JPH07508663A - 臓器移植のための予備血管新生されたポリマー性移植片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 臓器移植のための予備血管新生されたポリマー性移植片発明の背景 米国政府は、Ｎ１）Ｉの認可番号６Ｍ　２６６９８により、本発明（こお（する 権利を有する。

本発明は、一般に、医学分野および細胞培養分野に関し、そして特に、生体適合 性人工マトリ・ノクス上に形成された移植可能な臓器の領域に関する。

先天的欠陥、損傷、または病気により、臓器の機能力；失われ得る。薬物または 手術による何回もの治療（ま、それ自体（ｉ十分ではなく、そして患者は死亡す る力）、また（よ重篤な障害を与える。治療に対する１つのアプローチ（よ、患 者（こドナーの臓器または組織を移植することである。シクロスボ１ノンのよう な薬物は、組織の拒絶を防止するために使用されｔ尋る。

しかし、ドナーの臓器はすごく不足しており、大半１ｉ最近死亡した個体から得 なければならなし）。

分離された組織を培養し、そして体内（こ直接細胞を移植する試みが数多（なさ れてきた。例え（ｆ、臓器全体また番よ臓器の一部分として、そのいずれかの膵 臓組織を糖尿病患者に移植することが試みられてきた。血清り゛ルコースζよ、 この技術を用いて、より生理学的な方法で制御されるように見え、そしてそれに より合併症の進行が遅くなる。初期のアプローチは、長期間に渡る利益を達成す るのに成功しなかったが、それは、単離された島細胞の塊を門脈循環系に注入す ることにより、肝臓の血管床内の移植と共に島細胞を移植することである。より 最近の方法は、宿主による免疫攻撃を防ぐために、膵臓のβ細胞を被包化するこ と、および腎臓の被膜下の胎児のβ細胞を注入することを含んでいた。短期間機 能する証拠はあるが、長期間の結果はあまり満足しなかった（Ｄ、Ｅ、Ｒ，５ｕ ｔｈｅｒｌａｎｄ、　Ｄｉａｂｅｔｏｌｏ　ｉａ　２０，１６１−１８５（１９ ８１）；Ｄ、Ｅ、Ｒ，５ｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏ　ｉａ　２０ ．４３５−５００（１９８１））。現在は、膵臓の全器官を移植することが好ま しい治療である。

分離された細胞を体内に移植するのに伴う問題の一つは、それらが三次元的構造 を形成せず、そして細胞が貧食作用および摩耗によって失われることである。こ の問題を克服する１つのアプローチは、Ｌｉｍの米国特許に記載されており、そ こでは細胞が球内で被包化され、次いで移植される。この方法は、時折、生存可 能な機能細胞を維持し得るが、細胞は、器官または構造を形成せず、まれに長期 間生存し、そして被包細胞を複製する。大部分の細胞は、複製および機能するた めに、表面に付着することが必要条件である。

人工皮膚として使用するために、マトリックス上で細胞を培養する最初の試みは 、薄い三次元構造の形成を必要とするが、それはＹａｎｎａｓおよびＢｅ１ｌに よる一連の刊行物に記載されていた。彼らは、細胞と共に接種されたコラーゲン 型構造体を用い、次いで露出された領域に渡って置いた。コラーゲンマトリック スを用いる時のある問題は、分解速度がうま（制御されないことであった。別の 問題は、コラーゲンマトリックスの厚い断片の内部に移植された細胞が、生存し なかったことであった。

表皮細胞と共に線維格子を接種することにより、人工皮膚を形成する１つの方法 は、Ｂｅ１ｌの米国特許第４．４８５．０９７号に記載され、そこでは血小板お よび繊維芽細胞のような収縮性因子とケラチノサイトのような細胞を組み合わせ て、皮膚等価物を生成するのに用いる水和コラーゲン格子を開示している。

Ｙａｎｎａｓらの米国特許第４，０６０，０８１号は、人工皮膚として有用な多 層膜を開示しており、その多層膜は、体液および酵素の存在下でコラーゲンとム コ多糖との架橋された複合体のような、非分解性である不溶性の非免疫抗原物質 から形成され、膜全体の水分の流れを制御するために合成ポリマーのような非毒 性物質で覆われている。Ｙａｎｎａｓらの米国特許第４．４５８．６７８号は、 グリコサミノグリカンと架橋されたコラーゲンから形成された線維格子が表皮細 胞と共に接種されるという、皮膚等価物質を製造する方法を開示している。

最初の２つの方法に対する不利な点は、マトリックスが「永久的な」合成ポリマ ーから形成されていることである。第°６７８号の特許は、２つの先願特許のい ずれも、皮膚としての器官を生成するのに、適切な細胞を用いて任意の形状から 形成し得る生体分解性マトリ・１クスを有しないという特徴を有する。不運なこ とに、後者のマトリックスは、主としてコラーゲンに基づいているので、そのマ トリックスの組成および立体配置に渡っての制御を欠いている。さらに、コラー ゲンは酵素作用および時問いっばいの加水分解により分解されるので、分解は全 く一定しない。

Ｓｃｈｍｉｄｔの米国特許第４．５２０．８２１号は、尿路中の欠陥を修復する ために内張りを作るために用いられた類似のアプローチが記載されている。上皮 細胞は、合成マトリックス上に移植され、そこで上皮細胞は、マトリックスが分 解されるように新しい管状の内張りを形成した。マトリックスは、細胞が複製さ れる加水分を保つため、そして細胞が複製されたとき細胞を保持し、案内するた めという、２つの二重の目的に役立った。

Ｊｏｓｅｐｈ　Ｐ、　ＶａｃａｎｔｉおよびＲｏｂｅｒｔ　Ｓ、Ｌａｎｇｅｒに より１９８６年１１月２０日に出願された、米国出願第０７／９３３．０１８号 の「人工マトリックスを用いる器官のキメラ新形態発生（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　Ｎ ｅｏｒａ。

ｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ａｒｔｉｆｉｃｉ ａｌ　Ｍａｔｒｉｃｅｓ）　Ｊにおいて、その後の体内への移植のために、分離 された細胞を生体適合性、生体分解性マ）　＋７１クス上で培養する方法が記載 されている。この方法は、皮膚の直径より大きな直径を有する三次元構造を形成 するために細胞を培養する以前の試みに伴う主要な問題を克服するために計画さ れた。ＶａｃａｎｔｉおよびＬａｎｇｅｒは、器官形成のために用いられるいか なるマトリックスにおいても２つの要素を有する必要があることを認識した：そ れは、失った機能を戻すために大容量の細胞を体内に移植するのに適した構造お よび表面積、および、血管新生もなく生存し続けるために、細胞が付着および生 育するようにマトリックスじゆうに気体および栄養物を適切に拡散させる方法に より形成されたマトリックス、である。一旦移植され、血管新生されると、栄養 物および気体の拡散のために必要とされる多孔度は、もはや重要なものではない 。

しかし、Ｖａｃａｎｔｉこより記載された方法を用いてさえも、移植片は、最初 インビトロで構築され、次いで移植された。インビトロの工程を避は得ることは 、明らかに望ましい。Ｖａｃａｎｔｉらの、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、０７／３４３．１ ５８は、この問題を扱うために用いたアプローチを記載している。Ｖａｃａｎｔ ｉらの１９８６年の特許出願において最初に扱われたものであるが、インビトロ で移植片を維持するために血管新生の必要性を認識し、移植片はインビトロで接 種され、次いで直ちに高度に血管新生された組織、すなわち腸間膜に移植された 。この方法の短所は、移植片が身体のこの区域へのみ移植され得、そして多（の 薄い移植片が、細胞が必要数に達するまで用いられなければならないことであっ た。

それゆえ、本発明の目的は、失われた器官の機能を戻すために必要な数の細胞を 含む移植片を提供することである。

さらに、本発明の目的は、インビトロで予備培養せずに細胞と共に移植され得、 次いで移植された細胞が複製および器官構造を形成する間中ずっと制御された速 度で分解する、生体適合性ポリマー性移植片を提供することである。

発明の要約 所望の機能を有する細胞が、機能的な器官等価物を生成するために、予め患者に 移植され、そして血管および結合組織で浸潤された、生体適合性、生体分解性ま たは非分解性のポリマー性土台上および土台中に接種する方法が開示されている 。得られた類器官は、与えられた組織の実質成分および宿主の血管成分とマトリ ックス成分から形成されたキメラである。

マトリックスは、血管が内部成長するために、弾力性のある、非毒性で、注入可 能な多孔性鋳型であるべきである。孔サイズは、通常、約１００ミクロンと３０ ０ミクロンの間であり、血管および結合組織が、マトリックスの約１０％から９ ０％の至る所で内部成長するのを可能にし、そして細胞または患者に損傷を与え ることなく、肝細胞のような細胞を注入することを可能にすべきである。導入さ れた細胞は、結合組織に付着し、そして血管によって栄養供給される。マトリッ クスまたは支持構造を形成するための好ましい材料は、生体分解性合成ポリマー であり、例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリ無水 物、またはそれらのコポリマー、またはポリビニルアルコールから誘導されるス ポンジである。これらの材料の成分は、細胞付着性を増大するために二次材料で 覆われ得る。ポリマーマトリックスは、内部成長する組織の通路を与えるために 形造られなければならず、その結果生存性、および機能に必要な数の細胞を付着 させるのに適切な部位を形成し、そして血管新生および栄養物の拡散を可能にす る。生体分解性材料の利点は、脈管形成因子のような化合物、すなわち、血管、 およびリンパ管網または神経線維の内部成長を増強するか、または可能にする生 物学的活性化合物が、マトリックスの分解中にゆっくりと放出されるためにマト リックス内に取り込まれ得る、ということである。

１種またはそれ以上のタイプの細胞は、選択され得、そしてマトリックス上で生 育され得る。好ましいタイプの細胞は、肝細胞のような実質細胞であり、それは 通常の条件下で培養するのは困難である。肝臓タンパク質欠損症、および嚢胞線 維症のような代謝欠陥から生じるタンパク質のような、他面では欠けているタン パク質をコードする遺伝子を含有するように、遺伝子工学により作られた細胞は 、この方法で移植され得る。

肝細胞のように酸素要求性が高い細胞を移植する好ましい実施態様では、内在す るカテーテルを含む多孔性移植片は腸間膜内に移植され、ある期間、例えば５日 間予備血管新生され、そして細胞が注入される。肝細胞に対する最も好ましい実 施態様では、ポリマー移植の直前に、門脈工大静脈吻合（ｐｏｒｔａｃａｖａｌ 　５ｈｕｎｔ）が、移植片の複製および機能を増大させるために栄養刺激因子を 移植片に与えるように作り出される。

図面の簡単な説明 図１は、４日目、５日目、および６日目における１ｖａｌｏｎ内での組、織の内 部成長度（μ）である。

図２３および２ｂは、経時のＩｖａｌｏｎの血管分布であり、４日目、５日目、 ６日目、および１４日目における、血管／ＨＰＦ　（図３ａ）および血管面積（ μ２）（図３ｂ）である。

図３は、移植片の成長度に関する肝栄養刺激の効果のグラフであり、コントロー ル、７０％肝切除のみ、および門脈工大静脈吻合と７０％肝切除との組合せに対 する細胞面積（μ、２）である。

図４は、Ｉｖａｌｏｎ内での肝細胞生存数のグラフであり、５百万個の細胞およ び１子方個の細胞に対する、０時間、２４時間、および１週間における肝細胞面 積（μ２）である。

発明の詳細な説明 細胞移動および移植のための土台として、人工基質を用いて機能性器官等価物を 提供する方法が、本明細書中に開示されている。細胞の形状は、細胞骨格成分に より決定され、そしてマトリックスへの付着は、細胞***および分化した機能に おいて重要な役割をする。分離された細胞が、細胞付着せずに懸濁液として成熟 組織内に置かれた場合、それらの細胞は、付着部位を見い出す上で、極性化を達 成する上で、そして機能化する上で困難を有し得る。なぜなら、それらの細胞は 内在性の組織化（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を欠いて開始するからである。こ のことは、組織化しくｏｒｇａｎｉｚｅ）、増殖し、そして機能するために生存 可能なままであり得る移植された細胞の総数を制限する。

構築され、うま（移植され、機能するべき器官に対しては、マトリ、クスは、移 植後の血管の内部成長の前に、細胞成長および細胞分化が起こるようにし、栄養 物に対して十分な表面積と曝露を有しなければならない。マトリックス内で細胞 をうまく移植し、成長させるのに要する時間は、マトリックスが移植される区域 が予備血管新生されているならば、非常に低減される。移植した後、その立体配 置は、栄養物および老廃物の拡散を可能にし、そして、細胞増殖が起こるように 血管の内部成長が続くことを可能にする。

細胞は、マトリックス上に接種後移植され得るか、または所望の部位に既に移植 されたマトリックス内に注入されるかのいずれかである。後者は、マトリックス がその部位を予備血管新生するために使用され得るという利点を有する。

土台の設計および構築： 土台の設計および構築は、第一に重要なことである。マトリックスは、血管の内 部成長のために、弾力性のある非毒性で注入可能な多孔性鋳型であるべきである 。その孔は、血管の内部成長を可能にし、そして細胞または患者に損傷を与える ことなく、肝細胞のような細胞の注入を可能にするべきである。これらは、一般 に、約１００ミクロンおよび３００ミクロンの間の範囲の、相互に連結した孔で ある。細胞に対して栄養物および成長因子を適切に拡散させ得るために、そして 新しい血管および結合組織を内部成長させ得るために、マトリ。

クスは、表面積を最大にするように形造られるべきである。

現在では、耐圧縮性および／または耐引っ張り性のある孔構造が好ましい。

好ましい実施態様では、マトリックスは、生体吸収性、または生体分解性の合成 ポリマー、例えば、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、ポリグルフー ル酸およびコポリマーまたはそれらの混合物、から形成される。非分解性材料も また、マトリックスを形成するのに用いられ得る。適切な材料の例としては、エ チレンビニルアセテート、ポリビニルアルコールの誘導体、テフロン、およびナ イロンが挙げられる。好ましい非分解性材料は、エステルを含む、ポリビニルフ ル化誘導体である。非吸収性ポリビニルアルコールスポンジは、Ｕｎｉｐｏｉｎ ｔ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓから１ｖａｌｏｎ”として市販されている。この材料 を製造する方法は、Ｗｉ　１ｓｏｎの米国特許第２．６０９゜３４７号；　Ｈａ ｍｍｏｎの第２．６５３．９１７号、Ｈａｍｉ＋ｏｎの第２．６５９．９３５号 、Ｗｉｌｓｏｎの第２．６６４．３６６号、ＷＨｓｏｎの第２．６６４．３６７ 号、および、Ｗｉｌｓｏｎの第２．８４６．４０７号に記載され、それらの教示 は本明細書中に参考として援用されている。コラーゲンは、使用され得るが、制 御可能なものではなく、好ましくない。これらの材料は、すべて市販されている 。非生体分解性ポリマー材料は、成長細胞の根本的な性質に依存して使用され得 、ポリメタクリレートおよびシリコンポリマーを包含する。

ある実施態様では、基底膜成分、寒天、アガロース、ゼラチン、アラビアゴム、 コラーゲンｒ１Ｍ、ｒｘｌＭ、ｕ１２、ｒｖ３Ｍ、およびＶ型、フィブロネクチ ン、ラミニン、グリコサミノグリカン、それらの混合物、および細胞培養の当業 者に周知の他の材料のような化合物でポリマーを被覆することによって、細胞の ポリマーへの付着は増強される。

マトリックス内で用いるすべてのポリマーは、その後の成長および増殖を行う細 胞に適切な支持を与えるのに必要な力学的および生化学的パラメーターを満たさ なければならない。

ポリマーは、インストロン（１ｎｓｔｒｏｎ）テスターを用いた引っ張り強度の ような機械的特性に関して、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるポリ マー分子量、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によるガラス転移温度、および赤外 （ＩＲ）分光法による結合構造に対して、そしてエイムス（Ａｍｅｓ）アッセイ およびインビトロでの奇形遺伝性アッセイを含む初期スクリーニング試験による 毒物学、および免疫原性、炎症、放出および分解の研究のための、動物での移植 の研究に関して特徴付けられ得る。

好ましい実施態様では、マトリックスは、移植し、血管組織および結合組織が内 部成長した後、マトリックス内部に細胞を注入するためのカテーテルを含む。以 下の実施例に記載のように、異なる直径を有する医療用シラスティ、り（ｓｉｌ ａｓｔｉｃ）チューブから形成され、そしてマトリックス全体に細胞を均一に分 布させるための異なる出入口から形成されたカテーテルは、特に有用である。他 の方法もまた用いられ得る。

例えば、外部からマトリックス内部の種々の部分へのマトリックス分布チャンネ ル内に作る方法、またはマトリックス内で相互に連結した孔内に針を介して細胞 を直接注入する方法などである。

移植のための細胞の調製 細胞は、ドナーの臓器から、またはドナーの臓器からの細胞の細胞培養から、ま たは確立された細胞培養系から、得られ得る。好ましい実施態様では、細胞は、 ドナーの臓器がら直接得られ、洗浄され、そして予備移植され、予備血管新生さ れマトリックス内に直接移植される。細胞は、組織培養の分野の当業者に周知の 技術を用いて培養される。

１種またはそれ以上の細胞系の付着のための単一のマトリックスを用いる方法の １つの変法において、初期の細胞付着および成長が、マトリックス内で各集団に 対して別々に起こるように、土台が構築される。あるいは、単位となる土台は、 特定の場所に種々のタイプの細胞を付着させるのに最適な異なる材料から形成さ れ得る。付着は、細胞とマトリックスの組成物の両方のタイプの相関的要素であ る。走査型電子顕微鏡検査、組織学、および放射性同位元素による定量評価を用 いて、細胞の付着および生存性は評価され得る。

本発明の好ましい実施態様は、宿主内に移植した単一マトリックスを利用すべき であるが、１つ以上のマトリックスを使用するのが好ましいという状況があり、 各マトリックスは、異なるマトリックスから機能的な三次元器官構造を形成させ るために、付着細胞が成長するのに最適な時間で移植される。

インビトロおよびインビボの両方での移植された細胞の機能は、決定されなけれ ばならない。インビボでの肝機能の研究は、レシピエンドの総胆管内にカニユー レを置くことにより行われ得る。次いで、胆汁は、増加するように集められ得る 。胆汁色素は、誘導体化されていないテトラビロールを捜すために高圧液体クロ マトグラフィーにより分析され得、または、Ｐ−グルクロニダーゼで処理するか 、または処理せずに、ジアゾ化アゾジピロールエチルアントラニレートと反応さ せることによりアゾジビロールに変換された後、薄層クロマトグラフィーにより 分析され得る。二抱合型ビリルビンおよび単抱合型ビリルビンもまた、抱合型胆 汁色素をアルカリメタ／−ル分解した後、薄層クロマトグラフィーにより決定さ れ得る。一般的に、機能的な移植された肝細胞の数が増加するにつれて、抱合型 ビリルビンの濃度は増加する。簡単な肝機能検査もまた、アルブミン生成のよう に、血液サンプルに関して行われ得る。類似器官の機能の研究は、移植後の細胞 機能の程度を決定するのに必要とされるように、当業者に周知の技術を用いて行 われ得る。標識化グルコースを用いる研究、およびタンパク質アッセイを用いる 研究は、ポリマー土台上の細胞量を定量するために行われ得る。次いで、これら の細胞量の研究は、何が適切な細胞量なのかを決定するために、細胞機能の研究 と相関関係が有り得る。

（１ゾ’ｔ４ｅ） 移植の方法 本明細書中に記載の技術は、異なる組織構造を達成するために、多くの異なる細 胞タイプを送達するために用いられ得る。例えば、膵臓の島細胞は、糖尿病を治 療するためにインシュリンの適切な分泌によりグルコースの調節を達成するため に、肝細胞を移植するのに特に用いる様式と類似の様式で送達され得る。他の内 分泌組織もまた、移植され得る。マトリックスは、特定の適用に適するように、 身体の多くの異なる区域内に移植され得る。移植において、肝細胞を注入するた めの腸間膜以外の部位には、皮下組織、腹膜後絞、腹膜前肢、および筋肉内腔が 挙げられる。

これらの部位への移植はまた、標準的な外科的手技を用いて、門脈工大静脈吻合 術、および肝切除術により行われ得る。

これらの追加的な手技の必要性は、肝細胞の送達が必要であるという特定な臨床 的状況に依存する。例えば、肝細胞の再生を活性化するシグナルが、患者の潜在 的な肝疾患から患者内に生じている場合は、肝切除の必要はない。同様に、肝疾 患の一部分として副行チャンネルを通しての、重要な門脈工大静脈吻合術を行う 場合は、移植片の再生を刺激するために、門脈工大静脈吻合の必要はない。大部 分の他の適用においては、門脈下大静脈吻合術または肝切除術の必要はない。

上記のように、ポ１ツマー性移植片および予備血管新生を用いる方法は、以下の 実施例を参考として、さらに理解される。

実施Ｎｌ：細胞のインビボでの生存に必要とされる因子の決定 先願の特許出願に記載の方法は、移植後の細胞の生存における種々の因子の相対 的な重要性を決定するために用いられた。肝細胞は、単離直後に検査され、その ときにインビトロのポリマー構築物上に置かれ、そして移植後を時間０として開 始し、種々の時間点で検査された。標準的な肝細胞単離技術が用いられた。移植 は、インビトロでポリマー性繊維複合体に様々な密度の細胞を付着させること、 次いでこの複合体を移植することから成っていた。腸間膜は移植部位であった。

順調に機能する肝細胞の予備移植が、一定して高い生存率を達成し得るという結 果が示された。生存率は８５〜９０％の範囲であった。ルーチンパーコール（Ｒ ｏｕｔｉｎｅ　Ｐｅｒｃｏｌｌ）分離は、生存率を改善することが見出された。

また、生存率と機能が、インビトロでのポリマー構築物上で高（維持されること もまた測定された。対照的に、先行技術の方法を用いて、移植後の細胞の生存率 および機能の急激で大きな減少があった。これらの繊維複合体の定量分析に対す る、形態測定によるアプローチが行われたが、それは移植片中で生存可能な細胞 が非常にまれなので困難であった。細胞損失の概算量は９５〜９７％の間であっ た。組織学的には、長期間の移植成長（ｅｎｇｒａｆ　ｔｍｅｎ　ｔ）を伴った 、最初の２４〜２８時間後に生存している細胞集団の安定性およびこれらの細胞 の機能は１年までであると思われ、このことは、アルブミンに対するインンチュ ーの組織化学的な染色により証明された。肝細胞は、１００−２５０　ミクロン の間で変わる直径を有する塊り中に残存していた。これらの塊りは、細胞密度の 適用および移植部位の場所に依存せずに外観上不変であった。これらの塊りは常 に、未変性の組織および血管に最も近い領域では優勢であった。これらの観察は 、拡散の限界、特に、酸素の拡散の限界が肝細胞の死の最もありそうな要因であ ることを示唆した。対照的に、新しい軟骨を作るために軟骨細胞を用いる類似の 実験は、同種の軟骨板を形成して高度に成功し、このことは、低酸素症による損 傷に対する肝細胞に特定の感受性が問題であることをさらに示唆している。

実施例２：ポリ乳酸およびポリグリコール酸のマトリックス上における予備血管 新生および細胞移植炙去ヱニ皇五肚 シラスティックチコープ（０，３ｉｖ−，１０）を２．５インチの長さに分割し た。一方の端を閉じ、そして０．２５＋ｎｍの穴をチューブにあけた。これらの 注入カテーテルを、５　ｍｍの厚さのポリビニルアルコール発泡体（Ｉｖａｌｏ ｎ、　Ｕｎｉｐｏｉｎｔ　Ｉｎｄｕｓｔ、）の１　ｃ＋ａディスク内の中央に挿 入した。次いで、これらのデバイスを移植のために滅菌した。

艶嵐立並亘 ２００〜２５０　ｇのＦｉｓｈｅｒ　３４４　ラットをメトキシフルラン（ｍｅ ｔｈｏｘｙｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔し、腹部の手術の準備をした。中央切開し、 そして腸間膜を滅菌したガーゼ上に注意深く置いた。次いで、ポリマーを腸間膜 上に置き、さらに腸間膜をそのデバイス上でそれを包むように折り返した。その ポリマーを１本の６−ＱＰｒｏｌｅｎｅ”″（Ｅｔｈｉｃｏｎ）縫合糸でその場 で固定した。このとき、腹壁の側面を切開し、注入カテーテルを筋肉を介して皮 下ポケットに挿入し、そして固定した。腹部を閉じ、そして皮膚を閉じた。次い で、これは、肝細胞を無傷で導入するために後に通じ得た。

柾鳳Ｊ１月」査 適切なホルマリン固定をした後、各々の予備血管新生された移植片を、注入カテ ーテルの軸に垂直な、４つの予め決定された部位で区分化した。Ｈｅｍａｔｏｘ ｙｌｉｎおよびＥｏｓｉｎ（Ｈ＆　Ｅ）染色を行い、そしてその切片を血管分布 、組織の内部成長および生存可能な肝細胞の区域に対して評価した。モデル３０ ００イメージアナライザーを用いて、これらのパラメーターの数量化を行った。

託１１ト引臥限 Ｓｅｇｌａｎ法［Ａｉｋｅｎ、　１９９０　＃　１３］の変法を用いて、肝細胞 を単離した。同系のドナーのＦｉｓｈｅｒ　３４４の２００−２５０　ｇのラッ トをメトキシフルランで麻酔した。肝臓を露出し、モして■ｖｃを１６ｇの血管 カテーテル（ａｎｇｉｏｃａｔｈ）でカニニーレ挿入した。カルシウムを含まな い緩衝潅流液を用いて、３８℃で６分間の潅流を行った。これに続いて、適切に 肝細胞の分離が達成されるまで、０．０５％：＋ラゲナーゼＤ（Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の０．０５Ｍ塩化カルシウム含有緩衝液で潅流した 。次いで、パーコール（Ｐｅｒｃｏｌ　１）密度遠心分離を用いて、肝細胞を精 製した。生存率をトリバンブルー核排除法（Ｔｒｙｐａｎ　Ｂｌｕｅ　ｎｕｃｌ ｅａｒ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）により測定した。

肚１ｌｌＬ人 肝細胞を、Ｗｉｌｌｉａ＋＊ｓ　Ｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に１×１０７および２ Ｘ１０７生存可能細胞／ｃｃで懸濁した。ポリマー予備血管新生の５日後、細胞 注入を受けるラットを麻酔し、皮下注入カテーテルを露出させ、そして０．５ｃ ｃの細胞懸濁液を注入した。そして、注入直後、注入１日後または注入７日後の いずれかで、動物を集めた。カテーテルを皮下ポケットに置き換え、そして皮膚 を再び閉じた。

結果 １１叫古里底五 予備血管新生の１〜１４日後に、デバイスを集めた。その期間中、組織の内部成 長は、非常に一定した速度で起こった。１日目と３日目の間に、細胞性の増加と 共にフィブリン塊の沈着を認めた。この期間中に認められた組織の組織化または 血管の内部成長の証拠はなかった。４日目に組織化された組織および毛細血管が 、デバイスの相互に連結された間隙中に伸びるのを認め得た。組織の内部成長は 、予備血管新生の７日目に合流に達するまで、デバイスの両側から対称的であり 、組織の内部成長の速度は、図１に示すように、４日目と７日目の間では６０４ μｍ７日（５７５−６２７μｍ７日の範囲）で一定であった。

空間をポリマーと組織との間で一定に維持することは不可欠であると思われる。

肝細胞の注入および移植のためのチャンネルを作り出すのが、この空間である。

証ｉ公血 ２つの方法で血管分布を評価した。第一に、単位面積あたりの血管の数を、ポリ マー内の予め選択した多数の部位で決定し、そして平均値を得た。第二に、これ らの同一の領域内の血管面積を決定した。定量した領域では、組織化された組織 の内部成長は、最も中心の範囲であった。図２８およびｂに結果をグラフで示し た。一旦、組織の組織化が起こると、血管の数／ＦＩＰＦは、予備血管新生の５ 日目に最大密度１７に到達し、その後１４日までには９本の血管／ＨＰＦに減少 した。このことは、期間中一定のままであった血管面積とは対照的であり、この 期間中に少数から多数の血管に発達したことを示している。

の　および 肝細胞は細胞注入時に、上記ポリマー中に均等に分布した。

期間中、生存細胞が腸間膜およびポリマーとの接触面にますます局在化した。組 織学的には、生存細胞はまず、存続のために線維および血管組繊網への付着を要 することが示された。

接触していないものは２４時間以内に死滅する。１週間で、肝細胞はデバイスの 外縁に限定された。上記ポリマー中心部の細胞は、組織の内部成長部分と付着し ていても成長する様子はなかった。再造形（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）が起き、そ して移植した細胞は、上記ポリマーの外縁の周辺に、４〜５の細胞の島として、 または２〜３の細胞層のシートとして線維および血管組織に組み込まれた。上記 ポリマー中の肝細胞面積を試験し、生存を評価した。生存肝細胞面積の４０％が 最初の２４時間で減少し、１週間で最初の肝細胞面積の２５％まで漸次減少する ことが示された。４ケ月後の移植片の試験では、肝細胞面積の継続的な減少を示 し、移植した細胞、０時間の５〜１０％になった。注入する細胞数を１００％ま で増加させることは、期間中、面積に比例した減少をともなって、生存肝細胞面 積の１０（１％増加を提供する。

実施例３：多孔性ポリビニルアルコール移植片を用いた肝細胞の移植 実施例１を含む多くの研究は、細胞培養において肝細胞をポリグリコール酸のポ リマー繊維へ付着させ、そしてこれらのポリマー細胞構築物を腸間膜へ移植する 手法を用いると、肝細胞に多大な損失のあることを示した。これらの問題を解決 するために、細胞移植の前、開、および後での細胞の生存力および機能を評価す るための新しいアッセイ、代替細胞単離技術、細胞の生存能力を向上させる新規 物質、および移植のための血管新生した表面積を増進するための予備血管新生シ ステムを開発した。これらの努力の結果として、細胞が死亡する主な原因は、移 植時の変動に関連していることを見いだした。大部分の細胞死が移植後、最初の ６時間以内で生じた。

９５〜９７％の肝細胞が、移植後の、この早い時期に失われた。

インビボで移植片の組織切片を分析するために、形態測定の手法を開発した。こ のインビボ分析を発展した定量的「ノーザン」プロット解析と組み合わせ、移植 片中の総ＲＮＡおよび肝特異的アルブミンｍＲＮＡを測定した。これらのインビ ボ観察記録は、ポリマー上の細胞のインビトロＲＮＡ分析およびゲル電気泳動法 を用いたアルブミン産出物の測定と比較し得た。ＭＴＴ（３０）　４．５−ジメ チルチアゾール−２−イル（−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド） を用いて生存性を測定する、インビトロおよびインビボ分析をアッセイに用いた 。この生化学的アッセイを細胞生存性の非特異的マーカーとして用い、酸性ホス ファターゼ測定法と比較した。

長期にわたる移植および、肝細胞および胆管様の構造体の組織化として定義され る、成功した移植を可能とする、多孔性ポリマーのポリビニルアルコールを用い たシステムを開発した。多孔性材料のようなスポンジへ予備血管新生を行うポリ マーシステムを開発することによって、細胞の生存力６０〜７０％の範囲まで増 加した。細胞供給の効果は、移植後２４〜２８時間で４０から６０％の間である と評価される。この結果は、肝細胞の２次的な移入を伴う幾何的なスポンジへの 予備血管新生の戦略が、早い時期の細胞の損失を有意に減少させることを示す。

Ｇｕｎｎうｙ　）　（１５０〜２５０　ｇ）を麻酔し、そして端から側面まで門 脈工大静脈吻合術を行った。細胞注入のためのセントラルマルチポートシラステ ィックチューブ（ｃｅｎｔｒａｌ　ｍｕｌｔｉｐｏｒｔ　５ｉ１ａｓｔｉｃ　ｔ ｕｂｅｓ）と共に１．　Ｓｘ　ｔ、　５ｃｍのポリマー性スポンジを、腸間膜の エンベロープまたは皮下ポケットに置いた（ｎ＝２０）。

予備血管新生の５日後に、肝細胞を同系のウィスターラットからフラゲナーゼの 潅流によって単離した。１×１０７の肝細胞を注入した。移植して３日後、７０ ％の肝切除を行、い、そして移植片を６ケ月まで順次、Ｈ＆Ｅ切片によって評価 した。未変性の肝臓における管状構造体、異所性の移植片、および上記移植片の 個々の断面を形態測定の数量化によって比較した。統計的な有意性を評価するた めに種々の分析法を用いた。

Ｇケ月を通じて、肝細胞の移植成長および再組織化が全ての移植片外側で起きた 。　１　＋＊ｍまで組織化した小節はプレートに配置した肝細胞と同定された。

４および６ケ月で、３０％の移植片（ｎ・１０）は立方上皮が並んだ管状構造体 を含有し、その組織の外見は胆管過形成を伴う異所性移植片の構造体と類似して いた。これらの管の面積を、異所性移植片および未変性の肝臓中にある、立方上 皮をともなった最小の胆管の構造体である、小菓間胆管と比較した。移植片中の 管は７４５μ２±４７の平均面積を有し、異所性移植片内の肥厚性（ｈｙｐｅｒ ｐ　１ａｓｔ　ｉｃ）管は８１５μ２±４１（ｐ・０Ｊ４）を有し、その一方で 、未変性肝臓の門脈の三橋造と似た形態をもつ管は１３６０μ２±１０５（１） ＜０．００１＞の平均値を有した。

腸間膜および皮下での肝細胞移植物中の、肝組織の組織化した小節内部の管状構 造体の、長期にわたる移植成長および発達の両方を立証した。これらの構造体は 、形態学的にも形態測定的にも異所性肝臓移植片中の胆管過形成でみられたもの と類似しており、肝細胞移植後の胆管組織化を示唆する最初の証拠である。

実施例４：ポリマー性繊維マトリックスとポリビニルアルコールスポンジマトリ ックスとの比較 なにも含まないポリマーを移植して、該ポリマー中で繊維および血管組織を内部 成長させてから肝細胞を導入し、血管新生した表面積を増加させた。これによっ てより短かい拡散距離で酸素供給が可能になる。以下を包含するいくつかの幾何 学的な配置を試験した：１）生体吸収性のポリマー性繊維のみ２）分解されない ポリマー性繊維３）分解される繊維および分解されない繊維との混合物４）セル ローススポンジ５）　Ｉｖａｉｏｎスポンジ。

支持されない繊維複合体は全て、２つの理由で予備血管新生に適合しなかった。

何よりもまず、それらは十分な耐圧縮性を有せず、従って移入した線維および血 管組織が萎縮した。

このことはまた、直接注入、または、マルチポートカテーテルを内在させること による肝細胞導入のいずれにおいても、肝細胞の導入に対して非常に高い抵抗を 生じさせた。直接注入は移植片の隙間に出血を生じさせた。

スポンジモデルは優れた耐圧縮性を有することが認められたため、スポンジモデ ルを開発し、そして可能性を有する空間の維持が可能となった。Ｉｖａｌｏｎス ポンジおよびセルローススポンジの両方について多くの研究を行い、血管新生の 時間経過を測定した。両方のモデルにおいて、血管の良好な内部成長が生じた。

標準的なＩｖａ　Ｊｏｎスポンジ移植片は直径１０１１で、高さは０．３ｃ■ま でのディスクであった。５日までに血管の良好な内部成長があり、１１日までに 血管は非常によく内部成長した。小孔は相当に均等なサイズで、かつ全てが内部 で結合した。セントラルマルチボートカテーテルをＩｖａｌｏｎディスクに置い たシステムを設計することにより、肝細胞をシングル注入またはマルチプル注入 のいずれでも導入し得た。セルローススポンジは最小限の炎症で良好な血管内部 成長をさせたが、小孔が全（不均一な大きさであり、従って上記１ｖａｌｏｎ程 は適合しなかった。

方法 Ｉｖａｌｏｎスポンジ ＩｖａｌｏｎスポンジをＦｉｓｃｈｅｒ　３４４ラツトの腸間膜に置き、種々の 期間で予備血管新生させた。指定した時期に、中央に配置したシラスティックカ テーテルを通じて肝細胞を注入した。

肝細胞の濃度、およびスポンジに注いだ最終容量を変化させた。肝細胞注入後０ 時間および３日後に、上記動物をホルマリンで潅流した。これは先の研究に基づ いて決定された。その研究によれば、上記時間以降でかなり一定した細胞の生存 を示し、そして最初の２４時間で肝細胞が損失した。次に、細胞／ポリマー構築 物を切片にし、組織の内部成長、血管分布、肝細胞の分布および生存能力を評価 した。形態測定の画像解析を用いて、生存肝細胞の測定を行った。

細胞数を測定するために、各々の移植片を４片に分割し、そしてこれらの各々か ら切片を作製した。これら切片の各々は３つの相互的な切片を通じて顕微鏡下で 検査され、そして細胞面積を測定した。次いで平均細胞面積および体積を決定し 、ソシてスポンジの体積から細胞数を推定した。

ポリマー　か゛のＲＮＡの コラゲナーゼ潅流およびパーコールによる遠心分離によって肝細胞を単離した。

予備血管新生された１ｖａｌｏｎスポンジへの注入に先だって、ｌＯμＣｉ／ｍ １３■−ウリジンの懸濁液中で細胞質ＲＮＡを標識した。あらかじめ標識した肝 細胞ＲＮＡは、肝細胞ＲＮＡと侵入細胞ＲＮＡとの区別を可能とする。次いでｓ ｘ　ｉｏ’の標識肝細胞を、他で記載のように１ｖａｌｏｎスポンジへ注入した 。

ポリグリコール酸（ＰＧＡ）を用いた先の実験では、細胞を組織培養シャーレ中 のポリマーに添加し、１０μＣ１１０１３■−ウリジン中で一晩インキユベート し、そして前記のように移植した。

ＲＮＡを単離するために、間隔を置いて移植片を取り出し、そしてグアニジンイ ソチオシアネート溶解溶液に浸した。上記溶液の多数のアリコートをスポンジに 通じて作用させ、そしてこれらを合した。続いてフェノール−クロロホルム抽出 、そして塩化リチウムおよびエタノール沈澱でＲＮＡを精製した。

最終ＲＮＡサンプルをスロットプロット（ｓｌｏｔ　ｂｌｏｔ）装置（Ｓｃｈｌ ｅｉｅｈｅｒ＆　５ｃｈｕｅｌｌ）を用いて、ニトロセルロースフィルターに添 加した。続いてアルブミンｍＲＮＡに特異な、３２Ｐ標ｔｊｌｉｃＤＮＡプロー ブでハイブリダイゼーションし、上記フィルターを洗浄し、さらにＸ線フィルム の上に置いた。生じたオートラジオグラフをデンシトメーターで調べ、各サンプ ル中のアルブミンｎＲＮＡの相対的な量を測定した。あるいは、ＲＮＡサンプル をｍＲＮＡ種ごとに分離するため電気泳動し得、ニトロセルロースにプロットし て、そして普通にプローブし得る。後者のこの手法はノーザンプロット解析と称 される。

結果 Ｉｖａ　Ｉｏｎスポンジ 組１しλ丙」■１長 侵入した組織は、７日間で完全に３　ｍｍの厚さでＩｖａｌｏｎ上を架橋した。

その線維および血管成分の程度は時間とともに増加する。高度に血管化し、線維 化が最小の組織は５日で出現した。

このときなお移植片の中央部に、相対的に低細胞領域（ｈｙｐｏｃｅｌｌｕｌａ ｒ　ａｒｅａｓ）が存在した。組織は１４日間でさらに組織化し、細胞移植に有 効な空間が減少した。

゛　した　の 細胞の分布は全期間を通じて一定であり、注入直後の細胞の分布に等しかった。

注入後３日間に、細胞の生存が周辺部においてより支配的となり、そこでは新し い組織がさらに組織化した。

汗１１■針九存 肝細胞の生存を３日間、時間経過に応じて１切片あたり１０〜１４領域の細胞区 域、そしてスポンジあたり４つの切片で比較しながら測定した。これを、同様の 肝細胞を単離したのと同種の群のう、トに注入した肝細胞の生存と比較した。結 果を図４に示す。　第１群の動物の形態測定では、平均生存細胞面積が３１５３ ±６４５（注入後、０時間のＳ、　Ｅ、　Ｍ、　）であることを示した。

３日で平均生存細胞面積は１９６０±５６７であった。

これらの細胞面積は、０日から３日の平均細胞生存率６２％と一致した。測定し た平均細胞サイズおよびスポンジの体積に基づいた細胞数を計算すると、３白目 で３．６Ｘ１Ｇ’の生存肝細胞が認められた。

第２群の動物では、注入後０時間での細胞の生存は、１０８９±３３４の細胞面 積、２４時間目での１１７５±４４５の細胞面積で示された。これは上記方法の 誤差範囲内で、この期間にわたる完全な生存を示す。

これら移植片における、生存細胞総数はスポンジあたりそれぞれ１．８Ｘ１０６ および１．９Ｘ　１０’細胞であった。

ポリマー　か゛のＲＮＡの ＰＧＡおよびＩｖａｌｏｎスポンジのサンプルをアルブミン＋ｏＲＮＡレベルで 比較した。ＰＧＡの実験区では４つのポリマー片を各時間点において合同し、対 してＩｖａ　Ｊｏｎの実験区では２つのスポンジサンプルを各時間点において処 理した。スロットプロット解析の定量は、０と２４時間の間でＰＧＡポリマー上 の肝細胞のアルブミンｍＲＮＡが３３倍すなわち９７％減少することを示し、ノ ーザンブロ）ｌ）解析の先の結果と同様であった。対照的に、Ｉｖａｌｏｎスポ ンジのサンプルは、２４時間で１，６倍（３６％）の減少を示した。

さらに、得られるＩｖａｌｏｎ　ＲＮＡの総量は０〜２４時間で類似するのに対 して、ＰＧＡポリマーではこれが劇的に降下した。これらの結果は、肝細胞がＩ ｖａｌｏｎスポンジ上でアルブミン遺伝子の発現レベルに対して、インビボでの それらの機能の大部分を維持するが、ＰＧＡポリマー上では維持しないことを示 す。

実施例５：予備血管新生化マトリ、クスを用いた、移植片の生存に関する肝栄養 性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｈｉ　ｃ）刺激作用の効果 これらの結果は、肝細胞移植のスポンジモデルの予備血管新生が、移植後最初の ２４時間における細胞の生存を有意に改良することを示す。門脈工大静脈吻合術 および肝切除術、および一時的に移植された組織のための潅流チャンバーを用い て、移植細胞に直接０２を添加することによって生存のさらなる増加を獲得し得 る。

方法 炙しヱニΩ■皿 同系のルイス（Ｌｅｖｉｓ）ラット２５０〜３５０　ｇ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒ４ ｖｅｒ）をメトキンフルーランで麻酔した。中央切開し、そして腸間膜を滅菌ガ ーゼ上に置いた。シラスティック注入カテーテルを中央に置いたＩｖａｌｏｎ” （Ｕｎｉｐｏｉｎｔ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）フオームディスクを腸間膜のエン ベロープに固定した。注入カテーテルを離れた皮下部位に導入した。ポリマーを 付けた腸間膜を腹腔にもどし、そして切口を閉じた。動物に、ケフゾル（ｋｅｆ ｚｏｌ）を１００　ｍｇ／ｋｇで１回投与した。

下　ム ポリマーの移植に先だってまず門脈工大静脈吻合した。膵十二指腸静脈を結紮し て、そして切開した。肝動脈を避けて注意深く、門脈を肝門から肺静脈へ移動さ せた。左腎静脈から肝臓の下端へ大静脈を後内側に移動させた。この時点で門脈 を肛門で結紮し、そして抄成を起こさないクランプを肺静脈のレベルで適用した 。部分的に咬合したクランプを大静脈の前内側の表面に適用した。静脈切開して 、そして端から側面までの門脈工大静脈吻合をランニング８−ＯＰｒｏｌｅｎｅ ＴＭ　（Ｅｔｉｃｏｎ）縫合糸によって行った。適当な流量を保って移植片を上 記のように配置した。

１１胞皇里■ 肝細胞の単離にはＳｅｇｌａｎの手法（Ａｉｋｅｎ、　１９９０＃１３）の改変 法を用いた。メトキシフルランで相応の麻酔をし、大静脈にカニ二−レ挿入し、 そして肝臓をＣａ”を含まないの生理食塩緩衝液で逆向きに潅流し、続いて０． ０５％コラゲナーゼ［）（［３０ｅｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ＋ｍ）を含む生 理食塩緩衝液（０，０５Ｍ　ＣａＣ１を含む）で潅流した。潅流は３９°Ｃで行 われた。肝細胞の分離が適当になればすぐに、肝臓を切開し、そしてＷｉｌｌｉ ａｍｓ　Ｅ培地（ＧＩＢＣＯ）中での緩やかな分離を達成した。生存能力の基準 として、トリパンブルーの核排除を用いて生存能力を評価した。

次に、密度分離のための８７％パーコール遠心分離を用いて肝細胞をさらに精製 した。そして肝細胞画分を２Ｘ１０７細胞／ＣＣでＷｉｌｌｉａｍｓ　Ｅ培地に 再び懸濁した。全ての生体外での単離は４℃で行った。

の　および　７、 予備血管新生したＩｖａｌｏｎへの肝細胞注入に関する初期の研究に基づいて、 このポリマーを５日間予備血管新生した。これは移植のための最適の組織および 血管の内部成長を提供した。

動物に軽度のメタフェン（ｍｅｔａｐｈａｎｅ）麻酔をし、注入カテーテルを挿 入し、そして肝細胞を注入した。スポンジあたりｌＸ１０７の細胞（０，５ｃｃ ）を注入した。

この時点で部分的な肝切除を、門脈工大静脈吻合（ＰＣ５ｈｕｎｔｓ）の実施お よび未実施について、選ばれた動物で行った。標準として７０％の肝切除を行っ た。

１１ル亘■ｌ 細胞／ポリマー構築物を細胞注入後１週間で回収した。それらを固定し、切片を 作製し、そして）Ｉ＆Ｈによって染色した。

モデル３０００イメージアナライザー、および形態測定を補助するコンピュータ ーを用いて定量を行った。各デバイスを一定の形状で４つの部分で切片作製した 。４つの組織切片の各々から、４つの交叉する切片に従って肝細胞面積が定量さ れた。

これは評価の一定な手段を提供した。種々の分析を用いて統計学上の有意性を評 価した。

結果 ３つの実験群を評価した。肝切除も門脈工大静脈吻合もしていないコントロール 群（１）（ｎ・６）；７０％の肝切除のみを行った第２群（ＩＩ）（ｎ・６）； および、門脈工大静脈吻合および７０％の肝切除（ｎ＝６）を行った最後の群（ ｍ）。スポンジあたりの交叉する切片での肝細胞面積は、コントロールでは２． ６４３μ２（ＳＥＭ±１５８８）であり、そして肝切除のみを行った動物では１ ２．８０９μ２（ＳＥＭ±４０７４）であった。門脈工大静脈吻合（ＰＣ５ｈｕ ｎｔ）をともなって最大の肝栄養性刺激作用および７０％の肝切除を受けた動物 では、肝細胞面積は３４．３７２μ２（ＳＥＭ±９７５２）に達した。これを図 ３にグラフで示した。

門脈工大静脈吻合および肝切除を行った動物における、この増加した移植成長は 、コントロールの１２倍の増加を招き、そして肝切除のみのもののほぼ３倍の増 加を招いた。

組織学的評価はさらに、群間での有意な形態の相違を明らかにし、この相違は以 下のように要約し得る。肝栄養性刺激作用を受けないコントロール動物は、腸間 膜との接触面の近くにあるポリマーの外端で移植成長を示したにすぎない。光間 の至る所で初期の細胞成長をともなうが、デバイスの中央では細胞成長の損失を 生じた。上記細胞は２〜３の細胞層積層体として成長した。部分的に肝切除する と、細胞は厚さ５〜６細胞層の島に豚房配列（ａｃｉｎａｒ　ａｒｒａｎｇｅｍ ｅｎｔ）　Ｌながら成長することが示された。さらに驚（ことは門脈工大静脈吻 合して生じる形態であった。細胞の大きな集合体を上記ポリマーの至る所で認め 得た。これらの細胞は非常に健康的な外見を有した。豚房配列の他に、細胞は未 変性肝臓で見られるひも状の外見で積層に配列した。もう一つの興味ある特徴は 細管状管構造体の出現であった。これらの構造体は胆管と非常に類似していたの で、形態測定の評価を実行した。未変性肝臓の小葉内管および異所性移植片をこ れらの構造体のコントロールとして試験した。肝細胞構造体の組織学上の外見は 、異所性移植片の構造体と非常に類似していた。形態測定の定量化は、上記移植 片（７４５μ２±４７）および異所性移植片（８１４μ２±４０＞の管の大きさ が著しく類似することを示した；未変性の肝臓（１３６０μ２±９７）は有意に より大きな（ｐ＜０．００１）管を有した。

本発明を明確な実施態様に言及して記載したが、表面積を最大にしたマトリック ス上で、そして周囲を養分を含む環境でさらすことによって細胞を培養すること による人工臓器の構築のための方法および手段の、変更および修飾は当業者には 、明らかである。そのような修飾および変更は付随する請求の範囲内に包含され る。

＋ａ目　テＢｉｎ　ＧＢ目 峙り ＦＩＧ、７ 斗旧目　５８目　６８目　＋４−ｇ目 将間 Ｆ／θ２Ｃ −％−Ｂ　ｌｉｌ　５Ｂｇ　（，１１４ｅｌａ時ｐａ’Ｉ ＦＩＧ、２ｂ コ：トｏ−ｔｖ　Ｈｅｐ　ＰＣ／ＨｅｐＦＩＧ、Ｊ フロントページの続き （７２）発明者　イングバー、ドナルド　イー。

アメリカ合衆国　マサチューセッツ ０２１１６、ボストン、モントゴメリー　ストリート７１ （７２）発明者　ランガー、ロバート　ニス。

アメリカ合衆国　マサチューセッツ ０２１５８　、ニュートン、ロンバード　ストリート７７ （７２）発明者　ヴアカンティ、ジョーゼフ　ピー。

アメリカ合衆国　マサチューセッツ ０１８９０　、ウィンチェスタ−、フェルス　ロード　５１

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．人工マトリックスを用いて制御された細胞の移植のための人工マトリックス を形成する方法であって、以下の工程ａ．多孔性で非毒性のマトリックスを患者 に移植する工程であって、該マトリックスが、体内で耐圧縮性または耐引っ張り 性を有し、細胞をマトリックス内に導入するのに適しており、そして血管新生さ れ、生存可能な結合組織で浸潤された１０％と９０％の間の部位を生成するため に血管組織および結合組織の内部成長に適している、工程およびｂ．該マトリツ クスの１０％と９０％の間のものが血管新生されるまで待ち、次いで生存可能な 細胞を血管新生されたマトリックスに導入する工程、 を包含する方法。
2. ２．前記マトリックスの孔サイズが、約１００ミクロンと３００ミクロンの間で あり、血管の内部成長を可能にし、そして細胞または患者に損傷を与えることな くマトリックス内に細胞を注入することを可能にする、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記部位が、腸間膜、皮下組織、筋膜下および腹膜上から成る群から選択さ れる、請求項１に記載の方法。
4. ４．患者に門脈下大静脈吻合を行う工程をさらに包含する、請求項１の方法。
5. ５．マトリックスの原料として、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコ ール酸、ポリ乳酸、コポリマーおよびその混合物およびコラーゲンから成る群か ら、マトリックスを形成するための生体分解性ポリマーを選択する工程をさらに 包含する、請求項１に記載の方法。
6. ６．栄養物、補因子、成長因子、脈管形成を刺激する化合物、免疫モジュレータ ー、炎症の阻害剤、退行因子、細胞の分化を刺激する因子、リンパ管網の内部成 長を刺激する生物学的活性分子、神経成長を増大する因子および薬物から成る群 から選択された化合物をマトリックス内に与える工程をさらに包含する、請求項 １に記載の方法。
7. ７．前記マトリックスが、移植時にマトリックス内に細胞を導入する手段を含む 、請求項１に記載の方法。
8. ８．前記マトリックスが、細胞を導入するための分布チャンネルを含む、請求項 ７に記載の方法。
9. ９．前記マトリックスが、細胞を導入するためのカテーテルを含む、請求項７に 記載の方法。
10. １０．前記細胞が、肝細胞である、請求項１に記載の方法。
11. １１．前記細胞を、副甲状腺細胞、甲状腺細胞、副腎−視床下部−下垂体軸の細 胞、神経細胞、骨および軟骨を形成する細胞、および平滑筋および骨格筋を形成 する細胞から成る群から選択する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法 。
12. １２．多孔性で弾力性のある非毒性のマトリックスであって、該マトリックスが 、患者に移植した後のマトリックスに細胞を導入するための手段との組合せにお いて、体内で耐圧縮性または耐引っ張り性を有し、マトリックスヘの細胞の導入 に適しており、そして高度に血管新生された部位を生成するための血管組織およ び結合組織の内部成長に適しており、患者への移植後、マトリックス内に細胞を 導入する手段と組み合わせる、マトリックス。
13. １３．栄養物、成長因子、補因子、脈管形成を刺激する化合物、免疫モジユレー ター、炎症の阻害剤、退行因子、分化を刺激する因子、リンパ管網の内部成長を 刺激する生物学的活性分子、神経成長を増大する因子、薬物、およびそれらの組 合せから成る群から選択された化合物をさらに含有する、請求項１２に記載のマ トリックス。
14. １４．前記マトリックスが、異なる起源の細胞に対して付着する別々の区域を与 えるために形造られる、請求項１２に記載のマトリックス。
15. １５．前記導入する手段が、マトリックス内に形成されるチャンネルである、請 求項１２に記載のマトリックス。
16. １６．前記導入する手段が、カテーテルである、請求項１２に記載のマトリック ス。
17. １７．前記マトリックスの孔サイズが、約１００ミクロンと３００ミクロンの間 であり、血管の内部成長を可能にし、そして細胞または患者に損傷を与えること なくマトリックス内に細胞を尊人することを可能にする、請求項１２に記載のマ トリックス。
18. １８．前記マトリックスが、該マトリックスの材料として、ポリ無水物、ポリオ ルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、コポリマーおよびその混合物およ びコラーゲンから成る群から選択された、生体分解性ポリマーから形成される、 請求項１２に記載のマトリックス。
19. １９．前記マトリックスが、エチレンビニルアセテート、ポリビニルアルコール の誘導体、テフロン、ナイロンおよびシリコンから成る群から選択された非分解 性ポリマーから形成される、請求項１２に記載のマトリックス。
20. ２０．胆管細胞、副甲状腺細胞、甲状腺細胞、副腎−視床下部−下垂体軸の細胞 、心筋細胞、腎上皮細胞、腸管細胞、腎基底膜細胞、神経細胞、血管細胞、腸管 細胞、骨および軟骨を形成する細胞、平滑筋および骨格筋を形成する細胞から成 る群から選択された細胞をさらに含有する、請求項１２に記載のマトリックス。
21. ２１．分離された肝細胞をさらに含有する、請求項１２に記載のマトリックス。
22. ２２．ポリビニルアルコールの誘導体から形成される、請求項１２に記載のマト リックス。