JPH0779781A - 蛋白排出遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 産生蛋白質の菌体外への排出を促進せしめる
遺伝子（蛋白排出遺伝子）、該遺伝子を組み込んだ発現
ベクター及び該発現ベクターで形質転換または形質導入
せしめられた形質転換体または形質導入体の取得。 【構成】 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓ ＦＤ０１２０株の遺伝子ライブラリーを作成し、
該遺伝子ライブラリーよりクローン選別を行い、陽性ク
ローンから蛋白排出遺伝子発現に関与するＤＮＡ領域を
取得し、次にこのＤＮＡ配列を利用してＤＮＡ発現ベク
ターを作成し、さらにこの発現ベクターを用いて形質転
換体または形質導入体を作成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物によって産生さ
れる有用な蛋白質を、菌体外に排出せしめることを促進
する遺伝子に関する。

【０００２】さらに、本発明は蛋白質の菌体外排出を促
進する遺伝子（以下、簡単に「蛋白排出遺伝子」とい
う）を用いる有用蛋白質の製造法、該蛋白質排出遺伝子
を組み込んだ発現ベクターあるいはこうして得られた発
現ベクターで形質転換または形質導入した形質転換体ま
たは形質導入体に関する。

【０００３】

【従来の技術とその課題】従来微生物を用いて酵素など
を産生させる際に、その酵素などを分泌生産させること
は古くから知られている。

【０００４】この点に着目して、特定の微生物において
は遺伝子操作の手法を用いて有用物質の遺伝子を導入し
て分泌生産させることをめざし、分泌ベクターの構築が
試みられているが必ずしも満足すべき発現あるいは分泌
能を有するものは得られていないのが現状である。

【０００５】組換えＤＮＡ技術によって遺伝子工学的に
有用物質を生産する方法は、ある特定の物質については
既に確立されてきている。

【０００６】しかし、このような手法による物質の生産
方法は、通常、ベクターに所望物質をコードしている遺
伝子を組込んで構築された組換えＤＮＡを用いて、宿主
微生物などを形質転換または形質導入して、ついで得ら
れた形質転換体または形質導入体を培養したのち、その
所望とする物質を回収することによりなされるものであ
る。

【０００７】ところが、このような方法によって非分泌
性の蛋白質の生産を行うと、微生物細胞内で産生された
蛋白質は、宿主菌のプロテアーゼによって分解され、そ
の目的とする所望蛋白質を安定かつ大量に得ることがで
きないという問題点がある。さらに、所望有用物質が宿
主微生物にとっては異種あるいは外来の蛋白質に該当す
る場合、その使用する宿主微生物によっては凝集塊（ｉ
ｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を形成し、単純な分離精
製処理を施しても何ら活性を有した目的物が得られない
などという問題点も指摘されてきている。

【０００８】さらに、このような非分泌性の蛋白質を回
収するに際しては、宿主微生物を物理的に破壊したの
ち、所望の蛋白質の分離及び精製処理を行なわなければ
ならないが、一般にこのように一旦宿主微生物を破壊し
てのちに回収操作を施すことは、その操作をより複雑に
し、そのため目的蛋白質の収率が低かったり、活性を有
するものについてはその回収操作中に失活するなどとい
う問題点もあった。さらにこのようにして回収操作を行
なうとコスト的にも大変に問題であった。

【０００９】上記問題点を解決する手法としては、蛋白
質の膜通過に関与するシグナル配列の作用を利用するも
のがある。この方法は宿主微生物細胞内で産生された蛋
白質を細胞外あるいは細胞質膜外に分泌させる方法を含
むものである。ところでこのようなシグナル配列を利用
した遺伝子組換え手法による所望蛋白質の製造において
は、大腸菌が広く用いられて来た。大腸菌はその宿主・
ベクター系の開発が進んでいることから組換えＤＮＡに
より形質転換するにあたり広く用いられている宿主微生
物である。

【００１０】大腸菌はグラム陰性菌に属する微生物であ
り、細胞質膜と外膜とを有している。

【００１１】普通大腸菌を用いて組換えＤＮＡを導入し
て形質転換体を得、この形質転換体を通常の培養に付す
と、所望の外来蛋白質は細胞質膜と外膜との間に蓄積さ
れる。こうして蓄積された蛋白質は浸透圧ショック法に
よって外膜のみを破壊することにより菌体外へ放出され
て、回収される。しかしこのような方法は、その操作が
繁雑であり、さらに得られた所望蛋白質がそのままで有
用性を持たない場合が多いという問題点もある。

【００１２】従って、微生物を宿主細胞として用いて、
効率よくしかも大量に所望の蛋白質を製造する方法の開
発が求められている。

【００１３】一方、特定の微生物、例えばグラム陽性菌
などでは、組換えＤＮＡ技術を用いて産生させた蛋白質
を細胞外に分泌させて得ることができる場合もある。し
かしながら、そのような蛋白質を分泌する遺伝子を持っ
た微生物は極く限られており、いかなる種類の蛋白質に
も適用できるものではない。さらに、組換えＤＮＡをそ
の宿主微生物内で安定に保持することができない場合が
多く、また宿主・ベクター系の開発も不充分なものが多
い。またその微生物自体の取扱いの困難なものが多い。

【００１４】従って、利用しうる宿主・ベクター系の開
発のすすんだ微生物を宿主細胞として用いて、大量且つ
安価に、そして簡単な操作で目的蛋白質を得る方法の開
発が求められていた。

【００１５】

【課題を解決するための手段】上記のような問題点を解
決すべく、本発明者等は遺伝子組換技術においてその利
用が最も行い易い大腸菌等のグラム陰性菌に属する微生
物について研究を広範に行い、微生物によって産生され
る有用な蛋白質を菌体外に排出することを促進する遺伝
子を見出し、本発明を完成した。

【００１６】本発明の蛋白排出遺伝子は、配列番号１ま
たは配列番号２に示された塩基配列またはそれと実質的
に同等の活性を示すＤＮＡ配列を有している。

【００１７】本発明に従えば、上記蛋白排出遺伝子は、
発現ベクターあるいはプラスミドないしは染色体の有用
蛋白質をコードする遺伝子と共存して用いられる。

【００１８】本発明に従えば、こうして構築された発現
ベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換させて得ら
れた組換え微生物が提供される。

【００１９】さらに本発明によれば、大腸菌を用いた遺
伝子発現系において、有用蛋白質を細胞外に有効に排出
させて容易に産生取得する遺伝子操作技術を行うに適す
る改良された技術が提供される。

【００２０】本発明における蛋白排出遺伝子を取得し、
その全塩基配列を決定するにあたってはまずＢａｃｉｌ
ｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＦＤ０１２０株
を、通常の方法で培養増殖した後、得られた菌体から、
慣用される方法を適用して、例えばリゾチームによる細
胞溶解法などを用いて染色体ＤＮＡを回収し、次いで通
常の方法、例えばエタノール沈殿処理によって染色体Ｄ
ＮＡを精製したのち、適切な制限酵素、例えば制限酵素
Ｓａｕ３ＡＩによる部分分解をして適当な断片とし、得
られた断片を用いて遺伝子ライブラリーを作製する。遺
伝子ライブラリーを作製するために用いられるベクター
としては、目的に応じて当該分野で知られた慣用される
ものあるいは市販のものの中から選んで適宜用いること
ができる。また遺伝子ライブラリーを作製するのに用い
られる方法は、当該分野で知られた慣用される方法ある
いは市販キットの中から選んで適宜用いることができ
る。

【００２１】こうして得られた遺伝子ライブラリーより
蛋白排出遺伝子を含むクローン選別を行うためには、先
ず適切な分泌蛋白質として知られている遺伝子の制限領
域から適切な核酸塩基配列を切出し、ＰＣＲ法により、
蛋白排出遺伝子の一部を増幅し、得られたＤＮＡ断片を
プローブとして用いるスクリーニングを複数回、例えば
３〜４回繰り返す。陽性クローンを選別した後、ＤＮＡ
を回収し、制限酵素切断によって得られる蛋白排出遺伝
子を含むＤＮＡ断片をプラスミドに挿入する。大量に調
製された組換えプラスミドを適当な制限酵素で消化した
後、当該分野で知られた慣用される方法あるいは市販の
キットの中から選んだ方法、例えばエキソヌクレアーゼ
を用いるディレーションミュータント法あるいはジデオ
キシヌクレオタイドシークエンス法により塩基配列を解
析した。以上の操作によってもその塩基配列を決定でき
ない領域については、プライマーを化学合成してプライ
マーエクステンション法も利用し、その塩基配列を決定
して解析した。こうして得られた蛋白質排出遺伝子を含
むＤＮＡ断片の代表的なものの全塩基配列は、配列番号
１または配列番号２で示される。配列番号１で示される
遺伝子の典型はＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ
ｒｍｉｓのｘｐａＦ１，ｘｐａＦ２遺伝子であり、配列
番号２で示される遺伝子の典型はＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓのｘｐａＧ１，ｘｐａＧ２遺伝子であり、と
もに大腸菌からクローン化されたものではない。さらに
ｘｐａＦ１遺伝子から生成する蛋白はｘｐａＦ２遺伝子
から生成する蛋白を補う作用があることが知られている
ので、ｘｐａＦ２のみでも蛋白が排出できると考えても
よい。同様にｘｐａＧ１，ｘｐａＧ２遺伝子においても
ｘｐａＧ２のみでも蛋白が排出できると考えてもよい。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓでも枯草菌ｘｐａ
遺伝子があるので同様な機能を持つと考えられる。本発
明に従えば、上記と同様な方法あるいは類似の方法を適
用して種々の蛋白排出遺伝子に関連した遺伝子のＤＮＡ
配列を決定することができ、こうして得られたものも本
発明の思想に従うかぎりその範囲内のものであることは
理解されよう。

【００２２】本発明の蛋白排出遺伝子は、その活性を実
質的に保持したままそのＤＮＡ配列を当該分野で知られ
た慣用される方法あるいは市販のキットの中から選んだ
方法を用いて切り出し、その断片を利用してその実質的
に活性なＤＮＡ配列を有する発現ベクターを構築する。
この発現ベクターを構築するのに使用しうるプラスミド
としては、大腸菌をはじめとしたグラム陰性菌に属する
微生物由来のプラスミドなどが挙げられる。この発現ベ
クターを構築するのに適したプラスミドとしては、大腸
菌由来のプラスミドなどが挙げられ、例えばｐＵＣ系プ
ラスミド；ｐＨＳＧ３９８、ｐＭＷ系プラスミド；ｐＫ
Ｐ１５００、ｐＨＹ３００ＰＬＫなどがあげられる。こ
うして蛋白排出遺伝子をその活性を保持したまま有する
ＤＮＡ配列を含有する発現ベクターが構築される。もち
ろん蛋白排出遺伝子挿入域には、発現し、菌体外に排出
されることを目ざす蛋白質をコードする遺伝子挿入域を
有する発現ベクターが提供される。これは該挿入域の下
流例が一般的だが勿論これに限定されない。

【００２３】本発明によれば、上記蛋白排出遺伝子は、
種々の遺伝子産物である蛋白質を効率よく菌体外に排出
させる作用を有することから、たとえその蛋白質が宿主
にとって異種であったりあるいは外来蛋白質であっても
宿主に負担がかからず、その蛋白質の産生を効率よく行
うことができる。さらに宿主細胞外は通常培養液等の単
純な組成環境のものであることから得られた蛋白質の分
離精製も非常に効率よく行うことが可能である。

【００２４】次に本発明によれば特に配列番号１または
配列番号２で示されるＤＮＡ配列またはそれと実質的に
同等の蛋白排出活性を示すことのできるＤＮＡ配列を含
有することを特徴とする発現ベクターが開発提供され、
さらにその発現ベクターで形質転換された形質転換体が
提供される。特に本発明によれば、大腸菌を宿主細胞と
して用いて遺伝子操作技術を行う改良技術が提供され
る。

【００２５】配列表中の配列番号１または配列番号２で
示されるＤＮＡ配列は、その機能を実質的に有する限り
そこに含まれる塩基を置換したり、付加したり、あるい
は欠失処理してその配列以外のものに改変することが可
能である。このような改変法としては、適当な制限酵素
及びＤＮＡ合成酵素、リガーゼを用いる方法、オリゴヌ
クレオチド指定変異法（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）として
知られた方法、たとえばＭ．Ｓｍｉｔｈ及びＳ．Ｇｉｌ
ｌａｍ「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，
Ｖｏｌ．３，ｐ．１（１９８１），Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏ
ｗ及びＡ．Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ ｅｄｓ「Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」，Ｖｏｌ．１５３
−１５５（１９８７），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，ＣＡ．に記載のものあるいはそのうちに引用された
文献に記載のものなど、あるいは化学修飾法などが挙げ
られる。

【００２６】そしてこうして得られたＤＮＡ配列は配列
番号１または配列番号２で示されるＤＮＡ配列と実質的
に同等の蛋白排出遺伝子活性を示す限り、それを含有す
る発現ベクターの開発に同様にして用いることが可能で
ある。

【００２７】本発明の蛋白排出遺伝子ＤＮＡ配列または
それと実質的に同等の蛋白排出制御活性を示すＤＮＡ配
列を含有することを特徴とする発現ベクターは、その蛋
白排出遺伝子領域中その活性を実質的に有するＤＮＡ配
列を含有する限り特に制限がない。

【００２８】この発現ベクターのうちには上記ＤＮＡ配
列に加えて、通常用いられる制御あるいはコントロール
のための配列を有していてよい。このような制御あるい
はコントロールのための配列としては、たとえばターミ
ネーター、エンハンサーなどが挙げられる。この発現ベ
クターのうちには、複製起源、選択マーカーなどを有し
ていてよく、蛋白排出遺伝子と目的発現遺伝子とを同じ
制御下（同一のプラスミドに載せる）におくほうが、特
定の時期に高発現させてすぐに排出させるので有利であ
るが、異なる制御下（異なるプラスミドに載せる）にお
いて発現させても本質的な機能は変わらない。また同一
のプラスミドにおいても発現遺伝子の挿入部位は蛋白排
出遺伝子の下流、上流を問わない。

【００２９】この発現ベクターの選択マーカーとしては
各種抗生物質耐性遺伝子、例えば、アンピシリン耐性遺
伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性
遺伝子などが挙げられる。これらのものは、各種微生物
由来のもの、バクテリオファージ由来のもの、昆虫や哺
乳動物細胞を含む動物ウイルス由来の各種の通常用いら
れる制御あるいはコントロールのための配列を有してい
てよい。制御あるいはコントロールのための配列として
は、各種ウイルスベクター、各種プラスミドベクター、
コスミドベクター、シャトルベクターなどで用いられて
いるものが挙げられる。これらベクターとしては、大腸
菌、特にＥＫ型プラスミドベクター、λｇｔタイプファ
ージベクターなどが挙げられる。

【００３０】これら遺伝子制御配列は、適宜それらを組
み合わせたり、あるいは化学的に修飾したりしてベクタ
ーに組み込んで、外来遺伝子をコードする塩基配列を含
むｃＤＮＡ発現用のベクター構築に用いることができ
る。

【００３１】本発明の蛋白排出遺伝子またはそれと実質
的に同等の活性を示すＤＮＡ配列を含有する発現ベクタ
ーとしては、例えば、ｐＨＳＧＫＨ，ｐＬＡ３，ｐＤ１
４等があげられる。なおプラスミド中のｘｐａ遺伝子も
同様の活性を示すと考えられる。

【００３２】本発明の蛋白排出遺伝子は、ｐＵＣ１１８
の上流の制限酵素ＫｐｎＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入
されることにより、遺伝子発現用ベクターが構築でき
る。更に外来遺伝子の挿入部位は、その蛋白排出遺伝子
の３′下流に、例えば、ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ，Ｓｍａ
Ｉ，ＰｓｔＩなどの制限酵素切断部位を新たに設け、外
来遺伝子の発現が好ましくなされるようにデザインする
ことができる。

【００３３】本発明のＤＮＡ配列またはそれと実質的に
同等の蛋白排出制御活性を示すＤＮＡ配列を含有する発
現ベクターは、これを適当な宿主、特に使用する宿主細
胞に通常知られた方法に従って導入し、その宿主細胞を
形質転換させ、次のそのようにして形質転換された宿主
細胞を培養等の方法によって増殖させることなどによ
り、大量に形質転換体と呼ばれる外来遺伝子をも有し、
それがコードする蛋白質産生能を有し且つその蛋白質を
細胞外に排出することのできる細胞を得ることができ
る。

【００３４】ここで使用される宿主、特に宿主細胞とし
ては、大腸菌などのグラム陰性菌が好適に使用できる。
上記宿主への発現ベクターの導入法としては、通常遺伝
子組換え技術の分野で使用せられている方法を用いるこ
とができ、例えばコンピテント細胞と上記ベクターとを
混合したり、細胞をプロトプラスト化したのち、上記ベ
クターを担体に結合させて取り込ませるか、あるいは電
気パルス法、形質導入法、レーザーによるポーレーショ
ン法などを用いて行うことができる。

【００３５】このようにして得られた形質転換の増殖あ
るいは培養は、通常の各種細胞培養用培地を用いておこ
なうことができ、そのようなものとしては、例えば炭素
源、窒素源、ビタミン、アミノ酸、核酸、無機塩、有機
化合物などを含有し、適宜肉汁、ペプトン、カザミノ
酸、酵母エキス、魚肉エキス、バレイショ、麦芽汁、抗
生物質などを加えたものが挙げられるが、好適な培地は
一般に広く市販されているものを使用してそれをそのま
まあるいは適当に改変して用いることができる。

【００３６】上記形質転換体の増殖または培養にあたっ
ては、該形質転換体の生産に適したｐＨ、温度、通気、
光（照度）、攪拌、二酸化炭素濃度、培地交換の頻度な
どの条件は適宜選択され、好ましくは実験などにより決
定することができる。

【００３７】上記形質転換体を増殖または培養すること
により、本発明の蛋白排出遺伝子の制御をうけた外来遺
伝子発現に基づく蛋白質は、細胞外に出されることか
ら、通常の操作によりより簡単に分離採取することがで
きる。

【００３８】この分離採取法としては、先ず培養物から
細胞と培養上清とを遠心分離、膜濾過法などにより分離
し、得られた培養上清から、例えばタンパク質沈澱剤を
用いて沈澱処理するなどして分離する方法が挙げられ
る。

【００３９】このような分離精製法としては、各種塩類
を含んだ緩衝液による抽出処理、酸またはアルカリによ
る可溶化あるいは沈澱処理、さらには有機溶媒による抽
出あるいは沈澱処理、硫安などの蛋白質沈澱剤を用いる
塩析、透析、メンブレンフィルターなどを用いる限外濾
過、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフ
ィー、向流分配クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、高速流体クロマトグラフィー、等電
点あるいはゲル電気泳動などが挙げられ、それらは単独
あるいは適宜組合わせて用いられる。

【００４０】さらにまた、上記したような形質転換体か
ら採取された蛋白質は、必要に応じ適当な変性あるいは
再生処理など、例えば、グアニジン溶液で処理後透析す
るなどの、当該分野で知られた方法で、より好適な形態
のものにすることができる。

【００４１】その変性方法としては、ジチオスレイトー
ルなどによる還元法を利用し、透析するなどして行なう
ことができる。上記のようにして精製分離して得られた
蛋白質は、塩酸、硫酸などの酸、臭化シアン及びペプシ
ン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、アミノ
ペプチダーゼなどの蛋白質分解酵素などで加水分解した
後、得られたペプチド断片をイオン交換クロマトグラフ
ィーなどのクロマトグラフィーにかけて、精製したりあ
るいはそのアミノ酸組成などを分析すると共にそのアミ
ノ酸配列を決定することができる。

【００４２】上記遺伝子組換技術に用いられる方法は、
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ（１９８２）に記載された方法あるいはそこに引用さ
れた文献に記載された方法、さらにはそれらを適宜改変
した方法によって行うことができるが、本発明の目的及
び作用効果を果たす範囲内で適宜改変して適用すること
も許容される。

【００４３】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。

【００４４】実施例１ ＬＢ培地１００ｍｌで３７℃１晩培養したＢａｃｉｌｌ
ｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＦＤ０１２０の菌
体を５ｍｌの０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．８）に懸濁
後、凍結融解処理（−７０℃、３０分放置→３７℃、３
０分放置）し遠心分離によって菌体を回収した。次にリ
ゾチーム（２ｍｇ／ｍｌ）を含む上記緩衝液に懸濁して
３７℃で３０分間放置後、ＳＤＳを最終濃度０．５％に
なるように加え、６７℃、１５分インキュベイトしたの
ち、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
（２５／２４／１，ｖ／ｖ／ｖ）を全容量の２５％加
え、１０分間インキュベイトし、この操作を蛋白質が完
全に無くなるまで繰り返し行った。その後遠心分離し上
清に２倍量のエタノールを攪拌しながら加えてガラス棒
で染色体を巻き取った。これを７０％、８０％、９０％
のエタノールに各々２〜３分浸し精製水１．５ｍｌに懸
濁した。

【００４５】実施例２ 実施例１で得られたＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ染
色体ＤＮＡ ２０μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造
（株）製）で１５〜２３キロ塩基対程度の大きさになる
ように部分分解し、エタノール沈殿処理によって精製し
た。部分分解した染色体ＤＮＡ １μｇに対し制限酵素
ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩで２重切断されたλＥＭＢＬ３
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）２μｇを加えた後、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）を用いて４℃、一晩
反応させた。９−２３キロ塩基対の挿入断片をもつλＥ
ＭＢＬ３が選択的にパッケージされるキット（ＧＩＧＡ
ＰＡＣＫ ＧＯＬＤ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用
いて大腸菌中にＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓゲノム
の遺伝子ライブラリーを作製した。

【００４６】実施例３ 既に分泌蛋白質として知られているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉ
ｆｏｒｍｉｓ ＦＤ０１２０の細胞壁溶解酵素の遺伝子
（ｃｗｌＬ遺伝子）を含む染色体断片をベクターｐＵＣ
１９に連結し、細胞壁溶解性を指標にしてショットガン
法によりクローン化した。その上流の蛋白分泌調節領域
を含む断片をＥ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４にサブクロー
ニングした。このプラスミドより０．９６ｋｂのＰｓｔ
Ｉ断片（８７アミノ酸をコードするｘｐａＦ２以外にｃ
ｗｌＬ’の３’側をさらに削りとられたｃｗｌＬ”を含
む）を取り出し、ｐＵＣ１１８のＰｓｔＩ部位にｌａｃ
と方向性が合うように連結し、プラスミドｐＰＰを作製
した。このプラスミドｐＰＰを使ってＥ．ｃｏｌｉ Ｍ
Ｖ１１８４を形質転換し、アンピシリン耐性で選択し
た。得られた形質転換体をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６
８Ｓの細胞壁（０．６ｍｇ／ｍｌ），ＩＰＴＧ（４０ｍ
Ｍ），およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む
ＬＢ培地で細胞壁の溶解をメルクマールにして観察した
ところ、細胞壁溶解酵素ＣｗｌＬ”の菌体外排出の増加
が認められた。

【００４７】次にその０．９６ｋｂ ＰｓｔＩ断片をプ
ラークハイブリダイゼーションのプローブとして用いる
ためランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒
造（株）製）を用いて^３２Ｐ標識を行った。

【００４８】実施例４ 実施例２で得られた大腸菌中のＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ
ｒｍｉｓゲノム遺伝子ライブラリー合計１，０００個の
λプラークを既知の方法に従ってナイロンメンブレン
（Ｍｉｃｒｏｎ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ社製）に固定化
し実施例３で得られたプローブを用いてプラークハイブ
リダイゼーションを行った。

【００４９】実施例２で得られた遺伝子ライブラリー合
計１，０００個のプラークを５０％のホルムアミドを含
むハイブリダイゼーション溶液中で３７℃、４時間プレ
ハイブリダイゼーションを行ったのち実施例３で得られ
た標識プローブを加えてプラークハイブリダイゼーショ
ンを行った。３７℃で一晩保温した後２０ｍｌの２×Ｓ
ＳＣと１ｇのＳＤＳを含む２００ｍｌの溶液を用いて室
温で１０分間、４回洗浄を繰り返した。風乾後ＲＸフィ
ルム（フジ社製）を用いて−７０℃で一晩オートラジオ
グラフィーを行った結果、約４個の陽性クローンを得
た。得られた４個の陽性クローンについて同様な操作を
再度繰り返し最終的に２個の陽性クローンを得た。得ら
れた２種類の陽性クローンより既知の方法に従ってファ
ージＤＮＡを調製した。

【００５０】実施例５ 大腸菌中にクローン化した蛋白排出遺伝子の塩基配列を
解析するため実施例４で調製した１種類の陽性クローン
のファージ遺伝子を制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ、宝酒造
（株）製）で切断した。続いて実施例３に示したプラス
ミドｐＰＰのＰｓｔＩ断片をプローブとしてサザンハイ
ブリダイゼーションを行ったところ１種類のハイブリダ
イズしたＤＮＡバンドが観察された。このサイズに対応
する２．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を低融点アガロー
スゲル電気泳動を用いてＤＮＡ断片を既知の方法に従っ
て単離精製した。蛋白排出遺伝子が含まれていると推定
される配列についてディレーションミュータント法およ
びプライマーエクステンション法を用いて全塩基配列
〔配列番号２〕を決定した。

【００５１】実施例６ Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの蛋白排出遺伝子ｘｐ
ａＦ２と、枯草菌細胞壁溶解酵素遺伝子ｃｗｌＡをそれ
ぞれ含むプラスミドを共存させることにより細胞壁溶解
酵素ＣｗｌＡの大腸菌での菌体外排出を次のとおり行っ
た。

【００５２】実施例３のプラスミドｐＰＰからＢ．ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｘｐａＦ２遺伝子（蛋白排出
遺伝子）を含む０．３４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ断
片を取り出し、ベクターｐＨＳＧ３９８（宝酒造、クロ
ラムフェニコール耐性）のＥｃｏＲＩ，ＤｒａＩ部位に
連結したプラスミドｐＨＳＧＰＤを作成した。この結果
１ａｃプロモーターの下流に同じ方向性でｘｐａＦ２が
位置することとなった。一方ｃｗｌＡ遺伝子を含むプラ
スミドｐＢＡ３Ｂ４から１．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片を切り出し、ベクターｐＭＷ１１９（日本ジ
ーン、アンピシリン耐性）のＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ部
位に挿入したプラスミドｐＭＷＢ１を作成した。ｐＭＷ
Ｂ１中ではｃｗｌＡ遺伝子は１ａｃプロモーターの方向
性とは逆向きに位置していた。これら２つのプラスミド
を使ってＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アン
ピシリンとクロラムフェニコール耐性で選択しｐＨＳＧ
ＰＤとｐＭＷＢ１を共に持つ形質転換体を取得した。こ
の形質転換体をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８Ｓ細胞壁
（０．６ｍｇ／ｍｌ），ＩＰＴＧ（４０ｍＭ），アンピ
シリン（１００μｇ），およびクロラムフェニコール
（３０μｇ）を含むＬＢ寒天培地に塗り付け、ＣｗｌＡ
の菌休外排出を調べたところ、顕著な排出（ハロー）が
認められた。

【００５３】実施例７ Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＦＤ０１２０の蛋白
排出遺伝子を含む断片ｘｐａＧ１，ｘｐａＧ２をベクタ
ーｐＨＳＧ３９８に連結したプラスミドｐＨＳＧＫＨ
と、枯草菌細胞壁溶解酵素遺伝子ｃｗｌＡをベクターｐ
ＭＷ１１９に連結したプラスミドｐＭＷＢ１の共存によ
り細胞壁溶解酵素ＣｗｌＡの大腸菌での菌体外排出を次
のとおり行なった。

【００５４】λＥＭＢＬファージに連結したＢ．ｌｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＦＤ０１２０のＤＮＡ断片から
最初に２．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片をジーンクリー
ンにより取り出し、ＫｐｎＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化し
た後、生じた１．９ｋｂの断片（ｘｐａＧ１，ｘｐａＧ
２を含む）をベクターｐＨＳＧ３９８のＫｐｎＩ，Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ部位に連結し、これを使ってＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体から調製したプ
ラスミドｐＨＳＧＫＨは１．９ｋｂのＫｐｎＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片を含んでおり、１ａｃプロモーターの下流
に同じ方向性でｘｐａＧ１，ｘｐａＧ２が位置すること
を確認した。そこでｐＨＳＧＫＨと実施例６に示したｃ
ｗｌＡ遺伝子を持つプラスミドｐＭＷＢ１を使ってＥ．
ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン、クロ
ラムフェニコール耐性で選択した。得られた形質転換体
はｐＨＳＧＫＨとｐＭＷＢ１を共に含んでいた。そこで
この株をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８Ｓ細胞壁（０．
５ｍｇ／ｍｌ），ＩＰＴＧ（４０ｍＭ），アンピシリン
（１００μｇ／ｍｌ），およびクロラムフェニコール
（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗り付け、Ｃ
ｗｌＡの菌体外排出を調べたところ、顕著な蛋白排出
（ハロー）が認められた。

【００５５】実施例８ Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＦＤ０１２０の蛋白
排出遺伝子を含む断片ｘｐａＧ１，ｘｐａＧ２をｐＵＣ
１１８ＤＮＡ断片に連結し、これを使ってβ−ｇａｌａ
ｃｔｏｓｉｄａｓｅ遺伝子（１ａｃ）を染色体上に持つ
Ｅ．ｃｏｌｉＣ６００を形質転換し、生じた形質転換体
によるβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅの菌体外排出を
次のとおり行なった。

【００５６】実施例７で示した２．２ｋｂ ＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片中のＫｐｎＩ部位からおよそ０．９ｋｂまでの
長さのＤＮＡ断片（ＸＰａＧｌ，ＸＰａＧ２遺伝子を含
む）をベクターＰＵＣ１１８のマルチクローニング部位
に連結し、このプラスミドをｐＤ１４と名づけた。この
プラスミド（アンピシリン耐性を持つ）を使ってｌａｃ
＋であるＥ．ｃｏｌｉ Ｃ６００を形質転換し、アンピ
シリン耐性で選択した。得られた形質転換体をアンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ），およびＩＰＴＧ（１ｍＭ）
を含むＬＢ液体培地に植菌し増殖させた。増殖ならびに
β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性の経時変化を調べ
たところ、分泌しないことが知られているβ−ｇａｌａ
ｃｔｏｓｉｄａｓｅが菌体外に排出された。一方コント
ロールとしてＥ．ｃｏｌｉ Ｃ６００（ｐＵＣ１１８）
を同じ条件で培養したところ、排出はまったく認められ
なかった。

【００５７】〔配列表〕配列番号１はＢａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＦＤ０１２０株由来の
ｘｐａＦ１，ｘｐａＦ２を含むＤＮＡの配列を示す。配
列番号２はＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓ ＦＤ０１２０株由来のｘｐａＧ１，ｘｐａＧ２を
含むＤＮＡの配列を示す。

【配列表】

【００５８】配列番号：１ 名称：ｘｐａＦ１，ｘｐａＦ２ 配列の長さ：１０００ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：染色体ＤＮＡ 起源生物名：Ｂａｃｉｉｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ 株名：ＦＤ０１２０

【００５９】配列番号：２ 名称：ｘｐａＧ１，ｘｐａＧ２ 配列の長さ：２２０２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：染色体ＤＮＡ 起源生物名：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ 株名：ＦＤ０１２０

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:10）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１または配列番号２で示される
   ＤＮＡ配列またはそれと実質的に同等の蛋白排出活性を
   有する遺伝子。
2. 【請求項２】 配列番号１または配列番号２で示される
   ＤＮＡ配列またはそれと実質的に同等の蛋白排出活性を
   有する遺伝子を含有することを特徴とする発現ベクタ
   ー。
3. 【請求項３】 配列番号１または配列番号２で示される
   ＤＮＡ配列またはそれと実質的に同等の蛋白排出活性を
   有する遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換または
   形質導入せしめられた形質転換体または形質導入体。