーに固定し、これとＣＲＰを特
異的に反応させて、光ファイバー上にマウス由来抗ＣＲ
Ｐモノクローナル抗体−ＣＲＰの複合体（以下、抗ＣＲ
Ｐ−ＣＲＰ複合体と略す。）を形成した。 （９）前記（８）の抗ＣＲＰ−ＣＲＰ複合体を固定化し
た光ファイバーを前記（７）の抗ＣＲＰＩｇＧ−ＰｒＡ
−３７５９キトサン溶液に浸漬、特異的に反応させ、光
ファイバー上に、抗ＣＲＰ−ＣＲＰ複合体と抗ＣＲＰＩ
ｇＧ−ＰｒＡ−３７５９キトサンの結合体を形成し、こ
れを７８０ｎｍＬＤで励起させ、その蛍光を測定した結
果、ＣＲＰは、２．５×１０^-4ｍｇ／ｍｌで検出でき、
７８０ｎｍＬＤ素子は１０φ×１０で低価格となり、小
型化低価格化が実現できた。

【００５５】

【発明の効果】本発明によれば、特定のシアニン色素に
より標識された蛍光標識試薬を用いることにより、蛍光
免疫測定において赤外域の半導体レーザを励起光源とし
て用いることができる。また、本発明で用いるシアニン
色素は水溶媒系での溶解性に優れたものであるから、シ
アニン色素を用いた標識試薬の作成が容易である。ま
た、本発明により高感度で、低価格の免疫測定が可能と
なり、測定装置の小型化、低価格化が実現できる。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（１）または（２）により表され
   るシアニン色素により標識された親水性多官能基高分子
   よりなる蛍光標識試薬。 【化１】 （式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌｉ⁺ 等の金属イオ
   ンまたはＮ⁺ Ｈ（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ 、ＮＨ₄ ⁺ 、ピリジニウ
   ムイオン等のアンモニウム化合物イオン等を表す。） 【化２】 （式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌｉ⁺ 等の金属イオ
   ンまたはＮ⁺ Ｈ（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ 、ＮＨ₄ ⁺ 、ピリジニウ
   ムイオン等のアンモニウム化合物イオン等を表す。）
2. 【請求項２】 親水性多官能基高分子がアビジン、プロ
   テインＡ、アミノグリカン、またはポリペプチドである
   請求項１記載の蛍光標識試薬。
3. 【請求項３】 蛍光免疫測定において、請求項１または
   ２記載の蛍光標識試薬を用い、７５０〜８５０ｎｍの半
   導体レーザを励起光源とすることを特徴とする蛍光免疫
   測定法。
4. 【請求項４】 蛍光色素により標識された親水性多官能
   基高分子と、該親水性多官能基高分子と直接的または間
   接的に結合する生理活性物質よりなる蛍光免疫測定キッ
   トにおいて、該蛍光色素が一般式（１）または（２）に
   より表されるシアニン色素であることを特徴とする蛍光
   免疫測定キット。 【化３】 （式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌｉ⁺ 等の金属イオ
   ンまたはＮ⁺ Ｈ（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ 、ＮＨ₄ ⁺ 、ピリジニウ
   ムイオン等のアンモニウム化合物イオン等を表す。） 【化４】 （式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌｉ⁺ 等の金属イオ
   ンまたはＮ⁺ Ｈ（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ 、ＮＨ₄ ⁺ 、ピリジニウ
   ムイオン等のアンモニウム化合物イオン等を表す。）
5. 【請求項５】 親水性多官能基高分子がアビジン、プロ
   テインＡ、アミノグリカン、またはポリペプチドである
   請求項４記載の蛍光免疫測定キット。
6. 【請求項６】 一般式（１）または（２）により表され
   る蛍光色素により直接的またはアミノグリカン及び／又
   はポリペプチドを介して間接的に標識されたアビジン及
   び／又はプロテインＡよりなる結合体、およびビオチン
   及び／又は免疫グロブリンが直接的またはアミノグリカ
   ン及び／又はポリペプチドを介して間接的に生理活性物
   質に結合した結合体より構成されることを特徴とする蛍
   光免疫測定キット。 【化５】 （式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌｉ⁺ 等の金属イオ
   ンまたはＮ⁺ Ｈ（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ 、ＮＨ₄ ⁺ 、ピリジニウ
   ムイオン等のアンモニウム化合物イオン等を表す。） 【化６】 （式中、ＲはＨ⁺ 、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｌｉ⁺ 等の金属イオ
   ンまたはＮ⁺ Ｈ（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ 、ＮＨ₄ ⁺ 、ピリジニウ
   ムイオン等のアンモニウム化合物イオン等を表す。）