JPH07509698A - 後生動物寄生虫に対するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 後生動物寄生虫に対するワクチン 本発明は、新規な後生動物寄生虫抗原、および嬬虫（ｈｓｌｒａλｎｔｈｌおよ び他の後生動物寄生虫、特に嬬虫および節足動物（ａｒｔｈｒｏｐｏｄｌ寄生虫 によって引き起こされる家畜の病気の制御におけるその使用に関する。

家畜のそれぞれの種は、嬬虫および節足動物の多くの種を含む多数の異なる寄生 虫に感染することがあり、この感染は一般に病気を引き起こす過程である。これ らの病気の幾つかは、経済上かなり重要である。その−例はへセンカス症であっ て、これは、ヒツジを含む多くの反倒動物の第四胃または真正胃に感染する線虫 は、その口の部分で胃粘膜内の小血管に取付く吸血虫である。重度に感染したヒ ツジは大量の血液を失って、貧血、成長不良を来たし、しばしば死に至る。放牧 動物における非−寄生段階の捻転毛様線虫は低温の影響を受けやすく、温暖な気 候でも冬に生き残ることはめったにないため、ヘモンカス症は世界の熱帯および 亜熱帯地方において、より普及している。

また、経済上の観点からみてきわめて重要なものは、非血液栄養性（ｎｏｎ−ｂ ｌｏｏｄ　ｆｅｅｄｉｎｇｌの線虫類オステルタジアオステルタジ　（Ｏｓｔｅ ｒｔａｇｉａｏｓｔｅｒｔａｇｉ　）およびオステルタジア（テラドルサジア） サーカムシンクタ（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ　（Ｔｅｌａｄｏｒｓａｇｉａ）　ｃ ｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）である（０．　ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａは最近Ｔ、 　ｃｉｒｃｕｒｎｃｉｎｃｔａとして再分類されたが、この新名称はまだ広くは 用いられていない。）それぞれｏ、　ｏｓｔｅｒｔａｇｉおよびＴ、　ｃｉｒｅ ｕｍｃｉｎｃｔａに感染したウシおよびヒツジは、成長することができず、治療 しなければ死亡することがあるので、オステルタジア症は、今日の畜産における 問題を生じさせる主な螺虫感染症の一つである。

経済上重要な他の寄生性嬬虫としては、次の嬬虫科の種々の種：よびヒトにも、 致命的な結果になることは頻繁ではないが感染することがあるので、嬬虫の感染 および侵入は無視できない世界的に重要な問題を提起する。

他の重要な後生動物寄生虫としては、多くの節足動物種、特にクモ群および昆虫 群の動物、そして殊に外部寄生虫、例えば血液栄養性の（ｂｌｏｏｄ−ｆｅｅｄ ｉｎｇ）　（食面性、ｈａｅｍａｔｏｐｈａｇｏｕｓ）昆虫（例えば外翅変聾類 および内翅変態類）、クロバエ（キンバエ＋　ｉ、ｕＣｉｌｉａ）およびダニ類 が挙げられる。

これに関し、特に次のものを挙げることができる。マダニ類（ｔｉｃｋｓ　ｌの 種と例えばＭｅｌｏｐｈａｇｕｓ　ｏｖｉｎｕｓ　、およびチンキンムシ類（ｂ ｕｇｓｌ　、例えば９−１狸■ これら自身の寄生効果に加えて、多くの血液栄養性節足動物は、医学上および獣 医学上重要な多種多様の病原体、例えば病原性の原生動物またはウィルスの媒介 において重要である。置皿性節足動物およびそれらが媒介する病気のため、家畜 生産者は毎年、実質的な損失をこうむっている。

放牧家畜の蝉虫および節足動物寄生虫の制御は、現在、放牧管理と組み合わせた 殺虫剤、内外殺寄生虫剤および／または殺昆虫剤の使用に、主に基づいている。

このような技術は、第一に、薬剤を頻繁に投与する必要があるために、第二に、 殺虫剤および殺節足動物剤に対する耐性がますます広がるようになるために、第 三に、幾つかの牧場では適切な放牧管理がしばしば不可能であり、それが可能だ としても、利用できる牧草地の最善の使用に制約が生じることがあるために、し ばしば不満足である。家畜の寄生虫を免疫学的手段で制御しようとする試みがな されてきた。極めて少ない例（例えばウシの肺寄生虫、ｏｉｃｔｙｏｃａｕｌｕ ｓ線虫、および主な節足動物寄生虫に対する市販のワクチンは、今日まで存在し ていない。

も防御剤として可能な新規タンパク質が、幾つかの報告に記載されている討され ている）。

Ｈａ＠ｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの腸細胞の内腔に関連する螺旋重合 体状細胞外タンパク質であるコントルチン忙ｏｎｔｏｒｔｉｎ　ｌは、Ｍｕｎｎ によって１９７７年に初めて記載され（Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　１９ ７７、９２３−３４１、粗製抽出物として大用量（数ミリグラム）で投与すると 、その結果、子ヒツジをヘモンカス症に対して防御することが示されたｉＭｕｎ ｎ　１９８７．　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　９４３８５−３９７）。必要な用 量が大きく、かつ注射した調製物が純粋でないため、これらの実験で得られた防 御が実際にコントルチン自体によるものかどうか、あるいはワクチンに夾雑して いた他の抗原にによるものかどうかが明らかでなかった。更なる研究は、実に、 コントルチンのこのような調製物で免疫されたヒツジが、ＨｌｌｏＤと呼ばれる 腸膜タンパク質ダブレットに対する抗体を有していたことを示した。後になって 、少ない用量（二三百マイクログラム）の高純度Ｈ１ｌＯＤで免疫されたヒツジ は、ヘモンヵス症に対して実質的に防御されることが示された（Ｍｕｎｎ、　Ｗ Ｏ３８１００８３５；　ＭＷ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈＷ０９０／１１０８６１゜今 やＨＩＩＯＤは、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓに対する今日の最も有望なワクチＨａｅ ｍｏｎｃｈｕｓおよび他の蝉虫種の防御抗原を同定しようとしたが、あまり成功 しなかった試みも、文献に報告されている。即ち、例えば４５ｋｄ膜糖タンパク 質が成虫Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓから単離され、この寄生虫が寄生したモルモット にこのタンパク質を免疫原性物質として用いると、束数として約５０１の防御を 与えた（Ｓｈａｒｐ、　Ｗａｇｌａｎｄ　ａｎｄ　Ｃｏｂｏｎ　Ｗ０９２／１３ ８Ｂ９）。ヒツジにおけるその効果は記載されていない。寄生虫におけるこの抗 原の天然の（本来の、ｎａｔｉｖｅ）位置は示されておらず、これが内腔腸表面 タンパク質であるという指摘がないのは確かである。

Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ膜抽出物（これは殆ど必ず）ＩＩＩＯＤを含有している） のより粗製のフラクションは、ヒツジにおける卵数および束数をそれぞれ８８％ および７５％だけ減少させると主張されたが、群のサイズまたはヒツジ間の変異 に関する情報は与えられていない。Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ は、モルモットには自然に感染しない。ヒツジのような自然宿主でのように数週 間持続する代わりに、モルモットの）Ｉａｅｍｏｎｃｈｕｓ感染は著しく省略さ れるので、寄生虫が成体期に達する充分前の、感染後５〜７日に拒絶される　（ Ｗａｇｌａｎｄ、　Ａｂｅｙｄｅｅｒａ、　Ｒｏｔｈｗｅｌｌ　ａｎｄＯｕｗｅ ｒｋｅｒｋ　１９８９　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｆｏｒ 　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　１９３０１−３０５P゜ Ｗ０９２／１３８Ｂ９で用いられたモルモット抗原投与（チャレンジ）モデルに おいて、動物はチャレンジ後５または６日に死んだので、ワクチン接種群とコン トロール群との間の相違は、１または２日までの拒絶現象の促進を反映したにす ぎない。

この極めて僅かな差は、本発明においてヒツジについて説明する効果とは対照的 であり（上記）ｗｏａ８１００８３５およびＷ０９０／ｉ、１０８６参照）、コ ノような状況では、この実験室的モデルの値に疑問を投げかける。この疑問は、 本明細書において後で実験によって強調され、これらの実験では、Ｈａｅｍｏｎ ｃｈｕｓ膜抽出物の麦芽レクチン結合性フラクションが、ヒツジにとって極めて 防御的であることが見出されたが、ｗｏ９２／１３８８９では、本質的に同様の 調製物はモルモットにおいて作用しないことが報告された。

ＷＯ３９１００１６３には、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｂｒ ｉｆｏｒｍｉｓ　（これはＨａｅｍｏｎｃｈｕｓと分類学的に同じ科に属し、ヒ ツジ小腸の寄生虫である）からの４１Ｋｄタンパク質をコードする遺伝子のクロ ーン化および発現が記載されている。このタンパク質は特性決定されておらず、 また、この遺伝子を発現する組み換え微生物からのタンパク質でヒツジにワクチ ン接種した結果、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓでのチャレンジ後の卵数および束数を、 コントロールヒツジと比較して減少させると主張されたが、この減少は統計学的 に有意でなく、もし改善し続けることができないならば、与えられる防御の程度 は商業上を用でないだろう。

最近、水溶性システィンプロテアーゼがＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｒ＋ｔｏｒ ｔｕｓから単離され、これをコードする遺伝子がクローン化され、発現されたＩ Ｃｏｘ、　Ｐｒａｔｔ。

Ｈａｇｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｂｏｉｓｖｅｎｕｅ　１９９０　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏ■凵@４１２５− ３４）。このプロテアーゼは、還元性条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥランで判断して ３５　Ｋｄの分子量を有するが、３７　Ｋｄの分子量を有するより多くグリコジ ル化された翻訳物も同定された。このプロテアーゼ（多分フィブリノーゲンを分 解する）は、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｌ！が摂食しているとき宿主を血栓から防御し 、おそらく、血液栄養の摂取および消化の両方を向上させるという仮説が立てら れた。天然システィンプロテアーゼに富んだフラクシタン二三百マイクログラム をヒツジに繰り返し注射すると、ａａｅｍｏｎｃｈｕｓ幼虫２，５００個でのチ ャレンジ後、これらのヒツジの真中して防御されると主張された（Ｂｏｉｓｖｅ ｎｕｅ、　５ｔｉｆｆ、　Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ、　Ｃｏｘ　ａｎｄ　Ｈａｇｅｍ ａｎ１９９０　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＶＨｔｈ工ｎｔ＠ｒｎａ ｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏ■■ ｐ、４７５）。しかしながら、米国特許４０８３３９および４８７１８１に刊行 されたこれらの実験の詳細は、ワクチン接種群とコントロール群との間の束数お よび卵数の実際の差は近接しており、統計学的に有意でなかったことを露呈する 。

４４　Ｋｄプロテアーゼは、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ第３期幼虫の脱硝（ｅｘｓｈ ｅａｔｈｉｎｇ　ｌ液から単離された（Ｇａｍｂｌｅ、　Ｐｕｒｃｅｌｌ　ａｎ ｄ　Ｆｅｔｔ＠ｒ　１９８９　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａ■ ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　３３４９−５８１　。このプロテアーゼ（メタロ− プロテアーゼと定義され、かつペプスタチンで阻害されなかった）は脱皮を媒介 するが、防御機能については試験されなかった。Ｍａｋｉ　ａｎｄ　Ｙａｎａｇ ｉｓａｗａｗａ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｌｏｇｙ１９Ｂ ６．６０３ｌ−３７）は、成体Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｍａｎｓｏｎｉ、Ｄｉ ｒｏｆｉｌａｒｉａ　１ｍｍ１ｔｉｓ。

Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃａｎｔｏｎｅｎｓｉｓおよびＡｓｃａｒｉ ｓ　ｓｕｕｍにおけるカルボキシル（アスパルチル）およびチオールプロテアー ゼ活性を記載した。しかしながら、これらの活性は、分子量として分別または特 性決定されておらず、それらが候補となる防御抗原であるかどうかを決定しよう とする試みもなされなかった。

３１　Ｋｄ糖タンパク質は、第３期ｏ、　ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ幼虫から単 離された（ＭｃＧｉｌｌｉｖｅｒｙ、　Ｙｏｕｎｇ、　Ｒｉｆｆｋｉｎ　ａｎｄ 　Ａｄｌｅｒ　１９８９工ｎｔａｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａ戟@ｆｏｒ ３１　Ｋｄおよび１７　Ｋｄの２つの低分子量タンパク質は、Ｔ、　ｃｏｌｕｂ ｒｉｆｏｒｍｉｓの内分泌および外分泌産物から単離された（Ｓａｖｉｎ　ｅｔ 　ａｌ、　、　１９９０．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄを用いて、ヒツジをＴ 、　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓでのチャレンジに対して免疫すると、防御の程 度が低いかまたは変動することが報告されている（Ｅｍｅｒｙ　ａｎｄ　Ｗａｇ ｌａｎｄ１９９１＋　。

節足動物寄生虫に関する限り、文献には提案ワクチンについてのより少ない報告 が含まれており、これらの報告は主としてウシのマダニ、特にマダニａｏｏｐｈ ｉｌｕｓ　Ｍｉｃｒｏｐｌｕｓに集中している。即ち、ＪＯｈｎＳＯｎ　ａｔ　 ａｌ、は１９Ｂ６年に、Ｂ、　Ｍｉｃｒｏｐｌｕｓに対する防御抗原が、成体雌 性マダニから誘導された抽出物の可溶性および不溶性の両方のワラクシ３ン中に 見出されたことを報告した（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．工ｎ ｔ、　Ｊ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　１６（１１＋　２７−３４１　。それ以来 、成体マダニの腸からの抽出物、マダニ幼虫抽出物、および唾液腺成分から誘導 されたマダニ抗原を用いて、ウシをマダニに対する免疫を提案する報告が文献に 見られるようになった（例えばＷｉｌｌａｄｓｅｎ　ａｔ　ａｌ、、　１９Ｂ９ ．　ｒｎｔ、　Ｊ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ。

１８（２１＋　１８３−１８９ｉ　ＷＯｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｐ ａｒａｓｉｔｅ　工ｒｎｍｕｎＯＩＯｑｙ１１２４７５−８R７ Ｊａｃｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｐａｒａｓｉｔｅ工ｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ、　１２＋　１４１−１５１参照）。

新規かつ改良された後生動物寄生虫ワクチン、特に広範囲の蝉虫種および／また は節足動物種にわたって使用することのできるワクチンに対する持続した要求が ある。

従って、本発明は、後生動物寄生虫ワクチンとして、特に蝉虫および他の後生動 物寄生虫によって引き起こされる病気の制御における防御免疫として使用するた めの新規な抗原を提供しようとするものである。

より詳細には、本発明は、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの腸にはタンパク質分解活性 糖タンパク質複合体（我々は、これをＨ−ｇａｌ−ＧＰ　（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕ ｓ　ｇａｌａｃｔｏｓｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）と 名付けた）が含まれており、このものが動物にＨａｅｍＯｎｃｈｕ８および他の 寄生虫に対する、免疫を授けることができるという知見に基づいている。ｆｌ− ｇａｌ−ＧＰに類似する糖タンパク質複合体（我々は、これをＯｏ−ｇａｌ−Ｇ ＰおよびＯｃ−ｇａｌ−ＧＰと名付けた）が、それぞれＯｓｔｅｒｔａｇｉａ　 ｏｓｔｅｒｔａｇｉおよび０ｓｔｅｒｔａ　ｉａ　ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａか ら抽出され、同様のタンパク質分解活性が他の蝉虫、例えば丁ｒｉｃｈｏｓｔｒ ｏｎｇｙｌｕｓにおいて観察された。このような複合体は、例えばＴｒｉｔｏｎ 　Ｘ−１００のような界面活性剤の使用により、この複合体が組み込まれている 膜から遊離されると新規であり、蝉虫感染に対するワクチンの製造に有用である 。蝉虫に存在する酵素は、他の後生動物寄生虫、例えばクロバエ幼虫においても 観察された。

従って一つの観点からみて、本発明は、ｆａ＋タンパク質分解活性を有し、 （ｂ）天然形態において、完全な（ｉｎｔｅｇｒａｌ）膜タンパク質またはタン パク質複合体であり、寄生虫腸の腸刷毛縁に存在しており、（ｃ）ペプスタチン と結合することができ、そして（ｄｌ麦芽レクチン、およびβ−結合Ｎ−アセチ ルガラクトサミンに対して特異性を有するレクチンに結合できることを特徴とす る、１種または数種の後生動物寄生虫に対して防御抗原活性を有する後生動物寄 生虫防御抗原、その抗原性フラグメント、成分もしくは前駆体、および機能的に 等価なその誘導体、類似体もしくは変異体を提供する。

本発明のもう一つの観点は、ヒトまたはヒト以外の動物、好ましくは哺乳類、特 に好ましくは反部動物における後生動物寄生虫に対する免疫応答を刺激するのに 使用するための、上記のような防御抗原その抗原性フラグメント、成分もしくは 前駆体、および機能的に等価なその誘導体、類似体もしくは変異体を提供する。

問題の抗原の前駆体は、より大きなタンパク質であってよく、これを例えばタン パク質分解により処理して抗原それ自体を生じさせる。このような前駆体は、チ モーゲン類、即ち酵素の不活性前駆体の形態であってよく、例えばペプシン／ペ プシノーゲン系または血栓カスケードに関連するよく知られたチモーゲン類と同 様にして、タンパク質分解開裂により活性化される。

本発明の新規な抗原は、自然免疫動物からの血清によって認識されない。換言す れば、これらの抗原は、自然形態では、感染した宿主の免疫系にアクセスできず 、従って７隠れた（ｈｉｄｄｅｎｌ”、”潜伏したｆｃｏｎｃｅａｌｅｄ）”ま たは　”秘ｉの（ｃｒｙＰＩ−ｉｃ＋”抗原である。本発明の新規な抗原のレク チン結合特性に関しては、ｃａｎ　Ａ　ｓエントウマメ科植物およびＬｏｔｕｓ −のレクチンとの結合が実証され、これはマンノースおよび／またはフコース残 基の存在を示している。ＤａｔｕｒａおよびＢａｎｄｅｉｒａｅａのようなレク チンとの結合は観察されず、Ｎ−アセチルグルコサミン含有構造がないことを示 しているが、先に述べたように、Ｎ−アセチルガラクトサミン、特にβ−結合Ｎ −アセチルガラクトサミンに対して特異性を有するレクチン、殊にビーナツツお よびｊａｃａｌｉｎ　レクチンとの結合は顕著である。

タンパク質分解活性に関しては、一般的なプロテアーゼ基質、例えばアゾコラー ゲン、アゾカゼイン、ヘモグロビンおよびゼラチンを用いて実証されたが、より 特異的な活性、最も顕著にはアスパルチルブロティナーゼ様活性および中性エン ドペプチダーゼ様活性も観察された。即ち例えば、アスパルチルプロティナーゼ 様活性は、ＨおよびＯ−ｇａｌ−ＧＰ調製物と、蝉虫、例えばＴｒｉｃｈｏｓｔ ｒｏｎｇｙｌｕｓとの両方において観察された。中性エンドペプチダーゼ活性は 、本発明の抗原を含む抽出物に含有されている。更に１．特異的なＨ−ｇａｌ− ＧＰに関する限り、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰの成分をコードするＣＤＮＡクローンから の予備的ヌクレオチド配列データは、既知の自然エンドペプチダーゼ酵素と実質 的な相同性を示す。

従って別の観点からみると、本発明はまた、アスパルチルブロティナーゼ様活性 および／または中性エンドペプチダーゼ様活性を有し、自然形態において、完全 な膜タンパク質またはタンパク質複合体であることを特徴とする、１種または数 種の後生動物寄生虫に対して防御抗原活性を有する後生動物寄生虫防御抗原、そ の抗原性フラグメント、成分もしくは前駆体、および機能的に等価なその誘導体 、類似体もしくは変異体を提供する。

本発明の抗原のもう一つの主な特色は、これらがペプスタチンに結合することで ある。ペプスタチンはアスパルチルプロテアーゼの阻害剤としてよく知られてお り、より少ない程度ではあるが、中性エンドペプチダーゼを含む膜メタローエン ドペプチダーゼと結合することも実証される。

＋（ａｅｍｏｎｃｈｕｓ、　ＯｓｔｅｒｔａｇｉａおよびＴｒｉｃｈｏｓｔｒｏ ｎｇｙｌｕｓにおけるタンパク質分解活性は、ペプスタチンにより阻害されるこ とが見出された。従って、本発明のもう一つの観点は、ペプスタチンに結合する ことができ、天然形態において、完全な膜タンパク質またはタンパク質複合体で あることを特徴とする、１種または数種の後生動物寄生虫に対して防御抗原活性 を有する後生動物寄生虫防御抗原、その抗原性フラグメント、成分もしくは前駆 体、および機能的に等価なその誘導体、類似体もしくは変異体を提供する。

等電点電気泳動の研究は、本発明の糖タンパク質抗原の等電点（ｐｌ　）が約ｐ Ｈ２〜ｐＨ７，５の範囲にあることを示した。

本発明の抗原について、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥＩの研究を 行なった。このような研究は、還元性および非還元性ゲル上での挙動が異なるこ とを示した。特に、非還元性ゲル上の大きい方のバンドは、還元性条件下で再び 電気泳動すると、１個または数個の小さいバンドに分解する。後の更に詳しく説 明するように、タンパク質分解活性および防御抗原活性は、個々のバンドまたは 複合したバンドのタンパク質に帰することができるが、幾つかのバンドは他のバ ンドよりも”活性”である。本発明の抗原は、多重結合（ｍｕｌｔｉｍｅｒ工Ｃ ）酵素複合体であってもよい。

抗原）！−ｇａｌ−ＧＰの場合、ＰＡＧＥの研究結果は、以下の実施例１に詳細 に記載されている。従って本発明の抗原の好ましいサブセットは、実施例１に記 載の抗原（およびそのフラグメントまたは成分）、および機能的に等価なその誘 導体、類似体および変異体（他の属または種における類似体を含む）からなる。

即ち、本発明の好ましい抗原は、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｇおよび他の後生動物寄生 虫属から単離可能な、表１に示す５ＤＳ−ＰＡＧＥ分子量を有する抗原がらなっ ていてよい。

抗原Ｈ−ｇａｌ−ＧＰの場合、防御抗原活性は、以下の実施例７の実験５により 詳細に記載するように、幾つかの成分タンパク質バンド関連していることが示さ れた。

従って本発明の更にもう一つの観点は、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｓｐ、の腸から 得られる完全な膜タンパク質またはタンパク質複合体であるか、またはその一部 を形成し、非還元性条件下で５％ゲルにおいて５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約１ ９０〜２０５　ｋｄの分子量を有するか、または非還元性条件下で１０％ゲルに おいて５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約３５ｋｄまたは４５〜５０　ｋｄの分子量 を有する、１種または数種の後生動物寄生虫に対して防御抗原活性を有する後生 動物寄生虫防御抗原、その抗原性フラグメント、成分もしくは前駆体、および機 能的に等価なその誘導体、類似体もしくは変異体を提供する。

本発明において特に重要な後生動物寄生虫としては、特に蝉虫および節足動物寄 生虫が挙げられ、後者の場合、血液栄養性昆虫寄生虫、ウシのマダニおよびハエ ウジが挙げられる。このような蝉虫および節足動物寄生虫の代表例としては、例 えば先に列記した多種多様な種を挙げることができる。

本明細書で用いられる”防御抗原”なる用語は、宿主−防御性の、即ち免疫原性 の免疫応答、即ち寄生虫を損傷し、阻害し、または殺す免疫エフェクター分子、 抗体または細胞の産生を生じさせる宿主による応答を引き起こしつるものであっ て、これにより、宿主または宿主種を、臨床的または無症状の病気および繁殖損 失から”防御”する抗原を定義する。このような防御免疫応答は、普通には、寄 生虫の代謝機能を阻害しつる抗体を産生じ、発育阻止、産卵不足および／または 死亡を引き起こすことによって示すことができる。

ある種類の後生動物寄生虫、特に蝉虫寄生虫、および真正摂食者（ｏｂｌｉｇａ ｔｅｆｅｅｄｅｒ　ｌである外部寄生虫、例えばシラミおよびマダニ、または宿 主上である期間摂食するもの、例えばクロバエ、ウシバエ、ラセンウシバエおよ びウマバエ幼虫、シカおよび／またはバフアローバエ、およびマダニの場合、宿 主防御免疫応答反応は、寄生虫の死滅、衰弱および／または宿主からの駆出とい う結果を来すであろう。換言すれば、感染動物の感染度が低減され、感染動物そ れ自体がそれ自身の免疫応答の利益を獲得する。しかし他の場合には、”疫学的 ”効果を観察することができ、これにより直接の宿主それ自身は、その免疫応答 から有意に利益をを得る必要がない。例えば免疫された動物から摂食した結果、 所定の範囲の寄生虫密度を減少および／または減衰することができ、これにより 後になって宿主の群れおよび／または集団が保護される。多くの季節を通しての 免疫アプローチの持続は、寄生虫疾患の脅威を低減させるであろう。このことは 、摂食しかつ宿主から宿主へと急速に動き回ることのできるマダニ、ハエ等の節 足動物外部寄生虫に関して特に真実である。こうして、寄生虫によって摂取され た阻害性抗体は、寄生虫がその宿主から去った後にその効果を発揮することがで きるが、寄生虫を殺し、衰弱させ、または繁殖能を低下させることにより、宿主 動物群の他のメンバーを保護することができる。

以下により詳細に記載するように、保護的な免疫原性活性が、本発明の抗原につ いて実証された。更に、この保護的活性は、抗原が例えば解離および／または還 元により変性された場合に保持されることが示された。実際、上記のように、別 の観点からみて、本発明は、前記定義の後生動物寄生虫抗原、および１種または 数種の後生動物寄生虫に対する抗原活性を有するその成分、フラグメント、前駆 体および機能的に等価な誘導体、類似体または変異体を、ヒトまたはヒト以外の 動物、好ましくは哺乳類、特に好ましくは反部動物における後生動物寄生虫に対 する免疫応答を刺激するために用いられるワクチン組成物の製造に使用すること を提供することが判る。

本発明はまた、前記定義の抗原、および１種または数種の後生動物寄生虫に対す る抗原活性を有するその成分、フラグメント、前駆体および機能的に等価な誘導 体、類似体または変異体の１種または数種を、製剤上許容される担体、賦形剤ま たは希釈剤と一緒に含む、ヒトまたはヒト以外の動物、好ましくは哺乳類におけ る後生動物寄生虫に対する免疫応答を刺激するためのワクチン組成物、並びに、 ヒトまたはヒト以外の動物、好ましくは哺乳類に前記定義のワクチン組成物を投 与することからなる、前記動物における後生動物寄生虫に対する免疫応答を刺激 する方法を提供する。

上記のように、本発明の範囲には、新規な糖タンパク質抗原の機能的に等価な誘 導体、類似体および変異体が包含される。本明細書において、”機能的に等価な １とは、天然酵素タンパク質に関連するかまたはそれから誘導されるタンパク質 であって、アミノ酸が１つまたは多数のアミノ酸の置換、付加および／または欠 失によって修飾されている配列、そしてまた、アミノ酸が例えば脱グリコジル化 またはグリコジル化により化学的に修飾されてはいるが、保護的抗原性を保持し ている配列、例えば寄生虫に対して宿主保護的抗体および／または機能的免疫化 を生じさせることのできる配列、を定義するために用いられる。このような機能 的に等価な変異体は、自然の生物学的変種として生じることができ、または公知 の技術を用いて製造することができる。例えば機能的に等価な組み換えタンパク 質は、部位指向性突然変異発生、ランダム突然変異発生、または核酸の酵素的あ おれつおよび／または連結の公知技術を用いて製造できる。以下の実施例におい て類似の抗原複合体Ｈ−ｇａｌ−ＧＰおよび０−ｇａｌ−ＧＰを参照して更に詳 細に示すように、機能的に等価な類似体は異なる寄生虫種において生じさせるこ とができる。

含む。）好ましいものは、抗原が単離された寄生虫に加えて、他の広範囲の寄生 虫に対して宿主保護免疫応答を刺激しつる抗原、いわゆる０広いスペクトルの” も可能である。

上記のように、本発明に係る抗原かその宿主保護効果を発揮することができる１ つの方法は、寄生虫の成長、持続および／または発育を阻害する阻害抗体の産生 による。モノクローナルまたはポリクローナルであってよいこのような抗体およ びその抗原結合フラグメント（例えばＦｆａｂｈ　、　ＦａｂまたはＮフラグメ ント、即ち抗原結合部位を含む抗体の”可変”部のフラグメント）は、これらを 含有するワクチン組成物として、並びに寄生虫に対して宿主を免疫するワクチン 組成物の製造におけるその使用として、本発明の更なる態様を形成する。このよ うな阻害抗体は、イディオタイプ抗体を用いて産生させることができる。アンチ −イディオタイプ抗体をワクチンの免疫原として使用できる。

本発明に係る抗原は、寄生虫、例えば蝉虫からの抽出により、従来の生物化学的 および外科的技術を用いて、例えば寄生虫全体またはその腸だけをホモジナイズ し、次いで所望の酵素を従来の精製技術、例えば遠心、分別沈澱、クロマトグラ フィー等により単離することによって製造することができる。好ましい方法では 、標的分子が特別の選択的結合活性を有するという事実は、特定のりガントが固 相マトリックス上に固定化されているアフィニティークロマトグラフィーを用い ることによって利用される。

従って本発明はまた、少なくとも１種の上記定義の保護抗原を含有する後生動物 寄生虫の抽出物を調製し、この抗原の特異的結合パートナ−を含む固定化相に該 抗原を結合させ、次いで該抗原を該固定化相から溶離することにより、該抽出物 から該抗原を精製することからなる、ヒトまたはヒト以外の動物、好ましくは哺 乳類における後生動物寄生虫に対する免疫応答を刺激するのに用いられるワクチ ンの製造方法を提供する。好適な特異的結合パートナ−には、基質類似体、例え ば阻害剤ペブスクチン、およびオリゴ糖類特異的レクチン、例えばガラクトース および特にβ−結合Ｎ−アセチルガラクトサミンに特異的に結合するものが含ま れる。

我々の研究は実際に、幾つかのレクチンが、寄生虫の腸の内腔表面上での保護抗 原能についてのグリコジル化を同定するために、アフィニティークロマトグラフ ィーにおけるリガンドとして特に宵月であることが示した。

従って本発明のもう一つの観点は、寄生虫の統合膜フラクシヨンを、Ｎ−アセチ ルガラクトサミンに対して特異性を有する１種または数種のレクチンを担持する 固定化相を用いるアフィニティークロマトグラフィーにかけることからなる、寄 生虫における保護抗原を同定する方法を提供する。

これらのレクチンは、好ましくはピーナツまたはエントウレクチン、またはβ− 結合Ｎ−アセチルガラクトサミンに対して特異性を有する他のレクチンである。

寄生虫の統合膜フラクションは、この分野でよく知られた技術を用いて、例えば 界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ　Ｘ（００による抽出を用いて、容易に製造製 造出来る。

アフィニティークロマトグラフィーも同様にこの分野でよく知られており、バッ チシステムおよびカラムに基づくシステムが含まれる。レクチンを結合しつる広 範囲の固相、例えばアガロースまたはセファロースなどのゲルを用いることがで きる。ピーナツまたはエントウレクチンを担持したアガロースビーズは、実際に 市場で入手できる（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。

あるいは抗原は、標準的技術、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ ［１９（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍ ａｎｕａｌ　２ｎｄ　Ｅｄｄｉｔｉｏｎ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｐ窒■唐唐撃■ 記載されたような技術を用いて、組み換えＤＮＡ技術により製造することができ る。

本発明の抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は、本発明のもう一 つの態様を形成する。

抗原Ｈ−ｇａｌ−ＧＰに対応するクローンの予備的配列研究が行なわれた。ＨＧ ３と名付けたこのような１つのクローンの配列は、図３３に示されている＋ＳＥ ＱよりＮｏｔ１）。この配列は、図３４に示すアミノ酸の整列によって実証され るように、公知の哺乳類天然外部寄生虫酵素と有意な相同性を示す＋ＳＢＯＸＤ 　Ｎｏｔ　２１゜従って本発明に係る好ましい核酸分子は、図３３（ＳＥＱより Ｎｏｔ１１に示すヌクレオチド配列の全部または一部に実質的に対応する１種ま たは数種の核酸配列、変性物である配列または前記配列と実質的に相同性のまた は前記配列とハイブリッド化する配列を含んでいる。

本発明に係る核酸分子は、−末鎖または二本鎖ＤＮＡ　、　ｃＤＮＡまたはＲＮ Ａ　。

であってよく、そして、抗原または関連する抗原フラグメントをコードしつる変 性配列、実質的に相同性の配列またはハイブリッド化配列を包含する。。実質的 に相同性の”とは、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％または８０ ｔの配列相同性を有する配列を意味する。本発明の範囲に包含されるハイブリッ ド化配列は、非緊縮条件下（例えば、６　ｘ　ＳＳＣ５０％ホルムアミド、室！ Ｉ）で結合し、低緊縮条件下（例えば２　ｘ　５ＳＣ−室温、好ましくは２　ｘ 　ＳＳＱ　４２℃）または高緊縮条件下（例えば２　ｘ　ＳＳｃ、　６５℃）　 （；−コテＳＳＣ”　０．１５　Ｍ　ＮａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウ ム、ｐＨ７，２）で洗浄した配列、並びに、コードが変性または退化しないなら ば、前記の条件下でハイブリッド化する配列である。

抗原的に活性な抗原または抗原変異体をコードしつる本発明に係るヌクレオチド 配列の誘導体は、この分野でよく知られた従来の方法をもちいて得ることができ る。

本発明に係る抗原は、発現コントロール配列に作動的に結合された前記で広く定 義したヌクレオチド配列を含む組み換えＤＮＡ分子を含有する宿主細胞内で、ま たはこのような組み換えＤＮＡ分子を含有する組み換えＤＮＡクローニングビヒ クルまたはベクター内で発現させることによって、組み換え形態として製造でき る。このようにして発現された合成ポリペプチドは、本発明の更なる態様を形成 する（本明細書において５ポリペプチド”なる用語は、完全長さのタンパク質お よびより短いペプチド配列の両方を包含するものとして用いられる）。

こうして発現された抗原は、本発明に係る抗原の全部または一部と、これに融合 した組み換え分子のＤＮＡによりコードされた付加的ポリペプチドとを含んでい てよい。これは、例えばβ−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−８−）ランスフ ェラーゼ、肝炎コア抗原、またはこの分野で融合タンパク質に普通に用いられる 他の任意のポリペプチドによることができる。

従って本発明の別の態様は、本発明の抗原をコードするＤＮＡを含有するクロー ニングまたは発現ベクター、並びに、抗原をコードするヌクレオチド配列をベク ター核酸中に挿入することからなる、本発明に係る組み換え核酸分子の製造方法 を包含する。このような発現ベクターは、例えば、本発明の核酸分子とマツチす るリーディングフレームに結合された翻訳コントロール要素（例えば開始および 停止コドン、リボゾーム結合部位）および転写コントロール要素（例えばプロモ ーター−オペレーター領域、終止停止配列）のような適切なコントロール配列を 包含する。

本発明に係るベクターとしては、よく知られた技術に従った、この分野の文献に 記載されたプラスミドおよびウィルス（バクテリオファージおよび真核ウィルス の両方を含む）を挙げることができ、同様によく知られており、この分野の文献 に記載された種々の異なる発現系中で発現させることができる。好適なウィルス 性ベクターとしては、バクロウィルス、そしてまたアデノウィルスおよびワクシ ニアウィルスが挙げられる。他の多くのウィルスベクターが文献に記載されてい る。

このようなベクターを発現のために原核細胞または真核細胞中に挿入するが、ま たは微生物（ｇｅｒｍ）系統または体細胞中に挿入してトランスジェニック動物 を形成する種々の技術が公知であり、使用できる。好適な形質転換技術またはト ランスフェクション技術は、文献によく記載されている。

本発明はまた、前記の本発明に係る核酸分子を含有する、形質転換またはトラン スフェクトされた原核性または真核性宿主細胞、あるいはトランスジェニック微 生物を包含する。このような宿主細胞としては、例えばＥ、　ｃｏｌｉのような 真核細胞系、酵母またはバクロウィルス原核細胞系、形質転換乳類細胞およびト ランスジェニック動物および植物が挙げられる。特にトランスジェニック線虫が 本発明のもう一つの観点は、前記定義の本発明の抗原の全部または一部をコード する核酸分子を含有する宿主細胞を、該抗原が発現される条件下で培養し、こう して発現された抗原を回収することからなる、本発明の抗原の製造方法を提供す る。

本発明の抗原または機能的に等価な抗原変異体は、化学的手段、例えばよく知ら れたＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成操作により製造することもできる。

上記で論じた新規な抗原の水溶性誘導体は、本発明のもう一つの態様を形成する 。このような可溶性形態は例えば酵素エラスターゼを用いるタンパク質分解消化 により得ることができる。一般的にいって、抗原の酵素消化は２つのフラクショ ン、即ち界面活性剤可溶性フラクション（これは膜とともに残る）と、水溶性フ ラクションとを生じる。

本発明によれば、ワクチン組成物は、ワクチン製造の分野でよく知られた方法に よって製造することができる。伝統的ワクチン製剤は、適切ならば、１種または 数種の好適なアジュバント、例えば水酸化アルミニウム、サポニン、ｑｕｉ　ｌ −Ａまたはその精製形態、ムラミルジペプチド、鉱物油または植物油、ツバシー ム、非イオン性ブロック共重合体またはＤＥＡＥデキストランとともに、１種ま たは数種の製剤上許容される賦形剤（担体）または希釈剤の存在下で、１種また は数種の本発明に係る抗原または抗体を含むことができる。好ましい賦形剤とし ては、液状媒体、例えば動物または患者にペプチドまたはポリペプチドを導入す るためのビヒクルとして用いるのに適切な食塩溶液が挙げられる。追加の成分、 例えば保存剤を含んでいてもよい。

もう一つのワクチン調製物は、挿入された核酸分子によってコードされたポリペ プチドに対する免疫応答を刺激するために、本発明に係る核酸分子（例えばＤＮ Ａ分子）が挿入されているウィルスまたは宿主細胞、例えば微生物（例えばワク シニアウィルス、アデノウィルスまたはサルモネラ）（これらは生きていてもよ く、死滅または減衰されていてもよい）を含むことができる。

ワクチン組成物の投与は、任意の普通の経路で、例えば経口的または非経口的に 、例えば筋肉的注射により、所望により間隔を置いて、例えば７〜３５日の間隔 で２度注射することによって行うことができる。

本発明によれば、抗原は、同一または異なる寄生虫種から得られた他の保護抗原 と組み合わせて使用することができる。従って本発明に係るワクチン組成物は、 １種または数種の前記定義の抗原、例えばＨ−ｇａｌ−ＧＰを、前記の抗原Ｈ１ １０ＤおよびＨ４５と一緒に含んでいてもよい。このような混合ワクチン−組成 物は、問題の抗原だけを含む個々のワクチン製剤よりも少ない量の種々の抗原を 含むことができる。

本発明から利益を受ける動物は、ヒトまたはヒト以外の任意の動物であってよい が、コンパニオン動物、特にイヌおよびネコ、家畜、特に反部動物が好ましい。

特にヒツジ、ウシ、ブタ、シカおよびヤギが挙げられる。

（それぞれＨ−ｇａｌ−ＧＰ　、　Ｏｏ−ｇａｌ−ＧＰおよびＯｃ−ｇａｌ−Ｇ Ｐという）を個々に参照して、本発明を更に詳細に論じる。前記定義の本発明の 普遍性を限定するものではないが、Ｈ−９Ｊｌｌ−ＧＰＳＯｏ−ｇａｌ−ＧＰお よびＯｃ−ｇａｌ−ＧＰおよび／またはこれらの別個の成分を蝉虫ワクチンの製 造に使用すること、およびこれら抗原およびワクチン自体が、本発明の特に好ま しい態様を形成することが理解されよう。

タンパク質Ｈ−ｇａｌ−ＧＰは、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ腸細胞の刷毛縁ライニン グ中の内在性膜タンパク質である。これはグリコジル化されており、Ｎ−アセチ ルガラクトース−アミンに対して特異性を有するレクチンと選択的に結合する。

これはプロテアーゼ活性を示し、この活性は、アスパルチルプロテアーゼの特異 的阻害剤であるペプスタチンによって阻害されうる。５ＯＳ−ポリアクリルアミ ドゲル上での還元条件において、これは８個の主バンドとして走る。この理由か ら、このものはＨａｅｍｏｎｃｈｕｓガラクトース含有糖タンパク質複合体、ま たはＨ−ｇａｌ−ＧＰと名付けられた。

以下の非限定的実施例において、 図１は、１０１アクリルアミドゲル上でのＨ−ｇａｌ−ＧＰ　、　ＨｌｌｏＤお よびＨ−４５複合体の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる比較を示す。

トラック１〜３および４〜６　それぞれ非還元サンプルおよび還元サンプルトラ ックｌおよび４　Ｈｌｌおよび８４５複合体に富むフラクショントラック２およ び５　Ｈ２Ｓ複合体 トラック３および５　Ｈ−ｇａｌ−ＧＰトラック３における４７および５０　ｋ ｄバンドのＮ−末端アミノ酸配列が決定された。

図２は、非還元条件下５１アクリルアミドゲル上でのＨ−ｇａｌ−ＧＰの！９Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥプロフィールを示す。各トラックは電荷（ｌｏａｄｉｎｇ　）の異 なるＨ−ｇａｌ−ＧＰを含んでいる。記号は、ヒツジの実験５における抗原（実 施例７および図２２°参照）のために切り出したバンドであって、次のとおりで ある。

Ａ＝　グループ１５ノため０）　２３０　ｋｄ　。

Ｂ；　グループ１６ノため１７１１９０〜２０５　ｋｄ　。

Ｃ＝　グループ１７ノためノ１７０　ｋｄ　。

Ｄ≠　グループ１８のための色素フロントバンド。

図３は、非還元性条件下で予め分離された主Ｈ−ｇａｌ−ＧＰバンドの還元性条 件下での分析を示す。

トラックｌ　Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ トラック２　２３０ｋｄ　）これら見掛は分子量を有するバンドを５％非トラッ ク３　１７０ｋｄ　）還元性ゲル（例えば図２）から切り出し、再びトラック４ 　色素フロント　）還元電気泳動した。

トラック３における４５および４８　ｋｄバンドのＮ−末端アミノ酸配列が決定 された。

図４は、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ複合体を製造するための３つの方法のフローチャート を示す。

図５は、Ｍｏｎｏ　Ｑ媒体上でのＨ−ｇａｌ−ＧＰ複合体のイオン交換クロマト グラフィーにより得られたフラクションの５Ｏ８−ＰＡＧＥ　（１０％ゲル、還 元性）を示す。

ａ）　ピーナツレクチンで予め単離された出発材料トラック１　カラムにかけた 出発材料 トラック２　結合していないワラクシシントランク３〜５１４０關ＮａＣ１で溶 離トラック６および７　４００ｍＭＮａＣ１で溶離ｂ）エントウレクチンで予め 単離された出発材料トラック１　カラムにかけた出発材料 トラック２　結合していないフラクショントラック３〜５　１４０　ｍＭ　Ｎａ Ｃ１で溶離トラック６および７　４００ｍＭＮａＣ１で溶離トラック３　５００ 　ｍＭ　ＮａＣ１で溶離トラック９　１　Ｍ　ＮａＣ１で溶離 図６は、ピーナツ、ソラマメ　（Ｖｉｃｌａ）、Ｌｏｔｕｓ、ダイスｆｓｏｙｂ ｅａｎ　）またはＤｏｌｉｃｈｏｓｌのレクチンに結合したＨ　、ｃｏｎｔｏｒ ｔｕｓ膜のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００抽出物中の成分の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる 比較を示す。

等量のＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ膜のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００抽出物を、次のア ガロース−結合物を過剰に含むカラムに通した。１）ピーナツ、２）ＶＩＣｉａ 　ｖｉｌｌｏｓａ　、３）Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｎｏｇｌｏｂｕｌｕｓ　、４ １ダイズ、または５）　Ｄｏｌｉｃｈｏｓ　ｂｉｆｌｏｒｕｓ　０結合した材料 を適切な糖（表２）で溶離し、還元せずに５ｔアクリルアミドゲルにかけた。ト ラックには同じ順に番号をつけた。

図７は、ビオチン化レクチンのパネルへのＨ−ｇａｌ−ＧＰサブ成分の結合を示 す。

Ｈ−ｇａｌ−ＧＰを１０−ゲル上で還元性条件下に電気泳動し、イモピロン膜に プロットした。プロットを多数のストリップに切断し、次いで下記のビオチン化 レクチンとともにインキュベートした。１　なしく陰性コントロール）；２　コ ンカナバリンＡ；３　レンズマメ；４　麦芽；５　ピーナツ；６　エントウ；７ 　ダイス；８　サクノニル化麦芽；９　マイマイ　（ｈｅｌｉｘ　ｐｏｎ＋ａｔ ｉａ）。ストリップ１０はタンパク質についてクーマン−ブルーで染色した。

図８は、基質としてのアゾカゼインでの最適ｐＨを示す（横軸はｐＨを示し、縦 軸は４０５　ｎｍにおける吸光度を示す＝・Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ　、ムＯｃ−ｇａ ｌ−ＧＰ　。

＋　Ｏｏ−ｇａｌ　−ＧＰ　）。

図９は、基質としてのヘモグロビンでの最適ｐＨを示す（横軸はｐＨを示し、縦 軸は５６２　ｎｍにおける吸光度を示す：・Ｈ−ｇａｌ−Ｇｌ’　、ムＯｃ−ｇ ａｌ−ＧＰ　。

＋　Ｏｏ−ｇａｌ　−ＧＰ　）。

図１Ｏは、ピーナツレクチンへのＨ−ｇａｌ−ＧＰ複合体の結合を示す（１０％ ゲル、還元性条件）。

トラックｌ　ピーナツレクチンカラムにかけたＨａｅｍｏｎｃｈｕｓのＳ３抽出 物 トラツク２〜５　０．３Ｍ　ガラクトースでカラムから溶離したピークのフラク ション 図１１は、エントウレクチンへのＨ−ｇａｌ−ＧＰ複合体の結合を示す（１０＆ ゲル、還元性条件）。

トラック１　エントウレクチンカラムにかけた材料（麦芽レクチンに結合し、か つこれから溶離したＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ　５３のフラクション）トラック２　 結合しないフラクション−ＨｌｌｏＤに富むトラック４〜７　０．８Ｍ　ガラク トースでカラムがら溶離したピークのフラクション 注：　出発材料中の主バンドはＨｌｌＯＤである。これはエントウとは結合せず 、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰの１３０　ｋｄ酸成分これは結合する）よりも僅かに小さい ような条件下でのみ識別することができる。

図１２は、ペプスタチンアガロースへのＢ−ｇａｌ−ＧＰの選択的結合を示す（ １（ｎゲル、非還元性条件）。

トラック１　低いｐＨ（５，５）でペプスタチンアガロースにかけたＨａｅｍｏ ｎｃｈｕｓ　５３ トラック２　ＨＩＩＯＤに富んだ結合しない材料トラック３　ｐＨ８，５で溶離 した材料トラック４　１　％　ＳＯ５、ｐＨ７，４”’Ｃ溶離シ＋’Ｊｔ料トラ ック５　Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ　（陽性コントロール）図１３は、ペプスタチンアガ ロースへのＨ−ｇａｌ−ＧＰの選択的結合、および４７および５０　ｋｄバンド の活性を示す（抗−Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ血清でプローブした非非還元性条件での１ ０％ゲルランからの免疫プロット）。

トラックｌ　ＨｌｌｏＤに富んだ結合しない材料トラック２　ＰＨ８，５で溶離 した材料トラック３　１％ＳＤＳ　、　ｐＨ７，４で溶離した材料トラック４　 １　％　５０５溶離工程にペプスタチンアガロースになお結合してる材料（カラ ムを充填せず、ＳＤＳと渭とを含むＳＤＳ　ＰＡＧＥサンプル緩衝液とともにア ガロースを沸騰することによって放出されたもの） トラック５　Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ　（陽性コントロール）図１４は、蛍光標識した ピーナツレクチンで染色されたＨ、Ｃ０ｎｔＯｒｔｕ８のクリオスタソト切片を 示す。

スタット切片を示す。

図１６は、抗−Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ血清で染色されたＨ、ｃｏｎｔｏｒｔｕｓのク リオスタット切片を示す。

図１７は、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰで免疫したヒツジから回収され、ヒツジ免疫グロブ リンに対して特異的な抗血清で染色されたｕ、ｃｏｎｔｏｒｔｕｓのクリオスタ ット切片を示す。

図１８は、Ｈ，Ｃ０ｎｔＯｒｔｕＳ　膜のＰＢＳ　（３１１、Ｔｖｅｅｎ　（５ ２）およびＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（８３１抽出物中のＨ−ｇａｌ−ＧＰ分布 を示す。

トラック３．２およびｌはその順で、虫の同じバッチからのＰＢＳ％’ｒｗｅｅ ｎおよびＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００抽出物を含む。サンプルを還元し、１０％ゲ ル上で電気泳動し、プロットし、周期的に処理して炭水化物基を変性し、Ｈ−ｇ ａｌ−ＧＰに対する抗血清でプローブした。

図１９は、麦芽レクチンへのＨ−ｇａｌ−ＧＰおよびＨＩＩＯＤの結合を示す（ １ｏ１ゲル、還元性条件）。

トラック１　カラムにがけたＨａｅｍｏｎｃｈｕｓのｓ３抽出物トラック２〜８ 　ビークについて０．５ＭＮ−アセチルグルコサミンで溶離したＨＩＩＯＤおよ びＨ−ｇａｌ−ＧＰに富んだ連続フラクション図２０は、ペプスタチンアガロー スへのＨ−ｇａｌ−ＧＰの結合を示す（５１または１０％アクリルアミドゲル、 非還元性条件）。

トラックｌ　ペプスタチンアガロースカラムにかけたＨ−ｇａｌ−ＧＰ）　ラッ ク２　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＩ、５０ｍＭ　ＮａＣ１ｐｔｉ　ａ、ｏ中ノ １１５Ｄｓニよリカラムから脱着した材料 図２１は、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰの加水分解活性の基質ゲル分析を示す。基質として ０．１１ゼラチンを含む７．５％非還元性アクリルアミドゲルのクローズアップ 図である。

トラック１　ペプスタチンとともに前インキュベートしたＨ−ｇａｌ−ＧＰトラ ック２　未処理のＨ−ｇａｌ−ＧＰ図２２は、実施例７に記載のヒツジの保護実 験に用いられる免疫原を分別するためのプロトコールを示す。

図２３は、実施例７の実験１の結果を示す。グループの平均糞中卵数　・麦芽（ １）、ムコントロール（２）（横軸は感染後の日を示し、縦軸は卵／ｇ　（＋／ −ｓＥｌを示す。） 図２４は、実施例７の実験２の結果を示す。グループの平均糞中卵数　・Ｈｌｉ を除去した麦芽（３）、ムレクチン非結合（４）、＋コントロール（５）（横軸 は感染後の日を示し、縦軸は卵／ｇ　（＋／−ｓＥｌを示す。）図２５は、実施 例７の実験３の結果を示す。グループの平均糞中卵数　・Ｈｉｌ（６ｉ　、ムピ ーナツ（７）、＋コントロール（８）（横軸は感染後の日を示し、縦軸は卵／ｇ 　（＋／−ＳＥ）を示す。）図２６は、実施例７の実験４の結果を示す。グルー プの平均糞中卵数　・天然（９）、ムコントロール＋１２１　、＋　ＳＤＳ　（ １０１、◇ＳＤＳ＋渭（１１１（横軸は感染後の日を示し、縦軸は卵／ｑ　（＋ ／−ＳＥＩを示す。）図２７は、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰと、Ｑ、ＣｉｒＣｕｍｃｉｎ ｃｔａおよびＯ，ｏｓｔｅｒｔａｇｉからの等価なタンパク質との間の類似性を 示す。　サンプルを５％非還元性アクリルアミドゲル上で電気泳動し、イモピロ ン膜にプロットした。左のプロットは、ビオチン化ピーナツレクチンでプローブ され、右のプロットは、抗−Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ血清でプローブされた。抗血清で プローブされたプロットは、５０關過沃素酸塩とともに前インキュベートして、 可能な交叉反応性の炭水化物エピトープを変性させた。

正常血清とともにインキュベート下コントロールプロットでは、着色が観察去れ なかった。

トラックｌ　Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ Ｐ２Ｓ５、ペプスタチンアガロースへのＯ，ｃｉｒｃｕにｉｎｃｔａ−ｇａｌ− ＧＰの結合を示す。

ペプスタチン、ピーナツレクチンまたはＤｏｌｉｃｈｏｓレクチンに結合したア ガロースビーズを入れた試験管に、等量のＯ，ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ−ｇａ ｌ−ＧＰを加え、これらの試験管を４℃で３時間穏やかに攪拌した。ビーズをペ レット化し、未結合の上澄み液を保持した。３回洗浄した後、ビーズを最少体積 のＳＯ８ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で煮沸し、ペレット化した。アガロースに結 合した材料を含むこの工程からの上澄み液を、未結合上澄み液と一緒に、非還元 性５％ＳＤＳ　ＰＡＧＥゲル上で走らせ、イモピロン膜にプロットし、ビオチン 化ピーナツレクチンでプローブした。

結果は、Ｏ，ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ−ｇａｌ−ＧＰが、ピーナツレクチンお よびペプスタチンに特異的に結合することを示した。なぜならば、これは別のリ ガンド（ｄｏｌｉｃｈｏｓレクチン）に結合されたアガロースには結合しなかっ たからである。

トラックｌ　未結合Ｄｏｌｉｃｈｏｇ トラック２　結合Ｄｏｌｉｃｈｏｓ トラック３　未結合ピーナツ トラック４　結合ピーナツ トラック３　未結合ペブスクチン トラック４　結合ペプスタチン 図２９は、Ｏ，ｃｉｒｃｕ＋ｎｃｉｎｃｔａの内在性膜タンパク質の抗原調製物 （これは後続の免疫処置実験に用いられる）の５ＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを 示す（１０％アクリルアミドゲル、還元性条件）。

トラック１　虫全体からのＯ，ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ膜のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ −１００抽出物（Ｓ３）トラック２　実施例８の実験１におけるヒツジの免疫に 用いられるＳ３のＣｏｎＡ結合フ結合シラク シタンク３　ＣｏｎＡに結合しなかったｓ３のフラクション残りのトラックは、 分子量マーカーを含んでいる。

図３０は、コントロール子ヒツジ、およびＯ，ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ内在性 膜タンパク質のフンカナバリンＡ　ｆＣｏｎＡ）結合フラクションで免役した子 ヒツジにおいて、５０００匹のＯ，ｃｉｒｃｕ＋ｎｃｉｎｃｔａ幼虫でチャレン ジした後のグループの平均糞中卵数としての結果を示す（横軸はチャレンジ後の 日を示し、縦軸は平均卵数１９（＋／−ＳＥ）を示す）。

図３１は、実施例８の実験１からのＣｏｎＡ結合フラクションのプロットを示し く５％アクリルアミドゲル、非還元性条件、ｃ−ｇａｌ−ＧＰのパーセンテージ を示す。

トラックｌ　ピーナツレクチンでプローブしたＯ、ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａの ＣｏｎＡ　Ｓ３フラクシヨン トラック２　分子量マーカー トラック３　ＣｏｎＡレクチンでプローブしたＯ、ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａの ＣｏｎＡ　５３フラクシヨン 図３２は、フルオレセイン結合ピーナツレクチンによる正常な成体０、ｃｉｒｃ ｕｍｃｉｎｃｔａのクリオスタット切片の蛍光染色を示す。

図３３は、クローンＨＧ３のヌクレオチド配列を示す。

図３４は、クローンＨＧ３の推定アミノ酸配列、およびヒト天然アミノペプチダ ーゼとのアラインメントを示す。両方の配列は、ＣＤＮＡから演鐸される。アミ ノ酸同一性の程度は３３％であり、類似性のレベルは６５％である。このアライ ンメントは、Ｕｎｉｖｅｒｘｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｃｏｎｓｉｎ　ＧＣＧパッ ケージからのＢＥＳＴＦ工Ｔプログラムを用いて作成された。

図３５は、種々の後生動物寄生虫から誘導されたゲノムＤＮＡへのクローンＨＧ ｌｉのハイブリッド化およびＥｃｏ　ＲＩでの消化を示すサザンプロットである 。

ハイブリッド化は、中緊縮条件下で行なった。

Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ複合体の説明および生化学的特性決定１　）　５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅプロフィールこの分析に使用したＨ−ｇａｌ−ＧＰ複合体は、ビーナツツレク チンアフィニティークロマトグラフィー、続いて、脱塩工程後に、モノＱ培地（ ファーマシア）によるアニオン交換クロマトグラフィーを使用する濃縮により、 成体へモンカスのトリトンｘ−１ｏｏ抽出物（下記の実施例２および図４に詳述 されている）から単離した。１００　ｍＭと３５０ｍＭのＮａＣ１の間で溶離さ れた両分を保持した。典型的な収率は、トリトンｘ−ｔｏｏ抽出物中の全タンパ ク質の約２％であり、虫１ｇ当たり約２００μ９のタンパク質に相当した。

Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ複合体を、還元しないで７．５ｔまたは１０亀ゲルで電気泳動 した場合、タンパク質プロフィールは、約４７ｋｄおよび５０ｋｄバンドの軽度 の染色対と一緒に、約２００ｋｄ以上のポリペプチドの群からなっていた（図１ １　トラック３）。しかしながら、アクリルアミド濃度を５％に低下した場合、 高分子量の物質は約２３０ｋｄおよび１７０ｋｄの二つの主バンドとして分割し た（図２）。これらは不鮮明な２０５ｋｄのポリペプチドおよび拡散染色領域に またがっていた（図２）。図１、トラック３に見られる小さいポリペプチドは、 色素前（ｄｙｅｆｒｏｎｔｌまたはその付近で分割されずに流出した。還元条件 下で、未分別Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ複合体は１０亀アクリルアミドゲルでほぼ８つの バンドに分割した。タンパク質の殆どが４５ｋｄと５０ｋｄの間で三つのバンド として分割したが、不鮮明なバンドもまた、約３３ｋｄ　、　３５ｋｄ、　３７ ｋｄ、　９０ｋｄおよび１３０ｋｄで目視できた（図１、トラック６）。

未還元ポリペプチドの組成の更なる分析（これは表１に要約されている）を、５ ％非還元ゲルからの三つの主バンド（即ち、例えば図２の２３０ｋｄ１１７０ｋ ｄおよび色素前にある）を切除し、電気溶離および濃縮後に、それらを還元条件 下で１０　％アクリルアミドで再度電気泳動にかけることにより行った（図３） 。

１７０ｋｄのバンドは約４５ｋｄおよび４８ｋｄの二つの型染色成分に明らかに 減少した（図３、トラック３）。最大のハンド４２３０ｋｄｌは一層複雑であり 、約１３０ｋｄ、９０ｋｄ、　４８ｋｄ、　４０ｋｄおよび３３ｋｄの分子量を 有するほぼ５種のサブ成分に分離された（図３、トラック２）。　”色素前”バ ンドは約５０ｋｄ　、　４７ｋｄおよび３５ｋｄの３種の成分に分割した（図３ 、トラック４）。完全Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ複合体を還元しないで７．５１または１ ０％ゲルで電気泳動にかけた場合、これらの最初の二つはまた、上記の図１、ト ラック３に記載した。

上記のバンドのタンパク質は全て、本発明のＨ−ｇａｌ−ＧＰの成分である。

＊　１　ｙ−ｑａｌ−ａｐの還元ポリペプチドおよび非還元ポリペプチドの（ｋ ｄ）の　。

（２０５）参　） （１７０番　＝　４８”、４５” １これらのポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を決定した。

Ｉこれらのバンドを実施例７のヒツジ実験５で免疫原として試験した。注：２ｏ ５および１９０−２００のポリペプチドを１画分として合わせて試験した。

それ故、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰは最低１０種の異なる成分を含むだけでなく、非還元 条件下で見られる２０５ｋｄおよび１９０−２００　ｋｄの物質を含む。

２）　バンドのうちの四つのＮ末端アミノ酸配列図３、Ｎ００３および図Ｉ　Ｓ Ｎｏ、　３と同じトラックを含むゲルを調製し、膜（プロブロット−アプライド ・バイオシステムズ）で電気泳動した。クーマシーブルーで染色した後、図１お よび図３で同定されたポリペプチドの対を含むストリップを膜から切除し、夫々 のＮ末端アミノ酸組成をアプライド・バイオシステムズ・モデル４７７Ａペプチ ド配列決定装置で決定して、下記の配列を得た。

図３、トラック３　４５ｋｄ：　Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−７ −Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ｒ、１ａｕ（配列番号３および４） ４８ｋｄ：　Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｍｅ ｔ−Ａｓｎ−（即ち−Ｇｌｕ−または−Ａｓｎ−１＋配列番号５および６）図１ ．）ラック３　４７ｋｄ：　Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−工１ｅ −Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｉｎ（配列番号７） ５０ｋｄ＋　Ａｌａ−７−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ− Ｉ、ｙｓ（配列番号８） コンピューターサーチは、種々のデータベースに保有された配列との有意な相同 性を明らかにしなかった。

３）　イオン交換クロマトグラフィー ０．１％（ｖ／ｖ）　トリトンＸ−１００を含むｌｏｍＭのトリス−ＭＣＩ　ｐ Ｈ７，４中の場合、Ｈ−ｑａｌ−ａｐ　＊台体は、同じ緩衝液で平衡化したモノ Ｑイオン交換媒体に結合する。

Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ　ｙ１合体の殆どが１４０ｍＭと４００咽のＮａＣ１の間でカ ラムから溶離された（図５ａおよびｂ）。この範囲内の塩でサブ成分に分離する 証拠は、たとえそれを小さい増加段階で適用したとしても、なかった。

４）　レクチン結合 ａ）　自然条件下 Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ複合体は、ヘモンカス膜のトリトンｘ−１００抽出物から、ア ガロースビーズのような固相に架橋された種々のレクチンを使用するアフィニテ ィークロマトグラフィーにより単離することができる（図１０および１１、並び に実施例２）。

成る種のレクチンに関する天然Ｈ−ｇａｌ−ω複合体の推定相対アフィニティー を表２に要約する。ドリチョス・ビフロラス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ　ｂｉｆｌｏｒ ｕｓ）を除いて、Ｎ−アセチルガラクトサミンに対して特異性を有するレクチン はＨ−ｇａｌ−ＧＰを選択的に保持した。ドリチョスによる陰性結果は、このア フィニティーがα結合Ｎ−アセチルガラクトサミンよりむしろβ結合Ｎ−アセチ ルガラクトサミンに対し特異性であることを示唆した。

ＣｏｎＡレクチン、エントウ豆（ｐｅａｌレクチンおよびミヤコグサ（Ｌｏｔｈ ｕｓ）レクチンもまたＨ−ｇａｌ−Ｇｐ複合体を保持したという知見は、それが マンノースおよび／またはフコースををする糖タンパク質を含むことを示した一 方、ダツラ（Ｄａｔｕｒａ）およびパンデイラエア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ　ｌ による陰性結果は、Ｎ−アセチルガラクトサミンを含む構造の欠如を示唆した（ 表２）。しかしながら、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰを保持した全てのレクチンはそれの全 てと結合し、そして図６に例示されるように、そのサブ成分に対する特異なアフ ィニティーを示さなかった。

ｂ）解離され、還元された条件下 Ｈ−ｇａｌ−ＧＰのサブ成分がグリコジル化されたことを測定するために、複合 体を還元し、ＳＤＳ　ＰＡＧＥにより解離し、プロットし、ビオチニル化レクチ ンのパネルで探査した。結果（図７）は、幾つかのレクチン（例えば、レンチル 、１ａｎｔｉ　１）がバンドの殆どに結合した一方、その他（例えば、ビーナツ ツ、ヘリックス・ボマチア（ｈｅｌｉｘ　ｐｏｍａｔｉａｌおよびスクシニル麦 芽）は更に選択的であることを示した。大豆以外の全てが１３０ｋｄバンドおよ びわずかに小さい成分を強く現し、この領域においてダブレットの印象を与えた 。幾つかの、特に、レンチル、ｃｏｎＡおよび麦芽は９０ｋｄのバンド付近で拡 散領域を染色した。その他、特に麦芽、ビーナツツ、ジャカリン（ｊａｃａｌｉ ｎｌ　、スクシニル麦芽およびヘリックス・ボマチアは、クーマシーブルーで弱 く染色された約６０ｋｄの糖タンパク質と拡散して反応した。ｃｏｎＡ、ジャカ リン、麦芽およびレンチルはまた、　５０ｋｄ　）＜ンドと非常番二強く結合し た一方、４７ｋｄバンドがレンチルのみにより現した。

表２ コンカナバリンＡ　ａ　−Ｄ−ｍａｎｎ　、　（１−ｏ−ｇｌｃ　＋＋＋　今＋ ＋　＋＋＋エントウ豆　α−Ｄ−ｍ＆ｎｎ　＋＋＋　十今　９（ピシウム・サチ バム） ドリチョス・ビフロラス　α−Ｄ−ｇａｌ　ＮＡｃダツラ・ストラモニウム　β −ｏ−ｇｌｃ（１−４）−Ｄ−ｇｌｃ　ＮＡｃ　−−表２（続き） Ｈ−ｇａｌ−（、Ｐ＋Ｈ１１０ＤまたはＨ４５に対する種々ｑ１μロース架橋レ クチンの相対−２コンカナバリンＡｏ、ｓＭＩｙ）メチルマンノシドビンア・ビ ロソサ　０．２ＭのＮ−アセチルガラクトサミンドリチョス・ビフロラス　０． 四のアセチルガラクトサミンダツラ・ストラモニウム　０．４＃）Ｎ−アセチル グルコサミン５）　プロテアーゼ活性 Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ複合体は、アゾカゼインまたはヘモグロビンを基質として使用 する場合に、４．０または６．０の夫々の最適ｐＨでプロテアーゼ活性を示す（ 図７および図８）。この活性は、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰに強く結合するペプスタチン により阻害される。この最後の性質は、アフィニティークロマトグラフィーによ りＨ−ｇａｌ−ＧＰ複合体を濃縮するのに使用し得る。

６）　等電点 Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ複合体を、ミニフｔ　−（Ｍｉｎｉｐｈｏｒ１分取フリーフロ ー装置中で線形に行なわれるｐＨ勾配（範囲２〜９のｐＨ単位）内で等電点電気 泳動にかけた。

その殆どがＰＨ２〜７．３で溶離した。この広い範囲は、可変炭水化物残基がそ の分子に電荷の均一性を導入する糖タンパク質に典型的である。

Ｈ，コントルタスからのＨ−ｇａｌ−ＧＰ複合体の二つの調製方法これらは図４ 中のフローチャートに要約されており、また実施例２および３で更に詳しく説明 する。

（ＷＯ９０／１１０８６　）により記載されたのと本質的に同様にして調製した 。

ＥＤＴＡおよび１ｍＭのＰＭＳＦを含む酸性条件または中性条件下で酢酸塩緩衝 液またはリン酸塩緩衝食塩水で４℃でホモジナイズした。ホモジネートを標準条 件で１０．０００ｇで２０分間遠心分離し、こうして形成されたペレットを０． １１のトウィーン２０で抽出し、再度回転させた。この操作を繰り返し、次にこ うして形成されたペレットを２％のトリトンＸ−４００で抽出し、標準条件で遠 心分離した。上澄み液を１００，０００ｇで１時間にわたって超遠心分離にかけ 、この上澄み液（Ｓ３）を０．２２ミクロンのフィルターに通し、緩衝液、即ち 、０．５ＭのＮａＣ１、０，０１％のＮ＆ＮＩ　１ｐＨ７，４を含む１０關のト リス−ＨＣｌで４倍に希釈した。

こうして生成された希釈上澄み液Ｓ３を、アガロースゲルに結合された種々のレ クチンを使用してレクチンアフィニティークロマトグラフィーにかけた。カラム への希釈上澄み液を適用した後、数カラム容積の緩衝液で洗浄し、次いでレクチ ン結合物質を適切な糖で溶離した。

１１種の異なるレクチンの夫々へのＨ−ｇａｌ−ＧＰ結合の相対量を、図６に例 示されたように５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで目視で分析した。表２中の結果は、数種 のレクチンがＨ−ｇａｌ−ＧＰに結合したか、β結合Ｎ−アセチルガラクトサミ ンに対し特異性を有するレクチンのみか特異的に結合し、またこれらの中でビー ナツツおよびジャカリンか最も有効に結合することを示した。Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ のサブ成分がいずれかのレクチンにより分離するという証拠はなかった（図６） 。

ビーナツツレクチンまたはジャカリンレクチンを使用して、タンパク質Ｈ１１０ ＤおよびＨ４５は、その他の物質と一緒に洗浄されたが、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ複合 体は結合されたままであった。これは、夫々ピーナツツカラムおよびジャカリン カラムから０．３Ｍまたは０．８Ｍのガラクトースにより本質的に純粋な形態で 溶離した（図１０および図１１）。

麦芽レクチンを使用すると、若干のＨＩＩＯＤか結合し、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ複合 体（これはジャカリンカラムに適用された図１１、トラックｌに示された物質で ある）で溶離した以外は、０．５ＭのＮ−アセチルグルコサミンによる溶離後に 同様の結果を得た。

低ｐＨ１高イオン濃度の緩衝液、即ち２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ＩＭのＮａＣ １、ｐＨ５，５中の上澄み液Ｓ３を、アガロースビーズに結合されたペプスタチ ンを含むカラムに通した。ＨＩＩＯＤを含むポリペプチドの殆どは、このマトリ ックスに結合し２なかった（図１２、トラック１および２）。数カラム容積のこ の酸緩衝液で洗浄した後、少量のＨ−ｇａｌ−ＧＰおよびその他のゆるく結合さ れた物質を、ｐＨを８゜５に上昇することにより溶離した。次いでカラムを低１ 度の高度荷電界面活性剤（例えば、１％のドデシル硫酸ナトリウム　−５ＤＳ） を含む緩衝液で溶離した場合１．溶離されたポリペプチドのプロフィールはＨ− ｇａｌ−ＧＰに非常に似ていたが、１０亀の非還元性ゲルで約４５ｋｄで通常観 察されるバンドの対が消失した（図１２、トラック４）。カラムを充填せず、ま たアガロースのアリコートをジチオスレイトール＋　ＤＴＴ　）の存在下で５％ のＳＤＳとともにインキュベートした場合、これらの消失バンドにつき濃縮され た両分か溶離され、これらの保持が非常に結合活性であることを示唆した（図１ ３、トラック４）。プロテアーゼ活性は溶離物質中に検出し得ず、この酵素がＳ ＤＳの存在下で機能的でないことを示した。

コントロール実験を行い、これにより、上記の酸洗浄段階後にアガロースをカラ ムから除去し、緩衝液単独で、または２％までのデオキシコレートもしくは０゜ １亀までのＳＤＳを含む緩衝液で繰り返し遠心分離および再懸濁することにより 洗浄した。これらの処理のいずれもが、有意な量のＨ−ｇａｌ−ＧＰをアガロー スから除去せず、この現象がカラムの上部における不溶性タンパク質の物理的閉 じ込めによるためだけではないことを示した。Ｈ−ｇａｌ−ＧＰが成る種のレク チン−アガロースカラムに結合しなかったという知見（表２、トラック５、図６ ）は、ペプスタチン−アガロースへの結合がリガンド特異的であるという付加的 な証拠を与えた。

実施例４ Ｈ−ｇａｌ−ＧＰがヘモンカス・コントルタス腸細胞の刷子縁表面に位置し、そ こではＨ−ｇａｌ−ＧＰが膜内在性糖タンパク質であるという証拠（ａ）　腸管 刷子線配置 １）成体Ｈ，コントルタスのクリオスタット切片を蛍光標識レクチンのパネルで 染色した。ビーナツツレクチンおよび麦芽レクチンの両方が腸刷子縁を選択的に 染色することがわかった（図１４および図１５）。幾つかのレクチン（例えば、 ＣｏｎＡ）は殆どの構造を染色したが、その他（例えば、ウレックス、υ１ｅｘ ）は殆どまたは全く染色しなかった。この結果は、腸細胞の刷子縁が、ヘモンカ スの他の解剖学的構造よりも極めて高い密度の麦芽レクチンおよびビーナツツレ クチン結合部位を含むことを示す。Ｈ−ｇａｌ−ＧＰはビーナツツレクチンおよ び麦芽レクチンに結合するので、おそらくこの糖タンパク賀は腸細胞の刷子縁に 存在している。

λ１）　成体Ｈ，コントルタΔのクリオスタノト切片を、フロイント完全アジュ バント中の１４−ｇａｌ−ＧＰで免疫されたヒツジまたはアジュバントのみを注 射したコントロールヒツジからの血清とともにインキュベートした（詳細は実施 例７、実験３および４参照）。充分に洗浄した後、切片を、ヒツジ免疫グロブリ ンに特異的なフルオレセインイソチオシアネート接合ウマ抗体とともにインキュ ベートした。

更に洗浄した後、切片を蛍光顕微鏡で見た。

抗Ｈ−ｇａｌ−ＨＰ血清とともにインキュベートされた切片は、表皮下層だけで な（腸刷子縁膜の特有の蛍光を示した（図１６）。特をの染色は、コントロール ヒツジからの血清で染色された切片では観察されなかった。これらの結果は、Ｈ −ｇａｌ−ＧＰがヘモンカスの刷子縁膜および皮下組織中に位置してることを示 す。

１１１）　クリオスタソト切片を、フロイント完全アジュバント中のＨ−ｇａｌ −ＧＰで免疫されたヒツジまたはアジュバントのみを注射したヒツジから回収さ れた成体二モンカスから調製した（実施例７、実験３および４参照）。

切片を、ヒツジ免疫グロブリンに特異的なフルオレセインイソチオシアネート接 合抗体とともにインキュベートした。充分に洗浄した後、これらを上記のように 蛍光顕微鏡で見た。

Ｈ−ｇａｌ−ＧＰによる免疫感作で生存した虫の切片の全部ではないが幾つかは 、特有の蛍光を示した。これは腸細胞の刷子縁に制限された（図１７）。染色は 、コントロールヒツジからのへモノカス切片では観察されなかった。

この結果は、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰによる免疫感作で生存した幾つかの虫が、それら の腸細胞刷子縁膜を被覆するヒツジ免疫グロブリンを有することを示した。それ 故、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰはこの膜に位置している必要がある。先の項目に記載され た“インビトロゝ実験で観察された表皮下の染色は、見られなかった。おそらく 、”インビボ”宿主免疫グロブリンは、寄生虫解剖のこの部分と接触しないから である。

ｂ）膜内在性糖タンパク質 虫全体のＰＢＳ抽出物、トゥイーン抽出物およびトリトンＸ−１００抽出物を含 む過ヨウ素酸塩処理したプロット（即ち、図４に記載されたようなＳｌ、Ｓｌお よびＳ３の夫々）を、実験３で産生じた抗Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ血清で探査した場合 、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰはトリトンＸ−１００抽出物中でのみ検出された（図１８） 。この結果は、比較的に高感受性の技術により、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰが可溶性細胞 質タンパク質または膜周辺タンパク質として存在するのではなく、むしろそれが 細胞膜からそれを放出するトリトンＸ−４００の作用を必要とすることを推測さ せた。

この結果は、表２に要約されたレクチン結合特性と一緒に、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰが 膜内在性糖タンパク質であるという充分な証拠を与える。

実施例５ Ｈ−ｇａｌ−ＧＰＰ合体がタンパク質ダブレットＨ１１０Ｄ　（ＷＯ９０１１０ ８６１、タンパク質複合体Ｈ４５（ＷＯ９０／１１０８６）　、４５ｋｄの膜タ ンパク質＋ｗｏ９２／Ｄ８８９）または腺維素溶１）　レクチン結合 成る種のレクチンに対するＨ−ｇａｊ、−ＧＰＰ合体、ＨＤｌｌｏＤおよび８４ ５複合体の推定された相対アフィニティーを表２に要約する。これらのいずれに も結合しなかったドリチョス・ビフロラスを除いて、Ｎ−アセチルガラクトサミ ンに対し特異性を有するレクチンはＨ−ｑａｌ−ＧＰＰ合体を保持したが、ＨＬ ＩＯＤまたはＨ４５複合体を保持しなかった。

１λ）　等電点 Ｈ−ｇａｌ−ＧＰＰ合体は、）ＩＩＩＯＤまたはＨ４５複合体よりも低い等電点 を有し、イオン交換クロマトグラフィーによりそれらから分離し得る。例えば、 Ｈ４５複合体は、０．１％（ｖ／ｖ）のトリトンｘＬ１ｏｏを含む１０ｍＭのト リス−ＨＣｌ　ｐＨ７，４で平衡化したモノＱに非常に少量しか結合せず、Ｓｍ １ｔｈ　、　ＭｕｎｎＳＧｒａｈａｍ。

Ｔａｖｅｒｎｏｒ　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ　（Ｉｎ−ｔｅｒｎａｔｉｏｎ ａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｆｏｒ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ@１９９３ ２３２７１−２８０１の結果が確認された。保持された小部分は５０ｍＭのＮａ Ｃ１でＨＩＩＯＤの前に溶離し得た。全てのＨｌｌｏＤは２００　ｍＭのＮａＣ １で脱着され、これはＨ−ｇａｌ−ＧＰＰ合体の殆どが溶離し始める前である。

１ｉｉ）　５ＤＳ−ＰＡＧＥプロフィール還元腰または還元せずに走行させた場 合に１１０ｋｄで変化すないで残ったＨ１１０ｏダブレット（図１、トランクｌ および４））は、両方の状況（図１１　トラック１ｖｓ３およびトラック４ＶＳ ６）でＨ−ｇａｌ−ＧＰ復会合体は明らかに異なっていた。しかしながら、還元 はＨ４５複合体のプロフィールを有意に変化させた（図１、トランク２ｖＳ５） ので、それとＨ−ｇａｌ−ＧＰＰ合体の相違は、試料を還元して較するよりも（ 図１、トラック５ＶＳ６）、還元しないで比較する場合に（図１．トラック２Ｖ Ｓ３）、更に顕著であった。

ｉｖ）　ペプスタチン結合 ＨＩＩＯＤまたはＨ４５のいずれもが、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰＰ合体が強く付着する 媒体であるペプスタチンアガロースに結合しない（図１２および１３）。

ｂ）−一≦ｕ℃■（コを拓と竺Ｌ」墜星」ｌヱユづｐＪＡｌ）　レクチン結合 自然条件下でＨ−９ＪＬｌ−ＧＰ復会合体麦芽レクチンに結合する（表２、図１ ９）。

Ｗ０９２／１３８８９において探究された保護抗原は、このレクチンに結合しな かった。

これは４５ｋｄの膜タンパク質を精製するために本発明者らにより特別に使用さ れた性質である。

１工）　Ｎ末端アミノ酸配列 ＷＯ９２／１３８Ｂ９において４５ｋｄの膜タンパク質につき公表されたＮ末端 アミノ酸配列は、実施例１、バート２に記載されたＨ−ｑａｌ−ＧＰＰ合体の４ ５ｋｄ　、４７ｋｄ。

４８ｋｄまたは５０ｋｄの成分に関する相当するデータに近似しなかった。

１１１）変性された抗原の保護能力 Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ複合体は、ＳＤＳによる解離およびジチオスレイトールによる 還元後に変性された場合でさえも、ヒツジに対する保護を保持した（実施例７、 実験４および５参照）。Ｗ０９２／１３８８９に記載された４５ｋｄの膜タンパ ク質は、変性された形態でモルモットで試験した場合に、その保護抗原能力を失 った。

ｃｌ　Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ復会合体線維素溶解プロテアーゼとの相違ｌ）基質特異 性 Ｃｏｘ　、　Ｐｒａｔｔ　、　Ｈａｇｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｂｏｉｓｖｅｎｕｅ　 （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰａｒａｓｉ−ｔｏｌ ｏｇｙ　１９９０　４１　、２５−３４１は、ヘモノヵスからの線維素溶解プロ テアーゼを記載し、二つの小さなヒツジ試験からの説得力のないデータ（Ｃｏｘ 　。

Ｇ、Ｎ、、　Ｍｉｌｈａｕｓｅｎ　Ｍ、　ａｎｄ　Ｈａｑｅ＋ｎａｎ　Ｒ，１９ ９０欧州特許出願第４３４９０９号）にもかかわらず、このプロテアーゼが保護 抗原ポテンシャルを有すると主張した。

Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ複合体はフィブリノーゲンに対してタンパク質分解活性を示さ なかった（表４および実施例６ｖ参照）。

ｉｉ）溶解性 Ｃｏｘ　ｅｔ　ａｌにより１９９０に記載された線維素溶解プロテアーゼは、ヘ モノカスの生理食塩水抽出物から得られた。これとは対照的に、Ｈ−ｇａｌ−Ｇ Ｐ複合体は生理食塩水抽出物中に検出されず、しかもトリトンＸ−１００の如き 界面活性剤によってのみ、寄生虫から抽出し得た（図４．５）。

ｌ）最適ｐＨ 予備試験において、ビーナツツレクチンにより精製されたＨ−ｇａｌ−ＧＰは、 アゾコラーゲンに優先してアゾカゼインを加水分解することがゎがった。この活 性に最適のｐ）ｌを、オーバーラッピング０．１助酢酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝 液またはトリス緩衝液を使用してｐ）！範囲４〜９にわたって測定した（図８） 。最適活性はｐＨ４，５〜６．５で見られた。

１工）阻害剤感受性 ブロティナーゼ活性の阻害剤感受性を、ビーナツツレクチン精製Ｈ−ｇａｌ−Ｇ Ｐの４種の別個の調製物で試験した。酵素活性は、試験した全ての調製物におい てペプスタチンにより殆ど完全に阻害され、タンパク質分解がアスパルチルプロ テアーゼによるものであることを示した（表３）。

凱−Ｈ−ｇａｌ−Ｇｐ並びに０．サーカムシンクタ　（ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔ ａ　）およびｏ、＋剤感受性 ＰＭＳＦ　セリン（チオール）　１００　１０４　８４Ｅ６４　チオール　８７ ．８　１０１　１（ｎＥＤＴＡ　メタロ　９７．８　ＮＤ　ＮＤｌｌｌ）ペプス タチンアガロースにおけるアフィニティークロマトグラフィーＨ−ｇａｌ−ＧＰ 　（実施例１の項目ｌに記載されたようにして精製された）を、脂のＮａＣ１お よびＯ，ｉｔ　ｖ／ｖの還元トリトンＸ−１００を含む２５ＩＴＩＭの酢酸ナト リウム緩衝液、ｐＨ４，５で平衡化したペプスタチンアガロースのカラムに通し た（Ｄｏ　ｅｔａｌ　１９８７．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６２１０３ ７−１．０４３１　、４．５−１０のｐＨ範囲にわたって徹底的に洗浄すると、 タンパク質は殆ど脱着しなかった。しかしながら、１％のＳＤＳで溶離すると、 Ｈ−ｇａｌ−ＧＰの大部分が脱着した（図２０）。Ｈ−ｇａｌ−ＧＰは“天然コ ントロール”リガンド（例えば、ドリチ３スレクチン）にカップリングされたア ガロースに結合しなかった。この結果は、先の実施例３に記載された結果と一緒 に、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰがペプスタチンに対して強い特異性を有することを示し、 これは古典的にはアスパルチルプロテアーゼの特徴であり、膜メタロエンドペプ チダーゼについてはそれ程の特徴ではない（Ｚｏｌｌｅｒ、　Ｈ１９９０１Ｈａ ｎｄｂｏｏｋ　ｏｆｅｎＺｙＩＴｌｅ　１ｎｈｌｂｌｔｏｒｓ、　ＶＣＨ＋　Ｗ ｅｌｎｈｅｌｍ、ドイツにより発行）。５亀またはｉｏ＆の非還元性ゲルにおけ るＨ−ｇａｌ−ＧＰのプロフィールは、ペプスタチンアガロースとの結合の前後 で同じであった（図２０）。この結果は、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰがペプスタチン結合 プロテアーゼの混合物である多量体酵素複合体またはこれらの酵素との前駆体と の混合物であることを示唆する。

ｉｖｌ　基質ゲル分析 Ｈ−ｇａｌ−ＧＰをペプスタチンの存在下または不在下でブレインキュベートし 、非還元条件下で０．１％　ｗ／ｖのゼラチンを含む７．５１の５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅゲルで分離した。

電気泳動後に、ＳＤＳを過剰のトリトンＸ（００中で洗浄することにより溶離し 、ゲルをリン酸塩緩衝液、ｐＨ６，０中で３７℃で一夜インキユベートした。タ ンパク質分解の領域をクーマン−ブルー逆染色により視覚化した。

結果は可変であったが、一つの場合に、タンパク質分解はＨ−ｇａｌ−ＧＰ複合 体の多量の高分子量バンドと約４５ｋｄの少量成分との両方に相関関係があった 。活性の全ての領域がペプスタチンに感受性であった。別の場合に、活性は複合 体の１７０　ｋｄのバンドのみに局在化されることが明らかであり、ペプスタチ ンにより明らかに阻害された（図２１）。アスパルチルプロテア−ゼのこの可変 の視覚化は以前に記載されており、基質としてのゼラチンに対する比較的不十分 なアフィニティーのためであると考えられる　（Ｓｉｍｋｉｎ、　Ｋ、Ｇ、、　 Ｃｈａｐｍａｎ、　Ｃ，Ｒ，ａｎｄＣｏｌｅｓ、　Ｇ、Ｃ，１９８０，Ｅｘｐｅ ｒｉ＋ｎｅｒ＋ｔａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　４９．２８１−３８７）。

従って、おそらく、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰは、非還元条件下で観察された複合体の全 てのバンドと関連するアスパルチルプロテア−ゼ活性を有スル。

■）天然血液タンパク質に対するＨ−ｇａｌ−ＧＰのアフィニティーＨ−ｇａｌ −ＧＰを、等容積のＩＭの過ヨウ素酸の添加による未消化タンパク質の沈殿の前 に、フィブリノーゲン、アルブミンおよびヘモグロビン、並びにアゾカゼインと ともにインキュベートした（緩衝液、ｐＨ５，５中で全て１ｍｇ／ｍｌ）。タン パク質分解を、ニンヒドリンアッセイ　（Ｍａｔｈｅｗｓ、　Ｂ、Ｅ、　１９７ ７、　Ｓｙ−ｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｆＢｒｉｔｉｓｈ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｐ ａｒａｓｉｔｏ３．ｏｇｙ　１５：　１０３−１１９）を使用して放出された遊 離α−アミノ窒素の検出により監視した。

結果は、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰがヘモグロビンに対し明確な特異性を有すること（表 ４）、およびこの活性の最適ｐＨが４．０であること（図９）を示す。

表土−天然血液タンパク質およびアゾカゼインに対するＨ−ｇａｌ−ＧＰのアフ ィニティー 蚤！　タンパク質分解（５６３ｎｍにおける吸光度）フィブリノーゲン　０．０ ０ ヘモグロビン　５．１２ アゾカゼイン　０．５５ ｖｉ）　免疫ヒツジからの血清によるＨ−ｇａｌ−ＧＰタンパク質分解活性の阻 害実施例７、実験３に記載されたようにしてＨ−ｇａｌ−ＧＰまたはアジュバン トで免疫された子ヒツジからの血清をＨ−ｇａｌ−ＧＰの等しいアリコートとと もにインキュベートシた。続いて、基質としてアゾカゼインを使用して、これら の混合物をタンパク質分解活性につきアッセイした。結果（表５）は、Ｈ−ｇａ ｌ−ＧＰによる免疫感作がＨ〜ｇａｉ−ＧＰのタンパク質分解活性に対して、お そらく抗体による特異的な阻害応答を誘発することを示唆する。

表呈−Ｈ−タａ、１−ＧＰの免疫血清阻害コントロール子ヒツジ　０２ 免疫子ヒツジＡ　５８　５５ 免疫子ヒツジ１３　５１　５９ 実施例７ Ｈ−ｇａ】、−ＧＰで免疫されたヒツジがヘモノカス・コントルクスによる抗原 投与に対ふて保護されるという証拠 一連の保護試験を、Ｈ，コントルクスの種々のフラクションを用いて行った。五 つの実験においてヒツジの夫々の群のための免疫原を調製するのに使用されたス キームを要約する工程系統図を、図１１に示す。

保護実験の設計 ヒツジの１９の群を伴う五つの免疫感作抗原投与試験を、以下に概説される日付 順に行った。夫々の実験中に、群を性別および体重につきバランスさせた。

夫々の群の計画サイズは、６匹または７匹であったが、群９および１０の夫々で １匹のヒツジか尿結石で抗原投与前に死亡した。各の群を免疫するのに使用した 抗原を表６および図２２に示す。各ヒツジを等しい投与量のタンパク質で、また は全てのコントロールの場合にアジュバント＋生理食塩水のみで３回免疫し、全 てにｓ、ｏｏｏのＨ，コントルタ各幼虫を抗原投与した。フロイント完全アジュ バントをずっと使用し、各接種物を１ｍｌまたは２ｍｌの投与量として夫々の後 肢に筋肉内投与した。子ヒツジの年齢およびイベン！・の時期は、表７に詳しく 記載されたように、実験間でわずかに変化した。

実験ｌ 目的は、生膜全体のトリトンＸ−１００の抽出物の麦芽レクチン結合画分の保護 能力を評価することであった。

この免疫原は、抗原投与コントロールヒツジで観察された糞便の卵数を抑制する のに非常に有効であった（図２３）。同様に、免疫群は屠殺時に、コントロール よりも有意に少ない虫を含んでおり、正常よりも有意に高い雄対雌比であった（ 表６）。

この結果は、麦芽レクチン結合画分がモルモットを不十分に保護したＷＯ／：１ ３８Ｂ９の実験に記載された結果と対照的であった。この相違は、使用した抗原 投与系の型の相違、またはそのバルクが麦芽に結合しないＨｌｉＯＤ　（図１９ ）が実際にＷＯ７１３８８９の実験での主たる保護成分であったという事実を反 映しているかもしれない。

雌へモノカスが雄よりも免疫感作の効果を受け易かったという知見は、他の腸管 膜抗原実験（例えば、Ｓｍ１ｔｈ、　１９９３　Ｒｅｓ　Ｖｅｔ　Ｓｃｉ　５４ ９４−１ｏｌｌで以前に報告されており、また離去は雄よりも大きいので速い速 度で血液を摂取し、それ故、高い投与割合で有害抗体を受容するるという事実の ためであると考えられる。あるいは、この知見は、雌の同化要求が、産卵のため に、それらを栄養採収酵素のブロックを受け易くするという事実のためであるか もしれない。回収した虫の性別比の測定は、この方法により成功した免疫感作に より生じた効果を検出するための有益な付加的なパラメーターを提供する。

寒竺又 群１に使用された麦芽結合画分は、ヘモノカスに対し非常に保護することが既に 示されているタンパク質であるＨＩＩＯＤを若干含むことが知られているので（ Ｍｕｎｎ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ　１９９０）　、主目的は、イオン交換クロマト グラフィーによりＨｌｌＯＤを除去した麦芽結合画分を試験することであった。

非グリコジル化保護膜タンパク質の可能性を調べるために、第二の群を、麦芽レ クチンまたＪｊ　ＣｏｎＡレクチンに結合しない画分て免疫した（図２２）。

両方の免疫群はコントロールよりも一貫して低い平均卵数を有して（Ａたカー（ 図２４）、麦芽群の場合にのみ、殆どのサンプリング日に有意な相違があった。

（＼ｒれの免疫群も、コントロールよりも有意に少ない虫を含んで％’ｔなかっ た力（、麦芽群において感染度（ｂｕｒｄｅｎ）は、離去よりも有意に多（１雄 虫力）らなって０た（表６）。

コントロールヒツジの群平均卵数および束数は、この実験では他の４つの試験の コントロール値と較べて有意に少なく（図２４　ｖｓ　２３．２５、および２６ 並び（こ表６）、２匹の動物が非常に少数を有していた。この大きな変化（これ （よおそらく年齢の高いヒツジの使用を反映した）は、群３に与えられた保護の 重要性（もしあるとすれば）の評価を困難にし、反復実験を要求する状況であっ た。

大舅、！− それ故、目的は、更に若く更に一様に感受性の子ヒツジにおけるＨＩＩＯＤを含 まない麦芽結合画分の効力を再試験することであった。その間ζこ、同じ画分を 、ビーナツツレクチンによるアフィニティークロマトグラフィーによって更喜こ 簡単に生産し得ることかわかった（図２２）。なぜならば、このリガンド（よ検 出できるＨｌｌｏＤと結合しなかったからである。従って、ピーチ・ソツ結合画 分（即ち、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ　）およびＨＩＩＯＤの保護能力をこの実験で比較 した。

免疫子ヒツジの両方の群の糞便の卵数は、コントロールと較べて大きく減少しく 図２５）、異常に高い雄対雌の性別比を有する有意に少な（為虫力く回収された （表６）。

Ｘ線↓ 目的は、天然Ｈ−ｇａｌ−ＧＰで得られた保護結果を確かめ、かつその複合体が 解離状態、または還元され解離された状態にあるときに保護性を保持するか否か を決定することであった。

従って、Ｈ−ｇａｌ、−ＧＰのアリコートを０．５％のＳＤＳ　（２，５：　１ ｗ／ｗ　ＳＤＳ　＋タンパク質）とともに２５℃で１時間ンキュベーとすること により解離した。第二の同一アリコートを、還元剤としての２．５　＋ｎＭのジ チオスレイトール（請）と組み合わせた同量のＳＤＳにより１００℃で５分間解 離するごとにより変性した。群１０および１１を、これらの各方法で処理したＨ −ｇａｌ−ＧＰで免疫した一方、群９は天然Ｈ−９ａｌ−ＧＰの同一ではあるが 未処理のアリコートを投与した（表６）。

糞便中の卵排出量および束数の両方の非常に有意な減少が、全ての３つの免疫群 （図２６７表６）とコントロールとの間で観察されたが、この効果は天然群およ びＳＤＳ単独群で最も顕著であった。前記のように、離去は雌虫よりも免疫感作 効果に対して感受性であった。Ｈ−ｇａｌ−ＧＰの保護エピトープは、５０ｇに よる複合体の解離によって、またはＳＤＳで解離され謂により還元された場合の 変性によっては大きく影響されないことが結論された。この結果は、ＷＯ９２／ Ｄ８Ｂ９において４５ｋｄの膜糖タンパク質で得られた結果とは対照的であり、 しかもＨ−ｇａｌ−ＧＥ’のサブユニットポリペプチドがＳＤＳアクリルアミド ゲル上でのそれらの分離およびそれからの抽出後に、個々に試験し得ることを示 唆した。

寒見盈 それ故、目的は、非還元性５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されたＨ−ｑａｌ−ＧＰ の種々のポリペプチドサブ成分の保護抗原ポテンシャルを試験することであった 。

群１３および１４を、先に実験４に記載したとおりにＳＤＳで解離されたＨ−ｇ ａｌ−ＧＰ複合体５００μｑおよび２００μ９で夫々免疫した。群１５〜１８を 、複合体が非還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された後に５％のゲルか ら切除されたＨ−ｇａｌ−ＧＰの個々の成分で免疫した（図２２）。図２に示さ れるように、群１５には２３０　ｋｄのバンドを注射し、群１６には拡散１９Ｇ −２０５ｋｄの領域を注射し、群１７には１７０　ｋｄのバンドを注射し、群１ Ｂには色素前バンドを注射した（図２）。適切なバンドを含むゲル切片を適当な 容積の希釈剤中に再懸濁させ、等容積のアジュバントでホモジナイズした。分別 したＨ−ｇａｌ−ＧＰの量を計算し、その結果、これらの各ポリペプチドをＨ− ｇａｌ−ＧＰ　ｓｏｏμ９中に存在する量に相当する投与量（即ち、群１３に相 当）で群１５〜１８に投与した。抗原投与コントロール群（群１９）はアジュバ ントのみで免疫された。

１匹の動物（ヒツジ４）を除いて、ＳＤＳ解離Ｈ−ｇａｌ−ＧＰで免疫された陽 性コントロール群の両方が抗原投与感染に対し保護された。これは、コントロー ルと較べて減少された卵数および束数、並びに雄虫比率の増加により示された。

ヒツジ４を計算から除外すると、群１３に関する保護の数値は、虫７９％および 卵８７１であった（日数１８〜３５の平均数）。群１４に関して、相当する結果 は虫７０１および卵８４％であった。群１４に用いた減少された投与量は差を生 じないこと、また群１３に関する結果は上記の実験４で得られた結果と同様であ ることが結論された。

極めて大きい個々の変化が、）ｌ−ｇａｌ−ＧＰの種々のサブユニットバンドで 免疫された群で見られた。しかしながら、これらの結果は、保護がゲルから切除 された個々のサブユニットバンドで得られることを示した。これらの中で、群１ ６（１９０−２０５ｋｄ拡散）および群１８（色素前）が最良に保護された。

最良のサブユニット群における保護は、複合体全体で免疫された保護の場合より も一貫性が少ないようであった。これは、電気泳動分離の方法が保護エピトープ を若干損傷したため、または２種以上のサブユニットの組み合わせが一貫した効 果に必要であるためであったがもじれない。

これらの５つの実験がら、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰは、その天然状態にあろうとも、ま た解離されていようとも、あるいは更に還元されかつ解離されていようとも、ヘ モノカスに対する新規かつ一貫して有効な保護抗原複合体であることが結論され た。

実験番号　群　ｎ　抗原　投与量６平均数±ＳＥ　雄、％２　４７　未結合レク チン１４０　Ｄ８７＋３５０　”　４９．６＋４．１　’６　７　ＨｉｉＯＤ　 １ｏｏ　ｓｘａ＋Ｄ３ａ　６６．８＋５．４’”免疫感作当たりヒツジ当たりに 注射されたタンパク質μ９゜夫々の実験中、異なる添字を有する欄中の値は有意 に異なる。

表７ 実験　子ヒツジ　ブースター　抗原投与　死亡番号　の年齢１　回数”　の間隔 ６　日数１１２４および７１２３ ２　８　３および６２２Ｂ ３　２　３および６２３４ ４　５　３および６２３５ ５　３　３および６２３４または３５ ａ最初に注射された時の年齢（月数）ｉｂ最初の”ワクチン投与”後の通数；Ｃ ３回目の”ワクチン投与”と抗原投与の間の通数；ｄヒツジが死亡した時の抗原 投与後の日数 図４に示す方法により、オステルタギア・オステルタギまたはオステルタギア・ サーカムシンクタの抽出物をビーナツツレクチンでのアフィニティークロマトグ ラフィーで処理すると、それらの５ＤＳ−ＰＡＧＥにより判断して、Ｈ−ｇａｌ −ＧＰと広範囲で類似するタンパク質複合体が得られる（図２７）。Ｈ−ｇａｌ −ＧＰと同様に、両方の抽出物は、アゾカセインおよびヒツジヘモグロビンに対 して４〜６．０の最適ｐＦＩでプロテアーゼ活性を示し、（図８および９）、こ の活性は、ペプスタチンによって特異的に阻害された（表３）。

ペプスタチン、ビーナツツレクチンまたはドリチジスクチンんに結合したアガロ ースビーズを入れた試験管に等容量のＯｃ−ｇａｌ−ＧＰを加え、試験管を４℃ で３時間穏やかに攪拌した。ビーズをペレット化し、未結合上澄み液を保持した 。３回洗浄した後、ビーズを最少量の５ＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中でしょ ふつし、ペレット化した。アガロースに結合した物質を含有こるこの工程からの 上澄み液を、未結合上澄み液といっしょに、５　％　５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を 走行させ、イモピロン膜にプロットし、ビオチニル化ビーナツツレクチンで探査 した。

図２３に示された結果は、０ｃ−ｑａｌ−ＧＰがビーナツツレクチンおよびペプ スタチンアガロースに特異的に結合したことを示している。なぜならば、これが 天然コントロールリガンド（ドリチョスレクチン）に結合させたラガロースとは 結合しなかったからである。

実施例７の実験１および２に記載したようにしてＨ−ｇａｌ−ＧＰで免役したヒ ツジからの血清は、いずれかのオステルタギアのタンパク質エピトープと交叉反 応する（図２７）。

これらの結果は一緒に考えると、Ｈ，コントルクス、０．サーカムシンクタまた は０、オステルタギが、ペプスタチン−阻害可能なプロテアーゼ活性を含む抗原 的に関連するガラクトース含有糖タンパク質複合体の共通のファミリーを共有し ていることを示唆する。

より特異的な結果は、以下の実験において説明される。

大箆上 オステルタギア・サーカムシンクタの内在性膜タンパク質で免疫された子ヒツジ はこの寄生虫でのチャレンジに対して保護されるという証拠オステルタギア・サ ーカムシンクタ内在性膜タンパク質のコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ　ｌ結合画分 で免役された子ヒツジを、この寄生虫の感染性幼虫でチャレンジし、与えられた 保護の程度をチャレンジコントロール群との関係で測定することによって、実験 を行なった。

全ての抗原調製操作は、特に指示しない限り、氷上または４℃で行なわれ、遠心 工程は１０，０００　ｇで１５分間で行なった。凍結した０、サーカムシンクタ を融解し、緩衝液（リン酸塩緩衝食塩水、ｐＨ７，４、下記のプロテアーゼ：　 −１ｍＭＥＤＴＡ　１ｒｎＭ　ＰＭＳＦｌｌＴＩＩＭＮ−エチルマレイミドを含 何する）中でホモジナイズした。

ホモジネートを回転し、ｏ、１ｔ　（ｖ／ｖ）　）ウィーン２０を含有するホモ ジナイズ緩衝液中にベレットを再懸濁した。この工程をもう１回繰り返し、虫の 膜を含む洗浄ベレットを再懸濁し、次いで２％のトリトンＸ−１００を含むがＥ Ｉ７ｒＡを含まないホモジナイズ緩衝液中で２時間よく混合することにより抽出 した。抽出物を再度回転し、得られた上澄液を１００，０００ｇで１時間超遠心 した。Ｓ３（図２９、トラック１）として知られ、可溶化内在性膜タンパク質を 含むるこの上澄液を、孔径０゜２２μｍのフィルターに通し、緩衝液（１０Ｍｍ 　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，４，０，５Ｍ　ＮａＣ１およびＯ，Ｏｌｔ　Ｎａ Ｎ＋を含有する）で４倍に希釈し、ＣｏｒＩＡ−アガロースカラムにかけた。

未結合物質（図２９、トラック３および４）を捨て、よく洗浄した後、結合画分 を２００ｍＭα−メチルマンメチルグルコシド／αルコシドで溶離した（図２９ 、トラック２）。この両分をゲル濾過（セファデックスＧ−２５、ファーマシア ）により脱糖して脱塩し、モノＱ（ファーマシア）上でイオン交換して濃縮し、 等容積のフロイント完全アジュバントでホモジナイズする前に、冷リン酸塩緩衝 食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。

線虫寄生虫を排除することを意図した条件において畜舎で飼育された１４匹の５ ｕｆｆｏｌｋクロス子ヒツジを、それぞれ性別と体重をバランスさせ、６匹の免 役子ヒツジおよび８匹のコントロール子ヒツジからなる２つの群に割り当てた。

７月令で、免役群に各１００μ９の抗原を注射し、コントロール子ヒツジにはア ジュバントのみを注射した。ｌ　ｍｌのワクチンを、各後脚に単膜様および半腿 様筋肉内注射した。各群は更に、３および６週間後に同じ接種を受けた。最後の ブースト後２週開目に、全ての子ヒツジをｓ、ｏｏｏの第３期Ｏ，サーカムシン クタ幼虫で経口チャレンジした。チャレンジ後２週間口から毎週２回真中の卵を 計数し、チャレンジ後５週開目に、虫の総数を計数するために動物を殺した。

免役子ヒツジの群平均糞中卵数は、この実験を通してコントロール群よりも存意 に低かった（表８および図３０）。２１日および３５日の実験間で平均した群平 均を比較すると、免役群の卵排出量は８０％以上だけ減少したことが明らかであ った。皺胃内容物および粘膜消化物のサブサンプル（５〜１０１）を、虫につい て調べた。捕獲された第４早期幼虫は認められなす、全ての虫は第５期または成 体期まで発達していた。群の虫感染度を比較すると、免疫ヒツジでは約６０も低 く、統計的に有意差かあることを示した（表８）。

Ｐ　値　＜０．０５　＜０．０１　＜０．０１　＜０．０１　＜０．０２　＜０ ．０１　＜０．０１　＜Ｏ，０ｉａ−虫の総数 す−卵数／９糞 ！！１ ａ）　実験ｌでヒツジの免役のために用いられたＣｏｎＡ結合画分を、１０％還 元性５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、イモピロン膜上にプロットした。プ ロットをビオチニル化レクチン、即ちＯｃ−ｇａｌ−ＧＰに対して特異的である ことが示されたりガント（図２８＋２９）で探査した。陽性結果（図３１）は、 ■−ｇａｌ−ＧＰが保護抗原調製物中に存在することを示した。

ｂ　）　Ｏｃ−ｇａｌ−ＧＰを調製するために、成体０．サーカムシンクタを５ ３段階まで処理し、これを、前記の実験ｌに記載したようにピーナッツレクチン ーアガロスを含むカラムにポンプで通した。カラムを数カラム体積の緩衝液で洗 浄し、次いで結合した物質を０．５Ｍアガロースで溶離して、Ｏｃ−ｇａｌ−Ｇ Ｐを得た。

Ｏｃ−ｇａｌ−ＧＰのプロットを、炭水化物エピトープを分解し、可能性のある 交叉反応を低減するために、最初に過沃素酸塩で処理する以外は前記のようにし て作成した。ｆＷｏｏｄｗａｒｄ、　Ｙｏｕｎｇ　ａｎｄ　Ｂｌｏｏｄｇｏｏｄ 、　１９８５．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍｅｔｈ ｏｄ＋＋　７８＋　１４３−１５３）　プロットを実施例８の実験１からの免役 血清、または０．サーカムシンクタに対して自然免役のヒツジｆｓｍｉｔｈ、　 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　９５＋ 　２３５−２７５１からの胃リンパ液サンプルで探査した。実験ｌからのＣｏｎ Ａ結合抗原に対する抗血清は、ＱＣ−Ｃ１ａｌ−ＧＰと反応したが、自然免役動 物からのリンパ液との反応は見られなかった。これらの結果は、Ｏｃ−ｇａｌ− ＧＰがヒツジの免役に用いたＣｏｎＡ結合画分中に存在していたという前記実験 ２（ａ）での観察を支持し、Ｏｃ−ｇａｌ−ＧＰも”隠れた”抗原であることを 示した。

Ｏｃ−ｇａｌ−ＧＰが隔膜タンパク質であるという証拠ナツツレクチンで染色し た。強い蛍光が腸管にわたって観察されたが、内部構造もそれほど強くはないが 染色されたので同定されなかった。ビーナツツレクチンがＯｃ−ｇａｌ−ＧＰと 特異的に結合するので、この結果は、Ｏｃ−ｇａｌ−ＧＰが隔膜タンパク質であ ることを示す。

下で４０％だけ低下した。これに加えて、ゼラチン−基質ゲル分析により非還元 性条件下で視覚化されたタンパク質分解的に活性なダブレッｌ−（Ｍｗ　約　２ ０５テイナーゼ活性を含むことを示す。

プロテイナーゼ活性を、マイクロアッセイシステム中で基質としてのアゾカゼイ ンを用いて測定した。Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ　（２０μｍ中約５ロタ）を、阻害剤を 含まない（コントロール）か、または阻害剤を１ｍＨの最終濃度で含む２００μ ｍの滅菌０．１　Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７，０とともに３７℃で３０分間予備イ ンキュベートした。使用した阻害剤は、４−ヒドロキシ水銀ベンゾエート　＋４ 　）ＥＫＢ　）およびペプスタチンをメタノールに溶解した以外は、水中の１０ ０　ｍＭストック溶液として調製した。試験した阻害剤は、ジチオスレイトール （ＤＴＴｌｉ　Ｌ−システィン；還元グルタチオン；４沿…ｉＮ−エチルマレイ ミドｉ　ＥＤＴＡｉ　ＩＪＯ−フェナントロリンおよびペプスタチンであり、シ グマ社から購入した。予備インキュベートした後、２０μｍのアゾカゼイン（滅 菌蒸留水中５ｍｇ／ｍｌ、シグマ）を加え、反応混合物を３７℃で一夜インキユ ベートした。試験した各阻害剤関し、Ｈ−ｇａｌ−ＧＰの代わりに滅菌水を含む 平行ブランクを含め、二重にアッセイを行なった。等容量のＩＭ過塩素酸ｆＢＤ ＨＣｈｅｍｉｃａｌｓｌを加えて反応を停止し、氷上で１５分間保持して、未消 化タンパク質を沈澱させ、次いでこれを、マイクロフユージを用いた１１０００ ｑでの簡単な遠心によってペレット化した。”Ｍｏｎａｒｃｈ”マイクロ遠心分 析機ｆＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔａｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｗａｒｒ ｉｎｇｔｎ、　ＵＫ）を用いて、上澄み液のＯＤｔ　ｍ　ｓを測定した。適切な 試薬ブランクを差しづ匹）た後、阻害の程度を、コントロール反応と比較して残 存した活性の％として現した。

で洗浄し、液体窒素中で急速凍結した。凍結寄生虫を、−７０℃に予備冷却した 乳鉢およびモーターを用いて魔砕して粉末となし、２５ｍ１の抽出緩衝液（蒸留 水中の４Ｍグアニジンイソチオシアネート、２５ＩＴＩＭ　クエン酸ナトリウム 、０．５％　（ｗ／ｖｌサルコシル（ｓａｒｃｏｓｙｌ　）および０．７１（ｖ ／ｖ）　２−メルカプトエタノール）中で可溶化した。５ｍｌのフェノール／ク ロロホルムを加えた後、溶液を５分間回転して激しく混合し、次いで氷上で１０ 分間インキュベートした。１００００　ｇおよび４℃で３０分間遠心して水相と 有機相とを分離し、水相を保持し、等容量のイソプロパツールを加え、−２０℃ に１時間冷却することによりＲＮＡを沈澱させた。

ＲＮＡを前記のようにペレット化し、抽出緩衝液中に再溶解し、再ベレット化し た。

ベレットを７０１エタノールで洗浄し、乾燥し、０　、５ｍｌの蒸留水中に再溶 解した。

ポリ（Ａｌ中ｍＲＮＡは、Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ　ｅｔ　ａｌ　＋１９７６ 、　Ｃｅ１ｌ、　７２７９−２８８１により記載された方法を用いて、オリゴ− ｄＴ−セルロースクロマトグラフィーにより単離した。ポリ（Ａ）◆ｍ１ｔＮＡ をエタノールで沈澱させ、乾燥し、１０〜２０μｍの滅菌蒸留水中に再溶解した 。

２、ＣＤＮＡの合成およびλ９ｔ１１ライブラリーの作成Ａｍｅｒｓｈａｍから 購入したキットを用いて製造業者の指示に従って、２本鎖ＣＤＮＡをポリｆＡｊ ÷ｍＲＮＡから調製した。第−鎖の合成は、順逆転写酵素を用いて行ない、ラン ダムへキサヌクレオチドブライマーを用いて反応を開始した。第二鎖の合成は、 ＲＮａｓｅ　ＲおよびＥ、Ｃｏ１１を用いて行なった。最後に、Ｔ４　ＤＮＡポ リメラーゼを用いてＣＤＮＡを末端プラント　（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ　）にした 。Ａｍｅｒｓｈ印キット　（ＲＰＮ　１２８０１を用いて、ＣＤＮＡをバクテリ オファージλｇｔｌｌ　（λｑｔ１１１内に連結した。簡単にいうと、ＥｃｏＲ １アダプターをｃＤＮＡに連結し、未連結アダプター分子をゲル濾過により除去 し、ＣＤＮＡ　＞　５００　ｂｐをλ９ｔ１１アームへの連結のために保持した 。′アダブトした（　ａｄａＰｔｅｄ　ｌ″　ＣＤＮＡ末端をＴ４ポリヌクレオ チドキナーゼとの反応でリン酸化し、異なる量（１００，７５＆　４０　ｎｇ） をλ９ｔ１１アーム　（１μ９）に連結した。連結混合物をインビトロでパッケ ージしくＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　、アリコートを、イソプロピルチオガラクト ピラノシド（工ＰＴＧ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β− Ｄ−ガラクトピラノシド　（Ｘ−９ａ１）の存在下にＥ、Ｃｏ１１　Ｙ１０９０ 上にプレートし、組み換え力価を評価できるようにした。各連結反応により、約 ２　ｘ　１０’の組み換えファージが得られた。

Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ酸成分発現するファージを、１０１の組み換えファージの免役 スクリーニングにより、ヒツジ抗−〇−ｇａｌ−ＧＰ抗血清を用いて選択した（ 下記参照）。

Ｌ−寒天／アンピシリンプレート当たり１０００フアージの密度でプレートした 。プラークがちょうど見えるようになるまで４２℃でインキュベートしく４時間 ）、次いで１０ｍＭ１ｍ中で飽和して乾燥したニトロセルロースフィルターで被 覆した。フィルター付きプレートを３７℃で一夜インキユベートした。翌日、フ ィルターを除去し、ＴＢＳＴ　（５０ｍＭＴｒｉｓ−ｂａｓｅ、　１５０ｍＭ　 ＮａＣ１，ｐＨ８，０，０，０５ｔ　ｖ／ｖ　トウイーン２０を含有する）中で よく洗浄し、次いでＴ’ＢＳＴ中の５％ウマ血清中で１時間インキュベートした 。次いでフィルターを、５もウマ血清を含むＴＢＳＴで１１５００に希釈したヒ ツジ抗−Ｈ−ｇａｌ−ＧＰ抗血清とともに４時間インキュベートした。更にＴＢ ＳＴでよく洗浄した後、フィルターを、パーオキシダーゼ接合ウマ抗−ヒツジ免 役グロブチン抗血清＋ＴＢＳＴ中１／２００　）とともに２時間インキュベート し、洗浄し、免役陽性ファージを、ＤＡＢ発色溶液（５０ｍｌ　ＨａＯ中の１１ ０１１Ｉジアミノベンジジン−ＨＣ飄５０　ｕＬの３（ｌ過酸化水素を含有する 、シグマ）とともにインキュベートすることにより視覚化した。免役陽性プラー クの芯を抜き出し、継続的な交換／免役スクリーニングサイクルによってプラー クを純粋にした。１０＄のファージのスクリーニングにより、７つの陽性ファー ジが得られた。これらを抗体溶離によって更に分析した。

度でプレートし、４２℃で４時間インキュベートした。プレートをＩＰＴＧ飽和 ニトロセルロースフィルターで被覆し、３７℃で一夜インキユベートした。フィ ルターを除去し、ヒツジ抗−〇−ｇａｌ−ＧＰ抗血清とともに４時間インキュベ ートする前に、ＴＢＳＴでよく洗浄した。結合した抗体を、溶離緩衝液ｆ５＋ｎ Ｍグリシン、５００ｍＭ　ＮａＣ１，０，２％トウィーン２０ＳｐＨ２，３１を ２回、各２分間適用することにより溶離した。得られた抗体溶液（４ｍｌ）を２ ００ｕｌのＬＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，４を加えて中和し、ＴＢＳＴ中 の５１ウマ血清（ＴＢＳＴはトウィーン２ｏを含まない）で３倍に希釈し、７． ５％５０５−ＰＡＧＥにより分離されたＨ−ｇａｌ−ＧＰのウェスターンプロッ トストリップとともに一夜インキユベートした。続く洗浄操作、第二抗体とのイ ンキュベージタンおよびＤＡＢ溶液を用いる視覚化は、上記のように行なった。

λ９ｔ１１中のＥｃｏｌｕクローニング部位の側部にある領域を指向するプライ マーを用いるＰＤＲ増幅により、挿入（：ＤＮＡをプレパラティブ量で得た（Ｓ ａｉｋｉ　ｅｔａｌｌ、、　１９８８５ｉａｎｃａ　２９３４８７−４９１）　 。簡単に述べると、ファージ粒子を芯抜きプラークから、０　、５ｍｌエツペン ドルフ管に入れた５０μｌの滅菌蒸留水中に溶離した。簡単な凍結／融解サイク ルの後、２５μｌの上澄み液を５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８に記載さ れたＰＤＲ反応に用いた。プライマーを５５℃でアニールした。ＰＤＲ生成物を 、０．８１アガロースゲルまたは７．５％連続ポリアクリルアミドゲルスラブで 分別し、臭化エチジウム染色（アガロース）または銀染色（ポリアクリルアミド ）により生成物を視覚化した。

更に、ｃＤＮＡ挿入物のＰＣＲ増幅の生成物をアガロースゲルで分別し、Ｍａｎ ｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　ｆ１９８２Ｌ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ＋実験室マニュアルＣｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙに記載のキャピラリートランスファー技術により、ナイロン膜（Ｈｙｂｏ ｎｄ−Ｎ、　ｊｃａｒｓｈａ＋ｎｌ上でサザンプロットした。プロットを探査す るためのＤＮＡ　（１００ｎｇ）は、前記で概説したようにファージＨＧ３のＰ ＣＲ増幅により調製し、ｏ＝ｑｏｘｙｑｅｎｌｎ法によって製造業者の指示に従 って標識した（核酸の標識および検出キット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）。ハイブ リッド化は高緊縮条件下（ＳＯ％ホルムアミド中５　ｘ　ＳＳＣＯ，５％ｗ／ｖ ブｏ−７キング剤、Ｏ，Ｌ％　ｗ／ｖ　Ｎ−ラウリルサルコシン、０．０２　％ 　Ｗ／Ｖ　５ＤＳ）で、４２℃で一夜行なった。ハイブリッド化溶液に、探査Ｄ ＮＡを２５　ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。高緊縮洗浄後（最終洗浄　０．１ 　ｘ　ＳＳＣ，０，１％　ＳＤＳ　、　５６℃で１５分間）、アルカリ性ホスフ ァターゼ接合抗−ジゴキシゲニンおよび酵素触媒カラー反応を用いる免役学的検 出（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ｌにより、ハイブリッド化を視覚化した。

６、配列分析 ＰＯ増幅ｃＤＮＡ挿入物を、ＰＣＲ１０００ベクター（Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏｇｅｎ 　）に、製造業者の詳細に従ってサブクローニングした。ＤＮＡ配列は、ジデオ キシ連鎖終止手順により決定した（ｓａｎｑｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９７７　Ｐ ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉ ｅｎｃｅ　７９５４６２−５４６７）　。配列化反応は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　 Ｔ７配列化キットを用いて行ない、プライマーアニーリングおよび配列化反応は 、キットの指示に詳述された通りに行なった。反応生成物を、６％アクリルアミ ド、５０％尿素ゲルスラブにおいて、Ｔｒｉｓ／アセテート／ＥＤＴＡランニン グ緩衝液を用いて５０Ｗの一定電力で６時間まで分別した。電気泳動の後、ゲル を酢酸　メタノール、水（５＋５＋９０１中に４０分間浸漬し、ワットマン３１ 濾紙上で乾熾し、次いで分離したＤＮＡ画分をオートラジオグラフィーにより室 温で一夜検出した。このＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を、ＧＥＮＢＡＮＫおよ びＥＭＢＩ、データベースに存在する配列と比較した。

Ｈ−ｇａｌ−ＧＰに関連する中性エンドペプチダーゼ様活性は、基質としてのア ソガゼインを用いた差別的ブロレイナーゼ阻害剤感受性によって検出された。典 型的な分析の結果を表９に示す。

！旦　プロテイナーゼ阻害剤のパネルに対するＨ−ｇａｌ−ＧＰによるｐＨ７で のアゾカゼインタンパク質分解の感受性 阻害剤なしのコントロール　１００　１００４−ヒドロキシ水銀ベンゾエート　 ８８　９１阻害（％）は、阻害剤なしのコントロールと比較して残存する活性の パーセントとして現される。同じバッチのＨ−ｇａｌ−ＧＰついて、２つの別個 の分析の結果が示されている。

酵素活性は、キレート化剤ＥＤＴＡおよび１．１０−７エナントロリン、並びに チオール試薬ジチオスレイトールおよびシスティンによって阻害された。活性は 、４−ヒドロキシ水銀ベンゾエート、Ｎ−エチルマレイミド、ペプスタチンおよ びグルタチオンによっては相対的に影響されなかった。この阻害プロフィールは 、哺乳類起源の中性エンドペプチダーゼについて先に報告されたプロフィール（ ＫｅｎｎＹｒ１９７７、Ｉｎ＋　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　ｉｎ　ｍａｍｎａｌ ｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅｓ、　Ｅｄ＋　Ｂａｒｒｅｔ煤A　 Ａ、Ｊ。

Ｅｌｓｅｖｉｅｒで検討されている）と一致する。

２、　Ｆｌ−ｇａｌ−ＧＰ陽性λ９ｔ１１組み換え体の分子分析１０１のλ９ｔ １１組み換え体の免役スクリーニングは、７つの免役陽性ファージを生じた。抗 体溶離実験は、ＨＣｌと称する組み換えファージから溶離された抗体だけが、還 元性５Ｏ８−ＰＡＧＥゲルから作成したウェスタンプロットストリップにおいて Ｈ−ｇａｌ−ＧＰを明らかに認識したことを示した。非組み換えλ９ｔ１１から 溶離した抗体はＨ−ｇａｌ−ＧＰを認識せず、）ｉＧ３反応の特異性を実証した 。ＨＣｌからの増幅された挿入ＤＮＡを用いて、他の免役陽性プラークから増幅 された挿入ＤＮＡのサザンプロットを探査し、組み換え圓１１は、陽性ハイブリ ッド化シグナルを与えた。ＨＣｌおよびＨＧｌｌ内のｃＤＮＡ挿入物のサイズは 、それぞれ２１２　ｂｐおよび１０１９　ｂｐであった。

）ＩＧ３のヌクレオチド配列（図３３）およびアミノ酸配列（図３４）は、完全 に決定された。　ＨＣｌは、ヒト天然中性エンドペプチダーゼと３３％の同一性 および６５％の類似性、即ち極めて有意な相同性を示した。ＨＧｌｌの配列分析 は続行中であるが、園３に相当する領域が同定され、ヌクレオチドのレベルで９ ６％の同一性を示した。従って、％１１はＨＣｌの変異体のようである。このよ うな変化は、蝉虫の異なる系統および異なるライフサイクル期の間で自然の生物 学的変異体が存在するためであるかもしれない。更に、多重酵素形態（イソエン ザイム）が存在するかもしれず、これは寄生虫の発育の間に、または起源の異な る系統において別様に発現されるであろう。

実施例！■ 種々の後生動物寄生虫には中性エンドペプチダーゼをコードする遺伝子が存在す ることを示すために；　Ｅｃｏｒｌで消化した後生動物寄生虫からのゲノムＤＮ ＡへのクローンＨＧ１１のハイブリッド化 種々の後生動物寄生虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　、　Ｌｕｃｉｌｉａ　、　Ｎｅ ｍａｔｏｄｉｒｕｓおよびＢＯＯｐｈλｌｕｓ　）からのゲノムＤＮＡを調製す るために、液体窒素中で急速凍結したそれぞれの虫２９を、液体窒素中で磨砕し て微細粉末にした。この粉末を、２５ｍ１の溶解緩衝液（０，０５Ｍ　Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ　ｐＨ８，０，０，ＩＭ　ＥＤＴＡ　、　１％　ｗ／ｖサルコシル、０ ．０５ｍｇ／ｍｌブロティナーゼＫ）に徐々に加え、６５℃で２時間インキュベ ートした。次いでこの懸濁液を、ｌ容量のフェノール−クロロホルムで２回、２ 容量のクロロホルムで２回抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。ベレットを ２０ｍ１のＴｒｉｍ　５ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＩ、　ｐＨ８，ｏ）に、ロッキング テーブル上で４℃で一夜再懸濁し、次いで１リツトルのＴＥ緩衝液に対して２回 交換して透析した。

ＤＮａｓｅを含まないＲＮａｓ＊　Ａ　Ｔｙｐｅ工（Ｓｉｇｍａ）とともに、最 終濃度２０ｕｇ／ｍｌで３７℃で１時間インキュベートした後、前記のように、 フェノール−クロロホルムで１回、クロロホルムで１回抽出し、次いでエタノー ルで沈澱させることによりＲＮＡを除去した。ペレットを７０％ｖ／ｖエタノー ルで２回洗浄し、前記のように１ｍｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁した。

５μｇのゲノムＤＮＡを、ＥＣ０Ｒ１で３７℃で一夜消化し、Ｔｒｉｓ−アセテ ート緩衝液中の１％アガロースゲル上でトラック当たり５　ｕｇで電気泳動した 。ゲルを、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ａｔ　ａｌ　（１９８２）に記載のキャピラリー トランスファーにより、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ膜（Ａ＋ｎｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒ ｎａｔｉｏｎａｌ　ｌ上にサザンプロットした。紫外線を用い、製造業者の推奨 に従って、ＤＮＡを膜に固定化した。

ＨＧ１１クローンをｓａｃ工およびＢａｍＨＸで消化し、これを電気泳動し、７ ５０ｂｐの両分を回収した。Ｐｒｏｍｅｇａ　ＢｉｏｔｅｃｈからのＮ１ｃｋ翻 訳キツトを用、て造業者の指示に従って、挿入物を、”　Ｐ−ｄｃＴＰで放射性 標識した。スピンカラムクロマトグラフィーにより、一様に組み込まれた標識か ら、標識されたＤＭを分離した。

サザンプロットを、ハイブリッド化溶液（６ｘ　ＳＳＤ　、　５０　％ホルムア ミド、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％ＳＤ！９　）中で２８℃で３時間予 備ハイブリッド化し、次いで放射性標識プローブの存在下に中緊縮条件において ２８℃で一夜ハイブリッド化した。次いでプロットを室温で１０分間洗浄した後 、４２℃で１時間の第２洗浄を、両方とも２　ｘ　５５０．０．１％ＳＯＳ中で 行なった。オートラジオグラフィーによりプローブのプロットを０．４Ｎ水酸化 ナトリウム中で４２℃で３０分間インキュベートしてストリッピングした。プロ ーブの除去は、オートラジオグラフに一夜照射することによって確認した。

次いで同じプローブを使用して、プロットを低緊縮条件下で再ハイブリッド化し た。予備ハイブリッド化およびハイブリッド化は、２４℃の温度を用いた以外は 前記と同様に行なった。洗浄もまた、。第２洗浄を２４℃で３０分間行なった以 外は前記と同様であった。

）ＩＧＩＩプローブを用いたサザンプロットは、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ起源のＤ ＮＡとの結合があっただけでなく、図３５のトラック１〜４に示すように、他の 後生動物寄生虫Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　、　Ｌｕｃｉｌｉａ　％Ｎｅｍａｔｏｄ ｉｒｕｓおよびＢｏｏｐｈｉｌｕｓ起源のＤＮＡとの結合もあったことを示した 。これは、中および低緊縮条件下でのハイブリッド化によって確認された。

ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、ｌ、　−９−１−製造の２つの方法のフローチャート４も◆プロテアー ゼ阻害剤中での成体へモノヵスのホモジネートＦＩＧ、　５　ａ ＦＩＧ、５ｂ ＦＩＧ、　７ （ｕＩＵｒｏｔｙ）　ｘ　＊　ｍ （ｕＩ■Ｚ９Ｓ）　Ｘ　＊　遺 ＦＩＧ、　７１ ＦＩＧ、　７４゜ ＦＩＧ、　１６゜ １　２３　４５　６７　ｇ ＦＩＧ、　２０ ５％　１０％ ′ａ　ム （ＩＳ　−／＋）　’ｉｉｌ／發曲財士（’：（Ｓ　−／＋）　ｇ／發ｌ＃財士 （’ＥＳ−／＋）ｇ／凋１＃喀士 （：（針／＋）　’７１／”＊關嬉士 ＦＩＧ、２９ （支）−／＋）″ｔバＩ喀ホ ＦＩＧ、３５゜ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９ 　ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｂ　９２８２−４Ｂ／／Ｃｌ２Ｎ　９／６４　Ｚ　９１ ５２−４Ｂ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＢＹ。

ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ， ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、　ＰＬ、　 ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ。

ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ （７２）発明者　スミス、ステユアート　ケビン英国　ニブインバラ　イーエッ チ１６６ユーゼツト　ハウデン　ホール　ドライブＦＩ （７２）発明者　マーレイ、ジャックラインアメリカ合衆国　ダブりニュー　９ ８０５６ベルヴユー　コルクリーク　ピーケーワイエスイー　７３１１　ニュー ポート　りロッジング　ニーピーティー、エッチ２０３（７２）発明者　リップ ル、スーザン 英国　ニブインバラ　イーエッチ１１エスジエー　ハイ　ストリート　カラバー ズクローズ　４／１ （７２）発明者　ノックス、デービット　パトリック英国　イースト　ローシア ン　イーエッチ３２０シエープイー　コツケンジー　イースト　ローリマー　プ レース　１３

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．ペプスタチンと結合可能であり、天然形態において内在性（ｉｎｔｅｇｒａ ｌ）膜タンパク質またはタンパク質複合体であることを特徴とする、１種または 数種の後生動物寄生虫に対して防御抗原活性を有する後生動物寄生虫防御抗原、 その抗原性フラグメント、成分もしくは前駆体、および機能的に等価なその誘導 体、類似体もしくは変異体。
2. ２．（ａ）タンパク質分解活性を有し、（ｂ）天然形態において寄生虫腸の腸刷 毛縁に位置しており、そして（ｃ）麦芽レクチン、およびβ−結舎Ｎ−アセチル ガラクトサミンに対して特異性を有するレクチンに結合できる ことを特徴とする、請求項１に記載の抗原、その抗原性フラグメント、成分もし くは前駆体、または機能的に等価なその誘導体、類似体もしくは変異体。
3. ３．天然形態において、ＣｏｎＡ、エンドウ豆（ｐｅａ）、ミヤコグサ（Ｉｏｔ ｕｓ）、ヘリックス・ポマチア（Ｈｅｒｉｘｐｏｍａｔｉａ）、ピーナッツおよ びジャカリン（ｊａｃａｌｉｎ）のレクチンに結合できることを特徴とする、請 求項１に記載の抗原、その抗原性フラグメント、成分もしくは前駆体、または機 能的に等価なその誘導体、類似体もしくは変異体。
4. ４．抗原が更に、アスパルチルプロレイナーゼ様および／または中性エンドペプ チダーゼ様活性を有することを特徴とする、請求項１〜３の何れかに記載の抗原 、その抗原性フラグメント、成分もしくは前駆体、または機能的に等価なその誘 導体、類似体もしくは変異体。
5. ５．Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ属、Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ属またはＴｒｉｃｈｏｓｔ ｒｏｎｇｙｌｕｓ属の■虫から得られることを特徴とする、請求項１〜４の何れ かに記載の抗原、その抗原性フラグメント、成分もしくは前駆体、または機能的 に等価なその誘導体、類似体もしくは変異体。
6. ６．表１に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量分布、またはその成分を有することを 特徴とする、請求項１〜５の何れかに記載の抗原、その抗原性フラグメント、成 分もしくは前駆体、または機能的に等価なその誘導体、類似体もしくは変異体。
7. ７．Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ種の腸から得られ、非還元性条件下で５％ゲル上での ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、約１９０〜２０５ｋｄの分子量、または非還 元性条件下で１０％ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、約３５または ４５〜５０ｋｄの分子量を有することを特徴とする、請求項１〜６の何れかに記 載の抗原、その抗原性フラグメント、成分もしくは前駆体、または機能的に等価 なその誘導体、類似体もしくは変異体。
8. ８．ヒトまたはヒト以外の動物における後生動物寄生虫に対する免疫応答を刺激 するのに使用するための、請求項１〜７の何れかに記載の抗原、その抗原性フラ グメント、成分もしくは前駆体、または機能的に等価なその誘導体、類似体もし くは変異体。
9. ９．ヒトまたはヒト以外の動物における後生動物寄生虫に対する免疫応答を刺激 するのに用いられるワクチン組成物の製造への、請求項１〜７の何れかに記載の 抗原、その抗原性フラグメント、成分もしくは前駆体、または機能的に等価なそ の誘導体、類似体もしくは変異体の使用。
10. １０．請求項１〜７の何れかに記載の抗原、その抗原性フラグメント、成分もし くは前駆体、または機能的に等価なその誘導体、類似体もしくは変異体の１種ま たは数種を、製剤上許容される担体または希釈剤と一緒に含むことを特徴とする 、ヒトまたはヒト以外の動物における後生動物寄生虫に対する免疫応答を刺激す るためのワクチン組成物。
11. １１．前記抗原の１種または数種を、抗原Ｈ１１０ＤおよびＨ４５から選ばれた １種または数種の追加の抗原を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のワク チン組成物。
12. １２．ヒトまたはヒト以外の動物に、請求項１０または１１に記載のワクチン組 成物を投与することを特徴とする、ヒトまたはヒト以外の動物における後生動物 寄生虫に対する免疫応答を刺激する方法。
13. １３．請求項１〜７の何れかに記載の抗原、その抗原性フラグメント、成分もし くは前駆体、または機能的に等価なその誘導体、類似体もしくは変異体の何れか と選択的に結合できる抗体、あるいは該抗原結合性抗体のイディオタイプと選択 的に結合できる前記抗体の抗原結合性フラグメント。
14. １４．請求項１〜７の何れかに記載の防御抗原の少なくとも１種を含む後生動物 寄生虫の抽出物を調製し、該抗原に対しする特異的結合パートナーを含む固定化 相に該抗原を結合させることにより、該抗原を抽出物から精製し、次いで該抗原 を該固定化相から溶離することを特徴とする、ヒトまたはヒト以外の動物におけ る後生動物寄生虫に対する免疫応答を刺激するためのワクチンの製造方法。
15. １５．後生動物寄生虫の内在性膜フラグメントを、Ｎ−アセチルガラクトサミン に対する特異性を有する１種または数種のレクチンを担持した固定化相を用いる アフィニティークロマトグラフィーにかけることを特徴とする、後生動物寄生虫 内の防御抗原を同定する方法。
16. １６．前記特異的結合パートナーまたはレクチンピーナッツまたはジャカリンレ クチンであることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の方法。
17. １７．請求項１〜７の何れかに記載の抗原、その抗原性フラグメント、成分もし くは前駆体、または機能的に等価なその誘導体、類似体もしくは変異体をコード するヌクレオッチド配列を含むことを特徴とする、核酸分子。
18. １８．図３３に示すヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：）の全部または一部に 実質的に対応するヌクレオチド配列、またはこのは配列の変性配列、または該配 列と実質的に相同性であるか、またはハイブリッド化する配列の１種または数種 を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の核酸分子。
19. １９．請求項１７または１８に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、発現ま たはクローン化ベクター。
20. ２０．請求項１７または１８に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、宿主細 胞またはトランスジェニック微生物。
21. ２１．前記抗原の全部または一部をコードする核酸分子を含む宿主細胞を、該抗 原が発現される条件下で培養し、こうして産生された該抗原を回収することを特 徴とする、請求項１〜７の何れかに記載の抗原、その抗原性フラグメント、成分 もしくは前駆体、または機能的に等価なその誘導体、類似体もしくは変異体の製 造方法。
22. ２２．抗原が更に、アスパルチルプロテイナーゼ様および／または中性エンドペ プチダーゼ様活性を有し、天然形態において、内在性膜タンパク質またはタンパ ク質複合体であることを特徴とする、１種または数種の後生動物寄生虫に対して 防御抗原活性を有する後生動物寄生虫防御抗原、その抗原性フラグメント、成分 もしくは前駆体、または機能的に等価なその誘導体、類似体もしくは変異体。
23. ２３．Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ種の腸から得られる内在性膜タンパク質またはタン パク質複合体であるか、またはその一部を形成し、非還元性条件下で５％ゲル上 でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、約１９０〜２０５ｋｄの分子量、または 非還元性条件下で１０％ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、約３５ま たは４５〜５０ｋｄの分子量を有することを特徴とする、１種または数種の後生 動物寄生虫に対して防御抗原活性を有する後生動物寄生虫防御抗原、その抗原性 フラグメント、成分もしくは前駆体、および機能的に等価なその誘導体、類似体 もしくは変異体。