JP2951398B2 - 生体活性物質測定用試薬、その製法及び測定方法 - Google Patents
生体活性物質測定用試薬、その製法及び測定方法Info
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Description
用できる試薬、その製法及びこれら試薬を用いる生体活
性物質の測定方法に関する。
微量成分を検出する方法として、種々の免疫測定法が知
られており、これに関しては色素で標識された試薬、測
定方法、あるいは装置などについて様々な技術が提案さ
れている。
で標識された抗原、抗体などが開発されてきた。
標識されたものであるが、取り扱いが容易でない。また
酵素で標識されたものは、一部の物質に対してのみ有効
である。このため、発光剤標識試薬の高感度化が望まれ
ている。
として特開昭58−61468号には、複数個のルミネセント
が結合した有機高分子化合物と抗体又は抗原のいずれか
と結合した免疫試薬及びそれを用いた免疫定量法が、ま
た米国特許4166105号には、多官能性ポリマー骨格分子
アナライト体と特異的に反応可能な第一反応体(抗体)
で、多数の蛍光染料分子が結合したアナライト体の検出
試薬がそれぞれ提案されている。しかしながら、これら
の試薬は、結合させることができる色素の量が充分では
ないため、長波長で励起される感度の低い色素を用いた
場合には、検出感度が実用的でないという問題がある。
溶性有機高分子化合物をアビジンに結合させ、これを用
いた生物学的に活性な物質の測定方法が開示されてい
る。しかしながら、この試薬及び方法は、抗体あるいは
抗原を分子量の小さいビオチンを介してアビジンに結合
させているため、抗体あるいは抗原のまわりに多量のビ
オチンが結合し、免疫活性を減退させる可能性があり、
これを防ぐ処理を講ずる必要があること、また、水溶性
高分子をアビジンに結合させるのは立体障害により結合
させにくいという問題がある。
(発光剤)を励起したり、蛍光を伝播する方法が有効で
あり、種々の技術が開示されている。
原、抗体を光ファイバーに固定化する必要があり、この
ための技術として、セロファンなどの膜に抗原、抗体な
どを固定化させる膜固定化法、アクリルアミドゲルなど
の空隙に抗原、抗体などを封じ込める包括法などがある
が、前者は、光散乱による感度低下が、後者は、応答性
が悪いという問題があった。このため、光ファイバーに
直接抗原、抗体などを共有結合させる方法として、Anal
itical Chemistry Vol.59 No.8 p1226〜1230(1987)に
は、石英製光ファイバーの表面のシラノール基にシラン
カップリング剤である(3−グリシドキシプロピル)ト
リメトキシシラン(GOPS)を反応させ、次いでこれをHI
O2で処理して、石英製光ファイバーの表面にホルミル基
を導入し、このホルミル基に蛋白質のアミノ基を反応さ
せて固定化する方法が開示されている。しかしながら、
この方法は、石英ファイバーにのみ有効な方法であり、
樹脂製光ファイバーには使用できない。樹脂製光ファイ
バーは、値段も安価で、研磨加工しやすく、柔軟であ
り、取り扱いやすいため、樹脂製ファイバーに抗原や抗
体などの蛋白質を結合させる方法が望まれている。
−501873号(米国特許4582809)に免疫検定方法及び方
法が、また特開昭62−123358号、特開昭62−501102号
(スイス特許出願5306/84−5号)に光ファイバー型免
疫センサーがそれぞれ提案されている。しかしながら、
これらの明細書には、抗原、抗体の高感度標識を行うた
めの技術は何ら記載されておらず、このため、抗原とし
て、Hgランプ、XeランプやArレーザで励起するような感
度の高い蛍光色素を用いた場合にしか利用できず、ま
た、装置が大型で、高価なものになるという問題があ
る。
えば、特開昭60−24450号には、ビオチン−アジビン結
合により免疫複合体に結合した発光剤結合アビジンの発
光反応による発光量を測定する生物学的に活性な物質の
測定方法が提案されている。この方法は発光剤と抗体又
は抗原の間にアビジン−ビオチン結合を介しているが、
他の有機高分子化合物を介していないため、結合できる
色素量が少なく、低感度の色素を使用できないという問
題がある。また、ビオチン−アビジン結合を用いた試薬
としては、特開昭58−30667号(スイス特許出願6989/81
−01号)に標識化された免疫活性物質が提案されてい
る。しかし、この技術は免疫物質が酵素で標識させてお
り、酵素活性を測定するための処理が面倒であるという
問題がある。
を測定する方法において、測定感度をさらに向上させる
ためには、蛋白分子1個あたりの蛍光色素の結合量を増
やす必要があり、このために、生体活性物質を反応活性
基を多数有する化合物に結合させ、各反応活性基に蛍光
色素が多数結合した化合物を結合させることに想達し
た。また、蛍光色素の発する光を効率良く集光し、測定
できるような光ファイバーからなる検出部と、これを具
備する装置、及びこれら試薬と装置を使用した測定方法
の開発に成功した。
の反応活性基を有する化合物に結合し、該複数の反応活
性基を有する化合物の反応活性基には、複数の蛍光色素
で修飾された化合物が結合していることを特徴としてい
る。
れる色素を指し、化学発光や生物発光する蛍光色素を意
味しない。前記光は、レーザ光などのコヒーレント光が
望ましい。
する化合物の反応活性基の大部分に、複数の蛍光色素で
修飾された化合物が結合した該複数の反応活性基を有す
る化合物を、生体活性物質と結合させることにより、生
体活性物質当りの蛍光色素の結合量を増やすことによ
り、検出感度を飛躍的に向上させるものである。
ドロキシル基、カルボキシル基、ホルミル基などが挙げ
られるが、特にアミノ基が望ましい。この理由は、アミ
ノ基は比較的反応活性が高く、生成した結合が安定なた
めである。
存在していることが望ましい。この理由は、20個より少
ない場合は、検出感度の向上が期待できず、100000個よ
り多い場合、このような高分子を溶媒に溶解させること
が困難なためである。前記反応活性基は、1分子当り30
00〜6000個存在していることがより好ましく、4000〜50
00個が好適である。
カンあるいはポリアミノペプチドなどの化合物であるこ
とが望ましい。この理由は、これらの化合物には4000〜
5000個のアミノ基が存在しているためである。
トサミン、ポリノイラミン酸などを用いることができる
が、キトサンを用いることが好適である。
以上有するアミノ酸がペプチド結合により重合したもの
であって、ポリリジンなどが挙げられる。
子量1000程度の準高分子(semi−hight molecule)以上
の分子量をもつ天然高分子化合物であることが望まし
い。
ン、プロテインA、抗体、ホルモン、ホルモンレセプタ
ーなどが望ましい。
との結合、及び複数の反応活性基を有する化合物の反応
活性基と複数の蛍光色素で修飾された化合物との結合
は、適当な架橋剤を用いることができる。
質を介して、前記複数の反応活性基を有する化合物に結
合されていることが好ましい。
体、ホルモン又はホルモンレセプターである場合、それ
ぞれビオチン、抗体、プロテインA、ホルモンレセプタ
ー、ホルモンを介して前記複数の反応活性基を有する化
合物と結合し、特に「アビジン−ビオチン」の組合せが
好適である。
は、アビジンの表面に多数存在するアミノ基に蛍光色素
を結合させる。
た場合は、蛍光色素をプロテインA、抗体、いずれに結
合させてもよい。
ン様の結晶蛋白であって、ビオチンに対して選択的に非
常に高い親和性を持っている。またアビジンは、熱、p
H、化学修飾などに対して安定である上、等電点が10で
あることから、分子表面に多くのアミノ基をもつので、
アビジンは蛍光色素で修飾するのに適する。
との結合に寄与するものもあるので、アビジン1分子あ
たり2〜10個の蛍光色素を結合させることが望ましい。
性基を有する化合物−生体活性物質複合体を標識するこ
とにより、本発明の生体活性物質測定試薬が得られる。
の5%を占める分子量42000の蛋白であり、免疫グロブ
リン(抗体蛋白)と高い親和性をもつため、蛍光色素で
修飾されたプロテインAで、抗体蛋白−複数の反応活性
基を有する化合物−生体活性物質複合体を標識すること
により、本発明の生体活性物質測定試薬が得られる。
る生体活性物質と反応しないことが必要である。
合させることにより、一つの反応活性基に複数の蛍光色
素を結合させることができ、感度を飛躍的に向上させる
ことができる。
とが必要である。
である放射性同位元素による免疫測定(ラジオイムノア
ッセイ)に比べ、遥かに安全な測定ができ、また、化学
発光や生物発光における面倒な発光処理を省略でき、よ
り短時間で精度が高く、再現性のよい測定を実現できる
からである。
ド)であることが望ましく、該レーザ光はHe−Neレー
ザ、あるいは半導体レーザであることが望ましい。この
理由は、上記レーザは、XeランプやArレーザに比べ、小
型で、値段も安価なためである。上記半導体レーザを使
用する場合は、SHG素子(第2高調波発生素子;光の波
長を1/2にする素子)と組み合わせることにより、短波
長領域のレーザ光を発信できる。
励起されることが望ましい。
ギーが高すぎるため化学結合を破壊してしまい、該範囲
より長い波長の場合は、量子収率が低すぎて実用的でな
いからである。
リン誘導体、多環芳香族誘導体、ローダミンイソチオシ
アネート、フルオレセインイソチオシナネート、シアニ
ン色素、フィコビリタンパク、ダンシル誘導体、o−フ
タルアルデヒドなどが使用できるが、特にシアニン色素
が好適である。
チン鎖で結合した構造、 例えば、 (式中、Y及びY′は、O、S、Se、−NH−又は−CH=
CH−を表し、R及びR′は、メチル、エチル、プロピル
のようなアルキル基または、カルボキシエチルのような
カルボキシアルキル基を表し、Xは、ハロゲン原子を表
し、nは0〜3の自然数)で表されるものを指す。
や、現在受信している最も短い波長の半導体レーザ(63
8nm)で励起することができる。
SHG素子と組み合わせた半導体レーザを使用する場合に
比べて、小型化、低コスト化を図ることができる。
シアニン色素が好適に用いられる。
は、nは2である。
となるため、できるだけ温和な条件で反応が短時間のう
ちに終結し、かつ副反応が起こらないで反応活性基と結
合しうるものであることが必要である。そのために官能
基として共役系外にカルボキシル基をもつ上記式(1)
で示されるカルボシアニン系の色素が好適に使用され
る。
できる。
どがあるが、特に蛋白質が望ましい。
体、酵素、ハプテン又は酵素阻害剤であることが望まし
い。
ァイバーに結合されて、励起されることが望ましい。
定試薬を特異的に結合する物質を共有結合させることの
できる反応活性基を、コア表面に有する樹脂製光ファイ
バーが必要である。
ァイバーは、価格が安く、ガラス製光ファイバーに比べ
て研磨加工がしやすく、コア径を大きくできるので多く
の光量を伝送でき、かつコア径を大きくしてもフレキシ
ビリティーが保てる特徴がある。特にポリメタクリル酸
メチル製の光ファイバーの場合、560〜560nm付近の波長
領域の伝送性に優れているからである。
m2であることが望ましい。この理由は、前記範囲より密
度が低い場合、樹脂製光ファイバー表面の反応活性基の
絶対数が少なくなり、測定感度が低下するため実用的で
はなく、また、前記範囲より高い場合、蛍光色素が発す
る蛍光の光ファイバーへの透過率が非常に悪くなるため
である。(第7図参照:ポリメタクリル酸メチルの場
合) さらに前記反応活性基の密度は3.0×1012〜4.0×1013
個/cm2であることが好ましく、1.5×1013〜3.5×1013個
/cm2であることが好適である。この理由は、前記範囲よ
り密度が高い場合は、反応活性基間の距離が短くなるた
め、前記生体活性物質測定試薬の立体障害のため、再現
性が低下し始めるからである。
物質を吸収しない材質で透光性のよいものが必要であ
り、例えば、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル、
ポリエステル、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコ
ール、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネー
ト、あるいはこれらの共重合体などが使用できる。
構造を有している樹脂を主成分としていることが望まし
い。この理由は、光ファイバーの表面に反応活性基を導
入するための架橋剤を反応させやすいからである。
結合、アミド結合、エステル基、カルボキシル基、ホル
ミル基、アミノ基、ヒドロキシル基、エポキシ基、チオ
ール基などが望ましいが、エステル結合あるいはエステ
ル基などのエステル構造が好適である。
する透光性樹脂としては、ポリアクリル酸エステルある
いはポリエステルなどが好ましい。
の内、エステル構造を有するものであって、例えばアク
リル酸、メタクリル酸などのエステル誘導体の重合体か
らなる合成樹脂であり、具体的には、アクリル酸メチ
ル、アクリル酸エチル、メタクリル酸メチルなどの重合
体である。また、前記アクリル酸エステルポリマーの
内、本発明において特に好適に用いられるものは、ポリ
メタクリル酸メチルである。ポリメタクリル酸メチルは
他の樹脂に比べ、透光性がよいからである。
合させる技術は、特開昭59−501873号(米国特許458280
9号)に、ナイロン製光ファイバーの表面に、架橋剤を
用いて抗原、抗体を結合させた例が記載されている。ま
た、光ファイバーではないが、特開昭56−129841号に
は、ポリメタクリル酸メチルやナイロンの吸光度測定セ
ルの表面に蛋白質を結合させる技術が記載されている。
製光ファイバーを使用しており、本発明者らが試したと
ころ、ナイロンファイバーの伝播損失が大きく、本発明
者らが意図するところの高感度測定は困難であった。
させるもので、光ファイバーに固定化するための技術で
はない。
えば、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、メタクリ
ル酸メチルなどのモノマーとスチレンなどのモノマーと
の共重合体であってもよい。
ル基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、エ
ポキシ基、チオール基、イソシアナート基、イソチオシ
アナート基などが挙げられるが、ホルミル基が好適であ
る。この理由は、本発明のファイバーに共有結合される
物質は、生体活性物質であり、その活性を低下させない
温和な反応条件が必要であるが、ホルミル基は前記生体
活性物質、特に蛋白質のアミノ基と容易に反応するから
である。
する。
有していない場合は、樹脂に官能基を導入し、架橋剤と
反応する構造を有している場合には、該構造部に適当な
架橋剤を反応させることにより官能基を導入する。
しく、例えば、グルタルアルデヒド、スクシンジアルデ
ヒド、アジポアルデヒドなどのジアルデヒド、N,N′−
エチレンビスマレイミド、N,N′−o−フェニレンジマ
レイミド、ビスジアゾベンゼン、あるいはヘキサメチレ
ンジイソシアナートなどのジイソシアナート又はジイソ
チオシナートなどが用いられる。
ば、ポリスチレン製光ファイバーにホルミル基を導入す
る場合、側鎖であるベンゼン環をニトロ化し、次いで還
元を行い、これをアミノ基とした後、グルタルアルデヒ
ドを反応させることによりホルミル基を導入できる。
製光ファイバーは、エステル構造を有する樹脂を主成分
とする樹脂製光ファイバーのコア表面にホルミル基を持
った形態である。
製光ファイバーの露出したコア表面に、多官能性化合物
として、ホルミル基を有する求核試薬を反応させて、コ
ア表面にホルミル基を導入することにより製造される。
表される試薬が好適である。
はホルミル基を表し、nは0〜5の整数を表す) 前記式(2)で表される試薬としては、グルタルアル
デヒド、スクシンアルデヒドが挙げられる。
記反応式では、ポリメタクリル酸メチル)のエステル基
に求核的に反応する。
ド層を剥離してコア表面を露出させることが望ましい。
断面の直径は0.97mm位(断面積は0.739mm2)しかないの
で、活性基を多く導入するためには、クラッド層を剥離
してコア表面積を増やす必要があるためである。
しい。前記研磨は、アルコールを潤滑材とすることが好
ましい。
基、エタノールなどのアルコール系有機溶媒、NiSO4の
ようなNi塩のエタノール溶液、およびホルミル基を有す
る求核試薬を添加溶解させて調製することが望ましい。
同時に、ホルミル基の酸化やOH基の付加を防止するから
である。
浸漬して、エステル構造に反応させるが、反応温度は適
宜調節することが望ましい。
ると、アセタール化したアルコールが脱離して、ホルミ
ル基が結合した樹脂製光ファイバーが得られる。(下記
反応式参照) (測定用検出部) 本発明の生体活性物質測定用の検出部は、前記樹脂製
光ファイバーの反応活性基に被測定物質と特異的に結合
する物質を共有結合させることが必要である。
あることが望ましく、抗原、抗体、酵素、ハプテン、酵
素阻害物などが考えられる。
の場合、被測定物質と特異的に結合する物質を反応させ
た後、固定化処理を行うことが望ましい。この理由は、
固定化処理を行わない場合、被測定物質と特異的に結合
する物質が可逆反応で離脱しやすいからである。
る物質として蛋白質を選んだ場合について、以下に説明
する。
白溶液中に浸漬すると、ホルミル基が蛋白質のアミノ基
と反応して結合部位はイミノ基となる。これを水で洗浄
後、適当な濃度の還元剤、例えばNaBH4などで処理する
ことにより、イミノ基が還元されて不活性化し、蛋白質
が固定化される。
にて覆われていてもよく、第3図に示すような対向型で
もよく、また、第2図に示すような先端にミラー12のつ
いた反射型でもよい。
入射され、蛍光は検出部が取りつけられている光ファイ
バー3を伝播する。一方、反射型は、励起光は検出部が
取りつけられている光ファイバー3を伝播して入射さ
れ、励起光は、先端のミラー12にて反射され、前記光フ
ァイバー3を伝播する。
反応にて製造されるが、本発明の複数の蛍光色素で修飾
された蛋白質を製造するには、蛍光色素と蛋白質とを反
応させて、反応生成物から溶媒を除去した残留物をpHが
2〜7の緩衝液に懸濁させ、未反応色素を分離除去する
ものである。
蛋白質は溶解するが、未反応の蛍光色素は溶解しないた
め、容易に分離できるからである。
を起こしてしまい、またpHが7以上の場合は、蛍光色素
が溶解してしまうためである。
特にシアニン色素で修飾されたアビジンを製造する場合
には、6.5±0.5が好適である。
酸性蛍光色素であることが望ましい。
とが望ましい。
セインイソチオシアネートなどが用いられる。
ノスタン、酵素、ホルモンなどが考えられるが、塩基性
蛋白質(PI≧7なる蛋白質)であることが望ましい。こ
の理由は、前記塩基性蛋白質は、疎水性の蛍光色素が結
合していても、前記pHが2〜7の緩衝液中で良好な溶解
性を示すからである。
カルボジイミド、ジ−p−トルオイルカルボジイミドの
ようなカルボジイミド試薬を用いることにより、蛋白質
のアミノ基と蛍光色素の反応活性基とを縮合させる。
あればよく、例えばメタノール、エタノール、メチルア
ミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミ
ンのような有機溶媒又は塩基性水溶液のような溶媒中で
行う。
応を起こし、蛋白質の持つ反応特異性(抗原抗体反応
や、蛋白質がアビジンの場合にビオチンに対する反応
性)が失活してしまわないように、必要により酢酸など
を用いて反応を停止させる。
せ、pHが2〜7の緩衝液に溶解させる。
により、蛍光色素を容易に分離できる。
澄み液をガラスウールを充填した管に通すことにより、
除去できる。
に結合する2種類の化合物、化合物Aと化合物Bを含
み、生体活性物質が複数の反応活性基を有する化合物に
結合し、該複数の反応活性基を有する化合物の反応活性
基には化合物Bが結合し、該化合物Bには複数の蛍光色
素で修飾された化合物Aが結合したもの(簡略化の為、
以後、蛍光色素−化合物A−化合物B−複数の反応活性
基を有する化合物−生体活性物質という)は、以下の方
法で製造することが望ましい。
物の大部分の反応活性基に反応させ、複数の反応活性基
を有する化合物を化合物Bで修飾した後、生体活性物質
を反応させ、化合物B−複数の反応活性基を有する化合
物−生体活性物質複合体とした後、蛍光色素で修飾され
た化合物Aを反応させて、蛍光色素−化合物A−化合物
B−複数の反応活性基を有する化合物−生体活性物質複
合体を製造する。
合、副反応がおき、収率が低下してしまうからである。
わせは、蛋白質と該蛋白質と特異的に結合する化合物で
あることが望ましく、具体的には、アビジンとビオチ
ン、プロテインAと抗体、抗体とプロテインAなどが好
ましく、特にアビジンとビオチンの組み合わせが最適で
ある。
(I)は分子中に多数のアミノ基を有しており、キトサ
ン(I)にビオチン(II)を塩基性溶液中、水溶性カル
ボジイミド(CHMC)、N−ヒドロキシスクシンイミドの
ような脱水剤の存在下で反応させると、大部分のキトサ
ンのアミノ基にビオチンが酸アミド結合してビオチン化
キトサン(III)を得る。このビオチン化キトサン(II
I)に生体活性物質である蛋白質を上記と同様の脱水剤
を用いて反応させ、キトサン(I)の残余の遊離アミノ
基に蛋白質が結合したビオチン化キトサン(IV)を得
る。
素、例えばシアニン色素のカルボキシル基と蛋白質であ
るアビジンのアミノ基とを上記と同様の方法で反応させ
て得ることができる。
V)に上記蛍光色素で修飾したアビジン(V)を反応さ
せると、アビジンはビオチンと選択的に非常に高い親和
力を持って結合し、本発明の蛍光標識蛋白(VI)を得る
ことができる。
ミノ基と有機溶媒中で、例えばジシクロヘキシルカルボ
ジイミドのような脱水縮合剤を用いて、常法により容易
に縮合させてアミド結合させることができる。シアニン
色素とアビジンとの反応終了後、未反応物はなるべく除
去することが好ましく、例えば透析法、遠心分離法、ゲ
ル過法又は過材を用いる過法などによって除くこ
とができる。
アミド結合は、pH6で励起波長225.5nmのとき、450nm、3
00nm及び490nmの各付近に特徴的な蛍光ピークをもつ。
の濃度間とは、直線関係があるので、この特性を利用し
てキトサンの検量線を作成し、ビオチン化量を酸アミド
結合量から推定できる。
について説明する。
は、次のような方法で行われる。
測定物質と特異的に反応する物質からなる複合体を、光
ファイバー上の被測定物質と特異的に結合する物質又は
被測定物質と、特異的に反応させた後、光にて励起し、
蛍光を測定することを特徴とする測定方法。
異的に反応する物質を、光ファイバー上の被測定物質と
特異的に結合する物質又は被測定物質と、特異的に反応
させた後、蛍光色素で修飾されたアビジンを反応させ、
光ファイバー上にアビジン−ビオチン結合により複合体
を形成させた後、光にて励起し、蛍光を測定することを
特徴とする測定方法。
が、複数の反応活性基を有する化合物に結合し、該複数
の反応活性基を有する化合物の反応活性基には、複数の
蛍光色素で修飾された化合物が結合している試薬を、光
ファイバー上の被測定物質と特異的に結合する物質又は
被測定物質と、特異的に反応させた後、光にて励起し、
蛍光を測定することを特徴とする測定方法。
化合物Bとするとき、被測定物質あるいは被測定物質と
特異的に反応する物質が、複数の反応活性基を有する化
合物に結合し、該反応活性基には化合物Bが結合してい
る試薬を、光ファイバー上の被測定物質と特異的に結合
する物質又は被測定物質と特異的に反応させた後、蛍光
色素で修飾された化合物Aを反応させ、光ファイバー上
に化合物A−化合物Bの結合により、複合体を形成させ
た後、蛍光色素を光にて励起し、蛍光を測定することを
特徴とする測定方法。
ン−被測定物質又は被測定物質と特異的に結合する物質
からなる複合体を試薬として用いることが必要である。
質又は被測定物質と特異的に反応する物質を標識とする
と、蛍光色素の結合量は限られ、また蛍光色素の結合に
よって被測定物質又は被測定物質と特異的に反応する物
質の結合活性部位が損傷する恐れがある。
り、結合活性部位を損傷することなく、多くの蛍光色素
を結合させることができる。
結合する物質又は被測定物質と特異的に反応させた後、
光にて励起させる。
り、励起光と蛍光を伝播でき、効率的な測定が可能であ
るからである。
い。
m)や半導体レーザ(638nm)で励起することができ、装
置の小型化や低コスト化が可能である。
るだけ温和な条件で反応が短時間のうちに終結し、かつ
副反応が起こらないで反応活性基と結合しうるものであ
ることが必要であり、そのために官能基として、共役系
外にカルボキシル基をもつ下記式で示されるカルボシア
ニン系の色素が好適に使用される。
ニン色素のカルボキシル基と蛋白質のアミノ基を有機溶
媒中で、カルボジイミドのような脱水縮合剤の存在化で
アミド結合を形成させることにより得られる。この際、
未反応の色素は分離する。
LED光であることが望ましい。
る。
ビオチン−被測定物質からなる濃度既知の試薬を混合
し、そこに、被測定物質と特異的に結合する物質が固定
化された光ファイバーを浸漬し、特異的に反応させた
後、光にて励起し、蛍光を測定する方法である。前記競
合法の場合、光ファイバーには、被測定試料と、蛍光色
素−アビジン−ビオチン−被測定物質からなる試薬が、
それぞれの濃度比に従って結合する。
ビジン−ビオチン−被測定物質からなる試薬の結合量が
相対的に減り、蛍光強度は低下し、濃度−蛍光強度の検
量線の傾きは負になる。
特異的に結合する物質が固定化された光ファイバーを入
れる。前記光ファイバーには、その濃度に従って被測定
物質が結合される。該被測定物質が結合された光ファイ
バーを、蛍光色素−アビジン−ビオチン−被測定物質と
特異的に結合する物質からなる試薬の溶液に浸漬する。
前記光ファイバーには、蛍光色素−アビジン−ビオチン
−被測定物質と特異的に結合する物質からなる試薬が結
合する。
測定試料と同じ数の蛍光色素−アビジン−ビオチン−被
測定物質と特異的に結合する物質からなる試薬が結合す
る。
ビジン−ビオチン−被測定物質と特異的に結合する物質
からなる試薬の結合量が増え、蛍光強度は増加し、濃度
−蛍光強度の検量線の傾きは正になる。
様の効果を有するが、この方法では、初めにビオチンが
結合した被測定物質又は被測定物質と特異的に反応する
物質を、光ファイバー上の被測定物質と特異的に結合す
る物質又は被測定物質と、特異的に反応させた後、蛍光
色素で修飾されたアビジンを反応させることが必要であ
る。
結合させるため、蛍光色素の加水分解や酸化に伴う蛍光
強度の低下を防止でき、再現性の高い測定を行うことが
できるからである。
い。
LED光であることが望ましい。
る。
からなる濃度既知の試薬を混合し、そこに被測定物質と
特異的に結合する物質が固定化された光ファイバーを入
れ、特異的に反応させた後、蛍光色素で修飾されたアビ
ジンを結合させ、光にて励起、測定する方法である。前
記競合法の場合、光ファイバーには、被測定試料と、蛍
光色素−アビジン−ビオチン−被測定物質からなる試薬
が、それぞれの濃度比に従って結合する。
ビジン−ビオチン−被測定物質からなる試薬の結合量が
相対的に減り、蛍光強度は低下し、濃度−蛍光強度の検
量線の傾きは負になる。
特異的に結合する物質が固定化された光ファイバーを入
れる。前記光ファイバーには、その濃度に従って、被測
定物質が結合される。該被測定物質が結合された光ファ
イバーを、ビオチン−被測定物質と特異的に結合する物
質からなる試薬の溶液に浸漬する。前記ファイバーに
は、ビオチン−被測定物質と特異的に結合する物質から
なる試薬が結合する。前記ビオチン−被測定物質と特異
的に結合する物質からなる試薬が結合した光ファイバー
に、蛍光色素で修飾されたアビジンを結合させる。
測定試料と同じ数の蛍光色素−アビジン−ビオチン−被
測定物質と特異的に結合する物質が結合する。
ビジン−ビオチン−被測定物質と特異的に結合する物質
の結合量が増え、蛍光強度は増加し、濃度−蛍光強度の
検量線の傾きは正になる。
異的に反応する物質が、複数の反応活性基を有する化合
物に結合し、該複数の反応活性基を有する化合物の反応
活性基には、複数の蛍光色素で修飾された化合物が結合
している試薬を使用することが必要である。
蛍光色素の結合量を増やすことができ、検出感度を飛躍
的に向上させることができる。
い。
ジンであることが好ましく、ビオチンを介して複数の反
応活性基を有する化合物の反応活性基に結合しているこ
とが望ましい。
ノグルカンから選ばれることが望ましく、特にキトサン
が好適である。
光あるいはLED光であることが望ましい。
る。
応活性基を有する化合物に結合し、該複数の反応活性基
を有する化合物の反応活性基には、複数の蛍光色素で修
飾された化合物が結合している試薬を混合し、そこに、
被測定物質と特異的に結合する物質が固定化された光フ
ァイバーを浸漬し、特異的に反応させた後、光にて励起
し、蛍光を測定する方法である。前記競合法の場合、光
ファイバーには、被測定試料と、前記試薬とが、それぞ
れの濃度比に従って結合する。
合量が相対的に減り、蛍光強度は低下し、濃度−蛍光強
度の検量線の傾きは負になる。
特異的に結合する物質が固定化された光ファイバーを入
れる。前記光ファイバーには、その濃度に従って被測定
物質が結合する。該被測定物質を結合した光ファイバー
を、被測定物質と特異的に結合する物質が複数の反応活
性基を有する化合物に結合し、該複数の反応活性基を有
する化合物の反応活性基には、複数の蛍光色素で修飾さ
れた化合物が結合している試薬の溶液に入れる。
測定試料と同じ数の測定試薬が結合する。
合量が増え、蛍光強度は増加し、濃度−蛍光強度の検量
線の傾きは正になる。
質を化合物A、化合物Bとするとき、最初に、被測定物
質又は被測定物質と特異的に反応する物質が、複数の反
応活性基を有する化合物に結合し、該反応活性基には化
合物Bが結合している試薬を、光ファイバー上の被測定
物質と特異的に結合する物質又は被測定物質と、特異的
に反応させた後、蛍光色素で修飾された化合物Aを反応
させることが必要である。
の蛍光色素量を増やすことができ、なお且つ、蛍光色素
の加水分解や酸化に伴い蛍光強度の低下を防止でき、再
現性の高い測定を行うことができるからである。
い。
−ビオチン、プロテインA−抗体、抗体−プロテインA
の組合せが望ましく、特にアビジン−ビオチンの組合せ
が好適である。
測定物質と特異反応をおこさないものであることが必要
である。
ノグルカンから選ばれることが好ましく、特にキトサン
が好適である。
光あるいはLED光であることが望ましい。
る。
応活性基を有する化合物に結合し、該反応活性基には化
合物Bが結合している濃度既知の試薬を混合し、そこ
に、被測定物質と特異的に結合する物質が固定化された
光ファイバーを浸漬し、特異的に反応させた後、蛍光色
素で修飾された化合物Aを結合させ、光にて励起し、蛍
光を測定する方法である。前記競合法の場合、光ファイ
バーには、被測定試料と前記試薬とが、それぞれの濃度
比に従って結合する。
量が相対的に減り、蛍光強度は低下し、濃度−蛍光強度
の検量線の傾きは負になる。
特異的に結合する物質が固定化された光ファイバーを浸
漬する。前記光ファイバーには、その濃度に従って被測
定物質が結合する。該被測定物質を結合した光ファイバ
ーを、被測定物質と特異的に結合する物質が複数の反応
活性基を有する化合物に結合し、該反応活性基には化合
物Bが結合している試薬の溶液に入れる。前記ファイバ
ーには試薬が結合する。前記被測定物質と特異的に結合
する物質が複数の反応活性基を有する化合物に結合し、
該反応活性基には化合物Bが結合している試薬が結合し
た光ファイバーに、蛍光色素で修飾された化合物Aを結
合させる。
測定試料と同じ数の試薬が結合する。
が増え、蛍光強度は増加し、濃度−蛍光強度の検量線の
傾きは正になる。
を有する化合物に結合し、該複数の反応活性基を有する
化合物の反応活性基には、複数の蛍光色素で修飾された
化合物が結合している前記生体活性物質測定試薬を利用
して生体活性物質を測定するための装置である。
光源及び励起光又は蛍光を伝播するための光ファイバー
と、その一方の端面のコア表面を露出させ、その表面に
被測定物質と特異的に結合する物資を固定化した検出
部;検出部で励起された蛍光のみを取り出す機構;並び
に検出部で励起された蛍光の強度を測定するためのフォ
トカウンターからなることを特徴とする。
よって、励起光と蛍光を伝播でき、光損失がなく、効率
の良い測定ができる。
この理由は、樹脂の方が低価格であり、使用しやすいか
らである。
することが望ましい。この理由は、架橋剤を介すること
により、生体活性物質を共有結合させ、検出部を形成で
きるからである。
が望ましい。
(メタ)アクリル酸エステル樹脂又はポリエステル樹脂
が好適である。
反応活性基を有する化合物に結合し、該複数の反応活性
基を有する化合物の反応活性基には、複数の蛍光色素で
修飾された化合物が結合している生体活性物質測定試薬
が、測定の際に結合されることが必要である。
可能である。
い。この理由は、前記シアニン色素は、He−Neレーザ光
(630nm)や現在発信している最も短波長の半導体レー
ザ(638nm)で励起できるため、大型で高価なXeランプ
やArレーザ又は、高価なSHG素子(光の波長を1/2にする
素子)を使用する必要もないため、安価で小型の装置を
得ることができるからである。
ーから連結器により、脱着可能であることが望ましい。
イプが好適である。
とが必要で、He−Neレーザ、半導体レーザ、半導体レー
ザとSHG素子を組み合わせたレーザ、又はLED(発光ダイ
オード)であることが望ましい。
ルターなどが考えられるが、フィルターであることが望
ましい。
置するためのスペースが必要で、小型化しにくいからで
ある。前記ハーフミラーは検出部が反射型の場合に、ま
た前記フィルターは検出部が対向型の場合に主に使用さ
れている。
い。
かした。
(1)で得られた溶液を添加した。
ルボジイミド)を添加した。さらに撹拌しながら、5時
間〜一晩室温で反応させた。
合液4mを加えて、ビオチン化キトサンを沈澱させた。
と0.1g/mNa2CO3緩衝液で沈澱を洗浄した。
ウム−リン酸緩衝液(pH=7)で一晩、4℃で透析して
ビオチン化キトサンを得た。
Y)溶液と、CHMCを添加して、4℃で1夜反応させた。
反応終了後、12時間透析を行い、さらに、陰イオン交換
カラムを用いて未反応物を除去し、抗体が結合したビオ
チン化キトサンを得た。
のエタノールに溶解させた。次いで、2mgのNK1160(日
本感光色素研究所製;前記式(1)においてn=2のシ
アニン色素)を加えて充分に溶解させ、溶液を作成し
た。さらに前記溶液にジシクロヘキシルカルボジイミド
14mgを加えて、室温で4時間反応させた。
チルアミンを減圧除去した。
緩衝液(pH=6.5)2mに懸濁した後、遠心分離器を用
いて5000rpmで10分間遠心分離を行って、上澄みを採取
し、再度遠心分離にかけてNK1160で修飾されたアビジン
の溶液を得た。
の樹脂製光ファイバー(三菱レイヨン製、商品名:エス
カ)の先端を酢酸エチルに浸して拭きとり、クラッド層
を1cm剥離し、水洗した。ついで、光ファイバーの端面
をエタノールを潤滑剤としてポリシングフィルムで研磨
した。
タノール2.5mを加えた。この時、白色沈澱が生ずるた
め、これを3000rpmで遠心分離して上澄液を採取し、こ
れのNi−エタノール溶液とした。
タノール溶液0.1mを加え、さらに50%グルタルアルデ
ヒドを50μ添加し反応溶液とした。
脂製光ファイバーを50℃で10分間浸漬した後水洗した。
で洗浄し、樹脂製光ファイバーのコア部分表面にホルミ
ル基を導入した。
にホルミル基を導入した場合の、処理温度と、固定可能
な酵素(蛋白質)量との関係、及び第6図(a)には処
理温度とファイバーの光伝送率との関係を示す。
送減少率の関係を第7図に示す。
ると光伝送率が向上するが、反応温度が高くなると、結
合するホルミル基の密度が増えるため、光伝送率が低下
する。このため、第6図(a)に示すように、最も好適
な温度は、50℃付近となる。
ーゼに対するモノクローナル抗体であるマウスIgG抗原
4 1mgをりん酸緩衝生理食塩水(pH=7.5)に溶かし
た。この溶液に樹脂製光ファイバーを4℃で12時間浸漬
した。
浄した後、1%NaBH4水溶液に15分間浸漬した後、水で
洗浄してマウスIgG抗原4を固定化し、抗原固定化セン
サーとした。
検出部とした。
成した検出部5に浸漬した後、リン酸緩衝生理食塩水を
通して洗浄した。
化キトサン溶液に検出部5を浸漬した後、リン酸緩衝生
理食塩水を通して洗浄した。
アビジン溶液を検出部5に浸漬した後、リン酸緩衝生理
食塩水を通して洗浄した。
ザ光学系で蛍光を分光光度計8を用いて測定した。
(22)と同様の測定を繰り返し、抗マウスIgG(Y)の
濃度と蛍光強度の関係を調べ検量線を作成した。これ
を、第8図の(a)に示す。また、センサーの応答性を
第9図に示す。
た。
体が結合したビオチン化キトサン溶液、NK1160で修飾さ
れたアビジン溶液、抗原固定化センサー及び検出部を作
成した。
で作成した抗体が結合したビオチン化キトサン溶液を1:
1の割合で混合し、第1図に示すフローセル5に通した
後、リン酸緩衝生理食塩水を通して洗浄した。
ビジン溶液をフローセル5に通した後、リン酸緩衝生理
食塩水を通して洗浄した。
方法にて抗マウスIgG(Y)の濃度と蛍光強度の関係を
調べ、検量線を作成した。検量線を第8図(b)に示
す。
た。
かした。
溶液の2mに前記(1)で得た溶液を添加した。
ルボジイミド)を添加した。さらに撹拌しながら一晩4
℃で反応させた。
液4mを加えて抗体蛋白が結合したβ−1,4−ポリガラ
クトサミンを沈澱させた。
と0.1g/mのNa2CO3緩衝液で沈澱を洗浄した。
ウム−リン酸緩衝液(pH=7)に懸濁し、1晩4℃で透
析して、抗体蛋白が結合したβ−1,4−ポリガラクトサ
ミンを得た。
懸濁液に、抗マウスIgG(Y)溶液と、CHMCを添加し
て、4℃で1夜反応させた。反応終了後、12時間透析を
行い、さらに、陰イオン交換カラムを用いて未反応物を
除去し、抗体蛋白結合β−1,4−ポリガラクトサミンを
得た。
のエタノールに溶解させた。次いで、2mgのNK1160
(日本感光色素研究所製)を加え、充分に溶解させ、溶
液を作成した。さらに前記溶液にジシクロヘキシルカル
ボジイミド14mgを加えて、室温で4時間反応させた。
緩衝液(pH=6.5)2mに懸濁した後、遠心分離機を用
いて5000rpmで10分間分離を行って、上澄みを採取し、
再度遠心分離にかけてNK1160で修飾されたプロテインA
の溶液を得た。
ラクトサミンと、前記NK1160で修飾されたプロテインA
とを、リン酸緩衝生理食塩水中4℃で反応させ、シアニ
ン色素−プロテインA−抗体蛋白−β−1,4−ポリガラ
クトサミン−抗体 の複合体溶液を得た。
代わりに、スクシンジアルデヒドを用い、ポリメタクリ
ル酸メチル製光ファイバーの代わりに、ポリエステルを
含有する光ファイバーを使用し、実施例1の(12)〜
(18)と同様の方法にて第1図に示す検出部を作成し
た。
2)で得たシアニン色素−プロテインA−抗体蛋白−β
−1,4−ポリガラクトサミン−抗体 の複合体溶液を1:1の割合で混合し、第1図に示すフロ
ーセル5を通し、次いでリン酸緩衝生理食塩水を通して
洗浄した後、第5図に示す本発明の装置にてHe−Neレー
ザ光学系で蛍光を分光蛍光光度計8で測定した。抗マウ
スIgG(Y)の濃度を変え、同様の測定を繰り返して抗
マウスIgG(Y)の濃度と蛍光強度の関係を調べ、検量
線を作成した。検量線から検出限界を測定し、これを第
1表に示した。
が結合したビオチン化キトサン溶液を作成した。
ート1.8mgを、0.5M炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウ
ム緩衝液(pH=9.0)からなる塩基性溶媒5mに溶解さ
せ、4℃で光を遮断して撹拌を続け、20時間反応させ
た。
で溶媒を留去した。
5mに懸濁させた。
除去して上澄みを採取した。
し、さらに得られた上澄みをガラスウールを充填した管
に通して未反応色素を除去し、フルオレセインイソチオ
シアナートで修飾されたアビジンを得た。
固定化センサー及び検出部を作成した。
すフローセル5に通した後、リン酸緩衝生理食塩水を通
して洗浄した。
トサン溶液をフローセル5に通した後、リン酸緩衝生理
食塩水を通して洗浄した。
ナートで修飾されたアビジンの溶液をフローセル5に流
した後、リン酸緩衝生理食塩水を通して洗浄した。
ザと薄膜導波路型SHG素子を組み合わせたレーザ光学系
(波長490nm)と分光光度計8を用いて蛍光を測定し
た。
(11)と同様の測定を繰り返し、抗IgG(Y)の濃度と
蛍光強度の関係を調べ検量線を作成した。
た。
(11)の処理を行った後、0.17g/mの飽和硫酸ナトリ
ウム(溶媒:10mMカリウムリン酸緩衝液、pH=7)4m
を加え、2000rpmで10分遠心分離し、4℃で1時間放置
した。
た。
析して濃縮して使用した。
た。
加えて溶かし、12℃で2時間放置し、この溶液を用い
て、実施例1の(2)以降の処理を行った。検量線から
検出限界を測定し、これを第1表に示した。
ジンを使用した。反応条件は実施例1の条件に準ずる。
検量線から検出限界を測定し、これを第1表に示した。
1160で修飾されたアビジンの溶液を得た。
℃で12時間浸漬した。
原を固定化した。
ン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。
浄した。
から第1図の装置で測定した。
線を作成し、これから検出限界を測定し、これを第1表
に示した。
せて検出試薬を作成し、この試薬と、濃度既知の抗マウ
スIgG溶液を1:1の割合で混合し、実施例7の検出部を浸
漬し、測定を行い検量線を作成し、これから検出限界を
測定し、これを第1表に示した。
で修飾されたアビジンの溶液を得た。
して得られた抗IgG結合のキトサン溶液を混合して、グ
ルタルアルデヒドを加え、カルボジイミドの存在下、50
℃で加温することにより、アビジンのアミノ基のキトサ
ンのアミノ基をグルタルアルデヒドで架橋して、NK1160
−アビジン−(グルタルアルデヒド)−キトサン−抗Ig
Gの溶液を得た。
ムの存在下、ギ酸無水物を反応させ、ポリスチレンのフ
ェニル基にホルミル基を導入し、次いで、1,6−ヘキサ
ンジアミンをカルボジイミドの存在下にて反応させた
後、1%のNaHB4で還元した。
縮合させ、検出部5を作成した。
て、実施例2と同様に、競合法にて測定した。
た。
排除し、露出したコア部表面3に抗原4を結合させると
ともに、前記コア表面部3をフローセル5で囲んだ構造
を有する検出部である。
設けられている。
る。蛍光検出部(センシングチップ)9が光軸合わせの
ためのガイド11でとめられており、接着されていないの
で蛍光検出部9を自由に着脱でき、実用上非常に都合が
よい。この蛍光検出部9は、測定の度に交換することか
ら、コスト面から考えて、樹脂製光ファイバーであるこ
とが望ましい。前記樹脂製光ファイバーには、種々の方
法にて反応活性基を導入する。前記樹脂製光ファイバー
は、ポリアクリル酸エステルなどのエステル構造を持つ
ものが好ましく、前記蛍光検出部を樹脂製光ファイバー
で作成する場合には、このエステル基に>CH−CHO構造
をもつ化合物を塩基性条件下で反応させ、ホルミル基を
導入し、このホルミル基に抗原あるいは抗体などの蛋白
質を結合させる。
される。
9へレーザ光が入射し、入射光と蛍光が光軸合わせのた
めのガイド11を有するプラスチックファイバーへ入射
し、フィルター7にて、蛍光のみが取り出され、分光光
度計8で測定が行われる。
を示す。
血液又は体液中に極微量含まれている抗原、抗体、酵素
などの生体活性物質の免疫測定法を用いることができ、
生体活性物質1個当たりの蛍光色素量が多いため、検出
感度を大幅に向上させることができる。
小型、低価格、高感度を実現できる。
明の測定方法により、短時間で、簡便な測定を実現でき
るため、医療分野における疾病診断などに利用できる。
る蛍光測定系を示す。
蛍光を示す。
製光ファイバーの光伝送率の関係を示す。
係を示す。(a)及び(b)図の横軸は処理温度(c
゜)、(a)図の縦軸はファイバーの光伝送率(%)、
(b)図の縦軸は面積当りの酵素固定化量(μg/c
m2)、(c)図の横軸はビオチン化抗マイス抗体濃度
(mg/m),縦軸はカウント数を示す。
強度の検量線を示す。
伝送率とホルミル基の密度の関係を示す。横軸はホルミ
ル基の数(個/cm2)、縦軸はファイバーの光伝送減少率
(%)を示す。
量線を示す。横軸は抗マウスIgG(mg/m)、縦軸はカ
ウント数を示す。
IgG(10-3mg/m)への浸漬時間(分)、縦軸はカウン
ト数を示す。
4は抗原、5はフローセル、 は本発明の蛍光標識抗体、Yは試料中の抗体、6はHe−
Neレーザ発生装置又は半導体レーザとSHG素子を組み合
わせたレーザ発生装置、7はフィルター、8は分光蛍光
光度計、9はセンシングチップ、10はプレート、11は光
軸合わせのためのガイドレール、12はミラー、13はハー
フミラー。
Claims (19)
- 【請求項1】生体活性物質が、アミノグルカンに結合
し、該アミノグリカンのアミノ基には、複数の蛍光色素
で修飾されたアビジンが結合していることを特徴とする
生体活性物質測定試薬。 - 【請求項2】前記アビジンが、ビオチンを介して該アミ
ノグルカンのアミノ基に結合している、請求項1に記載
の試薬。 - 【請求項3】前記アミノグルカンが、キトサンである、
請求項1又は2に記載の試薬。 - 【請求項4】前記蛍光色素が、レーザ光により励起され
る色素である、請求項1又は2に記載の試薬。 - 【請求項5】前記蛍光色素が、200nm〜800nmのレーザ光
で励起される蛍光色素である、請求項1又は2に記載の
試薬。 - 【請求項6】前記蛍光色素が、クマリン誘導体、多環芳
香族誘導体、ダンシル誘導体、フィコビリタンパク、ロ
ーダミン、フルオレセイン又はo−フタルアルデヒドで
ある、請求項1又は2に記載の試薬。 - 【請求項7】前記蛍光色素が、シアニン色素である、請
求項1又は2に記載の試薬。 - 【請求項8】前記シアニン色素が、 式 (式中、nは0、1、2又は3を表す) で表される色素である、請求項7に記載の試薬。
- 【請求項9】前記生体活性物質が、蛋白質である、請求
項1又は2に記載の試薬。 - 【請求項10】前記生体活性物質が、抗原、抗体、酵
素、ハプテン又は酵素阻害剤である、請求項1又は2に
記載の試薬。 - 【請求項11】ビオチンをアミノグルカンのアミノ基に
反応させた後、生体活性物質を反応させ、ビオチン−ア
ミノグルカン−生体活性物質の複合体とした後、複数の
蛍光色素で修飾されたアビジンを反応させることを特徴
とする、蛍光色素−アビジン−ビオチン−アミノグルカ
ン−生体活性物質の複合体である生体活性物質測定試薬
の製造方法。 - 【請求項12】前記蛍光色素が、レーザ光により励起さ
れる色素である、請求項11に記載の製造方法。 - 【請求項13】前記蛍光色素が、シアニン色素又はフル
オレセインである、請求項11に記載の製造方法。 - 【請求項14】被測定物質又は被測定物質と特異的に反
応する物質が、アミノグルカンに結合し、該アミノグル
カンのアミノ基には、複数の蛍光色素で修飾されたアビ
ジンが結合している試薬を、光ファイバー上の被測定物
質と特異的に反応する物質又は被測定物質と特異的に反
応させた後、光にて励起し、蛍光を測定することを特徴
とする生体活性物質の測定方法。 - 【請求項15】前記アビジンが、ビオチンを介してアミ
ノグルカンのアミノ基に結合している、請求項14に記載
の測定方法。 - 【請求項16】被測定物質又は被測定物質と特異的に反
応する物質がアミノグルカンに結合し、該アミノグルカ
ンのアミノ基にはビオチンが結合している試薬を、光フ
ァイバー上の被測定物質と特異的に反応する物質又は被
測定物質と特異的に結合させた後、蛍光色素で修飾され
たアビジンを反応させ、上記光ファイバー上にアビジン
−ビオチンの結合により複合体を形成させた後、蛍光色
素を光にて励起し、蛍光を測定することを特徴とする生
体活性物質の測定方法。 - 【請求項17】前記アミノグルカンが、キトサンであ
る、請求項14ないし16のいずれか1項に記載の測定方
法。 - 【請求項18】前記蛍光色素が、シアニン色素である、
請求項14ないし16のいずれか1項に記載の測定方法。 - 【請求項19】前記光が、レーザ光である、請求項14な
いし16のいずれか1項に記載の測定方法。
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---|---|---|---|
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