JPH0768278B2 - Monoclonal antibody against transforming growth factor β1 - Google Patents
Monoclonal antibody against transforming growth factor β1Info
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- JPH0768278B2 JPH0768278B2 JP3150450A JP15045091A JPH0768278B2 JP H0768278 B2 JPH0768278 B2 JP H0768278B2 JP 3150450 A JP3150450 A JP 3150450A JP 15045091 A JP15045091 A JP 15045091A JP H0768278 B2 JPH0768278 B2 JP H0768278B2
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Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトトランスフォーミ
ング成長因子β１（以下ヒトＴＧＦ−β１）の完全アミ
ノ酸配列中に含まれる１部分のアミノ酸配列からなるペ
プチド化合物に対して特異的に反応することを特徴とす
るＴＧＦ−β１に対するモノクローナル抗体及びそれを
産生するハイブリドーマ細胞に関するものである。FIELD OF THE INVENTION The present invention specifically reacts with a peptide compound consisting of a part of the amino acid sequence contained in the complete amino acid sequence of human transforming growth factor β1 (hereinafter human TGF-β1). The present invention relates to a monoclonal antibody against TGF-β1 and a hybridoma cell producing the same.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ＴＧＦ−β１はＴＧＦ−βファミリーと
よばれるタンパク質群〔Ｊ．Ｍａｓｓａｇｅ，Ｃｅｌ
ｌ，４９，４３７−４３８（１９８７）〕の中で最初に
発見されたタンパク質であり、分子量約２５，０００、
１１２個のアミノ酸残基で構成されるポリペプチド（分
子量約１２，５００）のホモ２量体である。ＴＧＦ−β
１は、血小板と骨組織中に多く含まれ、動物体を構成す
る細胞の増殖・分化の調節に関与する重要なタンパク質
として注目されている〔Ｍ．Ｂ．Ｓｐｏｒｎ ｅｔａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３，５３２−５３４（１９
８６）〕。ＴＧＦ−βは、動物種間でアミノ酸配列が極
めて高く保存されており、例えば、ＴＧＦ−β１におい
ては、わかっているだけでヒト、サル、ウシ、ブタ、ニ
ワトリでは完全に一致、マウスにおいてもわずか１カ所
アミノ酸が違っているにすぎない〔Ｍ．Ｂ．Ｓｐｏｒｎ
ｅｔ．ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗ
ｔｈＦａｃｔｏｒ−βｓ，Ｋ．Ａ．Ｐｉｅｚ，Ｍ．Ｂ．
Ｓｐｏｒｎ Ｅｄｓ．（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａ
ｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），１−６，
（１９９０）；Ｒ．Ｄｅｒｙｃｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，４３７７−４３７９
（１９８６）〕。2. Description of the Related Art TGF-β1 is a group of proteins called TGF-β family [J. Massage, Cel
1, 49 , 437-438 (1987)], and has a molecular weight of about 25,000.
It is a homodimer of a polypeptide composed of 112 amino acid residues (molecular weight: about 12,500). TGF-β
1 is abundantly contained in platelets and bone tissues, and has attracted attention as an important protein involved in the regulation of proliferation / differentiation of cells constituting the animal body [M. B. Sporn eta
l. , Science, 233 , 532-534 (19).
86)]. Amino acid sequences of TGF-β are extremely highly conserved among animal species. For example, in TGF-β1, it is known that it is completely identical in humans, monkeys, cows, pigs, and chickens, and even in mouse. Only one amino acid is different [M. B. Sporn
et. al. , Transforming Grow
thFactor-βs, K. A. Piez, M .; B.
Sporn Eds. (The New York A
Cademy of Sciences), 1-6,
(1990); Deryck. et. al. J.
Biol. Chem. , 261 , 4377-4379.
(1986)].
【０００３】ＴＧＦ−β１は繊維芽細胞のコラーゲン形
成を刺激する作用を有しており〔Ｒ．Ｍｏｎｔｅｓｃｏ
ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８５，４８９４−４８９７（１
９８８）〕、創傷治療薬としての応用が現在検討されて
いる。また、ＴＧＦ−β１は、炎症、癌形成、骨形成、
動脈硬化、免疫抑制等との関与についても注目されてお
り、医学、薬学における研究開発ターゲットとしての重
要性が増している〔石井健久ら、現代化学増刊１８号
「サイトカイン」、１９９−２１２（１９９０）〕。TGF-β1 has an action of stimulating collagen formation of fibroblasts [R. Montesco
n et al. , Proc. Natl. Aca
d. Sci. , USA, 85 , 4894-4897 (1
988)], its application as a therapeutic drug for wounds is currently under investigation. In addition, TGF-β1 induces inflammation, carcinogenesis, bone formation,
Attention has also been paid to its involvement in arteriosclerosis, immunosuppression, etc., and its importance as an R & D target in medicine and pharmacy is increasing [Kenji Ishii et al., Hyundai Kagaku Special Issue No. 18, “Cytokine”, 199-212 ( 1990)].
【０００４】更に、癌患者の尿中にＴＧＦ−βタイプの
活性成分が多量に***されるとの報告もなされており
〔Ｒ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（ＧＡＮＮ），７７，５６０−５
６７（１９８６）〕、癌診断のためのＴＧＦ−β１の定
量、あるいはＴＧＦ−β１の機能解析等に用いることの
できるＴＧＦ−β１に対する抗体の研究も活発に行なわ
れている。例えば、特開平２−１５２９８８号公報に
は、ＴＧＦ−β１の完全アミノ酸配列中に含まれる１部
分のアミノ酸配列からなるペプチド化合物を抗原として
用いて得られる抗血清（ポリクローナル抗体）が報告さ
れている。ＴＧＦ−β１に対する抗血清についての他の
報告としては、Ｌ．Ｒ．Ｅｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６１，１２
３６２−１２３６７（１９８６）；Ｌ．Ｅ．Ｇｅｎｔｒ
ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，
７，３４１８−３４２７（１９８７）；Ｓ．Ｃｈｅｉｆ
ｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４８，４０９−４１
５（１９８７）；Ｋ．Ｃ．Ｆｌａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，７３９−７４
６（１９８８）などがある。Further, it has been reported that a large amount of TGF-β type active ingredient is excreted in the urine of cancer patients [R. Nishimura et al. , Jpn. C
ancer Res. (GANN), 77 , 560-5
67 (1986)], quantification of TGF-β1 for cancer diagnosis, or studies of antibodies against TGF-β1 which can be used for functional analysis of TGF-β1 and the like are also actively conducted. For example, JP-A-2-152988 reports an antiserum (polyclonal antibody) obtained by using as an antigen a peptide compound consisting of a part of the amino acid sequence contained in the complete amino acid sequence of TGF-β1. . Other reports on antisera against TGF-β1 include: R. Ellingworth et
al. J. Biol. Chem. , 261 , 12
362-12367 (1986); E. Gentr
y et al. , Mol. Cell Biol. ，
7 , 3418-3427 (1987); Cheif
etz et al. , Cell, 48 , 409-41.
5 (1987); C. Flanders et a
l. , Biochemistry, 27 , 739-74.
6 (1988).
【０００５】これらに報告された抗体は、いずれもポリ
クローナル抗体であり、抗原に用いたペプチド化合物の
アミノ酸配列のいずれかの部分を認識する多種類の抗体
の混合物である。従って、この抗体を用いて抗原部位を
厳密に分析するのは極めて困難である。更には、ポリク
ローナル抗体はウサギ等の動物を免疫して得られる血清
から取得されるものであり、これを多量に得るには多数
の動物を使用することが必要であり、また同じ性質を有
する抗体が常に得られるとは限らない。従ってポリクロ
ーナル抗体の開発には多くの困難が伴なう。The antibodies reported in these publications are all polyclonal antibodies, and are a mixture of various kinds of antibodies that recognize any part of the amino acid sequence of the peptide compound used as the antigen. Therefore, it is extremely difficult to strictly analyze the antigenic site using this antibody. Furthermore, a polyclonal antibody is obtained from serum obtained by immunizing animals such as rabbits, and it is necessary to use a large number of animals to obtain a large amount of this antibody, and an antibody having the same properties. Is not always obtained. Therefore, there are many difficulties in developing polyclonal antibodies.
【０００６】一方、ＴＧＦ−β１に対するモノクローナ
ル抗体の研究に関する報告もなされており、例えば特開
平２−１２６１５７号公報にはヒトＴＧＦ−β１に対す
るモノクローナル抗体が記載されている。また、Ｊ．
Ｒ．Ｄａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，１４２，１５３６−１５４１（１９８９）及び
Ｃ．Ｌｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，１４５，１４１５−１４２２（１９９０）にも同
様のモノクローナル抗体が報告されている。これらのモ
ノクローナル抗体は、すべてＴＧＦ−βそのもののタン
パクを抗原として用いて得られたモノクローナル抗体で
あり、ＴＧＦ−βタンパクのどの抗原部位を特異的に認
識するかについては不明であり、ＴＧＦ−βに対する反
応特異性の面では十分に満足し得るものではない。On the other hand, there have been reports on studies on monoclonal antibodies against TGF-β1. For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-126157 describes a monoclonal antibody against human TGF-β1. Also, J.
R. Dasch et al. J. Immuno
l. , 142 , 1536-1541 (1989) and C.I. Lucas et al. J. Immuno
l. , 145 , 1415-1422 (1990), a similar monoclonal antibody has been reported. All of these monoclonal antibodies are monoclonal antibodies obtained by using the protein of TGF-β itself as an antigen, and it is unknown which antigenic site of the TGF-β protein is specifically recognized. In terms of reaction specificity to, it is not fully satisfactory.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ヒトＴ
ＧＦ−β１の完全アミノ酸配列中に含まれる１部分のア
ミノ酸配列からなるペプチド化合物を数種類作製し、そ
れらを抗原として用いてモノクローナル抗体を作製し、
それらの反応性について種々検討した結果、ヒトＴＧＦ
−β１の完全アミノ酸配列中に含まれる特定のアミノ酸
配列部分に対して特に高い反応性を有するモノクローナ
ル抗体を得ることに成功し本発明を完成させた。従っ
て、本発明の目的は、ＴＧＦ−β１に対して特異性の高
い反応性を有するモノクローナル抗体及びそれを産生す
るハイブリドーマ細胞を提供することにある。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present inventors have found that human T
Several kinds of peptide compounds consisting of an amino acid sequence of a part contained in the complete amino acid sequence of GF-β1 were prepared, and these were used as antigens to prepare a monoclonal antibody,
As a result of various studies on their reactivity, human TGF
The present invention has been completed by succeeding in obtaining a monoclonal antibody having particularly high reactivity with a specific amino acid sequence portion contained in the complete amino acid sequence of -β1. Therefore, an object of the present invention is to provide a monoclonal antibody having high specificity for TGF-β1 and a hybridoma cell producing the same.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明は、ヒトトランス
フォーミング成長因子β１の完全アミノ酸配列中に含ま
れる下記式（Ｉ）に示すアミノ酸配列からなるペプチド
化合物に対して特異的に反応することを特徴とするトラ
ンスフォーミング成長因子β１に対するモノクローナル
抗体に関する。The present invention is directed to specifically reacting with a peptide compound having an amino acid sequence represented by the following formula (I) contained in the complete amino acid sequence of human transforming growth factor β1. It relates to a monoclonal antibody against the transforming growth factor β1.
【化３】 （NH2 側）Cys-Val-Pro-Gln-Ala-Leu-Glu-Pro-Leu-Pro-Ile- Val-Tyr-Tyr-Val-Gly-Arg-Lys-Pro-Lys-Val-Glu- Gln-Leu-Ser-Asn-Met-Ile-Val-Arg-Ser-Cys （COOH側) （Ｉ） 更に本発明は、上記のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞に関する。Embedded image (NH 2 side) Cys-Val-Pro-Gln -Ala-Leu-Glu-Pro-Leu-Pro-Ile- Val-Tyr-Tyr-Val-Gly-Arg-Lys-Pro-Lys-Val -Glu-Gln-Leu-Ser-Asn-Met-Ile-Val-Arg-Ser-Cys (COOH side) (I) The present invention further relates to a hybridoma cell producing the above monoclonal antibody.
【０００９】ヒトＴＧＦ−β１の完全アミノ酸配列は既
に公知であり〔Ｒ．Ｄｅｒｙｎｅｋｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ，３１６，７０１−７０５（１９８５）〕、上
記式（Ｉ）に示すアミノ酸配列は、ヒトＴＧＦ−β１単
量体の１１２個のアミノ酸残基からなる完全アミノ酸配
列のうちＮ末端側から数えて７８番目から１０９番目ま
でのアミノ酸配列部分に相当する。本発明のモノクロー
ナル抗体は、この７８番目から１０９番目までのアミノ
酸配列部分からなるペプチド化合物に対して特異的に反
応する性質を有する。他方、７８番目から１０９番目ま
でのうちの８８番目から１０７番目までのアミノ酸配
列、即ち下記式（ＩＩＩ）に示されるアミノ酸配列から
なるペプチド化合物に対しては実質的に反応しない性質
を有する。The complete amino acid sequence of human TGF-β1 is already known [R. Deryneket al. , Na
true, 316 , 701-705 (1985)], the amino acid sequence represented by the above formula (I) is counted from the N-terminal side of the complete amino acid sequence consisting of 112 amino acid residues of human TGF-β1 monomer. It corresponds to the amino acid sequence part from the 78th to the 109th. The monoclonal antibody of the present invention has the property of reacting specifically with the peptide compound consisting of the 78th to 109th amino acid sequence portions. On the other hand, it has a property of not substantially reacting with the peptide compound consisting of the amino acid sequence of 88th to 107th of 78th to 109th, that is, the amino acid sequence represented by the following formula (III).
【化４】 [Chemical 4]
【００１０】従って、本発明のモノクローナル抗体は、
ヒトＴＧＦ−β１の完全アミノ酸配列中の特に７８番目
から８７番目のアミノ酸配列部分、即ち下記式（ＩＩ）
に示すアミノ酸配列を特異的に認識する性質を有すると
考えられる。Therefore, the monoclonal antibody of the present invention is
In particular, the 78th to 87th amino acid sequence portion in the complete amino acid sequence of human TGF-β1, ie, the following formula (II)
It is considered to have the property of specifically recognizing the amino acid sequence shown in.
【化５】 （NH2 側）Cys-Val-Pro-Gln-Ala-Leu-Glu-Pro-Leu-Pro-（COOH側) （ＩＩ） ヒトＴＧＦ−β１の、この７８番目から８７番目のアミ
ノ酸配列部分は、わかっているだけで、サル、ブタ、ウ
シ、ニワトリ、マウスにおいて一致しているので、これ
ら、ヒト以外のＴＧＦ−β１にも特異的に認識する性質
を有すると考えられる。一方、本発明のモノクローナル
抗体は、ＴＧＦ−β２に対しては実質的に反応性を示さ
ない。ＴＧＦ−β２はＴＧＦ−β１と同様に血小板と骨
組織中に見出され、１１２個のアミノ酸残基で構成され
るポリペプチドのホモ２量体である。ＴＧＦ−β２はＴ
ＧＦ−βファミリーに属するタンパク質であり、ＴＧＦ
−β１とのアミノ酸配列の相同性が７１％である〔Ｒ．
ｄｅ Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，
６，３６７３（１９８７）〕。本発明で得られるモノク
ローナル抗体は、Ｈ鎖はＩｇＧ１、Ｌ鎖はχであるサブ
クラスに属するものである。(NH 2 side) Cys-Val-Pro-Gln-Ala-Leu-Glu-Pro-Leu-Pro- (COOH side) (II) The 78th to 87th amino acids of human TGF-β1 Since the sequence portion is known and is identical in monkey, pig, cow, chicken, and mouse, it is considered that these have the property of specifically recognizing TGF-β1 other than human. On the other hand, the monoclonal antibody of the present invention shows substantially no reactivity with TGF-β2. Similar to TGF-β1, TGF-β2 is a homodimer of a polypeptide found in platelets and bone tissues and composed of 112 amino acid residues. TGF-β2 is T
TGF, which is a protein belonging to the GF-β family
The amino acid sequence homology with -β1 is 71% [R.
de Martin et al. , EMBO J .; ，
6 , 3673 (1987)]. The monoclonal antibody obtained in the present invention belongs to a subclass in which the H chain is IgG1 and the L chain is χ.
【００１１】以上に示したように、本発明のモノクロー
ナル抗体は、特異性の高い反応性を示し、癌診断でのＴ
ＧＦ−β１の定量、ＴＧＦ−β１の機能解析、医薬製造
におけるＴＧＦ−β１のアフィニティークロマトグラフ
ィーへの応用等に利用できる。以下に本発明のモノクロ
ーナル抗体の製造について説明する。本発明のモノクロ
ーナル抗体を製造するために用いる抗原である上記式
（Ｉ）に示されるアミノ酸配列からなるペプチド化合物
は、通常の固相法による化学合成により作製することが
できる。例えば、アプライドバイオシステムズ社製４３
０Ａペプチド合成機により、ペプチド鎖を合成し脱保護
次いで固相からのペプチド鎖の開裂を行ない、高速液体
クロマトグラフィーにより精製することにより上記式
（Ｉ）に示すアミノ酸配列からなる精製ペプチド化合物
を得ることができる。As shown above, the monoclonal antibody of the present invention exhibits highly specific reactivity, and T
It can be used for quantification of GF-β1, functional analysis of TGF-β1, application of TGF-β1 to affinity chromatography in the manufacture of a drug, and the like. The production of the monoclonal antibody of the present invention will be described below. The peptide compound having the amino acid sequence represented by the above formula (I), which is an antigen used for producing the monoclonal antibody of the present invention, can be produced by chemical synthesis by a usual solid phase method. For example, 43 manufactured by Applied Biosystems
A purified peptide compound having the amino acid sequence represented by the above formula (I) is obtained by synthesizing a peptide chain with a 0A peptide synthesizer, deprotecting it, then cleaving the peptide chain from the solid phase, and purifying by high performance liquid chromatography. be able to.
【００１２】ペプチド化合物で動物を免疫後、動物から
脾臓細胞を取得する。動物としては、マウス、ラット、
などが使用され、これらの動物への抗原の投与は常法に
従って行なわれる。例えば、完全フロイントアジュバン
ト、不完全フロイントアジュバントなどのアジュバント
とペプチド化合物との懸濁液もしくは乳化液を調製し、
これを動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与す
ることによって動物を免疫化する。免疫化された動物か
ら抗体産生細胞である脾臓細胞を取得し、これとミエロ
ーマ細胞とをそれ自体公知の方法〔Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７
５）〕により融合することにより、本発明のハイブリド
ーマ細胞を作製することができる。After immunizing the animal with the peptide compound, spleen cells are obtained from the animal. Animals include mice, rats,
Etc. are used, and the administration of the antigen to these animals is performed according to a conventional method. For example, a suspension or emulsion of a peptide compound with an adjuvant such as complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant is prepared,
The animal is immunized by administering this several times to the vein, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, etc. of the animal. Spleen cells, which are antibody-producing cells, are obtained from the immunized animal, and the cells and myeloma cells are obtained by a method known per se [G. Kohler
et al. , Nature, 256 , 495 (197).
5)], the hybridoma cell of the present invention can be prepared.
【００１３】使用するミエローマ細胞株としては、マウ
スではＰ３Ｕ１株〔ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ ｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ，８１，１−７（１９７８）〕，Ｐ３ｘ６３Ａｇ
８〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕など
が挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチ
レングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤、
細胞融合後のハイブリドーマ細胞の選抜にはヒポキサン
チン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地が常法
により使用できる。As the myeloma cell line to be used, the P3U1 strain [CurrentTopics in
Microbiology and Immunol
Ogy, 81 , 1-7 (1978)], P3x63Ag
8 [Nature, 256 , 495 (1975)] and the like. When performing cell fusion, a fusion promoter such as polyethylene glycol or Sendai virus,
For selection of hybridoma cells after cell fusion, hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium can be used by a conventional method.
【００１４】目的とするハイブリドーマ細胞の選別は、
上記式（Ｉ）に示すアミノ酸配列からなるペプチド化合
物を吸着させたマイクロプレートを用いた酵素免疫測定
法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）
により実施することができる。このようにして得られる
ハイブリドーマ細胞からモノクローナル抗体を製造する
方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法によりハ
イブリドーマ細胞を培養し、培養上清液あるいは腹水を
通常の精製工程に付すことによって目的とするモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。The target hybridoma cells are selected by
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay (RIA) using a microplate on which a peptide compound having the amino acid sequence represented by the above formula (I) is adsorbed.
Can be carried out. As a method for producing a monoclonal antibody from the hybridoma cells thus obtained, the hybridoma cells are cultured by an ordinary cell culture method or ascites formation method, and the culture supernatant or ascites fluid is subjected to an ordinary purification step. The monoclonal antibody can be obtained.
【００１５】[0015]
【発明の効果】以上に詳述した通り、本発明では特異性
の高いＴＧＦ−β１に対するモノクローナル抗体及びそ
れを産生するハイブリドーマ細胞が提供される。このモ
ノクローナル抗体は癌診断におけるＴＧＦ−β１の定
量、医薬製造の際のＴＧＦ−β１のアフィニテイークロ
マトグラフィー、ＴＧＦ−β１の機能解析等に利用する
ことができる。このモノクローナル抗体は、それを産生
するハイブリドーマ細胞を培養することによって大量に
製造することが可能である。As described above in detail, the present invention provides a highly specific monoclonal antibody against TGF-β1 and a hybridoma cell producing the same. This monoclonal antibody can be used for quantification of TGF-β1 in cancer diagnosis, affinity chromatography of TGF-β1 in the production of drugs, functional analysis of TGF-β1 and the like. This monoclonal antibody can be produced in large quantities by culturing hybridoma cells that produce it.
【００１６】[0016]
１．抗原として用いるペプチド化合物の合成 ヒトＴＧＦ−β１の完全アミノ酸配列（１１２個のアミ
ノ酸残基）のうち、Ｎ末端側からかぞえて７８番目から
１０９番目までの配列の前記式（Ｉ）に示すペプチド化
合物（以下、Ａ７８／１０９ペプチド）を、アプライド
バイオシステム製４３０Ａペプチド合成機により化学合
成した。固相に形成されたペプチドを脱保護、固相から
の切断を行なった後、逆相高速液体クロマトグラフィー
（資生堂製、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＣ Ｃ18）にて精製
して、高純度Ａ７８／１０９ペプチドを得た。1. Synthesis of peptide compound used as antigen Peptide compound represented by the above formula (I) having a sequence from the 78th to the 109th position from the N-terminal side in the complete amino acid sequence of human TGF-β1 (112 amino acid residues) (Hereinafter, A78 / 109 peptide) was chemically synthesized by an Applied Biosystem 430A peptide synthesizer. The peptide formed on the solid phase was deprotected and cleaved from the solid phase, and then purified by reverse-phase high performance liquid chromatography (Shiseido, CAPCELL PAC C 18 ) to obtain high-purity A78 / 109 peptide. It was
【００１７】２．Ａ７８／１０９ペプチド抗原によるマ
ウスの免疫 精製Ａ７８／１０９ペプチドを抗原として、Ｂａｌｂ／
ｃ系マウス（６週令、メス）に対し、計４回免疫を行な
った。初回は、精製Ａ７８／１０９ペプチド５０μｇを
３０μｌのＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）に溶解
し、次に、５０％（Ｗ／Ｖ）のポリビニルピロリドン
（メルク製、平均分子量２５，０００）溶液を６０μｌ
加え、室温で２時間攪拌後、１１０μｌの完全フロイン
トアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ
Ａｄｊｕｖａｎｔ、ディフコ製）を混合、乳化し、そ
の溶液をマウスの皮下に投与した。２回目、３回目は、
初回免疫から２週間間隔で行ない、初回免疫と同じ処理
をしたペプチド液に不完全フロイントアジュバント（Ｉ
ｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａ
ｎｔ、ディフコ製）を混合、乳化し、その溶液をマウス
の腹腔内に投与した。最終免疫は、２００μｇの精製Ａ
７８／１０９ペプチドを１００μｌのＰＢＳに溶解し、
そのままマウス尾静脈に投与し、その３日後に、免疫し
たマウスの脾臓細胞を細胞融合に用いた。2. A78 / 109 peptide antigen
Using the immunopurified A78 / 109 peptide of Us as an antigen
C-type mice (6 weeks old, female) were immunized four times in total. First, 50 μg of purified A78 / 109 peptide was dissolved in 30 μl of PBS (phosphate buffered saline), and then 50% (W / V) polyvinylpyrrolidone (Merck, average molecular weight 25,000) solution 60 μl
In addition, after stirring at room temperature for 2 hours, 110 μl of complete Freund's adjuvant (Complete Freund's) was added.
Adjuvant, manufactured by Difco) was mixed and emulsified, and the solution was subcutaneously administered to a mouse. The second and third time,
Peptide solution treated with the same treatment as the initial immunization was performed at intervals of 2 weeks after the initial immunization, and incomplete Freund's adjuvant (I
ncomplete Freund's Adjuva
nt, manufactured by Difco) were mixed and emulsified, and the solution was intraperitoneally administered to the mouse. The final immunization was 200 μg of purified A
78/109 peptide was dissolved in 100 μl PBS,
It was directly administered to the tail vein of the mouse, and three days after that, the spleen cells of the immunized mouse were used for cell fusion.
【００１８】３．細胞融合による抗体産生ハイブリドー
マの作製 免疫した脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞（ミエロ
ーマ細胞）であるＰ３Ｕ１株を約５：１〜１０：１の割
合で混合し、５０％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール
溶液（ベーリンガーマンハイム製、細胞融合用、平均分
子量１，５００）を融合促進剤として使用し、常法に従
い細胞融合を行なった。細胞融合後、感作脾臓細胞換算
で５×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように１０
％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬製）にヒ
ポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを加えた培地
（ＨＡＴ培地）に懸濁し、９６ウエルマイクロプレート
（住友ベークライト製、ＭＳ−８０９６Ｆ）に１ウエル
あたり１００μｌずつ分注した。融合細胞をＣＯ2 イン
キュベーター（３７℃、５％ＣＯ2 、９５％Ａｉｒ）で
培養し、ＨＡＴ培地で増殖可能なハイブリドーマ細胞の
みを選択培養した。融合細胞を分注した４８０ウエル
中、４０４ウエルにコロニー形成が認められた。そこ
で、ハイブリドーマ細胞培養上清中の抗体の有無を確認
するために、ＥＬＩＳＡ法による分析を行なった。3. Antibody-producing hybrid by cell fusion
Ma immunized spleen cells and myeloma cells (myeloma cells) of syngeneic mouse P3U1 strain were mixed at a ratio of about 5: 1 to 10: 1 to prepare a 50% (W / V) polyethylene glycol solution (Boehringer Mannheim's cell fusion, average molecular weight 1,500) was used as a fusion promoter, and cell fusion was performed according to a conventional method. After cell fusion, the sensitized spleen cells were converted to a concentration of 5 × 10 6 cells / ml, which was 10
% FCS-containing RPMI1640 medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) was suspended in a medium (HAT medium) containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine, and 100 μl per well was added to a 96-well microplate (Sumitomo Bakelite, MS-8096F). Dispensed. The fused cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 , 95% Air), and only hybridoma cells capable of growing in HAT medium were selectively cultured. Among the 480 wells into which the fused cells were dispensed, colony formation was observed in 404 wells. Therefore, in order to confirm the presence or absence of the antibody in the hybridoma cell culture supernatant, analysis by the ELISA method was performed.
【００１９】９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（住友ベ
ークライト製、ＭＳ−３５９６Ｆ／Ｈ）に４００ｎｇ／
ウエルになるように精製Ａ７８／１０９ペプチド液を分
注し、１晩、風乾する。ブロッキング液（雪印製、ブロ
ックエース、４倍希釈液）を１５０μｌ／ウエルで分注
し、３７℃、２０分インキュベーションして、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ製）含有ＰＢＳ（以下ＰＢＳ
−Ｔ）で洗浄後、各ハイブリドーマ細胞培養上清を５０
μｌ／ウエルで分注し、３７℃、１時間インキュベーシ
ョンする。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、第２抗体として、ビオ
チン標識ウマ由来抗マウスＩｇＧ抗体（ベクターラボラ
トリーズ製、２００倍希釈液）を加え、３７℃、２０分
インキュベーションする。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、アビジ
ン標識アルカリフォスファターゼ（ベクターラボラトリ
ーズ製、５００倍希釈液）を加え、３７℃、２０分イン
キュベーションする。最後に、ＰＢＳ−Ｔで洗浄して、
０．０６％ｐ−ニトロフェニルリン酸（和光純薬製）で
３７℃、３０分発色させて、４０５ｎｍの吸光度をマイ
クロプレートリーダー（東ソー製、ＭＰＲ−Ａ４）で測
定し、抗体の有無を判定した。４０４ウエル中、最終的
に抗体陽性となったウエルの細胞を限外希釈法によるク
ローニングを２回繰返して行ない、クローン化ハイブリ
ドーマ細胞を得た。ハイブリドーマ細胞の産生するモノ
クローナル抗体は、１０％ＦＣＳ含有Ｅ−ＲＤＦ培地
（極東製薬製）で培養し、その培養上清をモノクローナ
ル抗体含有液として用いた。400 ng / in a 96-well ELISA plate (MS-3596F / H, manufactured by Sumitomo Bakelite)
The purified A78 / 109 peptide solution is dispensed to form wells and air-dried overnight. Blocking solution (manufactured by Snow Brand, Block Ace, 4-fold diluted solution) was dispensed at 150 μl / well, incubated at 37 ° C. for 20 minutes, and then 0.05
PBS containing% Tween20 (manufactured by Sigma) (hereinafter PBS)
-T), after washing each hybridoma cell culture supernatant with 50
Dispense in μl / well and incubate at 37 ° C for 1 hour. After washing with PBS-T, a biotin-labeled horse-derived anti-mouse IgG antibody (manufactured by Vector Laboratories, 200-fold diluted solution) is added as a second antibody, and the mixture is incubated at 37 ° C. for 20 minutes. After washing with PBS-T, avidin-labeled alkaline phosphatase (manufactured by Vector Laboratories, 500-fold diluted solution) is added and incubated at 37 ° C for 20 minutes. Finally, wash with PBS-T,
Color is developed with 0.06% p-nitrophenyl phosphate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for 30 minutes at 37 ° C., and the absorbance at 405 nm is measured with a microplate reader (Tosoh MPR-A4) to determine the presence or absence of antibodies. did. Of the 404 wells, the cells in the wells that finally became antibody-positive were cloned twice by the limiting dilution method to obtain cloned hybridoma cells. The monoclonal antibody produced by the hybridoma cells was cultured in a 10% FCS-containing E-RDF medium (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Inc.), and the culture supernatant was used as a monoclonal antibody-containing liquid.
【００２０】４．ハイブリドーマ細胞が産生するモノク
ローナル抗体のサブクラスの決定 クローンが産生するモノクローナル抗体のサブクラスを
決定した。方法としては、バイオラッド製マウスタイパ
ーキットを使用し、その取扱説明書に従って決定した。
モノクローナル抗体のサブクラスはＨ鎖はＩｇＧ１、Ｌ
鎖はχであった。このモノクローナル抗体を以後、３Ｈ
１０と呼称する。モノクローナル抗体３Ｈ１０を産生す
るハイブリドーマ細胞を１９９１年６月１２日に微工研
に寄託し受託番号微工研菌寄第１２３０２（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２３０２）が付与された。4. Monoc produced by hybridoma cells
Determination of subclass of clonal antibody The subclass of the monoclonal antibody produced by the clone was determined. As a method, a Bio-Rad mouse typer kit was used, and the determination was performed according to the instruction manual.
Subclass of monoclonal antibody is H1, IgG1, L
The chain was χ. This monoclonal antibody will be used for 3H
It is called 10. The hybridoma cells producing the monoclonal antibody 3H10 were deposited with the Institute of Microtechnology on June 12, 1991, and the deposit number was with the number Microorganisms Institute No. 12302 (FERM).
P-12302).
【００２１】５．得られたハイブリドーマ細胞が産生す
るモノクローナル抗体のＡ７８／１０９ペプチドとＡ８
８／１０７ペプチドとの反応性 得られたモノクローナル抗体３Ｈ１０について、抗原に
用いたＡ７８／１０９ペプチドと、この中に含まれるヒ
トＴＧＦ−β１の８８番目から１０７番目までの配列の
前記式（ＩＩＩ）に示すペプチド化合物（Ａ８８／１０
７ペプチド）との反応性を確認した。Ａ８８／１０７ペ
プチドは、実施例１で示した方法と同じ方法で化学合成
し、逆相高速液体クロマトグラフィーにて精製し、高純
度Ａ８８／１０７ペプチドを得た。その反応性は、実施
例３で示したＥＬＩＳＡ法で評価した。その結果、３Ｈ
１０モノクローナル抗体は、Ａ７８／１０９ペプチドに
は強く反応したが、Ａ８８／１０７ペプチドには、反応
しなかつた。その結果を表１に示した。5. The resulting hybridoma cells produce
A78 / 109 peptide and A8 of monoclonal antibody
Reactivity with 8/107 peptide Regarding the obtained monoclonal antibody 3H10, the A78 / 109 peptide used as an antigen and the above formula (III) of the sequence from the 88th position to the 107th position of human TGF-β1 contained therein Peptide compound shown in (A88 / 10
7 peptide) was confirmed. The A88 / 107 peptide was chemically synthesized by the same method as that shown in Example 1 and purified by reverse phase high performance liquid chromatography to obtain a highly pure A88 / 107 peptide. The reactivity was evaluated by the ELISA method shown in Example 3. As a result, 3H
Ten monoclonal antibodies reacted strongly with the A78 / 109 peptide but not with the A88 / 107 peptide. The results are shown in Table 1.
【表１】 [Table 1]
【００２２】６．得られたモノクローナル抗体のヒトＴ
ＧＦ−β１及びヒトＴＧＦ−β２との反応性（ＥＬＩＳ
Ａ法） モノクローナル抗体３Ｈ１０を用いて、Ａ７８／１０９
ペプチド、ヒトＴＧＦ−β１、及びヒトＴＧＦ−β２に
対する反応性を確認した。Ａ７８／１０９ペプチド、精
製ヒトＴＧＦ−β１（宝酒造製、ヒト血小板由来）なら
びに、精製ヒトＴＧＦ−β２（ナカライテスク製、ヒト
ガン細胞由来）をＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに適当
な濃度（０〜１００ｎｇ／ウエル）で固相化したものと
モノクローナル抗体液とを反応させ、実施例３で示した
ＥＬＩＳＡ法で評価した。その結果、３Ｈ１０モノクロ
ーナル抗体は、Ａ７８／１０９ペプチド、ヒトＴＧＦ−
β１には反応するが、ヒトＴＧＦ−β２にはほとんど反
応しなかった。結果を図１に示した。6. Human T of the obtained monoclonal antibody
Reactivity with GF-β1 and human TGF-β2 (ELIS
Method A) A78 / 109 using monoclonal antibody 3H10
Reactivity to peptides, human TGF-β1 and human TGF-β2 was confirmed. A78 / 109 peptide, purified human TGF-β1 (manufactured by Takara Shuzo, derived from human platelets) and purified human TGF-β2 (manufactured by Nacalai Tesque, derived from human cancer cells) at an appropriate concentration (0 to 100 ng / well) on an ELISA microplate. The solid-phase immobilized antibody was reacted with a monoclonal antibody solution and evaluated by the ELISA method shown in Example 3. As a result, the 3H10 monoclonal antibody showed A78 / 109 peptide and human TGF-
Reacts with β1, but hardly with human TGF-β2. The results are shown in Fig. 1.
【００２３】７．得られたモノクローナル抗体のヒトＴ
ＧＦ−β１との反応性（ウエスタンブロッティング法） 得られたモノクローナル抗体について、ヒトＴＧＦ−β
１に対する反応性について、ウエスタンブロッティング
法で確認した。精製ヒトＴＧＦ−β１をＳＤＳ（ドデシ
ル硫酸ナトリウム、ナカライテスク製）で処理し、同時
に、２−メルカプトエタノールで処理したもの（還元処
理）と、しなかったもの（非還元処理）の２つについ
て、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１６％、テフコ
製）電気泳動で分離した〔Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２２７，６８０，（１９７０）〕。泳動
後、Ｔｏｗｂｉｎらの方法〔Ｈ．Ｔｏｗｂｉｎ，ｅｔ．
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７６，４３５０，（１９７９）〕に準じてウエスタ
ンブロッティング法を行なった。用いたモノクローナル
抗体液は実施例３で作製したハイブリドーマ細胞培養上
清を原液のまま用い、検出は、ベクスタインＡＢＣ−Ａ
Ｐキット（ベクターラボラトリーズ製）でおこなった。
その結果、非還元処理ヒトＴＧＦ−β１（分子量約２
５，０００）、および還元処理ヒトＴＧＦ−β１（分子
量約１２，５００）のいずれに対しても、３Ｈ１０は強
く反応した。結果を図２に示した。7. Human T of the obtained monoclonal antibody
Reactivity with GF-β1 (Western blotting method) Human TGF-β
The reactivity to 1 was confirmed by Western blotting. Purified human TGF-β1 was treated with SDS (sodium dodecyl sulfate, manufactured by Nacalai Tesque) and simultaneously treated with 2-mercaptoethanol (reduction treatment) and not treated (non-reduction treatment). Separation by SDS-polyacrylamide gel (16%, Tefco) electrophoresis [U. K. Laemmli, N
ature, 227 , 680, (1970)]. After electrophoresis, the method of Towbin et al. [H. Towbin, et.
al. , Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 76 , 4350, (1979)]. The monoclonal antibody solution used was the hybridoma cell culture supernatant prepared in Example 3 as it was, and the detection was performed using Bexstein ABC-A.
It was performed with a P kit (manufactured by Vector Laboratories).
As a result, non-reduced human TGF-β1 (molecular weight about 2
3H10 strongly reacted with both 5,000) and reduced human TGF-β1 (molecular weight of about 12,500). The results are shown in Fig. 2.
【００２４】[0024]
【図１】モノクローナル抗体のＡ７８／１０９ペプチ
ド、ヒトＴＧＦ−β１及びヒトＴＧＦ−β２に対する反
応性を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the reactivity of monoclonal antibodies with A78 / 109 peptide, human TGF-β1 and human TGF-β2.
【図２】電気泳動を示す写真であって、具体的にはモノ
クローナル抗体のヒトＴＧＦ−β１に対する反応性につ
いてのウエスタンブロット分析結果を示す写真である。FIG. 2 is a photograph showing electrophoresis, specifically, a photograph showing the results of Western blot analysis on the reactivity of a monoclonal antibody with human TGF-β1.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical indication C12P 21/08 9161-4B G01N 33/53 D 33/577 B (C12P 21/08 C12R 1:91 )
Claims (5)
の完全アミノ酸配列中に含まれる下記式（Ｉ）に示すア
ミノ酸配列からなるペプチド化合物に対して特異的に反
応し、ヒトトランスフォーミング成長因子β２に対して
は実質的に反応しないことを特徴とするトランスフォー
ミング成長因子β１に対するモノクローナル抗体。 【化１】 1. A human transforming growth factor β1
Of the amino acid sequence represented by the following formula (I) contained in the complete amino acid sequence of the above, specifically reacts with no human transforming growth factor β2. Monoclonal antibody against transforming growth factor β1. [Chemical 1]
配列中に含まれる下記式（ＩＩ）に示すアミノ酸配列部
分に対して特異的に反応する請求項１のモノクローナル
抗体。 【化２】 2. The monoclonal antibody according to claim 1, which specifically reacts with an amino acid sequence portion represented by the following formula (II) contained in the amino acid sequence represented by formula (I) according to claim 1. [Chemical 2]
に属する請求項１または２のモノクローナル抗体。3. The monoclonal antibody according to claim 1 or 2, wherein the H chain belongs to IgG1 and the L chain belongs to χ subclass.
の完全アミノ酸配列中に含まれる下記式（Ｉ）に示すア
ミノ酸配列からなるペプチド化合物で予め免疫されたマ
ウスの脾臓細胞とマウスの骨髄腫細胞との融合により形
成されたハイブリドーマ細胞であって、ヒトトランスフ
ォーミング成長因子β１の完全アミノ酸配列中に含まれ
る下記式（Ｉ）に示すアミノ酸配列からなるペプチド化
合物に対して特異的に反応しヒトトランスフォーミング
成長因子β２に対しては実質的に反応しない、トランス
フォーミング成長因子β１に対するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ細胞。 【化３】 4. Human transforming growth factor β1
Which is a hybridoma cell formed by fusing mouse spleen cells and mouse myeloma cells pre-immunized with a peptide compound consisting of the amino acid sequence represented by the following formula (I) contained in the complete amino acid sequence of Specifically reacting with a peptide compound having the amino acid sequence represented by the following formula (I) contained in the complete amino acid sequence of transforming growth factor β1 and not substantially reacting with human transforming growth factor β2, A hybridoma cell producing a monoclonal antibody against transforming growth factor β1. [Chemical 3]
研菌寄第１２３０２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２３０２）と
して寄託されたハイブリドーマ細胞であって、ヒトトラ
ンスフォーミング成長因子β１の完全アミノ酸配列中に
含まれる下記式（Ｉ）に示すアミノ酸配列からなるペプ
チド化合物に対して特異的に反応し、ヒトトランスフォ
ーミング成長因子β１の完全アミノ酸配列中に含まれる
下記式（ＩＩＩ）に示すアミノ酸配列からなるペプチド
化合物に対しては実質的に反応せず、且つヒトトランス
フォーミング成長因子β２に対しても実質的に反応しな
い、トランスフォーミング成長因子β１に対するモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞である請求
項４のハイブリドーマ細胞。 【化４】 【化５】 5. A hybridoma cell deposited as Micromachine Research Institute No. 12302 (FERM P-12302) at the Institute of Microbial Science and Technology of the Institute of Industrial Science, which comprises the complete amino acid sequence of human transforming growth factor β1. A peptide comprising an amino acid sequence represented by the following formula (III) contained in the complete amino acid sequence of human transforming growth factor β1 which specifically reacts with a peptide compound comprising the amino acid sequence represented by the following formula (I) The hybridoma cell according to claim 4, which is a hybridoma cell that produces a monoclonal antibody against transforming growth factor β1 that does not substantially react with a compound and does not substantially react with human transforming growth factor β2. . [Chemical 4] [Chemical 5]
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|---|---|---|---|
| JP3150450A JPH0768278B2 (en) | 1991-06-21 | 1991-06-21 | Monoclonal antibody against transforming growth factor β1 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3150450A JPH0768278B2 (en) | 1991-06-21 | 1991-06-21 | Monoclonal antibody against transforming growth factor β1 |
Publications (2)
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|---|---|
| JPH06165692A JPH06165692A (en) | 1994-06-14 |
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1991
- 1991-06-21 JP JP3150450A patent/JPH0768278B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，２７〜２！（１９８８）Ｐ．７３９−７４６ |
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