JPH07505042A

JPH07505042A - パピローマウイルスワクチン

Info

Publication number: JPH07505042A
Application number: JP5502486A
Authority: JP
Inventors: フレーザー，イアン; ゾウ，ジャン
Original assignee: ザ・ユニバーシティ・オブ・クイーンズランド; シーエスエル・リミテッド
Priority date: 1991-07-19
Filing date: 1992-07-20
Publication date: 1995-06-08
Anticipated expiration: 2021-10-04
Also published as: NL300314I2; EP1471147A2; JP3828570B2; JP2004000269A; ES2267890T3; DE69233639D1; US7169585B2; AU651727B2; CY2007034I1; LU91386I2; US20070154902A1; ATE234925T1; CY2007015I1; DK1298211T3; LU91316I2; CY2007030I2; DE69233639T2; HK1059271A1; US6613557B1; WO1993002184A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】パピローマウィルスワクチン発明の分野本発明は、パピローマウィルス、特に、かかるウィルスによって引き起こされる感染の治療において有効である得る抗原およびワクチンに関する。

発明の背景パピローマウィルス感染は、ヒトにおいてのみならず、ヒツジ、テヌ、ウシ、コヨーテ、オオカミ、オポッナム、ジノ１１カモン力、ビーバー、カメ、ウマ、トカゲ類、サル、チンパンジー、ジラフ、アフリカ産大カモンカ、ゾウ、クジラ、ネコ、ブタ、ネズミ（ｇｅｒｂｉｌ）、オオシカ、ヤク、イルカ、オウム、ヤギ、サイ、ラクダ、レミング、ンアモア、スカンク、フクロウマ、アナウマ、キツネザル、カリブー、アルマシロ、イモリおよびヘビのごとき動物においても知られている（例えば、ジエイ・ビイ・サンドバーブ（］　Ｐ　Ｓｕｎｄｂｅｒｇ）による「動物におけるパピローマウィルス感染（Ｐａｐｉｌｌｏｍａ　Ｖｉｒｕｓ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ａｎｉ＋ｃａｌｓ）Ｊの「パピローマウィルスおよびヒトの病気（Ｐａｐｉｌｌｏｍａ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　Ｂｕｍａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ）Ｊに記載、ケイ・ンルヤ不ン、エル・ギスマンおよびエル・シイ・コス（Ｋ　５ｙｒｊａｎｅｎ。

Ｌ　Ｇ１５ｓ＠ａｎ　ａｎｄ　Ｌ　Ｇ　Ｋｏｓｓ）ｉｌｉ、　ノＬプリンゲル・フエアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ）１９８７参照））。

また、パピローマウィルスは、ＤＮＡ配列の相同性に応じてタイプ１〜５６に分けられるヒト・パピローマウィルス（ＨＰＶ）のごときいくつかの異なる群に包含されることも知られている（例えば、エイチ・ツイスタ−（ＨＰｆｉｓｔｅｒ）によって編集され、シイアールシイ・プレス・インコーホレイテッド（ＣＲＣＰｒｅｓｓ　Ｉｎｃ）によって発行された「パピローマウィルスおよびヒト癌（Ｐａｐｉｌｌｏｅ＋ａ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄＨｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ）Ｊ　）。ＨＰＶの臨床病理学的グループ分けおよびそれが最も頻繁に関連し得る障害の悪性の可能性は以下のとおり分けられる。

第１群には、良性足底イボを引き起こすタイプ１および４、良性尋常性ユウゼイを引き起こすタイプ２．２６．２８および２９、良性偏平イボを引き起こすタイプ３．１０および２７ならびにブッチャーズ（ｂｕｔｃｈｅｒ’　ｓ）ユウゼイを引き起こすタイプ７がリストされ得る。感染のこの第１の群は、正常なまたは免疫適格個体で起こる。

免疫無防備個体に関する第２群には、高度に悪性の斑状病変（ｍａｃｕｌａｒ　１ｅｓｉｏｎ）を引き起こすタイプ５および８、良性または稀には悪性である斑状ももしくは偏平病変を引き起こすタイプ９．１２．１４．１５．１７．１９− ２５．３６および４６−５０がリストされ得る。さもなければ、これらの斑状病変は、イボ状表皮異形成（ＥＶ）として知られている。

特に性器に感染する第３群には、稀に悪性であるフンジロームを引き起こすタイプ６．１１．３４および３９．４１−４４、および５１−５５、良性病巣上皮肥厚を引き起こすタイプ］３および３２、上皮形成異常およびその他丘疹症を含めたかなりの程度の病変を引き起こすタイプ１６および１８、中程度の悪性可能性を有するコニノンロームを引き起こすタイプ３０．３１．３３．３５．４５および５６がリストされ得る。該コンジロームは、はとんど、肛門性器管、特に頚部に出現する。タイプ１６および１８は、頚部、膣、外陰部および管部のｉｎ　５ｉｔｕおよび侵入性癌腫の大多数と関連する。また、コンジロームはアエロタイプエスティブ（ａｅｒｏｄｉｇｅｓｔｉｖｅ）管で起こり得る。

特に、ＨＰ１６は、尿生殖器管の前悪性および悪性疾患に関連し、特に、頚部の癌腫に関連する（ドウルスト（Ｄｕｒｓｔ）ら、ＰＮＡＳ　８０．３８１２−３８１５．１９８３　；ギスマン（Ｇｉｓｓｍａｎ）ら、ツヤ−ナル・オブ・インベステイガテイブ・デルマトロジ−（Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、）　８３　３６５　２８５．１９８４）。現在ＨＰＶ１６の中和における液性応答の役割についての情報はない。

ＨＰＶ１６感染を持つ患者の血清中のＨＰＶ融合蛋白（ジェニソン（Ｊｅｎｉｓｏｎ）ら、ジャーナル・オブ・バイｏｏジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）　６旦　１２０８−１２１８．１９９０；ケ・ソヘル（Ｋ、ｏｃｈｅｌンら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）　４８　６８２−６８８．１９９１）および合成ＨＰＶ１．６Ｌ１ペプチド（ディルナ−（Ｄｉｌｌｎｅｒ）ら、インターナショナル・ジャ０）に対する抗体の検出により、これらの技術によって同定されたＨＰＶ　１６Ｌ１−特異的抗体を有する患者はほとんどいなかったにも拘わらず、ＨＰＶのキャプシド蛋白内にＢエピトープがあることが確認される。ｉｎ　ｖｉｔｒｏにてのＨＰＶＩ６増殖についての系はなく、ヒト性器病巣はＨＰＶ１６ビリオンをほとんど産生せず、従って、免疫学的研究用にＨｐｖｉ６粒子は入手できなかった。

また、動物パピローマウィルスは、ウノ・パピローマウィルス（ＢＰＶ）および、特に、ＤＮＡ配列の相同性によっても区別されるタイプＢＰＶＩ、ＢＰＶ２、ＢＰＶ３、ＢＰＶ４、Ｂ　Ｐ　Ｖ　５およびＢＰＶ６を包含し得る。一般に、他の動物パピローマウィルスは、シカ、ウマ、ウサギ、イヌ、１歯類および鳥類に感染する。パピローマウィルスは、８つまでの初期遺伝子および２つの後期遺伝子をコードする小さなりＮＡウィルスである。（レビューについては、ランカスターおよびジエンノン（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ｊｅｎｓｏｎ）、１９８７、キャンサー・メタスタシス・レビューズ（Ｃａｎｃｅｒ　１ｌｅｔａｓｔ、　Ｒｅｖ、）６６５３−６６６４頁、およびツイスタ−（Ｐｆｉｓｔｅｒ）　１９８７、アドバーンンズ・イン・キャンサー・リサーチズ（＾ｄｖ。

Ｃａｎｃｅｒ　１ｉｅｓ、　）　４８．１．１３−ｉ４７参照）。後期遺伝子の組織は前期遺伝子よりも単純である。後期遺伝子Ｌ１およびＬ２は、はとんどの場合、相互にわずかに重複する。推定Ｌ２蛋白、特にＣ−末端の１０の塩基性アミノ酸の配列は、異なるパピローマウィルス間で高度に保存されている。中央部における広いドメインは、小さいクラスターの類似性のみを明らかにする。しかしながら、ＬｌｏＲＦは、すべての公知ケースにおいて、変化なく保存されているようどある。

（ンルヤネン（Ｓｙｒｊａｎｅｎ）ら、前掲、参照）。アミノ酸配列の相同性は、ＨＰＶｌａ、ＨＰＶ６ｂＳＢＰＶＩおよびＣＲＰＶ（コドンテールウサギ（ｃｏｔｔｏｎ　ｔａｉｌｒａｂｂｉｔ）・パピローマウィルス）の間で比較して、５０％に達する。

パピローマウィルス感染に関する免疫療法に関しては、イボおよび上皮病変の従前の治療方法は、苦痛および外傷となり得る外科手術の使用を含むものであり、傷を残し、再感染が起こりかねない危険をしばしば伴うものであった。また、化学品での治療も使用されてきた。通常の治療剤はサリチル酸であり、これはチンキおよびプラスター中の１０％ないし４０％の範囲の強さの主成分である。また、３％ないし２０％の強さのホルマリンも提案されている。寒冷療法は皮膚のイボの治Ｗに使用されてきた。治療剤としてのグルチルアルデヒドもまた使用されてきた。ボドフィリン（ｐｃｘ！ｏｐｈＶ１１ｉｎ）もまた種々の成功度をもって皮膚のイボおよび肛門性器コンジロームに使用されてきた。肛門性器コンジロームに使用されてきた外科手術のタイプは、外科的切除、冷凍外科およびレーザー外科を含むものであった。また、インターフェロンの使用も提案されてきた（例えば、シルヤネン（Ｓｙｒｊａｎｅｎ）ら、前掲、参照）。

ウシ・パピローマウィルス（ＢＰＶ）のＬ１蛋白に対する抗体は、つ・ｒルス中和活性（ビラデンスキー（Ｐｉｌａｃｉｎｓｋｉ）ら、１９８６）を有し、ＨＰＶ〕−１ピリオンは特異的抗血清（クリステンセンおよびクレイダ−（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　ａｎｄＫｒｅｉｄｅｒ）、ジャーナル・オブ・バイｏｐジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）　且　３１５１−３１５６．１９９０）によるｉｎ　ｖｉｔｒｏモデルで不活化できる。また、ＨＰＶＩ−誘発皮膚イボの自然発生的退行は、イボ蛋白に対する液性免疫応答の増大に関連するといういくらかの証拠もある（キルヒナ−（Ｋｉｒｃｈｎｅｒ）、プログ・メト・パイロル（Ｐｒｏｇ、　Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ、）３旦　１−４１．１９８６）。

また、ワクチンも提案されており、通常の成功を収めている。０原性腫瘍ホモジネートを含有するワクチンを使用することが提案されている〔アブカリアン（Ａｂｃａｒｉａｎ）ら、ジャーナル・オブ・サージカル・リサーチ（Ｊ、　Ｓｕｒｇ、　Ｒｅｓ、）２２：２３１−２３６（１９７７）、ディジージス・オブ・コロン・アンド・レフタム（Ｄｉｓ　Ｃｏ１ｏｎ　Ｒｅｃｔｕｍ）２５　：　６４８−５１　（１９８２）　、ディジージス・オブ・：２０：／−アンド・レフタム（Ｄｉｓ　Ｃｏ１ｏｎ　Ｒｅｃｔｕｍ）１９　：　２３７−２４４　（１９７６）］。しかしながら、最近、ウィルスＤＮＡの可能な腫瘍性効果のため、もはや０原性ワクチンで患者を治療すべきでないということが提唱されている（ブンネイ（Ｂｕｎｎｅｙ）、１９８６、ブリティッシｘｌメディカル・ジャーナル（Ｂｒ、　ｌ１ｅｄ。

Ｊ、）２９３．１０４５−１０４７）。

遺伝子工学により作成されるワクチンの生産に関しては、この事項は、ツイスタ −［（Ｐｆｉｓｔｅｒ）　（１９９０）　、前掲コで考察されており、異なるパピローマウィルスタイプの体液過剰のため、効果的なワクチンを得るのが困難なようである。

しかしながら、ツイスタ−（Ｐｆｉｓｔｅｒ）は、いわゆる初期蛋白（すなわち、Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、ＥｌまたはＥ８）に注意が向けられるべきと指摘している。なぜならば、これらの蛋白は、上方表皮層で発現される構造蛋白とは対照的に、イボ感染の増殖する基底細胞で合成されるようである。従って、ツイスタ−（Ｐｆｉ、５ｔｅｒ）　（１９９０）によると、ウィルスキャプシド蛋白はワクチンにおける使用では限られているようである。真核細胞におけるパピローマウィルス初期蛋白についてのｉｎ　ｖｉｔｒｏテスト系での組換えワクシニアウィルスの使用もまたツイスタ−（Ｐｆｉｓｔｅｒ）　（１９９０）　Ｆ考察されている。これは、パピローマウィルス蛋白を発現する遺伝的に修飾したワクシニアウィルス、あるいはｉｎ　ｖｉｔｒ。

にてワクンニア組換体で感染させたまたは他の発現ベクターでトランスフェクトしたバラホルムアルデヒド固定自己由来細胞の表面で発現する遺伝的に修飾したワクシニアウィルスからなる生ワクチンの形態をとり得る。ツイスタ−（Ｐｆｉｓｔｅｒ）（１９９０）で考察されたワクチン開発についてのもう１つの戦略は、グリコシドＱｕｉｌ＾の免疫刺激複合体を用いるものである。

成功した予防ワクチン接種についてのデータは、ウシ線維乳頭腫のウシ線維乳頭腫ホモゲナイズしたホモジネートについてのみ存在し、それは限定的な免疫性を提供することが示されている（オルノン（Ｏｌｓｏｎ）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ベテリナリ・メディカル・アソーシエーション（Ｊ、＾■、　Ｙｅｔ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、）１３５．４９９　（１９５９）　、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　）　２２　４６３　（１９６２））。遺伝子工学的に作成したＬ１融合蛋白（ピラチンスキー（Ｐｉｌａｃｉｎｓｋｉ）ら、ＵＣＬＡシンポジウム、モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー呻ニューーシリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｃｌ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｎｅｗ　５ｅｒｔｅｓ）Ｖｏ１３２．パピローマ・ヴイルシズ・モレキュラー・アンド・クリニカル・アスベクツ（Ｐａｐｉｌｌｏｍａ　Ｖｉｒｕｓｅｓ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ａｐｅｃｔｓ）、アラン・アール・リス（Ａｌａｎ　ＲＬｉ５ｓ）ニューヨーク、１９８５．２５７）を含むワクチンもウシで使用されてきたが、ヒトでは成功しなかった（バルトホールド（Ｂａｒｔｈｏｌｄ）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ベテリナリ・メゾイカ／イアソーシエーション（Ｊ、　Ａｍ、　Ｙｅｔ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、　）　１６５．２７６．１９７４）。ツイスタ−（Ｐｆｉｓｔｅｒ）（１９９０）において、キャプシド蛋白ワクチンの使用によるＨＰＶ感染の可能な予防についての証拠は現在ないが、抗腫瘍細胞免疫性の誘導は可能なようであると述べられている。

ＬｌおよびＬ２遺伝子はパピローマウィルス感染の予防および治療用のワクチンならびに診断で用いる免疫原およびパピローマウィルスの検出の基礎であった（国際出願ＷＯ３６０５８１６およびＷＯ３３０３６２３）。しかしながら、これらのワクチンの商業的用法は行われていないようである。

発明の概要従って、本発明の目的は、診断剤ならびにパピローマウィルス感染で用いるワクチンの成分の形成で有用であり得るウィルス様粒子（ＬＶＰ）を提供することにある。

従って、１の態様において本発明は、（１）パピローマウィルスト１蛋白またはパピローマウィルスト１蛋白およびパピローマウィルスト２蛋白の組合せを各々コードする１種またはそれを超える組換えＤＮＡ分子を構築し；次いで（ｉｉ）ウィルス様粒子（Ｖ　Ｌ　Ｐ）が、ＬｌまたはＬｌおよびＬ２蛋白の組合せの発現の後に細胞内で生産されるように、該１種またはそれを超える組換えＤＮＡ分子で適当な宿主細胞をトランスフェクトする工程よりなるパピローマウィルス様粒子（ＶＬＰ）の生産方法を含む。

もう１つの態様において本発明は、適当なアジュバントと組み合わせたノくビローマウイルスＶＬＰを含有するワクチンを含む。

工程（ｉ）に関しては、いくらかのパピローマウィルスのＶＬＰを形成するのにパピローマウィルスト１蛋白のみ要する。適当には、ＢＶＰＩ、ＨＰＶｌｌおよびＨＰＶ６ｂを含めたＨＰＶ６のＶＬＰを形成するのに、Ｌ１蛋白のみが必要である。しかしながら、ＬｌおよびＬ２蛋白を共に含有するＢＶＰｌ、ＨＰＶｌｌまたはＨＰＶ６ｂに関しては、ＶＬＰが形成され得る。ＨＰＶＩ６のごとき他のパピローマウィルスのＶＬＰの形成には、ＬｌおよびＬ２蛋白が共に必要である。この状況は、ＨＰＶＩ６と同様の病理学的兆候および同様のＤＮＡ配列相同性を有するＨＰＶＩ８に適用できると考えられる。さらに、ＬｌおよびＬ２遺伝子は同一のＤＮＡ組換え分子または異なるＤＮＡ組換え分子に包含させ得ることが理解されるであろう。

好ましくは、組換えＤＮＡ分子は、宿主細胞をトランスフェクトし得る組換えウィルスに含有される。この目的で使用できる適当なウィルスは、バクロウィルス、ワクシニア、ンンドビスウイルス、ＳＶ４０、センダイウィルス、アデノウィルス、レトロウィルスまたはポックスウィルスを包含する。適当な宿主細胞は、前記ウィルスに適合する宿主を包含し、これらはスボドブテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のごとき昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、ＢＨＫ細胞、ヒト５Ｗ１３細胞、ショウジヨウバエ、アエデス・アルボピクタス（Ａｅｄｅｓ　ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来の力細胞またはサル上皮細胞を包含する。また、他の真核細胞は酵母細胞または他の哺乳動物細胞を含み得ることは認識されるであろう。

それにより、Ｌ１蛋白およびＬ２蛋白が、後記にて考察する適当に設計したプライマーを用いてＰＣＲ増幅によって増幅され得るパピローマウィルスゲノムの入手源から得られたＤＮＡ組換え分子が適当である。好ましくは、Ｌ１蛋白をコードする遺伝子を、適当なプロモーターを含有するプラスミドに挿入し、該Ｌ１蛋白およびプロモーターを含有するＤＮＡ断片を、組換えＤＮＡ分子を構成し得る一次ブラスミドに組み込み、これを前記したごとく組換えウィルスベクターに挿入できる。

Ｌ２蛋白をコードする遺伝子もまた適当なプロモーターに連結でき、好ましくは、Ｌ２遺伝子およびプロモーターを組み込んだＤＮＡ断片を一次ブラスミドに挿入して、二重組換えプラスミドまたは二次プラスミドが得られ、このプラスミドもまた前記したごとく組換えウィルスベクターに挿入して、二重組換えウィルスベクターが得られる。

しかしながら、また、本発明は、−次ブラスミドおよび／または二次プラスミドが適当な宿主細胞を感染させて、適当な実験条件下でＬ１蛋白を含有するＶＬＰまたはＬｌおよびＬ２蛋白を含有するＶＬＰが得られる具体例も含む。後者のＶＬＰは、Ｂ２蛋白が天然感染において免疫優性であるので、パピローマウィルス特異的ワクチンについて理想的な免疫原である。

他の適当なりＮＡ組換え分子はニスミドならびに組換えウィルスを包含する。

過当な発現系はイー・コリおＪびいずれかのプ→スミドもしくは：１スミド発現ベクターを含めた原核細胞発現系、あるいは組換えウィルスベクターと組み合わゼた前記宿主細胞またはＰｉ句細胞および酵母プラスニドを含めた真核細胞系を包含する。

■、１またはＬｌおよびＩ、２を共１．．：″Ｉ−ドする遺伝子を組み込んだプラスミドを用いる状況、およびかかるプラスミドがＶＬＰの生産のために適当な宿主を感染させ得る状況では、かかるプラスミドは＼７　ｉ−ｐ構造蛋白の発現を促進するための過当なプロモーターも含有１べきであり、また関連するプロモーター・と関係のあるポリメラーゼも利用し得る。しかし７ながら、この状況においては、ＶＬＰは特別の実験条件下で得られるにすぎない。

ＬｌおよびＬ２遺伝イは、哺乳動物またはウィルスのボリアダニ１戸−ションシグナルで、いずれの哺乳動物またはウィルスプロモーターもオフとし得る。好ましくは、ＬｌおよびＢ２遺伝子は、適当と考んられる初期プロモーターまたは後記プロモーターであり得るいずれのワクシニアウィルスプロモーターからも転写される。かかるプロモーターのリストは、ダビンオンおよびモス（Ｄａｖｉｓｉｏｎ　ａｎｄＭｏｓｓ）　（１９８９）　、ジャーナル・オフ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏｌ。

いる。

行った実験において、Ｌ１遺伝子はワクシニア４ｂプロモーターの下流に位置させ、Ｂ２遺伝子は合成ワクシニア２８に後期プロモーターの下流に位置させる。

宿主細胞はサル上皮細胞である。

ＶＬＰはいずれかの適当な精製手段によってトランスフェクトした細胞から得ることができる。ＶＬＰはＩ　ＳＣ０Ｍ、ミョウバン、フロイントの不完全もしくは完全アジュバント、Ｑｕｉｌ　Ａおよびパン七ロウ・ニス［（Ｙａｎｓｅｌｏｗ　Ｓ、　Ｘ　１９８７　）、例えばベテリナリ・ブレチン（Ｖｅｔ、　Ｂｕｌｌ、）５７　８８１　８９６］に記載されている他のサポニンもしくは他のアジュバントと組み合わせることができる。

添付図面に例示されている本発明の種々の好ましい具体例を参照されたし。これらの好ましい具体例では、特別のパピローマウィルス、ＶＬＰおよびＤＮＡ組換え分子の特別の構築は例として挙げられていることに注意すべきである。

図面の簡単な記載図１は、、ＢＰＶＩ６組換えワクシニアウィルスを構築するために用いるプラスミドの模式図である。

図２Ａは、ワクシニアウィルスで感染したＣＶ−１細胞における組換えＢＰＶＩ６　Ｌｌのサザーンプロット分析である。

図３は、組換えワクシニアウィルスで感染させたＣＶ−１細胞のノーザンプロット分析である。

図４Ａおよび４Ｂは、組換えワクシニアウィルスで感染させたＣＶ−１からのＨＰ　Ｖウィルス様粒子の電子顕微鏡写真である。

図５は、ＢＰＶＩ６の空のキャプシドのＣｓＣ１平衡密度勾配沈降を示す。

図６は、精製したウィルス粒子におけるＬ１蛋白のグリコジル化を示す。

図７は、ＬｌをコードするプラスミドｐＬｃ２００ならびにＬｌおよびＢ２をコードするｐＬｃ２０１の構築の流れ図である。

図８は、マウス血清のバクロウィルス組換えＬ１蛋白との反応性のウェスタンプロット分析である。

図９および１０は、合成ＨＰＶ１６キヤブシドで免疫したＢ　Ｌ　Ａ　Ｂ　／　ｃ　。

Ｃ５７Ｂ１／６およびＣＢＡマウスからの血清、ならびにプールしたＣＦＡ免疫化対照血清についてのマツピング結果を示す。

図１１およびＩＩＡは、ＢＰＶＩ６　Ｌ１分子の重複する一連のペプチドとの、Ｌｌに特異的な２つのＭＡｂの反応性を示す。

図１１．Ｂは、ＢＰＶＩ６　Ｌｌの抗原性指標の予測を示す。

図１２は、ＢＰＶＩ６　Ｌｌのエピトープマツプを示す。

図１３Ａは、免疫化で用いる合成ＨＰＶ１６　ＶＬＰを示す。

図１３Ｂは、ウェスタンプロットによる、抗ＨＰＶ１６　Ｂ２抗血清との、精製したＶＬＰの反応性を示す。

図１３Ｃは、ＢＰＶＩとの関係における組換えワクシニアウィルスを構築するのに用いるプラスミドを示す。

図１４Ａおよび１４Ｂは、野生型および組換えワクシニアウィルスで感染させたＣＶ−１細胞におけるＢＰＶＩ　ＬｌおよびＢ２発現の分析を示す。

図１５Ａおよび１５Ｂは、組換えワクシニアウィルスで感染させた細胞から得られたＢＰＶＩキャプシドの電子顕微鏡写真を示す。

実施例１：ＨＰＶ１６由来のＶＬＰＬＰ０１ＴＧからのＨＰＶ−１６Ｌｌ遺伝子（ｎｔ５６３７）を、以下のプライマーを用い、（エル・キスマン（Ｌ、　Ｇｉｓｓｍａｎｎ）によって提供された）　ｐ）（ｐｖ１６からのポリメラーゼ鎖反応によって増幅させた。

最初のメチオニンコドンおよび停止コドンは下線によって示し、Ｂｇ１１１部位はサブクローニングを容易にするために含ませた。増幅させた１５２７ｂｐ断片をフェノールで抽出し、１％アガロースゲル電気泳動によりて精製した。

旦ｌ工目での由化の後、Ｌ１遺伝子を、強力なワクシニアウィルスプロモーター（４，ｂ）を含有するＰＫ１９プラスミド（ケント（Ｗｅｎｔ）、１９８８、Ｐｈ、Ｄ論文、ケンブリソノ大学）のＢａｍ８１部位にサブクローンした。得られたプラスミドを配列決定しくサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、１９７７、プロンーデイングズ。

オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＬＩＳＡ　７４．５４６３　５４６７）、Ｍａｕｌおよび５ｓｔｌで＋７）消化によって、４ｂプロモーターに連結したＢＰＶＩ６　Ｌｌ遺伝子を含有する断片を調製するのに使用した。この断片をＴ４　ＤＮ、Ａポリメラーゼで平滑末端化し、ワクシニアウィルスのＢ２４Ｒ遺伝子（コソトワルおよびモス（Ｘｏｔｗａｌ　ａｎｄ　１ｉｏｓｓ）、１９８９、ジャーナル・オフ・バイｏｏノー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　）６３．６００−６０６；スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、１９８９、ジャーナル・オフ・ジェネラル・パイロロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）７０．２３３３−２３４３）　、イー・コリｌ？ −工遺伝子（ファルクナーおよびモス（Ｆａｌｋｎｅｒ　ａｎｄ　１ｌｏｓｓ）、１９８８、ジャーナル・オフ・パイロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　）　６４．１８４９−１８５４　：ボイルおよびクバール（Ｂｏｙｌｅａｎｄ　Ｃｏｕｐａｒ）、１９８８、ジーン（Ｇｅｎｅ）　６５．１２３−１２８）およびプラスミドｐＬｃ２００を生産するための多重クローニング部位を含有する、ワクシニ（４１３８ｎｔ−５６６８ｎｔ）を得、これをフレノウで満たし、合成りａｍＨ１リンカ−に連結することによって調製した。このＢ２断片を、合成ワクシニア２８に後期プロモーターを有するｐ４８０なるプラスミドに由来し、いくらか修飾した（デイビノンおよびモス（Ｄａｖｉｓｏｎ　ａｎｄ　Ｍｏ５ｓ）、ジャーナル・オフ・モレキュラー・バイオロン−（Ｊ、　１ｌｏ１．　Ｂｉｏｌ、）２１０．７７１−７８４）の旦互三ＨＩ部位にクローンした。プロモーターの配列は以下の通りである。

５ｌ−ＧＡＧＣＴＣＴＴ’Ｍ’ＴＴＴＴＴ似幣ＴＴＴＩＴＴ′ＴＴＴＴＧＧＣＡＴＡ！ΔΔ八工ＧＧＡＧＧＴＡＣＣＣ−３１へ期プロモーターのモチーフには下線を施した。２８にプロモーターに連結したＢ２遺伝子を含有する断片をＳｓ± Ｔ／５ａｌｌでの消化によって単離し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端化し、次いで、ｐＬｃ２００の５ｓｔｌおよび５ａｉ１部位にクローンしてｐＬｃ２０１を得た（図１）。

図１において、ＢＰＶＩ６　Ｌｌ、Ｂ２（中空の箱形）はワクシニア４ｂプロモーター（塗り潰した箱形）の制御下にある。イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ｇ＋）工遺伝子（陰影を付けた箱形）は選択マーカーとして用いる。同種組換えのためのフランキング配列。転写の方向は矢印で示す。

次いで、ｐＬｃ２０１プラスミドを用いて、従前に記載されているごとくに（マケット（Ｍａｃｋｅｔｔ）呟１９８４、ジャーナル・オフ・パイロロジー（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、　）、４９．８５７−８６４）組換えワクシニアウィルスを構築した。ミコフェノール酸、キサンチン、およびヒボキサンチンの存在下、プラークアッセイによって、組換えウィルスｐＬＣ２０１ＶＶおよびｐＬＣ２０２ｖ■を選択した（ファルクナーおよびモス（Ｆａｌｋｎｅｒ　ａｎｄ　ｌ［ｏｓｓ）、１．９８８）、ＨＰＶＩ６１．１、ＨＰＶ１６Ｌ２を発現する組換えワクシニアウィルス（ＶＶ）を調製し、従前に記載されているごと（に用いプニ（ゾウ（Ｚｈｏｕ）ら、１９９０、ジャーナル・オフ・ジェネラル・バイオロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｔｒｏｌ、）、８１．２ｉ８５−２１９０）。

組換えプラスミドｐＬｃ２０１は、１９９２年３月２７日に、米国、マジソン州２０８５２、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉ　１１ｅ）、バークローン・ドライブ（ＰａｒｋｌａｖｎＤｒｉｖｅ）　１２３０１番地、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託し、受託番号７５２２６が付与された。

組換えワクシニアウィルスｐＬｃ２０１ＶＶは、１９９２年４月３日に、米国、マジソン州２０８５２、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、バークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｖｎ　Ｄｒｉｖｅ）　１２３０１番地、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託し、受託番号ＶＲ２３７１が付与された。

ウィルス様粒子の精製組換えウィルスｐＬｃ２０１ＶＶで感染させたＣＶ−１細胞を、感染後３２時間に、１０ｍＭトリス（ｐＨ９，０）中に収穫し、ダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）のホモジナイズーでホモジナイズした。ホモジナイズ物を２０００ｇでの遠心によって清澄化して、細胞夾雑物を除去し、３０％（ｖｔ／ｖｏｌ）ショ糖クッションに重ねた。

５Ｗ３８０−ター中、１１０，０００ｇにての９０分間遠心によって形成されたペレットを１０ｍＭトリス、ｐＨ９，０に懸濁し、２０−６０％不連続ショ糖勾配に重ねた。１００，０００ｇでの１８時間の遠心の後、０．２５ｍ１の１０の同１２０００ｇでの２０分間の遠心の後に得られたペレットをさらに分析のために収集した。ウィルス様粒子の密度を測定するため、平衡密度勾配沈降をＣｓＣ１（１，３０ｇ／ｍｌ）で行った。１２５，０００Ｘｇでの２０時間の遠心の後、０．２５ｍ１の１１の画分を収集した。各画分の密度を測定し、各々を透過型電子顕微鏡によってウィルス様粒子につき調べた。

図２Ａにおいて、細胞を、ｗｔ　ＶＶ　（Ｌｌ−ン１）およびｐＬｃ２０１ＶＶ（レーン２）で、１０ｐｆｕ／細胞にて感染させ、感染４８時間後に収穫した。

Ｌ１蛋白はＨＰＶＩ（３ＬＩ特異的ＭＡｂ　Ｃａｔ＋＋＋ｊｒ　１で検出した。

５７ｋＤａＬｌ蛋白は矢印によって示す。すべての３つのレーンにおける、Ｃａｍｖｊｒ　１の該３５　ｋ、　Ｄ　ａ蛋白への結合は非特異的である。

図３においで、ＨＰＶ蛋白Ｅ］およびＥ４をコードする遺伝子ならびにＨＰＶＩ６　ＬｌおよびＬ２をコードする遺伝子を組み込んだｐＬＣ２０１ＶＶ　（レーン２）　、ｐＬｃ２０２ＶＶ　（レーア３）またはｗｔ　ＶＶ　（レ−：／４）　でＩＢ染させた細胞から抽出したＲＮＡを１．２％ホルムアルデヒド−アガロ −・スゲル上で解像した。ＲＮＡをナイロン膜に移し、ｓ！Ｐ−標識化Ｌ２プローブとハイブリダイズさせた。ホルムアルデヒド−処理したラムダＤＮＡ−Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ切断マーカーを示す（レーン１）。

ナトリウム緩衝液中の３に（ｖｏｌ／ｖｏ／）グルタルアルデヒドで固定し、１％四酸化オスミウムで後固定し、グレード物のアルコールで脱水し、エポキシ樹脂に埋め込んだ。薄い切片を切り出し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。シ薯糖勾配からの両分をＥＭダグリッド上乾燥し、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）リンタングステン酸（ｐＨ７，０）で染色した。ＪＥＯＬ　１２００Ｅｘ透過型電子顕微鏡を用い、両分を調べた。

図４八では、ｐＬｃ２０１ＶＶで３２時間にて感染させたＣＶ−１細胞を示す。

ｃｖ−１核において、はぼ４０ｎｍ直径の粒子（矢印）が頻繁に見い出された。

棒線は１１００ｎに対応する。

図４Ｂでは、ショ糖勾配の画分５を示す。見た所、キャップソメアの規則的な配列からなるパピローマウィルス様粒子が観察された（矢印）。棒線は５０ｎｍに対応する。

ＨＰＶ　ＯＲＦ産物＋７）分析ＨＰＶＩ６　Ｌｌの発現は免疫沈降およびイムノプロットによって分析した。

免疫沈降については、３ｓＳで代謝的に標識した組換えｖＶ感染ＣＶ−１細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液０．１％ＳＤＳ、１％トリトンＸ−１００，１％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５μｇ／ｍｌアプロチニン、１０ｍＭトリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，４中で溶解させた。Ｌ１特異的ＭＡｂ　Ｃａ＋＋ｖｉｒ　１　（？クリーン（ｌｌｃｌｅａｎ）ら、１９９０、ジャーナル・オフ・クリニカル・バソロジ−（Ｊ、　Ｃｈｉｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、））および１２６Ｉ抗−マウスＩｇＧ（アメルスハム（＾ｍｅｒｓｈａｍ））を用いる、部分的に精製したウィルス様粒子のイムノプロット分析を、２−メルカプトエタノールを含有する２ＸＳＤＳゲル負荷緩衝液に可溶化した試料を用いて、従前に記載されているごとくに行った。ＨＰＶＩ６　Ｌ２遺伝子発現の分析は１Ｍ１３Ｂに示す。Ｎ−グリコリル化の分析については、部分的に精製したウィルス様粒子を１０（ｂｌｌの緩衝液（０，２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐｌ−Ｔ６．０１２０ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ２−メルカプトエタノール）まで採り、イムノブロッティングに先立って、３７℃で０．５ｕのＥｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ　（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ））と１８時間反応させた。

ミコフェノール酸を用いて、ｇｐｔプラスミドｐＬｃ２０１につきワクシニアウィルス組換体を選択し、これをｐＬｃ２０１ＶＶと命名した。ｐＬｃ２０１ＶＶで感染させた細胞中でのＬｌの合成は、イムノブロッティングおよび免疫沈降によって確認した。Ｌ１蛋白はほぼ５７に、Ｄａのオートラジオグラフィーでのバンドとして示された。これらの組換えウィルスで感染させたＣＶ−１細胞から抽出したＲＮＡのノーザンブロントにより、これらのウィルスいずれで感染させた細胞におけるＬ２　ｍＲ，ＮＡ転写の高レベルが確認された（図３）。合成ワクシニアウィルス後期プロモーターからのＬ２の転写により、異種ノーザンブロットのパターンが得られた。何故ならば、ｖ■後期ＲＮＡは特異的転写終止シグナルを使用しないからである。

ｃｖ−１細胞をｐＬｃ２０１ＶＶで感染させ、ウィルス様粒子について調べた。

ｐＬｃ２０１Ｖ”ｖ’で感染させた細胞の薄い断面の電子顕微鏡写真は細胞核でほぼ４０ｎｍのウィルス様粒子を示したが、野生型ワクシニアのみで感染させた対照細胞は示さなかった。はとんどの場合、これらの粒子は、核膜の近（で、鎖で連結されていた（図４ａ）。ＨＰＶＩ６　Ｌｌのみ、またはＬ２のみを発現し、対応する蛋白（Ｌｌ）またはｍＲＮＡ　（Ｌ２）を産生じた組換えワクシニアウィルスで感染させた細胞は、ウィルス様粒子を含有していなかった。同時に２つの異なる組換えワクシニアウィルス（これは、各々、ＨＰＶＩ６　’ＬＬおよびＨＰＶＩ６　Ｌ２を発現した）で感染させた細胞は、いずれのＨＰＶウィルス様粒子粒子製しなかった：Ｌ１蛋白およびＬ２ｍ、ＲＮＡはこれらの二重感染細胞のプールで同定できなかったが、個々の細胞内でのＬｌおよびＬ２双方の同時合成は示されなかった。

図５において、ｐＬｃ２０１ＶＶで感染させたＣＶ−１細胞から得られた５つのＨＰＶＩ、６ウイルス様粒子をンヨ糖りッション上で遠心し、次いで、ＣｓＣ１等密度沈降に付した。ウィルス様粒子（＋）は画分８および９に見い出された。

画分８からのネガティブ染色した粒子の透過型電子顕微鏡写真はインサート中に示される。各の勾配画分の密度（ｇ／ｍｌ）が示される。

図６において、ｃｖ−１細胞を３２時間でＩ）ＬＣ２０１ＶＶで感染させ、ウィルス様粒子をショ糖勾配で精製した。試料をエタノールで沈殿させ、−昼夜のエンドグリコンダーゼＦでの処理の後におｊブる抗−ＨＰＶＩ６　Ｌｌ抗体Ｃａｍｖｉｒ１、レーン１．精製したウィルス様粒子、Ｌｌ−ン２および３：でのイムノブロッティングによって分析前にエンドグリコノダーゼＦで処理した。Ｌ１ダブレットは（＝）によって示し、脱グリコノル化Ｌｌは矢印によって示す。分子量マーカーは左側に示す。

電子顕微鏡によって観察されたウィルス様粒子がＨＰＶＩ６　Ｌｌ蛋白を含有することを確認するために、ｐＬｃ２０１ＶＶ［染細胞からの細胞抽出物を２０％ −６０％ショ糖勾配中での部分的精製に付した。１０の両分を収集し、Ｌ１蛋白について調べた。画分３ないし７から、Ｌｌは検出することができ、画分５では、最高レベルのＬｌが見い出された。各画分をウィルス様粒子についてＥＭによって論べ、これらは画分５で観察された。リンタングステン酸ナトリウムでネガティブ染色した典型的なパピローマウィルスは、７２の規則的な密に詰められたキャップソメア（フィンチおよびフルーグ（Ｆｉｎｃｈ　ａｎｄ　Ｋｌｕｇ）、１９６５、ジャーナル・オフ・モレキュラー・バイオロジーＣＪ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、）１３．１−１２；ロウノンおよびマービイ（Ｒｏｖｓｏｎ　ａｎｄ　１ｌａｈｙ）、１９６７、バクチリオル・レブ（ＪｌａｃｔｅｒｉｏＬ、　Ｒｅｖ、　）　３１，１１０−４３１）を有し、直径約５　Ｑ　ｎ　ｍを有する。

感染したＣＶ−１１ｉ１胞から精製したウィルス様粒子の直径は３５ｎｍと４０ｎｍとの間で変化した。しかしながら、これらのウィルス様粒子はパピローマウィルスと同様のＥＭ外観を有し、キャップソメアの規則的配列が認められた（図４ｂ）。

従って、ンヨ糖勾配の画分５で同定されたウィルス様粒子は空であって、ＨＰ　Ｖキャップソメアの正しくない会合配列であると推定された。ＣｓＣ１において、ＨＰＶｌ、６ウイルス様粒子は約１．３１ｇ／ｍｌ　（図５）で沈降し、透過型電子顕微鏡下で典型的な空のパピローマウイルスキャップンドの外観を示した（図５、インサート）。

ｐＬｃ２０１ＶＶ感染ＣＶ−１細胞から精製したウィルス様粒子のウェスタンプロットにおいてＣａｍｖｉｒ　１は蛋白ダブレットと同定された（図６）。ＨＰＬＩ６　Ｌｌは４つの可能なＮ−グリコノル化部位を含有する（アスパラギン１５７．２４２．３６７および４２１）。該ダブレットがＬ１ポリペプチドのグリフンル化変異体を表すか否かをテストするために、部分的に精製したウィルス様粒子を、ＤＳＤ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングに先立ち、エンドグリコシダーゼＦでの処理に付した。この結果、約５７ｋＤａの予期される分子量にて、わずかに低い見掛分子量の単一のバンドによって該ダブレットが置き換えられた（図６、レーン２．３）。

１．２９−１．３０ｇ／ｍｌの浮遊密度を持つＣｓＣ１勾配の画分から収集したウィルス様粒子を、エライヤ法アッセイにおいて抗原として用いた。ＶＬＰで免疫したマウスからのすべての抗血清は陽性であった（表２）。野生型ワクシニアで感染させたＣＶ−１細胞の溶解物で調製した密度勾配の同様の画分て免疫したマウスからの対照血清はウィルス様粒子と非反応性であった。ウィルス様粒子をエライヤ法プレートにコートするための２つの異なるプロトコル（ディルナ−（Ｄｉｌｌｎｅｒ）ら、１９９１、ジャーナル・オフ・バイｏｏジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）１互、６８６２−６８７１）を用い、天然ＨＰＶウィルス様粒子粒子反応性を、破壊した粒子の部分的変性蛋白との反応性と区別する試みを行った。

ＶＬＰに対して生起したマウス抗血清は天然（ＯＤ　１．ＯＯ＋０．２０）および変性（ＯＤｌ、６０±０．４．５）粒子と同等に反応性であった。はっきりとしたＬｌエピトープに特異的な６のモノクロ−＝大ル抗体のパネルは、天然ＶＬＰと弱い反応性（ＯＤ　０．０６４）のただ１つ（Ｃａｍｖｉｒ　１）を包含し、天然粒子とよりも変性粒子（ＯＤ　０．１．０７）とより反応性であることが判明し、これは、該反応性は天然Ｖｌ、Ｐ調製中の父性Ｌ１蛋白とのものであることを示唆する。

図８において、、Ｈａｉ−標識抗−マウスＩｇＧを第２抗体として使用した。

５７−ｋＤａＬ１バンドは矢印によって示す。解説：ＶＬＰで免疫した個々のマウスからの血清、レーン１−５、ＢＡＬＢ／ｃ　；レーン６−１０．Ｃ５７Ｂ１／６、レーン１１−１．５、ＢＩＯＡ；ＣＦＡで免疫した個々のマウスからの血清；レーン１６、ＢＡＬＢ／Ｃ；レーン１７、Ｃ５７Ｂ１／６；レーン１８、ＢＩＯＡ：抗−ＨＰＶ　１６ＬＩＭＡｂ　Ｃａｍｖｉｒ　１、レーン１９゜分子量は左側に示す。

ＨＰＶｌ６のＬｌおよびＬ２蛋白との抗−ＶＬＰ抗血清の反応性は、バクロウィルス組換えＨＰＶｌ６　ＬｌおよびＬ２蛋白を用いるイムノプロットにより確認した。ウィルス様粒子で免疫したすべてのマウスからの血清、およびモノクローナル抗−ＨＰＶ１６　Ｌｌ抗体の各々は、Ｌｌ組換え一バクロウィルスー感染のニス・フルギペルダ（Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞溶解物で５７−ｋＤａ蛋白を認識しく図８）、野生型バクロウィルスで感染させたニス・フルネギベルダ（Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞の溶解物では匹敵する反応性は同等観察されなかった。Ｌ１蛋白との反応性の強度はマウス間で変動したが、すべての血清はイムノプロットの長い暴露と反応性であった。同様の結果がＬ２組換え一バクロウィルスー感染細胞溶解物で得られ：マウス抗−ＶＬＰ抗血清およびＬ２蛋白に対するウサギ抗血清は共に溶解物中の単一の蛋白と反応した。ＣＦＡ単独で免疫したマウスからの血清は、ＬｌまたはＬ２組換え一バクロウィルスー感染ニス・フルギベルダ（Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の溶解物からの蛋白と反応しなかった。

実施例２：ＨＰＶｌ６　Ｌｌの線状抗原性領域の明確化ＶＬＰを用いる蛋白さらなる一連の実験において、合成ＶＬＰを用いたＨＰＶｌ６　Ｌｌキャプシド蛋白の線状抗原性領域を決定した。かかる実験において、３つのハブロタイブ（Ｈ−２’、Ｈ−２１′、お、ｌ：びＨ−２’／’）（Ｄマウ７．を、ＨＰＶｌ６のＬｌおよびＬ２蛋白についてのワクシニアウイルス二重組換え体用いて生産した、合成ＨＰＶ１６ウイルス様粒子（ＶＬＰ）で免疫した。得られた抗−ＶＬＰ抗血清は、エライヤ法アッセイによるとＨＰＶＩ６キヤプシドを、イムノプロットではバクロウィルス組換えＨＰＶｌ６　ＬｌおよびＬ２蛋白を認識した。ＨＰＶｌ６　Ｌｌアミノ酸配列に対応する重複ペプチドを用いて、Ｌ１蛋白の免疫反応性領域を明確化させた。大部分のＬ１ペプチドは、合成ＨＰＶＩ、６キヤブシドで免疫したマウスからのＩｇＧと反応性であった。コンピューターアルゴリズムにより、ＨＰＶｌ６　Ｌｌには７つのＢエピトープがあり、このうち５つはマウス抗血清と強力に反応するペプチド内に存在すると予測された。マウス抗−ＶＬＰ抗血清は、組換えＬ１融合蛋白に対する他の物によって生起された抗−ＨＰＶｌ６　Ｌｌモノクローナル抗体によって認識された２つのペプチドと反応しなかった。本発明者らは、ウィルス様粒子を用いて明確化させたＨＰＶｌ６の免疫反応性エピトープは、組換えＨＰＶｌ６　Ｌｌ融合蛋白を用いて明確化させたものと有意に異なると結論したが、これは、かかる融合蛋白はＨＰＶ−感染患者におけるＨＰＶ１６Ｌ１特異的免疫応答を捜し出すための抗原とはなり得ないであろうことを意味する。

ＨＰＶ１６キヤブンドの生産ワクシニアウィルスプロモーター４ｂ（天然）およびｐ４８０　（合成）の制御下にあるＨＰＶｌ６　ＬｌおよびＬ２オーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するプラスミドｐＬｃ２０１を用いて、後記することを除き従前に記載されているごとくに、組換えワクシニアウィルス（ｒＶＶ）Ｉ）ＬＣ２０１ＶＶを構築した。ＨＰＶ１６ウイルス様粒子は、従前に言及されているごとくにｐＬＣ２ＱＩＶＶ−感染ＣＶ−３．細胞から調製したが、ワクシニアウィルスの集合および成熟を妨げるために、１００μｇ／ｍｌにてリファンピシンを含有する培地で細胞を培養した（モス（Ｍｏｓｓ）、「パイロｏジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）Ｊ、６８５−７０３頁、ラベン（Ｒａｖｅｎ）、ニューヨーク、１９８５　；カラコスタス（Ｋａｒａｃｏｓｔａｓ）ら、ＰＮＡＳ８６．８９６４−８９６７．１９８９）。感染した細胞を収穫し、凍結し、１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９，０）中のダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモゲナイズ化により解凍することによって溶解した。溶解物を２０００ｇでの遠心によって清澄化し、次いで、ＰＢＳ緩衝液中の２０％ンヨ糖クッりヨン上、１０００００ｇにて２時間回転させた。ベレットをＣｓＣ１と混合して１．３０ｇ／ｍｌの初期密度とし、〕８６にて、１００００ｇで１８時間遠心した。画分を収集し、エタノール沈殿させた蛋白でイムノプロットを行った。Ｌ１蛋白に陽性につきテストする画分をプールし、前記したごとき電子顕微鏡によってウィルス様粒子の存在が確認された。

抗血清の生産５匹のマウスＢＡＬＢ／ｃ　（Ｈ−２’）　、Ｃ５７Ｂ１／６　（Ｈ−２つ、およびＢ　１０Ａ　（Ｈ−２”’）の群を、ＣｓＣｌ勾配精製したＨＰＶ１６ウイルス様粒子で免疫した。皮下注射によって５μｇのキャプシド蛋白で動物を接種した。最初の注射はフロイントの完全アジュバントと共に投与し、３週間間隔にて３つのさらなる注射は生理食塩水中にて投与した。第４の注射後１４日目に、血清を収集し、−２０°で貯蔵した。野生型ワクシニアウィルスで感染させたｃｖ−１μ胞から調製し、ｐＬｃ２０１ＶＶｇｍ細胞についてと正確に同じに加工した物賀を用いて同一のプロトコルに従ってマウスの対照群を免疫した。

ペプチド５つの残基だけ重複し、ＨＰＶｌ６　Ｌｌ蛋白の推定されるアミノ酸配列にわたる一連の１５量体（シードルフ（Ｓｅｅｄｏｒｆ）ら、１９８５、パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１４旦　１８１−１８５：パルトン（Ｐａｒｔｏｎ）、１９９０、ヌクレイツク・アンズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｃｌｓ　Ｒｅｓ、　）　１８　３６３　）を、標準的なプロトコルによるＦｍｏｃ化学（フィールズおよびノーベル（Ｆｉｅｌｄｓ　ａｎｄ　Ｎｏｂｌｅ）、１９９０、インターナショナル・ジャーナル・オフ・ペブタイド・アンド・プロティン・リサーチ（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、）、３５　１６１−２１４）を用い、デュポン社製のＲａＭＰＳ多重ペプチド合成システムで合成し、次いで、グルタルアルデヒドでウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に連結した。Ｌ１蛋白におけるアミノ酸（ａ　ａ）の位置を調べるために、推定される第１の開始コドンをアミノ酸番号１とした（表１）。技術的な理由により、ａａ５２１−５３１に対応するＣ−末端ペプチドを使用しなかった。用いたすべてのペプチドは、Ｉ（Ｐ　Ｌ　Ｏ分析で判断して、８５％純度を超えるものであった。

組換えＬ　１．　＋　Ｌ　２蛋白ＨＰＣ１６Ｌ１またはＨＰＶ］、６Ｌ２　０ＲＦを発現する組換えバクロウィルスを用いて昆虫ＳＦ９細胞を感染させた。２５６での３日間のインキュベージ９ンの後、１４０００ｇにお１する５分間の遠心によって細胞をベレット化した。

該ベレットをＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，６；　２ｍＭＥＤＴＡ；５０ｍＭ　ＮａＣｌ；１％デオキシコレート；１％トリトンＸ−１００；０．２５％ＳＤＳ　：　１％アプロチニン；　１．ｍＭ　ＰＭＳＦ）に溶解した。

ウェスタンプロットウィルス様蛋白または組換えＬｌもしくはＬ２蛋白を、２％ＳＤＳ／ＤＴＴを含有する２×負荷緩衝液と混合し、５分間沸騰させた。蛋白を１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースフィルターにプロットした（トウビン（Ｔｗｏｂｉｎ）ら、１９７９、バイｏｏジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　］、ヱ５　１−９）。フィルターを切片に切断し、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡにて、３７６で１時間インキュベートした。ブロックした切片を種々のマウス抗血清（１：２００）またはモノクローナル抗体に４６で一昼夜暴露した。反応性蛋白を、＋２５■ 一連結抗一マウスＩｇＧ（０，２μＣｉ／ｍ１）（アメルスハム（＾ｍｅｒｓｈａｍ））との反応の後にオートラジオグラフィーによって可視化した。

エライザアッセイ従前に記載されているごとくに（クリステンセンＣＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）ら、１９９０゜リフローナル抗血清を合成ＨＰＶ１６キヤブンドとの反応性についてテストした。

「生の」合成ＨＰＶ１６キヤブシドでのアッセイにつき、ＰＢＳ　（ｐＨ７，５）中の１１００ｎの蛋白を、３７″での１時間のインキュベーンコンによって各エライザプレート・ウェル（７０つ・ラブダ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ））に付着させた。「変性した」粒子についてのアッセイでは、該粒子を炭酸塩緩衝液ｐＨ９，６に懸濁し、３７ｅにて一昼夜プレートに吸着させた。すべての引き続いてのインキュベーンコン（謔室温で行った。該プレートをＰＢＳで洗浄し２．非付着部位をブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の５％ミクル粉、ｐＨ７，５）中の１時間のインキュベーションによってブロックした。予め野生型ｖＶ−感染ＣＶ−１細胞抽出物で吸着させたマウス抗血清（１：　２００）を添加し、１時間インキュベートし、該プレートをＰＢＳで洗浄させた。ブロッキングＭ衝液中の１　：　１０００希釈のホースラディツシュペルオキシダーゼ一連結抗−マウスＩｇＧ（シグマ（Ｓｉｇ＋＋ａ））を添加し、１時間インキュベートし、続いてＰＢＳで１０回洗浄した。ＡＢＴＳ　（ベーリンガ−（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））およびＨ！　Ｏ！を含有する基質緩衝液（ｐＨ４，６）を添加し、１５分後にＯＤ　４１５で読み取った。

線状Ｂエピトープのマツピングエライヤ法によって、重複するＨＰＶ１６　Ｌ１ペプチドの組に対して免疫化した動物からの抗血清をスクリーニングすることによってＢエピトープを同定した。ＢＳＡにカップリングさせた合成ペプチドを１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，３）に希釈し、４ｅで一昼夜エライザ法プレートに吸着させた。ＰＢＳ中の３％ＢＳＡを用い、プレート上の残存する結合部位のブロッキングを３７゜で２時間行った。希釈したマウス抗血清（１：５００）を室温にて２時間、被覆されたプレートとともにインキュベートした。該プレートを、ツイーン（Ｔｖｅｅｎ）２０（０，１％）を含有するＰＢＳで洗浄し、ペルオキシダーゼ一連結抗 −マウスＩ　ｇＧ　（１：　１０００）（ングｖ　（Ｓｉｇｍａ））またはＩ　ｇＡ　（１：　２０００）（シグマ（Ｓｉｇ＋ａａ））とともに２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、４１５ｎｍで吸光度値を記録する前に、基質緩衝液（ｐＨ４，６）中の０．５ｍｇ／ｍ１ＡＢＴｓで１５分間展開した。テスト血清での０Ｄ４１５値が対照血清についての平均値を超えて３ＳＤよりも大きければ、ペプチドは反応性と考えられ；これは、０２６０のカットオフ値を与えた。対照血清で得られた平均０Ｄ４１５（０，５５）の５倍の０Ｄ４１５は、主要な反応性エピトープを定義すると考えられた。

ＨＰＶ１６Ｌ１融合蛋白に対して生起した５種のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を用いた。ＭＡｂ　５Ａ４、ＩＤ６．３Ｄ１、および８Ｃ４（ケイ７　ン（Ｃａｓｏｎ）ら、１９８９、ジャーナル・オフ・ジェネラル・パイロロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）７０　１２９７６−２９８７）は英国ロンドンのフィル・シェフアート（ＰｈｉｌＳｈｅｐｈｅｒｄ）博士から提供され、ＭＡｂ　Ｃａｍｂｉｒ　１　（７クリーン（１１ｃＬｅａｎ）ら、１９９０、ジャーナル・オフ・クリニカル・バソロジ−（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、）４３４８８−４９２）はシイ−７クリーン（Ｃ，ＭｃＬｅａｎ）博士（ケンブリッジ大学、病理学部）から入手した。ＨＰＶ１６　Ｌ２−Ｔｒｐ−Ｅ融合蛋白に対するウサギ抗血清はデニゼ・ガロウェイ（Ｄｅｎｉｓｅ　Ｇａ１ｌｏｖａｙ）博士（ワシントン大学、ンアトル）から提供された。

アミノ酸配列分析および抗原性指標の予測抗原性指標（ＡＩＸジェイムスンおよびウエルフ（Ｊａｍｅｓｏｎ　ａｎｄ　Ｗｏｌｆ）、１９８８、コンブ・アブル・バイオサイ（Ｃａｍｐ、＾ｐｐ１．　Ｂｉｏｓｃｉ、）４　１８１　１８６）は、ペプチド配列が抗原性である確率の測定である。それは、二次構造のいくつかの重みを付けた測定を合計することによって計算される。予測されるＨＰＶ１６Ｌ１配列についての値は、ＰＬＯＴＳＴＲＵＣＴＵｌ？Ｅソフトウェアを用いて計算される。

図９および１０において、ＨＰＶ１６　Ｌｌの配列に対応する一連の重複ペプチドとのエライヤ法における血清の反応性（ＯＤ４１５）が示される。ＨＰＶ１６Ｌ１配列（表１）に対応するペプチド数を示す。

図１１およびＩＩＡにおいて、アミノ酸についてのナンバリングシステムは第１の推定開始コドンからのＨＰＶ１６　Ｌｌに対応する。１．５を超えるＡＩ値の領域が示される。

図１２において、その中にＢエピトープがマツピングシステムの範囲にあることが示されるＨＰＶ１６　Ｌｌの領域を示す。ＶＬＰ（粒子）で免疫したマウスからの血清での結果、および頚部癌を持つヒトからの血清中のＩｇＡおよびｒｇＧ抗体（ヒトＩｇＡおよびヒトＴｇＧ）（ディルナ＝（Ｄｉｌｌｎｅｒ）ら、１９９０、インターナショナノいジャーナル・オフ・キャンサー（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）４５　５２９−５３５）での結果は、重複するペプチドを用いて得られた。ＯＤが１５５を超えた場合、マウス抗ＶＬＰ抗血清はペプチドと有意に反応性が保持された。

Ｌ１融合蛋白で免疫したウサギ（ウサギ血清）（ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）ら、１９９０、ジャーナル・オフ・ジョネラノいパイロロジ−（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）ヱ１２７０９−２７１７）からの結果をプロットする。これらは、一連の部分長発現クローンを用いて決定し、その中にエピトープがある配列の全長を示す。また、アルゴリズムで予測されるＢエピトープ（コンピューター）（ジエイムノンおよびウォルフ（Ｈａｍｅｓｏｎ　ａｎｄ　Ｗｏｌｆ）、コンブ・アブル・バイオサイ（Ｃｏｍｐ、＾ｐｐｌ。

Ｂｉｃｓｃｉ、）４　１．８１　１８６．１９８８）および公表されている抗− ＨＰＶ１６Ｌ１モノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ）　（ケイノン（Ｃａｓｏｎ）ら、ジャーナル・オフ・ジェネラル・バイａａジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）７０　２９７３−２９８７：マクリーン（ＭｃＬｅａｎ）ら、ジャーナル・オフ・クリニカル・パソロジー（Ｊ、　Ｃ１１ｎ。

Ｐａｔｈｏｌ、）４３　４８８−４９２．１９９０）によって認識されるエピトープを示す。スケールは、５３］、ａａ　Ｌｌ蛋白に沿ったエピトープの位置を示し、Ｎ−末端メチオニン（残基１）からナンバー付けする。ペプチドを含有する各エピトープについては、Ｎ−末端メチオニンに対する正確な位置も示す。

５つのａａの重複で蛋白の全長をカバーする、ＨＰＶ１６　Ｌｌ蛋白の一連の１５量体合成ペプチドを用いて、種々の免疫血清によって認識されるＬｌ中のエピトープを明確化させた。３つのテストした近交系マウス株からの１６の抗血清の各々。ＢＡＬＢ／ｃ　（Ｈ−２’）　、Ｃ５７Ｂ１／６　（Ｈ−２”）　、およびＢＩＯＡ　（Ｈ−２”’）　は、Ｌ１蛋白の多重線状ペプチドを認識し、ＨＰＶ１６Ｌ１からの実質的に同一のペプチドはすべてのテスト株によって認識された（図１０）。５つの個々の血清は各株からテストした。血清でのＯＤが平均値十陰性対照血清のＯＤの３ＳＤより大きいと、ペプチドを反応性とし：これは、０．２６０の反応性についてのカットオフを与えた。ＣＦＡ単独で免疫したマウスからの血清は、すべてのＬｌペプチドでの０．２８０未満の０Ｄ４１５反応性を有していた。いくらかの変動が、所与の株からの各抗−ＶＬＰ血清の各ペプチドとの反応性の強度で観察されたが、各ペプチドはマウスの各株からの抗−ＶＬＰ血清のすべてと反応性であるか（ＯＤ＞０．２６０）　、いずれとも反応性ではなかった。抗−ＶＬＰ血清中のペプチド特異的抗体のイソタイプはＩｇＧおよびＩｇＡ特異的抗−マウス免疫グロブリン抗体を用いて調べた。ＩｇＧ応答は示す通りであり（図９および１０）、有意なＩｇＡ反応性はいすべれのペプチドに対しても検出されなかった（ＯＤ＜０．０５０）。はとんどのペプチドは抗−ＶＬＰ血涜と反応性であるので、平均陰性値の５倍の任意ＯＤ値を用いてＬ１蛋白の主要反応性領域を明確化させ：主要免疫反応性ＬＬペプチドはＬｌ蛋白の長さに沿って均等に分布し、７つは当該分子のアミノ末端の３番目で見られ、７つは中央の３番目で見られ、８つはカルボキノ末端の３番目で見られた。対照的に、ＨＰＶｌ６　Ｌｌにつき特異的なモノクローナル抗体は従前に記載されているごとく（ケイスン（Ｃａｓｏｎ）ら、前掲、マクリーン（ＭｃＬｅａｎ）ら、１９９０、前掲）単一の主要線状エピトープを認識した。５つのうち４つの反応性抗 −ＨＰＶ１６Ｌ１モノクローナル抗体（５Ａ４、ＩＤ６．３Ｄ１．８Ｃ４）はペプチド３０（２９１−３０５）と反応性である一方、Ｃａｌ１ｖｉｒ　１はペプチド２４　（２３１−２４５）を認識した（図１１および１１Ａ）。ウィルス様粒子で免疫したマウスからの血清はこれらのいずれの粒子とも反応しなかった。

アルゴリズムを用いて、予測される蛋白二次構造に基づき、ＨＰＶ１６Ｌ１のＢエピトープを同様に推定した。可能な抗原性領域は、鎖のフレキシビリティ、高接近性および高度な親水性に基づいて、抗原性指標（Ａｌ）（ジエイムノンおよびウォルフ（Ｊａｍｅｓｏｎ　ａｎｄ　ｆｏｌｆ）、１９８８、前掲）として計算した（図１１）。

Ａ１値が１．５を超える領域は予測されるＢエピトープとみなした。７つのかかる領域（アミノ酸７９−８４．１０５−１０８．１２０−１２２．１３４−１３５．２６７．２６９．２９８−２９９．３６３−３６７）が見い出され、これらの７つの領域のうち５つは、合成ＨＰＶ１６キヤブシドで免疫したマウスからの抗血清で主要反応性が見られた２２ペプチド内にあった。異なる入手源からの抗血清のＢエピトープ特異性の合計を図１２に示す。

実施例１−２をさらに考慮すると、パピローマウィルスは、一般に、感染したケラナノサイト中にピリオンを生ずることに注意すべきであり、これは、電子顕微鏡によって容易に同定でき（アルメイダ（Ａｌ＠ｅｉｄａ）、１９６２、ジャーナル・オフ・インベスティガティブ・デルマトロジー（Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、）３８．３３７−３４５）　、ある場合には精製でき、感染性であることが示される（ロウノンおよびマヒイ（Ｒｏｖｓｏｎ　ａｎｄ　１ｌａｈｙ）、１９６７、バクチリアル・レオ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ、　Ｒｅｏ、）３１Ｓ１１０−１３１）　ｏ　しかしながら、ＨＰＶｌ６　ＬｌおよびＬ２後期遺伝子の転写は分化した生殖器上皮で起こり（フルム（Ｃｒｕ履）ら、１９８８、ジャーナル・オフ・パイロロジ−（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　）　６２．８４−９０）、またＬ１転写はこれらの組織で免疫反応性Ｌ１蛋白を生じる（スタンレイ（Ｓｔａｎｌｅｙ）ら、１９８９、インターナショナル・ジャーナル・オフ・キャンサー（Ｉｎｔ、　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ）４３．６７２−６７６）にも拘わらず、ＨＰＶ１６ビリオンはＨＰＶ１６感染頚部上皮組織で見られない。本明細書では、本発明者らは、上皮細胞におけるＨＰＶｌ６　ＬｌおよびＬ２遺伝子の発現は、ＨＰＶＩ、６ビリオン様粒子の集合を可能とするのに必要である共にそれで十分であり、かくして、ＨＰＶｌ６のＬ〕およびＬ２蛋白はピリオン集合に関して欠陥があるのではないことを示した。組織におけるＨＰＶ１６後期遺伝子の発現は上皮環境によって厳格に調節されているようである（タイキマン（Ｔａｉｃｈｍａｎ）ら、１９８３、ジャー　・ナル・オフ・インベスティガティブ・デルマトロジ−（Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、）１．１３７−１４０）　、　ｉｎ　ｖｉｖｏにてＨＰＶ１６ビリオンを検出できナイコとは、Ｌ］およびＬ２の転写ならびにＬｌの翻訳にも拘わらず、頚部上皮細胞におけるＬ２産生への後転写ブロック、あるいはピリオン集合の阻害剤いずれがかあることを示唆する。頚部組織に由来する、細胞系Ｗ１２を含有するＨＰＶｌ６において、細胞がマウスのミクコ環境でｉｎ　ｖｉｖｏの末端分化を受けると、ウィルス様粒子が観察され（スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）ら、１９９０．ジャーナル・オフ・パイロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　）　６４．６３０５−６３０７）　、これは、かかる細胞はピリオンの集合に対してブロックしないこと、およびＬ２の不十分な翻訳または他の知られていない理由で、頚部組織においてＨＰＶ１６ビリオンを示すことができないのが説明されることを示唆する。

本発明者らのＥＭ実験は、空のＨＰＶ１６ビリオンは他のパピローマウィルスよりも小さい約４０ｎｍの平均サイズを有するが、ウサギ・パピローマウィルス（フィンチおよびフルーグ（Ｆｉｎｃｈ　ａｎｄ　Ｋｌｕｇ）、１９６５、ジャーナル・オフ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、１３．１−１２）、またはヒト・イボウィルス（ロウノンおよびマーヒイ（１’ｔｏｗｓｏｎ　ａｎｄ　Ｍａｈｙ）ら、１９６７、前掲）のごとき他のパピローマウィルスと比較して同様の表面構造を有することを示す。

沈降は、約１．３１ｇ／ｍｌの空のキャプシド密度、無傷ＨＰＶ１ａピリオンについての約１．３６　ｇ／ｍ　ｌと比較して空のパピローマウィルスに予測される密度を示した（ドーパ−およびガリモア（Ｄｏｏｒｂａｒ　ａｎｄ　Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ）、１９８７、ジャーナル・オフ・パイロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）、６１．２７９３−２７９９）。

ＨＰＶからのＬ１蛋白は可能なグリコノル化部位を有し、また精製したＢＰＶ粒子は、その移動度がエンドグリコンダーゼ処理に感受性であるＬｌの少量の電気泳動形態を有する（ジルセン（Ｌａｒｓｅｎ）ら、１９８７、ジャーナル・オフ・パイロロジー（Ｊ、　Ｙｉｒｏｌ、）、６１．３５９６−３６０１）、ＨＶＰ　ｌａからのＬ２およびＨＰＶＩＩはダブレットであることが観察されており（ローズ（Ｒｏｓｅ）ら、１９９０、ジャーナル・オフ・ジェネラル・バイｏロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）、７］、、２７２５−２７２９；ドーパ− およびガリモア（Ｄｏｏｒｂａｒ　ａｎｄ　Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ）、１９８７、前掲ニシン（Ｊｉｎ）ら、１９８９、ジャーナル・オフ・ジェネラル・バイオロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）、９０．１１３３−１１４０）、これはグリコジル化の差異のためとされている。本発明者らのデータは、ＨＰＶ１６キヤツプソメアにおけるＬ１蛋白もグリコジル化されており、２つの異なるグリコジル化状態が存在することを示す。

本明細書において、本発明者らは、合成ウィルス様粒子を用いて、真核細胞系で生産されたＨＰＶｌ、６キヤブンド蛋白の免疫原性を研究した。真核細胞で生産されたパピローマウィルスのキャブンド蛋白は抗原提示の重要な決定基となり得る翻訳後修飾を受けたので（ブロウネ（Ｂｒｏｖｎｅ）ら、１９８８、ジャーナル・オフ・ジェネラル・パイロロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）６９．１２６３−１２７３　：ゾウ（Ｚｈｏｕ）ら、１９９１、バイｏロジー（ＶｉｒｏＬｏｇＹ）、１８５．６２５−６３２）、真核細胞で生産されたキャブンド蛋白を用いた。天然ＨＰＶ１６粒子は臨床的病巣、あるいは細胞培養におけるウィルス増殖から入手できないゆえ、組換えワクシニア発現ベクターを選択した。本発明者らは、ＨＰＶｌ６　ＶＬＰを用いて、マウスにおいてポリクローナル抗− ＶＬＰ抗血清を生産し、これらの血清はエライヤ法によると、ＨＰＶ１６ギヤブシドと強力に反応した。本発明者らは、イムノブロッティングにより、抗−ＶＬＰ抗血清は変性Ｌｌ（図２）およびＬ２中のエピトープを認識したことを証明した。さらに、抗−ＶＬＰ血清は、Ｌｌの一連の５１の１５量体ペプチドにおいて２２の主要反応性ペプチドを明確化した。これらのデータは、ウィルス粒子に対して生起した抗血清は、それに拘わらず、線状決定基をしばしば認識することを示す。−組のＬ１ペプチドとの液性反応性のプロフィールは２つのＭ）ＩＣ不一致マウス株を横切ってほとんど同一であり、これは、ここでテストしたマウス株においてＨＰＶｌ６　Ｌｌ蛋白に対する液性応答を決定するにおいてＭＨＣ制限が限定的でないＬｌ中の充分なＴエピトープがあることを示唆する。

本発明者のマウス抗−ＶＬＰ抗血清で得られたＢエピトープ特異性についてのデータは、頚部形成異常を持つ婦人からの「免疫」血清の同様の研究（ディルナ− （Ｄｉｌｌｎｅｒ）ら、１９９０、インターナショナル・ジャーナル・オフ・キャンサー（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）旦　５２９−５３５）と比較することができる（図１２）。

いくつかのペプチドは免疫ヒト血清および抗−ＶＬＰ抗血清双方によって認識されたが、マウス抗−ＶＬＰ抗血清と反応するペプチドの大部分は免疫ヒト血清と反応性でなかった（図４２）。Ｌｌ−特異的モノクローナル抗体（ケイスン（Ｃａｓｏｎ）ら、１９８９　；７クリーン（ＭｃＬｅａｎ）ら、１９９０）によって認識されるＬｌの領域（２２１−２３５，２９１−３０５）のいずれも本発明者らのマウス抗−ＶＬＰ抗血清によりて認識されなかった。Ｌｌ融合蛋白をこれらのＭＡｂを生起させるのに用い、またヒト血清においてＬｌに対する抗体についてスクリーニングするのに用いたので、ヒト血清のＬ１融合蛋白との反応性の欠損（ジエニセン（Ｊｅｎｉｓｅｎ）ら、１９９０、ジャーナル・オフ・インフェクシャス・ディジインターナショナル・ジャーナル・オフ・キャンサー（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）４８６８２−６８８）は、天然Ｌ１蛋白によってヒト免疫系に提示されたＬｌのエピトープをＬ１融合蛋白が示さないことにより説明され得る。

マウス血清における反応性が線状および立体配置決定基双方に対して向けられているか否かを決定する試みにおいて、本発明者らは、２つの方法でテスト粒子につきエライヤ法を行った：１つは、天然粒子を保持すると言われているもので、もう１つは変性蛋白を生産すると言われているものである（ディルナ−（Ｄｉｌｌｎｅｒ）ら、１９９１、ジャーナル・オフ・パイロロジ−（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）、旦互、６６８２−６８７１）。本発明者らは、１または他の方法で処理した粒子と絶対的に反応性のいずれの血清またはモノクローナル抗体も見い出さなかったが、１つのＭＡＲ（ＣａＩＩｖｉｒ　ｌ　）は、変性された「生の」粒子とより強力に反応した。変性粒子との大部分のＭＡｂの反応性の欠損は、同一抗体はウェスタンプロットにて変性蛋白と反応するので、それらは部分的に変性されたにすぎないことを示唆する。

逆に、天然粒子とのＣａｍｖｊｒ　１の反応性は、この抗体によって認識される線状エピトープは天然粒子調製中にいくらかの量で存在する変性Ｌ１蛋白を認識するとの証拠とはならず、本発明者らは、無傷ＶＬＰは本発明者らのエライヤ法条件下で保持されるという証拠を有しない。

はとんどの抗体は、い（つかの非近接ポリペプチド配列（アミド（＾ｗｉｔ）ら、１９８６、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３３．７４７−７５３）を含み得る立体配置依存性決定基（ベンジャミン（Ｂｅｎｊａｍｉｎ）ら、１９８４、アヌ・レブ・イミュノル（＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）２．６７− １０１）を認識するので、ＨＰＶＩ抗血清について示されているように（ステージおよびガリモア（Ｓｔｅｅｌｅ　ａｎｄ　Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ）、１９９０、パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｇｙ）、エヱ」、３８８−３９８）　、ピリオンに対し誘導された抗体は融合もしくは変性蛋白ならびに天然蛋白を認識しないようである。い（つかの皮膚イボ関連ＨＰＶのピリオンは、イボベアリング（ｐａｒｉｎｇ）につき、血清学アッセイに十分な量で入手可能である（アルメイダおよびゴフエ（＾１ｍｅｉｄａ　ａｎｄ　Ｇｏｆｆｅ）、１９６５、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）２．１２０５−１２０７；キーンツラー（Ｋｉｅｎｚｌｅｒ）ら、１９８３、ブリティッシュ・ジャーナル・オフ・デルマトロジ−（Ｂｒ、　Ｊ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、）１０旦　６６５−６７２　；ツイスタ−およびツルＨハウゼン（Ｐｆｉｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ｚｕｒ　Ｂａｕｓｅｎ）、１９７８、インターナショナル・ジャーナル・オフ・キャンサー（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）旦　１６１−１６５；ビルソネン（Ｐｙｒｈｓｏｎｅｎ）ら、１９８０、ブリティッシュ・ジャーナル・オフ・デルマトロジ−（Ｂｒ、　Ｊ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ）　１０２　２４７　２５４　：パスおよびマイラエル（Ｐａｓｓ　ａｎｄ　１ｌａｉｚｅｌ）、１９７３、ジ’ｒニーナル・オフ・インベスティガティブ・デルマトロジ−（Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、）６０　３０７− ３１１）　。ヒト免疫血清における精製したピリオンに対する抗体の罹患率は、用いた検出系に応じて、２０（ノェンナー（Ｇｅｎｎｅｒ）、１９７１、アクタ・デルム・ベネレエル（＾ｅｔａ。

Ｓｅｒｍ、　Ｖｅｎｅｒｅｏｌ、）　（Ｓｔｏｃｋｈ）５１　３６５−３７３）から８８％（モリラン（ｉｌｏｒｉｓｏｎ）、１９７５、ブリティッシュ・ジャーナル・オフ・デルマトロジ−（Ｂｒ、　Ｊ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ）　９３　５４５−５５２）変動する。しかしながら、最近まで、性器ＨＰＶタイプのピリオンは血清学的研究には入手できなかった。ヌードマウス異種移植系（クレイダ− （Ｋｒｅｉｄｅｒ）ら、１９８７、ジャーナル・オフ・バイｏｏジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）６１　５９０−５９３）は、ヒト抗体の検出用のＨＰＶ１１粒子の生産を可能にした（ボネツ（Ｂｏｎｎｅｚ）ら、１９９１、ジャーナル・オフ・ジェネラル・パイロロジー〇、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）７２　１３４３−１３４７）。

本発明者らは、本明細書に記載したＢＰＶＩ６　ＶＬＰは天然ＨＰＶ１６粒子に対する血清反応性と同様の研究が進展するのを可能し、ＨＰＶ１５Ｌ１融合蛋白に対するヒト血清中の反応性の欠損の観察（ジエニセン（Ｊｅｎｉｓｅｎ）ら、１９９１、ジャーナル・オフ・パイロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）６５　１２０８−１２１８　：ケッヘル（Ｋ■ｈｅｌ）ら、１９９１、前掲）は、ＨＰＶＩでの同様の観察（ステージおりＰＶ構造蛋白に対する抗体はウィルス中和活性を有しており（ピラチンスキー　（Ｐｉｌａｃｉｎｓｋｙ）ら、１９８６、チバ・ファウンド・ンンボ（Ｃｉｂａ　Ｆｏｕｎｄ、　Ｓｙｍｐ、　）、１２０．１３６−１５６）、また精製したＨＰＶＩＩピリオンに対して生起した抗血清も胸腺欠損マウス異種移植系で感染性ＨＰＶＩＩを中和できる（クリステンセンおよびクレイダ−（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　ａｎｄ　Ｋｒｅｉｄｅｒ）、１９９０、ジャーナル・オフ・パイロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）、６４．３１５１−３１５６）。本発明者らの結果は、精製した合成ＨＰＶ１６キヤプシドは免疫原性であり、この腫瘍ウィルスに特異的なウィルス中和抗体を生産し、および評価するのに使用できることを示す。エンエリキア・コリ（Ｅｓｈｅｒｊｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）で発現されるＢＰＶＩ　Ｌｌ蛋白およびＢＰＶ粒子は共にイボの発生からウシを保護した（ピラチンスキー（Ｐｉｌａｃｉｎｓｋｙ）ら、１９８６　：ジャレット（Ｊａｒｒｅｔｔ）ら、１９９０．ベテリナシ・ｌツク（ｌｌｅｔ、Ｒｅｃ、）１２６　４４９−４５２）　。ＨＰＶ１６ウイルス様粒子に対する同様の免疫応答はＨＰ１６−関連頚癌を予防する可能なワクチンのベースとなろう。

図１３Ａにおいて、ｐＬｃ２０１Ｖ〜ｒでの注射後、ＣＶＩ細胞溶解物を平衡勾配沈殿に付した。精製したウィルス様粒子を、リンタングステン酸でのネガティブ染色の後に透過型電子顕微鏡によって調べた［棒線＝１００ｎｍ］。

図１３Ｂにおいて、レーン１、野生型ウィルスで感染させたＣＶ−１細胞からの溶解物：レーン２、ウィルスｐＬＣ２０１ＶＶを発現するＬｌおよびＬ２からの溶解物、レーン３、精製したウィルス様粒子。Ｌ２蛋白をウサギ抗ＨＰＶ１６Ｌ２抗体、続いて＋２３１−蛋白Ａでプローブした。分子量は左側に示し、Ｌ２バントは矢印を付した。

図１３Ａおよび１３Ｂを参照し、ＢＰＶＩ６　Ｌｌお、Ｊ：びＬ２二１ｌＥｆｆｌ換えＶＶは、精製した〜’ＬＰおよび〜７■組換えＬ２蛋白に対して生起したウサギ抗血清を用いるウェスタンプロットによって示したごと＜Ｌ２蛋白を含有する。

実施例３：ＢＰＶＩ　ＶＬＰＢＰＶＩキャブンド蛋白についてのＶ〜′組換体を用い、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで同様に生産されたウシ・パピローマウィルス（ＢＰＶ）１ピリオンはＢＰＶＩ　ＤＮＡをパッケージできることも確認した。Ｅ１ウィルス・オーブンリーディングフレームの転写によって示すごとく、完全なピリオンは浸透可能なマウス線維芽細胞系を感染させることができ、感染は、ＢＰＶＩのキャブンド蛋白に対する抗体とのピリオンのインキュベーションによって阻害される。ＢＰＶＩ６についての観察とは対照的に、ウィルス様粒子は、ＢＰＶＩ　Ｌｌキャプシド蛋白単独についてのｖｖ組換体で感染させた細胞で集合するが、Ｌ２蛋白は感染性ピリオンを生産するのにＢＰＶＩ　ＤＮＡをパッケージする必要がある。

ＨＰＶ１６粒子の総じての形態は天然に存在するＨＰＶＩおよびＢＰＶＩ粒子とはむしろ異なるにも拘わらず、前記にて言及したＢＰＶＩ６　ＶＬＰに関しては、これらの粒子は臨床的病巣から精製したＨＰＶＩおよびＢＰＶＩ粒子で観察５６−１９９１、スタフエツト（Ｓｔａｑｕｅｔ）ら、ジャーナル・オフ・デルマトロジ力（Ｊ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ）よ旦２　２１３−２１９．１．９８１）。天然ＨＰＶ１６ビリオンは臨床的病巣から精製したものではなかったので、この形態学的差異がＢＰＶＩ６、あるいは当該ピリオンを生産するのに使用した組換えワクンニアウイルス（ｒＶＶ）系の特性であるのか否かを確認するのが望ましいと考えられる。

従ッテ、一連のｖｖ、すなわちＨＰＶ６、ＨＰＶｌ、１（７）、およびＢＰＶＩ１７）ＬｌおよびＬ２キャプシド蛋白についての各二重組換体を作製した。これらの二重組換体の各々でのＣＶ−１細胞の感染により、ウィルス様粒子が生産され、これらは標品ＨＰＶＩおよびＢＰＶＩピリオンにＨＰＶ１６粒子よりも似ている。天然ＢＰＶ−１粒子は形態学的にかつ免疫学的によく特徴付けられており（チェノ（Ｃｈｅｎ）ら、ペイカー（３ａｋｅｒ）ら、１９９１、コラサート（Ｃｏｗｓｅｒｔ）ら、ジャーナル・オフ・ナショナル・キャンサー・インスティテユーｈＱ、　Ｎａｔｌ、　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ、　）、ヱ旦、１０５３−１０５７）　、ＢＰＶ−Ｉ　ＤＮＡ０）エビソーム複製について許容される細胞系が入手可能であるので（ロー（Ｌａｗ）ら、１９８１、ＤＮＡ５Ｓ７８，２７２７−２７３１）　、本発明者らはＢＰＶ−１粒子を研究するのを選択した。

図１３Ｃにおいて、ＢＰＶＩＬＩはｐ４ｂ天然ワクンニア後期プロモーターから発現され、またＬ２はｐ４８０合成ワクンニア後期プロモーターから発現される。該イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ｇ　ｐｔ遺伝子を選択マーカーとして用いる。フランキング配列はワクシニアＢ２４Ｒ遺伝子であり、これは、同種組換えについてのフランニア配列を提供する。ＢＰＶＩ　ＬｌおよびＬ２遺伝子はプラスミドｐｍｌ−１からＰＣＨによってクローン１ノだ。ＢＰＶ］ゲノムを線状化し、ＢＰＶＩＬ２０Ｐ、Ｆ中のＢａｍＨ１部位にてこのプラスミドにクローンしたゆえ、ＢＰＶＩゲノムはＢａｍＨＩ消化によってｐｍｌ−１からまず単離し、再環化し、環化したＢＰＶ−Ｉ　ＤＮＡをＰＣＲ鋒型として用いた。Ｌ１増幅について用いたオリゴヌクレオチドブライマーは。

裸で表す。Ｌ２増幅についてのオリゴヌクレオチドブライマーは：であった。ＢｇｌＩＩ部位に下線を施し、第１メチオニンおよび停止コドンは裸で表す。堆幅した１４７８ｂｐ　Ｌｌ断片をプラスミドＰＫ１９中のＢａｍＨ１部位にクローンしてＰＫ１９ＢＰＶＬ１を得た。Ｌ１遺伝子およびフランニア４ｂプロモーターを、Ｍ　ｌ　ｕ　ＩおよびＳｍａ　Ｉでの消化によってこのプラスミドかう単離し、プラスミドｐｓＸ３１：移してｐＳＸＢＰＶｌを得た。１４０９ｂｐＬ２断片をＢｇｌ　１１で消化し、プラスミドル４８０中のＢａｍＨｌにクローンしてｐ４８０ＢＰＶＬ２を得た。合成フランニア後期プロモーターおよびＢＰＶ　Ｌ２遺伝子をこのプラスミドからｐｓＸＢＰＶＬｌ中のＳｍａ１部位にクロー：／Ｌ、、て二重組ｊＦ−ブラスミＩ’ｐＳＸＢＰＶＬＩＬ２を得た。ｐｓＸＢＰＶＬｌまたはｐｓＸＢＰＶＬＩＬ２　ＤＮＡを、野生型（ｗｔ）ＶＶ　ＷＲ株で感染させたＣＶ−１の単層にトランスフェクトして、ｒＶＶ　ｐｓＸＢＰＶＬＩＶＶ（ＬＩＮ現）　およびｐＳＸＢＰＶＬＩＬ２ＶＶ　（ＬｌおよびＬ２発現）を得た。

組換えワク７ニアウィルスをミコフェノール酸の存在下で３回精製した。精製に続き、組換体の大規模ＦＡ製を行い、これらの実験を通じて使用した。

図１．４Ａにおいて、ワクンニア感染細胞中の組換えＢＰＶＩ　ＬＸの免疫沈降分析を示す。ＣＶ−１細胞を１０ｐｆυ／細胞にてｗｔワクシニアウィルス（レーンｉ）：　ｐｓＸＢＰＶＬＩＶＶ　（Ｌ／−：／２）；　ｐｓＸＢＰＶＬＩＬ２ＶＶ’（レーン３）で感染させ、感染後４８時間に収穫した。Ｂ　Ｐ　Ｖ　Ｉ　Ｌ　］蛋白をＢＰＶｌ特異的ウサギ抗血清で検出した。５８ｋＤａのＬ１蛋白を矢印で示す。

図１４Ｂにおいｒ、ＢＰＶ１．　Ｌ２発現のノーザンプロット分析を示す。ｗｔＶＶ　（Ｌ／　−：／１）；　Ｉ）ＳＸＢＰＶＬＩＬ２ＶＶ　（Ｌ／−：／２）　で感染したＣＶ−１ｍ胞から抽出したＲＮＡをＢＰＶＩ　Ｌ２遺伝子でプローブした。Ｌ２同種転写体の可変長はＶｖプロモーターから発現された転写体に典型的である。免疫沈降１：”）イテは、ｒＶＶで感ｔｂサセｔ：ｍ抱をＲＩＰＡＭＬ液（ＯｌＩＳＤＳ、１％トリトンＸ−１００，１％デｔキシコーｋｒｄｔｆトリウム、１５０ｍＭ　ＮａＣ＋、０．５μｇ／ｍ＋アプロチニン、１０ｍＭ　ｈリス、ｐＨ７，４）で溶解した。可溶性蛋白を、１：１．ＯＯＯ希釈希釈ニラサギ抗ＢＰＶＩ抗体（ダコ（ＤＡＫＯ）、グロストラップ（Ｇ１．ｏｓｔｒｕｌ）））で免疫沈降させた。沈殿した蛋白をプロティン−Ａセファロースで収集し、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースフィルターにプロットした。スキムミルクでブロッキングした後、フィルターを抗ＢＰＶ１１ｆｎ清（１：　１０００）　、ａいｒ”’Ｉ−１白Ａ（０，１μｃｉ／ｍｌ）に＆露し、オートラジオグラフィーによって可視化した。合計ＲＮＡを細胞から抽出し、前記したごとくにＣｓＣ１を通しす遠心によって精製した。合計ＲＮＡ（トラック当たり３０μｇ）を１．２％ホルムアメデヒドーアガロースゲルで泳動させ、５ｉｐ−標識ＢＰＶＩ　Ｌｌ遺伝子でプローブした。

図１５Ａｌ：おいて、ｐｓＸＢＰＶＬＩＬ２ＶＶを参ｆｆｌされタシ。ｐＳＸＢＰＶＬＩＬ２ＶＶで感染させたＣＯＮ／ＢＰＶ細胞からのいくらかの粒子は電子密度コアを有する（インサート）。

図１５Ｂにおいて、ｐｓＸＢＰＶＬＩＶＶを参照されたし。（Ａ）における汚染フランニアウイルスはｒＶＪで示す。尺度用の棒線は５０ｎｍを示す。細胞を感染後２日に収穫し、ＰＢＳで洗浄し、凍結によって溶解し、３回解凍し、ＰＢＳ中で超音波処理した。細胞夾雑物を低速遠心によって除去し、上澄みを２０に（Ｗ／　Ｖ　）ショ糖クッションに重ね、１００．ＯＯＯｘｇにて２時間遠心した。

ベレットをＰＢＳに再懸濁し、１％（Ｗ／Ｖ）リンタングステン酸（ｐＨ７，０）プロモーター（図１３０）を用い、ｒＶＶ感染ＣＶ−１細胞からのノーザンブロ・ソにおける形態学的標品ＰＶピリオンの欠如、および電子顕微鏡によってＨＰ　Ｖ　１６Ｌ１感染紡織で見られたＰＶピリオンの欠如（シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）、（１９８７Ｌパピローマウイルスおよびヒトの病気（Ｐａｐｉｌｌｏａａｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　Ｈｕ＋１ａｎＤｉｓｅａｓｅ）　１９− ３９巻、ンユブリンゲル・フエアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ）、ベルリン）は、他のＰＶとは対照的に、ＢＰＶＩ６はウィルスキャプシド形成に関して欠如しているらしいことを示唆する。

Ｖ　Ｐ　Ｖ　Ｉ　Ｌ　１　／　Ｌ　２　ｒ　Ｖ　Ｖで感染させた細胞からのウィルス粒子の大部分を図１５ａインサートに示す。

ＨＰＶＩＩＬＩ／Ｌ２およびＨＰＶ６ｂＬ１／Ｌ２二重発現組換えワク７ニアウィルスについてのクローニング戦略を以下に記載する。

ＨＰＶＩＩＬｌｉ：１．ついては。

ＰＣＲ産物をＢｇｌ　Ｉ　Ｉ／ＥｃｏＲＩによって消化し、４ｂプロモーターの制御下にあるＲＫ１９にクローンした。次いで、プロモーター／１１Ｌ１配列を、フレノウによって平滑末端化したｐＳＸ３　ＢａｍＨ１部位にクローンした。

得られたプラスミドはｐｓＸｌｌＬｌであった。

１１Ｌ２については５　’　ＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＡＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＧＧＧである。

Ｂａｍ／Ｈｌ／Ｓｍａ　］消化のＰＣＲ断片を合成２８に後期プロモーター下のｐ４８０にりｏ−ンした。次イテプ０モー９−／１１Ｌ２断片をｐｓＸｌＩＬｌに移した。ＩＩＬＩ／Ｌ２二重Ｍ換え発現プラスミドをｐｓＸ１１Ｌ１／Ｌ２と命名した。

ＨＰＶ６ｂｌｌについては５　’　ＣＧＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＴＴ’Ｉ’ｌ［’ＡＧ−〒ＦＧＧＣＧＣＧＣ買ＡＣＧ’Ｆ”ｉ’Ａ（ｉＧＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／Ｓｍａｌで切断し、４ｂプロモーターの制御下にあるＰＫ１９にクローンした。次いで、プロモーター／６Ｌ１をｐｓＸ３にクローンしてｐｓＸ６Ｌ１を得た。

ＨＰ　Ｖ　８　Ｌ　２１：：ツイテハ：ＨＰＶ６Ｌ２をＡｃｃｌ／Ｘｂａｌによって６ｂゲノムから単離した（４４２２−５９０３）。断片をフレノウによってプロットし、ｐ４８０に挿入した。合成２８にプロモーター千６ｂＬ２をｐｓＸ６Ｌ１にクローンして二重組換えプラスミドｐｓＸ６Ｌ１／Ｌ２を得た。

しかる後、プラスミドｐｓＸ１１Ｌ１およびｐｓＸ１１ＬＩ／Ｌ２を宿主細胞（例工ば、ＣＶ１細胞またはＣｌ２７１［Ｂ胞）に感染させてＶＶ　ｐ　５ＸＩＩＬＩおよびＶＶ　ｐｓＸｌｌ　Ｌｌ／Ｌ２が得られ、それは、野生型ワク７ニアウィルスで感染させた宿主細胞のトランスフェクションの後に、Ｌ１蛋白（ｖｖｐｓＸ１１Ｌ１由来）ならびにＬｌおよびＬ２蛋白（ＶＶ　ｐｓＸ１１Ｌｌ／Ｌ２由来）を含有するＶＬＰを形成した。同様に、宿主細胞のトランスフェクションの後ｉ：、ｖｖ　ｐｓＸ６Ｌ］Ｊよびｖｖ　ｐｓＸ６Ｌ１／Ｌ２は、ＨＰＶ６ｂ　Ｌｌを含有するＶＬＰならびにＨＰＶ６ｂ　ＬｌおよびＨＰＶ６ｂ　Ｌ２を含有するＶＬＰを生産した。

また、本発明が、その範囲内に、パピローマウィルスキャブノド蛋白Ｌ１およびＬ２についてのウィルス二重組換体ならびにパピローマウィルスキャブノド蛋白Ｌ１を含有する組換えウィルスを包含することは認識されるであろう。

さらに、本発明が、その範囲内に、蛋白Ｌ１およびＬ２を含有するＶＬＰ粒子の検出工程を包含するエライザ法によるパピローマウィルス感染の診断法を包含することも認識されるであろう。

表１ＨＰＶＩ６ＬＩｌ！白の予測される配列からの１５ＡＡ１複ペプチド表２合成ＨＰＶ１６キヤブシドで免疫したマウスからの血清のウィルス様粒子に対する免疫反応性＊値は０Ｄ４１５の単位であり、平均値±１標準偏差で表す。

ＦＩＧ２ＡＦＩＧ２ＢＩＧ　３ＩＧ　６ＦＩＧ　９Ｆｉｇｕｒｅ　ＩＩＦＩＧｕ￥Ｅ　ＩＩρ 抗原性指標アミノ酸残基ＦＩＧ１３ＡＦＩＧ１３ＢｌＧ１４ＡＦＩＧ　１４ＢＦＩＧ１５国際ｖ４査報告　１藺−ｓｌ＊ｙ−ｍ８６Ｆｏ＋′ｌＩ＋　ＰＣＴｎＳＩＪ２１Ｑ　Ｉｅａｌ＋Ｌ＋ｌ１−ｏｒ　関りｍ　ａｈｅｄＭＩｕｌｙ　＋　９９２１　ｏｓｙｆｉフロントページの続き（５１）　ｆａｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　７１０４　９２８１−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　７０５５−２Ｊ３３１５６９　Ｌ　７０５５−２Ｊ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＳ（７２）発明者　ゾウ、シャンオーストラリア国りィーンズランド４０７４、ジンダジー、ムーリンガル・ストリート２５番

Claims

【特許請求の範囲】１．（ｉ）パピローマウイルスＬ１蛋白あるいはパピローマウイルスＬ１蛋白およびパピローマウイルスＬ２蛋白の組合せをコードする１またはそれを超る組換えＤＮＡ分子を構築し；次いで（ｉｉ）Ｌ１またはＬ１およびＬ２蛋白の組合せの発現の後に細胞内でウイルス様粒子（ＶＬＰ）が産生されるように、該１またはそれを超る組換えＤＮＡ分子で適当な宿主細胞をトランスフェクトする工程を含むことを特徴とするパピローマウイルス様粒子の生産方法。２．Ｌ１およびＬ２蛋白をコードするＤＮＡ分子が同一のＤＮＡ分子包含される請求の範囲第１項記載の方法。３．Ｌ１およびＬ２蛋白をコードするＤＮＡ分子が異なるＤＮＡ組換え分子に包含される請求の範囲第１項記載の方法。４．工程（ｉｉ）において、１またはそれを超える組換えＤＮＡ分子を含有する組換えウイルスが、宿主細胞をトランスフェクトする請求の範囲第１項記載の方法。５．工程（ｉ）において、該組換えＤＮＡ分子を含有する一次プラスミドを形成させ、続いて、これで、野生型ウイルスで既に感染させた宿主細胞を感染させて該組換えウイルスを得る請求の範囲第４項記載の方法。６．該一次プラスミドが、工程（ｉｉ）においてＬ１またはＬ１およびＬ２蛋白の発現を促進するプロモーターに連結した該組換えＤＮＡ分子を含有する請求の範囲第５項記載の方法。７．該一次プラスミドの形成に先立ち、該Ｌ１またはＬ２蛋白をコードする遺伝子を、一次プラスミドの形成前に、核プロモーターを含有する二次プラスミドに挿入する請求の範囲第５項記載の方法。８．Ｌ１蛋白をコードする該組換えＤＮＡ分子を含有する該一次プラスミドがそこに挿入されたし２蛋白をコードするさらなる組換えＤＮＡ分子を有して、二重組換え発現プラスミドを形成させ、しかる後、一次プラスミドおよび二重組換え発現プラスミドで、野生型ウイルスで感染させた宿主細胞を感染させる請求の範囲第５項記載の方法。９．該組換えウイルスがスポドブテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のごとき昆虫細胞を感染させるバクロウイルスに由来する請求の範囲第４項記載の方法。１０．該組換えウイルスがワクシニアウイルスに由来する請求の範囲第４項記載の方法。１１．Ｌ１蛋白をコードする遺伝子を、（ｉ）強力なワクシニアウイルスプロモーター４ｂを含有するプラスミドに組み込み、（ｉｉ）該４ｂプロモーターに連結した遺伝子を含有するＤＮＡ断片が該プラスミドに由来し、かつ（ｉｉｉ）その結果、ワクシニアウイルスのＢ２４Ｒ遺仏子およびイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｐｔ遺伝子および多重クローニング部位を含有するワクチン中間体ペクターに該ＤＮＡ断片を挿入してプラスミドｐＬＣ２００を得る請求の範囲第１０項記載の方法。１２．２８Ｋプロモーターに連結したＬ２遺伝子を含有する断片をプラスミドｐＬＣに挿入する前に、Ｌ２蛋白をコードする遺伝子を、合成ワクシニア２８Ｋ後期プロモーターを有するｐＵＣ由来プラスミドに組み込んでプラスミドｐＬＣ２０１を得る請求の範囲第１１項記載の方法。１３．プラスミドｐＬＣ２０１を利用して組換えワクシニアウイルスｐＬＣ２０１ＶＶを構築し、これで引き続いて哺乳動物細胞を感染させて蛋白Ｌ１およびＬ２を含有するＶＬＰを得る請求の範囲第１２項記載の方法。１４．ＢＰＶ　Ｌ１蛋白をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子を構築し、ＰＣＲ増幅後に、ワクシニア４ｂプロモーターに連結させ、しかる後、該ＤＮＡ組換え分子をプラスミドｐＳＸ３に挿入してプラスミドｐＳＸＢＰＶＬ１が得られ、しかる後、これで、野生型ワクシニアウイルスで感染させた宿主細胞をトランスフェクトさせてｒＶＶ　ｐＳＸＢＰＶＬ１が得られ、宿主細胞の引き続いてのトランスフェクションの後にＢＰＶ　Ｌ１蛋白を含有するＶＬＰが生産される請求の範囲第１項記載の方法。１５．ＰＣＲ増幅後に、合成ワクシニア２８Ｋ後期プロモーターに連結したＢＰＶ　Ｌ２蛋白をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子を構築して（その組換えＤＮＡ分子はプラスミドｐＳＸＢＰＶＬ１への挿入前にはプラスミドｐ４８０　ＢＰＶＬ２であり）プラスミドｐＳＸＢＰＶＬ１Ｌ２が得られ、しかる後、これで、野生型ワクシニアウイルスで感染させた宿主細胞をトランスフェクトさせてＢＰＶ　Ｌ１蛋白を含有するＶＬＰを得る請求の範囲第１４項記載の方法。１６．ＰＣＲ増幅の後に、ワタシエア４ｂプロモーターに連結したＨＰＶ１１Ｌ１蛋白をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子を構築し、しかる後、該ＤＮＡ組換え分子をプラスミドｐＳＸ３に挿入してプラスミドｐＳＸ１１Ｌ１が得られ、しかる後、これで、宿主細胞を感染させてＬ１蛋白を含有するＨＰＶ１１　ＶＬＰを得る請求の範囲第１項記載の方法。１７．ＰＣＲ増幅の後に、ワクシニア４ｂプロモーターに連結したＨＰＶ１１Ｌ２蛋白を−ドする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子を構築し、しかる後、該組換えＤＮＡ分子をワクシニア２８Ｋ後期プロモーターを含有するプラスミドｐ４８０に挿入し、引き続いて、該プロモーターに連結した該遺伝子を含有するＤＮＡ断片をプラスミドｐＳＸ１１Ｌ１に移してプラスミドｐＳＸ１１Ｌ１Ｌ２が得られ、しかる後、これで宿主細胞を感染させてＶＶｐＳＸ１１Ｌ１Ｌ２が得られ、宿主細胞のトランスフェクションの後に、これがし１およびＬ２を含有するＶＬＰを生産する請求の範囲第１項記載の方法。１８．ワクシニア４ｂプロモーターに連結したＨＰＶ６ｂＬ１蛋白をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子を構築し、引き続いて、これをプラスミドｐＳＸ３に挿入してプラスミドｐＳＸ３６Ｌ１が得られ、しかる後、これで宿主細胞を感染させてＶＶ　ｐＳＸ３６Ｌ１が得られ、宿主細胞のトランスフェクションの後に、これがＨＰＶ６ｂＬ１を含有するＶＬＰを生産する請求の範囲第１項記載の方法。１９．ワクシニア２８Ｋ後期プロモーターに連結したＨＰＶ６ｂＬ２をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子を構築し、しかる後、これをｐＳＸ３６Ｌ１にクローンして二重組換えプラスミドｐＳＸ６Ｌ１Ｌ２が得られ、しかる後、これで宿主細胞を感染させてＶＶ　ｐＳＸ３６Ｌ１Ｌ２が得られ、宿主細胞のトランスフェクションの後に、これがＨＰＶ６ｂＬ１蛋白およびＨＰＶ６ｂＬ２蛋白を含有するＶＬＰを形成する請求の範囲第１項記載の方法。２０．請求の範囲第１項ないし第２０項いずれか１項に記載のＶＬＰとアジュバントを組み合わせる工程を包含するワクチンの製法。２１．請求の範囲第１項ないし第２０項いずれか１項の方法で生産されたＶＬＰ。２２．請求の範囲第２１項の方法によって生産されたワクチン。２３．蛋白Ｌ１およびＬ２を含有するパピローマウイルスに由来するＶＬＰ。２４．蛋白Ｌ１およびＬ２を含有するＨＰＶ１６に由来するＶＬＰ。２５．蛋白Ｌ１およびＬ２を含有するＢＰＶ１に由来するＶＬＰ。２６．蛋白Ｌ１を含有するＢＰＶ１に由来するＶＬＰ。２７．蛋白し１およびＬ２を含有するＢＰＶ１に由来するＶＬＰ。２８．蛋白Ｌ１を含有するＨＰＶ１１に由来するＶＬＰ。２９．蛋白Ｌ１およびＬ２を含有するＨＰＶ６ｂに由来するＶＬＰ。３０．蛋白Ｌ１を含有するＨＰＶ６ｂに由来するＶＬＰ。３１．プラスミドＰＬＣ２０１。３２．パピローマウイルスキヤプシド蛋白Ｌ１およびＬ２のためのウイルスニ重組換体。３３．パピローマウイルスキヤプシド蛋白Ｌ１のためのウイルス組換体。３４．プラスミドＰＬＣ２００。３５．５′−【配列があります】−３′３６．５′−【配列があります】−３′ ３７．ＰＬＣ２０１ＶＶ。３８．ポリクローナル抗−ＶＬＰ　ＨＰＶ１６抗血清。３９．図１２に示したＢエピトープ。４０．ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のし１およびＬ２蛋白のためのＶＶ二重組換体。４１．　５′−【配列があります】４２．　５′−【配列があります】４３．　５【配列があります】４４．　５′−【配列があります】４５．ｐＳＸＢＰＶＬ１。４６．Ｐ４８０ＢＰＶＬ２。４７．ｐＳＸＢｐＶＬ１Ｌ２。４８．ｐＳＸＢＰＶＬ１ＶＶ。４９．ｐＳＸＢＰＶＬ１Ｌ２ＶＶ。５０．ｐＳＸ１１Ｌ１。５１．ｐＳＸ１１Ｌ１Ｌ２。５２．ｐＳＸ６Ｌ１。５３．ＤＳＸ６Ｌ１Ｌ２。５４．ＶＶ　ｐＳＸ１１Ｌ１。５５．ＶＶ　ｐＳＸ１１Ｌ１Ｌ２。５６．ＶＶ　ｐＳＸ６Ｌ１。５７．ＶＶ　ｐＳＸ６Ｌ１Ｌ２。５８．　５′【配列があります】５９．　５′【配列があります】６０．　５′【配列があります】６１．　５′【配列があります】６２．　５′【配列があります】６３．　５′【配列があります】６４．蛋白Ｌ１およびＬ２を含有するＶＬＰ粒子の検出工程を包含するエライサ法によるパピローマウイルスの先行感染の診断方法。