JPH07508647A - 組換えキシラナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えキシラナーゼ 発明の分野 本発明は、嫌気性菌類由来の組換えキシラナーゼおよび該組換えキシラナーゼの 製法ならびに該製法で用いるクローンに関する。

発明の背景 キシランはヘミセルロースの主要成分であって植物繊維の第２の主要成分である 。キシランはβ−１，４−結合したキシロース単位の骨格からなる。β−１，４ −キシロシド結合の酵素切断はエンド−β−１，４−キシラナーゼ（キシラナー ゼ）によって行われる。多くの微生物は細胞外キシラナーゼを産生ずる。過去１ ０年間、多くのキシラナーゼ遺伝子がリグノセルロース分解性細菌が単離されて いるが、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）において機能的発現を持つ菌類からのキ シラナーゼ遺伝子の単離は本発明に先立って記載されていない。

リグノセルロース分解性菌類は、通常、細菌よりも活性なキシラナーゼを産生じ 、特に、ヒツジのルーメンから単離された嫌気性菌類ネオカリマスティックス・ パトリンアルム（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ　ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｇ＋） はキシラン分解につき高能力を有する。

本発明に対する背景となる先行技術として供される他の先行技術にも言及する。

かかる先行技術は以下のものを包含する：（１）レイモンド（Ｒｅｙｓｏｎｄ） ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）１１０　（１９９２）　５７−６３　；（ｉｌ）ウォン グ（ｌｏｎｇ）ら、クリニカル・レビューズ・イン・バイオテクノロジー（ＣＩ ｉｎ、　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１２４１３−４ ３５　（１９９２）　：（ｆｆｌ）オルビン（Ｏｒｐｉｎ）ら、カレント−ｖイ クロバオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔｌｌｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第３巻（１９７ ９）　、１２１−１２４頁；（ｔｒ）　モウントフォルト（ｌｌｏｕｎｔｆｏｒ ｔ）およびアッシャ−（Ａｓｈｅｒ）　ｌ、「反御消化における原生動物および 菌類の役割（Ｔｈｅ　Ｒｏｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｏｚｏａ　ａｎｄ　Ｆｕｎｇ ｉ　ｉｎＲｕｍｉｎａｎｔ　Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）、（１９８９）ベルナムブル ・ブックス（Ｐｅｒｎａｍｂｕｌ　Ｂｏｏｋｓ）　（オーストラリア）； （Ｖ）ジョブリン（Ｊｏｂｌｉｎ）ら、エフ・イー・エム・ニス・マイクロバイ オロジー・レターズ（ＦＥＭＳ　ｌｌｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ ）６５（１９８９）１１９−１２２　；（＠）ローウニ（Ｌｏｖｅ）ら、アプラ イド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（＾ｐｐｌｉｅｄ 　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　１１ｉｃｒｏｂｉｏ１ｏｇｙ）６月号 　１９８７．１２１６−１２１５頁：および （ｖｉ）ローウニ（Ｌｏｖｅ）ら、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル ・マイクロバイオロジー（＾ｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａ ｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）６月号　１９８７．１２１６−１２２３頁 細菌からのキシラナーゼ遺伝子のクローニングは、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ ）で確立されているゲノミック・ライブラリーからの酵素的に活性なりローンの 単離によって達成できる。しかしながら、キシラナーゼの機能的発現を用いての 菌類ゲノミック・ライブラリーからのキシラナーゼ遺伝子の単離についてのアプ ローチは可能でない。これは、菌類が真核細胞微生物だからである。はとんどの 真核生物遺伝子はイントロンを含有し、イー・コリはイントロンをスプライシン グするためにｍＲＮＡの転写後修飾を行うことができない。従って、酵素的に機 能的な蛋白は、通常は、菌類ケノミック・ライブラリーから得られたクローンに おいて合成することかできない。

イー・コリにおける転写後修飾の問題を克服するためにｃＤＮＡクローニングア プローチを用いることができる。しかしながら、菌類におけるキシラナーゼは、 通常、糖鎖付加されており、糖鎖付加はしばしば多くの糖鎖付加酵素の生物学的 活性を要求する。クローン化遺伝子が酵母のごとき真核生物に移行されたならば 、この問題は解決できる。イー・コリにおけるｃＤＮＡクローンから生物学的に 機能的な蛋白を得るにおいてしばしば遭遇する他の問題は、（１）多くの真核生 物ｍＲＮＡは、ベクター中に供給された翻訳スタートからクローン化蛋白の合成 を妨げる遺伝子の翻訳開始コドンの上流に翻訳停止コドンを含有すること、およ び（ｉｔ）クローン化蛋白の合成は融合蛋白に基づいており、また、クローン化 蛋白の生物学的機能はしばしばクローニングベクターに由来する融合ペプチドに よって悪影響されることである。

従って、過去においては、この分野の研究者は、菌類多糖類ヒドロラーゼｃＤＮ ＡまたはゲラミックＤＮＡクローンの単離のためにディファレンシャル（ｄｉｆ ｆｅｒｅｎｔｉａｌ）もしくはクロス・ハイブリターイゼーション、抗体プロー ブまたはオリゴヌクレオチドプローブを使用してきた。この点に関して関連する 文献は、レイモンド（Ｒｅｙｍｏｎｄ）ら、エフ・イー・エム・ニス・マイクロ バイオロジー・レターズ（ＦＥｉｌＳ　ｌｌｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔ ｅｒｓ）７７　（１９９１）　１０７−１１２　；テエリ（Ｔｅｅｒｉ）らA バイオチクノロノー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１　６９１−６９６　（１ ９８３）　；シムズ（Ｓｉｎｓ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）７４　４１１−４２２ 　（１９８８）　；モロソリ（ＭｏｒｏｓｏＬｉ）およびドウランド（Ｄｕｒａ ｎｄ）エフ・イー・エム・ニス・マイクロバイオロジー・レターズ（ＦＥＭＳｌ ｌｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）　５１　２１７−２２４　（１９ ８８）　；およびアゼベト（Ａｚｅｖｅｄｏ）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラ ル・マイクロバイオロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、１１ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ）’）１ ３６２５６９−２５７６　（１９９０）を含む。しかしながら、これらの方法は 非常に時間がかかり、非常にしばしば広範な２段階のクローニング作業が酵素的 に機能的なりローンの単離に必要である。抗体またはオリゴヌクレオチドプロー ブについては、菌類キシラナーゼの精製も必要である。通常、前記アプローチを 用いて機能的酵素クローンを得るには１年以上を要する。

イー・コリにおける発現系を用いることによる菌類キシラナーゼｃＤＮＡの単離 は、恐らく部分的には、不適当な発現ベクターを用いることによって酵素的に機 能的かキシラナーゼ・クローンを得るのに失敗したことにより、本発明の出現前 には報告されていない。発現ベクター系の選択は重要である。ｐＵＣベクターの ごときプラスミド発現ベクターを用い、かつクローン化酵素が細胞内に捕らえら れると、便宜なキンラン−寒天プレート技術によるキシラナーゼ・クローンにつ いてのスクリーニングは困難である。バクテリオファージベクターは、細胞の溶 解のため、クローン化酵素をキンラン−寒天培地に放出する点につき利点を有す る。しかしながら、通常使用されているバクテリオファージ発現ベクターλｇｔ ｌｌおよびその誘導体は、ＬａｃＺペプチドのＣ−末端においてポリクローナル 部位を有する。クローン化酵素に融合したＬａｃＺペプチドの大きな部分はクロ ーン化酵素の活性にしばしば悪影響する。

特に前記したレイモンドらの（１９９１）文献においては、エン・フロンタリ（ Ｎ。

ｆｒｏｎｔａｌｉｓ）である嫌気性菌類からの多糖類ヒドロラーゼ（すなわち、 セルラーゼ）遺伝子の分子クローニングの試みが記載されている。この文献では 、エン・フロンタリ（Ｎ、　ｆｒｏｎｔａｌｉｓ）に由来するｃＤＮＡライブラ リーからのクローンが、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒ ｅｅｓｅｉ）のエキソ−セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ１）の一部をコードする ＤＮＡプローブにハイブリダイズされている。しかしながら、引き続いて、レイ モンドらによって、私信において、エン・フロンタリ（Ｎ、　ｆｒｏｎｔａｌｉ ｓ）に由来する特別のｃＤＮＡクローンはいずれの多糖類ヒドロラーゼをもコー ドしないことが明らかにされている。

さらに、レイモンドらの文献は、これらのクローンからの生物学的に機能的な酵 素の産生を記載していない。

菌類キシラナーゼ遺伝子の単離に関しては、本発明に先立ってこれまでに存在す る唯一の報告は前記したモロソリ（Ｍｏｒｏｓｏｌｉ）およびドウランド（Ｄｕ ｒａｎｄ）の文献であり、それは、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーショ ン技術を用いて酵母クリプトコツカス・アルビドウス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ　ａｌｂｉｄｕｓ）からキシラナーゼ遺伝子を単離することを記載している。

しかしながら、この文献は、このキシラナーゼ遺伝子から生物学的に機能的な酵 素の産生を記載していない。

発明の詳細な陳述 本発明の目的は、キンランの加水分解に関して商業的に使用できる、嫌気性ルー メン菌類からの組換えキシラナーゼを提供することにある。

本発明のさらなる目的は、本発明の組換えキシラナーゼをコードし得る嫌気性ル ーメン菌類からキシラナーゼｃＤＮＡをクローニングする方法を提供することに ある。

本発明のさらなる目的は、前記した方法で産生され得るキシラナーゼ・クローン を提供することにある。

本発明のクローニング方法は、以下の工程：（ｉ）嫌気性ルーメン菌類を培養し ： （Ｕ工程（ｉ）における培養から全ＲＮＡを単離し；（ｆｆｌ）工程（ム）でい う全ＲＮＡからポリＡ″’ｍＲＮＡを単離し：（ｔｖ）ｃＤＮＡ発現ライブラリ ーを構築し：（ｖ）λＺＡＰ、λＺＡＰＩＩまたは同様の特性のベクターから選 択されるバクテリオファージ発現ベクターにｃＤＮＡを連結し。

（ｖｉ）キンラン加水分解の検出によって、キシランを取り込んだ培地において キシラナーゼ陽性組換えクローンをスクリーニングし。

（ｖｉ）　キシラナーゼ陽性組換えクローンを精製することよりなる。

嫌気性菌類からの組換えキシラナーゼの調製に関する前記工程（ｉ）において、 特に消化管菌類を後記するごとくに培養する。これらの菌類は厳格な嫌気性であ り、その例は、ネオカリマスティックス・パトリンアルム（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍ ａｓｔｉｘｐａｔｒｉｃｉａｒ＋ｍ）、ネオカリマスティックス・フロンタリス （ＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘｆｒｏｎｔａＨｓ）、ネオカリマスティックス ・フルレイエンシス（Ｎｅｏｃａｌｌｉ＋ｍａｓｔｉｘｈｕｒｌｅｙｅｎｓｉｓ ）、ネオカリマスティックス・スタントルペンシス（Ｎｅｏｃａｌｌｉ＋＊ａｓ ｔｉｘｓｔａｎｔｈｏｒｐｅｎｓｉｓ）、スフェロモナス・コミュニス（Ｓｐｈ ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、セコマイセス・エキイ（Ｃａｅｃｏ ｍｙｃｅｓ　ｅｑｕｉ）、ピロマイセス・コミュニスＣＰｉｒｏｍｙｃｅｓＣＯ ■−ｕｎｉｓ）、ピロマイセス・エキイ（Ｐｉｒｏ曹ｙｃｅｓ　ｅｑｕｉ）、ピ ロマイセス・ドウンポニ力（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ　ｄ＋ｍｂｏｎｉｃａ）、ピロ マイセス・レタルギクス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓｌｅｔｈａｒｇｉｃｕｓ）、ピロ マイセス・マイ（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｉ）、ルミノマイセイ・エレガンス （Ｒｕｍｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｅｌｅｇａｎｓ）、アオロマイセス・ムクロナトウ ス（Ａｎａｅｒｏｍｙｃｅｓｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ）、オルピノマイセス・ボビ ス（Ｐｒｐｉｎｏ＋＊ｙｃｅｓ　ｂｏｖｉｓ）およびオルピノマイセス・ジオヨ ニイ（Ｏｒｐｉｎｏ園ｙｃｅｓ　ｊｏｙｏｎｉｉ）である。前記した嫌気性消化 管菌類については、セコマイセス・エキイ（Ｃａｅｃｏｍｙｃｅｓ　ｅｑｕｉ） 、ピノマイセス・エキイ（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ　ｅｑｕｉ）、ピロマイセス・ド ウンポニ力（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｕｍｂｏｎｉｃａ凄よびピロマイセス・マ イ（Ｐｉｒｏ＠ｙｃｅｓ　ｍａｉ）がウマで見い出されており、か（して、前記 した他の菌類と同様ウシのルーメンに極在しない。

培養は、ルーメン液を含有する適当な培地で行うことができ、また、嫌気性条件 下、炭素源としてアビセル（＾ｖｉｃｅｌ）　（すなわち、マイクロクリスタリ ン・セルロースの形態）のごときセルロースを含有することもできる。菌類の培 養の後、全ＲＮＡがいずれかの適当な方法で得られる。かくして、まず、濾過１ こよって菌類の細胞を収穫し、続いて、機械的破壊によって適当な細胞溶解緩衝 液中で溶解する。また、適当なＲＮＡ保存性化合物を菌類細胞に添加して、さも なけれ：ｆ菌類ＲＮＡを攻撃するかも知れないＲＮＡ５ｅを変性することによっ てＲＮＡを無傷に維持することもできる。続いて、全ＲＮＡを、Ｃｓ　Ｃ１ｔり １．シタンを通じての超遠心によって、またはモレキュラー・クローニングニア ・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；＾Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ）第２版、コールド・スジ１ノング・ハーバ−・ラボラトリ−・ プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒ ｅｓｓ）、１９８９にサムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）によって記載された別 の方法によるごと（、Ｇ）ずれかの適当な技術によってホモジネートから単離で きる。前記されたものζ；対して全菌類ＲＮＡの調製の別法は、パイオーテクニ ・ソクス（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）１４ｇ−１４９，１９９０でブイサ ント（Ｐｕｉｓｓａｎｔ　）およびホウデビン（ｔｌｏｕｄｅｂｉｎｅ）ｌ二よ ってＮｅ載された手法に基づくものであってもよく、あるいはそれから適用され たものであってもよい。また、この別法技術における全菌類ＲＮＡは、ｐＨ４に お（Ｘでフェノールクロロホルムでの抽出によって前記ホモジネートから単離し てＤＮＡおよび関連蛋白を除去することができる。さらに、塩化リチウム−尿素 溶液での洗浄によって全ＲＮＡを精製した。

次いで、オリゴ（ｄＴ）セルロースのごとき多重チミジン残基を含有する化合物 上のアフィニティークロマトグラフィーによって、ポリ（Ａ）”ｍＲＮＡを全Ｒ ＮＡから単離することができる。別法として、ポリ（Ｕ　）　−５ｅｐｈａｄｅ ｘのごとき多重ウラシル残基を含有する化合物を用いることもできる。次０で、 ボＩＪ（Ａ）’ｍＲＮ、Ａを適当な緩衝液によってアフィニティーカラムから溶 出させることもできる。

次いで、酵素逆転写酵素によるポリ（Ａ）”ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの変換（二基 づく標準的な技術を用いて、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを構築すること力（でき る。

ｃＤＮＡの第１鎖は逆転写酵素を用いて合成でき、また、ｃＤＮＡの第２鎖１ま イー・コリのＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成できる。続（Ａて、ｃＤＮＡＩ ；ｉ適当なサイズに分画でき、バクテリオファージ発現ベクター、好ましくはλ ＺＡＰまたはλＺＡＰＩＩに連結することができる。次いで、イー・コリの適当 な株のごときいずれかの適当な宿主細菌細胞を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケンジの後に増幅できる。

工程（Ｙ）におけるバクテリオファージ発現ベクターの選択は、かかる発現ベク ターが以下の特徴・ （ｉ）イー・コリ・プロモーターを有すること：（ｉｆ）翻訳開始コドンを有す ること；（坦）リポソーム結合部位を有すること。

（汁）該ベクターに由来する融合ペプチドは、クローン化蛋白の生物学的機能は 通常該ベクターに由来する融合ペプチドによって悪影響を受けるのでできる限り 小さくあるべきである。従って、バクテリオファージ発現ベクターのポリクロー ナル部位は、適当には、λＺＡＰＩＩにおけるごと＜ＩａｃＺペプチドのＮ−末 端に位置する。

を有すべき点が重要である。

前記したことより、発現ベクターが前記したごとくに使用されるならば、生物学 的に機能的な酵素を得る機会が大いに増加することは明らかであろう。本発明に おける後記するごとき多くの酵素的に機能的なキノラナーゼクローンの単離はこ のアプローチを効果的なものとした。我々の知識に及ぶ限り、これは、前記した 発現ベクターを用いてのイー・コリにおける組換えバクテリオファージの発現に 基づいて、嫌気性菌類から、機能的酵素活性をもつキシラナーゼｃＤＮＡクロー ンを単離する最初の記録である。λＺＡＰおよびλＺＡＰＩＩはかかる発現ベク ターの例である。

従って、λＺＡＰまたはλＺＡＰＩＩと「同様の特性のベクター」なる語は、そ の範囲内に、前記した特徴（ｉ）、（ｉｆ）、（伍）および（汁）を有する発現 ベクターを包含する。

また、製造業者によって供給されたλＺＡＰＩＩベクターを伴う産物の要約より 、融合蛋白の発現については、かかる融合蛋白は抗体プローブによってスクリ一 二ングされるだけであることも明らかである。明らかに、λＺＡＰＩＩベクター は、適当な基質での酵素発現または生物学的活性によるいずれかの直接的スクリ ーニングを含めた、クローンのスクリーニングで用いることができる。本発明は 真核生物起源（すなわち、菌類起源）のｃＤＮＡのイー・コリのごとき細菌宿主 細胞における発現を含むことが実現されると、本発明の新規性は強調される。

キシラナーゼ陽性組換えクローンのスクリーニングは、キシランの加水分解に基 づくいずれかの適当な技術によって行うことができる。この手法において、クロ ーンを、キンランを取り込んだ培地で増殖させることができ、加水分解は、適当 な発色指示薬によって適当に助力されたキシラナーゼ陽性プラークの存在によっ て検出できる。次いで、キシラナーゼ陽性組換えクローンを精製し、次いで、ｃ ＤＮＡインサートを切り出してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ　（ＳＫ　（−）　）に入 れ、イー・コリにおけるキシラナーゼの発現を促進するλＺＡＰＩＩ構築体と比 較して、簡単な構造の発現ベクターを得ることができる。

いずれの適当なイー・コリ・プロモーターも前記した発現ベクターで用いること ができる。適当なプロモーターは］ａｃＺ、Ｔａｃ、バクテリオファージＴ７お よびラムグーＰＬを包含する。

次いで、組換えキシラナーゼ酵素を特徴付けることができ、確認された主要な特 徴は以下の通りである。

（ｉ）クローン化キシラナーゼは高い特異的活性を有する。

（Ｕ）酵素はセルロースに対して残存する活性を有さず、一方、多くの他のキシ ラナーゼはいくらかのセルラーゼ活性を有する。キシラナーゼのこの特性は、セ ルロース繊維を損傷することなく植物繊維からキンランを除去しリグニンを解離 するバルブおよび紙工業へのその適用で特に有用である。

クローン化キノラナーゼの高い特異的活性はこの菌類キシラナーゼの優れた固有 の性質である。キシラナーゼｃＤＮＡの本構築体の発現レベルはさらに遺伝子お よびプロモーターを操作することによって改善できる。

１、微生物株、ベクターおよび培地 オルピン（Ｏｒｐｉｎ）およびムン（Ｍｕｎｎ）　（１９８６）　［トランス・ プル・マイコル・ツク（Ｔｒａｎｓ、　Ｂｒ、　Ｍｙｃｏｌ、　Ｓｏｃ、）８６ 　１７８−１８１］によって、嫌気性菌類ネオカリマスティックス・パトリンア ルム（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ　ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ）　（タイプ種 ）をヒツジ・ルーメンから単離し、リグノセルロース基質による選択下、何年間 も、実験室で培養した。ｃＤＮＡクローニングについての宿主株および組換えキ シラナーゼの特徴付けはイー・コリＰＬＫ−Ｆ、ＸＬ１−Ｂ］ｕｅおよびＪＭ８ ３であった。

ベクターはλＺＡＰＩＩ、　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　（ＳＫ−Ｘストラタジー ン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））であった。エン・パトリノアルム（Ｎ、　ｐａｔ ｒｉｃｉａｒｕｍ）培養を、ケンプ（Ｋｅｅｐ）ら（１９８４）によって記載さ れているごとくに、１０％ルーメン液を含有する培地で維持した。イー・コリ株 を、一般的目的のために、サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）に よって記載されているごとくにＬ−ブロス中で増殖させた。組換えファージは、 ストラタジーンの指示に従って、ＮＺＹ培地を用いて、イー・コリ株中で増殖さ せた。

２、一般的な組換えＤＮＡ技術 アガロース電気泳動、制限酵素およびＴ４　ＤＮＡＮカリゼを用いるイー・コリ の形質転換およびＤＮＡの修飾は前記したサムプルツクに記載されている通りで あった。ヌクレイツク・アンッズ・リサーチズ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒ ｅｓ、）７　１５１３−１５２３　（１９７６）に記載されているビルンボイム （Ｂｉｒｎｂｏｉｓ）およびドリイ（Ｄｏｌｙ）のアリカリ性溶解を用いてプラ スミドを単離した。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によるｉｎ　ｖｉｔｒｏＤＮ Ａ増幅は、サイキ（Ｓａｉｋｉ）　（１９８９）　［ビイ・シイ・アール・テク ノロジー（ＯＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　（エイチ・エイ・エーリツヒ（ｎ、 ＾、　Ｅｒ１ｉｃｈ）編）、７−１６頁、エム・ストックトン・プレス（Ｍ、　 ５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク］によって記載された手法に基 づくものであった。

３、ＲＮＡの調製のためのルーメン嫌気性菌類、エン・／クトリシアルム（Ｎ、 　ｐａｔｒｉｃｉａｒ＋ｍ）の培養エン・バトリシアルム（Ｎ、　ｐａｔｒｉｃ ｉａｒｕｍ）は、１％Ａｖｉｃｅｌの存在下、嫌気性条件下、３９℃にて、４８ 時間、ケンプ（Ｋｅｍｐ）ら［ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオ ロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｊｏｌ、）１３０　２７−３７　（１９ ８４）コによって記載されているごとくにルーメン液含有培地で増殖させた（フ ィリップス（Ｐｈｉｌｉｐｓ）およびゴルドン（Ｇｏｒｄｏｎ）によってアブル ン・エンピロン・マイクロパイオル（＾ｐｐｌｎ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ、）５５　１６９５−１７０２で、ローウニ（Ｌｏｖｅ）によって ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　１ｌ ｉｃｒｏｂｉｏ１．）乳鉢および乳棒を用い、液体窒素下、凍結した菌糸を微細 な粉末に摩砕した。

チオンアン酸グアニジウム溶液（４Ｍチオンアン酸グアニジウム、０．５％ラウ リルサルコンンナトリウム、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０，１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．ＩＭ　β−メルカプトエタノール）の５〜１０倍容量を、凍 結した菌糸粉末に添加し、乳鉢および乳棒を用いて混合物を５分間、ポリトロン （Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ホモゲナイサーを用いて全速度にてさらに２分間ホモジネ ートした。ＣｓＣ］クッションを通しての超遠心によって全ＲＮＡをホネジネー トから単離した（サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９）　（ブイサ ンド（Ｐｕｉｓｓａｎｔ）およびホウデビン（ｔｌｏｕｄｅｂｉｎｅ）によって バイオ−テクニックス（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）１４８−１４９．１９ ９０に記載されている手法の適用のごとき、全菌類ＲＮＡの別調製法を用いるこ ともてきる）。

５　ポリＡ”ｍＲＮＡ精製 ポリ八゛は、オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーによって全ＲＮＡか ら精製した（サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、１９８９）。

ｃＤＮＡライブラリーは、基本的には製造業者の指示に従い、トスラタジーン（ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のλＺＡＰｃＤＮＡ合成キットを用いて構築した。

該手法は簡単に述べると以下の通りである　Ｘｈｏｌリンカー−オリゴ（ｄＴ） プライマーおよび５−メチルｄＣＴＰを用い、ポリＡ゛、ＲＮＡを逆転写酵素に よって第１鎖ｃＤＮＡに変換した。ＲＮＡ５ｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼ■の 作用によって二本鎖鎖ｃＤＮＡを該第１鎖ｃＤＮＡから合成した。ｃＤＮＡを平 滑末端とした後、該ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩアダプターで連結し、リン酸化し、Ｘ ｈｏｌで消化して、５°領域にＥｃｏＲ１部位および３゛領域にＸｈｏ１部位を 持つｃＤＮＡを得た。該ｃＤＮＡを１％低融点アガロースゲル電気泳動によって サイズ分画し、１．２−８ｋｂのサイズのｃＤＮＡをフェノール抽出によって回 収した（サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、１９８９）、該サイズ分画したｃ ＤＮＡを、次いで、ＥｃｏＲＩ／Ｘｈｏｌ消化のλＺＡＰＩＩベクターに連結し た。

該ｃＤＮＡライブラリーをｉｎ　ｖｉｔｒｏにてパッケージし、イー・コリＰＬ Ｋ−Ｆ’を平板培養細胞として用いて増幅した。

７、キシラナーゼ陽性組換えバクテリオファージクローンのスクリーニング０． １％キシランおよび１０ｍＭイソプロピル−β−チオーガラクトピラノンド（Ｉ 　ＰＴＧＳＬａｃＺプロモーター制御の遺伝子発現のための指示薬）を含有する ０、７％頂部寒天中のイー・コリＸ　Ｌ　１−Ｂｌｕｅにて組換えファージを増 殖させた。３７℃における一晩のインキュベーションの後、０．５％コンゴーレ ッド溶液を該頂部寒天に添加した。１５分間のＲＴにおけるインキュベーション の後、未結合染料を、ＩＭ　ＮａＣｌでの洗浄によって除去した。キシラナーゼ 産生ファンプラークは、赤色のバックグラウンドに対して、黄色のハローによっ て囲まれていた。

キシラナーゼ陽性組換えファージを、再度平板培養し、該ファージを前記したご とく２〜３回再スクリーニングすることによって均質に精製した。

キシラナーゼ陽性ファージ中のｃＤＮＡインサートを、Ｒ４０８ヘルパーフアー ジを用いて切り出してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ　（−）に入れた。

８、キシラナーゼおよび関連酵素アッセイキシラナーゼ陽性組換えプラスミドを 有するイー・コリからのクローン化酵素抽出物は、細胞を遠心によって収穫する ことによって調製した。細胞ペレットを、リゾチーム（０，２５ｍｇ／ｍｌ）を 含有する２５ｍＭ　トリス−ＣＩ／２ｍＭＥＤＴＡに！濁し、氷上で６０分間イ ンキュベートした。凍結、解凍およびホモジネート化の後、粗製細胞溶解物を酵 素アッセイに用いた。

該酵素を、明細書に特記する以外は、５〇−關クエン酸ナトリウム、ｐＨ６，５ 中、４０℃にてキシランおよび他の基質の加水分解についてアッセイした。キン ランまたは他の植物多糖類（Ａｖｉｃｅｌ）から放出された還元糖は、アナル・ バイオケム（＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）４７　２７３−２７９．１９７２ にレバー（Ｌｅｖｅｒ）によって記載されているごとくに測定した。

クラフトバルブに対するキシラナーゼ活性は以下のごとくに行った：クラフトバ ルブを水道水に懸濁し、１Ｍ硫酸でｐＨを７に調整した。キシラナーゼ抽出物を クラフトパルプ墾濁液に添加し、放出された還元糖を前記したごとくに測定した 。

９、ＤＮＡ配列決定 一重鎮ブラスミドＤＮＡは基本的にはストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） のプロトコルに従って調製した。得られたＤＮＡの配列決定は、Ｔ７　ＤＮＡポ リメラーゼ配列決定キット（プロメガ（Ｐｒｏａ＋ｅｇａ））の製造業者によっ て推奨されたプロトコルら基づくものであった。

１０、ｐＮＸ−Ｔａｃクローンの増殖条件の最適化ｐＮＸ−Ｔａｃプラスミドを 保有するイー・コリ株ＪＭ８３は、ＬＢ／Ａｍｐ９．。。ｇｇ／ｌＩ中、３０℃ にて一晩増殖させた。−晩培養物１ｍｌを表５に示したように１００ｍ１の培地 に接種した。ＩＰＴＧを増殖の異なる時点で添加した。培養物を３０℃で１７時 間、２４時間および３０時間増殖させた。キシラナーゼ収率の測定のために細胞 を収穫した。

＾ｖｉｃｅｌｌを唯一の炭素源として増殖させたエン・パトリシアルム（Ｎ。

ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ）から単離したｍＲＮＡを用い、１０６クローンからな るｃＤＮＡライブラリーを構築した。キンランを加水分解した３１の組換えバク テリオファージを、ライブラリーからの５Ｘ１０’クローンの最初のスクリーニ ングの後に同定し、１６の強いキシラナーゼ陽性のファージおよび２つの弱いキ シラナーゼ陽性のファージを単離し、精製した。これらの組換えバクテリオファ ージクローンのキシラナーゼ活性は、キンラン−加水分解ゾーンをスコア取りし た後に最初に分析した（図１および表１）。

これらの１６の強いキシラナーゼ陽性のクローンを、まず、ザ・ユニバーンティ ・オブ・ニューキャッスルーアポンーチュ−：／　（Ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉ ｔｙ　ｏｆ　Ｎｅｗｃａｔｓｌｅ−ｕｐｏｎ−Ｔｙｎｅ）のエイチ・ジェイ・ギ ルバート（ＨＪ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）博士およびジエイ・ビイ・ハズレウッド（Ｇ 　Ｐ　Ｈａｚｌｅｖｏｏｄ）博士、および英国の動物生理学および遺伝研究のＡ ＦＲＣ研究所（Ａ　Ｆ　ＲＣＩｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｐｈｙ ｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ＧｅｎｅｔｉｃｓＲｅｓｅａｒｃｈ）に送り、そこで 、制限マツピングおよびハイブリダイゼーション分析ならびに最長クローンの配 列決定を含めたこれらのクローンのさらなる研究が行われた。この点に関し、エ イチ・ジェイ・ギルバート（ＨＪ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）、ジエイ・ビイ＋ハズレウ ッド（Ｇ　Ｐ　ｌｌａｚｌｅｗｏｏｄ）、ジエイ・アイ・ラウリー（Ｊ、　１． 　Ｌａｕｒｉｅ）、シイ・シイ・オルピン（Ｃ，Ｇ、　０ｒｐｉｎ）およびシイ ・ビイ・キュー（Ｇ、　Ｐ、　Ｘｕｅ）による、モレクユラー・マイクロバイオ ロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＭｉｃｒｏＢｉｏｌｏｇｙ）　（１９９２）６　 （１５）　２０６５−２０７２に発表された論文ｒＢｏｍｏｇｅｎｏｕｓ　ｃａ ｔａｌｙｔｉｃ　ｄｏ＋ａａｉｎｓ　ｉｎ　ａ　ｒｕｍ■■ ｆｕｎｇａｌ　ｘｙｌａｎａｓｅ；　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｄ ｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｌｉｃ　盾窒奄■奄獅i に言及すべきである。この刊行物で言及されている最長クローンはｐＮＸｌと命 名され、これは後記するクローンｐＮＰＸ２１に対応する。前記したギルバート らの文献においては、他のプラスミドｐＮＸ２、ｐＮＸ３、ｐＮＸ４、ｐＮＸ５ 、ｐＮＸ６およびｐＮＸ７が、制限酵素によってｐＮＸｌの切形の結果として産 生されている。

前記したイー・コリ株Ｘ　Ｌ　１−ＢｌｕｅにおけるクローンｐＮＸ１に対応す るクローンは、１９９２年６月２２日、受託番号Ｎ９２／２７５４２の下、国際 寄託当局、オートスラリア政府分析研究所（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ　Ｇｏｖｅｒ ｎｍｅｎｔ　ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に寄託した。

より高活性のキシラナーゼを得る試において、該ライブラリーからの４　Ｘ　１ ０’クローンのさらなるスクリーニングを行い、その結果、〉２００のキシラナ ーゼ陽性クローンが得られた。１０の高活性クローンを単離し、精製した。これ らの組換えバクテリオファージ・クローンのうち２つは（λＮＰＸ２９およびλ ＮＰＸ３０）は、従前に単離した高活性クローンよりもかなり強いキシラナーゼ 活性を有していた（表１参照）。

ネオカリマスティックス・パトリシアルム（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ　ｐ ａｔｒｉｃｉａｒ＋ｍ）キシラナーゼをコードする該ｃＤＮＡインサートをバク テリオファージ（λＺＡＰ１１）形態から切り出し、プラスミドｐＢ１ｕｅｓｃ ｒｉｐ　Ｓ　Ｋ−形態に入れた。高いキシラナーゼ活性を持ついくつかのクロー ンを、基質特異性につき分析した（表２に示した４つのクローン）。これらのク ローンによって産生されたキシラナーゼは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭ Ｃ，エンド−グルカナーゼについての基質）またはＡｖｉｃｅｌ　（Ａｖｉｃｅ ｌは結晶セルロースであって、エンド−グルカナーゼの基質である）に対して活 性を有しない。代表的なりローンの制限地図を図２に示す。これらの４つのキシ ラナーゼｃＤＮＡは同一の制限パターンを有するが、長さは異なっているようで ある。ｐＮＰＸ１３およびｐＮＰＸ２９はｐＮＰＸ２１よりも短い長さを有する が、ｐＮＰＸ２１よりはかなり高い活性を有している。興味あることニハ、ｐＮ ＰＸＳ０はｐＮＰＸ２１と同様の長さを有するが、ｐＮＰＸ２１より約１５倍も 高いキシラナーゼ活性を有する。ｐＮＰＸ２１とｐＮＰＸＳ０との間の酵素活性 の顕著な差異ため、ｐＮＰＸ３ＱクローンのキシラナーゼｃＤＮＡを配列決定し た。結果は、ｐＮＰＸＳ０のＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡの大部分において、ｐＮＰ Ｘ２１と同一の配列を共に有するが、５°および３′の両頭域で異なることを示 す（図３）。ｐＮＰＸ３０ｃＤＮＡは全長ではない。興味あることには、ｐＮＰ Ｘ３０キシラナーゼのＮ−末端は６つの反復したアルギニン／グルタミン酸残基 を有する（図４）。

ｐＮＰＸ２１およびｐＮＰＸＳ０によって産生されたキシラナーゼのｐＨおよび 温度の最適を調べた。これらの酵素は、広範囲のｐＨで、好ましくはｐＨ５−８ で活性であった。これらの酵素の熱安定性を３０℃−６０℃の温度でテストした 。該酵素は３０℃−５５℃、好ましくは４０℃−５０℃で活性である。

エン・バトリノアルム・キシラナーゼｃＤＮＡの遺伝的修飾ｐＮＰＸ３０　（お よびｐＮＰＸ２１）は、２つの大きい反復したドメインを含有する。３つの主要 な構築体はｐＮＰＸＳ０から産生された。

ｐＮＸＤ−Ｔａｃ ｐＮＰＸ３０プラスミド（ｐＮＰＸ２１も使用できる）を、プライマー■および ブライ７−Ｎを用いるｐＮＸＤ−Ｔａｃの構築用ＰＣＨによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ増幅についての鋳型として使用した（図５）。増幅したＤＮＡをＥｃｏＲ ＩおよびＨｊｎｄＩＩＩで消化し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化のｐＢ Ｔａｃ　（イーリンガ−（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））に連結してｐＮＸＤ−Ｔａ ｃを得た。

ｐＮＸＳ−Ｔａｃ ｐＮＸＤ−ＴａｃプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フレノウで満たすこと によって平滑とし、続いて、Ｓａｃ　Ｉで部分的に消化した。ＬＭＴアガロース ゲル上での分画の後、５．３Ｋｂバンドを該ゲルから回収し、連結してｐＤＧＸ Ｓ構築体が得られ、これはキシラナーゼ活性を有している。ｐＤＧＸＳプラスミ ドを、プライマー■およびプライマーＩＩを用いるｐＮＰＸＳ−Ｔａｃの構築用 の１ｎｖｉｔｒｏＤ　Ｎ　Ａ増幅のための鋳型として使用した（図５）。増幅し たＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ ｄＩＩＩ消化のｐＢＴａｃ２ベクターに連結してｐＮＰＸＳ−Ｔａｃを得た。

ｐＮＸ−Ｔａ　ｃ ｐＮＰＸ３０プラスミド（図２にリストしたｐＮＰＸ２１または他のキシラナー ゼｃＤＮＡを使用できる）をＲｓａｌで消化し、図５に示した７０９ｂｐ断片を アガロースゲル電気泳動での分画の後に単離した。該７０９ｂｐ断片をＳｍａ　 １およびＰｓｔｌ消化のｐＵｃ１８に連結した（Ｐｓｔｌ末端はＴ４ＤＮＡポリ メラーゼで平滑とした）。この構築体をｐＮＸＰ２と命名し、ｐＮＰＸＳ０から の切形キシラナーゼｃＤＮＡの右側向きを持つ二の構築体のキシラナーゼ活性に より、該ｃＤＮＡのこの断片が触媒的に機能的なドメインをコードすることが確 認された。２つのオリゴヌクレオチドブライマー、プライマーＩＩＩおよびプラ イマーＩＶ（図５）を、次いで、ｐＮＸＰ２キシラナーゼｃＤＮＡインサートの ＰＣＲ増幅のために消化した。該ＰＣＲ増幅断片をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｃＨ ＩＩで消化し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌ消化のｐＢＴａｃベクターに連 結してｐＮＸ−Ｔａｃが得られた。

これらの構築体をすべて切形キシラナーゼｃＤＮＡのＮ−末端配列にて修飾し、 翻訳停止コドン（ＴＡＡ）を該切形キノラナーゼ暗号領域の末端に導入した。キ シラナーゼの発現はＴａｃプロモーター（図６）によって制御し、これらの構築 体におけるキシラナーゼは非融合蛋白として合成される。ｐＮＸ−Ｔａｃにおけ る修飾したキノラナーゼｃＤＮＡ配列を図７に示す。

ｐＮＸＤ−Ｔａｃ、ｐＮＸＳ−ＴａｃおよびｐＮＸ−Ｔａｃクローンの粗製キシ ラナーゼ調製物の特異的活性は、５０℃における５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩 衝液（ｐＨ６）中で測定して、各々、イー・コリの合計細胞蛋白の２２訳１２４ および６７２Ｕ／ｍｇであった（図５）。りｏ−ンｐＮＸ−Ｔａｃによって合成 されたキシラナーゼは主として細胞ペレット中に見いだされ、少量のキシラナー ゼ（約５％）が培地に放出された（表３）。該ｐＮＸ−ＴａｃキシラＴａ上は５ ０℃の最適温度を有し、４０ないし５５℃で最大活性の〉８０％、６０℃で該活 性の５５％を有していた（図８）。ｐＮＸ−Ｔａｃキシラナーゼは広範囲のｐＨ 範囲を有しく図９）　、ｐＨ５−７，５で最も活性であり、ｐＨ８，５で５０％ 、およびｐＨ９，５で２０％であった。該ｐＮＸ−ＴａｃキシラＴａ上は、水道 水中にての（ｐＨは硫酸でｐＨ７に調整した、図８参照）、かつ５５℃における クラフトパルプからの還元糖の放出において高活性を有し、ｐＨ７で少な（とも ３時間、５５℃における該パルプからのキシランの加水分解において活性を保持 していた（図１０）。ｐＮＸ−Ｔａｃキシラナーゼはワーカリおよびマツのクラ フトバルブからかなりの量のキシランを加水分解できる（表４）。

ｐＮＸ−丁ａＣクローンの増殖条件の最適化キシラン生産のコストを減少させる ため、ｐＮＸ−Ｔａｃプラスミドを有するイー・コリ株ＪＭ８３の増殖条件を調 べた。表５は、実験室規模において、ｐＮＸ−Ｔａｃクローンは、好ましくは、 ３０℃において２４時間増殖させ、それにより、ＬＢＳの２倍高いキシラナーゼ 収量を産生ずることを示す。好ましくは、ＩＰＴＧを培養の最初に添加する（表 ６）。

キシラナーゼは、パルプおよび紙工業、食品加工、飼料工業および動物生産業の ごとき多くの産業への適用を有する。これらの組換えキシラナーゼクローンによ って産生された酵素はセルラーゼ活性を有さす、パルプの酵素的前処理で用いる 条件に合致したｐＨおよび温度プロフィールを有する（特に、遺伝的に修飾した キシラナーゼ・クローン、ｐＮＸ−Ｔａｃ）。従って、本発明のキシラナーゼは 紙およびパルプ工業に適用できると信する。

米国のサントス・プロダクツ・ピティ・リミテッド（Ｓａｎｄｏｚ　Ｐｒｏｄｕ ｃｔｓ　ＰｔｙＬｔｄ）は、菌類キシラナーゼであって（粗製）、３０℃−５５ ℃、ｐＨ３ないし５で活性で、２つのキシラナーゼを含有し、力りＩＵのキシラ ナーゼ７ｇバルブを用いて塩素の２５−３３％の減少が可能であることが見いだ されたその産物Ｃａｒｔａｚｙ■ｅを用いて、現実的な試みを行った。また、該 産物は、化学品を単独で使用した場合よりも鮮やかである。該キシラナーゼのも う１つの利点は、化学品は低リグニン含量でセルロースを攻撃でき、繊維強度の 減少および他の望ましくない物理的特性に導くが、それは特異的であるというこ とである。従って、キシラナーゼはパルプ漂白でより重要となり得、その特異性 および高レベルの発現のため組み換えたものは特にそうであることは明らかであ る。特に、ｐＮＸ−Ｔａｃキシラナーゼはクラフトバルブからのキシランの加水 分解において非常に活性である。

また、本発明のキシラナーゼは、糖工業において、効率的な処理のため、ならび に食品の処理のために、バガスまたは他の産物を処理して栄養価値を改善する関 係において、価値ある適用を有すると信する。遺伝的に修飾されたキシラナーゼ 遺伝子はルーメン細菌の修飾に使用して反部動物による植物繊維の利用を改善す る二ともできる。

従って、前記したことより、本発明はその範囲内に、前記した組換えキシラナー ゼのみならず、本明細書中に記載した方法によつて調製し得る前記した他の嫌気 性菌類由来のキシラナーゼも包含することは明らかであろう。

本発明は、また、その範囲内に、 （ｉ）これらのキシラナーゼｃＤＮＡ由来のＤＮＡ配列（特に、ｐＮＰＸ３０、 ｐＮＸＤ−Ｔａｃ、ｐＮＸＳ−ＴａｃおよびｐＮＸ−Ｔａｃにおける配列）およ びサムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）に記載された標準的な核酸 ／％イブリダイゼーション技術を用いてそれにハイブリダイズできるＤＮＡ配列 ；（ｉｆ）適当な発現宿主においてキシラナーゼ活性を有するポリペプチドの発 現または過剰発現を指示できる調節領域に作動可能に連結した（ｉ）におけるご ときＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築体；（迅）前記したキシラナーゼ構築体を 有する、菌類キシラナーゼの発現または過剰発現ができる形質転換微生物宿主。

（ｉｖ）　（世）におけるごとき微生物宿主を用いた発現によって産生されたキ シラナーゼ活性活性を有するポリペプチド：（ｖ）当業者により、キシラナーゼ 、それからの切形および修飾から誘導されるアミノ酸配列； を包含する。

イ−−：ｆｆｌＪ株ＪＭ８３中のプラスミドｐＮＸ−Ｔａｃは、１９９３年３月 １７日に、受託番号Ｎ９３／１２２１１の下、国際寄託当局、すなわち、オース トラリア政府分析研究所（＾ｕｓｔｒａｌｉａｎ　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ａｎ ａｌｙｔｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に寄託した。

要約すると、本発明のクローニング方法は、イー・コリで機能的に発現されたエ ン・バトリノアルムのごとき嫌気性ルーメン菌類からの、強力なキシラナーゼ活 性を有する数多くの組換えキシラナーゼ・クローンを得ることに基づ（。菌類キ シラナーゼまたはセルラーゼのごとき他の植物多糖類ヒドロラーゼの単離につい てのこのアプローチは本発明以前には記載されていない。本発明で用いたアプロ ーチは非常に効率的であり、嫌気性菌類から生物学的に機能的なキシラナーゼを 得るのに、単一のクローニング工程のみを要する。従って、前記した先行技術に 記載されている菌類から植物多糖類ヒドロラーゼを単離するための従前のアプロ ーチと比較して、菌類源から生物学的に機能的なキシラナーゼ・クローンを得る のに非常に短い時間がかかるだけである。

添付する請求の範囲で用いる「実質的」なる語は、図３．４．５および７に示し た配列と７０−１００％同一性を有する配列をその範囲内に包含する。

キンラン−ブレートアッセイに対する組換えバクテリオファージ・クローンのキ シラナーゼ活性 主シランー除去ゾーン 込ＰＸ１１　Ｌ 訳ＰＸ１２　−５ ＩＮＰＸ１３　Ｌ＋＋＋　（９ｍｍｌ ＷＰＸ１４　Ｌ χＮＰＸ１５　Ｌ＋ χＮＰＸ１６　Ｌ 法ＰＸ１７　Ｓ　（４ｍｍｌ 川ＰＸ用８　、　Ｌ＋ 川ＰＸ１９　Ｌ 法ＰＸ２０　Ｌ 込ＰＸ２３’　Ｌ 込ＰＸ２４　Ｌ υＪＰＸ２５　Ｌ＋ λＮＰＸ２８　Ｌ＋ 括弧に入れた値１はゾーンの直径である。

さらなるスクリーニングの後に単離した。

表２ エン・パトリンアルムからのクローン化キシラナーゼの特異的活性特異的活性（ Ｕ／ｍｇ蛋白） キシラン　ＣＭＣ＊　結晶セルロース ｐＮＰＸ１３　４１．６　０　０ ｐＮＰＸ２１　７．８　０　０ ｐＮＰＸ２９　７３．５　０　０ ｐＮＰＸ３０　１１３　０　０ 粗製酵素抽出物を酵素アッセイで用いた。反応は０．２５％キシランまたは１％ Ａｖ４ｃａｌを含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）中、４０℃ で行った。

ｐＮＸ−Ｔａｃキシラナーゼの特異的活性細胞ペレット キシラン　６７２　７２６　２３ ＣＭＣ＊　０ 結晶セルロース　０ ＊ＣＭＣ−プレートで分析 ｐＮＸ−Ｔａｃプラスミドを有するイー・コリ株ＪＭ８３を３０℃で１７時間、 Ｌ−ブロス中で増殖させた。

キシラナーゼ活性は０．２５％キシランを含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウム （ｐＨ６）中、５０℃で測定し、放出された還元糖は前記した方法で測定した。

表４ クラフトパルプから放出された還元糖 は５２℃で３時間行った。

ｐＮＸ−Ｔａｃプラスミドを有するイー・コリＪＭ８３の増殖条件の最適化キシ ラナーゼ収率 ＬＢＳ　Ｏ，ＳｍＭ　１０　１００％　１００％ＬＢＳＧ　１１　５５％　５５ ％ ＬＢＭＧ　０．１ｍＭ　２２　１６８％　１６８％０．５ｍＭ　２２　１５１％ 　２００％　２００％２．５ｍＭ　２２　１９０％　１９０％ＬＢＭＨＧ　０． ５ｍＭ　２０　１１０％　１１０％ｐＮＸ−Ｔａｃプラスミドを有するイー・コ リ株ＪＭ８３は、３０℃にて、５０％ｇ／ｍｌ　Ａｍｐを含有する特別の培地で 増殖させ、ＩＰＴＧは培養の最初に添加した。

表６ ｐＮＸ−Ｔａｃクローンの誘導時間の最適化ＩＰＴＧの添加時間　キシラナーゼ 収率（相対活性）０時間　１００％ ８時間　８２％ １６時間　４０％ ｐＮＸ−Ｔａｃプラスミドを有するイー・コリ株ＪＭ８３は、３０℃において、 ５０％ｇ／ｍｌ　Ａｍｐおよび０．５ｍＭ　ＩＰＴＧを含有するＬＢＭＧ中で２ ４時間増殖させた。

説明一覧 図１　（ａ）　、１　（ｂ）　、１　（ｃ）および１（ｄ）各々、クローンλＮ ＰＸ１３、λＮＰＸ１７、λＮＰＸ２１およびλＮＰＸ２６に関するエン・バト リンアルムについてのキシラナーゼｃＤＮＡを含有する組換えバクテリオファー ジ・クローンのキンラン−除去ゾーン図２ ネオカリマスティックス・パトリシアルムｃＤＮＡライブラリーから単離した高 活性クローンの制隔地図 制限酵素の略字 Ｂ、Ｂｓ　ｔＸｌ　；ＥｌＥｃｏＲＩ　；Ｈ，Ｈｐａｌ　：に、Ｋｐｎｌ　；Ｐ 、ＰｖｕＩ　Ｉ　；　Ｓ、５ａｃｌ　；５ｃ１Ｓｃａｌ　；Ｘ、Ｘｈｏ１図３ ｐＮＰＸ３０キシラナーゼｃＤＮＡのＤＮＡ配列。小文字でタイプした配列はｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋベクターから来たものである。

図４ ｐＮＰＸ３０キノラナーゼのアミノ酸配列。下線を施したアミノ酸残基は、Ｌａ ｃＺペプチドのＮ−末端から来たものであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ ベクターにおけるポリリンカー配列によってコードされている。

図５ キシラナーゼｃＤＮＡの遺伝的に修飾した構築体ベクター・ｐＢＴａｃ２ プライマｍ： ＰＩ：　５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧ　ＧＣＴ　ＡＧＣＡＧＡ　ＴＴＡ　ＡＣ ＣＧＴＣＧＧＴ　ＡＡＴ　ＧＧＴ　ＣＰ１１５’−ＡＴＡＣＧＴＡＡＧＣＴＴＡ ＡＡＣＡＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＡＧｐＨｌ：　５’−ＣＧＧＡＡ　ＴＴ ＣＡＴ　ＧＧＣＴＡ　ＧＣＡＡＴ　ＧＧＴＡＡ　ＡＡＡＧＴ　ｎＡＣＴ　ＧＰＩ Ｖ５’−ＡＴＡＣＧ　ＴＡＡＧＣＴｒＡＡＣＧＡＧＧＡ　ＧＣＧＧＣＡＧＡＧＧ 　ＴＧＧ制限酵素についての略字 Ｂ、ＢｓｔＸｌ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ，Ｈｐａｌ；に、Ｋｐｎｌ；Ｐ、Ｐｖｕｌ ｌ　：Ｓ、５ａｃｌ　；Ｓｃ、５ｃａｌ　；Ｘ、Ｘｈｏ１図６ ｐＮＸ−Ｔａｃ構築体 図７ ｐＮＸ−Ｔａｃにおける修飾したキシラナーゼｃＤＮＡの配列図８ ｐＮＸ−Ｔａｃキノラナーゼの活性に対するインキュベーション温度の影響キシ ラナーゼアッセイは、種々の温度で３０分間、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐ Ｈ７）および０２５％（Ｗ／Ｖ）キンラン中で行った。

図９ ｐＮＸ−Ｔａｃキノラナーゼの活性に対するｐＨの効果キノラナーゼアッセイは ０．２５％キシランを含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５−７）または２ ５ｍＭ）リス−Ｃ１１５０ｍＭ　ＮａＣ１（ｐＨ７゜５−９．５）中で５０Ｃで ３０分間行った。緩衝液のｐＨは室温で測定した。

図１０ ユーカリ・クラフトバルブに対するＩ）ＮＸ−Ｔａｃキ／ラーゼ活性の時間経過 加水分解はｐＨ７，０にて、警濁バルブ水道水中、５５℃で行った。

ｐＮＰＸ３０牛ノラナーゼｃＤＮＡ ＦＴＧｔＪＲＥ　３ ＭＴＭ工ＴＰＳＳＫＬＴＬＴＫＧＮＫＳＷＳＳＴＡＶＡＡＡＬＥＬＶＤＰＰＧＣ ＲＮＳＡＲＧＥＲＥＲＥＲＥＲＥＲＥＲＡＱＷＧＧＧＧＡＳＡＧＱＲＬＴＶＧＮ ＧＱＴＱＨＫＧＶＡＤＧＹＳＹＥＩＷＬＤＨ７ＧＧＳＧＳＭＴＬＧＳＧＡＴＦＫ ＡＥＷＮＡＳＶＮＲＧＮＦＬＡＲＲＧＬＤＦＧＳＱＫＫＡＴＤＹＳＹ工ＧＬＤＹ ＴＡＴＹＲＱＴＧＳＡＳＧＮＳＲＬＣＶＹＧＷＦＱＮＲＧＶＱＧＶＰＬＶＥＹＹ エエＥＤＷＶＤＷＶＰＤＡＱＧＲＭＶＴよりＧＡＱＹＫ工ＦＱＭＤＨＴＧＰＴ工 ＮＧＧＳＥＴＦＫＱＹＦＳＶＲＱＱＫＲＴＳＧＨ工ＴＶＳＤＨＦＫＥＷＤＶＹＴ ＴＱＫＧＳＮＰＡＰＴＳＴＧＴＶＰＳＳＳＡＧＧＳＴＡＮＧＫＫＦＴＶＧＮＧＱ ＮＱＨＫＧＶＮＤＧＦＳＹＥ工ＷＬＤＮＴＧＧＮＧＳＭ’ｒＬＧＳＧＡＴＦＫＡ ＥＷＮＡＡＶＮＲＧＮＦＬＡＲＲＧＬＤＦＧＳＱＫＫＡＴＤＹＤＹ工ＧＬＤＹＡ ＡＴＹＫＱＴＡＳＡＳＧＮＳＲＬＣＶＹＧＷＦＱＮＲＧＬＮＧＶＰＬＶＥＹＹＩ ＩＥＤＷＶＤＷＶＰＤＡＱＧＫＭＶＴよりＧＡＱＹＫ工ＦＱＭＤＨＴＧＰＴ工Ｎ ＧＧＳＥＴＦＫＱＹＦＳＶＲＱＱＫＲＴＳＧＨ工ＴＶＳＤＨＦＫＥＷＡＫＱＧＷ ＧＩＧＮＬＹＥＶＡＬＮＡＥＧＷＱＳＳＧＶＡＤＶＴＬＬＤＶＹＴＴＰＫＧＳＳ 　ＰＡＴＳＡＡＰＲＴＴＴＲＴＴＴＲＴＫＳＬＰＴＮＹＮＫＣ５ＡＲＩＴＡＱＧ ＹＫＣＣ５ＤＰＮＣＶＶＹＹＴＤＥＤＧＴＷＧＶＥＮ　ＮＤＷＣＧＣＧＶＥＱＣ ＳＳＫ工ＴＳＱＧＹＫＣＣ５ＤＰＮＣＶＶＦＹＴＤＤＤＧＫＷＧＡＥＮＮＤＷＣ ＧＣＧＦＦｉｇｕｒｅ　６ ＡＣＣＧＴＧＧＡＣＴＴＡＡＴＧＧＣＧＴＴＣＣＴｒＴＡＧＴＡＧＡＡＴＡＣＴ ＡＣＡＴＣ：ａＴＴＧＡＡＧＡＴＴＧＧＧＴＴＧＡＣＴＮＲＧＬＮＧＶＰＬＶＥ ＹＹＩ　ＩＥＤＷＶＤＧＧＧＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＡＣＡＡＧＧｋＡＡＡＡＴＧ ＧＴＭＣＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＡＴＡＴＡＡＧＡＴＴＴＴ’ＣＣＷＶ ＰＤＡＱＧＫＨＶＴＩＤＧＡＱＹＫＩＦＡＡＡＴＧＧＡＴＣＡＣＡＣ丁ＧＧＴＣ ＣＡＡＣＴＡ　丁ＣＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＧＣＡＡ 　丁ＡＣＴＴＣＡＱＭＤＨＴＧＰＴ　工　ＮＧＧＳＥＴＦＫＱＹＦＧＧＧＣＣＡ ＡＡＣＡＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＡＴＴＧＧＴＡＡＣＣｍＡ丁ＧＡＡＧＴＴＧＣ’ ｒ’ｒ’ＴＧｋＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＴＷＡＫＱＧ＄、ＩＧＩＧＮＬＹＥＶＡ ＬＮＡＥＧＧＧＣＡＡＡＧＴＡＧＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＡＴＧＴＣＡＣＣＴｒ ＡＴｒＡＧＡτＧＴＴＴＡＣＡＣＡ）ｒｃＴｃｃｋＡＡＧＧＧＴＴＷＱＳＳＧＶ ＡＤＶＴＬＬＤＶＹＴＴＰＫＧＦｉｇｕｒｅ　７ 八 搗♀嬶−４６４十□□□禰 ＦＩＧＬＩＲＥ　９ ＦＩＧＵＲＥ　１０ 国際調査報告　□□８０ ＰＣｒｆＡＵ　９３７０１１２ｓ４ 国際調査報告　−一□陶 ＰＣＴ／ＡＵ９３／ｍＮ 国際調査報告　−／ＡＵ９３ｊＤａ１９４謬ゲ＝＝工＝二≧コ＝１；電−＝Ｐａ ｍ？”Ｏｍ−二雪：習ｆｏｒ　ｔｈｅｓｅ　ｐａｒｔｉｃｕｌａｎ　ｗｈｉｃｈ 　ａｒｅ　ｍｅｒｅｌｙ　ｇｉｖｅ＋＋　ｆｏｒ山ｅ　ｐｕｒｐｏｓｅ　ｏｆ　 １獅■盾氏{ｗ＋ｏｎ。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　１５１ ０９　ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ１：６４５） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　９／３８ Ｃ１２Ｒ１：１９） （３１）優先権主張番号　ＰＬ　８１００（３２）優先臼　１９９３年４月１日 （３３）優先権主張国　オーストラリア（ＡＵ）ＦＩ Ｃ１２Ｒ１：６４５） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＮＥ 、ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＢＹ。

ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ， ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、ＲＯ， ＲＵ。

ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. １．（ｉ）嫌気性ルーメン菌類を培養し；（ｉｉ）工程（ｉ）における培養から 全ＲＮＡを単離し；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）でいう全ＲＮＡからポリＡ＋ｍＲＮ Ａを単離し；（ｉｖ）ｃＤＮＡ発現ライブラリーを構築し；（ｖ）λＺＡＰ、λ ＺＡＰＨまたは同様の特性のベクターから選択されたバクテリオファージ発現ベ クターにｃＤＮＡを連結し；（ｖｉ）キシラン加水分解の検出によって、キシラ ンを取り込んだ培地中でキシラナーゼ陽性の組換えクローンをスクリーニングし ；次いで、（ｖｉｉ）キシラナーゼ陽性組換えクローンを精製する；工程よりな ることを特徴とする嫌気性ルーメン菌類からキシラナーゼ・クローンをクローニ ングする方法。
2. ２．該発現ベクターがλＺＡＰＨである請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．酸素加水分解の該検出を発色指示薬コンゴーレッドを用いて行う請求の範囲 第１項記載の方法。
4. ４．キシラナーゼ陽性クローンの生産の後、かかるクローン中のｃＤＮＡインサ ートをヘルパーファージを用いて切り出してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに入れる請 求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．該ヘルパーファージがＲ４０８ヘルパーファージである請求の範囲第１項記 載の方法。
6. ６．請求の範囲第１項記載の方法によって産生されたキシラナーゼ陽性組換えク ローン。
7. ７．以下の特性： （ｉ）エヌ・パトリシアルム由来のキシラナーゼｃＤＮＡを含有する培養中にキ シラン除去ゾーンを生成すること； （ｉｉ）キシランの加水分解における活性を有するが、ＣＭＣまたは結晶セルロ ースに関する活性を有しない； を有するキシラナーゼ陽性組換えクローン。
8. ８．１９９２年６月２２日に、受託番号Ｎ９２／２７５４２下、オーストラリア 政府分析研究所（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ａｎａｌｙｔ ｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に寄託した組換えキシラナーゼ・クロー ンｐＮＰＸ２１。
9. ９．それにハイブリダイズできるＤＮＡ配列を含めた図３に示したｐＮＰＸ３０ キシラナーゼｃＤＮＡに実質的に対応するＤＮＡ配列を包含する単離されたＤＮ Ａ分子。
10. １０．実質的に図４に示したｐＮＰＸ３０キシラナーゼのアミノ酸配列を包含す るポリペプチド。
11. １１．それにハイブリダイズできるＤＮＡ配列を含めた実質的に図５に示したｐ ＮＸＤ−Ｔａｃに対応するＤＮＡ配列を含めた単離されたＤＮＡ分子。
12. １２．それにハイブリダイズできるＤＮＡ配列を包含する実質的に図５に示した ｐＮＸＳ−Ｔａｃに対応するＤＮＡ配列を含めた単離されたＤＮＡ分子。
13. １３．それにハイブリダイズできるＤＮＡ配列を包含する実質的に図５に示した ｐＮＸ−Ｔａｃに対応するＤＮＡ配列を含めた単離されたＤＮＡ分子。
14. １４．図５に示したプライマーＰＩ。
15. １５．図５に示したプライマーＰＩＩ。
16. １６．図５に示したプライマーＰＩＩＩ。
17. １７．図５に占めたプライマーＰＩＶ。
18. １８．それにハイブリダイズできるＤＮＡ配列を包含する実質的に図７に示した ＤＮＡ配列を含めた単離されたＤＮＡ分子。
19. １９．請求の範囲第６項に記載の組換えキシラナーゼ・クローンから産生された キシラナーゼ。
20. ２０．請求の範囲第７項に記載の組換えキシラナーゼ・クローンから産生された キシラナーゼ。
21. ２１．適当な発現宿主中において、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの発 現または過剰発現を指示できる調節領域に作動可能に連結した請求の範囲第９項 に記載のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築体。
22. ２２．適当な発現宿主中において、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの発 現または過剰発現を指示できる調節領域に作動可能に連結した請求の範囲第１１ 項に記載のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築体。
23. ２３．適当な発現宿主中において、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの発 現または過剰発現を指示できる調節領域ご作動可能に連結した請求の範囲第１２ 項に記載のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築体。
24. ２４．適当な発現宿主中において、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの発 現または過剰発現を指示できる調節領域に作動可能に連結した請求の範囲第１３ 項に記載のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築体。
25. ２５．適当な発現宿主中において、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの発 現または過剰発現を指示できる調節領域に作動可能に連結した請求の範囲第１８ 項に記載のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築体。
26. ２６．請求の範囲第２１項に記載のキシラナーゼ構築体を有する菌類キシラナー ゼの発現または過剰発現が可能な形質転換微生物宿主。
27. ２７．請求の範囲第２２項に記載のキシラナーゼ構築体を有する菌類キシラナー ゼの発現または過剰発現が可能な形質転換微生物宿主。
28. ２８．請求の範囲第２３項に記載のキシラナーゼ構築体を有する菌類キシラナー ゼの発現または過剰発現が可能な形質転換微生物宿主。
29. ２９．請求の範囲第２４項に記載のキシラナーゼ構築体を有する菌類キシラナー ゼの発現または過剰発現が可能な形質転換微生物宿主。
30. ３０．請求の範囲第２５項に記載のキシラナーゼ構築体を有する菌類キシラナー ゼの発現または過剰発現が可能な形質転換微生物宿主。
31. ３１．請求の範囲第２６項に記載の微生物宿主を用いる発現によって産生された キシラナーゼ活性を有するポリペプチド。
32. ３２．請求の範囲第２７項に記載の微生物宿主を用いる発現によって産生された キシラナーゼ活性を有するポリペプチド。
33. ３３．請求の範囲第２８項に記載の微生物宿主を用いる発現によって産生された キシラナーゼ活性を有するポリペプチド。
34. ３４．請求の範囲第２９項に記載の微生物宿主を用いる発現によって産生された キシラナーゼ活性を有するポリペプチド。
35. ３５．請求の範囲第３０項に記載の微生物宿主を用いる発現によって産生された キシラナーゼ活性を有するポリペプチド。
36. ３６．その切形された形態および修飾された形態を含めた請求の範囲第３１項に 記載のポリペプチドに由来するアミノ酸配列を包含するポリペプチド。
37. ３７．その切形された形態および修飾された形態を含めた請求の範囲第３２項に 記載のポリペプチドに由来するアミノ酸配列を包含するポリペプチド。
38. ３８．その切形された形態および修飾された形態を含めた請求の範囲第３３項に 記載のポリペプチドに由来するアミノ酸配列を包含するポリペプチド。
39. ３９．その切形された形態および修飾された形態を含めた請求の範囲第３４項に 記載のポリペプチドに由来するアミノ酸配列を包含するポリペプチド。
40. ４０．その切形された形態および修飾された形態を含めた請求の範囲第３５項に 記載のポリペプチドに由来するアミノ酸配列を包含するポリペプチド。
41. ４１．１９９３年、３月１７日に、受託番号Ｎ９３／１２２１１の下、オースト ラリア政府分析研究所（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ａｎａ ｌｙｔｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に寄託された組換えキシラナーゼ ・クローンｐＮＸ−Ｔａｃ。
42. ４２．機能的ネオカリマスティックス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）キシラ ナーゼをコードする単離されたｃＤＮＡ分子。
43. ４３．機能的ネオカリマスティックス・パトリシアルム（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａ ｓｔｉｘｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ）キシラナーゼをコードする単離されたｃＤＮ Ａ分子。
44. ４４．請求の範囲第４２項に記載のｃＤＮＡ分子を有する菌類キシラナーゼの発 現または過剰発現が可能な形質転換微生物宿主。
45. ４５．請求の範囲第４３項に記載のｃＤＮＡ分子を有する菌類キシラナーゼの発 現または過剰発現が可能な形質転換微生物宿主。
46. ４６．請求の範囲第４４項に記載の微生物宿主を用いる発現によって産生された キシラナーゼ活性を有するポリペプチド。
47. ４７．請求の範囲第４５項に記載の微生物宿主を用いる発現によって産生された キシラナーゼ活性を有するポリペプチド。
48. ４８．その切形された形態および修飾された形態を含めた請求の範囲第４６項に 記載のペプチドに由来するアミノ酸配列。
49. ４９．その切形された形態および修飾された形態を含めた請求の範囲第４６項に 記載のペプチドに由来するアミノ酸配列。