JPH0777510A - Enzyme electrode - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To mass-produce high response disposable enzyme electrodes by printing measuring electrodes 'on an insulating substrate with a conductive ink containing a conductive powder, an enzyme, an electron transmission substance and a binder. CONSTITUTION:A conductive powder, e.g. carbon black, an enzyme, e.g. glucose oxidase, an electron transmission substance, e.g. benzoquinone, and a binder are mixed with a phosphoric acid buffer solution prepare a conductive ink. In this regard, the properties of ink, i.e., wettability with substrate, adhesion, viscosity, etc., are combined with the properties of electrode, i.e., wettability with the working liquid and the surface of electrode. Measuring electrodes 3 are then screen-printed with the conductive ink containing oxygen on a polyethylene terephthalate insulating substrate on which counter electrodes 1 of carbon are formed. It is then coated with a polymer layer 4 except a part of electrodes. This method realizes mass production.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、血液、尿等の体液試料
中の生体化学成分の濃度を簡易に定量する酵素電極に関
する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an enzyme electrode for easily quantifying the concentration of biochemical components in a body fluid sample such as blood or urine.

【０００２】[0002]

【従来の技術】近年、検量線の校正や電極の洗浄が不
要、すなわちメンテナンスフリーで小型化が可能なた
め、使い捨て型の酵素電極が注目されている。酵素電極
とは、一般には電極と固定化酵素から構成され、酵素反
応による物質変化を電極により電気信号の変化として取
りだし、その酵素が特異的に作用する基質の濃度を測定
するものである。ここでは、電極に酵素および電子伝達
物質を脱落しないよう固定化する技術が必要である。2. Description of the Related Art In recent years, disposable enzyme electrodes have been attracting attention because they do not require calibration of calibration curves or cleaning of electrodes, that is, they can be downsized without maintenance. The enzyme electrode is generally composed of an electrode and an immobilized enzyme, and changes a substance due to an enzyme reaction as an electric signal change by the electrode, and measures the concentration of a substrate on which the enzyme specifically acts. Here, a technique is required to immobilize the enzyme and the electron transfer substance on the electrode so as not to drop out.

【０００３】具体的には、 （イ）ポリマーや適当な粘度を持った化学物質中に酵素
や電子伝達物質を分散したものを電極上に塗布する（特
開平２−１２９５４１号公報など） （ロ）導電性ポリマーの電解重合により、中に酵素を閉
じこめた膜を電極上に形成する（特開昭６２−１１５２
８４号、特開平２−８５７５４号公報など） （ハ）感光性ポリマー中に酵素や電子伝達物質を分散さ
せて光硬化させ、３次元網目構造膜を電極上に形成する
（特開平２−２４０５５５号公報など） 等の方法がある。Specifically, (a) a polymer or a chemical substance having an appropriate viscosity, in which an enzyme or an electron transfer substance is dispersed, is applied onto an electrode (JP-A-2-129541, etc.). A film containing an enzyme therein is formed on an electrode by electrolytic polymerization of a conductive polymer (JP-A-62-1152).
No. 84, JP-A-2-85754, etc.) (C) An enzyme or an electron transfer substance is dispersed in a photosensitive polymer and photocured to form a three-dimensional network structure film on an electrode (JP-A-2-240555). No. gazette etc.) etc.

【０００４】これらの方法は、電極として金属あるいは
グラファイト、グラッシーカーボンなどのバルク状の電
極を用いているため、酵素や電子伝達物質などは必然的
に電極表面の別層中に重ねて塗布する形態となってしま
う。このため、効率的な電子授受が起こり難く応答性が
悪いため、必要以上に多量の酵素や電子伝達物質を使用
しなければならない。また、使用中層間で剥離しやすい
という問題点があった。さらに、小型化にも限界があ
り、使い捨て型の酵素電極として適切なものとは言い難
い。In these methods, since a bulk electrode such as metal or graphite or glassy carbon is used as the electrode, the enzyme and the electron transfer substance are inevitably applied in a separate layer on the surface of the electrode. Will be. Therefore, since efficient electron transfer does not occur easily and the responsiveness is poor, an unnecessarily large amount of enzyme or electron transfer substance must be used. Further, there is a problem that the layers are easily separated during use. Further, there is a limit to miniaturization, and it is hard to say that it is suitable as a disposable enzyme electrode.

【０００５】この問題点を解決した方法として、 （ニ）電極となる導電性粉末と共に、ポリマー中に酵素
または／および電子伝達物質を混合固定化する方法があ
る。この混合法では、酵素および電子伝達物質が電極と
なる導電性粉末の近傍に、あるいは表面に吸着して存在
しているため、電子授受がスムースに行われ、優れた応
答性が得られる。特開平２−８８９６０号や特開昭６１
−６１０４９号公報では、電子伝達物質をカーボン粉末
とともに混合、また、特開平２−９９８４９号、特開平
３−１７０８５４号、特開平３−１７０８５６号公報で
は、酵素を金属粉や金属修飾カーボン粉末等と混合して
電極を形成している。As a method for solving this problem, there is (d) a method of mixing and immobilizing an enzyme or / and an electron transfer substance in a polymer together with a conductive powder serving as an electrode. In this mixing method, the enzyme and the electron transfer substance are present in the vicinity of the conductive powder serving as the electrode or adsorbed on the surface thereof, so that the electron transfer is smoothly performed and excellent responsiveness is obtained. JP-A-2-88960 and JP-A-61
In JP-A-61049, an electron transfer substance is mixed with carbon powder, and in JP-A-2-99849, JP-A-3-170854 and JP-A-3-170856, an enzyme is used as a metal powder or a metal-modified carbon powder. To form an electrode.

【０００６】しかしながら、効率的な電子授受を行わせ
る為には、酵素あるいは電子伝達物質のどちらか一方だ
けでなく、両者ともに導電性粉末とともに固定化される
のが望ましいが、上記の公報に開示されたのもは、酵素
あるいは電子伝達物質のどちらか一方のみが、導電性粉
末とともに固定化されているので効率が悪い。また、そ
もそも全て必要な成分を含む導電性インキとし、印刷方
式と組み合わせることにより、電極形成と酵素固定化の
両者が一工程で作成でき、製造コストを低くする事がで
きるのである。However, in order to perform efficient electron transfer, it is desirable that both the enzyme and the electron transfer substance be immobilized together with the conductive powder, but it is disclosed in the above-mentioned publication. However, the efficiency is poor because only one of the enzyme and the electron transfer substance is immobilized together with the conductive powder. Further, by using a conductive ink containing all necessary components in the first place and combining it with a printing method, both electrode formation and enzyme immobilization can be prepared in one step, and the manufacturing cost can be reduced.

【０００７】これに対して、特開平２−２９８８５５号
や特表平３−５０３９３１号公報の様に導電性粉末と酵
素および電子伝達物質を含んで成る電極部を持つものも
一部開示されている。しかしながら、これらはペースト
状の電極成分を電極ホルダ等の容器につめて用いてお
り、使い捨てあるいは小型のセンサーにふさわしい形態
とは言い難い。[0007] On the other hand, some of those disclosed in JP-A-2-298855 and JP-A-3-503931 having an electrode portion containing a conductive powder, an enzyme and an electron transfer substance are also disclosed. There is. However, since these paste-like electrode components are packed in a container such as an electrode holder and used, it cannot be said that they are suitable for a disposable or small sensor.

【０００８】[0008]

【発明が解決しようとする課題】よって、本発明が解決
しようとする課題は、優れた応答性を持ち、大量生産技
術により製造可能な一回限りの使い捨て酵素電極を提供
する事である。Therefore, the problem to be solved by the present invention is to provide a one-time disposable enzyme electrode which has excellent responsiveness and can be manufactured by a mass production technique.

【０００９】[0009]

【課題を解決するための手段】本発明は、絶縁性基板上
に設けられた少なくとも測定極と対極とを有する電極系
において、測定極が少なくとも導電性粉末、酵素、電子
伝達物質およびバインダーを含む導電性インキからな
り、印刷方式により形成された酵素電極である。According to the present invention, in an electrode system having at least a measuring electrode and a counter electrode provided on an insulating substrate, the measuring electrode contains at least a conductive powder, an enzyme, an electron transfer substance and a binder. An enzyme electrode made of a conductive ink and formed by a printing method.

【００１０】この場合インキとして必要な特性として
は、基板との濡れ性、接着性、粘度が重要である。ま
た、電極として実際に測定に用いた場合には、検液と電
極表面の濡れ性が必要である。この様な特性は、主にバ
インダーの性質に支配される。本発明で用いるバインダ
ーは上述のような性質の他に、導電性粉末、酵素および
電子伝達物質との親和性すなわち馴染みがよくなければ
ならない。また酵素は強い有機溶剤によって変性され失
活してしまうおそれがあるため、アセトンやトルエン等
の強い有機溶剤にしか溶けないバインダーは用いること
ができない。In this case, the wettability with the substrate, the adhesiveness and the viscosity are important as the properties required for the ink. Further, when actually used for measurement as an electrode, wettability between the test solution and the electrode surface is required. Such properties are mainly controlled by the properties of the binder. In addition to the properties described above, the binder used in the present invention must have good affinity, that is, compatibility with the conductive powder, the enzyme, and the electron mediator. Further, since the enzyme may be denatured and deactivated by a strong organic solvent, a binder that is soluble only in a strong organic solvent such as acetone or toluene cannot be used.

【００１１】具体的には、でんぷん系・セルロース系・
アルギン酸系・ガム類・タンパク質系などの天然高分子
類、アクリル系・ブチラール系・酢酸ビニル共重合体系
・ポリアミド系・ポリエステル系・ポリウレタン系など
の合成高分子類が挙げられる。水溶性のバインダーを用
いる場合には、非水溶性バインダーと混合して用いる必
要がある。水溶性バインダーのみでは使用中に電極部の
溶解、脱落が起きてしまい測定できなくなる。バインダ
ーの総含有量は、バインダー量を減らして導電性粉末の
添加量を増加すると高導電性が得られる傾向にあるので
少ない方が好ましいが、インキとしての流動性や基材へ
の接着性等とのバランスで決定され、通常総固形分の５
〜５０％程度である。Specifically, starch-based / cellulose-based
Examples include natural polymers such as alginic acid type, gums, protein type, and synthetic polymers such as acrylic type, butyral type, vinyl acetate copolymer type, polyamide type, polyester type, polyurethane type. When using a water-soluble binder, it is necessary to mix it with a water-insoluble binder. If the water-soluble binder alone is used, the electrode part will dissolve and fall off during use, making measurement impossible. It is preferable that the total content of the binder is small because the high conductivity tends to be obtained when the amount of the binder is increased and the amount of the conductive powder is increased. It is determined by the balance with
It is about 50%.

【００１２】電極として働く導電性粉末としては、金属
およびその酸化物、カーボン、グラファイト等の顔料が
挙げられるが、コスト、表面の親水性およびインキ適性
等よりカーボンブラックが好ましい。インキ中に含有さ
せる酵素は、酸化還元酵素であれば特に制限なく、たと
えばグルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダ
ーゼ、ラクテートオキシダーゼ、アルコールオキシダー
ゼ、キサンチンオキシダーゼ、ピルベートオキシダー
ゼ、アルデヒドオキシダーゼ等が用いられる。添加量
は、それぞれの酵素の活性に応じて変えることができ
る。酵素は高価であるため、性能を発揮できる範囲では
含有量は少ない方が好ましい。Examples of the electroconductive powder that works as an electrode include metals and oxides thereof, pigments such as carbon and graphite, and carbon black is preferable in terms of cost, hydrophilicity on the surface, suitability for ink and the like. The enzyme contained in the ink is not particularly limited as long as it is a redox enzyme, and for example, glucose oxidase, cholesterol oxidase, lactate oxidase, alcohol oxidase, xanthine oxidase, pyruvate oxidase, aldehyde oxidase and the like are used. The addition amount can be changed according to the activity of each enzyme. Since the enzyme is expensive, it is preferable that the content is small within the range where the performance can be exhibited.

【００１３】電子伝達物質としては、酸化還元酵素の電
子伝達体として機能するレドックス化合物であれば特に
制限されない。具体的には、フェロセンおよびその誘導
体、ベンゾキノン、メチレンブルー、２，６−ジクロロ
インドフェノール、金属シアン化錯体等が挙げられる。The electron transfer substance is not particularly limited as long as it is a redox compound that functions as an electron transfer agent for oxidoreductase. Specific examples include ferrocene and its derivatives, benzoquinone, methylene blue, 2,6-dichloroindophenol, and metal cyanide complex.

【００１４】絶縁性基板としては、セラミック、ガラ
ス、ガラスエポキシ、プラスチック等、検液によって侵
されないものであればなんでもよいが、使い捨てである
ため安価で扱い易いポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポ
リエチレン、ポリプロピレン等のプラスチックフィルム
が好ましい。なお、一般的に体液中に含まれる特定の生
体成分、例えばアスコルビン酸等によって測定中検体の
ｐＨが変化しないよう緩衝作用を働かせるため、緩衝剤
を添加してもよい。細粉砕した固体の緩衝剤を導電性粉
末、酵素、バインダーとともにインキ中に混合する、あ
るいは水溶液として添加しても良い。電極が測定時検体
と接したときに、検体中の水分によって電極中の固体の
緩衝剤が溶かされて緩衝作用を発揮する。The insulating substrate may be ceramic, glass, glass epoxy, plastic or the like as long as it is not corroded by a test liquid, but it is disposable and inexpensive and easy to handle. Polyvinyl chloride, polyester, polyethylene, polypropylene and the like. Of plastic films are preferred. A buffering agent may be added in order to exert a buffering action so that the pH of the sample during measurement is not changed by a specific biological component contained in the body fluid, such as ascorbic acid. A finely pulverized solid buffer may be mixed with the conductive powder, enzyme, and binder in the ink, or added as an aqueous solution. When the electrode comes into contact with the sample at the time of measurement, the solid buffering agent in the electrode is dissolved by the water in the sample to exert a buffering action.

【００１５】緩衝剤は用いる酵素の至適ｐＨに合わせて
種類を選択し、測定に用いる検体量から１電極あたりに
加える量を計算して決定する。例えばグルコースオキシ
ダーゼはｐＨ７付近で最大の活性を示すため、りん酸系
の緩衝剤を選び、検体に溶け出した時の濃度が、０．０
５〜０．０２５モル程度となるように含有量を決める。The type of buffer is selected according to the optimum pH of the enzyme used, and the amount added per electrode is calculated and determined from the amount of the sample used for measurement. For example, glucose oxidase has the maximum activity around pH 7, and therefore, when a phosphate buffer is selected and dissolved in the sample, the concentration is 0.0
The content is determined so as to be about 5 to 0.025 mol.

【００１６】印刷方法としては、スクリーン印刷の他、
グラビア印刷、グラビアオフセット印刷、ノズルコーテ
ィング、ディスペンサー印刷、インキジェット印刷等が
応用できる。例えば、スクリーン印刷方法にて形成する
場合には、インキ粘度が１０〜２０００ポイス゛程度に
なるよう調整し、１００〜４００メッシュのスクリーン
版を用いて印刷し、電極部を形成する。As a printing method, in addition to screen printing,
Gravure printing, gravure offset printing, nozzle coating, dispenser printing, ink jet printing, etc. can be applied. For example, in the case of forming by a screen printing method, the viscosity of the ink is adjusted to about 10 to 2000 poise and printing is performed using a screen plate of 100 to 400 mesh to form the electrode part.

【００１７】[0017]

【作用】酵素が基質を酸化あるいは還元し、電子を電子
伝達物質から導電性粉末へとレドックス反応により授受
する場合、本発明の酵素電極によると、酵素および電子
伝達物質が導電性粉末の近傍に、あるいは表面に吸着し
て存在するため、電子授受がスムーズに行われやすい。
また、印刷方式と組み合わせることによって、電極形成
と酵素および電子伝達物質の固定化を一工程で行うこと
が可能であり、１回限りの使い捨て電極を簡単な大量生
産技術により製造することができる。When the enzyme oxidizes or reduces the substrate and transfers electrons from the electron transfer substance to the conductive powder by the redox reaction, according to the enzyme electrode of the present invention, the enzyme and the electron transfer substance are located near the conductive powder. Or, since it exists by being adsorbed on the surface, it is easy to transfer electrons smoothly.
Further, by combining with a printing method, it is possible to perform electrode formation and immobilization of an enzyme and an electron transfer substance in one step, and a one-time disposable electrode can be manufactured by a simple mass production technique.

【００１８】[0018]

【実施例】【Example】

〈実施例１〉グルコースオキシダーゼによって血液中の
グルコースを測定する場合の例を示す。アセチレンブラ
ック（旭電化工業（株）製）１０ｇ、フェリシアン化カ
リウム１ｇ、カルボキシメチルセルロース１０％溶液２
０ｇ、ポリエステル樹脂エリーテルＵＥ−３２００（ユ
ニチカ（株）製）の１０％溶液４０ｇおよび酢酸セロソ
ルブ１００ｇを３本ロールにて混合分散させた。これ
に、グルコースオキシダーゼ（関東化学（株）製）０．
５ｇを０．１モルりん酸緩衝液に溶解したものを添加
し、均一になるまで混合して導電性インキを作製した。Example 1 An example of measuring glucose in blood by glucose oxidase will be described. Acetylene black (Asahi Denka Kogyo KK) 10 g, potassium ferricyanide 1 g, carboxymethylcellulose 10% solution 2
0 g, 40 g of a 10% solution of polyester resin Elitel UE-3200 (manufactured by Unitika Ltd.) and 100 g of cellosolve acetate were mixed and dispersed with a three-roll mill. Glucose oxidase (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.)
What melt | dissolved 5 g in 0.1 mol phosphate buffer was added, and it mixed until it became uniform, and the conductive ink was produced.

【００１９】カーボンの対極（１）を設けたポリエチレ
ンテレフタレートからなる絶縁性の基板（２）に、上述
の酵素含有導電性インキを用いてスクリーン印刷法によ
って測定極（３）を形成した。このとき用いたスクリー
ン版は、１５０メッシュ、ゾル厚８０μｍである。その
上に電極を一部残して絶縁性のポリマー層（４）を上に
設けた。このようにして作製した酵素電極を用いて、グ
ルコース濃度と出力電流の関係を調べるためにグルコー
ス濃度をいろいろ変えて調整したグルコース溶液を電極
上に滴下し、測定極にＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して
＋０．７Ｖを印加して３０秒後に増加する電流を測定し
た。結果を図２に示す。グルコース濃度０〜３０ミリモ
ルの範囲で良好な応答が得られた。A measuring electrode (3) was formed on the insulating substrate (2) made of polyethylene terephthalate provided with a carbon counter electrode (1) by the screen printing method using the above-mentioned enzyme-containing conductive ink. The screen plate used at this time has 150 mesh and a sol thickness of 80 μm. An insulative polymer layer (4) was provided on the electrode, leaving a part of the electrode thereon. Using the enzyme electrode thus prepared, a glucose solution prepared by varying the glucose concentration in order to investigate the relationship between the glucose concentration and the output current was dripped on the electrode, and the Ag / AgCl reference electrode was used as a measuring electrode with respect to the reference electrode. Then, +0.7 V was applied, and the increasing current was measured after 30 seconds. The results are shown in Figure 2. Good response was obtained in the glucose concentration range of 0 to 30 mmol.

【００２０】〈実施例２〉カーボンブラック−コンダク
テックスＳＣ（コロンビアンカーボン社製）１５ｇ、フ
ェロセン２ｇ、ブチラール樹脂エスレック（ユニチカ
（株）製）の５％溶液１００ｇおよびブチルセロソルブ
１００ｇをペイントシェーカーにて３時間混合分散させ
た。これに、グルコースオキシダーゼ（関東化学（株）
製）０．５ｇを０．１モルりん酸緩衝液５ｍｌに溶解し
たものを添加し、均一になるまで混合して導電性インキ
を作製した。Example 2 15 g of carbon black-Conductex SC (manufactured by Colombian Carbon Co.), 2 g of ferrocene, 100 g of a 5% solution of butyral resin S-REC (manufactured by Unitika Ltd.) and 100 g of butyl cellosolve were mixed with a paint shaker. It was mixed and dispersed for a time. In addition to this, glucose oxidase (Kanto Chemical Co., Inc.)
(Manufactured by Mitsui Chemicals Co., Ltd.) 0.5 g dissolved in 5 ml of 0.1 mol phosphate buffer was added and mixed until uniform to prepare a conductive ink.

【００２１】この導電性インキを用いて、ディスペンサ
ー印刷方式によって電極部を形成する以外は実施例１と
同様の構成で酵素電極を作成した。この酵素電極を用い
て、グルコース濃度と出力電流の関係を調べるためにグ
ルコース濃度をいろいろ変えて調整したグルコース溶液
を電極上に滴下し、測定極にＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極に
対して＋０．４Ｖを印加して３０秒後に増加する電流を
測定した。結果を図３に示す。グルコース濃度０〜５０
ミリモルの範囲で良好な応答が得られた。Using this conductive ink, an enzyme electrode was prepared in the same configuration as in Example 1 except that the electrode portion was formed by the dispenser printing method. Using this enzyme electrode, in order to investigate the relationship between the glucose concentration and the output current, a glucose solution prepared by varying the glucose concentration was dropped on the electrode and +0.4 V was applied to the measurement electrode with respect to the Ag / AgCl reference electrode. The increasing current was measured 30 seconds after the application. The results are shown in Fig. 3. Glucose concentration 0-50
Good responses were obtained in the millimolar range.

【００２２】[0022]

【発明の効果】本発明の酵素電極においては、上述の作
用により電子授受がスムーズに行われやすい。このた
め、（ａ）出力安定までの時間が短い、（ｂ）ばらつき
が小さく再現性が高い、（ｃ）保存安定性が高い、等の
効果が得られた。さらに、１工程で測定極が形成できる
ため、低コスト化が可能となり、使い捨てタイプに好適
な電極を得ることができる。EFFECT OF THE INVENTION In the enzyme electrode of the present invention, electrons are easily exchanged due to the above-mentioned action. Therefore, effects such as (a) short time until output stabilization, (b) small variations and high reproducibility, and (c) high storage stability were obtained. Furthermore, since the measuring electrode can be formed in one step, the cost can be reduced and an electrode suitable for a disposable type can be obtained.

【００２３】[0023]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明の一実施例に係る酵素電極の斜視図であ
る。FIG. 1 is a perspective view of an enzyme electrode according to an embodiment of the present invention.

【図２】実施例１におけるグルコース濃度と出力電流の
関係を示すグラフ図である。FIG. 2 is a graph showing the relationship between glucose concentration and output current in Example 1.

【図３】実施例２におけるグルコース濃度と出力電流の
関係を示すグラフ図である。FIG. 3 is a graph showing the relationship between glucose concentration and output current in Example 2.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

１…対極 ２…絶縁性の基板 ３…測定極 ４…絶縁性
ポリマー層1 ... Counter electrode 2 ... Insulating substrate 3 ... Measuring electrode 4 ... Insulating polymer layer

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】絶縁性基板上に設けられた少なくとも測定
極と対極とを有する電極系において、測定極が少なくと
も導電性粉末、酵素、電子伝達物質およびバインダーを
含む導電性インキからなり、印刷方式により形成された
ことを特徴とする酵素電極。1. An electrode system having at least a measuring electrode and a counter electrode provided on an insulating substrate, wherein the measuring electrode comprises a conductive ink containing at least a conductive powder, an enzyme, an electron transfer substance and a binder, and a printing method. An enzyme electrode formed by: