JPH0771515B2 - ビリルビンの光学的測定法および測定用試薬 - Google Patents
ビリルビンの光学的測定法および測定用試薬Info
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- JPH0771515B2 JPH0771515B2 JP1327523A JP32752389A JPH0771515B2 JP H0771515 B2 JPH0771515 B2 JP H0771515B2 JP 1327523 A JP1327523 A JP 1327523A JP 32752389 A JP32752389 A JP 32752389A JP H0771515 B2 JPH0771515 B2 JP H0771515B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、臨床検査上有用なビリルビンの光学的測定法
および測定用試薬、さらに詳しくは、ビリルビン含有検
体を、緩衝液中、亜鉛化合物、発色剤およびビリルビン
オキシダーゼを反応させることを特徴とするビリルビ
ン、とくに総ビリルビンおよび直接ビリルビンを光学的
に測定する方法、およびそれに用いる試薬に関する。
および測定用試薬、さらに詳しくは、ビリルビン含有検
体を、緩衝液中、亜鉛化合物、発色剤およびビリルビン
オキシダーゼを反応させることを特徴とするビリルビ
ン、とくに総ビリルビンおよび直接ビリルビンを光学的
に測定する方法、およびそれに用いる試薬に関する。
従来の技術 ビリルビンには抱合（直接）型と非抱合（間接）型があ
り、これら直接ビリルビンと間接ビリルビンを合わせ
て、総ビリルビンと称している。一般に、臨床検査で測
定されるビリルビンは総ビリルビンと直接ビリルビンで
あり、間接ビリルビンはこれらの差として求められてい
る。ビリルビンと病態との関係は例えば急性閉塞性黄疸
では血中に直接ビリルビンが増加する。一方、溶血性貧
血では間接ビリルビンが増加する。従って、総ビリルビ
ン、直接ビリルビンの正確な定量は臨床検査上不可欠で
ある。
り、これら直接ビリルビンと間接ビリルビンを合わせ
て、総ビリルビンと称している。一般に、臨床検査で測
定されるビリルビンは総ビリルビンと直接ビリルビンで
あり、間接ビリルビンはこれらの差として求められてい
る。ビリルビンと病態との関係は例えば急性閉塞性黄疸
では血中に直接ビリルビンが増加する。一方、溶血性貧
血では間接ビリルビンが増加する。従って、総ビリルビ
ン、直接ビリルビンの正確な定量は臨床検査上不可欠で
ある。
このような血清ビリルビンの測定法としては、一般にエ
ベリン−マロイ（Evelyn−Malloy）法やミハエルソン
（Michaelsson）法によるジアゾ試薬による比色法が採
用されているが、この方法では反応の特異性、操作の煩
雑性などの欠点がある。
ベリン−マロイ（Evelyn−Malloy）法やミハエルソン
（Michaelsson）法によるジアゾ試薬による比色法が採
用されているが、この方法では反応の特異性、操作の煩
雑性などの欠点がある。
最近、酵素を用いた総ビリルビンの測定が開発されてお
り、例えばアガリカス・ビスポラス（Agaricus bisporu
s）の由来にビリルビンオキシダーゼを用いる測定法
（特公昭58−11194号）、ミロセシウム属（Myrotheciu
m）由来のビリルビンオキシダーゼを用いる測定法（特
開昭59−17999号）およびエビタケ（Trachydermatsunod
ac）由来のビリルビンオキシダーゼＭ−１を用いる測定
法（特開昭60−249060号）などがある。さらに、この酵
素法による直接ビリルビンの測定法も開発されている
（特公昭61−44000号）。この酵素法は、ビリルビンオ
キシダーゼをビリルビン含有検体に作用させて、生じる
ビリルビンの黄色色調の減少を光学的に測定する方法で
あって、反応の特異性による正確にビリルビンの定量が
可能である点で化学的方法より優れた方法であるが、盲
検を必要とする欠点がある。
り、例えばアガリカス・ビスポラス（Agaricus bisporu
s）の由来にビリルビンオキシダーゼを用いる測定法
（特公昭58−11194号）、ミロセシウム属（Myrotheciu
m）由来のビリルビンオキシダーゼを用いる測定法（特
開昭59−17999号）およびエビタケ（Trachydermatsunod
ac）由来のビリルビンオキシダーゼＭ−１を用いる測定
法（特開昭60−249060号）などがある。さらに、この酵
素法による直接ビリルビンの測定法も開発されている
（特公昭61−44000号）。この酵素法は、ビリルビンオ
キシダーゼをビリルビン含有検体に作用させて、生じる
ビリルビンの黄色色調の減少を光学的に測定する方法で
あって、反応の特異性による正確にビリルビンの定量が
可能である点で化学的方法より優れた方法であるが、盲
検を必要とする欠点がある。
また、酵素での反応に際して発色剤を用いてビリルビン
を発色させる発色法による総ビリルビンの測定法も開発
されており、例えば、発色剤として３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノン−ヒドラゾン（MBTH）を用い、これと
ビリルビンオキシダーゼＭ−１を作用させて赤色色素を
生成させたのち、塩酸などの強酸を用いて酸性にして生
成する青色色素を光学的に測定することによりビリルビ
ンを定量する方法（特開昭61−31096号）、さらに他の
ビリルビンオキシダーゼを用いて同様に処理するビリル
ビンの定量法（特開昭62−112068号）などが知られてい
る。
を発色させる発色法による総ビリルビンの測定法も開発
されており、例えば、発色剤として３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノン−ヒドラゾン（MBTH）を用い、これと
ビリルビンオキシダーゼＭ−１を作用させて赤色色素を
生成させたのち、塩酸などの強酸を用いて酸性にして生
成する青色色素を光学的に測定することによりビリルビ
ンを定量する方法（特開昭61−31096号）、さらに他の
ビリルビンオキシダーゼを用いて同様に処理するビリル
ビンの定量法（特開昭62−112068号）などが知られてい
る。
さらに上記発色法における酵素の代わりに塩化第二鉄を
用いる化学的発色法によるビリルビンの測定法も提案さ
れている［J.Fog,Nature195,490（1962）］。
用いる化学的発色法によるビリルビンの測定法も提案さ
れている［J.Fog,Nature195,490（1962）］。
このような発色法によるビニルビンの測定法においては
検体盲検が不要であるため、この点ではビリルビンの黄
色色調の減少を測るいわゆる酵素法よりは優れている
が、反応後の溶液を酸性にする必要があるため操作が煩
雑となり迅速性に欠け、自動分析に適さない欠点があ
る。さらに総ビリルビンを測定するにはコール酸ナトリ
ウム、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などの直接化剤
の使用が必要であるが、酸性にした場合、直接化剤が不
溶となって溶液が白濁するため測定が不能となる。した
がって、実際の患者血清についてかかる発色法が総ビリ
ルビンを測定することができず、また直接ビリルビンの
測定もできない。
検体盲検が不要であるため、この点ではビリルビンの黄
色色調の減少を測るいわゆる酵素法よりは優れている
が、反応後の溶液を酸性にする必要があるため操作が煩
雑となり迅速性に欠け、自動分析に適さない欠点があ
る。さらに総ビリルビンを測定するにはコール酸ナトリ
ウム、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などの直接化剤
の使用が必要であるが、酸性にした場合、直接化剤が不
溶となって溶液が白濁するため測定が不能となる。した
がって、実際の患者血清についてかかる発色法が総ビリ
ルビンを測定することができず、また直接ビリルビンの
測定もできない。
発明が解決しようとする課題 上述のとおり、従来知られているビリルビンの測定法に
おいては、化学的方法では反応の非特異性、操作の煩雑
性の欠点があり、酵素法では反応の特異性において化学
的方法よりも優れているが、検体盲検を要する欠点があ
り、さらにMBTHなどの発色剤を用いる発色法では、検体
盲検を必要をしない点では酵素法よりも優れているが、
これを自動分析で行なうには、試薬の安定性を考慮する
と、第１試薬に発色剤を含む緩衝液、第２試薬にビリル
ビンオキシダーゼ、第３試薬に酸性溶液と分けなければ
ならず、操作も３工程と煩雑であり迅速性に欠け、さら
に最終反応液を強酸酸性とするためコール酸ナトリウ
ム、SDSなどの直接化剤が不溶となって用いられず、し
たがって総ビリルビン、直接ビリルビンの測定ができな
い。
おいては、化学的方法では反応の非特異性、操作の煩雑
性の欠点があり、酵素法では反応の特異性において化学
的方法よりも優れているが、検体盲検を要する欠点があ
り、さらにMBTHなどの発色剤を用いる発色法では、検体
盲検を必要をしない点では酵素法よりも優れているが、
これを自動分析で行なうには、試薬の安定性を考慮する
と、第１試薬に発色剤を含む緩衝液、第２試薬にビリル
ビンオキシダーゼ、第３試薬に酸性溶液と分けなければ
ならず、操作も３工程と煩雑であり迅速性に欠け、さら
に最終反応液を強酸酸性とするためコール酸ナトリウ
ム、SDSなどの直接化剤が不溶となって用いられず、し
たがって総ビリルビン、直接ビリルビンの測定ができな
い。
したがって、上記のような欠点のない、総ビリルビン、
直接ビリルビンが容易に測定し得る方法の開発が望まれ
ている。
直接ビリルビンが容易に測定し得る方法の開発が望まれ
ている。
課題を解決するための手段 本発明者らは、上記のような欠点のない改良されたビリ
ルビンの測定法を見い出すべく種々研究を重ねた結果、
前記酵素を用いた発色法において、亜鉛化合物の存在下
に、発色剤およびビリルビンオキシダーゼを反応させる
ことにより、反応液を強酸酸性にすることなく安定な緑
色色素が生成し、きわめて容易に測定が可能であり、し
かも緩衝液のpHを適当な範囲に調節することにより総ビ
リルビンおよび直接ビリルビンも測定できることを知
り、本発明を完成するに至った。
ルビンの測定法を見い出すべく種々研究を重ねた結果、
前記酵素を用いた発色法において、亜鉛化合物の存在下
に、発色剤およびビリルビンオキシダーゼを反応させる
ことにより、反応液を強酸酸性にすることなく安定な緑
色色素が生成し、きわめて容易に測定が可能であり、し
かも緩衝液のpHを適当な範囲に調節することにより総ビ
リルビンおよび直接ビリルビンも測定できることを知
り、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ビリルビンの光学的測定法におい
て、ビリルビン含有検体を適当な緩衝液中で、亜鉛化合
物、発色剤およびビリルビンオキシダーゼと反応させる
ことを特徴とするビリルビンの測定法を提供するもので
ある。本発明の他の目的は、緩衝液としてpH6.0〜9.0の
緩衝液を用いて総ビリルビンを測定する方法を提供する
ことである。本発明のさらに他の目的は、緩衝液とし
て、pH3.0〜4.5の緩衝液を用いて直接ビリルビンを測定
する方法を提供することである。本発明のさらに他の目
的は、これらの測定法に用いられるビリルビン測定用試
薬を提供するものである。
て、ビリルビン含有検体を適当な緩衝液中で、亜鉛化合
物、発色剤およびビリルビンオキシダーゼと反応させる
ことを特徴とするビリルビンの測定法を提供するもので
ある。本発明の他の目的は、緩衝液としてpH6.0〜9.0の
緩衝液を用いて総ビリルビンを測定する方法を提供する
ことである。本発明のさらに他の目的は、緩衝液とし
て、pH3.0〜4.5の緩衝液を用いて直接ビリルビンを測定
する方法を提供することである。本発明のさらに他の目
的は、これらの測定法に用いられるビリルビン測定用試
薬を提供するものである。
本発明によるビリルビンの測定はビリルビン含有検体に
亜鉛化合物と発色剤を含む緩衝液を加え、予加温後、ビ
リルビンオキシダーゼを加えて反応させ、生じた緑色の
生成物を比色法により測定することにより行なわれる。
この方法では、前記特開昭62−112068号に記載の方法の
ように、反応後に反応液を強酸酸性にする必要なしに、
分子吸光係数の大きい安定した緑色色素が生成される。
また、公知の発色法におけるように、ビリルビンオキシ
ダーゼと発色剤のみを反応させた場合には、非特異性反
応に基づく妨害吸収が認められるが、本発明方法におけ
るように、亜鉛化合物の存在下で反応させれば、その亜
鉛化合物がかかる妨害吸収を消去する作用も示すため、
正確なビリルビンの測定が可能となる。
亜鉛化合物と発色剤を含む緩衝液を加え、予加温後、ビ
リルビンオキシダーゼを加えて反応させ、生じた緑色の
生成物を比色法により測定することにより行なわれる。
この方法では、前記特開昭62−112068号に記載の方法の
ように、反応後に反応液を強酸酸性にする必要なしに、
分子吸光係数の大きい安定した緑色色素が生成される。
また、公知の発色法におけるように、ビリルビンオキシ
ダーゼと発色剤のみを反応させた場合には、非特異性反
応に基づく妨害吸収が認められるが、本発明方法におけ
るように、亜鉛化合物の存在下で反応させれば、その亜
鉛化合物がかかる妨害吸収を消去する作用も示すため、
正確なビリルビンの測定が可能となる。
本発明で用いられる亜鉛化合物としては、亜鉛を含有す
る物質であればいずれも使用でき、例えば、酸化亜鉛、
水酸化亜鉛などの亜鉛酸化物、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛など
の無機酸亜鉛、酢酸亜鉛、乳酸亜鉛などの有機酸亜鉛、
フッ化亜鉛、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛などのハ
ロゲン化亜鉛、シアン化亜鉛などが挙げられる。これら
亜鉛化合物は適当な濃度で用いられるが、分子吸光係数
の大きい緑色色素をうるには、反応系中の濃度として、
総ビリルビン測定用には0.02〜3.0mM、好ましくは0.05
〜2.1mM、直接ビリルビン測定用には0.1〜3.0mM、好ま
しくは0.4〜2.1mMの範囲である。
る物質であればいずれも使用でき、例えば、酸化亜鉛、
水酸化亜鉛などの亜鉛酸化物、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛など
の無機酸亜鉛、酢酸亜鉛、乳酸亜鉛などの有機酸亜鉛、
フッ化亜鉛、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛などのハ
ロゲン化亜鉛、シアン化亜鉛などが挙げられる。これら
亜鉛化合物は適当な濃度で用いられるが、分子吸光係数
の大きい緑色色素をうるには、反応系中の濃度として、
総ビリルビン測定用には0.02〜3.0mM、好ましくは0.05
〜2.1mM、直接ビリルビン測定用には0.1〜3.0mM、好ま
しくは0.4〜2.1mMの範囲である。
用いられる発色剤としては、前記MBTHのほか、２−ヒド
ラジノベンゾチアゾール、１−ヒドラジノピタラジン塩
酸塩が挙げられ、いずれも安定な緑色色素を生成する。
発色剤の使用量は所望の発色効果を達成する範囲で適宜
選択されるが、通常0.3〜30mMの範囲から選ばれる。
ラジノベンゾチアゾール、１−ヒドラジノピタラジン塩
酸塩が挙げられ、いずれも安定な緑色色素を生成する。
発色剤の使用量は所望の発色効果を達成する範囲で適宜
選択されるが、通常0.3〜30mMの範囲から選ばれる。
緩衝液としては亜鉛化合物に対してキレート作用のない
ものであれば、公知のいずれの緩衝液も使用され得る
が、測定する対象が総ビリルビンか直接ビリルビンかに
よってpH範囲の異なるものが用いられる。
ものであれば、公知のいずれの緩衝液も使用され得る
が、測定する対象が総ビリルビンか直接ビリルビンかに
よってpH範囲の異なるものが用いられる。
総ビリルビン測定用には、pH6.0〜9.0の範囲の緩衝液が
用いられ、例えば、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−ア
ミノエタンスルホン酸（ACES）緩衝液、３−（Ｎ−モル
ホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（MOPS
O）緩衝液、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン
酸（MOPS）緩衝液、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチルアミノ］−２−ハイドロキシプロパンスルホ
ン酸（TAPSO）緩衝液などのグッド緩衝液でpH6.0〜9.0
の範囲のものが挙げられる。なお、総ビリルビン測定
に、反応促進のために、コール酸ナトリウム、SDS、ラ
ウリルベンゼン硫酸塩（LBS）などの直接化剤を該緩衝
液に添加するのが好ましい。
用いられ、例えば、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−ア
ミノエタンスルホン酸（ACES）緩衝液、３−（Ｎ−モル
ホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（MOPS
O）緩衝液、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン
酸（MOPS）緩衝液、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチルアミノ］−２−ハイドロキシプロパンスルホ
ン酸（TAPSO）緩衝液などのグッド緩衝液でpH6.0〜9.0
の範囲のものが挙げられる。なお、総ビリルビン測定
に、反応促進のために、コール酸ナトリウム、SDS、ラ
ウリルベンゼン硫酸塩（LBS）などの直接化剤を該緩衝
液に添加するのが好ましい。
直接ビリルビン測定用には、pH3.0〜4.5の範囲のものが
用いられ、例えば、乳酸、乳酸ナトリウム緩衝液、酒石
酸−酒石酸ナトリウム緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、
酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液または酢酸ナトリウム−塩
酸緩衝液などが挙げられる。クエン酸緩衝液およびリン
酸緩衝液は亜鉛をブロックするので使用できない。
用いられ、例えば、乳酸、乳酸ナトリウム緩衝液、酒石
酸−酒石酸ナトリウム緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、
酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液または酢酸ナトリウム−塩
酸緩衝液などが挙げられる。クエン酸緩衝液およびリン
酸緩衝液は亜鉛をブロックするので使用できない。
ビリルビンオキシダーゼとしては公知の酵素がいずれも
用いられ、例えば、ミロセシウム属由来ビリルビンオキ
シダーゼ、エビタケ（Trachydermatsumodae）の産生す
るビリルビンオキシダーゼなどが挙げられる。ビリルビ
ンオキシダーゼの使用量は所望の酵素活性を示す範囲で
適宜用いられるが、通常、反応液中に0.04〜10単位/m
l、好ましくは、総ビリルビン測定用には0.08〜４単位/
ml、直接ビリルビン測定用には0.4〜８単位/mlの範囲で
用いられる。
用いられ、例えば、ミロセシウム属由来ビリルビンオキ
シダーゼ、エビタケ（Trachydermatsumodae）の産生す
るビリルビンオキシダーゼなどが挙げられる。ビリルビ
ンオキシダーゼの使用量は所望の酵素活性を示す範囲で
適宜用いられるが、通常、反応液中に0.04〜10単位/m
l、好ましくは、総ビリルビン測定用には0.08〜４単位/
ml、直接ビリルビン測定用には0.4〜８単位/mlの範囲で
用いられる。
なお、所望により反応促進剤を用いることができ、この
反応促進剤の併用によりビリルビンオキシダーゼの使用
量を低減することができる。例えば、直接ビリルビン測
定用の反応液に、反応促進剤としてフェリシアン化カリ
ウム10〜500μＭを添加すると、ビリルビンオキシダー
ゼの使用量を0.04〜1.2単位/mlの範囲に低減できる。
反応促進剤の併用によりビリルビンオキシダーゼの使用
量を低減することができる。例えば、直接ビリルビン測
定用の反応液に、反応促進剤としてフェリシアン化カリ
ウム10〜500μＭを添加すると、ビリルビンオキシダー
ゼの使用量を0.04〜1.2単位/mlの範囲に低減できる。
かかる反応促進剤としては、上記フェリシアン化カリウ
ムのほか、フェリシアン化ナトリウム、フェロシアン化
カリウム、フェロシアン化ナトリウムなど、さらに硫酸
銅、硝酸銅、酢酸第二銅、臭化第二銅、塩化第二銅など
のに二価の銅イオン化合物がいずれも使用され得る。こ
れらの反応促進剤は通常１〜700mMの範囲で用いられ
る。
ムのほか、フェリシアン化ナトリウム、フェロシアン化
カリウム、フェロシアン化ナトリウムなど、さらに硫酸
銅、硝酸銅、酢酸第二銅、臭化第二銅、塩化第二銅など
のに二価の銅イオン化合物がいずれも使用され得る。こ
れらの反応促進剤は通常１〜700mMの範囲で用いられ
る。
本発明の方法を実施するには、一般に、ビリルビン含有
検体に、亜鉛化合物および発色剤、所望により直接化剤
を含む緩衝液を加え、25〜45℃で３〜15分間、通常37℃
で５分間、予加温し、ついでこの混合液にビリルビンオ
キシダーゼおよび所望により反応促進剤を含む緩衝液
（酵素試薬）を加え、25〜45℃で３〜15分間、通常は37
℃で５分間、反応させることにより達成される。
検体に、亜鉛化合物および発色剤、所望により直接化剤
を含む緩衝液を加え、25〜45℃で３〜15分間、通常37℃
で５分間、予加温し、ついでこの混合液にビリルビンオ
キシダーゼおよび所望により反応促進剤を含む緩衝液
（酵素試薬）を加え、25〜45℃で３〜15分間、通常は37
℃で５分間、反応させることにより達成される。
得られた緑色反応液を比色定量することにより所望のビ
リルビンが測定される。
リルビンが測定される。
比色定量は常法によって行なわれ、例えば、市販の分光
光度計（例えば、島津UV−2100分光光度計）を用い、波
長580nmにて、試薬ブランクを対照として光度的密度を
測定する。この際、対照として一定量（既知濃度）のビ
リルビン含有血清（以下、標準ビリルビンという）を用
いて同様に光学的密度を測定し、これらのデータに基づ
いて下記式により検体血清中のビリルビン濃度（mg/d
l）を算出する。
光度計（例えば、島津UV−2100分光光度計）を用い、波
長580nmにて、試薬ブランクを対照として光度的密度を
測定する。この際、対照として一定量（既知濃度）のビ
リルビン含有血清（以下、標準ビリルビンという）を用
いて同様に光学的密度を測定し、これらのデータに基づ
いて下記式により検体血清中のビリルビン濃度（mg/d
l）を算出する。
［式中、AT:検体血清の光学的密度 AST:標準ビリルビンの光学的密度 x:標準ビリルビン中のビリルビン濃度（mg/dl）］ 上記測定操作をさらに具体的に説明すると、総ビリルビ
ン測定の場合、検体血清に亜鉛化合物（例えば、0.13mM
硫酸亜鉛）と発色剤（例えば、3mM MBTH）、所定量のビ
リルビンオキシダーゼを含む緩衝液［例えば、0.3％コ
ール酸ナトリウムを含有する0.1M ACES緩衝液（pH7.
0）］を加え、例えば37℃、５分間反応する。また、上
記反応液からビリルビンオキシダーゼをぬいた場合は検
体血清とその反応液をインキュベート（例えば、37℃、
３分間）し、この溶液に所定量のビリルビンオキシダー
ゼを添加して、例えば、37℃、５分間反応してもよい。
これを試薬ブランクを対照にして波長580nmで光学的密
度（AT）を測定する。一方、上記検体血清に代えて標準
ビリルビンを用い、上記と同様に操作を行ない、光学的
密度ASTを測定する。
ン測定の場合、検体血清に亜鉛化合物（例えば、0.13mM
硫酸亜鉛）と発色剤（例えば、3mM MBTH）、所定量のビ
リルビンオキシダーゼを含む緩衝液［例えば、0.3％コ
ール酸ナトリウムを含有する0.1M ACES緩衝液（pH7.
0）］を加え、例えば37℃、５分間反応する。また、上
記反応液からビリルビンオキシダーゼをぬいた場合は検
体血清とその反応液をインキュベート（例えば、37℃、
３分間）し、この溶液に所定量のビリルビンオキシダー
ゼを添加して、例えば、37℃、５分間反応してもよい。
これを試薬ブランクを対照にして波長580nmで光学的密
度（AT）を測定する。一方、上記検体血清に代えて標準
ビリルビンを用い、上記と同様に操作を行ない、光学的
密度ASTを測定する。
直接ビリルビン測定の場合は、緩衝液をpH3.0〜4.5の緩
衝液を用いて上記と同様に処理して測定する。
衝液を用いて上記と同様に処理して測定する。
本発明のビリルビン測定用試薬は、通常、 （１）亜鉛化合物、発色剤および所望により直接化剤を
含む緩衝液（発色試薬） （２）ビリルビンオキシダーゼおよび所望により反応促
進剤を含有する緩衝液（酵素試薬）および （３）一定量のビリルビン含有血清（標準ビリルビン） から構成される。その場合、試薬の安定性の点より、 （１）発色剤（凍結乾燥品） （２）亜鉛化合物を含む発色剤溶解用緩衝液 （３）ビリルビンオキシダーゼ（凍結乾燥品） （４）酵素溶解用緩衝液および （５）標準ビリルビン（凍結乾燥品） からなるキットとして構成するのが好ましい。
含む緩衝液（発色試薬） （２）ビリルビンオキシダーゼおよび所望により反応促
進剤を含有する緩衝液（酵素試薬）および （３）一定量のビリルビン含有血清（標準ビリルビン） から構成される。その場合、試薬の安定性の点より、 （１）発色剤（凍結乾燥品） （２）亜鉛化合物を含む発色剤溶解用緩衝液 （３）ビリルビンオキシダーゼ（凍結乾燥品） （４）酵素溶解用緩衝液および （５）標準ビリルビン（凍結乾燥品） からなるキットとして構成するのが好ましい。
実施例 次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 総ビリルビンの測定試薬： 第１試薬:1.3mM硫酸亜鉛、3mM MBTHを各濃度になるよう
に、0.3％コール酸ナトリウムを含有する0.1M ACES緩衝
液（pH7.0）に溶解する。
に、0.3％コール酸ナトリウムを含有する0.1M ACES緩衝
液（pH7.0）に溶解する。
第２試薬:10単位ビリルビンオキシダーゼ（ミロセシウ
ム属由来）を0.1M ACES緩衝液（pH7.0）に溶解し、全量
を10mlとする。
ム属由来）を0.1M ACES緩衝液（pH7.0）に溶解し、全量
を10mlとする。
測定操作： （１） 日立7150自動分析装置を用いＲ−１に第１試
薬、Ｒ−２に第２試薬を入れた。測定条件は試料10μｌ
にＲ−１ 0.3mlを加え、37℃で５分間予備加温した
後、第２試薬0.075mlを加え、同温で５分間反応させ、
試薬ブランクを対照に主波長580nm、副波長700nmで測定
し、それらのデータから前記式（Ｉ）により総ビリルビ
ン濃度を算出した。
薬、Ｒ−２に第２試薬を入れた。測定条件は試料10μｌ
にＲ−１ 0.3mlを加え、37℃で５分間予備加温した
後、第２試薬0.075mlを加え、同温で５分間反応させ、
試薬ブランクを対照に主波長580nm、副波長700nmで測定
し、それらのデータから前記式（Ｉ）により総ビリルビ
ン濃度を算出した。
なお、吸収曲線の測定は直接ビリルビンも含有している
血清0.1mlに第１試薬2.0mlを加え、37℃で５分間予加温
した後、第２試薬0.5mlを加え、同温度で10分反応させ
た後、精製水を対照にして300nm〜800nmの吸収曲線を島
津UV−2100分光光度計を用いて測定した。得られた総ビ
リルビン測定の吸収曲線を第１図に示す。第１図の結果
から明らかなように亜鉛化合物存在下で分子吸光係数の
大きい安定な緑色色素が生成し、総ビリルビン測定での
亜鉛化合物による顕著な効果が得られた。
血清0.1mlに第１試薬2.0mlを加え、37℃で５分間予加温
した後、第２試薬0.5mlを加え、同温度で10分反応させ
た後、精製水を対照にして300nm〜800nmの吸収曲線を島
津UV−2100分光光度計を用いて測定した。得られた総ビ
リルビン測定の吸収曲線を第１図に示す。第１図の結果
から明らかなように亜鉛化合物存在下で分子吸光係数の
大きい安定な緑色色素が生成し、総ビリルビン測定での
亜鉛化合物による顕著な効果が得られた。
（２） 次に、総ビリルビン測定のpH域を検討した。試
薬は第１試薬をpH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10にpH
5.5は直接化剤添加でにごりを生じるためコール酸ナト
リウムをぬいた。第２試薬は上記第２試薬と同じであ
る。
薬は第１試薬をpH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10にpH
5.5は直接化剤添加でにごりを生じるためコール酸ナト
リウムをぬいた。第２試薬は上記第２試薬と同じであ
る。
測定は日立7150自動分析装置を用い上記測定操作と同じ
である。測定試料として、正常ヒト血清（セラクリアN;
日本商事（株）製）、粉末ビリルビン（間接ビリルビ
ン；米国ICN社製）を添加したセラクリアＮおよび２例
の患者血清を用いて測定した。また、比較例として市販
の総ビリルビン測定用酵素試薬（ネスコートＴ−BIL−V
E;日本商事（株）製）を用いて同様に測定した。その結
果を第１表に示す。
である。測定試料として、正常ヒト血清（セラクリアN;
日本商事（株）製）、粉末ビリルビン（間接ビリルビ
ン；米国ICN社製）を添加したセラクリアＮおよび２例
の患者血清を用いて測定した。また、比較例として市販
の総ビリルビン測定用酵素試薬（ネスコートＴ−BIL−V
E;日本商事（株）製）を用いて同様に測定した。その結
果を第１表に示す。
第１表の結果から明らかなように、pH6.0〜pH9.0で、患
者血清２例の測定値は市販酵素試薬で測定した濃度とほ
ぼ同じであることが認められる。総ビリルビン測定pH5.
5の患者血清２例の濃度が低値になっているのは直接化
剤を添加していないため、本反応５分間では反応が完結
していないためと考えられる。また、pH10でもそれら血
清の濃度が低値になったのはビリルビンオキシダーゼが
活性を示す領域から外れているものと解される。
者血清２例の測定値は市販酵素試薬で測定した濃度とほ
ぼ同じであることが認められる。総ビリルビン測定pH5.
5の患者血清２例の濃度が低値になっているのは直接化
剤を添加していないため、本反応５分間では反応が完結
していないためと考えられる。また、pH10でもそれら血
清の濃度が低値になったのはビリルビンオキシダーゼが
活性を示す領域から外れているものと解される。
（３） また、標準血清（総ビリルビン14.2mg/dl、直
接ビリルビン9.2mg/dl）を段階希釈（1/4、2/4、3/4、4
/4）し、前記試薬を用い、日立7150自動分析装置で測定
した。その結果を第２図に示す。第２図より明らかなご
とくほぼ原点を通る直線が得られた。
接ビリルビン9.2mg/dl）を段階希釈（1/4、2/4、3/4、4
/4）し、前記試薬を用い、日立7150自動分析装置で測定
した。その結果を第２図に示す。第２図より明らかなご
とくほぼ原点を通る直線が得られた。
実施例２ 直接ビリルビンの測定試薬： 第１試薬:0.9mM硫酸亜鉛、10mM MBTHを各濃度になるよ
うに、界面活性剤0.1％ノイゲンEA−170（第一工業製薬
（株）製）、0.05％エマルゲン108（花王石鹸（株）
製）を含有する0.1M乳酸−乳酸ナトリウム緩衝液（pH3.
7）に溶解する。
うに、界面活性剤0.1％ノイゲンEA−170（第一工業製薬
（株）製）、0.05％エマルゲン108（花王石鹸（株）
製）を含有する0.1M乳酸−乳酸ナトリウム緩衝液（pH3.
7）に溶解する。
第２試薬:40単位ビリルビンオキシダーゼ（ミロセシウ
ム属由来）を0.5mMフェリシアン化カリウム溶液で溶解
し、全量を10mlとする。
ム属由来）を0.5mMフェリシアン化カリウム溶液で溶解
し、全量を10mlとする。
測定操作： （１） 日立7150自動分析装置による測定および吸収曲
線の測定は、実施例１にしたがった。得られた直接ビリ
ルビンの吸収曲線を第３図に示す。第３図の結果から明
らかなように亜鉛化合物存在下で分子吸光係数の大きい
安定な緑色色素が生成し、直接ビリルビン測定での亜鉛
化合物による顕著な効果が得られた。
線の測定は、実施例１にしたがった。得られた直接ビリ
ルビンの吸収曲線を第３図に示す。第３図の結果から明
らかなように亜鉛化合物存在下で分子吸光係数の大きい
安定な緑色色素が生成し、直接ビリルビン測定での亜鉛
化合物による顕著な効果が得られた。
（２）次に直接ビリルビン測定のpH域を検討した。第１
試薬の0.1M乳酸−乳酸ナトリウム緩衝液の代わりに0.1M
酒石酸−酒石酸ナトリウム緩衝液を用い、第１試薬をpH
2.5、3.0、3.7、4.0、4.5、5.0に調製した。第２試薬は
上記第２試薬と同じである。前記実施例１の測定操作
（２）と同様にして、正常ヒト血清（セラクリアN:日本
商事（株）製）、粉末ビリルビン（間接ビリルビン；米
国ICN社製）を添加したセラクリアＮおよび２例の患者
血清について行ない、比較例として市販の直接ビリルビ
ン測定用酵素試薬（ネスコートＤ−BIL−VE;日本商事
（株）製）を用いた。その結果を第２表に示す。
試薬の0.1M乳酸−乳酸ナトリウム緩衝液の代わりに0.1M
酒石酸−酒石酸ナトリウム緩衝液を用い、第１試薬をpH
2.5、3.0、3.7、4.0、4.5、5.0に調製した。第２試薬は
上記第２試薬と同じである。前記実施例１の測定操作
（２）と同様にして、正常ヒト血清（セラクリアN:日本
商事（株）製）、粉末ビリルビン（間接ビリルビン；米
国ICN社製）を添加したセラクリアＮおよび２例の患者
血清について行ない、比較例として市販の直接ビリルビ
ン測定用酵素試薬（ネスコートＤ−BIL−VE;日本商事
（株）製）を用いた。その結果を第２表に示す。
第２表から明らかなように、直接ビリルビンはpH3.0〜
4.5で患者血清２例の測定値は市販の酵素試薬で測定し
た濃度とほぼ同じであることが認められた。粉末ビリル
ビン（間接ビリルビン）添加セラクリアＮはpH2.5〜4.5
までセラクリアＮの濃度と同じであり、間接ビリルビン
は全く反応が起こっていないことが認められた。患者血
清２例のpH2.5の測定値でも市販酵素試薬の測定値とほ
ぼ同じであるが、pH2.5の酸性液では青色色素になり、
亜鉛化合物の効果のpH域から外れている。なお、pH2.5
で反応したのはビリルビンオキシダーゼと併用したフェ
リシアン化カリウムの効果であると解される。
4.5で患者血清２例の測定値は市販の酵素試薬で測定し
た濃度とほぼ同じであることが認められた。粉末ビリル
ビン（間接ビリルビン）添加セラクリアＮはpH2.5〜4.5
までセラクリアＮの濃度と同じであり、間接ビリルビン
は全く反応が起こっていないことが認められた。患者血
清２例のpH2.5の測定値でも市販酵素試薬の測定値とほ
ぼ同じであるが、pH2.5の酸性液では青色色素になり、
亜鉛化合物の効果のpH域から外れている。なお、pH2.5
で反応したのはビリルビンオキシダーゼと併用したフェ
リシアン化カリウムの効果であると解される。
（３） また、前記の標準血清をセラクリアＮで段階希
釈（1/4、2/4、3/4、4/4）し、前記直接ビリルビン試薬
を用い日立7150自動分析装置で測定した。その結果を第
４図に示す。第４図より明らかなごとくほぼ原点を通る
直線が得られた。
釈（1/4、2/4、3/4、4/4）し、前記直接ビリルビン試薬
を用い日立7150自動分析装置で測定した。その結果を第
４図に示す。第４図より明らかなごとくほぼ原点を通る
直線が得られた。
実施例３ 総ビリルビン測定は実施例１の第１試薬のMBTHの代わり
に２−ヒドラジノベンゾチアゾールを用い、直接ビリル
ビン測定は実施例２の第１試薬のMBTHの代わりに２−ヒ
ドラジノベンゾチアゾールを用い、以下同様に反応後の
吸収曲線を測定した。総ビリルビン測定および直接ビリ
ルビン測定共に安定な緑色色素（λ＝600nm）を得た。
に２−ヒドラジノベンゾチアゾールを用い、直接ビリル
ビン測定は実施例２の第１試薬のMBTHの代わりに２−ヒ
ドラジノベンゾチアゾールを用い、以下同様に反応後の
吸収曲線を測定した。総ビリルビン測定および直接ビリ
ルビン測定共に安定な緑色色素（λ＝600nm）を得た。
実施例４ 総ビリルビン測定は実施例１の第２試薬の代わりに、エ
ビタケ由来のビリルビンオキシダーゼ10単位/mlを用
い、直接ビリルビン測定は実施例２の第２試薬の代わり
にエビタケ由来のビリルビンオキシダーゼ0.3単位/mlを
用い、580nmで10分間タイムコースを測定した。
ビタケ由来のビリルビンオキシダーゼ10単位/mlを用
い、直接ビリルビン測定は実施例２の第２試薬の代わり
にエビタケ由来のビリルビンオキシダーゼ0.3単位/mlを
用い、580nmで10分間タイムコースを測定した。
5.5％のヒトアルブミンに添加した粉末ビリルビン（間
接ビリルビン）は総ビリルビン測定では反応するが、直
接ビリルビン測定ではほとんど反応しなかった。直接ビ
リルビンも含有する血清は総ビリルビン測定および直接
ビリルビン測定共に反応した。
接ビリルビン）は総ビリルビン測定では反応するが、直
接ビリルビン測定ではほとんど反応しなかった。直接ビ
リルビンも含有する血清は総ビリルビン測定および直接
ビリルビン測定共に反応した。
実施例５ （１） 実施例１の総ビリルビン測定と一般に使用のジ
アゾ法（ネスコートビリルビンキット−Ｎ）（日本商事
（株）製）を用い日立7150自動分析装置により総ビリル
ビンを定量した。その結果を第５図に示す。第５図にお
いて、ジアゾ法の測定値をＸ、本発明法の測定値をＹと
すると相関係数γ＝0.998であり、回帰直線の式はＹ＝
1.044X＋0.005と良好であった。
アゾ法（ネスコートビリルビンキット−Ｎ）（日本商事
（株）製）を用い日立7150自動分析装置により総ビリル
ビンを定量した。その結果を第５図に示す。第５図にお
いて、ジアゾ法の測定値をＸ、本発明法の測定値をＹと
すると相関係数γ＝0.998であり、回帰直線の式はＹ＝
1.044X＋0.005と良好であった。
（２） 次に実施例２の直接ビリルビン測定の第１試薬
の0.1M乳酸−乳酸ナトリウム緩衝液（pH3.7の代わりに
0.1M酒石酸−酒石酸ナトリウム緩衝液（pH3.7）を用
い、以下同様に測定し、その結果を第６図に示す。第６
図において、ジアゾ法との相関係数はγ＝0.988であ
り、回帰直線の式はＹ＝0.963X＋0.061と良好であっ
た。
の0.1M乳酸−乳酸ナトリウム緩衝液（pH3.7の代わりに
0.1M酒石酸−酒石酸ナトリウム緩衝液（pH3.7）を用
い、以下同様に測定し、その結果を第６図に示す。第６
図において、ジアゾ法との相関係数はγ＝0.988であ
り、回帰直線の式はＹ＝0.963X＋0.061と良好であっ
た。
以上の結果より、本発明法の総ビリルビン測定法および
直接ビリルビン測定法の正確度が確認された。
直接ビリルビン測定法の正確度が確認された。
実施例６ 種々の金属化合物について総ビリルビン測定における発
色効果を調べた。
色効果を調べた。
試薬の調製： 第１試薬:1.6mM金属化合物剤（後記第３表および第７図
参照、ただし、酸化亜鉛は水に溶け難いため、第１試薬
中0.1mMとする）、1mM MBTHの各濃度になるように0.1M
MOPSO緩衝液（pH6.5）で溶解する。
参照、ただし、酸化亜鉛は水に溶け難いため、第１試薬
中0.1mMとする）、1mM MBTHの各濃度になるように0.1M
MOPSO緩衝液（pH6.5）で溶解する。
第２試薬:40単位ビリルビンオキシダーゼ（ミロセシウ
ム属由来）を0.1M MOPSO緩衝液（pH6.5）で溶解し、全
量を10mlとする。
ム属由来）を0.1M MOPSO緩衝液（pH6.5）で溶解し、全
量を10mlとする。
測定方法： 直接ビリルビンも含有している血清0.1mlに第１試薬2.0
mlを加え、37℃で５分間予加温したのち、第２試薬0.5m
lを加え、同温で10分反応させた、精製水を対照にし
て、300〜800nmの吸収曲線を島津UV−2100分光光度計を
用いて測定した。それらの結果を下記第３表および第７
図に示す。
mlを加え、37℃で５分間予加温したのち、第２試薬0.5m
lを加え、同温で10分反応させた、精製水を対照にし
て、300〜800nmの吸収曲線を島津UV−2100分光光度計を
用いて測定した。それらの結果を下記第３表および第７
図に示す。
第３表および第７図の結果から明らかなように、亜鉛化
合物を添加した場合だけが、分子吸光係数が大きい、安
定な緑色色素の反応生成物になり、亜鉛化合物によるそ
の効果が得られた。亜鉛化合物と同じ族のカドミウム化
合物、ベリリウム化合物、バリウム化合物などの金属は
その効果は認められなかった。
合物を添加した場合だけが、分子吸光係数が大きい、安
定な緑色色素の反応生成物になり、亜鉛化合物によるそ
の効果が得られた。亜鉛化合物と同じ族のカドミウム化
合物、ベリリウム化合物、バリウム化合物などの金属は
その効果は認められなかった。
発明の効果 本発明によれば亜鉛化合物の効果で、分子吸光係数が大
きい安定な緑色色素に発色し、血清中のビリルビンを特
異的に定量でき、しかも、反応後の液を強酸酸性にしな
くてもよいことから操作は簡単となり、また、強酸性で
は不溶となる直接化剤も用いることができ、患者血清中
のビリルビン反応が迅速になるため、本発明の定量法お
よびその試薬は血清中の総ビリルビン、直接ビリルビン
の臨床検査にきわめて有用である。さらにきわめて簡便
かつ迅速に実施できるため、自動分析への適用が容易で
ある。
きい安定な緑色色素に発色し、血清中のビリルビンを特
異的に定量でき、しかも、反応後の液を強酸酸性にしな
くてもよいことから操作は簡単となり、また、強酸性で
は不溶となる直接化剤も用いることができ、患者血清中
のビリルビン反応が迅速になるため、本発明の定量法お
よびその試薬は血清中の総ビリルビン、直接ビリルビン
の臨床検査にきわめて有用である。さらにきわめて簡便
かつ迅速に実施できるため、自動分析への適用が容易で
ある。
第１図は本発明方法による試料中の総ビリルビン測定に
おける吸収曲線、第２図は標準血清の段階希釈液につい
て総ビリルビンを測定した場合の吸収を示すグラフ、第
３図は本発明方法による試料中の直接ビリルビン測定に
おける吸収曲線、第４図は標準血清の段階希釈液につい
て直接ビリルビンを測定した場合の吸収を示すグラフ、
第５図は本発明方法による総ビリルビン測定値と一般の
ジアゾ法による測定値との相関を示すグラフ、第６図は
本発明方法による直接ビリルビン測定値と一般のジアゾ
法による測定値との相関を示すグラフ、第７図は種々の
亜鉛化合物を用いた本発明方法による総ビリルビン測定
における吸収曲線を示す。
おける吸収曲線、第２図は標準血清の段階希釈液につい
て総ビリルビンを測定した場合の吸収を示すグラフ、第
３図は本発明方法による試料中の直接ビリルビン測定に
おける吸収曲線、第４図は標準血清の段階希釈液につい
て直接ビリルビンを測定した場合の吸収を示すグラフ、
第５図は本発明方法による総ビリルビン測定値と一般の
ジアゾ法による測定値との相関を示すグラフ、第６図は
本発明方法による直接ビリルビン測定値と一般のジアゾ
法による測定値との相関を示すグラフ、第７図は種々の
亜鉛化合物を用いた本発明方法による総ビリルビン測定
における吸収曲線を示す。
Claims (10)
- 【請求項１】ビリルビンを光学的に測定する方法におい
て、ビリルビン含有検体を、緩衝液中で亜鉛化合物、発
色剤およびビリルビンオキシダーゼと反応させることを
特徴とするビリルビンの光学的測定法。 - 【請求項２】pH6.0〜9.0の緩衝液中で反応させて、総ビ
リルビンを測定する請求項第（１）項の測定法。 - 【請求項３】pH3.0〜4.5の緩衝液中で反応させて、直接
ビリルビンを測定する請求項第（１）項の測定法。 - 【請求項４】亜鉛化合物が亜鉛酸化物、無機酸亜鉛、有
機酸亜鉛、ハロゲン化亜鉛およびシアン化亜鉛から選ば
れる少なくとも１種である請求項第（１）、（２）また
は（３）項の測定法。 - 【請求項５】発色剤が３−メチル−２−ベンゾチアゾリ
ノン−ヒドラゾン、２−ヒドラジノベンゾチアゾールま
たは１−ヒドラジノフタラジン塩酸塩である請求項第
（１）〜（４）項いずれか１つの測定法。 - 【請求項６】緩衝液が、グッド緩衝液から選ばれる１種
である請求項第（２）項の測定法。 - 【請求項７】緩衝液が、酒石酸−酒石酸ナトリウム緩衝
液、乳酸−乳酸ナトリウム緩衝液、グリシン−塩酸緩衝
液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、および酢酸ナトリウ
ム−塩酸緩衝液から選ばれる１種である請求項第（３）
項の測定法。 - 【請求項８】亜鉛化合物および発色剤を含有する緩衝液
およびビリルビンオキシダーゼを含有する緩衝液からな
ることを特徴とするビリルビン測定用試薬。 - 【請求項９】緩衝液が、pH6.0〜9.0のグッド緩衝液から
選ばれる１種である総ビリルビン測定用の請求項第
（８）項の試薬。 - 【請求項１０】緩衝液が、pH3.0〜4.5の酒石酸−酒石酸
ナトリウム緩衝液、乳酸−乳酸ナトリウム緩衝液、グリ
シン−塩酸緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、およ
び酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液から選ばれる１種である
直接ビリルビン測定用の請求項第（８）項の試薬。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1327523A JPH0771515B2 (ja) | 1989-12-18 | 1989-12-18 | ビリルビンの光学的測定法および測定用試薬 |
| ES90124576T ES2075127T3 (es) | 1989-12-18 | 1990-12-18 | Metodo para la medicion optica de bilirrubina y reactivo utilizado para ello. |
| US07/629,454 US5262304A (en) | 1989-12-18 | 1990-12-18 | Method for optical measurement of bilirubin and reagent therefor |
| EP90124576A EP0433977B1 (en) | 1989-12-18 | 1990-12-18 | Method for optical measurement of bilirubin and reagent therefor |
| DK90124576.1T DK0433977T3 (da) | 1989-12-18 | 1990-12-18 | Metode til optisk måling af bilirubin og et reagens dertil |
| DE69019810T DE69019810T2 (de) | 1989-12-18 | 1990-12-18 | Verfahren zur optischen Bestimmung von Bilirubin und Reagenz dafür. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1327523A JPH0771515B2 (ja) | 1989-12-18 | 1989-12-18 | ビリルビンの光学的測定法および測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03187400A JPH03187400A (ja) | 1991-08-15 |
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