JPH078270A - 石油，廃油資化性新規微生物 - Google Patents
石油，廃油資化性新規微生物Info
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- JPH078270A JPH078270A JP5159560A JP15956093A JPH078270A JP H078270 A JPH078270 A JP H078270A JP 5159560 A JP5159560 A JP 5159560A JP 15956093 A JP15956093 A JP 15956093A JP H078270 A JPH078270 A JP H078270A
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- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 バイオサーファクタントを産生し、石油，
廃油を広く分解・資化する新規微生物を提供すること。 【構成】 シュウドモナス属に属し、バイオサーファ
クタントを産生し、石油，廃油を分解・資化する、シュ
ウドモナス・エルギノサ ＴＹ−２９（ＦＥＲＭ Ｐ−
１３６６７）、及びシュウドモナス・エルギノサ ＴＹ
−３０（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６６８）の新規微生物。
廃油を広く分解・資化する新規微生物を提供すること。 【構成】 シュウドモナス属に属し、バイオサーファ
クタントを産生し、石油，廃油を分解・資化する、シュ
ウドモナス・エルギノサ ＴＹ−２９（ＦＥＲＭ Ｐ−
１３６６７）、及びシュウドモナス・エルギノサ ＴＹ
−３０（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６６８）の新規微生物。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、石油やエンジンオイル
等の廃油を分解・資化する新規微生物に関するものであ
る。
等の廃油を分解・資化する新規微生物に関するものであ
る。
【０００２】
【技術的背景】近年、タンカー事故に伴なう原油流出に
よる海洋汚染や、エンジンオイル等の廃油の焼却処理に
よる大気汚染並びに地中投棄による土壌汚染など、石
油，廃油に起因する環境汚染問題に対する関心が非常に
高まっている。本発明者等は、微生物を用いて石油，廃
油を生物学的に処理するための研究をする中で、石油，
廃油を広く分解・資化する新規微生物を見い出し、本発
明を完成するに至った。
よる海洋汚染や、エンジンオイル等の廃油の焼却処理に
よる大気汚染並びに地中投棄による土壌汚染など、石
油，廃油に起因する環境汚染問題に対する関心が非常に
高まっている。本発明者等は、微生物を用いて石油，廃
油を生物学的に処理するための研究をする中で、石油，
廃油を広く分解・資化する新規微生物を見い出し、本発
明を完成するに至った。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、バイオサー
ファクタント（微生物由来の生分解性界面活性剤）を産
生し、石油，廃油を広く分解・資化して、石油，廃油を
生物学的に処理することが出来る新規微生物を提供せん
とするものである。
ファクタント（微生物由来の生分解性界面活性剤）を産
生し、石油，廃油を広く分解・資化して、石油，廃油を
生物学的に処理することが出来る新規微生物を提供せん
とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明の石油，廃油資化
性新規微生物は、シュウドモナス属に属し、バイオサー
ファクタントを産生し、石油，廃油を分解・資化する微
生物であり、具体的には、シュウドモナス・エルギノサ
ＴＹ−２９（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６６７）、及びシュ
ウドモナス・エルギノサ ＴＹ−３０（ＦＥＲＭ Ｐ−
１３６６８）である。
性新規微生物は、シュウドモナス属に属し、バイオサー
ファクタントを産生し、石油，廃油を分解・資化する微
生物であり、具体的には、シュウドモナス・エルギノサ
ＴＹ−２９（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６６７）、及びシュ
ウドモナス・エルギノサ ＴＹ−３０（ＦＥＲＭ Ｐ−
１３６６８）である。
【０００５】
【実施例】以下、本発明の実施例を説明するが、これら
の実施例は本発明を説明するための一例であって、本発
明の範囲を限定するものではない。
の実施例は本発明を説明するための一例であって、本発
明の範囲を限定するものではない。
【０００６】［新規微生物のスクリーニング］ ＜スクリーニング用培地の調整＞５００ml振盪培養フラ
スコに、ペプトン１ｇと酵母エキス０．５ｇ，塩化ナト
リウム０．５ｇ，及び廃油（使用後のエンジンオイル）
１mlと水１００mlを加え、オートクレーブ（１２１℃／
２０min ）にて滅菌を行ない、スクリーニング用培地と
した。
スコに、ペプトン１ｇと酵母エキス０．５ｇ，塩化ナト
リウム０．５ｇ，及び廃油（使用後のエンジンオイル）
１mlと水１００mlを加え、オートクレーブ（１２１℃／
２０min ）にて滅菌を行ない、スクリーニング用培地と
した。
【０００７】＜前培養用ＬＢ液体培地及び単一菌株分離
用ＬＢ寒天培地の調整＞ペプトン１ｇと酵母エキス０．
５ｇ，塩化ナトリウム０．５ｇに蒸留水１００mlを加
え、オートクレーブ（１２１℃／２０min ）にて滅菌し
た後、２０ml用滅菌試験管に５mlずつ分注し、アルミキ
ャップしたものを前培養用ＬＢ液体培地とした。又、上
記のＬＢ液体培地に寒天を２％加えたものを、単一菌株
分離用ＬＢ寒天培地として用いた。
用ＬＢ寒天培地の調整＞ペプトン１ｇと酵母エキス０．
５ｇ，塩化ナトリウム０．５ｇに蒸留水１００mlを加
え、オートクレーブ（１２１℃／２０min ）にて滅菌し
た後、２０ml用滅菌試験管に５mlずつ分注し、アルミキ
ャップしたものを前培養用ＬＢ液体培地とした。又、上
記のＬＢ液体培地に寒天を２％加えたものを、単一菌株
分離用ＬＢ寒天培地として用いた。
【０００８】而して、１００ml三角フラスコに上記作成
したスクリーニング用培地１００mlを入れ、そこに様々
な場所から採取してきた土壌サンプル０．５ｇを加え、
１５０ｒｐｍの振盪培養器で３０℃，３７℃及び５０℃
にそれぞれ保持して４８時間振盪培養した。振盪培養終
了後、各培養液１００μｌを１０mlの希釈用滅菌水が入
った試験管に分注して希釈し、同様の希釈操作を繰り返
して培養液を１０6 まで希釈した。
したスクリーニング用培地１００mlを入れ、そこに様々
な場所から採取してきた土壌サンプル０．５ｇを加え、
１５０ｒｐｍの振盪培養器で３０℃，３７℃及び５０℃
にそれぞれ保持して４８時間振盪培養した。振盪培養終
了後、各培養液１００μｌを１０mlの希釈用滅菌水が入
った試験管に分注して希釈し、同様の希釈操作を繰り返
して培養液を１０6 まで希釈した。
【０００９】これら各希釈培養液１００μｌを上記作成
した単一菌株分離用ＬＢ寒天培地（プレート）上に広げ
て植菌し、それぞれの温度で２４時間静置培養し、ＬＢ
寒天培地上に成育したコロニーの数，色，形態などを観
察した。
した単一菌株分離用ＬＢ寒天培地（プレート）上に広げ
て植菌し、それぞれの温度で２４時間静置培養し、ＬＢ
寒天培地上に成育したコロニーの数，色，形態などを観
察した。
【００１０】そして、成育したコロニーを単一菌株（シ
ングルコロニー）として、それぞれ１株ずつ採取し、前
記前培養用液体培地に植菌し、シングルコロニーで石
油，廃油を分解・資化可能な菌株を選択した。
ングルコロニー）として、それぞれ１株ずつ採取し、前
記前培養用液体培地に植菌し、シングルコロニーで石
油，廃油を分解・資化可能な菌株を選択した。
【００１１】スクリーニングした結果、石油，廃油を分
解・資化可能な菌株約２０００種類を単離することがで
き、この中から特に有効性が高い２つの菌株について同
定を行なった。
解・資化可能な菌株約２０００種類を単離することがで
き、この中から特に有効性が高い２つの菌株について同
定を行なった。
【００１２】［菌株の同定］ここで分離選別した菌体の
菌学的性質を調べるために、Bergey’s Manual ofSyste
matic Bacteriology に基づき、グラム染色を始めとし
た種々の同定確認試験をそれぞれ下記の手法により行な
った。試験の結果を表１に示す。
菌学的性質を調べるために、Bergey’s Manual ofSyste
matic Bacteriology に基づき、グラム染色を始めとし
た種々の同定確認試験をそれぞれ下記の手法により行な
った。試験の結果を表１に示す。
【００１３】１．グラム染色 Ｈｕｃｋｅｒの変法に従って、スライドガラス上に塗抹
し、乾燥後火炎固定した菌液について、Ｈｕｃｋｅｒの
液（１．５％クリスタルバイオレット−エタノール溶
液）で３０秒間染色した。染色後ただちに水洗いし、Ｌ
ｕｇｏｌ液で１分間媒染した。媒染終了後水洗し、さら
にアルコールで３０秒間脱色し、ただちに水洗した。水
をよく切った後、サフラニンで３０秒間染色を行なっ
た。染色した標本を顕微鏡で観察し、紫色に染色された
菌をグラム陽性とし、赤色に染色された菌をグラム陰性
とした。また、検鏡により被検菌の形態を観察した。
し、乾燥後火炎固定した菌液について、Ｈｕｃｋｅｒの
液（１．５％クリスタルバイオレット−エタノール溶
液）で３０秒間染色した。染色後ただちに水洗いし、Ｌ
ｕｇｏｌ液で１分間媒染した。媒染終了後水洗し、さら
にアルコールで３０秒間脱色し、ただちに水洗した。水
をよく切った後、サフラニンで３０秒間染色を行なっ
た。染色した標本を顕微鏡で観察し、紫色に染色された
菌をグラム陽性とし、赤色に染色された菌をグラム陰性
とした。また、検鏡により被検菌の形態を観察した。
【００１４】２．運動性 肉エキス１０ｇとペプトン１０ｇ，塩化ナトリウム２
ｇ，寒天５ｇ及び蒸留水１０００mlを加えてなる半流動
培地を試験管に分注し、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅
菌した後、高層に固めた。この培地に被検菌を白金線で
穿刺し、３７℃で１８〜２４時間培養した。培養後、培
地全体が混濁した場合に運動性陽性とし、穿刺した白金
線の周りにだけ線状に発育した場合を陰性とした。
ｇ，寒天５ｇ及び蒸留水１０００mlを加えてなる半流動
培地を試験管に分注し、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅
菌した後、高層に固めた。この培地に被検菌を白金線で
穿刺し、３７℃で１８〜２４時間培養した。培養後、培
地全体が混濁した場合に運動性陽性とし、穿刺した白金
線の周りにだけ線状に発育した場合を陰性とした。
【００１５】３．生育温度 下記組成の液状チオグリコレート培地を１２１℃で１５
分間滅菌し、試験管に５mlずつ分注した。この培地に被
検菌を植え、２５℃，３７℃及び４１℃の温度で静置培
養して、１２時間または２４時間後に培地が混濁したも
のを生育したと判断した。 ＜液状チオグリコレート培地の組成＞ Ｌ- シスチン 0.75ｇ 0.1 ％レザズリン 1.0ml 酵母エキス 5.0 ｇ ＮａＣｌ 2.5 ｇ ブドウ糖 5.0 ｇ カゼイン消化物 15.0 ｇ 寒 天 0.75ｇ チオグリコール酸ナトリウム 0.5 ｇ 蒸留水 1000ml ｐＨ ７．２
分間滅菌し、試験管に５mlずつ分注した。この培地に被
検菌を植え、２５℃，３７℃及び４１℃の温度で静置培
養して、１２時間または２４時間後に培地が混濁したも
のを生育したと判断した。 ＜液状チオグリコレート培地の組成＞ Ｌ- シスチン 0.75ｇ 0.1 ％レザズリン 1.0ml 酵母エキス 5.0 ｇ ＮａＣｌ 2.5 ｇ ブドウ糖 5.0 ｇ カゼイン消化物 15.0 ｇ 寒 天 0.75ｇ チオグリコール酸ナトリウム 0.5 ｇ 蒸留水 1000ml ｐＨ ７．２
【００１６】４．発育：ＭａｃＣｏｎｋｅｙ 下記組成のＭａｃＣｏｎｋｅｙ培地を１２１℃で１５分
間高圧蒸気滅菌したのち、平板に固めた。この培地上に
白金線で画線培養（３７℃，２４時間）し、コロニーを
形成したものを陽性とした。 ＜ＭａｃＣｏｎｋｅｙ培地＞ 肉エキス 10ｇ デオキシコール酸 ２ｇ ペプトン 10ｇ ニュートラルレッド 30mg ＮａＣｌ ２ｇ クリスタルバイオレット １mg 乳 糖 10ｇ 蒸留水 1000ml
間高圧蒸気滅菌したのち、平板に固めた。この培地上に
白金線で画線培養（３７℃，２４時間）し、コロニーを
形成したものを陽性とした。 ＜ＭａｃＣｏｎｋｅｙ培地＞ 肉エキス 10ｇ デオキシコール酸 ２ｇ ペプトン 10ｇ ニュートラルレッド 30mg ＮａＣｌ ２ｇ クリスタルバイオレット １mg 乳 糖 10ｇ 蒸留水 1000ml
【００１７】５．ＯＦ（Oxidation or Fermentation ） Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎの方法に従って、下記組成の
ＯＦ培地を１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌し、培地が
６０℃程度に冷めたところで終濃度１％となるように濾
過滅菌したグルコースを加え、得られた培地を２本の試
験管にそれぞれ３mlずつ分注し、高層に固めた。この培
地に被検菌を穿刺し、１本の試験管には流動パラフィン
を１〜２cmの厚さに重層して嫌気的に培養し、他方の試
験管はそのまま好気的に培養した。各菌体の生育温度で
３〜４日間培養した後、酸化的糖分解を行なう菌で好気
的条件で培養した培地色調が黄変したものを（Ｏ）と表
記し、発酵的糖分解を行なう菌で好気的及び嫌気的両条
件で培地色調が黄変したものを（Ｆ）と表記した。 ＜ＯＦ培地の組成＞ トリプトン 2.0 ｇ リン酸水素二カリウム 0.3 ｇ ＮａＣｌ 5.0 ｇ Ｂ．Ｔ．Ｂ． 0.03ｇ 寒 天 2.5 ｇ 蒸留水 1000ml ｐＨ ７．１
ＯＦ培地を１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌し、培地が
６０℃程度に冷めたところで終濃度１％となるように濾
過滅菌したグルコースを加え、得られた培地を２本の試
験管にそれぞれ３mlずつ分注し、高層に固めた。この培
地に被検菌を穿刺し、１本の試験管には流動パラフィン
を１〜２cmの厚さに重層して嫌気的に培養し、他方の試
験管はそのまま好気的に培養した。各菌体の生育温度で
３〜４日間培養した後、酸化的糖分解を行なう菌で好気
的条件で培養した培地色調が黄変したものを（Ｏ）と表
記し、発酵的糖分解を行なう菌で好気的及び嫌気的両条
件で培地色調が黄変したものを（Ｆ）と表記した。 ＜ＯＦ培地の組成＞ トリプトン 2.0 ｇ リン酸水素二カリウム 0.3 ｇ ＮａＣｌ 5.0 ｇ Ｂ．Ｔ．Ｂ． 0.03ｇ 寒 天 2.5 ｇ 蒸留水 1000ml ｐＨ ７．１
【００１８】６．ＳＣ培地 下記組成の培地を蒸留水に溶し約２mlずつ試験管に分注
し、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した後、全斜面に
固めた。斜面部分に被検菌を植え、各菌の生育温度で１
８〜２４時間培養した。この培地に含まれる唯一の炭素
源であるクエン酸を利用し生育した場合を陽性とした。
陽性の場合に、培地に含まれるブロム・チモールが緑色
から深青色に変色した。 ＜ＳＣ培地の組成＞ 塩化ナトリウム 5.0 ｇ 硫酸マグネシウム 0.2 ｇ リン酸二水素アンモニウム 1.0 ｇ クエン酸ナトリウム 2.0 ｇ リン酸水素二カリウム 1.0 ｇ ブロム・チモール青 0.08ｇ 寒天末 15.0 ｇ 精製水 1000ml ｐＨ ６．８
し、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した後、全斜面に
固めた。斜面部分に被検菌を植え、各菌の生育温度で１
８〜２４時間培養した。この培地に含まれる唯一の炭素
源であるクエン酸を利用し生育した場合を陽性とした。
陽性の場合に、培地に含まれるブロム・チモールが緑色
から深青色に変色した。 ＜ＳＣ培地の組成＞ 塩化ナトリウム 5.0 ｇ 硫酸マグネシウム 0.2 ｇ リン酸二水素アンモニウム 1.0 ｇ クエン酸ナトリウム 2.0 ｇ リン酸水素二カリウム 1.0 ｇ ブロム・チモール青 0.08ｇ 寒天末 15.0 ｇ 精製水 1000ml ｐＨ ６．８
【００１９】７．ＮＡＣ培地 下記組成のＮＡＣ培地を９０℃で加熱溶解し、１２１℃
で１分間高圧蒸気滅菌した後、平板に固めた。この培地
上に白金線で画線培養（３７℃，２４時間）し、コロニ
ーを形成したものを成育陽性とし、さらにコロニーに着
色が観察されたものを色素産生陽性とした。 ＜ＮＡＣ培地＞ ペプトン 20.0ｇ リン酸水素二カリウム 0.3ｇ 硫酸マグネシウム 0.3ｇ セトリマイド 0.2ｇ ナリジクス酸 15mg 寒 天 1000ml
で１分間高圧蒸気滅菌した後、平板に固めた。この培地
上に白金線で画線培養（３７℃，２４時間）し、コロニ
ーを形成したものを成育陽性とし、さらにコロニーに着
色が観察されたものを色素産生陽性とした。 ＜ＮＡＣ培地＞ ペプトン 20.0ｇ リン酸水素二カリウム 0.3ｇ 硫酸マグネシウム 0.3ｇ セトリマイド 0.2ｇ ナリジクス酸 15mg 寒 天 1000ml
【００２０】８．ＴＳＩ培地（Ｈ2 Ｓ産生能を含む） 下記組成のＴＳＩ培地を加熱溶解して、試験管に３mlず
つ分注し、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した後、半
斜面に固めた。被検菌を白金線で斜面部に画線すると共
に、高層部に穿刺し、３７℃で２４時間培養した。斜面
部が黄変したものを斜面部陽性（乳糖および白糖のいず
れかを分解し酸を生産）とし、高層部が黄変したものを
高層部陽性（ブドウ糖を発酵的に分解し酸を生産）と
し、また高層部が黒変したものをＨ2 Ｓ陽性とした。 ＜ＴＳＩ培地＞ ペプトン 20.0ｇ 硫酸鉄アンモニウム 0.2ｇ ＮａＣｌ 5.0ｇ チオ硫酸ナトリウム 0.2ｇ 乳 糖 10.0ｇ フェノールレッド 20 mg 白 糖 10.0ｇ 寒 天 12.0ｇ ブドウ糖 1.0ｇ 蒸留水 1000ml
つ分注し、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した後、半
斜面に固めた。被検菌を白金線で斜面部に画線すると共
に、高層部に穿刺し、３７℃で２４時間培養した。斜面
部が黄変したものを斜面部陽性（乳糖および白糖のいず
れかを分解し酸を生産）とし、高層部が黄変したものを
高層部陽性（ブドウ糖を発酵的に分解し酸を生産）と
し、また高層部が黒変したものをＨ2 Ｓ陽性とした。 ＜ＴＳＩ培地＞ ペプトン 20.0ｇ 硫酸鉄アンモニウム 0.2ｇ ＮａＣｌ 5.0ｇ チオ硫酸ナトリウム 0.2ｇ 乳 糖 10.0ｇ フェノールレッド 20 mg 白 糖 10.0ｇ 寒 天 12.0ｇ ブドウ糖 1.0ｇ 蒸留水 1000ml
【００２１】９．オキシダーゼ テルモ（株）製バクトラボ オキシダーゼ・テストを用
いて試験した。即ち、二塩化Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テト
ラメチル−ｐ−フェニレンジアミンを含んだ綿棒に被検
菌を付け、オキシダーゼ活性により生成する青紫色を生
じた場合に、オキシダーゼ陽性と判断した。
いて試験した。即ち、二塩化Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テト
ラメチル−ｐ−フェニレンジアミンを含んだ綿棒に被検
菌を付け、オキシダーゼ活性により生成する青紫色を生
じた場合に、オキシダーゼ陽性と判断した。
【００２２】１０．カタラーゼ 毛細管の一端に被検菌を付けた後、被検菌を付けた毛細
管の一端から３％過酸化水素水を吸い上げて、被検菌と
過酸化水素水とを毛細管内で混合させた。毛細管内で過
酸化水素分解にともない酸素の気泡が発生した場合を、
カタラーゼ陽性とした。
管の一端から３％過酸化水素水を吸い上げて、被検菌と
過酸化水素水とを毛細管内で混合させた。毛細管内で過
酸化水素分解にともない酸素の気泡が発生した場合を、
カタラーゼ陽性とした。
【００２３】１１．ゼラチンの液化 普通ブイヨン１０００mlに精製ゼラチン１００ｇを加
え、１２１℃で１２分間高圧蒸気滅菌した培地を滅菌試
験管に３mlずつ分注し、高層に固めた。被検菌を高層部
分に穿刺し、各菌体の生育温度で１週間培養した。穿刺
線に沿ったゼラチン液化の有無を観察し、液化が観察さ
れたものを陽性とした。
え、１２１℃で１２分間高圧蒸気滅菌した培地を滅菌試
験管に３mlずつ分注し、高層に固めた。被検菌を高層部
分に穿刺し、各菌体の生育温度で１週間培養した。穿刺
線に沿ったゼラチン液化の有無を観察し、液化が観察さ
れたものを陽性とした。
【００２４】１２．硝酸塩還元能 ０．１％硝酸ナトリウム加ブイヨン培地に被検菌を接種
し、菌体の生育温度で５日間培養した。得られた培養液
に、α- ナフチルアミン液（α- ナフチルアミン０．１
ｇを３０％酢酸水溶液２００mlに溶解したもの）１．０
mlとスルファニル酸液（スルファニル酸０．５ｇを３０
％酢酸水溶液１５０mlに溶解したもの）１．０mlを加え
てよく混和させた後、３０分以内に硝酸還元により生成
した亜硝酸による桃赤色を呈した場合を陽性とした。
し、菌体の生育温度で５日間培養した。得られた培養液
に、α- ナフチルアミン液（α- ナフチルアミン０．１
ｇを３０％酢酸水溶液２００mlに溶解したもの）１．０
mlとスルファニル酸液（スルファニル酸０．５ｇを３０
％酢酸水溶液１５０mlに溶解したもの）１．０mlを加え
てよく混和させた後、３０分以内に硝酸還元により生成
した亜硝酸による桃赤色を呈した場合を陽性とした。
【００２５】１３．硝酸からのガス産生 被検菌を硝酸塩還元試験用培地を用いて３７℃で５日間
培養した後、培養液に亜鉛粉末を少量加え、気泡が発生
した場合を陽性とした。
培養した後、培養液に亜鉛粉末を少量加え、気泡が発生
した場合を陽性とした。
【００２６】１４．インドール 下記組成のＳＩＭ培地を加熱溶解して、３mlずつ試験管
に分注し、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した後、高
層に固めた。穿刺培養（３７℃，２４時間）の後、培地
にＫｏｖａｃ試薬を加え、赤色を呈した場合にインドー
ル陽性とした。 ＜ＳＩＭ培地＞ 肉エキス 3.0ｇ 塩酸システイン 0.2ｇ ペプトン 30.0ｇ 寒 天 5.0ｇ チオ硫酸ナトリウム 0.05ｇ 蒸留水 1000ml クエン酸鉄アンモニウム 0.5ｇ
に分注し、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した後、高
層に固めた。穿刺培養（３７℃，２４時間）の後、培地
にＫｏｖａｃ試薬を加え、赤色を呈した場合にインドー
ル陽性とした。 ＜ＳＩＭ培地＞ 肉エキス 3.0ｇ 塩酸システイン 0.2ｇ ペプトン 30.0ｇ 寒 天 5.0ｇ チオ硫酸ナトリウム 0.05ｇ 蒸留水 1000ml クエン酸鉄アンモニウム 0.5ｇ
【００２７】１５．Ｋｉｎｇ Ａ，Ｂ培地 下記組成の培地を加熱溶解し、８mlずつ試験管に分注し
て１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌し、斜面に固めた。
斜面部に被検菌を植菌し、３７℃で２４時間培養した。
Ｋｉｎｇ Ａ培地で緑変した場合をＫｉｎｇ Ａ陽性と
し、ＫｉｎｇＢ培地で緑変した場合をＫｉｎｇ Ｂ陽性
とした。 ＜Ｋｉｎｇ Ａ培地＞ バクトペプトン 20.0ｇ グリセリン 10.0ml 塩化マグネシウム（無水） 1.4ｇ 硫酸カリウム（無水） 1.0ｇ 寒 天 15.0ｇ 蒸留水 1000ml ＜Ｋｉｎｇ Ｂ培地＞ プロテオーゼペプトンNo3 20.0ｇ グリセリン 10.0ml リン酸水素二カリウム 1.5ｇ 硫酸マグネシウム 1.5ｇ 寒 天 15.0ｇ 蒸留水 1000ml
て１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌し、斜面に固めた。
斜面部に被検菌を植菌し、３７℃で２４時間培養した。
Ｋｉｎｇ Ａ培地で緑変した場合をＫｉｎｇ Ａ陽性と
し、ＫｉｎｇＢ培地で緑変した場合をＫｉｎｇ Ｂ陽性
とした。 ＜Ｋｉｎｇ Ａ培地＞ バクトペプトン 20.0ｇ グリセリン 10.0ml 塩化マグネシウム（無水） 1.4ｇ 硫酸カリウム（無水） 1.0ｇ 寒 天 15.0ｇ 蒸留水 1000ml ＜Ｋｉｎｇ Ｂ培地＞ プロテオーゼペプトンNo3 20.0ｇ グリセリン 10.0ml リン酸水素二カリウム 1.5ｇ 硫酸マグネシウム 1.5ｇ 寒 天 15.0ｇ 蒸留水 1000ml
【００２８】１６．クリグラー培地 下記組成のクリグラー培地を試験管に分注した後、１２
１℃で１５分間高圧蒸気滅菌して高層斜面に固めた。斜
面部分および高層部分に被検菌を植え、各菌の生育温度
で１８〜２４時間培養した。培養後、斜面部分が黄変色
した場合を斜面部陽性（乳糖を分解し酸を生成）とし、
高層部分で黄変色した場合を高層部陽性（ブドウ糖を分
解し酸を生成）とした。尚、表１に示した（ＮＣ）は斜
面部陰性を、（Ｒ）は高層部陰性を、それぞれ意味す
る。 ＜クリグラー培地の組成＞ 肉エキス 4.0ｇ ペプトン 15.0ｇ 乳糖 10.0ｇ ブドウ糖 1.0ｇ 塩化ナトリウム 5.0ｇ チオ硫酸ナトリウム 0.08ｇ 亜硫酸ナトリウム 0.4ｇ 硫酸第一鉄 0.2ｇ フェノール赤 0.02ｇ 寒天末 15.0ｇ 精製水 1000ml ｐＨ ７．２
１℃で１５分間高圧蒸気滅菌して高層斜面に固めた。斜
面部分および高層部分に被検菌を植え、各菌の生育温度
で１８〜２４時間培養した。培養後、斜面部分が黄変色
した場合を斜面部陽性（乳糖を分解し酸を生成）とし、
高層部分で黄変色した場合を高層部陽性（ブドウ糖を分
解し酸を生成）とした。尚、表１に示した（ＮＣ）は斜
面部陰性を、（Ｒ）は高層部陰性を、それぞれ意味す
る。 ＜クリグラー培地の組成＞ 肉エキス 4.0ｇ ペプトン 15.0ｇ 乳糖 10.0ｇ ブドウ糖 1.0ｇ 塩化ナトリウム 5.0ｇ チオ硫酸ナトリウム 0.08ｇ 亜硫酸ナトリウム 0.4ｇ 硫酸第一鉄 0.2ｇ フェノール赤 0.02ｇ 寒天末 15.0ｇ 精製水 1000ml ｐＨ ７．２
【００２９】 １７．Ｏｒ（オルニチンからの脱炭酸試験） Ｄｉｆｃｏ社製 Standard Dehydrated Culture Medium
１０．５ｇ及びＬ−オルニチン１０．０ｇを蒸留水１０
００mlに溶解させ、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌
し、滅菌試験管に３mlずつ分注した。この培地に被検菌
を植菌し、各菌体の生育温度で１８〜２４時間培養し、
培地色調が小豆色から黄変したものを陽性とした。
１０．５ｇ及びＬ−オルニチン１０．０ｇを蒸留水１０
００mlに溶解させ、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌
し、滅菌試験管に３mlずつ分注した。この培地に被検菌
を植菌し、各菌体の生育温度で１８〜２４時間培養し、
培地色調が小豆色から黄変したものを陽性とした。
【００３０】１８．Ｌｙ（リジンからの脱炭酸試験） Ｄｉｆｃｏ社製 Standard Dehydrated Culture Medium
１０．５ｇ及びＬ−オルニチン１０．０ｇを蒸留水１０
００mlに溶解させ、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌
し、滅菌試験管に３mlずつ分注した。この培地に被検菌
を植菌し、各菌体の生育温度で１８〜２４時間培養し、
培地色調が赤紫色から黄変したものを陽性とした。
１０．５ｇ及びＬ−オルニチン１０．０ｇを蒸留水１０
００mlに溶解させ、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌
し、滅菌試験管に３mlずつ分注した。この培地に被検菌
を植菌し、各菌体の生育温度で１８〜２４時間培養し、
培地色調が赤紫色から黄変したものを陽性とした。
【００３１】 １９．Ａｒ（アルギニンからの脱炭酸試験） Ｄｉｆｃｏ社製 Standard Dehydrated Culture Medium
１０．５ｇ及びＬ−オルニチン１０．０ｇを蒸留水１０
００mlに溶解させ、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌
し、滅菌試験管に３mlずつ分注した。この培地に被検菌
を植菌し、各菌体の生育温度で１８〜２４時間培養し、
培地色調が茶褐色から黄変したものを陽性とした。
１０．５ｇ及びＬ−オルニチン１０．０ｇを蒸留水１０
００mlに溶解させ、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌
し、滅菌試験管に３mlずつ分注した。この培地に被検菌
を植菌し、各菌体の生育温度で１８〜２４時間培養し、
培地色調が茶褐色から黄変したものを陽性とした。
【００３２】２０．酸産生（糖の資化能判定） 前記のＯＦ培地を１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌し、
培地温度が６０℃程度に冷めたところで濾過滅菌した糖
を１％の割合で加え、よく混和させた後、試験管に３ml
ずつ分注し、高層に固めた。この培地に被検菌を穿刺
し、各菌体の生育温度で２４時間培養し、培地色調が黄
変したものを陽性とした。
培地温度が６０℃程度に冷めたところで濾過滅菌した糖
を１％の割合で加え、よく混和させた後、試験管に３ml
ずつ分注し、高層に固めた。この培地に被検菌を穿刺
し、各菌体の生育温度で２４時間培養し、培地色調が黄
変したものを陽性とした。
【００３３】
【表１】
【００３４】以上の同定確認試験の結果から、ここで分
離選別した２つの菌株はそれぞれ同一の性質を有し、シ
ュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する菌
株であることが判明し、種名はエルギノサ（ａｅｒｕｇ
ｉｎｏｓａ）と同定され、夫々シュウドモナス・エルギ
ノサ ＴＹ−２９及びシュウドモナス・エルギノサＴＹ
−３０と命名した。以後、これら菌株をそれぞれＴＹ−
２９，ＴＹ−３０と称する。
離選別した２つの菌株はそれぞれ同一の性質を有し、シ
ュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する菌
株であることが判明し、種名はエルギノサ（ａｅｒｕｇ
ｉｎｏｓａ）と同定され、夫々シュウドモナス・エルギ
ノサ ＴＹ−２９及びシュウドモナス・エルギノサＴＹ
−３０と命名した。以後、これら菌株をそれぞれＴＹ−
２９，ＴＹ−３０と称する。
【００３５】これらの新菌株は、１９９３年６月１日に
工業技術院生命工学工業技術研究所において、ＴＹ−２
９がＦＥＲＭ Ｐ−１３６６７として、またＴＹ−３０
がＦＥＲＭ Ｐ−１３６６８として、夫々寄託された。
工業技術院生命工学工業技術研究所において、ＴＹ−２
９がＦＥＲＭ Ｐ−１３６６７として、またＴＹ−３０
がＦＥＲＭ Ｐ−１３６６８として、夫々寄託された。
【００３６】次に、これら新菌株ＴＹ−２９及びＴＹ−
３０の石油，廃油に対する分解・資化の挙動、並びにバ
イオサーファクタント産生について検証する。
３０の石油，廃油に対する分解・資化の挙動、並びにバ
イオサーファクタント産生について検証する。
【００３７】［石油，廃油に対する分解・資化能の測定
方法］石油，廃油分解・資化能の測定は、昭和４９年９
月３０日環境庁告示第６４号の水質汚濁防止法に基づく
排水基準の検定方法に従いこれを改良して行なった。即
ち、下水道法の油分測定法（ｎ−ヘキサンによる油分抽
出法）に基づき、実験室レベルに適合するように改良し
た。
方法］石油，廃油分解・資化能の測定は、昭和４９年９
月３０日環境庁告示第６４号の水質汚濁防止法に基づく
排水基準の検定方法に従いこれを改良して行なった。即
ち、下水道法の油分測定法（ｎ−ヘキサンによる油分抽
出法）に基づき、実験室レベルに適合するように改良し
た。
【００３８】具体的な測定方法を示す。 １．前培養：５ml, Ｌ培地で一夜培養したものを用い
る。 ２．本培養：１００mlＬ培地に１．０ｇの原油を入れた
ものを培地として用い、１５０回転／min の振盪培養器
で２４時間培養する。
る。 ２．本培養：１００mlＬ培地に１．０ｇの原油を入れた
ものを培地として用い、１５０回転／min の振盪培養器
で２４時間培養する。
【００３９】３．資化判定方法 ｎ−ヘキサン３０mlを本培養終了液に加え、激しく撹
拌しして残存油分を有機層に抽出する。 遠心管（試験管）に一部を移し、２０００ｇで３分間
遠心する。 有機層から正確に５ml採取し、予め重量を測定したア
ルミ皿の中に移す。 乾燥庫内で５０℃に保持し、６０分間、ｎ−ヘキサン
を乾燥させる。 重量を測定し、残存油分の重量を測定する。
拌しして残存油分を有機層に抽出する。 遠心管（試験管）に一部を移し、２０００ｇで３分間
遠心する。 有機層から正確に５ml採取し、予め重量を測定したア
ルミ皿の中に移す。 乾燥庫内で５０℃に保持し、６０分間、ｎ−ヘキサン
を乾燥させる。 重量を測定し、残存油分の重量を測定する。
【００４０】４．空試験 水１００mlに原油１ｇを加えたものを空試験の試料と
する。 前記資化判定方法で示した同様の操作により、ｎ−ヘ
キサンで抽出される油分の重量を測定する。
する。 前記資化判定方法で示した同様の操作により、ｎ−ヘ
キサンで抽出される油分の重量を測定する。
【００４１】５．石油資化量の定義 石油資化量＝（１−分解試料（ｇ）／空試験（ｇ））×
１００（％）で示す。何％油分が除去されたかをもって
石油資化量とする。
１００（％）で示す。何％油分が除去されたかをもって
石油資化量とする。
【００４２】［新菌株による石油，廃油の分解・資化能
の測定］石油としてイラニアンヘビー（原油）を用い、
また廃油として使用後のエンジンオイルを用いて、それ
ぞれ上記の測定方法に従って新菌株による石油，廃油の
分解・資化量を測定した。その結果を下記の表２に示
す。
の測定］石油としてイラニアンヘビー（原油）を用い、
また廃油として使用後のエンジンオイルを用いて、それ
ぞれ上記の測定方法に従って新菌株による石油，廃油の
分解・資化量を測定した。その結果を下記の表２に示
す。
【００４３】
【表２】 菌株名 廃 油 イラニアンヘビー ＴＹ−２９ ６３．７％ ８５．４％ ＴＹ−３０ ７０．５％ ８６．８％
【００４４】この様に、新菌体ＴＹ−２９及びＴＹ−３
０によれば、３％廃油を２４時間で６０％以上も分解・
資化し、また１％原油（イラニアンヘビー）を２４時間
で８５％以上も分解・資化していることが明らかになっ
た。
０によれば、３％廃油を２４時間で６０％以上も分解・
資化し、また１％原油（イラニアンヘビー）を２４時間
で８５％以上も分解・資化していることが明らかになっ
た。
【００４５】［新菌株のバイオサーファクタント活性の
測定］新菌株ＴＹ−２９及びＴＹ−３０によるバイオサ
ーファクタントの産生を検証するために、Ｌ培地でもっ
て３７℃に保持し２４時間，１５０回転／min で振盪培
養した新菌株ＴＹ−２９及びＴＹ−３０を用いて、バイ
オサーファクタント活性、すなわち培養後における表面
張力を測定した。表面張力の測定は、株式会社相互理化
学硝子製作所製の滴数計を使用して行なった。測定結果
を下記の表３に示す。
測定］新菌株ＴＹ−２９及びＴＹ−３０によるバイオサ
ーファクタントの産生を検証するために、Ｌ培地でもっ
て３７℃に保持し２４時間，１５０回転／min で振盪培
養した新菌株ＴＹ−２９及びＴＹ−３０を用いて、バイ
オサーファクタント活性、すなわち培養後における表面
張力を測定した。表面張力の測定は、株式会社相互理化
学硝子製作所製の滴数計を使用して行なった。測定結果
を下記の表３に示す。
【００４６】
【表３】 ＊ＪＭ１０９は、バイオサーファクタントを産生しない
コントロール実験用のものである。
コントロール実験用のものである。
【００４７】この測定結果から、新菌株ＴＹ−２９及び
ＴＹ−３０ともに、著しい表面張力の低下が認られ、界
面活性物質であるバイオサーファクタントを産生分泌し
ていることが確認された。
ＴＹ−３０ともに、著しい表面張力の低下が認られ、界
面活性物質であるバイオサーファクタントを産生分泌し
ていることが確認された。
【００４８】［新菌株の生育とバイオサーファクタント
生産］新菌株ＴＹ−２９及びＴＹ−３０をそれぞれＬ培
地に植菌し、菌体の生育と、バイオサーファクタントの
生産の関係を調べた。菌体の生育の測定は、菌体の増殖
を６６０ｎｍの吸光度を測定することにより行ない、バ
イオサーファクタント生産の測定は、イラニアンヘビー
１mlが乳化する面積を測定し、１cm2 を１ユニット（ｕ
／ml）として表した。測定の結果を図１及び図２に示
す。図中、白丸は菌体の生育を示し、黒丸はバイオサー
ファクタント生産を示す。
生産］新菌株ＴＹ−２９及びＴＹ−３０をそれぞれＬ培
地に植菌し、菌体の生育と、バイオサーファクタントの
生産の関係を調べた。菌体の生育の測定は、菌体の増殖
を６６０ｎｍの吸光度を測定することにより行ない、バ
イオサーファクタント生産の測定は、イラニアンヘビー
１mlが乳化する面積を測定し、１cm2 を１ユニット（ｕ
／ml）として表した。測定の結果を図１及び図２に示
す。図中、白丸は菌体の生育を示し、黒丸はバイオサー
ファクタント生産を示す。
【００４９】図１及び図２から明らかなように、新菌株
ＴＹ−２９及びＴＹ−３０は増殖に伴い高いバイオサー
ファクタントを産生し、生育が終了した後にバイオサー
ファクタントを生産していた。
ＴＹ−２９及びＴＹ−３０は増殖に伴い高いバイオサー
ファクタントを産生し、生育が終了した後にバイオサー
ファクタントを生産していた。
【００５０】
【発明の効果】以上の通り、本発明に係る新規微生物シ
ュウドモナス・エルギノサ ＴＹ−２９及びシュウドモ
ナス・エルギノサ ＴＹ−３０はバイオサーファクタン
トを有効的に産生し、石油やエンジンオイル等の廃油を
高度に分解・資化することが可能であり、本発明に係る
新規微生物を用いれば、石油やエンジンオイル等の廃油
を生物学的に処理することが出来る。
ュウドモナス・エルギノサ ＴＹ−２９及びシュウドモ
ナス・エルギノサ ＴＹ−３０はバイオサーファクタン
トを有効的に産生し、石油やエンジンオイル等の廃油を
高度に分解・資化することが可能であり、本発明に係る
新規微生物を用いれば、石油やエンジンオイル等の廃油
を生物学的に処理することが出来る。
【図１】 本発明に係る新菌株ＴＹ−２９の生育とバイ
オサーファクタント生産の経時変化を示すグラフ図。
オサーファクタント生産の経時変化を示すグラフ図。
【図２】 本発明に係る新菌株ＴＹ−３０の生育とバイ
オサーファクタント生産の経時変化を示すグラフ図。
オサーファクタント生産の経時変化を示すグラフ図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:385） (72)発明者 山本 悦雄 神奈川県川崎市川崎区浮島町６番１号 ゼ ネラル石油株式会社中央研究所内
Claims (3)
- 【請求項１】 シュウドモナス属に属し、バイオサーフ
ァクタントを産生し、石油，廃油を分解・資化する新規
微生物。 - 【請求項２】 石油，廃油を分解・資化する微生物がシ
ュウドモナス・エルギノサ ＴＹ−２９（ＦＥＲＭ Ｐ
−１３６６７）である請求項１記載の新規微生物。 - 【請求項３】 石油，廃油を分解・資化する微生物がシ
ュウドモナス・エルギノサ ＴＹ−３０（ＦＥＲＭ Ｐ
−１３６６８）である請求項１記載の新規微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5159560A JPH078270A (ja) | 1993-06-29 | 1993-06-29 | 石油，廃油資化性新規微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5159560A JPH078270A (ja) | 1993-06-29 | 1993-06-29 | 石油，廃油資化性新規微生物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH078270A true JPH078270A (ja) | 1995-01-13 |
Family
ID=15696407
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5159560A Pending JPH078270A (ja) | 1993-06-29 | 1993-06-29 | 石油，廃油資化性新規微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH078270A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6649400B2 (en) | 1999-03-29 | 2003-11-18 | Technology Licensing Organization Inc. | Bacteria mixture having heavy oil degrading ability and method of treating oil components |
| JP2019208460A (ja) * | 2018-06-07 | 2019-12-12 | シーシーアイホールディングス株式会社 | 油脂の新規分解微生物 |
| CN111440742A (zh) * | 2020-04-08 | 2020-07-24 | 天津科技大学 | 一种用于石油烃降解的铜绿假单胞菌突变株 |
-
1993
- 1993-06-29 JP JP5159560A patent/JPH078270A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6649400B2 (en) | 1999-03-29 | 2003-11-18 | Technology Licensing Organization Inc. | Bacteria mixture having heavy oil degrading ability and method of treating oil components |
| JP2019208460A (ja) * | 2018-06-07 | 2019-12-12 | シーシーアイホールディングス株式会社 | 油脂の新規分解微生物 |
| CN111440742A (zh) * | 2020-04-08 | 2020-07-24 | 天津科技大学 | 一种用于石油烃降解的铜绿假单胞菌突变株 |
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