JPH0768276B2 - Hivのcd4結合領域に特異的な抗体 - Google Patents
Hivのcd4結合領域に特異的な抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 後天性免疫不全症候群(AIDS)はウイルスによって引き
起こされるが、このウイルスは、時代に応じて、ヒトT
リンパ球刺激ウイルスIII型(HTLV−III)と呼ばれた
り、リンパ節症関連ウイルス(LAV)と呼ばれてきた。
現在では、このウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス1型
(HIV−1)として知られている。
起こされるが、このウイルスは、時代に応じて、ヒトT
リンパ球刺激ウイルスIII型(HTLV−III)と呼ばれた
り、リンパ節症関連ウイルス(LAV)と呼ばれてきた。
現在では、このウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス1型
(HIV−1)として知られている。
HIV−1は、Tヘルパー/インデューサーリンパ球(以
降、T細胞と呼ぶ)に感染し、これらを枯渇させること
によって、免疫系に障害を与える。T細胞が重要である
のは、T細胞が、B細胞による抗体の産生、細胞障害T
リンパ球(キラーT細胞)の成熟、マクロファージおよ
びナチュラルキラー細胞の成熟および活性、ならびに免
疫系のエフェクター機能を調節するためである。
降、T細胞と呼ぶ)に感染し、これらを枯渇させること
によって、免疫系に障害を与える。T細胞が重要である
のは、T細胞が、B細胞による抗体の産生、細胞障害T
リンパ球(キラーT細胞)の成熟、マクロファージおよ
びナチュラルキラー細胞の成熟および活性、ならびに免
疫系のエフェクター機能を調節するためである。
T細胞の感染は、HIV−1が担うエピトープとT細胞表
面上に位置する受容体部位との相互作用によって生じ
る。T細胞上のこの受容体部位は、CD4抗原として知ら
れるタンパク分子である。HIV−1上のエピトープは、
外層エンヴェロープの糖タンパクgp120(分子量約120,0
00ダルトン)に担われている。この糖タンパクgp120
は、HIV感染T細胞中で作られる前駆体の糖タンパクgp1
60が、膜透過部分のgp41(分子量約4,1000ダルトン)と
gp120とに開裂する際に生じる。糖タンパクgp41は、ヴ
ィリオンの膜の脂質二重層と感染細胞の脂質二重層にわ
たり、その露出部分は引共有結合を介してgp120と会合
している。糖タンパクgp120には、標的細胞と融合する
部位があるが、その標的細胞によってウイルスの遺伝情
報が細胞中にもとらされる。
面上に位置する受容体部位との相互作用によって生じ
る。T細胞上のこの受容体部位は、CD4抗原として知ら
れるタンパク分子である。HIV−1上のエピトープは、
外層エンヴェロープの糖タンパクgp120(分子量約120,0
00ダルトン)に担われている。この糖タンパクgp120
は、HIV感染T細胞中で作られる前駆体の糖タンパクgp1
60が、膜透過部分のgp41(分子量約4,1000ダルトン)と
gp120とに開裂する際に生じる。糖タンパクgp41は、ヴ
ィリオンの膜の脂質二重層と感染細胞の脂質二重層にわ
たり、その露出部分は引共有結合を介してgp120と会合
している。糖タンパクgp120には、標的細胞と融合する
部位があるが、その標的細胞によってウイルスの遺伝情
報が細胞中にもとらされる。
CD4抗原は、HIV−1のための細胞表面受容体と同定され
ているので、CD4抗原の溶解型(sCD4)は、ウイルスの
感染性を阻止し得ることが繰り返し示されてきた。溶解
型CD4はHIV−1の多様な変異体を阻害し、このことは、
これらすべてのウイルスが比較的よく保存されたCD4結
合領域を共有することを意味する。ラスキーらは、gp12
0とCD4との相互作用を阻害し得る、gp120特異的ウサギ
のモノクローナル抗体を同定した。文献[Cell,50:995
−985(1987)]参照。
ているので、CD4抗原の溶解型(sCD4)は、ウイルスの
感染性を阻止し得ることが繰り返し示されてきた。溶解
型CD4はHIV−1の多様な変異体を阻害し、このことは、
これらすべてのウイルスが比較的よく保存されたCD4結
合領域を共有することを意味する。ラスキーらは、gp12
0とCD4との相互作用を阻害し得る、gp120特異的ウサギ
のモノクローナル抗体を同定した。文献[Cell,50:995
−985(1987)]参照。
このモノクローナル抗体によって認識されるエピトープ
は、HIV−1と遠縁のHIV−2が顕著な相同性を共有する
アミノ酸残基413〜456中の保存領域にマッピングされて
きた。gp120の領域はCD4への結合に重要であると思われ
る。しかし、エンヴェロープの糖タンパクgp120のCD4結
合領域は、HIV−1感染者には免疫原性を示さないよう
である。HIV−1またはHIV−2に感染した患者からの血
清間で、エンヴェロープタンパクに対する抗原の交差反
応性が非常に小さいからである。文献[Clavel,R.et a
l.,Science,233:343−346(1986)]参照。
は、HIV−1と遠縁のHIV−2が顕著な相同性を共有する
アミノ酸残基413〜456中の保存領域にマッピングされて
きた。gp120の領域はCD4への結合に重要であると思われ
る。しかし、エンヴェロープの糖タンパクgp120のCD4結
合領域は、HIV−1感染者には免疫原性を示さないよう
である。HIV−1またはHIV−2に感染した患者からの血
清間で、エンヴェロープタンパクに対する抗原の交差反
応性が非常に小さいからである。文献[Clavel,R.et a
l.,Science,233:343−346(1986)]参照。
発明の概要 この発明は、T細胞のCD4受容体に結合するHIV−1のエ
ンヴェロープ糖タンパクgp120の領域内に位置するエピ
トープ、およびこのエンピトープに結合する抗体に関す
る。このエピトープは、GP120のアミノ酸残基423〜437
に位置している。エピトープと反応する抗体は、HIV−
1のさまざまな株によってT細胞の感染を抑制し得る。
ンヴェロープ糖タンパクgp120の領域内に位置するエピ
トープ、およびこのエンピトープに結合する抗体に関す
る。このエピトープは、GP120のアミノ酸残基423〜437
に位置している。エピトープと反応する抗体は、HIV−
1のさまざまな株によってT細胞の感染を抑制し得る。
すなわち、本発明は、HIV−1のgp120のCD4結合領域中
のアミノ酸配列INMWQKVGKAMYAPに結合し、HIV−Iの異
なる複数の株によるT細胞の感染を抑制するモノクロー
ナル抗体を提供する。また、本発明は、細胞障害剤、抗
ウイルス剤、または血液−脳関門の通過を容易にする薬
剤と結合した上記本発明のモノクローナル抗体を含む免
疫複合体を提供する。さらに、本発明は、抗体生産細胞
と骨髄種細胞とを融合することにより得られ、上記本発
明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提
供する。
のアミノ酸配列INMWQKVGKAMYAPに結合し、HIV−Iの異
なる複数の株によるT細胞の感染を抑制するモノクロー
ナル抗体を提供する。また、本発明は、細胞障害剤、抗
ウイルス剤、または血液−脳関門の通過を容易にする薬
剤と結合した上記本発明のモノクローナル抗体を含む免
疫複合体を提供する。さらに、本発明は、抗体生産細胞
と骨髄種細胞とを融合することにより得られ、上記本発
明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提
供する。
この発明の抗体(および関連抗体)は、AIDS(AIDS関連
複合体、ARC)に対する治療薬もしくはワクチンとして
使用可能であり、またはHIV感染者であるが無症候の個
人を治療するために使用することができる。また、HIV
−1感染細胞に薬剤を運搬する目的の免疫複合体を作成
するため、こういった抗体を、細胞障害薬または抗ウイ
ルス薬に結合させるか、そういった薬剤を含む微小担体
(例えば、リポソーム)に複合させることができる。治
療薬の標的に対する運搬も、この発明の抗体に由来する
両特異的抗体を用いて行うことができる。両特異的な抗
体には、標的に運ばれるべき薬剤に対する別の特異性が
ある。
複合体、ARC)に対する治療薬もしくはワクチンとして
使用可能であり、またはHIV感染者であるが無症候の個
人を治療するために使用することができる。また、HIV
−1感染細胞に薬剤を運搬する目的の免疫複合体を作成
するため、こういった抗体を、細胞障害薬または抗ウイ
ルス薬に結合させるか、そういった薬剤を含む微小担体
(例えば、リポソーム)に複合させることができる。治
療薬の標的に対する運搬も、この発明の抗体に由来する
両特異的抗体を用いて行うことができる。両特異的な抗
体には、標的に運ばれるべき薬剤に対する別の特異性が
ある。
治療を目的とした場合、この発明の抗体は、マウスまた
は他の動物からそのまま得られた抗体として生体内で使
用することができる。抗体はヒト由来のものが好まし
い。また、その抗体は、動物/ヒトのキメラ抗体の形態
で作成することもできる。
は他の動物からそのまま得られた抗体として生体内で使
用することができる。抗体はヒト由来のものが好まし
い。また、その抗体は、動物/ヒトのキメラ抗体の形態
で作成することもできる。
この発明のモノクローナル抗体の他の用途としては、診
断のために使用される抗イディオタイプの開発、抗体の
スクリーニング、または薬剤のスクリーニングなども可
能である。
断のために使用される抗イディオタイプの開発、抗体の
スクリーニング、または薬剤のスクリーニングなども可
能である。
図面の簡単な説明 図面の詳細な説明 図1Aおよび1Bはそれぞれ、シンシチウム形成試験によっ
て測定された、7種類の抗CD4結合領域抗体による、異
なったHTLV−III単離物の中和を示す。
て測定された、7種類の抗CD4結合領域抗体による、異
なったHTLV−III単離物の中和を示す。
図2A、2Bおよび2Cはそれぞれ、H9細胞を用いた感染性検
定法によって測定された、7種類の抗CD4結合領域抗体
による、異なったHTLV−III単離物の中和を示す。
定法によって測定された、7種類の抗CD4結合領域抗体
による、異なったHTLV−III単離物の中和を示す。
図3は、2つのHTLV−III株で行われたHIV−1結合阻害
試験の結果を示す。
試験の結果を示す。
図4は、AIDS患者またはAIDS関連複合体(ARC)患者、
無症候性HIV−1血清型陽性者、およびペプチドT35Sを
有する血清型陰性対照者からのヒト血清の免疫反応性を
示す。
無症候性HIV−1血清型陽性者、およびペプチドT35Sを
有する血清型陰性対照者からのヒト血清の免疫反応性を
示す。
図5は、HTLV−III B、HTLV−III MNまたはHTLV−RFに
感染されたH9細胞に露呈した際、免疫複合体G−3−51
9−PAP−Sの細胞障害効果を示す。
感染されたH9細胞に露呈した際、免疫複合体G−3−51
9−PAP−Sの細胞障害効果を示す。
図6は、免疫複合体の細胞障害効果を特異性を示すヒス
トログラムである。
トログラムである。
発明の詳細な説明 この発明のモノクローナル抗体の反応エピトープは、T
細胞のCD4受容体に結合する領域内のgp120上に位置して
いる。CD4受容体結合エピトープは、アミノ酸配列IINMW
QKVGKAMYAPを有するセグメントを含む。この配列は、gp
120の残基423〜437に相当する。このエピトープに体す
る抗体は、強い感染性のHIVを阻害する。例えば、この
エピトープに特異的であったモノクローナル抗体はすべ
て、数種のHIV−1株を阻害する。さらに、このエピト
ープは、各HIV−1株の間で高度に保存されている。そ
の結果、これらエピトープの1種類以上に特異的な抗体
は、HIV−1のさまざまな株を阻害し得る。
細胞のCD4受容体に結合する領域内のgp120上に位置して
いる。CD4受容体結合エピトープは、アミノ酸配列IINMW
QKVGKAMYAPを有するセグメントを含む。この配列は、gp
120の残基423〜437に相当する。このエピトープに体す
る抗体は、強い感染性のHIVを阻害する。例えば、この
エピトープに特異的であったモノクローナル抗体はすべ
て、数種のHIV−1株を阻害する。さらに、このエピト
ープは、各HIV−1株の間で高度に保存されている。そ
の結果、これらエピトープの1種類以上に特異的な抗体
は、HIV−1のさまざまな株を阻害し得る。
このエピトープに対する抗体は、体細胞融合法によって
作成することができる。一般には、文献[G.Kohler and
C.Milstein,Nature,256,725(1975)およびFung et a
l.,Biotechnology5:940−946(1987)]参照。すなわ
ち、マウスなどの動物がHIVのgp120によって免疫化され
る。このgp120は、この目的のウイルス溶解物から精
製、または部分的精製が可能である。gp120の精製は、g
p120に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラ
フィーによっつ行うことができる。免疫化の後、B細胞
の免疫動物から採取し、骨髄腫細胞などの悪性細胞と融
合させる。
作成することができる。一般には、文献[G.Kohler and
C.Milstein,Nature,256,725(1975)およびFung et a
l.,Biotechnology5:940−946(1987)]参照。すなわ
ち、マウスなどの動物がHIVのgp120によって免疫化され
る。このgp120は、この目的のウイルス溶解物から精
製、または部分的精製が可能である。gp120の精製は、g
p120に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラ
フィーによっつ行うことができる。免疫化の後、B細胞
の免疫動物から採取し、骨髄腫細胞などの悪性細胞と融
合させる。
エピトープに結合する抗体を産生するハイブリドーマ
は、スクリーニング手法によって同定することができ
る。こういったスクリーニング手法では、ハイブリド細
胞が最初に、好ましくは酵素結合免疫吸着検定法(ELIS
A)またはウエスターン法を用いてgp120に対する抗体の
産生の可否について試験される。この決定法を各ハイブ
リド細胞に行い、その後の解析のために陽性のハイブリ
ド細胞を選別する。最後に、最も高い反応性を示すもの
を選別する。さまざまな株の中で交差反応性に関して、
ウイルス感染細胞表面の免疫蛍光染色、代謝的に放射線
標識されたウイルスを用いた放射線免疫沈澱法によっ
て、これらの抗体を試験することができる。Fungの上記
文献を参照。
は、スクリーニング手法によって同定することができ
る。こういったスクリーニング手法では、ハイブリド細
胞が最初に、好ましくは酵素結合免疫吸着検定法(ELIS
A)またはウエスターン法を用いてgp120に対する抗体の
産生の可否について試験される。この決定法を各ハイブ
リド細胞に行い、その後の解析のために陽性のハイブリ
ド細胞を選別する。最後に、最も高い反応性を示すもの
を選別する。さまざまな株の中で交差反応性に関して、
ウイルス感染細胞表面の免疫蛍光染色、代謝的に放射線
標識されたウイルスを用いた放射線免疫沈澱法によっ
て、これらの抗体を試験することができる。Fungの上記
文献を参照。
上記の方法によってgp120と反応性のある抗体を同定し
た後、これら抗体を中和活性に関して試験することがで
きる。この活性は、2つの検定法によって測定されるこ
とが好ましいが、最初の方法はウイルス中和法であっ
て、文献[Ho,D.D.et al.,Science,239:1021−1023(19
88)]に記載されている。この検定法では、H9細胞中の
HIV−1感染性の抑制の程度が測定される。第2の中和
法は、文献[Nara,P.L.et al.,AIDS Res.Hum.Retroviru
ses,3:283−302(1987)]に記載されたようなシンシチ
ウムの阻害の程度に基づくものである。HIV−1および
抗体が、CD4+CEM−SS細胞を播種した穴に添加される。
HIVが感染したCEM−SS細胞は、細胞表面上にgp120をよ
く発現するようになり、隣接のCD4+CEM−SS細胞とシン
シチウムを形成する。モノクローナル抗体によるHIV−
1の中和は、シンシチウムの形成阻害となって現れる。
た後、これら抗体を中和活性に関して試験することがで
きる。この活性は、2つの検定法によって測定されるこ
とが好ましいが、最初の方法はウイルス中和法であっ
て、文献[Ho,D.D.et al.,Science,239:1021−1023(19
88)]に記載されている。この検定法では、H9細胞中の
HIV−1感染性の抑制の程度が測定される。第2の中和
法は、文献[Nara,P.L.et al.,AIDS Res.Hum.Retroviru
ses,3:283−302(1987)]に記載されたようなシンシチ
ウムの阻害の程度に基づくものである。HIV−1および
抗体が、CD4+CEM−SS細胞を播種した穴に添加される。
HIVが感染したCEM−SS細胞は、細胞表面上にgp120をよ
く発現するようになり、隣接のCD4+CEM−SS細胞とシン
シチウムを形成する。モノクローナル抗体によるHIV−
1の中和は、シンシチウムの形成阻害となって現れる。
次いで、HIV−1阻害抗体が結合するエピトープが同定
される。これは、さまざまな領域に相当し、5つのアミ
ノ酸が互いに重なりあうペプチドを調製することによっ
て行うことができる。続いて、これらのペプチドとの反
応性を、ELISAなどの標準的な免疫検定法で調べること
ができる。特に、これらの抗体は、アミノ酸配列IINMWQ
KVGKAMYAPを有する、gp120のI15P領域との反応性に関し
て調べることができる。
される。これは、さまざまな領域に相当し、5つのアミ
ノ酸が互いに重なりあうペプチドを調製することによっ
て行うことができる。続いて、これらのペプチドとの反
応性を、ELISAなどの標準的な免疫検定法で調べること
ができる。特に、これらの抗体は、アミノ酸配列IINMWQ
KVGKAMYAPを有する、gp120のI15P領域との反応性に関し
て調べることができる。
この発明のモノクローナル抗体の治療的用途としては、
生体内での免疫療法および生体外での免疫療法が挙げら
れる。この発明のモノクローナル抗体を使った直接の生
体内療法では、体内、好ましくは静注によってこの抗体
を投与することである。脳で感染細胞を処置する必要の
ある場合、抗体をある種の親油性物質などの薬剤に結合
させることができ、これによって薬剤が血液−脳関門を
通過できるようになる。この発明の抗体は、HIV−1の
さまざまな株および分離物によってT細胞の感染を抑制
できるので、これらは、患者群が遭遇するウイルスのさ
まざまなタイプに対して有効な防御を可能とする。
生体内での免疫療法および生体外での免疫療法が挙げら
れる。この発明のモノクローナル抗体を使った直接の生
体内療法では、体内、好ましくは静注によってこの抗体
を投与することである。脳で感染細胞を処置する必要の
ある場合、抗体をある種の親油性物質などの薬剤に結合
させることができ、これによって薬剤が血液−脳関門を
通過できるようになる。この発明の抗体は、HIV−1の
さまざまな株および分離物によってT細胞の感染を抑制
できるので、これらは、患者群が遭遇するウイルスのさ
まざまなタイプに対して有効な防御を可能とする。
確立された遺伝子工学的手法を用いれば、動物由来およ
びヒト由来の部分を有する抗体を創製することができ
る。こういったキメラ抗体は、動物由来の抗原結合(可
変)領域およびヒト抗体由来の一定領域を含む。動物
は、マウスまたはラットなど他の囓歯類であり得る。こ
のキメラ抗体の可変領域がマウス由来であって、一定領
域がヒト由来であれば、一般にキメラ抗体は、「純粋
な」マウス由来のモノクローナル抗体より免疫原性が弱
くなるので、おそらく治療の用途に一層適するであろ
う。
びヒト由来の部分を有する抗体を創製することができ
る。こういったキメラ抗体は、動物由来の抗原結合(可
変)領域およびヒト抗体由来の一定領域を含む。動物
は、マウスまたはラットなど他の囓歯類であり得る。こ
のキメラ抗体の可変領域がマウス由来であって、一定領
域がヒト由来であれば、一般にキメラ抗体は、「純粋
な」マウス由来のモノクローナル抗体より免疫原性が弱
くなるので、おそらく治療の用途に一層適するであろ
う。
キメラ抗体は、成分の抗体鎖をコードするキメラDNA構
造体によって産生され得る。文献[V.T.Oi et al.,Bio
Techniques4(4):214−221(1986);L.K.Sun et al.,
Hybridoma5(1986)]参照。こういったDNA構造体は、
ヒトの不変領域をコードするDNAに結合したHIV−1中和
抗体の短鎖または長鎖の可変領域の機能的に再配列した
遺伝子をコードするDNAを含む。骨髄腫などのリンパ球
様細胞、または短鎖および長鎖のためのDNA構造体をト
ランスフェクトしたハイブリドーマは、抗体鎖を発現
し、これらを会合することができる。
造体によって産生され得る。文献[V.T.Oi et al.,Bio
Techniques4(4):214−221(1986);L.K.Sun et al.,
Hybridoma5(1986)]参照。こういったDNA構造体は、
ヒトの不変領域をコードするDNAに結合したHIV−1中和
抗体の短鎖または長鎖の可変領域の機能的に再配列した
遺伝子をコードするDNAを含む。骨髄腫などのリンパ球
様細胞、または短鎖および長鎖のためのDNA構造体をト
ランスフェクトしたハイブリドーマは、抗体鎖を発現
し、これらを会合することができる。
もう一つ別の、実質的に非免疫原的な療法は、ヒトのモ
ノクローナル抗体を使用するものである。不死化抗体産
生B細胞系を得る好ましい方法は、HIV−1感染者から
のB細胞をエプシュタインバールウイルスでトランスフ
ォーメイションすることである。トランスフォーメイシ
ョンされたB細胞クローンは、gp120およびそのエピト
ープペプチドを用いた特異的反応性によってスクリーニ
ングすることが可能である。さらに一つの好ましい方法
は、バクテリオファージλ発現ベクター(例えば、カリ
フォルニア州ラジョラのストラトサイト社によるImmuno
ZapTM)を使って、ヒトのモノクローナル発現ライブラ
リーを作成することである。これは、文献[Alting−Me
es et al.,Strategies in Molecuuar Biology,No.1,Vo
l.3,(Jan.1990)]に記載されている。本質的にこの方
法では、リンパ球集団からの免疫がグリブリン可変領域
遺伝子の増幅、これに続く大腸菌中のライブラリーの作
成を行う。その際、大腸菌の中で長鎖の可変領域遺伝子
が、単独、または短鎖の可変領域遺伝子と組み合わさっ
て発現される。抗原(この発明のペプチドなど)は、抗
原に対する結合領域を産生するクローンを同定するため
のスクリーニングに使用される。抗原特異的可変領域の
遺伝子が同定されると、これらを、上記のキメラ抗体の
産生に使用した方法に類似の方法によって、望ましいヒ
トの一定領域遺伝子に結合させることができる。
ノクローナル抗体を使用するものである。不死化抗体産
生B細胞系を得る好ましい方法は、HIV−1感染者から
のB細胞をエプシュタインバールウイルスでトランスフ
ォーメイションすることである。トランスフォーメイシ
ョンされたB細胞クローンは、gp120およびそのエピト
ープペプチドを用いた特異的反応性によってスクリーニ
ングすることが可能である。さらに一つの好ましい方法
は、バクテリオファージλ発現ベクター(例えば、カリ
フォルニア州ラジョラのストラトサイト社によるImmuno
ZapTM)を使って、ヒトのモノクローナル発現ライブラ
リーを作成することである。これは、文献[Alting−Me
es et al.,Strategies in Molecuuar Biology,No.1,Vo
l.3,(Jan.1990)]に記載されている。本質的にこの方
法では、リンパ球集団からの免疫がグリブリン可変領域
遺伝子の増幅、これに続く大腸菌中のライブラリーの作
成を行う。その際、大腸菌の中で長鎖の可変領域遺伝子
が、単独、または短鎖の可変領域遺伝子と組み合わさっ
て発現される。抗原(この発明のペプチドなど)は、抗
原に対する結合領域を産生するクローンを同定するため
のスクリーニングに使用される。抗原特異的可変領域の
遺伝子が同定されると、これらを、上記のキメラ抗体の
産生に使用した方法に類似の方法によって、望ましいヒ
トの一定領域遺伝子に結合させることができる。
この発明のさらに別の実施態様では、細胞障害薬または
抗ウイルス薬の運搬を助けるために本発明のモノクロー
ナル抗体を使用することができ、これは、ある毒素に結
合した抗体またはその断片を含む免疫複合体を形成する
ことによって使用可能である。細胞障害薬の例として
は、細胞障害ステロイド類、ゲロニン、アブリン、リシ
ン、およびホスホリパーゼ類が挙げられる。抗ウイルス
薬の例としては、インターフェロン、アジドチミジンお
よびリバビリンが挙げられる。この発明の抗体とともに
用いられる特に好ましい毒素は、アメリカヤマゴボウの
抗ウイルスタンパク(PAP−S)である。この免疫複合
体は、抗体と毒素を化学的に結合させるか、組換えDNA
技術によって形成することが可能である。
抗ウイルス薬の運搬を助けるために本発明のモノクロー
ナル抗体を使用することができ、これは、ある毒素に結
合した抗体またはその断片を含む免疫複合体を形成する
ことによって使用可能である。細胞障害薬の例として
は、細胞障害ステロイド類、ゲロニン、アブリン、リシ
ン、およびホスホリパーゼ類が挙げられる。抗ウイルス
薬の例としては、インターフェロン、アジドチミジンお
よびリバビリンが挙げられる。この発明の抗体とともに
用いられる特に好ましい毒素は、アメリカヤマゴボウの
抗ウイルスタンパク(PAP−S)である。この免疫複合
体は、抗体と毒素を化学的に結合させるか、組換えDNA
技術によって形成することが可能である。
モノクローナル抗体のもう一つの形態は、両特異的なハ
イブリド抗体であり、この抗体は、2つの異なった抗原
結合部分(すなわち、異なった特異性)を有する。一方
の抗原結合部分はこの発明のモノクローナル抗体由来の
ものであり、他の抗原結合部分は特定部位を標的とする
薬剤に対して特異性をもつものであり得る。例えば、他
方の特異性は、CD4分子になどの、ヒトT細胞またはマ
クロファージの表面エピトープに関する場合がある。こ
れらの両特異的抗体は、HIV−1感染細胞へT細胞また
はマクロファージを運搬するために用いることができ
る。
イブリド抗体であり、この抗体は、2つの異なった抗原
結合部分(すなわち、異なった特異性)を有する。一方
の抗原結合部分はこの発明のモノクローナル抗体由来の
ものであり、他の抗原結合部分は特定部位を標的とする
薬剤に対して特異性をもつものであり得る。例えば、他
方の特異性は、CD4分子になどの、ヒトT細胞またはマ
クロファージの表面エピトープに関する場合がある。こ
れらの両特異的抗体は、HIV−1感染細胞へT細胞また
はマクロファージを運搬するために用いることができ
る。
両特異的抗体は、両特異性を有する、単一抗体、ハイブ
リド抗体または抗体断片(文献[M.Brennan,“A Chemic
al Technique for the Preparation of Bispecific Ant
ibodies from Fab′ Fragments of Mouse Monoclonal I
gGl",Biotechniques4:424−27(1986)]参照)か、ま
たはこの抗体は、それぞれが異なった特異性を有する2
つの抗体のヘテロ凝集体であり得る。
リド抗体または抗体断片(文献[M.Brennan,“A Chemic
al Technique for the Preparation of Bispecific Ant
ibodies from Fab′ Fragments of Mouse Monoclonal I
gGl",Biotechniques4:424−27(1986)]参照)か、ま
たはこの抗体は、それぞれが異なった特異性を有する2
つの抗体のヘテロ凝集体であり得る。
この発明の抗体は、集団中でさまざまな株のHIV−1に
対して交差保護が可能であるため、受動免疫に特に適し
ている。この方法では、無症候性(AIDSまたはARCの症
候を呈さない)の患者、または血清適陰性であるが高リ
スク群の患者に、感染を抑制する処置が行われる。対象
の例としては、HIV−1キャリアーの母親によって感染
される胎児またはその母親の新生児、およびAIDS患者ま
たは汚染された血液を吸う健常な職員が挙げられる。ま
た、治療のための薬剤は、この発明のモノクローナル抗
体、キメラモノクローナル抗体、または両特異的モノク
ローナル抗体であり得る。
対して交差保護が可能であるため、受動免疫に特に適し
ている。この方法では、無症候性(AIDSまたはARCの症
候を呈さない)の患者、または血清適陰性であるが高リ
スク群の患者に、感染を抑制する処置が行われる。対象
の例としては、HIV−1キャリアーの母親によって感染
される胎児またはその母親の新生児、およびAIDS患者ま
たは汚染された血液を吸う健常な職員が挙げられる。ま
た、治療のための薬剤は、この発明のモノクローナル抗
体、キメラモノクローナル抗体、または両特異的モノク
ローナル抗体であり得る。
この発明のモノクローナル抗体は、既知の技術を使って
抗イディオタイプ抗体を調製するためにも用いられる。
これには、無症候性のHIV−1感染者またはAIDSもしく
はARC患者が、HIV−1株のgp120のペプチドセグメント
と抗原的に関連のある特定のペプチドセグメントに反応
性を示す抗体を産生するか否かを決定するために、診断
的検定法としての用途がある。こういった診断的決定法
であれば、サンドイッチ法またはタンデム検定法など数
種の既知タイプの手法があり得る。
抗イディオタイプ抗体を調製するためにも用いられる。
これには、無症候性のHIV−1感染者またはAIDSもしく
はARC患者が、HIV−1株のgp120のペプチドセグメント
と抗原的に関連のある特定のペプチドセグメントに反応
性を示す抗体を産生するか否かを決定するために、診断
的検定法としての用途がある。こういった診断的決定法
であれば、サンドイッチ法またはタンデム検定法など数
種の既知タイプの手法があり得る。
その抗イディオタイプ抗体は、モノクローナル抗体、そ
の他のCD4結合領域に反応性を示す薬剤を単離するため
の薬剤スクリーニング法にも使用可能なので、治療面で
極めて有用である。
の他のCD4結合領域に反応性を示す薬剤を単離するため
の薬剤スクリーニング法にも使用可能なので、治療面で
極めて有用である。
この発明の中和抗体は、アミノ酸配列IINMWQKVGKAMYPを
有するgp120のCD4結合領域に位置するエピトープを認識
する。このペプチドは、gp120の#423残基から#437残
基を示す。アミノ酸残基#422〜432を含み、文献[Lask
y et al.,Cell,50:975−985(1987)]においてもモノ
クローナル抗体5C2E5とかつて同定された、11個のアミ
ノ酸のペプチドは、この発明のモノクローナル抗体とは
反応しなかった。
有するgp120のCD4結合領域に位置するエピトープを認識
する。このペプチドは、gp120の#423残基から#437残
基を示す。アミノ酸残基#422〜432を含み、文献[Lask
y et al.,Cell,50:975−985(1987)]においてもモノ
クローナル抗体5C2E5とかつて同定された、11個のアミ
ノ酸のペプチドは、この発明のモノクローナル抗体とは
反応しなかった。
この発明のモノクローナル抗体を免疫応答により誘起で
きるペプチドは、互いに結合させて、より大きな多価の
オリゴペプチドが形成可能である。このペプチドを化学
合成によって製造することもできる。または、これらペ
プチドは、これらをコードするDNA配列が合成される
か、HIV−1DNAから単離されて適当な発現系で実現され
るような組換えDNA技術によって製造することもでき
る。
きるペプチドは、互いに結合させて、より大きな多価の
オリゴペプチドが形成可能である。このペプチドを化学
合成によって製造することもできる。または、これらペ
プチドは、これらをコードするDNA配列が合成される
か、HIV−1DNAから単離されて適当な発現系で実現され
るような組換えDNA技術によって製造することもでき
る。
これらペプチドは、HIV−1に対する免疫応答を引き起
こすために、個々に、または組み合わせて使用すること
することもできる。この目的で、一般に宿主1kgあたり
1μgないし20mgの範囲の濃度で投与するためのワクチ
ン組成物にペプチドを調製することもできる。水、生理
食塩水またはリン酸緩衝液(PBS)といった生理学的に
許容性のある担体を、配合物中で使用することが可能で
ある。水酸化アルミニウムゲルなどのアジュバントも使
用することができる。投与経路は、筋肉内、腹腔内、ま
たは静脈内とすることができる。それら組成物は、通常
1ないし4週間間隔で必要な回数だけ何回も投与するこ
とができる。
こすために、個々に、または組み合わせて使用すること
することもできる。この目的で、一般に宿主1kgあたり
1μgないし20mgの範囲の濃度で投与するためのワクチ
ン組成物にペプチドを調製することもできる。水、生理
食塩水またはリン酸緩衝液(PBS)といった生理学的に
許容性のある担体を、配合物中で使用することが可能で
ある。水酸化アルミニウムゲルなどのアジュバントも使
用することができる。投与経路は、筋肉内、腹腔内、ま
たは静脈内とすることができる。それら組成物は、通常
1ないし4週間間隔で必要な回数だけ何回も投与するこ
とができる。
この発明を、以下の実施例によって詳述する。
実施例1 gp120のCD4係合領域に対して反応性を示すモ
ノクローナル抗体の生産および試験 A.材料および方法 1.抗体生産およびスクリーニング HTLV−III Bのエンヴェローブ糖タンパクであるgp120
を、H9/HTLV−III B細胞抽出物から調製した。H9/HTLV
−III B細胞を、10mM Tris−HCl(pH7.5)、120mM Na
Cl、1mM MnCl2、0.5%Triton X−100および0.1mM フッ化フェニルメチルスルホニルからなる溶解緩衝液で
溶解した。抽出物を、56℃で1時間、熱で不活化し、レ
ンチルセファロース(シグマ社、ミズリー州セントルイ
ス)と反応させた。結合分画を溶出させ、gp120に対す
るマウスのモノクローナル抗体が結合したアフィゲル−
10(BAT123)とともにインキュベーションした。文献
[Fung al.,Biotechnology,5:940−946(1987)]参
照。ウイルスのgp120分画を溶出させ、免疫原として使
用した。5匹のBALB/cマウスをフロインド完全アジュバ
ンド中のタンパク25μgで免疫し、1カ月間隔をおいて
同じアジュバント中にタンパク25μgでさらに3回免疫
した。この最終の追加免疫化の3日後、マウスを解剖し
て脾臓細胞を分離し、Fungら(上掲)の記載通りにSP2/
0骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリッドを、増殖培地
に0.1mM ヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリンおよ
び16μMチミジンを補充することによって選択した。2
週間後、上清をマイクロタイタープレートの穴から回収
した。10日後、各穴には約10個のハイブリッドコロニー
が存在していた。コーチング抗原としてペプチドT35Sお
よびgp120を用いたELISAによる連続的スクリーニングで
は、約140,000個のハイブリドーマが存在すると推定さ
れた。ペプチドT35Sは、Laskyら(上掲)が記載する通
りのCD4結合領域を含む合成ペプチドである。さらに特
徴を調べるために選択されたハイブリドーマからのモノ
クローナル抗体は、マウスの腹水中で生産され、プロテ
インAアフィニティークロマトグラフィーによって精製
された。両スクリーニング法で強い陽性反応を与える合
計7つの増殖体を、限界希釈によってクローン化し、そ
の上清を、コーチング抗原としてT35Sを用いてELISAに
よってスクリーニングした。これら7つのモノクローナ
ル抗体をG3系列で命名し、それぞれG3−42、−211、−2
99、−508、−519、−536、および−537と命名した。こ
れらは、すべてIgG1のサブクラスである。
ノクローナル抗体の生産および試験 A.材料および方法 1.抗体生産およびスクリーニング HTLV−III Bのエンヴェローブ糖タンパクであるgp120
を、H9/HTLV−III B細胞抽出物から調製した。H9/HTLV
−III B細胞を、10mM Tris−HCl(pH7.5)、120mM Na
Cl、1mM MnCl2、0.5%Triton X−100および0.1mM フッ化フェニルメチルスルホニルからなる溶解緩衝液で
溶解した。抽出物を、56℃で1時間、熱で不活化し、レ
ンチルセファロース(シグマ社、ミズリー州セントルイ
ス)と反応させた。結合分画を溶出させ、gp120に対す
るマウスのモノクローナル抗体が結合したアフィゲル−
10(BAT123)とともにインキュベーションした。文献
[Fung al.,Biotechnology,5:940−946(1987)]参
照。ウイルスのgp120分画を溶出させ、免疫原として使
用した。5匹のBALB/cマウスをフロインド完全アジュバ
ンド中のタンパク25μgで免疫し、1カ月間隔をおいて
同じアジュバント中にタンパク25μgでさらに3回免疫
した。この最終の追加免疫化の3日後、マウスを解剖し
て脾臓細胞を分離し、Fungら(上掲)の記載通りにSP2/
0骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリッドを、増殖培地
に0.1mM ヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリンおよ
び16μMチミジンを補充することによって選択した。2
週間後、上清をマイクロタイタープレートの穴から回収
した。10日後、各穴には約10個のハイブリッドコロニー
が存在していた。コーチング抗原としてペプチドT35Sお
よびgp120を用いたELISAによる連続的スクリーニングで
は、約140,000個のハイブリドーマが存在すると推定さ
れた。ペプチドT35Sは、Laskyら(上掲)が記載する通
りのCD4結合領域を含む合成ペプチドである。さらに特
徴を調べるために選択されたハイブリドーマからのモノ
クローナル抗体は、マウスの腹水中で生産され、プロテ
インAアフィニティークロマトグラフィーによって精製
された。両スクリーニング法で強い陽性反応を与える合
計7つの増殖体を、限界希釈によってクローン化し、そ
の上清を、コーチング抗原としてT35Sを用いてELISAに
よってスクリーニングした。これら7つのモノクローナ
ル抗体をG3系列で命名し、それぞれG3−42、−211、−2
99、−508、−519、−536、および−537と命名した。こ
れらは、すべてIgG1のサブクラスである。
次いで、上記と同じ免疫化を別の2匹のマウスに実施し
た。これらを解剖した後、上記と同一の融合法を実施し
た。ハイブリッドの選別も上記のとおりに行ったが、60
枚の96穴プレートを使用した。1穴あたり約10個のクロ
ーンが存在し、ハイブリドーマのコロニー約60,000個を
産生していた。ペプチドgp120を用いたELISAによって連
続的にスクリーニングを行ったところ、635個の穴が陽
性を示した(ELISA上での光学密度>0.25で示す)。こ
れらのハイブリドーマを選別し、上記のとおりに増殖さ
せたところ、そのスクリーニングで強い陽性を示す4つ
のハイブリドーマを、限界希釈でクローン化した。そし
て、上清は、コーチング剤としてgp120を用いたELISAに
よってスクリーニングした。この4つのモノクローナル
抗体はすべてIg G1サブクラスであって、G45シリーズで
命名し、それぞれG45−60、G45−16、G45−70、およびG
45−89と命名した。
た。これらを解剖した後、上記と同一の融合法を実施し
た。ハイブリッドの選別も上記のとおりに行ったが、60
枚の96穴プレートを使用した。1穴あたり約10個のクロ
ーンが存在し、ハイブリドーマのコロニー約60,000個を
産生していた。ペプチドgp120を用いたELISAによって連
続的にスクリーニングを行ったところ、635個の穴が陽
性を示した(ELISA上での光学密度>0.25で示す)。こ
れらのハイブリドーマを選別し、上記のとおりに増殖さ
せたところ、そのスクリーニングで強い陽性を示す4つ
のハイブリドーマを、限界希釈でクローン化した。そし
て、上清は、コーチング剤としてgp120を用いたELISAに
よってスクリーニングした。この4つのモノクローナル
抗体はすべてIg G1サブクラスであって、G45シリーズで
命名し、それぞれG45−60、G45−16、G45−70、およびG
45−89と命名した。
2.さまざまなHIV−1の単離物を用いた反応性に関する
モノクローナル抗体の性質決定 G3系列のモノクローナル抗体を、その他のHIV−1単離
物との反応性に関して試験した。HTLV−III B、HTLV−I
II RF、HTLV−III MN、HTLV−III AL、HTLV−III WMJ、
HTLV−III Z34およびHTLV−III Z84で断続的に感染させ
たH9細胞を、10%熟不活化ウシ胎児血清、100U/mlペニ
シリンおよび100μg/mlストレプトマイシを添加したRPM
I−1640培地中で維持した。高レベルの逆転写酵素活性
を含むHTLV−III B、HTLV−III RFおよびHTLV−III AL
で感染させたH9細胞からの無細胞培養上清の一部を凍結
させ、下記のとおりに中和試験で使用した。
モノクローナル抗体の性質決定 G3系列のモノクローナル抗体を、その他のHIV−1単離
物との反応性に関して試験した。HTLV−III B、HTLV−I
II RF、HTLV−III MN、HTLV−III AL、HTLV−III WMJ、
HTLV−III Z34およびHTLV−III Z84で断続的に感染させ
たH9細胞を、10%熟不活化ウシ胎児血清、100U/mlペニ
シリンおよび100μg/mlストレプトマイシを添加したRPM
I−1640培地中で維持した。高レベルの逆転写酵素活性
を含むHTLV−III B、HTLV−III RFおよびHTLV−III AL
で感染させたH9細胞からの無細胞培養上清の一部を凍結
させ、下記のとおりに中和試験で使用した。
3.免疫蛍光染色 HIV−1感染H9細胞の免疫蛍光染色法は、Fungら(上
掲)によって記載された。5×106細胞/mlのH9細胞の一
部55μlを、1.5mlの微小遠心管に添加した。プロテイ
ンAで精製したモノクローナル抗体(5μg/ml)55μl
を添加し、室温で30分間インキュベーションした。次い
で、これらの遠心管を300×gで5分間遠心し、上清を
除いて、細胞を2%ウシ胎児血清および0.1%アジ化ナ
トリウムを含むRPMI−1640倍地で洗浄した。これらの遠
心管に水を加え、細胞をほぐした。リン酸緩衝液(PB
S)により1:200で希釈した、フルオロセインイソチオシ
アネート(FITC)複合抗マウスIg Gやぎ抗体(タゴ社、
カリフォルニア州ブーリンゲーム)10μlを添加し、室
温で30分間インキュベーションした。細胞を洗浄した
後、PBSに浮遊させ、この液をスライドガラス上にの
せ、カバーガラスで覆って、蛍光顕微鏡で調べた。対照
は、非感染のH9細胞および特異性のない抗体であった。
掲)によって記載された。5×106細胞/mlのH9細胞の一
部55μlを、1.5mlの微小遠心管に添加した。プロテイ
ンAで精製したモノクローナル抗体(5μg/ml)55μl
を添加し、室温で30分間インキュベーションした。次い
で、これらの遠心管を300×gで5分間遠心し、上清を
除いて、細胞を2%ウシ胎児血清および0.1%アジ化ナ
トリウムを含むRPMI−1640倍地で洗浄した。これらの遠
心管に水を加え、細胞をほぐした。リン酸緩衝液(PB
S)により1:200で希釈した、フルオロセインイソチオシ
アネート(FITC)複合抗マウスIg Gやぎ抗体(タゴ社、
カリフォルニア州ブーリンゲーム)10μlを添加し、室
温で30分間インキュベーションした。細胞を洗浄した
後、PBSに浮遊させ、この液をスライドガラス上にの
せ、カバーガラスで覆って、蛍光顕微鏡で調べた。対照
は、非感染のH9細胞および特異性のない抗体であった。
G45シリーズのモノクローナル抗体では、同じ染色法を
使ってある腫のHIV−1単離物への結合を試験した。し
かし、細胞は、0.5%パラホルムアルデヒドで固定して
から、フローサイトメトリー法(Kim et al.,1990.J.Im
munol.144:1257)によって解析した。
使ってある腫のHIV−1単離物への結合を試験した。し
かし、細胞は、0.5%パラホルムアルデヒドで固定して
から、フローサイトメトリー法(Kim et al.,1990.J.Im
munol.144:1257)によって解析した。
4.酵素結合免疫吸着検定法(ELISA) モノクローナル抗体のスクリーニングおよびエピトープ
マッピングは、ELISAによって行なわれた。HIV−1血清
型陽性患者の血清の反応性も、ELISAによって試験し
た。血清は、65人のHIV−1血清型陽性患者から任意に
採取した。これら被検者の30人はAIDS患者であり、19人
はAIDS関連複合体をもっており、16人は無症候であっ
た。10人の血清型陰性ドナーからの血清も対照として試
験した。
マッピングは、ELISAによって行なわれた。HIV−1血清
型陽性患者の血清の反応性も、ELISAによって試験し
た。血清は、65人のHIV−1血清型陽性患者から任意に
採取した。これら被検者の30人はAIDS患者であり、19人
はAIDS関連複合体をもっており、16人は無症候であっ
た。10人の血清型陰性ドナーからの血清も対照として試
験した。
ELISAでは、イムロン(Immulon)2マイクロタイタープ
レート(ダイナテック社、バージニア州チャンチリ)
を、PBSに溶けた、合成ペプチド100μl(5μg/ml、し
かしT35Sでは0.5μg/ml)または精製gp120(0.1μg/m
l)で室温にて一晩コートした。次いで、これらを、PBS
に溶けた5%BLOTTOで室温にて1時間インキュベーショ
ンし、PBS−Tween20(0.05%)で洗浄した。次いで、培
養培地100μl、または精製マウスモノクローナル抗体1
00μl(PBS/Tween20で0.4μg/mlまで希釈)もしくは希
釈ヒト血清100μl(BLOTTO緩衝液で1:100に希釈)を添
加した。そして穴を、セイヨウワサビのパーオキシダー
ゼと結合した適切な抗マウスIg Gヤギまたは抗ヒトIg G
ヤギで室温にて1時間インキュベーションした。もう1
回の洗浄工程を行った後、結合した抗体を、基質として
の0.1%テトラメチルベンジヂンおよび0.0003%過酸化
水素との反応によって肉眼で観察できるようにした。反
応溶液の光学密度(OD)を450nmで測定した。
レート(ダイナテック社、バージニア州チャンチリ)
を、PBSに溶けた、合成ペプチド100μl(5μg/ml、し
かしT35Sでは0.5μg/ml)または精製gp120(0.1μg/m
l)で室温にて一晩コートした。次いで、これらを、PBS
に溶けた5%BLOTTOで室温にて1時間インキュベーショ
ンし、PBS−Tween20(0.05%)で洗浄した。次いで、培
養培地100μl、または精製マウスモノクローナル抗体1
00μl(PBS/Tween20で0.4μg/mlまで希釈)もしくは希
釈ヒト血清100μl(BLOTTO緩衝液で1:100に希釈)を添
加した。そして穴を、セイヨウワサビのパーオキシダー
ゼと結合した適切な抗マウスIg Gヤギまたは抗ヒトIg G
ヤギで室温にて1時間インキュベーションした。もう1
回の洗浄工程を行った後、結合した抗体を、基質として
の0.1%テトラメチルベンジヂンおよび0.0003%過酸化
水素との反応によって肉眼で観察できるようにした。反
応溶液の光学密度(OD)を450nmで測定した。
5.gp120ペプチドの生成 ペプチドT35Sを合成し、ペニシュラ・ラボラトリーズ社
(カルフォルニア州ベルモント)によってその性質を調
べた。この発明で使用された他すべてのペプチドは、マ
ニュアルに記載されたFMOC(9−フルオレニルメトキシ
カルボニル)合成プロトコールによって、デュポン社
(デラウエア州ウイルミントン)のRaMPSペプチド合成
系を使って合成した。RaMPS合成ペプチドの純度を高速
液体クロマトグラフィーによって決定し、予想された構
造を高速原子衝撃/質量分析法によって検定した。その
合成ペプチドのアミノ酸残基および配列は、表1に示す
ように、HIV−1のHXB2クローン由来であった[Myers,
G.et al.,Human Retroviruses and AIDS,Los Alamos Na
tl LAb.,Los Alamos,NM(1988)]。
(カルフォルニア州ベルモント)によってその性質を調
べた。この発明で使用された他すべてのペプチドは、マ
ニュアルに記載されたFMOC(9−フルオレニルメトキシ
カルボニル)合成プロトコールによって、デュポン社
(デラウエア州ウイルミントン)のRaMPSペプチド合成
系を使って合成した。RaMPS合成ペプチドの純度を高速
液体クロマトグラフィーによって決定し、予想された構
造を高速原子衝撃/質量分析法によって検定した。その
合成ペプチドのアミノ酸残基および配列は、表1に示す
ように、HIV−1のHXB2クローン由来であった[Myers,
G.et al.,Human Retroviruses and AIDS,Los Alamos Na
tl LAb.,Los Alamos,NM(1988)]。
6.放射線免疫沈澱検定法(RIPA) G3系列抗体の反応性を確立したRIPAプロトコールによっ
て試験した。文献[Ho,D.D.et al.,Science239:1021−1
023(1988)]参照。すなわち、H9細胞(HTLV−III B、
HTLV−III RF、HTLV−III ALおよびHTLV−III WMJで感
染)を、[35S]システインおよび[35S]メチオニン
(100μCi/ml)(ICN、カルフォルニア州イルビン)で
代謝的に標識し、RIPA溶解緩衝液(50mM Tris−HCl(pH
8.0)、150mM NaCl、1%Triton X−100、1%Naデオ
キシコレート、0.1%SDS、および1mM フッ化フェニル
メチルスルフォニル)中に浮遊した。溶解物は、マウス
のκ短鎖(κ−PAS)に対するウサギ抗血清に結合した
プロテインAセファロースで室温にて3時間前処理し
た。RIPAは、精製マウスモノクローナル抗体3μg、お
よび10%κ−PAS浮遊液0.3mlを、標識して清澄化した溶
解物200μlに添加することによって行った。これらの
試料を4℃で18時間インキュベーションし、RIPA溶解緩
衝液で洗浄した。ペレットを、電気泳動の試料緩衝液中
に懸濁し、3分間沸騰させた。タンパクをSDSポリアク
リルアミドゲル電気泳動、続いてオートラジオグラフィ
ーによって解析した。
て試験した。文献[Ho,D.D.et al.,Science239:1021−1
023(1988)]参照。すなわち、H9細胞(HTLV−III B、
HTLV−III RF、HTLV−III ALおよびHTLV−III WMJで感
染)を、[35S]システインおよび[35S]メチオニン
(100μCi/ml)(ICN、カルフォルニア州イルビン)で
代謝的に標識し、RIPA溶解緩衝液(50mM Tris−HCl(pH
8.0)、150mM NaCl、1%Triton X−100、1%Naデオ
キシコレート、0.1%SDS、および1mM フッ化フェニル
メチルスルフォニル)中に浮遊した。溶解物は、マウス
のκ短鎖(κ−PAS)に対するウサギ抗血清に結合した
プロテインAセファロースで室温にて3時間前処理し
た。RIPAは、精製マウスモノクローナル抗体3μg、お
よび10%κ−PAS浮遊液0.3mlを、標識して清澄化した溶
解物200μlに添加することによって行った。これらの
試料を4℃で18時間インキュベーションし、RIPA溶解緩
衝液で洗浄した。ペレットを、電気泳動の試料緩衝液中
に懸濁し、3分間沸騰させた。タンパクをSDSポリアク
リルアミドゲル電気泳動、続いてオートラジオグラフィ
ーによって解析した。
7.HIV−1の中和試験 2種類の異なる検定法を用いて、G3系列のモノクローナ
ル抗体でウイルスの中和試験を実施した。その決定法と
は、文献[Nara et al.,AIDS Res.Human Retroviruses,
3:283−302(1987)]に記載されたような、CEM−SS細
胞を用いたシンシチウム形成試験、および文献[Ho et
al.,(上掲)]に記載されたような、H9細胞を用いた別
の中和試験である。G45系列には、シンシチウム形成試
験のみを使用した。
ル抗体でウイルスの中和試験を実施した。その決定法と
は、文献[Nara et al.,AIDS Res.Human Retroviruses,
3:283−302(1987)]に記載されたような、CEM−SS細
胞を用いたシンシチウム形成試験、および文献[Ho et
al.,(上掲)]に記載されたような、H9細胞を用いた別
の中和試験である。G45系列には、シンシチウム形成試
験のみを使用した。
シンシチウム形成試験では、モノクローナル抗体の2倍
の逓減希釈を、10%の熱不活化ウシ胎児血清を補ったRP
MI−1640培地中で行った。各希釈抗体50μlを等量のウ
イルス(100シンシチウム形成単位、すなわちSFU)と混
合し、室温で1時間インキュベーションした。この混合
物を、DEAE−デキストラン処理CEM−SS細胞5×104を含
むポリ−L−リシン処理マイクロタイター2穴に添加
し、3〜4日インキュベーションした。形成されたシン
シチウムの数を、倒立顕微鏡を使って計数した。中和の
力価は、50%(Vn/Vo=0.5)を用いて決定した。Vnは、
試験穴中のウイルス誘導SFUの数を示し、Voは、増殖培
地のみが添加された際に対照でのウイルス誘導SFUの総
数を示す。
の逓減希釈を、10%の熱不活化ウシ胎児血清を補ったRP
MI−1640培地中で行った。各希釈抗体50μlを等量のウ
イルス(100シンシチウム形成単位、すなわちSFU)と混
合し、室温で1時間インキュベーションした。この混合
物を、DEAE−デキストラン処理CEM−SS細胞5×104を含
むポリ−L−リシン処理マイクロタイター2穴に添加
し、3〜4日インキュベーションした。形成されたシン
シチウムの数を、倒立顕微鏡を使って計数した。中和の
力価は、50%(Vn/Vo=0.5)を用いて決定した。Vnは、
試験穴中のウイルス誘導SFUの数を示し、Voは、増殖培
地のみが添加された際に対照でのウイルス誘導SFUの総
数を示す。
他の中和試験では、H9の細胞中でのHIV−1の阻害程度
が測定された。この検定法では、ウイルス接種物100μ
l(50TCID50)を異なった濃度の試験抗体100μlで37
℃にて1時間プレインキュベーションしてから、この接
種物を、15%ウシ胎児血清、10mM HEPES(N−2−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−N′−2−エタンスルホン
酸)、250U/ml ペニシリン、250μg/mlストレプトマイ
シンおよび2mM Lグレタミンを補ったRPMI−1645培地
1.5ml中に存在する0.75×106個のH9の細胞中に接種し
た。7日目に、ELISA(アボットラボラトリーズ社、イ
リノイ州N.シカゴ)によるHIV−特異的p24抗原を試験す
るために、無細胞培養の上清を回収した。
が測定された。この検定法では、ウイルス接種物100μ
l(50TCID50)を異なった濃度の試験抗体100μlで37
℃にて1時間プレインキュベーションしてから、この接
種物を、15%ウシ胎児血清、10mM HEPES(N−2−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−N′−2−エタンスルホン
酸)、250U/ml ペニシリン、250μg/mlストレプトマイ
シンおよび2mM Lグレタミンを補ったRPMI−1645培地
1.5ml中に存在する0.75×106個のH9の細胞中に接種し
た。7日目に、ELISA(アボットラボラトリーズ社、イ
リノイ州N.シカゴ)によるHIV−特異的p24抗原を試験す
るために、無細胞培養の上清を回収した。
数人の患者のHIV−1単離物にG3−519を使ったもう一つ
の中和試験を、文献[Ho,D.D.et al.,N.Engl.J.Med.198
9,321:1621]に記載されたような、別の方法によって実
施した。患者のHIV−1の単離物の50TCID50を使って、H
IV−1の血清型陰性クローンから得られた、1×106個
のPHA刺激末梢血核球(PBMC)を感染させた。さまざま
な濃度のモノクローナル抗体を、感染前に37℃で1時間
ウイルスとともにインキュベーションした。7〜10日目
では、p24検定法(以下記載)のための培養上清を回収
し、HIV−1感染をモニターした。
の中和試験を、文献[Ho,D.D.et al.,N.Engl.J.Med.198
9,321:1621]に記載されたような、別の方法によって実
施した。患者のHIV−1の単離物の50TCID50を使って、H
IV−1の血清型陰性クローンから得られた、1×106個
のPHA刺激末梢血核球(PBMC)を感染させた。さまざま
な濃度のモノクローナル抗体を、感染前に37℃で1時間
ウイルスとともにインキュベーションした。7〜10日目
では、p24検定法(以下記載)のための培養上清を回収
し、HIV−1感染をモニターした。
8.HIV−1結合阻害試験 G3系列に対して、Ho,D.D.ら(上掲)が記載するような
結合阻害試験を用いた。すなわち、HIV−1ヴィリオン
の濃縮調製物(10μl)をモノクローナル抗体(1mg/m
l)10μlで室温にて30分間前処理してから、C8166細胞
とともにインキュベーション(5×105個、37℃で30分
間)した、続いて、細胞を洗浄し、FITC(希釈率1:50)
に複合させたヒト抗HIV25ml中に浮遊させた。4℃で30
分間、細胞を洗浄し、1%パラホルムアルデヒドで固定
して、フローサイトメトリーによって解析した。
結合阻害試験を用いた。すなわち、HIV−1ヴィリオン
の濃縮調製物(10μl)をモノクローナル抗体(1mg/m
l)10μlで室温にて30分間前処理してから、C8166細胞
とともにインキュベーション(5×105個、37℃で30分
間)した、続いて、細胞を洗浄し、FITC(希釈率1:50)
に複合させたヒト抗HIV25ml中に浮遊させた。4℃で30
分間、細胞を洗浄し、1%パラホルムアルデヒドで固定
して、フローサイトメトリーによって解析した。
B.結果 1.gp120特異的モノクローナル抗体の生産および性質決
定 ここで詳述した方法で単離した7種類のG3系列モノクロ
ーナル抗体およびG45系列モノクローナル抗体は、HTLV
−III RF、−MN、−AL、−Z84および−Z34といった他の
HIV−1株に反応性を示す。これは、ウイルス感染細胞
表面を間接的に免疫蛍光染色することによって確認され
た(表2)。
定 ここで詳述した方法で単離した7種類のG3系列モノクロ
ーナル抗体およびG45系列モノクローナル抗体は、HTLV
−III RF、−MN、−AL、−Z84および−Z34といった他の
HIV−1株に反応性を示す。これは、ウイルス感染細胞
表面を間接的に免疫蛍光染色することによって確認され
た(表2)。
代謝的に標識したHTLV−III B、HTLV−III RF、HTLV−I
II ALおよびHTLV−III MJが感染したH9細胞溶解物を使
って、G3系列モノクローナル抗体を放射線免疫沈澱試験
によっても調べた。表3に総括されるように、7種類の
G3系列すべてのモノクローナル抗体は、さまざまなHIV
−1単離物のgp120とgp160の両者を特異的に沈澱させ
た。このことは、HIV−1の少なからぬ株に対するこれ
ら抗体の幅広い反応性をさらに示す。
II ALおよびHTLV−III MJが感染したH9細胞溶解物を使
って、G3系列モノクローナル抗体を放射線免疫沈澱試験
によっても調べた。表3に総括されるように、7種類の
G3系列すべてのモノクローナル抗体は、さまざまなHIV
−1単離物のgp120とgp160の両者を特異的に沈澱させ
た。このことは、HIV−1の少なからぬ株に対するこれ
ら抗体の幅広い反応性をさらに示す。
2.HTLV−III B、HTLV−III RF、HTLV−III ALおよびHTL
V−III Z84感染性の中和 シンシチウム形成試験では、複数のシンシチウムが3日
目または4日目に計数された。群特異的な中和免疫反応
がCD4結合領域に対するモノクローナル抗体の特徴か否
かを決めいために、gp120中の予想アミノ酸配列が21.4
%だけ異なるHTLV−III BおよびHTLV−III RF単離物を
使用し、同様にこれらの株とは異なることが知られてい
るHTLV−III Z84(ザイール由来)およびHTLV−III AL
(ハイチ由来)を使用した。図1に示すように、7種類
のG3系列モノクローナル抗体は、単離物HTLV−III Bお
よびHTLV−III RFに対して異なった中和活性を明らかに
示す[これらの株の中和を、図1(A)および図1
(B)にそれぞれ示す]。Vnは試験穴中のウイルス誘導
SFUの総数を、Voは抗体を用いない対照のウイルス誘導S
FUの総数を示す。HTLV−III BおよびHTLV−III RFに対
する各G3系列モノクローナル抗体のID50(50%阻害用
量、すなわち、HIV−1による標的細胞の感染が50%だ
け阻害されるモノクローナル抗体濃度)を表4に示す。
表4は、HTLV−III MNおよびHTLV−III Z84に対するG3
−519およびG45−60のシンシチウム形成阻害も示す。
V−III Z84感染性の中和 シンシチウム形成試験では、複数のシンシチウムが3日
目または4日目に計数された。群特異的な中和免疫反応
がCD4結合領域に対するモノクローナル抗体の特徴か否
かを決めいために、gp120中の予想アミノ酸配列が21.4
%だけ異なるHTLV−III BおよびHTLV−III RF単離物を
使用し、同様にこれらの株とは異なることが知られてい
るHTLV−III Z84(ザイール由来)およびHTLV−III AL
(ハイチ由来)を使用した。図1に示すように、7種類
のG3系列モノクローナル抗体は、単離物HTLV−III Bお
よびHTLV−III RFに対して異なった中和活性を明らかに
示す[これらの株の中和を、図1(A)および図1
(B)にそれぞれ示す]。Vnは試験穴中のウイルス誘導
SFUの総数を、Voは抗体を用いない対照のウイルス誘導S
FUの総数を示す。HTLV−III BおよびHTLV−III RFに対
する各G3系列モノクローナル抗体のID50(50%阻害用
量、すなわち、HIV−1による標的細胞の感染が50%だ
け阻害されるモノクローナル抗体濃度)を表4に示す。
表4は、HTLV−III MNおよびHTLV−III Z84に対するG3
−519およびG45−60のシンシチウム形成阻害も示す。
図1および表4のデータから、(シンシチウム阻害とH9
細胞感染性試験の両者によって測定されるように)G3−
299がHTLV−III Bの中和で最も強く、一方、G3−519がH
TLV−III RFの中和で最も強いことが示唆される。これ
らモノクローナル抗体の大部分は、投与HIV−1の50%
中和を達成するのに高用量(>10μg/ml)を必要とす
る。
細胞感染性試験の両者によって測定されるように)G3−
299がHTLV−III Bの中和で最も強く、一方、G3−519がH
TLV−III RFの中和で最も強いことが示唆される。これ
らモノクローナル抗体の大部分は、投与HIV−1の50%
中和を達成するのに高用量(>10μg/ml)を必要とす
る。
シンシチウム阻害だけで測定した場合、G45−60は、HTL
V−III RFおよびHTLV−III MNを中和する上でG3−519と
実質的に同等であった。しかし、G45−60は、HTLV−III
Z84を中和する際には実質的により有効であった。
V−III RFおよびHTLV−III MNを中和する上でG3−519と
実質的に同等であった。しかし、G45−60は、HTLV−III
Z84を中和する際には実質的により有効であった。
HIV−1中和に関する同様の結果が、H9細胞の感染性試
験によるG3系列のモノクローナル抗体で得られた。これ
らの結果を表4および図2に総括するが、図2Aは、HTLV
−III Bの中和を示し、図2BはHTLV−III RFの中和を示
し、図2CはHTLV−III ALの中和を示す。図2は、対照の
培養物と比較した場合、上清中のp24高原の減少を示
す。記号は図1でのものと同一である。ここでも、HTLV
−III BおよびHTLV−III RFの中和で最も強い抗体は、
それぞれG3−299およびG3−519であった。HTLV−III AL
はG3−508、G3−519、G3−42およびG3−536による中和
に特に感受性を示した。G3−508およびG3−519のID
50は、両者とも0.2μg/ml未満であった(表4)。数種
のモノクローナル抗体は、HIV−1の感染性を50%中和
するのに10μg/mlを超える濃度を要した。
験によるG3系列のモノクローナル抗体で得られた。これ
らの結果を表4および図2に総括するが、図2Aは、HTLV
−III Bの中和を示し、図2BはHTLV−III RFの中和を示
し、図2CはHTLV−III ALの中和を示す。図2は、対照の
培養物と比較した場合、上清中のp24高原の減少を示
す。記号は図1でのものと同一である。ここでも、HTLV
−III BおよびHTLV−III RFの中和で最も強い抗体は、
それぞれG3−299およびG3−519であった。HTLV−III AL
はG3−508、G3−519、G3−42およびG3−536による中和
に特に感受性を示した。G3−508およびG3−519のID
50は、両者とも0.2μg/ml未満であった(表4)。数種
のモノクローナル抗体は、HIV−1の感染性を50%中和
するのに10μg/mlを超える濃度を要した。
3.G3−519による患者のHIV−1単離物の調製および中和 G3−519を使った中和試験を、ロサンゼルス地域の8人
のAIDS患者の血漿から得られた数種のHIV−1初期単離
物に対して実施した。これらの初期HIV−1単離物を使
用して、PHA刺激血清型陰性の末梢血単核球(PBMC)を
感染させた。7日目ないし10日目に、患者のウイルス単
離物を含む培養上清を細胞培養物の遠心によって回収し
た。この培養上清は、アボット・ラボラトリーズ社製の
p24ELISAを用いて、p24濃縮物に関して測定された。
のAIDS患者の血漿から得られた数種のHIV−1初期単離
物に対して実施した。これらの初期HIV−1単離物を使
用して、PHA刺激血清型陰性の末梢血単核球(PBMC)を
感染させた。7日目ないし10日目に、患者のウイルス単
離物を含む培養上清を細胞培養物の遠心によって回収し
た。この培養上清は、アボット・ラボラトリーズ社製の
p24ELISAを用いて、p24濃縮物に関して測定された。
G3−519は、8人の患者中4人に対して中和活性(ID50
<5μg/ml)および1人の患者に対して限界中和活性
(ID≧5μg/ml)を示し、3人の患者に対して全く中和
活性を示さなかった。
<5μg/ml)および1人の患者に対して限界中和活性
(ID≧5μg/ml)を示し、3人の患者に対して全く中和
活性を示さなかった。
4.CD4結合領域におけるエピトープの構造 gp120上のCD4結合中和においてエピトープをより正確に
マッピングするために、それぞれ5個のアミノ酸同士が
重なり合う4種類のペプチド(T15W、I15P、A15Sおよび
I15D)、ならびにモノクローナル抗体のエピトープが5C
2E5(Lasky,L.A.ら、上掲)と同定された5種類目のペ
プチドQ11Kを合成した(表1)。この群のペプチドに対
するELISAを、7種類のモノクローナル抗体を用いて実
施した。これらすべてのモノクローナル抗体は、I15Pに
極めて強く結合するが(OD>1.0)、その隣接ペプチド
には結合しない(OD<0.1)(表5)。ペプチドQ11K(L
asky,L.A.ら、上掲)は、N末端のグルタミンを除いて
ペプチドI15Pに全体的にほとんど含まれる11個のアミノ
酸からなるペプチドであって、これらの実験条件下で7
種類のモノクローナル抗体のいずれとも反応性を示さな
いことは興味深い。
マッピングするために、それぞれ5個のアミノ酸同士が
重なり合う4種類のペプチド(T15W、I15P、A15Sおよび
I15D)、ならびにモノクローナル抗体のエピトープが5C
2E5(Lasky,L.A.ら、上掲)と同定された5種類目のペ
プチドQ11Kを合成した(表1)。この群のペプチドに対
するELISAを、7種類のモノクローナル抗体を用いて実
施した。これらすべてのモノクローナル抗体は、I15Pに
極めて強く結合するが(OD>1.0)、その隣接ペプチド
には結合しない(OD<0.1)(表5)。ペプチドQ11K(L
asky,L.A.ら、上掲)は、N末端のグルタミンを除いて
ペプチドI15Pに全体的にほとんど含まれる11個のアミノ
酸からなるペプチドであって、これらの実験条件下で7
種類のモノクローナル抗体のいずれとも反応性を示さな
いことは興味深い。
5.CD4+細胞に結合するHIV−1の阻害 図3に示されるように、gp120のアミノ酸423−437に対
するG3系列モノクローナル抗体は、CD4+C8166細胞に対
するHTLV−III B(開放カラム)またはHTLV−III RF
(充填カラム)の結合を有意に阻害する。これらのモノ
クローナル抗体は、図3で以下のように示される。G3−
519(4)、G3−508(5)、G3−42(6)、G3−211
(7)、G3−299(8)、G3−536(9)、G3−537(1
0)。その他の試薬は、AIDS血清(1)、健常者血清
(2)、およびBAT−123(3)である。上記のように、
HIV−1を中和する能力の実質的な差異にかかわらず、C
D4+C8166細胞に対するHIV−1の特異的な結合におい
て、これらモノクローナル抗体の阻害活性は同程度であ
った。対照的に、BAT−123は、gp120の中心部の超可変
ループ(アミノ酸残基300〜330、Fnugら、上掲)に特異
的なマウスのモノクローナル抗体であって、標的細胞に
対するHIV−1の結合に影響を及ぼさなかった。
するG3系列モノクローナル抗体は、CD4+C8166細胞に対
するHTLV−III B(開放カラム)またはHTLV−III RF
(充填カラム)の結合を有意に阻害する。これらのモノ
クローナル抗体は、図3で以下のように示される。G3−
519(4)、G3−508(5)、G3−42(6)、G3−211
(7)、G3−299(8)、G3−536(9)、G3−537(1
0)。その他の試薬は、AIDS血清(1)、健常者血清
(2)、およびBAT−123(3)である。上記のように、
HIV−1を中和する能力の実質的な差異にかかわらず、C
D4+C8166細胞に対するHIV−1の特異的な結合におい
て、これらモノクローナル抗体の阻害活性は同程度であ
った。対照的に、BAT−123は、gp120の中心部の超可変
ループ(アミノ酸残基300〜330、Fnugら、上掲)に特異
的なマウスのモノクローナル抗体であって、標的細胞に
対するHIV−1の結合に影響を及ぼさなかった。
6.CD4結合領域ペプチドT35Sを有する、HIV−1感染者か
らの血清の反応性 AIDS患者(N=30)またはARC患者(N=16)、無症候
性のHIV−1血清型陽性者、および健常者ドナー(N=1
0)からの血清試料は、ELISAによってペプチドT35Sとの
反応性に関して解析した。各血清試料に対して、ペプチ
ドでコートした2穴とPBSで処理した2穴の平均吸光度
の差としてOD値を計算した。カットオフのOD値(0.07
5)は、10個の血清型陰性の血清試料に対して、平均OD
値+2SDを示す。ELISAの結果(第4)は、AIDSまたはAR
C患者からの血清によって示された免疫反応性が、健常
者の対照試料のものと有意差がないことを表す。試験し
た30人のAIDS患者および19人のARC患者の間では、ペプ
チドT35Sに対する検出可能な抗体は見いだされなかっ
た。無症候性血清型陽性者16人中2人からの血清試料だ
けが、上記のカットオフ値を有意に越えるシグナルを示
す。実施例2 PAP−Sおよびモノクローナル抗体の免
疫複合体 免疫複合体は、HIV−1のgp120のCD4結合領域を認識す
るマウスのさまざまなモノクローナル抗体をジスルフィ
ド結合を介してPAP−Sに化学的に結合させることによ
って調製可能である。これら免疫複合体は、G3−519−P
AP−Sで例示されるように、HIV−1のさまざまな株に
感染したヒトT細胞に対する特異的な細胞毒性を示す場
合がある。合成ペプチドを使った、上記のエピトープマ
ッピング試験によれば、モノクローナル抗体G3−519はg
p120の相対的に保存された領域(アミノ酸数423〜433)
を認識することが分かった。
らの血清の反応性 AIDS患者(N=30)またはARC患者(N=16)、無症候
性のHIV−1血清型陽性者、および健常者ドナー(N=1
0)からの血清試料は、ELISAによってペプチドT35Sとの
反応性に関して解析した。各血清試料に対して、ペプチ
ドでコートした2穴とPBSで処理した2穴の平均吸光度
の差としてOD値を計算した。カットオフのOD値(0.07
5)は、10個の血清型陰性の血清試料に対して、平均OD
値+2SDを示す。ELISAの結果(第4)は、AIDSまたはAR
C患者からの血清によって示された免疫反応性が、健常
者の対照試料のものと有意差がないことを表す。試験し
た30人のAIDS患者および19人のARC患者の間では、ペプ
チドT35Sに対する検出可能な抗体は見いだされなかっ
た。無症候性血清型陽性者16人中2人からの血清試料だ
けが、上記のカットオフ値を有意に越えるシグナルを示
す。実施例2 PAP−Sおよびモノクローナル抗体の免
疫複合体 免疫複合体は、HIV−1のgp120のCD4結合領域を認識す
るマウスのさまざまなモノクローナル抗体をジスルフィ
ド結合を介してPAP−Sに化学的に結合させることによ
って調製可能である。これら免疫複合体は、G3−519−P
AP−Sで例示されるように、HIV−1のさまざまな株に
感染したヒトT細胞に対する特異的な細胞毒性を示す場
合がある。合成ペプチドを使った、上記のエピトープマ
ッピング試験によれば、モノクローナル抗体G3−519はg
p120の相対的に保存された領域(アミノ酸数423〜433)
を認識することが分かった。
この実施例では、アメリカヤマゴボウの抗ウイルスタン
パクおよびgp120のCD4結合領域上のエピトープに対して
反応するモノクローナル抗体の調製法および有効性を説
明する。
パクおよびgp120のCD4結合領域上のエピトープに対して
反応するモノクローナル抗体の調製法および有効性を説
明する。
A.材料および方法 1.PAP−Sの精製 バルビエリら[Barbieri L.et al.,(1982)Biochem.J.
203:55−59]の方法を用いてフィトラッカ・アメリカナ
(Phytolacca anmericana)(アメリカヤマゴボウ)の
種子から、PAP−Sを精製した。すなわち、アメリカヤ
マゴボウの種子(100g)を5mMのリン酸緩衝液(pH6.0)
500ml中でホモジネーションした。10,000×gで1時間
遠心した後、不溶性物質および脂質を除去した。上清
を、5mMリン酸緩衝液で平衡化した、CMセファロース・
ファースト・フロー(ファルマシア社、ニュージャージ
ー州ピスカタウエイ)カラムにかけた。洗浄した後、結
合タンパクをNaCl勾配(0〜0.3M)で溶出した。リボソ
ーム不活化活性を含むピークをプールし、分子量カット
オフ値10,000ダルトンの膜を用いてPBSに対して透析し
た。
203:55−59]の方法を用いてフィトラッカ・アメリカナ
(Phytolacca anmericana)(アメリカヤマゴボウ)の
種子から、PAP−Sを精製した。すなわち、アメリカヤ
マゴボウの種子(100g)を5mMのリン酸緩衝液(pH6.0)
500ml中でホモジネーションした。10,000×gで1時間
遠心した後、不溶性物質および脂質を除去した。上清
を、5mMリン酸緩衝液で平衡化した、CMセファロース・
ファースト・フロー(ファルマシア社、ニュージャージ
ー州ピスカタウエイ)カラムにかけた。洗浄した後、結
合タンパクをNaCl勾配(0〜0.3M)で溶出した。リボソ
ーム不活化活性を含むピークをプールし、分子量カット
オフ値10,000ダルトンの膜を用いてPBSに対して透析し
た。
2.抗体および毒素複合体 カールソンら[Carlson J.et al.,(1978),Biochem.J.
173:723−737]が記載する通りに、G3−519とヘテロ二
機能性架橋剤のN−スクシンイミジル−3−(2−ピリ
ジルジチオ)プロピオネート(ファルマシア社)とをモ
ル比1:3で反応させた。文献[Lambert,R.et al.,(197
8),Biochemistry,17:406−416]の記載通りに、アメリ
カヤマゴボウの抗ウイルスタンパク(6mg)と2−イミ
ノチオランとをモル比1:3で反応させた。10PDカラム
(バイオ・ラド社、カリフォルニア州リッチモンド)を
用いたゲル濾過によって、過剰の薬剤を除去した。化学
的に修飾された抗体およびPAP−Sを一緒にして、室温
で2時間または4℃で一晩インキュベーションした。非
結合のPAP−Sを、PBSで平衡化したセファクリルS−20
0(HR)カラム上でのゲル濾過によって除去した。抗体
および複合体を含むピークをプールして、10mlまで濃縮
してから、5mMリン酸緩衝液(pH6.0)に対して透析し
た。透析試料をモノS(ファルマシア社)カラムにかけ
て、NaCl勾配をかけて免疫複合体をカラムから溶出させ
た。その免疫複合体の組成は、非還元条件下(ファース
トシステム、ファルマシア社)で分子量マーカー(バイ
オラド社)とともに7.5%ドデシル硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって解
析した。
173:723−737]が記載する通りに、G3−519とヘテロ二
機能性架橋剤のN−スクシンイミジル−3−(2−ピリ
ジルジチオ)プロピオネート(ファルマシア社)とをモ
ル比1:3で反応させた。文献[Lambert,R.et al.,(197
8),Biochemistry,17:406−416]の記載通りに、アメリ
カヤマゴボウの抗ウイルスタンパク(6mg)と2−イミ
ノチオランとをモル比1:3で反応させた。10PDカラム
(バイオ・ラド社、カリフォルニア州リッチモンド)を
用いたゲル濾過によって、過剰の薬剤を除去した。化学
的に修飾された抗体およびPAP−Sを一緒にして、室温
で2時間または4℃で一晩インキュベーションした。非
結合のPAP−Sを、PBSで平衡化したセファクリルS−20
0(HR)カラム上でのゲル濾過によって除去した。抗体
および複合体を含むピークをプールして、10mlまで濃縮
してから、5mMリン酸緩衝液(pH6.0)に対して透析し
た。透析試料をモノS(ファルマシア社)カラムにかけ
て、NaCl勾配をかけて免疫複合体をカラムから溶出させ
た。その免疫複合体の組成は、非還元条件下(ファース
トシステム、ファルマシア社)で分子量マーカー(バイ
オラド社)とともに7.5%ドデシル硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって解
析した。
3.免疫複合体の細胞毒性試験 G3−519免疫複合体のHIV感染細胞殺傷能を、感染細胞の
[3H]−チミジン取込みの阻害によって測定した。非感
染か、またはHIV−1株(HTLV−III B、HTLV−III RF、
およびHTLV−III MN)による慢性感染のH9細胞を、15%
熱不活化ウシ胎児血清、100U/mlペニシリンおよび100μ
g/mlストレプトマイシンを補ったRPMI−1640培地中にて
対数増殖期に維持した。100および80μlの5×104細胞
/mlを96穴マイクロタイマープレートの各穴に分注し
た。5段階に逓減希釈(100μg/ml〜160ng/ml)した精
製免疫複合体20μlを3つ組みで穴に添加した。対照
は、同一条件下で同等濃度の無関係なPAP−S免疫複合
体または非複合体抗体とPAP−Sとの混合物とした。細
胞培養物を37℃で24時間保存し、さらに4時間1穴あた
り1μCiの[3H]−チミジンでパルスした。スカトロン
(Skatron)細胞収穫器を使って細胞をガラスフィルタ
ー上に収穫し、乾燥濾紙上に保持された[3H]−チミジ
ンをシンチレーション計測によって測定した。細胞によ
るチミジンの取込みの阻害は、対照試料の試験培養物の
放射活性と比較することによって計算した。
[3H]−チミジン取込みの阻害によって測定した。非感
染か、またはHIV−1株(HTLV−III B、HTLV−III RF、
およびHTLV−III MN)による慢性感染のH9細胞を、15%
熱不活化ウシ胎児血清、100U/mlペニシリンおよび100μ
g/mlストレプトマイシンを補ったRPMI−1640培地中にて
対数増殖期に維持した。100および80μlの5×104細胞
/mlを96穴マイクロタイマープレートの各穴に分注し
た。5段階に逓減希釈(100μg/ml〜160ng/ml)した精
製免疫複合体20μlを3つ組みで穴に添加した。対照
は、同一条件下で同等濃度の無関係なPAP−S免疫複合
体または非複合体抗体とPAP−Sとの混合物とした。細
胞培養物を37℃で24時間保存し、さらに4時間1穴あた
り1μCiの[3H]−チミジンでパルスした。スカトロン
(Skatron)細胞収穫器を使って細胞をガラスフィルタ
ー上に収穫し、乾燥濾紙上に保持された[3H]−チミジ
ンをシンチレーション計測によって測定した。細胞によ
るチミジンの取込みの阻害は、対照試料の試験培養物の
放射活性と比較することによって計算した。
上記の免疫複合体による細胞の特異的な殺傷を調べるた
めに、その複合体と拮抗する非複合モノクローナル抗体
を使った試験を行った。チミジンの取込みを55%阻害す
る0.6μg/mlのG3−519−PAP−Sがこの試験に選ばれ
た。G3−519−PAP−Sを添加する前に、感染したH9細胞
を37℃で30分間非複合モノクローナル抗体とインキュベ
ーションした。
めに、その複合体と拮抗する非複合モノクローナル抗体
を使った試験を行った。チミジンの取込みを55%阻害す
る0.6μg/mlのG3−519−PAP−Sがこの試験に選ばれ
た。G3−519−PAP−Sを添加する前に、感染したH9細胞
を37℃で30分間非複合モノクローナル抗体とインキュベ
ーションした。
B.結果 1.G3−519免疫複合体の精製および性質決定 G3−519免疫複合体を、110mM NaCl濃度のところの単一
ピークとして、モノSカラムから溶出させた。しかし、
このピークは、非還元条件下での7.5%SDS−PAGEによっ
て解析されたので、2つのタンパクバンドに分割した、
すなわち、それらは、抗体1分子あたりPAP−S2分子を
含む複合体を表す高分子量のバンドと、1抗体分子あた
りPAP−S1分子の複合体を表す低分子量のバンドであ
る。クマシブルー染色したゲルのデンシトメターによる
解析では、高分子量の複合体が総免疫複合体の約25%を
占めることが示された。G3−519の総合エピトープを含
む合成オリゴSDS−PAGEを使ったELISAによって測定され
た免疫複合体の結合活性によれば、複合の後に抗体の結
合活性の障害は生じないことが分かった。
ピークとして、モノSカラムから溶出させた。しかし、
このピークは、非還元条件下での7.5%SDS−PAGEによっ
て解析されたので、2つのタンパクバンドに分割した、
すなわち、それらは、抗体1分子あたりPAP−S2分子を
含む複合体を表す高分子量のバンドと、1抗体分子あた
りPAP−S1分子の複合体を表す低分子量のバンドであ
る。クマシブルー染色したゲルのデンシトメターによる
解析では、高分子量の複合体が総免疫複合体の約25%を
占めることが示された。G3−519の総合エピトープを含
む合成オリゴSDS−PAGEを使ったELISAによって測定され
た免疫複合体の結合活性によれば、複合の後に抗体の結
合活性の障害は生じないことが分かった。
2.G3−519−PAP−SのHIV−1感染細胞に対する細胞毒
性 HIV−1の3種類の異なった株で別個に感染させたH9細
胞はすべて、G3−519−PAP−S処理に感受性を示した
(図5)。記号は以下のとおりである。非感染H9細胞
(黒塗り三角)、HTLV−III B感染H9細胞(白抜き
丸)、HTLV−III MN(白抜き三角)、およびHTLV−III
RF感染H9細胞(白抜き四角形)。この免疫複合体は、HT
LV−III Bで感染させたH9細胞(IC50=1.4×10-9M)よ
り、HTLV−III MNで感染させたH9細胞(IC50=1.7×10
-9M)をより効果的に殺傷した、G3−519−PAP−Sは、
5.3×10-8Mまで非感染H9細胞に細胞毒性を示さなかっ
た。
性 HIV−1の3種類の異なった株で別個に感染させたH9細
胞はすべて、G3−519−PAP−S処理に感受性を示した
(図5)。記号は以下のとおりである。非感染H9細胞
(黒塗り三角)、HTLV−III B感染H9細胞(白抜き
丸)、HTLV−III MN(白抜き三角)、およびHTLV−III
RF感染H9細胞(白抜き四角形)。この免疫複合体は、HT
LV−III Bで感染させたH9細胞(IC50=1.4×10-9M)よ
り、HTLV−III MNで感染させたH9細胞(IC50=1.7×10
-9M)をより効果的に殺傷した、G3−519−PAP−Sは、
5.3×10-8Mまで非感染H9細胞に細胞毒性を示さなかっ
た。
3.免疫複合体の特異的細胞毒性 標的細胞に対するG3−519免疫複合体の特異性を、抗体
阻害試験によって調べた。図6に示すように、この免疫
複合体と標的細胞をインキュベーションする前に、非複
合G3−519(白抜きバー)を添加したところ、この添加
によって、その免疫複合体と結合する細胞が拮抗し、用
量異存様式で免疫複合体の細胞毒性が効果的に阻害され
た。X軸の数値は、非複合抗体濃度(μg/ml)を示す。
阻害試験によって調べた。図6に示すように、この免疫
複合体と標的細胞をインキュベーションする前に、非複
合G3−519(白抜きバー)を添加したところ、この添加
によって、その免疫複合体と結合する細胞が拮抗し、用
量異存様式で免疫複合体の細胞毒性が効果的に阻害され
た。X軸の数値は、非複合抗体濃度(μg/ml)を示す。
上記のように、0.6μg/mlのG3−519−PAP−Sは、HTLV
−III Bで感染させたH9細胞のチミジン取り込み量を55
%阻害した。50倍過剰量のモノクローナル抗体G3−519
の存在下では、その免疫複合体はチミジンの取り込み量
を13%阻害した。hCG(斜線バー)に無関係のモノクロ
ーナル抗体は、200倍過剰量のこの抗体を添加しても免
疫複合体の細胞毒性を阻害しなかった。
−III Bで感染させたH9細胞のチミジン取り込み量を55
%阻害した。50倍過剰量のモノクローナル抗体G3−519
の存在下では、その免疫複合体はチミジンの取り込み量
を13%阻害した。hCG(斜線バー)に無関係のモノクロ
ーナル抗体は、200倍過剰量のこの抗体を添加しても免
疫複合体の細胞毒性を阻害しなかった。
これらの結果は、G3−519−PAP−Sが、HTLV−IIIの3
種類の異なった株で感染させたH9細胞を特異的に殺傷す
るので、さまざまな株に対して有効であることを示す。
CD4に対する他の抗体複合体も、さまざまなHIV−1株で
感染させた細胞を殺傷する上で有効なはずである。同等
物 当該分野の技術者には、単なるルーチーンの実験法を用
いて、ここに記載したこの発明の特異的な実験態様およ
び実施例に相当する多くの例を、認識するか、確証し得
るであろう。一連の同等物は、以下の請求の範囲に含ま
れる。
種類の異なった株で感染させたH9細胞を特異的に殺傷す
るので、さまざまな株に対して有効であることを示す。
CD4に対する他の抗体複合体も、さまざまなHIV−1株で
感染させた細胞を殺傷する上で有効なはずである。同等
物 当該分野の技術者には、単なるルーチーンの実験法を用
いて、ここに記載したこの発明の特異的な実験態様およ
び実施例に相当する多くの例を、認識するか、確証し得
るであろう。一連の同等物は、以下の請求の範囲に含ま
れる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 A61K 39/395 M C12N 5/10 // C12N 15/02 C12P 21/08 9161−4B G01N 33/569 H 33/577 B (C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 チャン ナンシー ティー. アメリカ合衆国 テキサス州 77005 ヒ ューストン ロビンフッド 3323 (72)発明者 チャン ツェ―ウェン アメリカ合衆国 テキサス州 77008 ヒ ューストン ロビンフッド 3323 (56)参考文献 国際公開87−7616(WO,A) 欧州特許出願公開279688(EP,A) Cell,50[6](1987)P.975− 985
Claims (5)
- 【請求項1】HIV−1のgp120のCD4結合領域中のアミノ
酸配列IINMWQKVGKAMYAPに結合し、HIV−Iの異なる複数
の株によるT細胞の感染を抑制するモノクローナル抗
体。 - 【請求項2】マウス起源の抗体である、請求項1記載の
モノクローナル抗体。 - 【請求項3】Ig Gイソタイプの抗体である、請求項2記
載のモノクローナル抗体。 - 【請求項4】細胞障害剤、抗ウイルス剤、または血液−
脳関門の通過を容易にする薬剤と結合した請求項1ない
し3のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む免疫
複合体。 - 【請求項5】抗体生産細胞と骨髄種細胞とを融合するこ
とにより得られ、請求項1記載のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ。
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ES (1) | ES2097759T3 (ja) |
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CA2070182C (en) * | 1989-12-27 | 2002-12-24 | John Ghrayeb | Chimeric immunoglobulin for cd4 receptors |
WO1991012021A2 (en) * | 1990-02-13 | 1991-08-22 | Oxford Virology Plc | Therapeutic agents, and intermediates for the synthesis thereof |
AP237A (en) * | 1990-05-29 | 1993-04-29 | Cedars Sinai Medical Center | Immunoreagents reactive with a conserved epitope of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) gp120 and methods of use. |
JPH05262662A (ja) * | 1991-07-15 | 1993-10-12 | Calpis Food Ind Co Ltd:The | Hiv重感染防止剤、抗イディオタイプ抗体作製用抗原及び抗イディオタイプ抗体の製造法 |
US5558865A (en) * | 1991-08-22 | 1996-09-24 | Nissin Shokuhin Kabushiki Kaisha | HIV immunotherapeutics |
EP0629244B1 (en) * | 1992-03-06 | 1996-09-18 | Creagen, Inc. | Pathogen-targeted biocatalyst |
GB9217124D0 (en) * | 1992-08-13 | 1992-09-23 | Antisoma Ltd | Medical treatment |
ATE177843T1 (de) * | 1994-01-19 | 1999-04-15 | Us Health | Peptomere mit erhöhter immunogenizität |
US5618922A (en) * | 1994-07-25 | 1997-04-08 | Nissin Shokuhin Kabushiki Kaisha | NM03 antibody materials and methods |
US5843882A (en) | 1995-04-27 | 1998-12-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Antiviral proteins and peptides |
US6987096B1 (en) | 1995-04-27 | 2006-01-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Antiviral proteins and peptides, DNA coding sequences therefor, and uses thereof |
US6428790B1 (en) | 1995-04-27 | 2002-08-06 | The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services | Cyanovirin conjugates and matrix-anchored cyanovirin and related compositions and methods of use |
US7048935B2 (en) | 1995-04-27 | 2006-05-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Cyanovirin conjugates and matrix-anchored cyanovirin and related compositions and methods of use |
US6780847B2 (en) | 1995-04-27 | 2004-08-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Glycosylation-resistant cyanovirins and related conjugates, compositions, nucleic acids, vectors, host cells, methods of production and methods of using nonglycosylated cyanovirins |
US6193982B1 (en) | 1995-04-27 | 2001-02-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Anti-cyanovirin antibody with an internal image of gp120, a method of use thereof, and a method of using a cyanovirin to induce an immune response to gp120 |
JP2933159B2 (ja) * | 1996-03-18 | 1999-08-09 | 株式会社椿本チエイン | 直線作動機のリミットスイッチ取付構造 |
JP4307841B2 (ja) | 2001-03-22 | 2009-08-05 | アメリカ合衆国 | グリコシル化抵抗性シアノビリン及び関連コンジュゲート、組成物、核酸、ベクター、宿主細胞、非グリコシル化シアノビリンの製造方法及び使用方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0279688A2 (en) * | 1987-02-20 | 1988-08-24 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for the use of HIV env polypeptides and antibodies thereto |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU617088B2 (en) * | 1986-06-12 | 1991-11-21 | Biogen, Inc. | Peptides involved in the pathogenesis of hiv infection |
DE3853779T2 (de) * | 1987-05-29 | 1995-09-07 | Baylor College Medicine | Hiv-1 neutralisierende monoklonale antikörper. |
EP0339504A3 (en) * | 1988-04-26 | 1990-09-12 | The Du Pont Merck Pharmaceutical Company | Human immunodeficiency virus (hiv) env-coded peptide capable of eliciting hiv-inhibiting antibodies in mammals |
CA2066607A1 (en) * | 1989-09-22 | 1991-03-23 | Thomas Kieber-Emmons | Peptides associated with the cd4 binding region of gp120 and their methods of use |
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1990
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- 1990-04-25 WO PCT/US1990/002261 patent/WO1990012868A1/en active IP Right Grant
- 1990-04-25 JP JP2507112A patent/JPH0768276B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-04-25 DE DE69029937T patent/DE69029937T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-04-25 DK DK90907850.3T patent/DK0470184T3/da active
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- 1990-04-25 AT AT90907850T patent/ATE148918T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-04-25 CA CA002051107A patent/CA2051107A1/en not_active Abandoned
- 1990-04-25 EP EP90907850A patent/EP0470184B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0279688A2 (en) * | 1987-02-20 | 1988-08-24 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for the use of HIV env polypeptides and antibodies thereto |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Cell,50[6(1987)P.975−985 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012065055A3 (en) * | 2010-11-12 | 2012-07-12 | The Rockefeller University | Fusion proteins for hiv therapy |
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WO1990012868A1 (en) | 1990-11-01 |
DE69029937T2 (de) | 1997-05-28 |
DE69029937D1 (de) | 1997-03-27 |
ATE148918T1 (de) | 1997-02-15 |
EP0470184B1 (en) | 1997-02-12 |
CA2051107A1 (en) | 1990-10-26 |
AU633570B2 (en) | 1993-02-04 |
JPH04506004A (ja) | 1992-10-22 |
EP0470184A4 (en) | 1992-10-07 |
ES2097759T3 (es) | 1997-04-16 |
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