JP3524919B2 - 臓器移植のための予備血管新生されたポリマー性移植片 - Google Patents
臓器移植のための予備血管新生されたポリマー性移植片Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
米国政府は、NIHの認可番号6M 26698により、本発明
における権利を有する。
における権利を有する。
本発明は、一般に、医学分野および細胞培養分野に関
し、そして特に、生体適合性人工マトリックス上に形成
された移植可能な臓器の領域に関する。
し、そして特に、生体適合性人工マトリックス上に形成
された移植可能な臓器の領域に関する。
先天的欠陥、損傷、または病気により、臓器の機能が
失われ得る。薬物または手術による何回もの治療は、そ
れ自体は十分ではなく、そして患者は死亡するか、また
は重篤な障害を与える。治療に対する１つのアプローチ
は、患者にドナーの臓器または組織を移植することであ
る。シクロスポリンのような薬物は、組織の拒絶を防止
するために使用され得る。しかし、ドナーの臓器はすご
く不足しており、大半は最近死亡した個体から得なけれ
ばならない。
失われ得る。薬物または手術による何回もの治療は、そ
れ自体は十分ではなく、そして患者は死亡するか、また
は重篤な障害を与える。治療に対する１つのアプローチ
は、患者にドナーの臓器または組織を移植することであ
る。シクロスポリンのような薬物は、組織の拒絶を防止
するために使用され得る。しかし、ドナーの臓器はすご
く不足しており、大半は最近死亡した個体から得なけれ
ばならない。
分離された組織を培養し、そして体内に直接細胞を移
植する試みが数多くなされてきた。例えば、臓器全体ま
たは臓器の一部分として、そのいずれかの膵臓組織を糖
尿病患者に移植することが試みられてきた。血清グルコ
ースは、この技術を用いて、より生理学的な方法で制御
されるように見え、そしてそれにより合併症の進行が遅
くなる。初期のアプローチは、長期間に渡る利益を達成
するのに成功しなかったが、それは、単離された島細胞
の塊を門脈循環系に注入することにより、肝臓の血管床
内の移植と共に島細胞を移植することである。より最近
の方法は、宿主による免疫攻撃を防ぐために、膵臓のβ
細胞を被包化すること、および腎臓の被膜下の胎児のβ
細胞を注入することを含んでいた。短期間機能する証拠
はあるが、長期間の結果はあまり満足しなかった（D.E.
R.Sutherland,Deabetologia 20,161−185（1981）;D.E.
R.Sutherland,Diabetologia 20,435−500（981））。現
在は、膵臓の全器官を移植することが好ましい治療であ
る。
植する試みが数多くなされてきた。例えば、臓器全体ま
たは臓器の一部分として、そのいずれかの膵臓組織を糖
尿病患者に移植することが試みられてきた。血清グルコ
ースは、この技術を用いて、より生理学的な方法で制御
されるように見え、そしてそれにより合併症の進行が遅
くなる。初期のアプローチは、長期間に渡る利益を達成
するのに成功しなかったが、それは、単離された島細胞
の塊を門脈循環系に注入することにより、肝臓の血管床
内の移植と共に島細胞を移植することである。より最近
の方法は、宿主による免疫攻撃を防ぐために、膵臓のβ
細胞を被包化すること、および腎臓の被膜下の胎児のβ
細胞を注入することを含んでいた。短期間機能する証拠
はあるが、長期間の結果はあまり満足しなかった（D.E.
R.Sutherland,Deabetologia 20,161−185（1981）;D.E.
R.Sutherland,Diabetologia 20,435−500（981））。現
在は、膵臓の全器官を移植することが好ましい治療であ
る。
分離された細胞を体内に移植するのに伴う問題の一つ
は、それらが三次元的構造を形成せず、そして細胞が貧
食作用および摩耗によって失われることである。この問
題を克服する１つのアプローチは、Limの米国特許に記
載されており、そこでは細胞が球内で被包化され、次い
で移植される。この方法は、時折、生存可能な機能細胞
を維持し得るが、細胞は、器官または構造を形成せず、
まれに長期間生存し、そして被包細胞を複製する。大部
分の細胞は、複製および機能するために、表面に付着す
ることが必要条件である。
は、それらが三次元的構造を形成せず、そして細胞が貧
食作用および摩耗によって失われることである。この問
題を克服する１つのアプローチは、Limの米国特許に記
載されており、そこでは細胞が球内で被包化され、次い
で移植される。この方法は、時折、生存可能な機能細胞
を維持し得るが、細胞は、器官または構造を形成せず、
まれに長期間生存し、そして被包細胞を複製する。大部
分の細胞は、複製および機能するために、表面に付着す
ることが必要条件である。
人工皮膚として使用するために、マトリックス上で細
胞を培養する最初の試みは、薄い三次元構造の形成を必
要とするが、それはYannasおよびBellによる一連の刊行
物に記載されていた。彼らは、細胞と共に接種されたコ
ラーゲン型構造体を用い、次いで露出された領域に渡っ
て置いた。コラーゲンマトリックスを用いる時のある問
題は、分解速度がうまく制御されないことであった。別
の問題は、コラーゲンマトリックスの厚い断片の内部に
移植された細胞が、生存しなかったことであった。
胞を培養する最初の試みは、薄い三次元構造の形成を必
要とするが、それはYannasおよびBellによる一連の刊行
物に記載されていた。彼らは、細胞と共に接種されたコ
ラーゲン型構造体を用い、次いで露出された領域に渡っ
て置いた。コラーゲンマトリックスを用いる時のある問
題は、分解速度がうまく制御されないことであった。別
の問題は、コラーゲンマトリックスの厚い断片の内部に
移植された細胞が、生存しなかったことであった。
表皮細胞と共に線維格子を接種することにより、人工
皮膚を形成する１つの方法は、Bellの米国特許第4,485,
097号に記載され、そこでは血小板および繊維芽細胞の
ような収縮性因子とケラチノサイトのような細胞を組み
合わせて、皮膚等価物を生成するのに用いる水和コラー
ゲン格子を開示している。Yannasらの米国特許第4,060,
081号は、人工皮膚として有用な多層膜を開示してお
り、その多層膜は、体液および酵素の存在下でコラーゲ
ンとムコ多糖との架橋された複合体のような、非分解性
である不溶性の非免疫抗原物質から形成され、膜全体の
水分の流れを制御するために合成ポリマーのような非毒
性物質で覆われている。Yannasらの米国特許第4,458,67
8号は、グリコサミノグリカンと架橋されたコラーゲン
から形成された線維格子が表皮細胞と共に接種されると
いう、皮膚等価物質を製造する方法を開示している。
皮膚を形成する１つの方法は、Bellの米国特許第4,485,
097号に記載され、そこでは血小板および繊維芽細胞の
ような収縮性因子とケラチノサイトのような細胞を組み
合わせて、皮膚等価物を生成するのに用いる水和コラー
ゲン格子を開示している。Yannasらの米国特許第4,060,
081号は、人工皮膚として有用な多層膜を開示してお
り、その多層膜は、体液および酵素の存在下でコラーゲ
ンとムコ多糖との架橋された複合体のような、非分解性
である不溶性の非免疫抗原物質から形成され、膜全体の
水分の流れを制御するために合成ポリマーのような非毒
性物質で覆われている。Yannasらの米国特許第4,458,67
8号は、グリコサミノグリカンと架橋されたコラーゲン
から形成された線維格子が表皮細胞と共に接種されると
いう、皮膚等価物質を製造する方法を開示している。
最初の２つの方法に対する不利な点は、マトリックス
が「永久的な」合成ポリマーから形成されていることで
ある。第'678号の特許は、２つの先願特許のいずれも、
皮膚としての器官を生成するのに、適切な細胞を用いて
任意の形状から形成し得る生体分解性マトリックスを有
しないという特徴を有する。不運なことに、後者のマト
リックスは、主としてコラーゲンに基づいているので、
そのマトリックスの組成および立体配置に渡っての制御
を欠いている。さらに、コラーゲンは酵素作用および時
間いっぱいの加水分解により分解されるので、分解は全
く一定しない。
が「永久的な」合成ポリマーから形成されていることで
ある。第'678号の特許は、２つの先願特許のいずれも、
皮膚としての器官を生成するのに、適切な細胞を用いて
任意の形状から形成し得る生体分解性マトリックスを有
しないという特徴を有する。不運なことに、後者のマト
リックスは、主としてコラーゲンに基づいているので、
そのマトリックスの組成および立体配置に渡っての制御
を欠いている。さらに、コラーゲンは酵素作用および時
間いっぱいの加水分解により分解されるので、分解は全
く一定しない。
Schmidtの米国特許第4,520,821号は、尿路中の欠陥を
修復するために内張りを作るために用いられた類似のア
プローチが記載されている。上皮細胞は、合成マトリッ
クス上に移植され、そこで上皮細胞は、マトリックスが
分解されるように新しい管状の内張りを形成した。マト
リックスは、細胞が複製される間水分を保つため、そし
て細胞が複製されたとき細胞を保持し、案内するためと
いう、２つの二重の目的に役立った。
修復するために内張りを作るために用いられた類似のア
プローチが記載されている。上皮細胞は、合成マトリッ
クス上に移植され、そこで上皮細胞は、マトリックスが
分解されるように新しい管状の内張りを形成した。マト
リックスは、細胞が複製される間水分を保つため、そし
て細胞が複製されたとき細胞を保持し、案内するためと
いう、２つの二重の目的に役立った。
Joseph P.VacantiおよびRobert S.Langerにより1986
年11月20日に出願された、米国出願第07/933,018号の
「人工マトリックスを用いる器官のキメラ新形態発生
（Chimeric Neomorphogenesis of Organs Using Artifi
cial Matrices）」において、その後の体内への移植の
ために、分離された細胞を生体適合性、生体分解性マト
リックス上で培養する方法が記載されている。この方法
は、皮膚の直径より大きな直径を有する三次元構造を形
成するために細胞を培養する以前の試みに伴う主要な問
題を克服するために計画された。VacantiおよびLanger
は、器官形成のために用いられるいかなるマトリックス
においても２つの要素を有する必要があることを認識し
た：それは、失った機能を戻すために大容量の細胞を体
内に移植するのに適した構造および表面積、および、血
管新生もなく生存し続けるために、細胞が付着および生
育するようにマトリックスじゅうに気体および栄養物を
適切に拡散させる方法により形成されたマトリックス、
である。一旦移植され、血管新生されると、栄養物およ
び気体の拡散のために必要とされる多孔度は、もはや重
要なものではない。
年11月20日に出願された、米国出願第07/933,018号の
「人工マトリックスを用いる器官のキメラ新形態発生
（Chimeric Neomorphogenesis of Organs Using Artifi
cial Matrices）」において、その後の体内への移植の
ために、分離された細胞を生体適合性、生体分解性マト
リックス上で培養する方法が記載されている。この方法
は、皮膚の直径より大きな直径を有する三次元構造を形
成するために細胞を培養する以前の試みに伴う主要な問
題を克服するために計画された。VacantiおよびLanger
は、器官形成のために用いられるいかなるマトリックス
においても２つの要素を有する必要があることを認識し
た：それは、失った機能を戻すために大容量の細胞を体
内に移植するのに適した構造および表面積、および、血
管新生もなく生存し続けるために、細胞が付着および生
育するようにマトリックスじゅうに気体および栄養物を
適切に拡散させる方法により形成されたマトリックス、
である。一旦移植され、血管新生されると、栄養物およ
び気体の拡散のために必要とされる多孔度は、もはや重
要なものではない。
しかし、Vacantiにより記載された方法を用いてさえ
も、移植片は、最初インビトロで構築され、次いで移植
された。インビトロの工程を避け得ることは、明らかに
望ましい。Vacantiらの、U.S.S.N.07/343,158は、この
問題を扱うために用いたアプローチを記載している。Va
cantiらの1986年の特許出願において最初に扱われたも
のであるが、インビトロで移植片を維持するために血管
新生の必要性を認識し、移植片はインビトロで接種さ
れ、次いで直ちに高度に血管新生された組織、すなわち
腸間膜に移植された。この方法の短所は、移植片が身体
のこの区域へのみ移植され得、そして多くの薄い移植片
が、細胞が必要数に達するまで用いられなければならな
いことであった。
も、移植片は、最初インビトロで構築され、次いで移植
された。インビトロの工程を避け得ることは、明らかに
望ましい。Vacantiらの、U.S.S.N.07/343,158は、この
問題を扱うために用いたアプローチを記載している。Va
cantiらの1986年の特許出願において最初に扱われたも
のであるが、インビトロで移植片を維持するために血管
新生の必要性を認識し、移植片はインビトロで接種さ
れ、次いで直ちに高度に血管新生された組織、すなわち
腸間膜に移植された。この方法の短所は、移植片が身体
のこの区域へのみ移植され得、そして多くの薄い移植片
が、細胞が必要数に達するまで用いられなければならな
いことであった。
それゆえ、本発明の目的は、失われた器官の機能を戻
すために必要な数の細胞を含む移植片を提供することで
ある。
すために必要な数の細胞を含む移植片を提供することで
ある。
さらに、本発明の目的は、インビトロで予備培養せず
に細胞と共に移植され得、次いで移植された細胞が複製
および器官構造を形成する間中ずっと制御された速度で
分解する、生体適合性ポリマー性移植片を提供すること
である。
に細胞と共に移植され得、次いで移植された細胞が複製
および器官構造を形成する間中ずっと制御された速度で
分解する、生体適合性ポリマー性移植片を提供すること
である。
発明の要約
所望の機能を有する細胞が、機能的な器官等価物を生
成するために、予め患者に移植され、そして血管および
結合組織で浸潤された、生体適合性、生体分解性または
非分解性のポリマー性土台上および土台中に接種する方
法が開示されている。得られた類器官は、与えられた組
織の実質成分および宿主の血管成分とマトリックス成分
から形成されたキメラである。
成するために、予め患者に移植され、そして血管および
結合組織で浸潤された、生体適合性、生体分解性または
非分解性のポリマー性土台上および土台中に接種する方
法が開示されている。得られた類器官は、与えられた組
織の実質成分および宿主の血管成分とマトリックス成分
から形成されたキメラである。
マトリックスは、血管が内部成長するために、弾力性
のある、非毒性で、注入可能な多孔性鋳型であるべきで
ある。孔サイズは、通常、約100ミクロンと300ミクロン
の間であり、血管および結合組織が、マトリックスの約
10％から90％の至る所で内部成長するのを可能にし、そ
して細胞まはた患者に損傷を与えることなく、肝細胞の
ような細胞を注入することを可能にすべきである。導入
された細胞は、結合組織に付着し、そして血管によって
栄養供給される。マトリックスまたは支持構造を形成す
るための好ましい材料は、生体分解性合成ポリマーであ
り、例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルト
エステル、ポリ無水物、またはそれらのコポリマー、ま
たはポリビニルアルコールから誘導されるスポンジであ
る。これらの材料の成分は、細胞付着性を増大するため
に二次材料で覆われ得る。ポリマーマトリックスは、内
部成長する組織の通路を与えるために形造られなければ
ならず、その結果生存性、および機能に必要な数の細胞
を付着させるのに適切な部位を形成し、そして血管新生
および栄養物の拡散を可能にする。生体分解性材料の利
点は、脈管形成因子のような化合物、すなわち、血管、
およびリンパ管網または神経線維の内部成長を増強する
か、または可能にする生物学的活性化合物が、マトリッ
クスの分解中にゆっくりと放出されるためにマトリック
ス内に取り込まれ得る、ということである。
のある、非毒性で、注入可能な多孔性鋳型であるべきで
ある。孔サイズは、通常、約100ミクロンと300ミクロン
の間であり、血管および結合組織が、マトリックスの約
10％から90％の至る所で内部成長するのを可能にし、そ
して細胞まはた患者に損傷を与えることなく、肝細胞の
ような細胞を注入することを可能にすべきである。導入
された細胞は、結合組織に付着し、そして血管によって
栄養供給される。マトリックスまたは支持構造を形成す
るための好ましい材料は、生体分解性合成ポリマーであ
り、例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルト
エステル、ポリ無水物、またはそれらのコポリマー、ま
たはポリビニルアルコールから誘導されるスポンジであ
る。これらの材料の成分は、細胞付着性を増大するため
に二次材料で覆われ得る。ポリマーマトリックスは、内
部成長する組織の通路を与えるために形造られなければ
ならず、その結果生存性、および機能に必要な数の細胞
を付着させるのに適切な部位を形成し、そして血管新生
および栄養物の拡散を可能にする。生体分解性材料の利
点は、脈管形成因子のような化合物、すなわち、血管、
およびリンパ管網または神経線維の内部成長を増強する
か、または可能にする生物学的活性化合物が、マトリッ
クスの分解中にゆっくりと放出されるためにマトリック
ス内に取り込まれ得る、ということである。
１種またはそれ以上のタイプの細胞は、選択され得、
そしてマトリックス上で生育され得る。好ましいタイプ
の細胞は、肝細胞のような実質細胞であり、それは通常
の条件下で培養するのは困難である。肝臓タンパク質欠
損症、および嚢胞線維症のような代謝欠陥から生じるタ
ンパク質のような、地面では欠けているタンパク質をコ
ードする遺伝子を含有するように、遺伝子工学により作
られた細胞は、この方法で移植され得る。
そしてマトリックス上で生育され得る。好ましいタイプ
の細胞は、肝細胞のような実質細胞であり、それは通常
の条件下で培養するのは困難である。肝臓タンパク質欠
損症、および嚢胞線維症のような代謝欠陥から生じるタ
ンパク質のような、地面では欠けているタンパク質をコ
ードする遺伝子を含有するように、遺伝子工学により作
られた細胞は、この方法で移植され得る。
肝細胞のように酸素要求性が高い細胞を移植する好ま
しい実施態様では、内存するカテーテルを含む多孔性移
植片は腸間膜内に移植され、ある期間、例えば５日間予
備血管新生され、そして細胞が注入される。肝細胞に対
する最も好ましい実施態様では、ポリマー移植の直前
に、門脈下大静脈吻合（portacaval shunt）が、移植片
の複製および機能を増大させるために栄養刺激因子を移
植片に与えるように作り出される。
しい実施態様では、内存するカテーテルを含む多孔性移
植片は腸間膜内に移植され、ある期間、例えば５日間予
備血管新生され、そして細胞が注入される。肝細胞に対
する最も好ましい実施態様では、ポリマー移植の直前
に、門脈下大静脈吻合（portacaval shunt）が、移植片
の複製および機能を増大させるために栄養刺激因子を移
植片に与えるように作り出される。
図面の簡単な説明
図１は、４日目、５日目、および６日目におけるIval
on内での組織の内部成長度（μ）である。
on内での組織の内部成長度（μ）である。
図2aおよび2bは、経時のIvalonの血管分布であり、４
日目、５日目、６日目、および14日目における、血管/H
PF（図3a）および血管面積（μ２）（図3b）である。
日目、５日目、６日目、および14日目における、血管/H
PF（図3a）および血管面積（μ２）（図3b）である。
図３は、移植片の成長度に関する肝栄養刺激の効果の
グラフであり、コントロール、70％肝切除のみ、および
門脈下大静脈吻合と70％肝切除との組合せに対する細胞
面積（μm2）である。
グラフであり、コントロール、70％肝切除のみ、および
門脈下大静脈吻合と70％肝切除との組合せに対する細胞
面積（μm2）である。
図４は、Ivalon内での肝細胞生存数のグラフであり、
５百万個の細胞および１千万個の細胞に対する、０時
間、24時間、および１週間における肝細胞面積（μ２）
である。
５百万個の細胞および１千万個の細胞に対する、０時
間、24時間、および１週間における肝細胞面積（μ２）
である。
発明の詳細な説明
細胞移動および移植のための土台として、人口基質を
用いて機能性器官等価物を提供する方法が、本明細書中
に開示されている。細胞の形状は、細胞骨格成分により
決定され、そしてマトリックスへの付着は、細胞***お
よび分化した機能において重要な役割をする。分離され
た細胞が、細胞付着せずに懸濁液として成熟組織内に置
かれた場合、それらの細胞は、付着部位を見い出す上
で、極性化を達成する上で、そして機能化する上で困難
を有し得る。なぜなら、それらの細胞は内存性の組織化
（organization）を欠いて開始するからである。このこ
とは、組織化し（organize）、増殖し、そして機能する
ために生存可能なままであり得る移植された細胞の総数
を制限する。
用いて機能性器官等価物を提供する方法が、本明細書中
に開示されている。細胞の形状は、細胞骨格成分により
決定され、そしてマトリックスへの付着は、細胞***お
よび分化した機能において重要な役割をする。分離され
た細胞が、細胞付着せずに懸濁液として成熟組織内に置
かれた場合、それらの細胞は、付着部位を見い出す上
で、極性化を達成する上で、そして機能化する上で困難
を有し得る。なぜなら、それらの細胞は内存性の組織化
（organization）を欠いて開始するからである。このこ
とは、組織化し（organize）、増殖し、そして機能する
ために生存可能なままであり得る移植された細胞の総数
を制限する。
構築され、うまく移植され、機能するべき器官に対し
ては、マトリックスは、移植後の血管の内部成長の前
に、細胞成長および細胞分化が起こるようにし、栄養物
に対して十分な表面積と曝露を有しなければならない。
マトリックス内で細胞をうまく移植し、成長させるのに
要する時間は、マトリックスが移植される区域が予備血
管新生されているならば、非常に低減される。移植した
後、その立体配置は、栄養物および老廃物の拡散を可能
にし、そして、細胞増殖が起こるように血管の内部成長
が続くことを可能にする。
ては、マトリックスは、移植後の血管の内部成長の前
に、細胞成長および細胞分化が起こるようにし、栄養物
に対して十分な表面積と曝露を有しなければならない。
マトリックス内で細胞をうまく移植し、成長させるのに
要する時間は、マトリックスが移植される区域が予備血
管新生されているならば、非常に低減される。移植した
後、その立体配置は、栄養物および老廃物の拡散を可能
にし、そして、細胞増殖が起こるように血管の内部成長
が続くことを可能にする。
細胞は、マトリックス上に接種後移植され得るか、ま
たは所望の部位に既に移植されたマトリックス内に注入
されるかのいずれかである。後者は、マトリックスがそ
の部位を予備血管新生するために使用され得るという利
点を有する。
たは所望の部位に既に移植されたマトリックス内に注入
されるかのいずれかである。後者は、マトリックスがそ
の部位を予備血管新生するために使用され得るという利
点を有する。
土台の設計および構築：
土台の設計および構築は、第一に重要なことである。
マトリックスは、血管の内部成長のために、弾力性のあ
る非毒性で注入可能な多孔性鋳型であるべきである。そ
の孔は、血管の内部成長を可能にし、そして細胞または
患者に損傷を与えることなく、肝細胞のような細胞の注
入を可能にするべきである。これらは、一般に、約100
ミクロンおよび300ミクロンの間の範囲の、相互に連結
した孔である。細胞に対して栄養物および成長因子を適
切に拡散させ得るために、そして新しい血管および結合
組織を内部成長させ得るために、マトリックスは、表面
積を最大にするように形造られるべきである。現在で
は、耐圧縮性および／または耐引っ張り性のある孔構造
が好ましい。
マトリックスは、血管の内部成長のために、弾力性のあ
る非毒性で注入可能な多孔性鋳型であるべきである。そ
の孔は、血管の内部成長を可能にし、そして細胞または
患者に損傷を与えることなく、肝細胞のような細胞の注
入を可能にするべきである。これらは、一般に、約100
ミクロンおよび300ミクロンの間の範囲の、相互に連結
した孔である。細胞に対して栄養物および成長因子を適
切に拡散させ得るために、そして新しい血管および結合
組織を内部成長させ得るために、マトリックスは、表面
積を最大にするように形造られるべきである。現在で
は、耐圧縮性および／または耐引っ張り性のある孔構造
が好ましい。
好ましい実施態様では、マトリックスは、生体吸収
性、または生体分解性の合成ポリマー、例えば、ポリ無
水物、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、ポリグルコール
酸およびコポリマーまたはそれらの混合物、から形成さ
れる。非分解性材料もまた、マトリックスを形成するの
に用いられ得る。適切な材料の例としては、エチレンビ
ニルアセテート、ポリビニルアルコールの誘導体、テフ
ロン、およびナイロンが挙げられる。好ましい非分解性
材料は、エステルを含む、ポリビニルアルコールスポン
ジ、またはそのアルキル化誘導体およびアシル化誘導体
である。非吸収性ポリビニルアルコールスポンジは、Un
ipoint IndustriesからIvalonTMとして市販されてい
る。この材料を製造する方法は、Wilsonの米国特許第2,
609,347号;Hammonの第2,653,917号、Hammonの第2,659,9
35号、Wilsonの第2,664,366号、Wilsonの第2,664,367
号、および、Wilsonの第2,846,407号に記載され、それ
らの教示は本明細書中に参考として援用されている。コ
ラーゲンは、使用され得るが、制御可能なものではな
く、好ましくない。これらの材料は、すべて市販されて
いる。非生体分解性ポリマー材料は、成長細胞の根本的
な性質に依存して使用され得、ポリメタクリレートおよ
びシリコンポリマーを包含する。
性、または生体分解性の合成ポリマー、例えば、ポリ無
水物、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、ポリグルコール
酸およびコポリマーまたはそれらの混合物、から形成さ
れる。非分解性材料もまた、マトリックスを形成するの
に用いられ得る。適切な材料の例としては、エチレンビ
ニルアセテート、ポリビニルアルコールの誘導体、テフ
ロン、およびナイロンが挙げられる。好ましい非分解性
材料は、エステルを含む、ポリビニルアルコールスポン
ジ、またはそのアルキル化誘導体およびアシル化誘導体
である。非吸収性ポリビニルアルコールスポンジは、Un
ipoint IndustriesからIvalonTMとして市販されてい
る。この材料を製造する方法は、Wilsonの米国特許第2,
609,347号;Hammonの第2,653,917号、Hammonの第2,659,9
35号、Wilsonの第2,664,366号、Wilsonの第2,664,367
号、および、Wilsonの第2,846,407号に記載され、それ
らの教示は本明細書中に参考として援用されている。コ
ラーゲンは、使用され得るが、制御可能なものではな
く、好ましくない。これらの材料は、すべて市販されて
いる。非生体分解性ポリマー材料は、成長細胞の根本的
な性質に依存して使用され得、ポリメタクリレートおよ
びシリコンポリマーを包含する。
ある実施態様では、基底膜成分、寒天、アガロース、
ゼラチン、アラビアゴム、コラーゲンＩ型、II型、III
型、IV型、およびＶ型、フィブロネクチン、ラミニン、
グリコサミノグリカン、それらの混合物、および細胞培
養の当業者に周知の他の材料のような化合物でポリマー
を被覆することによって、細胞のポリマーへの付着は増
強される。
ゼラチン、アラビアゴム、コラーゲンＩ型、II型、III
型、IV型、およびＶ型、フィブロネクチン、ラミニン、
グリコサミノグリカン、それらの混合物、および細胞培
養の当業者に周知の他の材料のような化合物でポリマー
を被覆することによって、細胞のポリマーへの付着は増
強される。
マトリックス内で用いるすべてのポリマーは、その後
の成長および増殖を行う細胞に適切な支持を与えるのに
必要な力学的および生化学的パラメーターを満たさなけ
ればならない。ポリマーは、インストロン（Instron）
テスターを用いた引っ張り強度のような機械的特性に関
して、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によるポリ
マー分子量、示差走査熱量測定法（DSC）によるガラス
転移温度、および赤外（IR）分光法による結合構造に対
して、そしてエイムス（Ames）アッセイおよびインビト
ロでの奇形遺伝性アッセイを含む初期スクリーニング試
験による毒物学、および免疫原性、炎症、放出および分
解の研究のための、動物での移植の研究に関して特徴付
けられ得る。
の成長および増殖を行う細胞に適切な支持を与えるのに
必要な力学的および生化学的パラメーターを満たさなけ
ればならない。ポリマーは、インストロン（Instron）
テスターを用いた引っ張り強度のような機械的特性に関
して、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によるポリ
マー分子量、示差走査熱量測定法（DSC）によるガラス
転移温度、および赤外（IR）分光法による結合構造に対
して、そしてエイムス（Ames）アッセイおよびインビト
ロでの奇形遺伝性アッセイを含む初期スクリーニング試
験による毒物学、および免疫原性、炎症、放出および分
解の研究のための、動物での移植の研究に関して特徴付
けられ得る。
好ましい実施態様では、マトリックスは、移植し、血
管組織および結合組織が内部成長した後、マトリックス
内部に細胞を注入するためのカテーテルを含む。以下の
実施例に記載のように、異なる直径を有する医療用シラ
スティック（silastic）チューブから形成され、そして
マトリックス全体に細胞を均一に分布させるための異な
る出入口から形成されたカテーテルは、特に有用であ
る。他の方法もまた用いられ得る。例えば、外部からマ
トリックス内部の種々の部分へのマトリックス分布チャ
ンネル内に作る方法、またはマトリックス内で相互に連
結した孔内に針を介して細胞を直接注入する方法などで
ある。
管組織および結合組織が内部成長した後、マトリックス
内部に細胞を注入するためのカテーテルを含む。以下の
実施例に記載のように、異なる直径を有する医療用シラ
スティック（silastic）チューブから形成され、そして
マトリックス全体に細胞を均一に分布させるための異な
る出入口から形成されたカテーテルは、特に有用であ
る。他の方法もまた用いられ得る。例えば、外部からマ
トリックス内部の種々の部分へのマトリックス分布チャ
ンネル内に作る方法、またはマトリックス内で相互に連
結した孔内に針を介して細胞を直接注入する方法などで
ある。
移植のための細胞の調製
細胞は、ドナーの臓器から、またはドナーの臓器から
の細胞の細胞培養から、または確立された細胞培養系か
ら、得られ得る。好ましい実施態様では、細胞は、ドナ
ーの臓器から直接得られ、洗浄され、そして予備移植さ
れ、予備血管新生されマトリックス内に直接移植され
る。細胞は、組織培養の分野の当業者に周知の技術を用
いて培養される。
の細胞の細胞培養から、または確立された細胞培養系か
ら、得られ得る。好ましい実施態様では、細胞は、ドナ
ーの臓器から直接得られ、洗浄され、そして予備移植さ
れ、予備血管新生されマトリックス内に直接移植され
る。細胞は、組織培養の分野の当業者に周知の技術を用
いて培養される。
１種またはそれ以上の細胞系の付着のための単一のマ
トリックスを用いる方法の１つの変法において、初期の
細胞付着および成長が、マトリックス内で各集団に対し
て別々に起こるように、土台が構築される。あるいは、
単位となる土台は、特定の場所に種々のタイプの細胞を
付着させるのに最適な異なる材料から形成され得る。付
着は、細胞とマトリックスの組成物の両方のタイプの相
関的要素である。走査型電子顕微鏡検査、組織学、およ
び放射性同位元素による定量評価を用いて、細胞の付着
および生存性は評価され得る。
トリックスを用いる方法の１つの変法において、初期の
細胞付着および成長が、マトリックス内で各集団に対し
て別々に起こるように、土台が構築される。あるいは、
単位となる土台は、特定の場所に種々のタイプの細胞を
付着させるのに最適な異なる材料から形成され得る。付
着は、細胞とマトリックスの組成物の両方のタイプの相
関的要素である。走査型電子顕微鏡検査、組織学、およ
び放射性同位元素による定量評価を用いて、細胞の付着
および生存性は評価され得る。
本発明の好ましい実施態様は、宿主内に移植した単一
マトリックスを利用すべきであるが、１つ以上のマトリ
ックスを使用するのが好ましいという状況があり、各マ
トリックスは、異なるマトリックスから機能的な三次元
器官構造を形成させるために、付着細胞が成長するのに
最適な時間で移植される。
マトリックスを利用すべきであるが、１つ以上のマトリ
ックスを使用するのが好ましいという状況があり、各マ
トリックスは、異なるマトリックスから機能的な三次元
器官構造を形成させるために、付着細胞が成長するのに
最適な時間で移植される。
インビトロおよびインビボの両方での移植された細胞
の機能は、決定されなければならない。インビボでの肝
機能の研究は、レシピエントの総胆管内にカニューレを
置くことにより行われ得る。次いで、胆汁は、増加する
ように集められ得。胆汁色素は、誘導体化されていない
テトラピロールを捜すために高圧液体クロマトグラフィ
ーにより分析され得、または、Ｐ−グルクロニダーゼで
処理するか、または処理せずに、ジアゾ化アゾジピロー
ルエチルアントラニレートと反応させることによりアゾ
ジピロールに変換された後、薄層クロマトグラフィーに
より分析され得る。二抱合型ビリルビンおよび単抱合型
ビリルビンもまた、抱合型胆汁色素をアルカリメタノー
ル分解した後、薄層クロマトグラフィーにより決定され
得る。一般的に、機能的な移植された肝細胞の数が増加
するにつれて、抱合型ビリルビンの濃度は増加する。簡
単な肝機能検査もまた、アルブミン生成のように、血液
サンプルに関して行われ得る。類似器官の機能の研究
は、移植後の細胞機能の程度を決定するのに必要とされ
るように、当業者に周知の技術を用いて行われ得る。標
識化グルコースを用いる研究、およびタンパク質アッセ
イを用いる研究は、ポリマー土台上の細胞量を定量する
ために行われ得る。次いで、これらの細胞量の研究は、
何が適切な細胞量なのかを決定するために、細胞機能の
研究と相関関係が有り得る。
の機能は、決定されなければならない。インビボでの肝
機能の研究は、レシピエントの総胆管内にカニューレを
置くことにより行われ得る。次いで、胆汁は、増加する
ように集められ得。胆汁色素は、誘導体化されていない
テトラピロールを捜すために高圧液体クロマトグラフィ
ーにより分析され得、または、Ｐ−グルクロニダーゼで
処理するか、または処理せずに、ジアゾ化アゾジピロー
ルエチルアントラニレートと反応させることによりアゾ
ジピロールに変換された後、薄層クロマトグラフィーに
より分析され得る。二抱合型ビリルビンおよび単抱合型
ビリルビンもまた、抱合型胆汁色素をアルカリメタノー
ル分解した後、薄層クロマトグラフィーにより決定され
得る。一般的に、機能的な移植された肝細胞の数が増加
するにつれて、抱合型ビリルビンの濃度は増加する。簡
単な肝機能検査もまた、アルブミン生成のように、血液
サンプルに関して行われ得る。類似器官の機能の研究
は、移植後の細胞機能の程度を決定するのに必要とされ
るように、当業者に周知の技術を用いて行われ得る。標
識化グルコースを用いる研究、およびタンパク質アッセ
イを用いる研究は、ポリマー土台上の細胞量を定量する
ために行われ得る。次いで、これらの細胞量の研究は、
何が適切な細胞量なのかを決定するために、細胞機能の
研究と相関関係が有り得る。
移植の方法
本明細書中に記載の技術は、異なる組織構造を達成す
るために、多くの異なる細胞タイプを送達するために用
いられ得る。例えば、膵臓の島細胞は、糖尿病を治療す
るためにインシュリンの適切な分泌によりグルコースの
調節を達成するために、肝細胞を移植するのに特に用い
る様式と類似の様式で送達され得る。他の内分泌組織も
また、移植され得る。マトリックスは、特定の適用に適
するように、身体の多くの異なる区域内に移植され得
る。移植において、肝細胞を注入するための腸間膜以外
の部位には、皮下組織、腹膜後腔、腹膜前腔、および筋
肉内腔が挙げられる。
るために、多くの異なる細胞タイプを送達するために用
いられ得る。例えば、膵臓の島細胞は、糖尿病を治療す
るためにインシュリンの適切な分泌によりグルコースの
調節を達成するために、肝細胞を移植するのに特に用い
る様式と類似の様式で送達され得る。他の内分泌組織も
また、移植され得る。マトリックスは、特定の適用に適
するように、身体の多くの異なる区域内に移植され得
る。移植において、肝細胞を注入するための腸間膜以外
の部位には、皮下組織、腹膜後腔、腹膜前腔、および筋
肉内腔が挙げられる。
これらの部位への移植はまた、標準的な外科的手技を
用いて、門脈下大静脈吻合術、および肝切除術により行
われ得る。これらの追加的な手技の必要性は、肝細胞の
送達が必要であるという特定な臨床的状況に依存する。
例えば、肝細胞の再生を活性化するシグナルが、患者の
潜在的な肝疾患から患者内に生じている場合は、肝切除
の必要はない。同様に、肝疾患の一部分として副行チャ
ンネルを通しての、重要な門脈下大静脈吻合術を行う場
合は、移植片の再生を刺激するために、門脈下大静脈吻
合の必要はない。大部分の他の適用においては、門脈下
大静脈吻合術または肝切除術の必要はない。
用いて、門脈下大静脈吻合術、および肝切除術により行
われ得る。これらの追加的な手技の必要性は、肝細胞の
送達が必要であるという特定な臨床的状況に依存する。
例えば、肝細胞の再生を活性化するシグナルが、患者の
潜在的な肝疾患から患者内に生じている場合は、肝切除
の必要はない。同様に、肝疾患の一部分として副行チャ
ンネルを通しての、重要な門脈下大静脈吻合術を行う場
合は、移植片の再生を刺激するために、門脈下大静脈吻
合の必要はない。大部分の他の適用においては、門脈下
大静脈吻合術または肝切除術の必要はない。
上記のように、ポリマー性移植片および予備血管新生
を用いる方法は、以下の実施例を参考として、さらに理
解される。
を用いる方法は、以下の実施例を参考として、さらに理
解される。
実施例1:細胞のインビボでの生存に必要とされる因子の
決定 先願の特許出願に記載の方法は、移植後の細胞の生存
における種々の因子の相対的な重要性を決定するために
用いられた。肝細胞は、単離直後に検査され、そのとき
にインビトロのポリマー構築物上に置かれ、そして移植
後を時間０として開始し、種々の時間点で検査された。
標準的な肝細胞単離技術が用いられた。移植は、インビ
トロでポリマー性繊維複合体に様々な密度の細胞を付着
させること、次いでこの複合体を移植することから成っ
ていた。腸間膜は移植部位であった。
決定 先願の特許出願に記載の方法は、移植後の細胞の生存
における種々の因子の相対的な重要性を決定するために
用いられた。肝細胞は、単離直後に検査され、そのとき
にインビトロのポリマー構築物上に置かれ、そして移植
後を時間０として開始し、種々の時間点で検査された。
標準的な肝細胞単離技術が用いられた。移植は、インビ
トロでポリマー性繊維複合体に様々な密度の細胞を付着
させること、次いでこの複合体を移植することから成っ
ていた。腸間膜は移植部位であった。
順調に機能する肝細胞の予備移植が、一定して高い生
存率を達成し得るという結果が示された。生存率は85〜
90％の範囲であった。ルーチンパーコール（Routine Pe
rcoll）分離は、生存率を改善することが見出された。
また、生存率と機能が、インビトロでのポリマー構築物
上で高く維持されることもまた測定された。対照的に、
先行技術の方法を用いて、移植後の細胞の生存率および
機能の急激で大きな減少があった。これらの繊維複合体
の定量分析に対する、形態測定によるアプローチが行わ
れたが、それは移植片中で生存可能な細胞が非常にまれ
なので困難であった。細胞損失の概算量は95〜97％の間
であった。組織学的には、長期間の移植成長（engraftm
ent）を伴った、最初の24〜28時間後に生存している細
胞集団の安定性およびこれらの細胞の機能は１年までで
あると思われ、このことは、アルブミンに対するインシ
チューの組織化学的な染色により証明された。肝細胞
は、100−250ミクロンの間で変わる直径を有する塊り中
に残存していた。これらの塊りは、細胞密度の適用およ
び移植部位の場所に依存せずに外観上不変であった。こ
れらの塊りは常に、未変性の組織および血管に最も近い
領域では優勢であった。これらの観察は、拡散の限界、
特に、酸素の拡散の限界が肝細胞の死の最もありそうな
要因であることを示唆した。対照的に、新しい軟骨を作
るために軟骨細胞を用いる類似の実験は、同種の軟骨板
を形成して高度に成功し、このことは、低酸素症による
損傷に対する肝細胞に特定の感受性が問題であることを
さらに示唆している。
存率を達成し得るという結果が示された。生存率は85〜
90％の範囲であった。ルーチンパーコール（Routine Pe
rcoll）分離は、生存率を改善することが見出された。
また、生存率と機能が、インビトロでのポリマー構築物
上で高く維持されることもまた測定された。対照的に、
先行技術の方法を用いて、移植後の細胞の生存率および
機能の急激で大きな減少があった。これらの繊維複合体
の定量分析に対する、形態測定によるアプローチが行わ
れたが、それは移植片中で生存可能な細胞が非常にまれ
なので困難であった。細胞損失の概算量は95〜97％の間
であった。組織学的には、長期間の移植成長（engraftm
ent）を伴った、最初の24〜28時間後に生存している細
胞集団の安定性およびこれらの細胞の機能は１年までで
あると思われ、このことは、アルブミンに対するインシ
チューの組織化学的な染色により証明された。肝細胞
は、100−250ミクロンの間で変わる直径を有する塊り中
に残存していた。これらの塊りは、細胞密度の適用およ
び移植部位の場所に依存せずに外観上不変であった。こ
れらの塊りは常に、未変性の組織および血管に最も近い
領域では優勢であった。これらの観察は、拡散の限界、
特に、酸素の拡散の限界が肝細胞の死の最もありそうな
要因であることを示唆した。対照的に、新しい軟骨を作
るために軟骨細胞を用いる類似の実験は、同種の軟骨板
を形成して高度に成功し、このことは、低酸素症による
損傷に対する肝細胞に特定の感受性が問題であることを
さらに示唆している。
実施例2:ポリ乳酸およびポリグリコール酸のマトリック
ス上における予備血管新生および細胞移植 ポリマーの設計 シラスティックチューブ（0.3mm ID）を2.5インチの
長さに分割した。一方の端を閉じ、そして0.25mmの穴を
チューブにあけた。これらの注入カテーテルを、5mmの
厚さのポリビニルアルコール発泡体（Ivalon,Unipoint
Indust.）の1cmディスク内の中央に挿入した。次いで、
これらのデバイスを移植のために滅菌した。
ス上における予備血管新生および細胞移植 ポリマーの設計 シラスティックチューブ（0.3mm ID）を2.5インチの
長さに分割した。一方の端を閉じ、そして0.25mmの穴を
チューブにあけた。これらの注入カテーテルを、5mmの
厚さのポリビニルアルコール発泡体（Ivalon,Unipoint
Indust.）の1cmディスク内の中央に挿入した。次いで、
これらのデバイスを移植のために滅菌した。
動物の移植
200〜250gのFisher 344ラットをメトキシフルラン（m
ethoxyflurane）で麻酔し、腹部の手術の準備をした。
中央切開し、そして腸間膜を滅菌したガーゼ上に注意深
く置いた。次いで、ポリマーを腸間膜上に置き、さらに
腸間膜をそのデバイス上でそれを包むように折り返し
た。そのポリマーを１本の６−0 ProleneTM（Ethicon）
縫合糸でその場で固定した。このとき、腹壁の側面を切
開し、注入カテーテルを筋肉を介して皮下ポケットに挿
入し、そして固定した。腹部を閉じ、そして皮膚を閉じ
た。次いで、これは、肝細胞を無傷で導入するために後
に通じ得た。
ethoxyflurane）で麻酔し、腹部の手術の準備をした。
中央切開し、そして腸間膜を滅菌したガーゼ上に注意深
く置いた。次いで、ポリマーを腸間膜上に置き、さらに
腸間膜をそのデバイス上でそれを包むように折り返し
た。そのポリマーを１本の６−0 ProleneTM（Ethicon）
縫合糸でその場で固定した。このとき、腹壁の側面を切
開し、注入カテーテルを筋肉を介して皮下ポケットに挿
入し、そして固定した。腹部を閉じ、そして皮膚を閉じ
た。次いで、これは、肝細胞を無傷で導入するために後
に通じ得た。
組織学的検査
適切なホルマリン固定をした後、各々の予備血管新生
された移植片を、注入カテーテルの軸に垂直な、４つの
予め決定された部位で区分化した。HematoxylinおよびE
osin（Ｈ＆Ｅ）染色を行い、そしてその切片を血管分
布、組織の内部成長および生存可能な肝細胞の区域に対
して評価した。モデル3000イメージアナライザーを用い
て、これらのパラメーターの数量化を行った。
された移植片を、注入カテーテルの軸に垂直な、４つの
予め決定された部位で区分化した。HematoxylinおよびE
osin（Ｈ＆Ｅ）染色を行い、そしてその切片を血管分
布、組織の内部成長および生存可能な肝細胞の区域に対
して評価した。モデル3000イメージアナライザーを用い
て、これらのパラメーターの数量化を行った。
肝細胞の単離
Seglan法［Aiken,1990＃13］の変法を用いて、肝細胞
を単離した。同系のドナーのFisher 344の200−250gの
ラットをメトキシフルランで麻酔した。肝臓を露出し、
そしてIVCを16gの血管カテーテル（angiocath）でカニ
ューレ挿入した。カルシウムを含まない緩衝灌流液を用
いて、38℃で６分間の灌流を行った。これに続いて、適
切に肝細胞の分離が達成されるまで、0.05％コラゲナー
ゼＤ（Boehringer Mannheim）の0.05M塩化カルシウム含
有緩衝液で灌流した。次いで、パーコール（Percoll）
密度遠心分離を用いて、肝細胞を精製した。生存率をト
リパンブルー核排除法（Trypan Blue nuclear exclusio
n）により測定した。
を単離した。同系のドナーのFisher 344の200−250gの
ラットをメトキシフルランで麻酔した。肝臓を露出し、
そしてIVCを16gの血管カテーテル（angiocath）でカニ
ューレ挿入した。カルシウムを含まない緩衝灌流液を用
いて、38℃で６分間の灌流を行った。これに続いて、適
切に肝細胞の分離が達成されるまで、0.05％コラゲナー
ゼＤ（Boehringer Mannheim）の0.05M塩化カルシウム含
有緩衝液で灌流した。次いで、パーコール（Percoll）
密度遠心分離を用いて、肝細胞を精製した。生存率をト
リパンブルー核排除法（Trypan Blue nuclear exclusio
n）により測定した。
肝細胞注入
肝細胞を、Williams E培地（Gibco）中に１×107およ
び２×107生存可能細胞/ccで懸濁した。ポリマー予備血
管新生の５日後、細胞注入を受けるラットを麻酔し、皮
下注入カテーテルを露出させ、そして0.5ccの細胞懸濁
液を注入した。そして、注入直後、注入１日後または注
入７日後のいずれかで、動物を集めた。カテーテルを皮
下ポケットに置き換え、そして皮膚を再び閉じた。
び２×107生存可能細胞/ccで懸濁した。ポリマー予備血
管新生の５日後、細胞注入を受けるラットを麻酔し、皮
下注入カテーテルを露出させ、そして0.5ccの細胞懸濁
液を注入した。そして、注入直後、注入１日後または注
入７日後のいずれかで、動物を集めた。カテーテルを皮
下ポケットに置き換え、そして皮膚を再び閉じた。
結果
組織の内部成長
予備血管新生の１〜14日後に、デバイスを集めた。そ
の期間中、組織の内部成長は、非常に一定した速度で起
こった。１日目と３日目の間に、細胞性の増加と共にフ
ィブリン塊の沈着を認めた。この期間中に認められた組
織の組織化または血管の内部成長の証拠はなかった。４
日目に組織化された組織および毛細血管が、デバイスの
相互に連結された間隙中に伸びるのを認め得た。組織の
内部成長は、予備血管新生の７日目に合流に達するま
で、デバイスの両側から対称的であり、組織の内部成長
の速度は、図１に示すように、４日目と７日目の間では
604μm/日（575−627μm/日の範囲）で一定であった。
の期間中、組織の内部成長は、非常に一定した速度で起
こった。１日目と３日目の間に、細胞性の増加と共にフ
ィブリン塊の沈着を認めた。この期間中に認められた組
織の組織化または血管の内部成長の証拠はなかった。４
日目に組織化された組織および毛細血管が、デバイスの
相互に連結された間隙中に伸びるのを認め得た。組織の
内部成長は、予備血管新生の７日目に合流に達するま
で、デバイスの両側から対称的であり、組織の内部成長
の速度は、図１に示すように、４日目と７日目の間では
604μm/日（575−627μm/日の範囲）で一定であった。
空間をポリマーと組織との間で一定に維持することは
不可欠であると思われる。肝細胞の注入および移植のた
めのチャンネルを作り出すのが、この空間である。
不可欠であると思われる。肝細胞の注入および移植のた
めのチャンネルを作り出すのが、この空間である。
血管分布
２つの方法で血管分布を評価した。第一に、単位面積
あたりの血管の数を、ポリマー内の予め選択した多数の
部位で決定し、そして平均値を得た。第二に、これらの
同一の領域内の血管面積を決定した。定量した領域で
は、組織化された組織の内部成長は、最も中心の範囲で
あった。図2aおよびｂに結果をグラフで示した。一旦、
組織の組織化が起こると、血管の数/HPFは、予備血管新
生の５日目に最大密度17に到達し、その後14日目までに
は９本の血管/HPFに減少した。このことは、期間中一定
のままであった血管面積とは対照的であり、この期間中
に少数から多数の血管に発達したことを示している。
あたりの血管の数を、ポリマー内の予め選択した多数の
部位で決定し、そして平均値を得た。第二に、これらの
同一の領域内の血管面積を決定した。定量した領域で
は、組織化された組織の内部成長は、最も中心の範囲で
あった。図2aおよびｂに結果をグラフで示した。一旦、
組織の組織化が起こると、血管の数/HPFは、予備血管新
生の５日目に最大密度17に到達し、その後14日目までに
は９本の血管/HPFに減少した。このことは、期間中一定
のままであった血管面積とは対照的であり、この期間中
に少数から多数の血管に発達したことを示している。
肝細胞の分布および生存
肝細胞は細胞注入時に、上記ポリマー中に均等に分布
した。期間中、生存細胞が腸間膜およびポリマーとの接
触面にますます局在化した。組織学的には、生存細胞は
まず、存続のために線維および血管組織網への付着を要
することが示された。接触したいないものは24時間以内
に死滅する。１週間で、肝細胞はデバイスの外縁に限定
された。上記ポリマー中心部の細胞は、組織の内部成長
部分と付着していても成長する様子はなかった。再造形
（remodeling）が起き、そして移植した細胞は、上記ポ
リマーの外縁の周辺に、４〜５の細胞の島として、また
は２〜３の細胞層のシートとして線維および血管組織に
組み込まれた。上記ポリマー中の肝細胞面積を試験し、
生存を評価した。生存肝細胞面積の40％が最初の24時間
で減少し、１週間で最初の肝細胞面積の25％まで漸次減
少することが示された。４ケ月後の移植片の試験では、
肝細胞面積の継続的な減少を示し、移植した細胞、０時
間の５〜10％になった。注入する細胞数を100％まで増
加させることは、期間中、面積に比例した減少をともな
って、生存肝細胞面積の100％増加を提供する。
した。期間中、生存細胞が腸間膜およびポリマーとの接
触面にますます局在化した。組織学的には、生存細胞は
まず、存続のために線維および血管組織網への付着を要
することが示された。接触したいないものは24時間以内
に死滅する。１週間で、肝細胞はデバイスの外縁に限定
された。上記ポリマー中心部の細胞は、組織の内部成長
部分と付着していても成長する様子はなかった。再造形
（remodeling）が起き、そして移植した細胞は、上記ポ
リマーの外縁の周辺に、４〜５の細胞の島として、また
は２〜３の細胞層のシートとして線維および血管組織に
組み込まれた。上記ポリマー中の肝細胞面積を試験し、
生存を評価した。生存肝細胞面積の40％が最初の24時間
で減少し、１週間で最初の肝細胞面積の25％まで漸次減
少することが示された。４ケ月後の移植片の試験では、
肝細胞面積の継続的な減少を示し、移植した細胞、０時
間の５〜10％になった。注入する細胞数を100％まで増
加させることは、期間中、面積に比例した減少をともな
って、生存肝細胞面積の100％増加を提供する。
実施例3:多孔性ポリビニルアルコール移植片を用いた肝
細胞の移植 実施例１を含む多くの研究は、細胞培養において肝細
胞をポリグリコール酸のポリマー繊維へ付着させ、そし
てこれらのポリマー細胞構築物を腸間膜へ移植する手法
を用いると、肝細胞に多大な損失のあることを示した。
これらの問題を解決するために、細胞移植の前、間、お
よび後での細胞の生存力および機能を評価するための新
しいアッセイ、代替細胞単離技術、細胞の生存能力を向
上させる新規物質、および移植のための血管新生した表
面積を増進するための予備血管新生システムを開発し
た。これらの努力の結果として、細胞が死亡する主な原
因は、移植時の変動に関連していることを見いだした。
大部分の細胞死が移植後、最初の６時間以内で生じた。
95〜97％の肝細胞が、移植後の、この早い時期に失われ
た。
細胞の移植 実施例１を含む多くの研究は、細胞培養において肝細
胞をポリグリコール酸のポリマー繊維へ付着させ、そし
てこれらのポリマー細胞構築物を腸間膜へ移植する手法
を用いると、肝細胞に多大な損失のあることを示した。
これらの問題を解決するために、細胞移植の前、間、お
よび後での細胞の生存力および機能を評価するための新
しいアッセイ、代替細胞単離技術、細胞の生存能力を向
上させる新規物質、および移植のための血管新生した表
面積を増進するための予備血管新生システムを開発し
た。これらの努力の結果として、細胞が死亡する主な原
因は、移植時の変動に関連していることを見いだした。
大部分の細胞死が移植後、最初の６時間以内で生じた。
95〜97％の肝細胞が、移植後の、この早い時期に失われ
た。
インビボで移植片の組織切片を分析するために、形態
測定の手法を開発した。このインビボ分析を発展した定
量的「ノーザン」ブロット解析と組み合わせ、移植片中
の総RNAおよび肝特異的アルブミンmRNAを測定した。こ
れらのインビボ観察記録は、ポリマー上の細胞のインビ
トロRNA分析およびゲル電気泳動法を用いたアルブミン
産出物の測定と比較し得た。MTT（30）4,5−ジメチルチ
アゾール−２−イル（−2,5−ジフェニルテトラゾリウ
ムブロマイド）を用いて生存性を測定する、インビトロ
およびインビボ分析をアッセイに用いた。この生化学的
アッセイを細胞生存性の非特異的マーカーとして用い、
酸性ホスファターゼ測定法と比較した。
測定の手法を開発した。このインビボ分析を発展した定
量的「ノーザン」ブロット解析と組み合わせ、移植片中
の総RNAおよび肝特異的アルブミンmRNAを測定した。こ
れらのインビボ観察記録は、ポリマー上の細胞のインビ
トロRNA分析およびゲル電気泳動法を用いたアルブミン
産出物の測定と比較し得た。MTT（30）4,5−ジメチルチ
アゾール−２−イル（−2,5−ジフェニルテトラゾリウ
ムブロマイド）を用いて生存性を測定する、インビトロ
およびインビボ分析をアッセイに用いた。この生化学的
アッセイを細胞生存性の非特異的マーカーとして用い、
酸性ホスファターゼ測定法と比較した。
長期にわたる移植および、肝細胞および胆管様の構造
体の組織化として定義される、成功した移植を可能とす
る、多孔性ポリマーのポリビニルアルコールを用いたシ
ステムを開発した。多孔性材料のようなスポンジへ予備
血管新生を行うポリマーシステムを開発することによっ
て、細胞の生存が60〜70％の範囲まで増加した。細胞供
給の効果は、移植後24〜28時間で40から60％の間である
と評価される。この結果は、肝細胞の２次的な移入を伴
う幾何的なスポンジへの予備血管新生の戦略が、早い時
期の細胞の損失を有意に減少させることを示す。
体の組織化として定義される、成功した移植を可能とす
る、多孔性ポリマーのポリビニルアルコールを用いたシ
ステムを開発した。多孔性材料のようなスポンジへ予備
血管新生を行うポリマーシステムを開発することによっ
て、細胞の生存が60〜70％の範囲まで増加した。細胞供
給の効果は、移植後24〜28時間で40から60％の間である
と評価される。この結果は、肝細胞の２次的な移入を伴
う幾何的なスポンジへの予備血管新生の戦略が、早い時
期の細胞の損失を有意に減少させることを示す。
Gunnラット（150〜250g）を麻酔し、そして端から側
面まで門脈下大静脈吻合術を行った。細胞注入のための
セントラルマルチポートシラスティックチューブ（cent
ral multiport silastec tubes）と共に1.5×1.5cmのポ
リマー性スポンジを、腸間膜のエンベロープまたは皮下
ポケットに置いた（ｎ＝20）。予備血管新生の５日後
に、肝細胞を同系のウィスターラットからコラゲナーゼ
の灌流によって単離した。１×107の肝細胞を注入し
た。移植して３日後、70％の肝切除を行い、そして移植
片を６ケ月まで順次、Ｈ＆Ｅ切片によって評価した。未
変性の肝臓における管状構造体、異所性の移植片、およ
び上記移植片の個々の断面を形態測定の数量化によって
比較した。統計的な有意性を評価するために種々の分析
法を用いた。
面まで門脈下大静脈吻合術を行った。細胞注入のための
セントラルマルチポートシラスティックチューブ（cent
ral multiport silastec tubes）と共に1.5×1.5cmのポ
リマー性スポンジを、腸間膜のエンベロープまたは皮下
ポケットに置いた（ｎ＝20）。予備血管新生の５日後
に、肝細胞を同系のウィスターラットからコラゲナーゼ
の灌流によって単離した。１×107の肝細胞を注入し
た。移植して３日後、70％の肝切除を行い、そして移植
片を６ケ月まで順次、Ｈ＆Ｅ切片によって評価した。未
変性の肝臓における管状構造体、異所性の移植片、およ
び上記移植片の個々の断面を形態測定の数量化によって
比較した。統計的な有意性を評価するために種々の分析
法を用いた。
６ケ月を通じて、肝細胞の移植成長および再組織化が
全ての移植片外側で起きた。1mmまで組織化した小節は
プレートに配置した肝細胞と同定された。４および６ケ
月で、30％の移植片（ｎ＝10）は立方上皮が並んだ管状
構造体を含有し、その組織の外見は胆管過形成を伴う異
所性移植片の構造体と類似していた。これらの管の面積
を、異所性移植片および未変性の肝臓中にある、立方上
皮をともなった最小の胆管の構造体である、小葉間胆管
と比較した。移植片中の管は745μ２±47の平均面積を
有し、異所性移植片内の肥厚性（hyperplastic）管は81
5μ２±41（ｐ＝0.34）を有し、その一方で、未変性肝
臓の門脈の三構造と似た形態をもつ管は1360μ２±105
（ｐ＜0.001）の平均値を有した。
全ての移植片外側で起きた。1mmまで組織化した小節は
プレートに配置した肝細胞と同定された。４および６ケ
月で、30％の移植片（ｎ＝10）は立方上皮が並んだ管状
構造体を含有し、その組織の外見は胆管過形成を伴う異
所性移植片の構造体と類似していた。これらの管の面積
を、異所性移植片および未変性の肝臓中にある、立方上
皮をともなった最小の胆管の構造体である、小葉間胆管
と比較した。移植片中の管は745μ２±47の平均面積を
有し、異所性移植片内の肥厚性（hyperplastic）管は81
5μ２±41（ｐ＝0.34）を有し、その一方で、未変性肝
臓の門脈の三構造と似た形態をもつ管は1360μ２±105
（ｐ＜0.001）の平均値を有した。
腸間膜および皮下での肝細胞移植物中の、肝組織の組
織化した小節内部の管状構造体の、長期にわたる移植成
長および発達の両方を立証した。これらの構造体は、形
態学的にも形態測定的にも異所性肝臓移植片中の胆管過
形成でみられたものと類似しており、肝細胞移植後の胆
管組織化を示唆する最初の証拠である。
織化した小節内部の管状構造体の、長期にわたる移植成
長および発達の両方を立証した。これらの構造体は、形
態学的にも形態測定的にも異所性肝臓移植片中の胆管過
形成でみられたものと類似しており、肝細胞移植後の胆
管組織化を示唆する最初の証拠である。
実施例4:ポリマー性繊維マトリックスとポリビニルアル
コールスポンジマトリックスとの比較 なにも含まないポリマーを移植して、該ポリマー中で
繊維および血管組織を内部成長させてから肝細胞を導入
し、血管新生した表面積を増加させた。これによってよ
り短かい拡散距離で酸素供給が可能になる。以下を包含
するいくつかの幾何学的な配置を試験した:1）生体吸収
性のポリマー性繊維のみ ２）分解されないポリマー性
繊維 ３）分解される繊維および分解されない繊維との
混合物 ４）セルローススポンジ ５）Ivalonスポン
ジ。
コールスポンジマトリックスとの比較 なにも含まないポリマーを移植して、該ポリマー中で
繊維および血管組織を内部成長させてから肝細胞を導入
し、血管新生した表面積を増加させた。これによってよ
り短かい拡散距離で酸素供給が可能になる。以下を包含
するいくつかの幾何学的な配置を試験した:1）生体吸収
性のポリマー性繊維のみ ２）分解されないポリマー性
繊維 ３）分解される繊維および分解されない繊維との
混合物 ４）セルローススポンジ ５）Ivalonスポン
ジ。
支持されない繊維複合体は全て、２つの理由で予備血
管新生に適合しなかった。何よりもまず、それらは十分
な耐圧縮性を有せず、従って移入した線維および血管組
織が萎縮した。このことはまた、直接注入、または、マ
ルチポートカテーテルを内在させることによる肝細胞導
入のいずれかにおいても、肝細胞の導入に対して非常に
高い抵抗を生じさせた。直接注入は移植片の隙間に出血
が生じさせた。
管新生に適合しなかった。何よりもまず、それらは十分
な耐圧縮性を有せず、従って移入した線維および血管組
織が萎縮した。このことはまた、直接注入、または、マ
ルチポートカテーテルを内在させることによる肝細胞導
入のいずれかにおいても、肝細胞の導入に対して非常に
高い抵抗を生じさせた。直接注入は移植片の隙間に出血
が生じさせた。
スポンジモデルは優れた耐圧縮性を有することが認め
られたため、スポンジモデルを開発し、そして可能性を
有する空間の維持が可能となった。Ivalonスポンジおよ
びセルローススポンジの両方について多くの研究を行
い、血管新生の時間経過を測定した。両方のモデルにお
いて、血管の良好な内部成長を生じた。標準的なIvalon
スポンジ移植片は直径1cmで、高さは0.3cmまでのディス
クであった。５日までに血管の良好な内部成長があり、
11日までに血管は非常によく内部成長した。小孔は相当
に均等なサイズで、かつ全てが内部で結合した。セント
ラルマルチポートカテーテルをIvalonディスクに置いた
システムを設計することにより、肝細胞をシングル注入
またはマルチプル注入のいずれでも導入し得た。セルロ
ーススポンジは最小限の炎症で良好な血管内部成長をさ
せたが、小孔が全く不均一な大きさであり、従って上記
Ivalon程は適合しなかった。
られたため、スポンジモデルを開発し、そして可能性を
有する空間の維持が可能となった。Ivalonスポンジおよ
びセルローススポンジの両方について多くの研究を行
い、血管新生の時間経過を測定した。両方のモデルにお
いて、血管の良好な内部成長を生じた。標準的なIvalon
スポンジ移植片は直径1cmで、高さは0.3cmまでのディス
クであった。５日までに血管の良好な内部成長があり、
11日までに血管は非常によく内部成長した。小孔は相当
に均等なサイズで、かつ全てが内部で結合した。セント
ラルマルチポートカテーテルをIvalonディスクに置いた
システムを設計することにより、肝細胞をシングル注入
またはマルチプル注入のいずれでも導入し得た。セルロ
ーススポンジは最小限の炎症で良好な血管内部成長をさ
せたが、小孔が全く不均一な大きさであり、従って上記
Ivalon程は適合しなかった。
方法
予備血管新生化Ivalonスポンジ
IvalonスポンジをFischer 344ラットの腸間膜に置
き、種々の期間で予備血管新生させた。指定した時期
に、中央に配置したシラスティックカテーテルを通じて
肝細胞を注入した。肝細胞の濃度、およびスポンジに注
いだ最終容量を変化させた。肝細胞注入後０時間および
３日後に、上記動物をホルマリンで灌流した。これは先
の研究に基づいて決定された。その研究によれば、上記
時間以降でかなり一定した細胞の生存を示し、そして最
初の24時間で肝細胞が損失した。次に、細胞／ポリマー
構築物を切片にし、組織の内部成長、血管分布、肝細胞
の分布および生存能力を評価した。形態測定の画像解析
を用いて、生存肝細胞の測定を行った。
き、種々の期間で予備血管新生させた。指定した時期
に、中央に配置したシラスティックカテーテルを通じて
肝細胞を注入した。肝細胞の濃度、およびスポンジに注
いだ最終容量を変化させた。肝細胞注入後０時間および
３日後に、上記動物をホルマリンで灌流した。これは先
の研究に基づいて決定された。その研究によれば、上記
時間以降でかなり一定した細胞の生存を示し、そして最
初の24時間で肝細胞が損失した。次に、細胞／ポリマー
構築物を切片にし、組織の内部成長、血管分布、肝細胞
の分布および生存能力を評価した。形態測定の画像解析
を用いて、生存肝細胞の測定を行った。
細胞数を測定するために、各々の移植片を４片に分割
し、そしてこれらの各々から切片を作製した。これら切
片の各々は３つの相互的な切片を通じて顕微鏡下で検査
され、そして細胞面積を測定した。次いで平均細胞面積
および体積を決定し、そしてスポンジの体積から細胞数
を推定した。
し、そしてこれらの各々から切片を作製した。これら切
片の各々は３つの相互的な切片を通じて顕微鏡下で検査
され、そして細胞面積を測定した。次いで平均細胞面積
および体積を決定し、そしてスポンジの体積から細胞数
を推定した。
ポリマー性移植片からのRNAの単離
コラゲナーゼ灌流およびパーコールによる遠心分離に
よって肝細胞を単離した。予備血管新生されたIvalonス
ポンジへの注入に先だって、10μCi/ml3H−ウリジンの
懸濁液中で細胞質RNAを標識した。あらかじめ標識した
肝細胞RNAは、肝細胞RNAと侵入細胞RNAとの区別を可能
とする。次いで５×106の標識肝細胞を、他で記載のよ
うにIvalonスポンジへ注入した。ポリグリコール酸（PG
A）を用いた先の実験では、細胞を組織培養シャーレ中
のポリマーに添加し、10μCi/ml3H−ウリジン中で一晩
インキュベートし、そして前記のように移植した。
よって肝細胞を単離した。予備血管新生されたIvalonス
ポンジへの注入に先だって、10μCi/ml3H−ウリジンの
懸濁液中で細胞質RNAを標識した。あらかじめ標識した
肝細胞RNAは、肝細胞RNAと侵入細胞RNAとの区別を可能
とする。次いで５×106の標識肝細胞を、他で記載のよ
うにIvalonスポンジへ注入した。ポリグリコール酸（PG
A）を用いた先の実験では、細胞を組織培養シャーレ中
のポリマーに添加し、10μCi/ml3H−ウリジン中で一晩
インキュベートし、そして前記のように移植した。
RNAを単離するために、間隔を置いて移植片を取り出
し、そしてグアニジンイソチオシアネート溶解溶液に浸
した。上記溶液の多数のアリコ−トをスポンジに通じて
作用させ、そしてこれらを合した。続いてフェノール−
クロロホルム抽出、そして塩化リチウムおよびエタノー
ル沈澱でRNAを精製した。最終RNAサンプルをスロットブ
ロット（slot blot）装置（Schleicher＆Schuell）を用
いて、ニトロセルロースフィルターに添加した。続いて
アルブミンmRNAに特異な、32P標識cDNAプローブでハイ
ブリダイゼーションし、上記フィルターを洗浄し、さら
にＸ線フィルムの上に置いた。生じたオートラジオグラ
フをデンシトメーターで調べ、各サンプル中のアルブミ
ンmRNAの相対的な量を測定した。あるいは、RNAサンプ
ルをmRNA種ごとに分離するため電気泳動し得、ニトロセ
ルロースにブロットして、そして普通にプローブし得
る。後者のこの手法はノーザンブロット解析と称され
る。
し、そしてグアニジンイソチオシアネート溶解溶液に浸
した。上記溶液の多数のアリコ−トをスポンジに通じて
作用させ、そしてこれらを合した。続いてフェノール−
クロロホルム抽出、そして塩化リチウムおよびエタノー
ル沈澱でRNAを精製した。最終RNAサンプルをスロットブ
ロット（slot blot）装置（Schleicher＆Schuell）を用
いて、ニトロセルロースフィルターに添加した。続いて
アルブミンmRNAに特異な、32P標識cDNAプローブでハイ
ブリダイゼーションし、上記フィルターを洗浄し、さら
にＸ線フィルムの上に置いた。生じたオートラジオグラ
フをデンシトメーターで調べ、各サンプル中のアルブミ
ンmRNAの相対的な量を測定した。あるいは、RNAサンプ
ルをmRNA種ごとに分離するため電気泳動し得、ニトロセ
ルロースにブロットして、そして普通にプローブし得
る。後者のこの手法はノーザンブロット解析と称され
る。
結果
予備血管新生化Ivalonスポンジ組織の内部成長
侵入した組織は、７日間で完全に3mmの厚さでIvalon
上を架橋した。その線維および血管成分の程度は時間と
ともに増加する。高度に血管化し、線維化が最小の組織
は５日で出現した。このときなお移植片の中央部に、相
対的に低細胞領域（hypocellular areas）が存在した。
組織は14日間でさらに組織化し、細胞移植に有効な空間
が減少した。
上を架橋した。その線維および血管成分の程度は時間と
ともに増加する。高度に血管化し、線維化が最小の組織
は５日で出現した。このときなお移植片の中央部に、相
対的に低細胞領域（hypocellular areas）が存在した。
組織は14日間でさらに組織化し、細胞移植に有効な空間
が減少した。
注入した細胞の分布
細胞の分布は全期間を通じて一定であり、注入直後の
細胞の分布に等しかった。注入後３日間に、細胞の生存
が周辺部においてより支配的となり、そこでは新しい組
織がさらに組織化した。
細胞の分布に等しかった。注入後３日間に、細胞の生存
が周辺部においてより支配的となり、そこでは新しい組
織がさらに組織化した。
肝細胞の生存
肝細胞の生存を３日間、時間経過に応じて１切片あた
り10〜14領域の細胞区域、そしてスポンジあたり４つの
切片で比較しながら測定した。これを、同様の肝細胞を
単離したのと同種の群のラットに注入した肝細胞の生存
と比較した。結果を図４に示す。第１群の動物の形態測
定では、平均生存細胞面積が3153±645（注入後、０時
間のS.E.M.）であることを示した。３日で平均生存細胞
面積は1960±567であった。
り10〜14領域の細胞区域、そしてスポンジあたり４つの
切片で比較しながら測定した。これを、同様の肝細胞を
単離したのと同種の群のラットに注入した肝細胞の生存
と比較した。結果を図４に示す。第１群の動物の形態測
定では、平均生存細胞面積が3153±645（注入後、０時
間のS.E.M.）であることを示した。３日で平均生存細胞
面積は1960±567であった。
これらの細胞面積は、０日から３日の平均細胞生存率
62％と一致した。測定した平均細胞サイズおよびスポン
ジの体積に基づいた細胞数を計算すると、３日目で3.6
×106の生存肝細胞が認められた。
62％と一致した。測定した平均細胞サイズおよびスポン
ジの体積に基づいた細胞数を計算すると、３日目で3.6
×106の生存肝細胞が認められた。
第２群の動物では、注入後０時間での細胞の生存は、
1089±334の細胞面積、24時間目での1175±445の細胞面
積で示された。これは上記方法の誤差範囲内で、この期
間にわたる完全な生存を示す。
1089±334の細胞面積、24時間目での1175±445の細胞面
積で示された。これは上記方法の誤差範囲内で、この期
間にわたる完全な生存を示す。
これら移植片における、生存細胞総数はスポンジあた
りそれぞれ1.8×106および1.9×106細胞であった。
りそれぞれ1.8×106および1.9×106細胞であった。
ポリマー性移植片からのRNAの単離
PGAおよびIvalonスポンジのサンプルをアルブミンmRN
Aレベルで比較した。PGAの実験区では４つのポリマー片
を各時間点において合同し、対してIvalonの実験区では
２つのスポンジサンプルを各時間点において処理した。
スロットブロット解析の定量は、０と24時間の間でPGA
ポリマー上の肝細胞のアルブミンmRNAが33倍すなわち97
％減少することを示し、ノーザンブロット解析の先の結
果と同様であった。対照的に、Ivalonスポンジのサンプ
ルは、24時間で1.6倍（36％）の減少を示した。さら
に、得られるIvalon RNAの総量は０〜24時間で類似する
のに対して、PGAポリマーではこれが劇的に降下した。
これらの結果は、肝細胞がIvalonスポンジ上でアルブミ
ン遺伝子の発現レベルに対して、インビボでのそれらの
機能の大部分を維持するが、PGAポリマー上では維持し
ないことを示す。
Aレベルで比較した。PGAの実験区では４つのポリマー片
を各時間点において合同し、対してIvalonの実験区では
２つのスポンジサンプルを各時間点において処理した。
スロットブロット解析の定量は、０と24時間の間でPGA
ポリマー上の肝細胞のアルブミンmRNAが33倍すなわち97
％減少することを示し、ノーザンブロット解析の先の結
果と同様であった。対照的に、Ivalonスポンジのサンプ
ルは、24時間で1.6倍（36％）の減少を示した。さら
に、得られるIvalon RNAの総量は０〜24時間で類似する
のに対して、PGAポリマーではこれが劇的に降下した。
これらの結果は、肝細胞がIvalonスポンジ上でアルブミ
ン遺伝子の発現レベルに対して、インビボでのそれらの
機能の大部分を維持するが、PGAポリマー上では維持し
ないことを示す。
実施例5:予備血管新生化マトリックスを用いた、移植片
の生存に関する肝栄養性（hepatotrophic）刺激作用の
効果 これらの結果は、肝細胞移植のスポンジモデルの予備
血管新生が、移植後最初の24時間における細胞の生存を
有意に改良することを示す。門脈下大静脈吻合術および
肝切除術、および一時的に移植された組織のための灌流
チャンバーを用いて、移植細胞に直接O2を添加すること
によって生存のさらなる増加を獲得し得る。
の生存に関する肝栄養性（hepatotrophic）刺激作用の
効果 これらの結果は、肝細胞移植のスポンジモデルの予備
血管新生が、移植後最初の24時間における細胞の生存を
有意に改良することを示す。門脈下大静脈吻合術および
肝切除術、および一時的に移植された組織のための灌流
チャンバーを用いて、移植細胞に直接O2を添加すること
によって生存のさらなる増加を獲得し得る。
方法
ポリマーの移植
同系のルイス（Lewis）ラット250〜350g（Charles Ri
ver）をメトキシフルーランで麻酔した。中央切開し、
そして腸間膜を滅菌ガーゼ上に置いた。シラスティック
注入カテーテルを中央に置いたIvalonTM（Unipoint Ind
ustries）フォームディスクを腸間膜のエンベロープに
固定した。注入カテーテルを離れた皮下部位に導入し
た。ポリマーを付けた腸間膜を腹腔にもどし、そして切
口を閉じた。動物に、ケフゾル（kefzol）を100mg/kgで
１回投与した。
ver）をメトキシフルーランで麻酔した。中央切開し、
そして腸間膜を滅菌ガーゼ上に置いた。シラスティック
注入カテーテルを中央に置いたIvalonTM（Unipoint Ind
ustries）フォームディスクを腸間膜のエンベロープに
固定した。注入カテーテルを離れた皮下部位に導入し
た。ポリマーを付けた腸間膜を腹腔にもどし、そして切
口を閉じた。動物に、ケフゾル（kefzol）を100mg/kgで
１回投与した。
門脈下大静脈吻合
ポリマーの移植に先だってまず門脈下大静脈吻合し
た。膵十二指腸静脈を結紮して、そして切開した。肝動
脈を避けて注意深く、門脈を肝門から脾静脈へ移動させ
た。左腎静脈から肝臓の下端へ大静脈を後内側に移動さ
せた。この時点で門脈を肝門で結紮し、そして挫滅を起
こさないクランプを脾静脈のレベルで適用した。部分的
に咬合したクランプを大静脈の前内側の表面に適用し
た。静脈切開して、そして端から側面までの門脈下大静
脈吻合をランニング８−0 ProleneTM（Eticon）縫合糸
によって行った。適当な流量を保って移植片を上記のよ
うに配置した。
た。膵十二指腸静脈を結紮して、そして切開した。肝動
脈を避けて注意深く、門脈を肝門から脾静脈へ移動させ
た。左腎静脈から肝臓の下端へ大静脈を後内側に移動さ
せた。この時点で門脈を肝門で結紮し、そして挫滅を起
こさないクランプを脾静脈のレベルで適用した。部分的
に咬合したクランプを大静脈の前内側の表面に適用し
た。静脈切開して、そして端から側面までの門脈下大静
脈吻合をランニング８−0 ProleneTM（Eticon）縫合糸
によって行った。適当な流量を保って移植片を上記のよ
うに配置した。
肝細胞の単離
肝細胞の単離にはSeglanの手法（Aiken,1990＃13）の
改変法を用いた。メトキシフルランで相応の麻酔をし、
大静脈にカニューレ挿入し、そして肝臓をCa++を含まな
いの生理食塩緩衝液で逆向きに灌流し、続いて0.05％コ
ラゲナーゼＤ（BoeringerMannheim）を含む生理食塩緩
衝液（0.05M CaClを含む）で灌流した。灌流は39℃で行
われた。肝細胞の分離が適当になればすぐに、肝臓を切
開し、そしてWilliams E培地（GIBCO）中での緩やかな
分離を達成した。生存能力の基準として、トリパンブル
ーの核排除を用いて生存能力を評価した。
改変法を用いた。メトキシフルランで相応の麻酔をし、
大静脈にカニューレ挿入し、そして肝臓をCa++を含まな
いの生理食塩緩衝液で逆向きに灌流し、続いて0.05％コ
ラゲナーゼＤ（BoeringerMannheim）を含む生理食塩緩
衝液（0.05M CaClを含む）で灌流した。灌流は39℃で行
われた。肝細胞の分離が適当になればすぐに、肝臓を切
開し、そしてWilliams E培地（GIBCO）中での緩やかな
分離を達成した。生存能力の基準として、トリパンブル
ーの核排除を用いて生存能力を評価した。
次に、密度分離のための87％パーコール遠心分離を用
いて肝細胞をさらに精製した。そして肝細胞画分を２×
107細胞/ccでWilliams E培地に再び懸濁した。全ての生
体外での単離は４℃で行った。
いて肝細胞をさらに精製した。そして肝細胞画分を２×
107細胞/ccでWilliams E培地に再び懸濁した。全ての生
体外での単離は４℃で行った。
肝細胞の移植および肝切除
予備血管新生したIvalonへの肝細胞注入に関する初期
の研究に基づいて、このポリマーを５日間予備血管新生
した。これは移植のための最適の組織および血管の内部
成長を提供した。動物に軽度のメタフェン（metaphan
e）麻酔をし、注入カテーテルを挿入し、そして肝細胞
を注入した。スポンジあたり１×107の細胞（0.5cc）を
注入した。
の研究に基づいて、このポリマーを５日間予備血管新生
した。これは移植のための最適の組織および血管の内部
成長を提供した。動物に軽度のメタフェン（metaphan
e）麻酔をし、注入カテーテルを挿入し、そして肝細胞
を注入した。スポンジあたり１×107の細胞（0.5cc）を
注入した。
この時点で部分的な肝切除を、門脈下大静脈吻合（PC
shunts）の実施および未実施について、選ばれた動物
で行った。標準として70％の肝切除を行った。
shunts）の実施および未実施について、選ばれた動物
で行った。標準として70％の肝切除を行った。
移植片の評価
細胞／ポリマー構築物を細胞注入後１週間で回収し
た。それらを固定し、切片を作製し、そしてＨ＆Ｅによ
って染色した。モデル3000イメージアナライザー、およ
び形態測定を補助するコンピューターを用いて定量を行
った。各デバイスを一定の形状で４つの部分で切片作製
した。４つの組織切片の各々から、４つの交叉する切片
に従って肝細胞面積が定量された。これは評価の一定な
手段を提供した。種々の分析を用いて統計学上の有意性
を評価した。
た。それらを固定し、切片を作製し、そしてＨ＆Ｅによ
って染色した。モデル3000イメージアナライザー、およ
び形態測定を補助するコンピューターを用いて定量を行
った。各デバイスを一定の形状で４つの部分で切片作製
した。４つの組織切片の各々から、４つの交叉する切片
に従って肝細胞面積が定量された。これは評価の一定な
手段を提供した。種々の分析を用いて統計学上の有意性
を評価した。
結果
３つの実験群を評価した。肝切除も門脈下大静脈吻合
もしていないコントロール群（Ｉ）（ｎ＝６）;70％の
肝切除のみを行った第２群（II）（ｎ＝６）；および、
門脈下大静脈吻合および70％の肝切除（ｎ＝６）を行っ
た最後の群（III）。スポンジあたりの交叉する切片で
の肝細胞面積は、コントロールでは2,643μ２（SEM±15
88）であり、そして肝切除のみを行った動物では12,809
μ２（SEM±4074）であった。門脈下大静脈吻合（PC sh
unt）をともなって最大の肝栄養性刺激作用および70％
の肝切除を受けた動物では、肝細胞面積は34,372μ
２（SEM±9752）に達した。これを図３にグラフで示し
た。
もしていないコントロール群（Ｉ）（ｎ＝６）;70％の
肝切除のみを行った第２群（II）（ｎ＝６）；および、
門脈下大静脈吻合および70％の肝切除（ｎ＝６）を行っ
た最後の群（III）。スポンジあたりの交叉する切片で
の肝細胞面積は、コントロールでは2,643μ２（SEM±15
88）であり、そして肝切除のみを行った動物では12,809
μ２（SEM±4074）であった。門脈下大静脈吻合（PC sh
unt）をともなって最大の肝栄養性刺激作用および70％
の肝切除を受けた動物では、肝細胞面積は34,372μ
２（SEM±9752）に達した。これを図３にグラフで示し
た。
門脈下大静脈吻合および肝切除を行った動物におけ
る、この増加した移植成長は、コントロールの12倍の増
加を招き、そして肝切除のみのもののほぼ３倍の増加を
招いた。
る、この増加した移植成長は、コントロールの12倍の増
加を招き、そして肝切除のみのもののほぼ３倍の増加を
招いた。
組織学的評価はさらに、群間での有意な形態の相違を
明らかにし、この相違は以下のように要約し得る。肝栄
養性刺激作用を受けないコントロール動物は、腸間膜と
の接触面の近くにあるポリマーの外端で移植成長を示し
たにすぎない。先の研究に基づくとこれは進歩的な現象
であり、ポリマーの隙間の至る所で初期の細胞成長をと
もなうが、デバイスの中央では細胞成長の損失を生じ
た。上記細胞は２〜３の細胞層積層体として成長した。
部分的に肝切除すると、細胞は厚さ５〜６細胞層の島に
腺房配列（acinar arrangement）しながら成長すること
が示された。さらに驚くことは門脈下大静脈吻合して生
じる形態であった。細胞の大きな集合体を上記ポリマー
の至る所で認め得た。これらの細胞は非常に健康的な外
見を有した。腺房配列の他に、細胞は未変性肝臓で見ら
れるひも状の外見で積層に配列した。もう一つの興味あ
る特徴は細管状管構造体の出現であった。これらの構造
体は胆管と非常に類似していたので、形態測定の評価を
実行した。未変性肝臓の小葉内管および異所性移植片を
これらの構造体のコントロールとして試験した。肝細胞
構造体の組織学上の外見は、異所性移植片の構造体と非
常に類似していた。形態測定の定量化は、上記移植片
（745μ２±47）および異所性移植片（814μ２±40）の
管の大きさが著しく類似することを示した；未変性の肝
臓（1360μ２±97）は有意により大きな（ｐ＜0.001）
管を有した。
明らかにし、この相違は以下のように要約し得る。肝栄
養性刺激作用を受けないコントロール動物は、腸間膜と
の接触面の近くにあるポリマーの外端で移植成長を示し
たにすぎない。先の研究に基づくとこれは進歩的な現象
であり、ポリマーの隙間の至る所で初期の細胞成長をと
もなうが、デバイスの中央では細胞成長の損失を生じ
た。上記細胞は２〜３の細胞層積層体として成長した。
部分的に肝切除すると、細胞は厚さ５〜６細胞層の島に
腺房配列（acinar arrangement）しながら成長すること
が示された。さらに驚くことは門脈下大静脈吻合して生
じる形態であった。細胞の大きな集合体を上記ポリマー
の至る所で認め得た。これらの細胞は非常に健康的な外
見を有した。腺房配列の他に、細胞は未変性肝臓で見ら
れるひも状の外見で積層に配列した。もう一つの興味あ
る特徴は細管状管構造体の出現であった。これらの構造
体は胆管と非常に類似していたので、形態測定の評価を
実行した。未変性肝臓の小葉内管および異所性移植片を
これらの構造体のコントロールとして試験した。肝細胞
構造体の組織学上の外見は、異所性移植片の構造体と非
常に類似していた。形態測定の定量化は、上記移植片
（745μ２±47）および異所性移植片（814μ２±40）の
管の大きさが著しく類似することを示した；未変性の肝
臓（1360μ２±97）は有意により大きな（ｐ＜0.001）
管を有した。
本発明を明確な実施態様に言及して記載したが、表面
積を最大にしたマトリックス上で、そして周囲を養分を
含む環境でさらすことによって細胞を培養することによ
る人工臓器の構築のための方法および手段の、変更およ
び修飾は当業者には、明らかである。そのような修飾お
よび変更は付随する請求の範囲内に包含される。
積を最大にしたマトリックス上で、そして周囲を養分を
含む環境でさらすことによって細胞を培養することによ
る人工臓器の構築のための方法および手段の、変更およ
び修飾は当業者には、明らかである。そのような修飾お
よび変更は付随する請求の範囲内に包含される。
フロントページの続き
(73)特許権者 591044027
チルドレンズ メディカル センター
コーポレイション
ＣＨＩＬＤＲＥＮ’Ｓ ＭＥＤＩＣＡＬ
ＣＥＮＴＥＲ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯ
Ｎ
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
02115 ボストン シャタックストリー
ト 55
(72)発明者 イングバー，ドナルド イー.
アメリカ合衆国 マサチューセッツ
02116，ボストン，モントゴメリー ス
トリート 71
(72)発明者 ランガー，ロバート エス.
アメリカ合衆国 マサチューセッツ
02158，ニュートン，ロンバード スト
リート 77
(72)発明者 ヴァカンティ，ジョーゼフ ピー.
アメリカ合衆国 マサチューセッツ
01890，ウィンチェスター，フェルズ
ロード 51
合議体
審判長 竹林 則幸
審判官 松浦 新司
審判官 小柳 正之
(56)参考文献 特開 平３−164168（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61L 27/00
Claims (11)
- 【請求項１】生体分解性または非分解性の合成ポリマー
あるいはコラーゲンから形成される、多孔性で弾力性の
ある非毒性のマトリックスであって、該マトリックス
が、患者に移植した後のマトリックスに細胞を導入する
ための手段を備え、体内で耐圧縮性または耐引っ張り性
を有し、マトリックスヘの細胞の導入に適しており、そ
して高度に血管新生された部位を生成するための血管組
織および結合組織の内部成長に適している、マトリック
ス。 - 【請求項２】栄養物、成長因子、補因子、脈管形成を刺
激する化合物、免疫モジュレーター、炎症の阻害剤、退
行因子、分化を刺激する因子、リンパ管網の内部成長を
刺激する生物学的活性分子、神経成長を増大する因子、
薬物、およびそれらの組合せから成る群から選択された
化合物をさらに含有する、請求項１に記載のマトリック
ス。 - 【請求項３】前記マトリックスが、異なる起源の細胞に
対して付着する別々の区域を与えるように形造られる、
請求項１に記載のマトリックス。 - 【請求項４】前記導入する手段が、カテーテルである、
請求項１に記載のマトリックス。 - 【請求項５】前記マトリックスの孔サイズが、100ミク
ロンと300ミクロンの間であり、血管の内部成長を可能
にし、そして、前記細胞または前記患者に損傷を与える
ことなく前記マトリックス内に細胞を導入することを可
能にする、請求項１に記載のマトリックス。 - 【請求項６】前記マトリックスが、該マトリックスの材
料として、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリ
コール酸、ポリ乳酸、これらのコポリマーおよび混合
物、ならびにコラーゲンから成る群から選択された、生
体分解性ポリマーから形成される、請求項１に記載のマ
トリックス。 - 【請求項７】前記マトリックスが、エチレンビニルアセ
テート、ポリビニルアルコールの誘導体、ポリテトラフ
ルオロエチレン、ナイロンおよびシリコーンから成る群
から選択された非分解性ポリマーから形成される、請求
項１に記載のマトリツクス。 - 【請求項８】胆管細胞、副甲状腺細胞、甲状腺細胞、副
腎−視床下部−下垂体軸の細胞、心筋細胞、腎上皮細
胞、腎管細胞、腎基底膜細胞、神経細胞、血管細胞、腸
管細胞、骨および軟骨を形成する細胞、平滑筋および骨
格筋を形成する細胞から成る群から選択された細胞をさ
らに含有する、請求項１に記載のマトリツクス。 - 【請求項９】分離された肝細胞をさらに含有する、請求
項１に記載のマトリックス。 - 【請求項１０】ポリビニルアルコールの誘導体から形成
される、請求項１に記載のマトリックス。 - 【請求項１１】移植後に細胞が接種され、インビボにお
いて機能的な血管新生された器官組織を生成する土台で
あって、該土台が、： 多孔性で三次元の土台であって、該土台内において一般
的に相互に連結した100から300ミクロンの直径の孔を有
し、そしてポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリ
コール酸、ポリ乳酸、それらのコポリマーおよび混合
物、コラーゲン、エチレンビニルアセテート、ポリビニ
ルアルコールの誘導体、ポリテトラフルオロエチレン、
ナイロン、およびシリコーンよりなる群より選択される
生体適合性ポリマーより構成される、土台を含み、 ここで、該土台が、インビボにおいて機能的な血管新生
器官組織を生成するために効果的な量の該細胞の付着を
可能にするのに十分な表面積を提供し、 ここで、該土台が、該患者において耐圧縮性であり、そ
れにより、該土台の孔サイズを100から300ミクロンの間
で維持し、ならびに高度に血管新生した土台を生成する
血管の内部成長および該細胞または該患者を損傷するこ
となく該細胞を該血管新生された土台へ導入することを
可能にする構造の孔サイズを維持し、 さらに、該患者へ移植した後の土台に実質細胞を導入す
るための手段を備える、土台。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US78502191A | 1991-10-30 | 1991-10-30 | |
| US785,021 | 1991-10-30 | ||
| PCT/US1992/009142 WO1993008850A1 (en) | 1991-10-30 | 1992-10-28 | Prevascularized polymeric implants for organ transplantation |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001397626A Division JP2002200162A (ja) | 1991-10-30 | 2001-12-27 | 臓器移植のための予備血管新生されたポリマー性移植片 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07508663A JPH07508663A (ja) | 1995-09-28 |
| JP3524919B2 true JP3524919B2 (ja) | 2004-05-10 |
Family
ID=25134239
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50852193A Expired - Lifetime JP3524919B2 (ja) | 1991-10-30 | 1992-10-28 | 臓器移植のための予備血管新生されたポリマー性移植片 |
| JP2001397626A Pending JP2002200162A (ja) | 1991-10-30 | 2001-12-27 | 臓器移植のための予備血管新生されたポリマー性移植片 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001397626A Pending JP2002200162A (ja) | 1991-10-30 | 2001-12-27 | 臓器移植のための予備血管新生されたポリマー性移植片 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0610423B1 (ja) |
| JP (2) | JP3524919B2 (ja) |
| AT (1) | ATE152631T1 (ja) |
| CA (1) | CA2121040A1 (ja) |
| DE (1) | DE69219613T2 (ja) |
| WO (1) | WO1993008850A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5610753A (en) | 1991-12-12 | 1997-03-11 | Eastman Kodak Company | Optical design of laser scanner to reduce thermal sensitivity |
| US6689608B1 (en) | 1993-02-01 | 2004-02-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Porous biodegradable polymeric materials for cell transplantation |
| ATE223493T1 (de) * | 1993-04-21 | 2002-09-15 | Pasteur Institut | Biokompatibles implantat zur in vivo expression und sekretion von therapeutischer verbindung |
| FR2708202B1 (fr) * | 1993-07-26 | 1996-03-29 | Pasteur Institut | Implant biocompatible pour l'expression chez l'homme ou chez l'animal de substances déterminées. |
| WO1994025079A1 (en) * | 1993-04-23 | 1994-11-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Porous biodegradable polymeric materials for cell transplantation |
| EP0707498B1 (en) * | 1993-07-07 | 2003-06-25 | Smith & Nephew PLC | Implantable prosthesis, kit and device for manufacturing the same |
| DK0663817T3 (da) | 1993-08-10 | 2000-03-13 | Gore & Ass | Celleindkapslingsindretning |
| US6176874B1 (en) * | 1993-10-18 | 2001-01-23 | Masschusetts Institute Of Technology | Vascularized tissue regeneration matrices formed by solid free form fabrication techniques |
| US5549675A (en) * | 1994-01-11 | 1996-08-27 | Baxter International, Inc. | Method for implanting tissue in a host |
| WO1995024929A2 (en) * | 1994-03-15 | 1995-09-21 | Brown University Research Foundation | Polymeric gene delivery system |
| US5716404A (en) * | 1994-12-16 | 1998-02-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Breast tissue engineering |
| US5648088A (en) | 1995-03-06 | 1997-07-15 | Ethicon, Inc. | Blends of absorbable polyoxaesters containing amines and/or amide groups |
| US5855610A (en) | 1995-05-19 | 1999-01-05 | Children's Medical Center Corporation | Engineering of strong, pliable tissues |
| WO1997010807A1 (en) * | 1995-09-22 | 1997-03-27 | Gore Hybrid Technologies, Inc. | Improved cell encapsulation device |
| DE69631402T2 (de) | 1995-11-06 | 2004-12-09 | Ethicon, Inc. | Polymermischungen die Polyoxaestern und Lactonpolymeren enthalten |
| WO1998021312A1 (en) * | 1996-11-08 | 1998-05-22 | Rpms Technology Limited | Human hepatocytes in three-dimensional support systems |
| US6316522B1 (en) | 1997-08-18 | 2001-11-13 | Scimed Life Systems, Inc. | Bioresorbable hydrogel compositions for implantable prostheses |
| US6129757A (en) | 1998-05-18 | 2000-10-10 | Scimed Life Systems | Implantable members for receiving therapeutically useful compositions |
| WO2000021470A1 (en) | 1998-10-12 | 2000-04-20 | Therics, Inc. | Composites for tissue regeneration and methods of manufacture thereof |
| JP2004505746A (ja) * | 2000-08-21 | 2004-02-26 | バーナード オブライエン インスティチュート オブ マイクロサージェリー | 血管化組織移植片 |
| US7998735B2 (en) | 2000-08-21 | 2011-08-16 | Victorian Tissue Engineering Centre Pty. Ltd. | Vascularized tissue graft |
| KR20010044624A (ko) * | 2001-03-12 | 2001-06-05 | 정재호 | 연골조직공학을 위한 연골지지체의 제조방법 및 이연골지지체를 사용하여 제조한 인공연골 |
| US7034037B2 (en) | 2001-06-29 | 2006-04-25 | Ethicon, Inc. | Compositions and medical devices utilizing bioabsorbable polymeric waxes and rapamycin |
| US6967234B2 (en) | 2002-12-18 | 2005-11-22 | Ethicon, Inc. | Alkyd-lactone copolymers for medical applications |
| US7030127B2 (en) | 2001-06-29 | 2006-04-18 | Ethicon, Inc. | Composition and medical devices utilizing bioabsorbable polymeric waxes |
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| US7005136B2 (en) | 2002-03-29 | 2006-02-28 | Ethicon, Inc. | Bone replacement materials utilizing bioabsorbable liquid polymers |
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