JPH0757198B2 - ジデオキシイノシンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は２′,3′−ジデオキシアデノシンからの２′,
3′−ジデオキシイノシンの製造方法に関するものであ
る。

２′,3′−ジデオキシイノシンは強い抗ウイルス作用を
有する為に、インフルエンザ，エイズ等のウイルス性疾
患の治療薬として期待されている。

〔従来の技術〕

従来、２′,3′−ジデオキシイノシン等のジデオキシヌ
クレオシドの合成方法としてはChem.Pharm.Bull.,22,12
8（1974）に知られているようにヌクレオシド類の２′
位あるいは３′位の脱酸素反応が知られているが、反応
に先立ち保護基を導入しなければならないこと、２′
位、３′位は立体障害が大きく反応が起きにくいこと、
ヌクレオシドが過激な条件下では不安定なため、過激な
反応条件や反応剤を用いることができない等の理由によ
り報告例は極めて少なく，また工業的に満足する方法は
まだ確立されていない。

このような背景の下、本発明者らは２′,3′−ジデオキ
シウリジン又は２′,3′−ジデオキシリボース−１−リ
ン酸から微生物の作用により２′,3′−ジデオキシイノ
シン、２′,3′−ジデオキシアデノシン等の２′,3′−
ジデオキシヌクレオシドを製造する方法を開発している
（特願昭62−149893）。

しかし、この方法は効果的な方法ではあるが、２′,3′
−ジデオキシイノシンを製造する場合には若干収率が劣
るという欠点が残る。

また、動物臓器由来のアデノシンデアミナーゼを用い
て、２′,3′−ジデオキシアデノシンを２′,3′−ジデ
オキシイノシンに変換する試み（Biohim.Biophis,Act
a.,566（２）,259（1979））もなされているが酵素源が
動物由来であるために、コスト面と供給量の両面におい
て、工業的に適していない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来、化学法はいずれも反応工程が長く、また収率が低
いという欠点がある。従って本発明の課題は高収率で効
率良くしかも安価に、２′,3′−ジデオキシイノシンを
製造する方法の提供である。

酵素を用いて、２′,3′−ジデオキシアデノシンを
２′,3′−ジデオキシイノシンに変換する方法は、先に
示した様に動物臓器由来のアデノシンデアミナーゼにお
いて知られているが、微生物由来の酵素においてはまっ
たく知られていない。一般に動物由来の酵素は、基質特
異性が広く（上記の例ではアデノシンをイノシンに変換
するアデノシンデアミナーゼが、２′,3′−ジデオキシ
アデノシンに作用して２′,3′−ジデオキシイノシンを
生成）、一方、微生物由来の酵素はその基質特異性が狭
いことが知られている。本発明の課題は、２′,3′−ジ
デオキシアデノシンをジデオキシイノシンに変換する酵
素源を工業的に適した微生物に求め、動物酵素と同様
に、基質特異性の広い酵素を生産する微生物を見い出す
か、あるいは、２′,3′−ジデオキシアデノシンに特異
的に作用する酵素を生産する微生物を見い出し、２′,
3′−ジデオキシアデノシンを安価に２′,3′−ジデオ
キシイノシンに変換する方法を確立することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者はこのような目的を達成すべく鋭意検討の結
果、先に開発した２′,3′−ジデオキシウリジン又は
２′,3′−ジデオキシリボース−１−リン酸から微生物
の作用により、安定かつ安価に生産・供給される２′,
3′−ジデオキシアデノシンを基質に用い、これに微生
物の菌体等を作用させることにより高収率で２′,3′−
ジデオキシイノシンが生産できることを初めて見いだ
し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、２′,3′−ジデオキシアデノシン
を２′,3′−ジデオキシイノシンに変換する能力を有す
るアクロモバクター，アシネトバクター，エアロモナ
ス，アグロバクテリウム，アルカリゲネス，アースロバ
クター，バチルス，ブレビバクテリウム，セルロモナ
ス，シトロバクター，コリネバクテリウム，エシェリヒ
ア，エンテロバクター，エルビニア，フラボバクテリウ
ム，ハフニア，クレブシエラ，クルイヘラ，ミクロバク
テリウム，ミクロコッカス，ミコプラナ，ノカルディ
ア，プラノコッカス，プロタミノバクター，プロテウ
ス，シュードモナス，リゾビウム，ロドコッカス，サル
モネラ，セラチア，スタフィロコッカス，ストレプトマ
イセス，ビブリオ，キサントモナス属に属する微生物の
培養液、菌体または菌体処理物を２′,3′−ジデオキシ
アデノシンに作用せしめて、２′,3′−ジデオキシイノ
シンを生成・蓄積させることを特徴とする２′,3′−ジ
デオキシイノシンの製造方法に関する。

もちろん本発明者等が以前に開発した上記方法（２′,
3′−ジデオキシウリジン又は２′,3′−ジデオキシリ
ボース−１−リン酸から直接２′,3′−ジデオキシイノ
シンを製造する方法）を用いても２′,3′−ジデオキシ
イノシンを得ることができるが、２′,3′−ジデオキシ
イノシンの生産に関しては、本発明の方法の方が反応収
率が極めて高く、より有利な方法と言える。

本発明に使用される微生物としては、例えば以下の様な
ものがある。

Acinetobacter lwoffii ATCC−9036 Aeromonas salmonicida ATCC−14174 Alcaligenes faecalis FERMBP−940 Arthrobacter citreus ATCC−11624 Bacillus firmus ACTT−8247 Brevibacterium pusillum ACTT−19096 Cellulomonas flavigena ATCC−491 Citrobacter freundii ATCC−8090 Corynebacterium aquaticum ATCC−14665 Escherichia coli FERM−P 7404 Enterobacter cloacae ATCC−13047 Erwinia carotovora FERM−P 2766 Flavobacterium aquatile ATCC 8375 Hafnia alvei ATCC−9760 Klebsiella pneumoniae ATCC−8308 Kluyvera citrophila FERM−P 8193 Microbacterium imperiable ATCC−8365 Micrococcus luteus ATCC−400 Mycoplana dimorpha ATCC−4279 Nocardia restricta ATCC−14887 Planococcus citreus ATCC−15234 Protaminobacter alboflavus ATCC−8458 Proteus rettgeri FERMBP−941 Pseudomonas oleovorans ATCC−8062 Rhizobium meliloti FERM−P 8197 Rhodococcus rhodochrous ATCC−12974 Salmonella typhimurium FERM−P 9470 Arthobacter ureafaciens FERMBP−2472 Serratia grimesii ATCC−14460 Staphyrococcus epidermidis ATCC−155 Streptomyces flavovirens IFO−3197 Vibrio metschnikovii ATCC−7708 Xantomonas citri FERM−P 3396 また、本発明に用いられる微生物は、２′,3′−ジデオ
キシアデノシンを脱アミノ化させて２′,3′−ジデオキ
シイノシンを生成するものであれば上記以外の微生物で
も特に限定されない。

本微生物を培養することにより２′,3′−ジデオキシア
デノシンを２′,3′−ジデオキシイノシンに変換せしめ
る方法としては培養当初より２′,3′−ジデオキシアデ
ノシンを含有する培地に本発明の微生物を培養してもよ
いし、また培養途中に２′,3′−ジデオキシアデノシン
を培地に添加してもよい。

本微生物の培養のために用いられる培地は２′,3′−ジ
デオキシアデノシンを含むほかは通常の炭素源，窒素
源，無機イオン更に必要ならば有機栄養源を含む通常の
培地である。

炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロー
ル等のアルコール類、有機酸その他が適宜使用される。
窒素源としては、アンモニアガス，アンモニア水、アン
モニウム塩，その他が用いられる。無機イオンとして
は、マグネシウムイオン，燐酸イオン，カリウムイオ
ン，鉄イオン，マンガンイオン，その他が必要に応じ適
宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン，アミノ
酸等及びこれらを含有する酵母エキス，ペプトン，肉エ
キス，コーンスティープリカー，カゼイン分解物その他
が適宜用いられる。

培養は好気的条件下に、pH5ないし８、温度25ないし40
℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ましい結果が得ら
れる。

かくして１ないし10日間も培養を行えば、２′,3′−ジ
デオキシアデノシンは２′,3′−ジデオキシイノシンに
効率よく変換される。

一方、本微生物の培養液または菌体または菌体処理物
を、水溶液中にて２′,3′−ジデオキシアデノシンと接
触せしめて作用せしめる場合には、酵素源として、本酵
素を含む微生物菌体、及びそれを含む培養液等が使用で
きる他に、これらの処理物等も使用できる。処理物とし
ては、アセトン乾燥物、磨砕物，超音波処理物，界面活
性剤あるいはトルエン等の処理物，リゾチーム等の酵素
処理物，菌体より抽出した後、塩析，カラムクロマト等
により分離した蛋白画分，本反応の酵素活性を有する蛋
白画分の精製物，更にこれら菌体およびその処理物の固
定化物等何れもが利用できる。

基質として使用する２′,3′−ジデオキシアデノシンの
濃度は１−5000mM程度が適当であり、反応開始時に全量
添加してもよいし、反応途中に分割添加してもよい。こ
の基質を含む水溶液に微生物の培養液，菌体，または菌
体処理物を加え、pHを３−10、好ましくは４−９の範囲
に調整した後、５−70℃、好ましくは20−60℃で静置あ
るいはかくはんしながら10分−10日間保持すると反応が
進行し、反応液中に目的とする２′,3′−ジデオキシイ
ノシンが著量蓄積される。尚、本反応はアンモニアが生
成する反応である為、反応の進行と共に反応液のpHが上
昇するので酸を用いてpHの上昇をおさえれば更に良い結
果を得ることができる。使用される酸は、塩酸，燐酸，
硫酸，硝酸等の鉱酸，蟻酸，酢酸，クエン酸等の有機酸
を始め、反応を大きく阻害しないものであれば何を用い
ても良い。

反応液より２′,3′−ジデオキシイノシンを採取する方
法は、水等の溶媒に対する溶解度差を利用する方法、イ
オン交換樹脂や吸着樹脂を用いる方法など通常の精製法
で行うことができる。

また２′,3′−ジデオキシイノシンの定量は常法に従っ
て高速液体クロマトグラフィーで行った。以下、実施例
に従って本発明を更に詳細に説明する。

実施例１ 5g/dlの２′,3′−ジデオキシアデノシンまたはアデノ
シンを含む1MのTris−HCl緩衝液（pH7.5）10mlに、各々
シグマ社製アデノシンデアミナーゼ（タイプX,仔牛脾臓
由来）８ユニットまたは天野製薬製デアミザイム （糸
状菌由来）50mgまたは第１表に示した微生物の洗浄菌体
（微生物の培養条件は次の実施例２と同様）200mgを添
加し、30℃にて１時間反応させた。

この時生成した２′,3′−ジデオキシイノシンまたはイ
ノシンの量を高速液体クロマトグラフィーで測定し、第
１表にその相対値を示した。

ここで、市販品である天野製薬製の微生物由来のデアミ
ザイム を用いた場合は、２′,3′−ジデオキシアデノ
シンを基質とした時にはアデノシンを基質とした時と比
較して、ほとんど反応性がなかった。これに対し、本発
明の微生物を用いた場合には、シグマ社製動物由来酵素
と同様に、アデノシンを基質に用いた場合よりも、
２′,3′−ジデオキシアデノシンを用いた場合の方が、
反応性が高かった。

なお、Sarcina albida FERM−P 7048の場合において、
２′,3′−ジデオキシアデノシンを２′,3′−ジデオキ
シイノシンに変換する反応を触媒する酵素をDEAE−Toyo
pearlを用いて部分精製して性質を検討した結果、アデ
ノシンをイノシンにするが、２′,3′−ジデオキシイア
デノシンには作用しない酵素と、２′,3′−ジデオキシ
アデノシンを２′,3′−ジデオキシイノシンに変換する
がアデノシンもイノシンに変換できる酵素の２つが含ま
れている事が判明した。

実施例２ 酵母エキス0.5g/dl,ペプトン1.0g/dl,肉エキス1.0g/dl
およびNaCl0.5g/dlを含む培地（pH7.0）50mlを500ml容
肩付きフラスコに分注し殺菌した。この培地に、ブイヨ
ン寒天培地にて30℃、16時間前培養した第２表に示す微
生物を１白金耳ずつ接種し、30℃にて16時間振とう培養
した。得られた培養液より菌体を遠心分離にて分離した
後、0.05M Tris HCl緩衝液（pH7.2）で洗浄し、更に遠
心分離することにより洗浄菌体を調製した。

上記洗浄菌体を1g/dlの２′,3′−ジデオキシアデノシ
ンを含む0.05M Tris−HCl緩衝液（pH7.2）に5g/dlにな
るように添加し、30℃、２時間反応させた。この時に生
成した２′,3′−ジデオキシイノシン量を第２表に示し
た。

〔発明の効果〕 本発明によれば安価に供給される微生物及びその含有物
もしくはその処理物を作用させることにより効率よく、
しかも短時間で２′,3′−ジデオキシアデノシンから
２′,3′−ジデオキシイノシンを製造することができ
る。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07 1:13 1:15 1:19 1:18 1:20 1:22 1:265 1:365 1:38 1:41 1:42 1:425 1:45 1:465 1:63 1:64） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−８１９７ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−９４７０ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２４７２ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−３３９６ (72)発明者 入江 康夫 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１―１ 味の 素株式会社中央研究所内 審査官 谷口 博

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】２′,3′−ジデオキシアデノシンを２′,
   3′−ジデオキシイノシンに変換する能力を有するアシ
   ネトバクター、エアロモナス、アルカリゲネス、アース
   ロバクター、バチルス、ブレビバクテリウム、セルロモ
   ナス、シトロバクター、コリネバクテリウム、エシェリ
   ヒア、エンテロバクター、エルビニア、フラボバクテリ
   ウム、ハフニア、クレブシエラ、クルイヘラ、ミクロバ
   クテリウム、ミクロコッカス、ミコプラナ、ノカルディ
   ア、プラノコッカス、プロタミノバクター、プロテウ
   ス、シュードモナス、リゾビウム、ロドコッカス、サル
   モネラ、セラチア、スタフィロコッカス、ストレプトマ
   イセス、ビブリオ、キサントモナス属に属する微生物の
   培養液、菌体または菌体処理物を２′,3′−ジデオキシ
   アデノシンに作用せしめて、２′,3′−ジデオキシイノ
   シンを生成・蓄積させることを特徴とする２′,3′−ジ
   デオキシイノシンの製造方法。