JPH07501928A - 哺乳類の細胞における遺伝子のエクジステロイド依存調節 - Google Patents
哺乳類の細胞における遺伝子のエクジステロイド依存調節Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
哺乳類の細胞における遺伝子のエフジステロイド依存調節発明の分野
本発明は一般的に云って、蛋白質を結合するエフジステロイド・レセプターの調
節のもとに異種遺伝子の遺伝子発現を誘発する、哺乳類の細胞における特定のエ
フジステロイドの使用に関するものである。
発明の背景
ステロイドホルモンレセプターの一群は、主にリガンド依存の転写因子として機
能し発生や代謝のプロセスに影響する、進化的に保存された蛋白質群をあられe
nce 240.889[1988])。レセプター蛋白の構造の分析は、DN
Aやりガントと結合しそして転写を促進する機能をもつこれら蛋白質のドメイン
を同定41、812 [1988];S、 M、 Hollenberg 及び
R,M、 Evans、Ce1l 55.899[1988];N、J、 G、
Webster、S、 Green、J、 R,Jin 及びP。
ChaIllbon、Ce11 54,199[1988])。リガンド結合は
、あるレセプターとその同族体反応要素の相互作用のために必要であり(P、
B、 Beckerほか、Nature 324.686[1988])、そし
てまた二量化や転写活性能をもコントロールし得る(S、Y、Tsaiほか、C
e1l 55.361[1988];V、Kuwar及ステムと異種遺伝子の発
現を制御する新規なメカニズムを提供した(A、J、C。
urey 及びR,Tjian、Ce11 55.887(1988):A、J
、Courey、D、 A。
Ho1tzIIlan、S、 P、Jackson 及びR,Tjian、Ce
11 59.827[1989])。
哺乳動物のステロイドホルモンレセプターは、酵母(D、 Metzger、
J 、 H,Whi現させるときに機能することが見出された。
エフジステロイドは、作用が細胞内レセプターによって仲介されるステロイドで
あって、昆虫の脱皮ホルモンを包含する。β−エクジソンとして知られているエ
フジステロイドホルモン2O−OHエクジソンは、多くの昆虫での発育のタイミ
ングを調節する。一般文献としてKoolman(編)、Ecdysone:F
ro+e Chemistry to Mode of Action、Th1
es+e Medical Pub、 、ニューヨーク(1989)を参照のこ
と。「エクジソン」という一般的な用語は、屡々2O−OHエクジソンの略号と
して用いられる。昆虫の生育中の短時間におけるエクジソン濃度のパルス(即ち
上昇と下降)はショウジョバエの生長のいろんな段階で認められる。
胚形成、三つの幼虫段階及び二つの桶段階がこれらの段階に含まれる。最終の輛
段階は成虫ハエの形成によって終了する。生育についてのエクジソンの研究結果
は第三の、即ち最後の幼虫段階の終期のパルスから得られた。このパルスは、幼
虫から成虫への変態の開始を誘発するものである。成虫組織と呼ばれる特定の組
織は、目や翼や脚のような、その成虫構造の形成を開始する様誘導される。
生育の幼虫段階のあいだ、巨大多糸染色体が非成虫の幼虫組織中で生長する。
これらのケーブル状の染色体は、約2.000にも達する染色体コピーより成る
凝集体から成っている。これらの染色体の凝集体は極めて有用である。何故なら
ば、それによって染色体内のある遺伝子の位置が、通常の染色体に典型的に可能
であるより数等高いオーダーの極めて高い分解能で決定できる手段が提供される
からである。
多糸染色体中のパフは、パフ座における遺伝子の転写に関連した、これらのケー
ブル状多糸染色体凝集体の局所的な拡大又は膨張である。したがって、パフとは
、染色体中の特定位置にある遺伝子の転写の指標である。
遺伝子調節のモデルは、幼虫から成虫への変態を惹起するエクジソンパルスによ
って誘導される多糸染色体パフの一時的なシーケンスを説明するために提案され
た。Ashburnerらの「多糸染色体におけるパフ活性の一時的制御につい
てJCold Spring Harbor Symp、 Quat、Biol
、3旦、655−662(1974)を参照。このモデルは、エクジソンはレセ
プター蛋白(エクジソンレセプター)との」遺伝子の小セットの転写を直接に誘
導するであろう。これら初期の遺伝子は、初期のパフ後に現れる「後期の」パフ
の形成の原因となる「後期の」遺伝子の第二のセットの転写を誘発する調節蛋白
をコードしていると考えられている。すなわちこのモデルは三ランクの遺伝子調
節階層を定める。すなわちエクジソンレセプター遺伝子が第一ランク、初期の遺
伝子が第二ランク、そして後期の遺伝子が第三ランクである。パフパターンが誘
導されたこのモデルは非成虫組織中で見られる一方で、類似の遺伝調節階層もま
た、(他の生長段階でおこるエクジソンのパルスで誘発される組織生育の変化と
同じように)エクジソンのターゲットでもある成虫組織の生育における変態をも
決定し得る。
種々の構造データが、を椎動物のステロイドや他の親油性レセプター蛋白から誘
導された。このようなレセプターの「大家族」はその構造の類似性にもとづいて
定義される。E vnsrステロイドと甲状腺ホルモンレセプターの大家族J
S cience988)参照。それらの機能が定義されると、対応するホルモ
ンと複合したレセプターは、上のモデルにおいてエクジソンレセプターで提案さ
れたように、元来の標的遺伝子の転写を調節する。
ンヨウジョウバエの黒色腹腔部(melanogaster)成虫のメスからの
エフジステロイドレセプターは、Hnadlerらの、Mol、Ce1l En
do、63.403−9(1989)に記載されている。アオバエCa1lip
hora vicinaのエフジステロイドレセプターはL ehmannらの
、Eur、J、Biochem、181,577−82(1989)により特性
づけられている。Vitex 5trickeri(東アフリカの草)からの2
0−ヒドロキシエクジソンの単離は、日本特許1,135.794に記載がある
。ショウジヨウバエ唾液腺の培養基のエクジソン含量はソ連特許1,130,6
05に記載がある。ファラダナ(faladana)植物の種子から抽出したム
リステロンとその生物学的殺虫剤はアメリカ特許3,828.082に記載があ
る。エクジソンの合成は、アメリカ特許3.354.154に記載がある。
エフジステロイドの同族体は、昆虫の生育を阻害するため、植物により生産され
ることもある。植物から生成するエフジステロイド同族体のひとつはメリストン
へである。ムリステロンもしくはムリステロンA(図7]化合物IV)の分子量
は496,640ダルトン、分子式はCt t H440g、そしてCHCD名
は2.3.5゜11.14.20.21−へキサヒドロキシ−7−二レステンー
6−オン(Cononica、L、ら、Phytochemistry 14.
529.1975)である。本品はサツマイモ属の力ロニクチンの成分で、高い
昆虫の脱皮活性を示し、幼虫期の昆虫の生育を阻害することにより植物を保護す
ると考えられる(Trematerraら、Bollettin。
Zool、 Agr、 Bachic、1旦、87−93(1986)参照)。
ムリステロンAはダニの唾液腺の崩壊を誘発すると云ったような、昆虫に対して
のエフジステロイド活性をもつことが判明している( L 1ndsayら、J
、In5et Physiol、34,351−360(1988参照)。ムリ
ステロンA−レセプター複合物は、他のエフジステロイド−レセプター複合物は
ど、高い塩緩衝液中での解離に敏感でな(、この親和性は、クロマトグラフィー
中でエフジステロイドレセプターを追うために、放射能ラベルしたムリステロン
Aの使用を可能にした( L andonら、J、Bi。
1、Chew、263.4693−4697(1988参照)。
多くの医学的及び商業的に重要な蛋白が、遺伝子操作バクテリアから使用可能形
態で生産され得る。しかし多くの発現蛋白はバクテリア中で正しく処理されず、
好ましくは遺伝工学処理した有核生物細胞により生産される。典型的には、酵母
細胞又は哺乳動物組織−培養細胞が用いられる。酵母細胞中の異種蛋白の蛋白処
理はまた屡々不適当と認められるので、哺乳動物培養細胞が蛋白生産の主流とな
ってきた。異種蛋白の大量生成がこれらの細胞を不健康にし所望の蛋白の収量に
悪影響を及ぼすことが通例である。この問題は部分的に、誘導可能の発現系を用
いることで回避しつる。そのような系では細胞は、異種蛋白を発現せぬよう処理
され、従って誘発剤が生育培地に添加される迄は不健康ではない。このようにし
て大量の健康な細胞が生産され、次いで大量の異種蛋白の生産を誘発する。残念
乍ら、現在入手可能の系では、金属イオンや高温といったような誘発剤自体は細
胞に悪影響を与えるので、細胞の生産する所望の異種蛋白の収率をこれもまた低
下させる。従って、組換え蛋白の効果的生産のための無害な誘発因子の開発の必
要性がある。そのような無害な因子はまた特定の蛋白の生成能力の欠除した患者
であるヒトの治療にも価値がある可能性がある。
培養細胞中の蛋白生産のためのこれらのものと類似の方法を用いることにより、
所望の蛋白の合成を誘発するためのそのような無害の因子は、患者が生成する蛋
白の量とタイミングの両方をコントロールするのに使用できる。従って哺乳類の
細胞培養物及び哺乳動物それ自体において誘発可能な発現系が必要である。
哺乳類又はその他のを椎動物のステロイドレセプターのスーパーファミリーと結
合するホルモンは、そのような無害因子の候補でもなければそのような因子に必
要な性質を満足させるものでもない。何となれば、哺乳類の細胞は、対応するホ
ルモンの存在下で多くの標的遺伝子の発現を変えて宿主細胞に悪影響を与えるよ
うなこれらのレセプター乃至は高度にホモローガスな蛋白を含んでいるからであ
る。以上の及びその他の理由のため、別のステロイドレセプタ・−系の開発は研
究の究極目的であった。残念ながら、莫大な財源投資にも拘わらず、努力は不成
功に終わった。非哺乳類のステロイドレセプターについての構造、機能及び分子
生物学の情報の欠除が、そのような物質の生産の可能性を著しく妨げてきた。近
年、David Hognessの研究室で以前に同定(W、S eegrav
es、論文、スタッフォード大学[1988])されたステロイドホルモンレセ
プタースーパーファミリーのひとつのDHR23αポリペプチドの部分配列をも
つンヨウジョバエのDHR23αDNAの単離と特性化は、DHR23αをコー
ド化するDNA配列の単離を可能とした。この単離したDNA配列は、DHR2
3αエクジステロイドレセブターをコード化するDNAを包含する発現系の構築
化を可能にした。
要約すれば、昆虫ステロイドホルモンとそのレセプター(たとえばエフジステロ
イド)は、哺乳類の細胞培養及び哺乳動物自体に用いる無害なステロイドレセプ
ター系の有用な原料である。しかし哺乳類中でエフジステロイドレセプターの活
性を誘発する機能を示すエフジステロイドは無い。したがって昆虫ホルモン−レ
セプター系にもとづく系を開発するためには、哺乳類細胞中のエフジステロイド
レセプターを誘発し、そのエフジステロイドレセプターの制御下に置かれたこれ
らの遺伝子を発現するエフジステロイドホルモン又はホルモン類似体が必要で本
発明者は、ショウジヨウバエのステロイドレセプター同族体のDIR23αは、
ムリステロンAを含む特定のエフジステロイド群で誘導されたときに、培養哺乳
類細胞中でエフジステロイド依存性転写因子として機能することを示すものであ
る。ムリステロンAや25−水酸基不含の関連エフジステロイドは、DHR23
αの転写調節下にDNA配列の発現を哺乳類細胞中で誘発するであろう。DHR
23α誘発活性は、テストされた哺乳類ステロイドホルモンのいかなるものに依
っても誘発されなかった。ウィルス、哺乳類及びバクテリアの蛋白のDNA結合
及びトランス活性化活性は、DHR23αリガンド結合領域に融合されるとエフ
ジステロイド依存性となった。この系は、哺乳類細胞での内因性及び異種の遺伝
子の発現を選択的に調節するのに有用である。
図面の説明
図1.(A)DHR23αcDNAクローン(配列番号コ)のヌクレオチドと誘
導アミノ酸配列。左右の数字は夫々ヌクレオチドとアミノ酸残基を示す。推定D
NA結合領域に対応する保存アミノ酸には下線をつけである。(B)ショウジヨ
ウバエのDHR23α蛋白と、ヒト甲状腺ホルモンレセプター(hTRβ)、ヒ
トビタミンD3レセプター(hVDR)及びヒトレチノイン酸レセプター(hR
ARα)との比較図。アミノ酸残渣を、囲みの上に数字で示す。DNAと表示し
たDIR23αの領域を、他のレセプターのDNA結合領域と比較し、である。
リガンドと表示したDHR23αの領域は、他のレセプターのリガンド結合領域
への最高のホモロ−ガスを含む。これらの領域での百分率は枠内の数字で表わす
。QLQPと表示した領域は、アミノ酸、グルタミン(Q)、ロイシン(I、)
及びプロリン(P)に富んでいる。
図2.特定のエフジステロイドは、哺乳類細胞中のDHR23αレセプターのア
ゴニストである。ヒト293細胞を、2.5μgの発現プラスミドpR8V、D
HR23α又は親発現プラスミドpR3V(コントロール)と0.5Mgsのリ
ポータ−プラスミドl)EC4M−7?C0(ECRE)又はl)04M−77
CO(GRE)と共トランスフェクトする。l・ランスフエクション効率のコン
トロールのために、0.5MgsのコントロールプラスミドpR5V、hGHを
トランスフェクション混合物中へ導入する。トランスフェクション後に細胞をα
−エクジソン(alpha)、2O−OHエクジソン(20−OH)、ポリボジ
ンB(ppB)、ポナステロンA (pan A )又はムリステロンA(mu
rA)と共に、又はなしで(−)処理する。CAT抽出物をトランスフェクショ
ン後に48時間培養し、モしてテストする。数値は、hGT(の発現に標準化し
、そして独立した3つの実験の平均値で示す。「誘発倍数」とは、加えるべきリ
ガンドの不存在下に培養した細胞からの抽出物中の該リポータ−遺伝子の発現で
、ホルモンと共に培養した細胞中の該リポータ−遺伝子の発現レベルを割ったも
のである。
図3.哺乳類ホルモンのDHR23α活性に対する効果。細胞をDHR23α発
現ベクターとEc、M、、Coリポータ−遺伝子でトランスフェクトし、そして
以下のホルモン(1μM)と共に、又はなしで(−)処理する。即ちムリステロ
ンA(曹urA)、デキサメサゾン(D ex)、17β−エストラジオール(
R2)、アルドステロン(Aldo)、コルチコステロン(Cart)、ヒドロ
キシコルチコステロン(OH−Cart)、甲状腺ホルモン(T3)、プロメゲ
ストン(P romeg)又は1,25−ジヒドロキシ・ビタミンDs(VDs
)。リポータ−遺伝子活性は、図2に述べたと同様に測定。
図4.レセプター蛋白の模式図と発現。(A)レセプター構築は、元のN−末端
トランス活性化、DNA結合及びリガンド結合領域を表わす三部分の命名に従っ
て示す。G及びEcはそれぞれグルココルチコイドレセプター及びDHR23α
をあられす。Eは、DNA結合特異性をニストロケンレセプターのそれに変える
2つのアミノ酸置換(G458E、5459G)を持ったラットのグルココルチ
コイドレセプターDNA結合領域の誘導体を示す。X(枠内の)は、E 5ch
erichiacoli LexA蛋白のDNA結合領域(アミノ酸1〜87)
を示す。■(影をつけた枠内の)は、7ミ/M153〜406がH8V VP1
6蛋白(アミノ酸411〜490)の転写活性領域で置換されたGRN−末端領
域の誘導体をあられす。
GGEcは、GGGのリガンド結合領域(アミノ酸528〜795)をDHR2
3αのリガンド結合領域(アミノ酸329〜878)で置換され構築されたもの
である。同様にして、GXEcの構築のためには、GXGのリガンド結合領域を
DHR23αリガンド結合領域で置換した。(B)トランスフェクトした細胞で
のレセプター蛋白の蓄積。すべての細胞抽出物は、次の融合蛋白をコードするレ
セプター発現プラスミドでトランスフェクトして48時間後に作った。すなわち
レーン1はEcEcEc;L/−ン2はGGG:L/−ン3はGGEcルーン4
はVGEC:L/−ン51;!E″E”G;レーン6はE−E”Ec:レ−ン7
1tGXG;Lz−ン8はEXEc;及びレーン9はXVEc、図中の斑点図形
は、ラットのグルココルチコイド・レセプターのN−末端領域のエピトープを認
識するモノクローナル抗体BμgR2と反応させ、次いでセイヨウワサビのパー
オキシダーゼとがツブリングした、マウス抗体に対するヒツジの抗血清と反応さ
せたものである。分子マーカーの位置が示されている。
図5.レセプター蛋白で誘発された転写体のRNase保護分析。全RNAは、
DHR23α(EcEcEc)、GGG又はGGEcの何れかとリポータ−遺伝
子64M−77Goをコードしている発現プラスミドでトランスフェクトして4
8時間後に細胞から作成した。G4M、、Coの377塩基保護バンドと、内部
コントロール遺伝子(CMVエンハンサ−/プロモーター構築から発現)の29
4塩基保護バンドの位置は、夫々黒色及び白色の矢で示しである。
図6.エストロゲンレセプター(EREs)のキメラレセプターによる誘導。細
胞を、MTVプOモー9−と融合した4EREsを含むE 4 M −t t
CO及びDHR23α(EcEcEc)、G″E″G又はG″E″Ecをコード
する発現プラスミドでトランスフェクトした。細胞は、ムリステロンA(M)若
(はデキサメサゾン(D)と共に、又はそれなしで(−)48時間培養したもの
である。
図7.エクジステロイド類の化学構造。(1)エフジステロイドのナンバリング
法を示し、R,及びR2は電気的陰性基置換位置を表わす;(II)エクジソン
;(II I)20−OHzクシソン(β−エクジソン);(IV)ボナステロ
ンA:(v)ムリステロンA;(Vl)5−デヒドロキシムリステロンA:そし
て(VII)11−デヒドロキシムリステロンA0
好ましい実施態様の説明
ステロイドレセプターは、その同族体ステロイドリガンドの結合によって活性が
強固に調節された転写因子という大きな一群のうちのメンバーである。これらの
リガンド依存転写因子は、哺乳類細胞の異種遺伝子の調節発現を得るために利用
できる。しかし、トランスジェニック動物におけるこれら系の有用性は内因性ス
テロイドとそのレセプターという背景により限定される。本発明により、昆虫エ
フジステロイドの類似体(ムリステロンA)は昆虫ステロイドレセプターDHR
23αとそのDNA結合配列を用いての哺乳類における遺伝子発現を誘発するこ
とが示される。
本発明において、トランスジェニック動物や組織培養における哺乳類の細胞中で
異種遺伝子を特に調節する系を発展させることを本発明者は希望した。そのよう
な系は、異種遺伝子の生産物の合成を調節するための強力な方法を提供する。
リガンド依存転写因子として機能する哺乳類ステロ・イドホルモンレセプターの
能力を利用する系は、哺乳類の細胞における異種遺伝子の発現の調節に有用であ
ることが証明されている(D、I 、I 5rael 及びR,J、 Kauf
man、Nuc、 Ac1dsRes、lヱ、4589[1989])。しかし
培養細胞又はトランスジェニック動物におけるこれらの系の応用は、異種ステロ
イドレセプターやそのリガンドという背景により限定をうける。本発明において
本発明者は、ショウジヨウバエのDHR23α蛋白(1988年にスタッフォー
ド大学のW、S eegravesにより同定[W、S eegraves、論
文、スタッフす−ド大学(1988)]されたステロイドホルモンレセプターの
スーパーファミリーのうちのひとつ)は、たとえばDHR23αのような特定の
エフジステロイドで誘発されると哺乳類細胞中でリガンド依存転写因子として機
能するという事を示すものである。DHR23αの活性は、特定のエフジステロ
イドの投与で誘発されるが、テストした哺乳類ホルモンの何れによっても誘発さ
れない。新しいターゲット遺伝子特異性は、異種DNA結合領域に融合したDH
R23αリガンド結合領域を含むキメラレセプターを用いて得られた。
最後に、これらのキメラ蛋白の活性は、活性なウィルス・トランスアクチベーシ
ョン領域を含ませることによって増大しつる。
部分的DIR23配列にもとづくオリゴヌクレオチド・プローブ(W、S ea
grayes、論文、スタッフォード大学:1988])を、ショウジヨウバエ
の初期のサナギの幼虫から得たcDNAライブラリーをスクリーニングするのに
用いた。DHR23αクローンの推定アミノ酸配列を図IAに示す。DHR23
αとほかのステロイドレセプタースーパーファミリーに属するものとの間の最高
のホモロジー領域は、DNA結合領域に相当するノスティンに富む領域(残基2
64−329)に見出される(図IB)。推定上のリガンド結合領域は、レチノ
イン酸と甲状腺ホルモンレセプターの一群とビタミンDレセプターとの間で限ら
れたホモロジーを共有する。N−末端領域(残基1−263)は、いかなるステ
ロイドレセプターのスーパーファミリーのものとも顕著なホモロジーを共有しな
い。本発明者はまた分別スプライシングでおこると考えられるこの蛋白のもうひ
とつのフオーム(DIR23β)を同定した。DHR23βはDNAやリガンド
結合領域においてDHR23αと同一であるが、234コのアミノ酸の無関係な
N−末端領域を有している。
DIR23αは、2O−OHエクジソンで処理したショウジヨウバエの組織培養
細胞内のエクジソン応答因子(EcREs)を含む遺伝子の転写を調節するとの
報告がある(M、 Koelle、 1989年10月2日のセミナーで発表、
GenentechInc、、サンフランシスコ、カリフォルニア)。本発明者
はDHR23αが、ネズミの哺乳類腫瘍ウィルス(MTV)プロモーターとクロ
ラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子と結合したE
cREsを含むリポータ−遺伝子の転写を高めるべ(エフジステロイドで処理し
た哺乳類細胞中で機能するか否かを決定した。ヒトの293細胞は、MTVプロ
モーター・CAT構築物と結合したショウジヨウバエHSP27プロモーターか
らのエクジソン応答要素(EcRE)の4つのコピーを含むリポータ−遺伝子E
c4M−ttco及びDHR23αをコードするR3Vに基づく発現ベクターで
共トランスフェクトされた(G、Riddihough及びH,R,B、Pel
ham、EMBOJ、6 3729[1987])。CAT活性は、エフジステ
ロイドα若くは2O−OHエクジソン、ポリポジンB1ボナステロンA又はムリ
ステロンAと共に(又はなしで)培養した細胞からの抽出物中で測定された。α
−エクジソンや2O−OHエクジソンそしてボリボジンBの何れも哺乳類細胞中
でDHR23αのアゴニストとして作用しなかった。逆に、リポータ−遺伝子の
発現は、ムリステロンAで処理した細胞内では顕著に、そしてポナステロンAで
処理したときはそれよりも少ない程度で増大した(図2)。この誘発はリポータ
−遺伝子中のEcREの存在に依存する。何故ならばDHR23αは、グルココ
ルチコイドレセプター側(GRE、図2)か又はエストロゲンレセプター側(E
RE、図6)の結合を含むリポータ−遺伝子の発現を調節しないからである。
すなわち哺乳類の細胞中ではDHR23αは、エフジステロイド依存的に作用し
て、リポータ−遺伝子を含むEcREからの発現を選択的に亢進させる。
ショウジヨウバエ細胞系でのアゴニストである2O−OHエクジソンやポリポジ
ンBが何故に哺乳類細胞中でDHR23αを活性化するかは明らかでない。輸送
の失敗、不活性化及び非特異的結合が哺乳類細胞内の活性の欠除の理由として挙
げ得る。しかし特定の活性とレセプターに対するリガンドの相対的効率は、その
レセプターが異種系で発現した時は、ときどき異なることがわかっている。たと
えばグルココルチコイド・リガンドのそのレセプターに対する活性は酵母と哺乳
類細胞中で著しく相異することが知られている。驚(べきことには、エクジソン
の特定の誘導体のみがアゴニストとして作用し、それは25−水酸基の欠除とい
う関連態様を共有している。弱いアゴニストのポナステロンAと2O−OHエク
ジソン(これは不活性)の間における唯一の構造上の相異点は、前者は25の位
置に水酸基をもたないという点である。更に驚くべきそして予期しなかったこと
は、強力なアゴニストのムリステロンは5と11の位置の水酸基の付加という点
においてのみボナステロンAと相異しているという事である。したがって、驚く
べきことには、哺乳類細胞においてはDHR23α−調節発現のエフジステロイ
ド・インデューサーは25位の水酸基を欠除しているのである。好ましい実施態
様において、エフジステロイドは5又は11位に1コの水酸基をもっている。ま
たは、ムリステロンの5及び/又は11位に置換する電気的陰性基は、エフジス
テロイド・レセプターの活性化をもたらすものと期待されよう。ムリステロンの
5及び11位に置換できる電気的陰性基としてはヒドロキシ、ケトン、スルフヒ
ドラル、ナイトレート、ナイトライド及びハロゲン(特にフッ素、臭素及び塩素
)がある。DHR23α調節発現の最も活性なインデューサーはムリステロンA
で、本島は5と11の両位置に水酸基をもっている。ムリステロンAのCHCD
名は2.3,5.11.14.20.22−ヘプタヒドロキシ−7−クレスチン
−6−オン:5−デヒドロキシムリステロンAのそれは2.3.11.14.2
0.22−セブタヒドロキシー7−コレステン−6−オン、そして11−デヒド
ロキシムリステロンへのそれは2,3.5.14.20.22−セブタヒドロキ
シー7−コレステン一〇−オンである。
本発明においてエフジステロイドレセプターとは、ムリステロンA又は5−若く
は11−位に電気的陰性基置換をもつムリステロンA誘導体に対して生理的に顕
著な結合親和力をもつ昆虫ステロイド・レセプターとして定義されるものである
。そのような生理的に顕著なレセプターとしてはエクンソンレセブターやDHR
23Xがある。生理的に顕著な結合親和力とは、10−6モル以下の濃度で有効
に結合することである。本発明においてエフジステロイドとは、エフジステロイ
ド・レセプターに対して生理的活性親和力をもち25−OHを欠除するステロイ
ドとして定義される。
哺乳類ステロイドホルモンがDHR23αのアゴニストとして作用するか否かを
決定するため、本発明者は活性な哺乳類ステロイド・レセプターとして公知のホ
ルモンの代表的なものについてテストした。これらホルモンの何れもがDHR2
3αのアゴニストとして作用しなかった(図3)。この結果は、DHR23活性
はエフジステロイドにより哺乳類細胞中で選択的に調節されることを示唆してい
る。したがって、DHR23αのコントロール下の遺伝子を含む哺乳類細胞はム
リステロンAにより誘発され、テストされた上記の哺乳類ステロイドホルモンで
は誘発されない。
哺乳類、ウィルス及びバクテリアのDNA結合又はトランスアクチベーション領
域のエフジステロイド調節
ステロイドホルモンレセプターの著しい特徴は、異種蛋白の領域と組合せた時に
個々の領域が機能できる程度にある。レセプターのDNA結合特異性は、そのD
NA結合領域を他のステロイドレセプターのそれら(S、 Green及びP、
Chambon、Proc、 Natl、、Acad、Sci、U、S、A、3
25,75[1987コ)又はバクテリアからのもの(P、J、 Godows
ki、D、Picard 及びに、 RoYamamoto。
結合蛋白で置換することにより変更できる。幾つかの例においては、異種蛋白の
活性は、もし該蛋白がステロイドレセプターリガンド結合領域に融合されるとホ
ルモン調節的となる。たとえば、E I A、 c−a+yc又はc−fosの
トランスアクチベーンヨン又は形質転換活性は、ステロイドレセプターリガンド
結合領域の融合によりホルモンの管理下におかれ得る(M、Eilers、D、
Picard、に、 R,Yamam。
uperti−Furga、G、Bergers、D、Picard 及びM、
Busslinger、 Proc、 Natl。Acad、Sci、Ll、S
、A、88.5114[1991])。
本発明者は、DHR23αのリガンド結合領域が、次の理由によって哺乳類グル
ココルチコイド・レセプターのDNA結合及びトランスアクチベーション領域を
調節するのに使えるか否かを決めることとした。まず、DHR23αと逆に、G
Rの高親和性DNA結合部位を同定しくM、Beato、 Ce11. 5旦、
335[1989])そしてこれらの部位を含むリポータ−遺伝子を極めて強力
に調節する。すなわち我々のアッセイの感度を上昇させる。第二に、これらのキ
メラレセプターが、エフジステロイドに応答する哺乳類細胞の異種遺伝子を選択
的に調節するのに用いる。本発明者は、その中でGRのリガンド結合領域をコー
ド化する配列がDHR23αのそれ(図4A)と置換しているキメラ遺伝子、G
GEc、を構築した。ウェスタンプロット分析は、GGEcはトランスフェクト
された細胞中で発現された(但し完全なGR(図4B)よりは可成り低いレベル
ではあるが)ことを示す。予期したようにDHR23αは、高い親和性GRE(
表1)の4つのコピーを含むリポータ−遺伝子であるG4M−7tcoの発現を
誘発できながった。しかし、GRE含有リポータ−遺伝子の発現は、ムリステロ
ン処理した細胞中のGGEcによって700倍以上も誘発された。キメラレセプ
ターのアゴニストとしてのエフジステロイドの相対的効率はDi−IR23αの
それと同等であり; α−エクジソン、2O−OHエクンソン又はポリポジンB
はアゴニストとして作用せず、一方ボナステロンAとムリステロンAはそれぞれ
弱い及び強いアゴニストとして作用した。
CATアッセイの結果は確認され、そして調節されたプロモーターで開始された
転写物の直接分析によって拡げられた。トランスフェクトされた細胞がら単離さ
れたRNAは、CMAエンハンサ−及びプロモーターから発現された共トランス
フェクトされたコントロール遺伝子とレポータープラスミドを含むGREと補足
し合うプローブを用いるRNAaseマツピング実験によってアッセイされた。
図5はGGEcがホルモン依存性に作用してGRE−MTVプロモーター構築が
らの発現を刺戟することを示している。
次にDIR23融合蛋白が、エストロゲンに正常に応答する遺伝子を調節できる
か否かを決めた。GRのDNA結合特異性をERのそれに変換するとされている
ラットのグルココルチコイド・レセプター(G458E、5459G)の第一の
フィンガー中へ2つのアミノ酸変更を合一するGGEc誘導体を構築した(K、
Usesono及びR,Evans、Ce11 5ヱ、1139[1989コ
;M、Danielsen、 L。
Hinck 及びG、Ringold、Ce11 5ヱ、1131[19891
X図4A)。この融合蛋白G″E″Ecは、ムリステロン依存性にレポーター遺
伝子E 4 M −7□C○を含むEREを調節する(図6)。予期したように
、G″E″Ecは、EREs欠損レポーター遺伝子の発現を誘発しなかった。
哺乳類蛋白のDNA結合部位に融合したDHR23αリガンド結合領域を含むキ
メラ蛋白は、形質転換した動物の形質転換異種遺伝子が又は未変性のもののi現
を調節するのに有用であることが証明されると期待される。そのような融合構築
は、形質転換した哺乳類又は哺乳類細胞に導入した異質遺伝子の発現を調節する
のに有用であると期待される。次いでDIR23αリガンド結合領域が、哺乳類
細胞に正常に発現されてないDNA結合領域の活性を調節するのに用い得るが否
かを決定した。GGEc融合のGRDNA結合領域のための配列コーディングを
、Escherichia coli LexAリプレッサーのDNA結合領域
で置換することによってキメラ遺伝子GL、xEcを構築した(J、 W、Lj
、ttle 及びS、 A、、 トl111.Proc、 Natl、Acad
、Sci、 U、S、A、82.2301[1985]X図4)。CMVプロモ
ーターの一33位(D26bp 1exオペレ−9−0)4)(Dコピー4含む
レポーター遺伝子、X4C−socoを構築する(R,Brent 及びM、P
tashne、Nature 312.612[1984コ)。GLxEcは
、lex オペレーターのないレポーター遺伝子であるQC−3sCOの発現に
効果がない(図6B)。しかし、X4cm3scoの転写はGLxEcにより強
力に誘発され、そしてこの誘発にまったくホルモン依存的であった(図6A)。
対照として次のことを示した。すなわちX4C,、COは、ムリステロンで処理
され、そして1exA DNA−結合領域を欠くDHR23αにより、又はグル
ココルチコイド・レセプター・リガンド結合領域を含むGLxGにより(P、J
、 Godovski、D、Picard 及びに、 R,Yama+noto
。
5cience 24ユ、812[1988])共トランスフェクトされた細胞
中で誘発されない。
最後に、DHR23α融合蛋白の活性は、活性なウィルス・トランスアクチベー
ノヨン領域の融合によって更に高められるか否かを決定した。GGEc及びGL
xEcのGRN−末端活性領域の部分をヘルペスウィルスvp16酸性活性領域
で置換して、夫々VGEc及びVLxEcを構築した(1. 5adovski
ほか、Proc、 Natl、 Acad、Sci、335.563[198
8];D、J、Cousens、R8Greaves、C,R,Coding、
及びP、O’Hare、EMBOJ、8.2337[1989](図4A)。ト
ランスフェクトされた細胞でこれらの蛋白は、VP16活性領域を欠く誘導体と
類似のレベルにまで蓄積された(図4B)。VGEc及びVLxECの何れもが
エフジステロイド依存的に作用して適当なレポーター遺伝子の活性を誘発した(
表1及び2)。しかしvGEcとVLxEcの活性は、GGEc及びGLxEc
よりも5乃至10倍大きかった(M、 A、Labow、S、B、 Ba1n、
T、5henk及びA、J、 Levine、Mo1. and Ce11.
Biol、皿、3343[1990コ)。
すなわちDHR23αリガンド結合領域は、ウィルス、哺乳類及びバクテリアの
DNA−結合又はトランスアクチベーンヨン領域の活性を調節するのに使用でき
る。
真核細胞内の内因性及び外因性遺伝子の調節された発現のための系の発展は、こ
れら遺伝子生産物の機作を研究しそして病態動物モデルの開発するための重要な
方法を提供する。本発明の結果は、哺乳類細胞の遺伝子を調節するために非哺乳
類ステロイドホルモンレセプターを使用することの可能性を示した。この系には
幾つもの重要な特徴がある。DHR23αはEcREc’を含有する遺伝子の転
写の有力かつ選択的レギュレーターとして作用し、DIR23αの活性はそのD
NA結合又はトランスアクチベーション領域を異種蛋白のそれと置換することに
より更に修飾される。重要なことに、DHR23α活性は、ふつうの哺乳類細胞
で発現しないところのエフジステロイドによって調節される。すべての哺乳類ス
テロイドをしらべたわけではないが、それらの何れもがDHR23αのアゴニス
トとして作用する天然のネズミのステロイドが豊富ではなかった。すなわちDH
R23α又はDHR23α融合蛋白の転写調節活性は完全に外因性リガンドの投
与に依存することが認められる。
哺乳類細胞中の遺伝子発現を調節するE、 coli lac レプレッサーを
使用する可能性は幾つもの論文に示されている。lac レプレッサー及びステ
ロイドレセプターに基づ(系の何れもが転写を誘発し又は抑制することができる
(D、 M。
0m1tz、R,W、 Moreadith 及びP、Leder、PNAs
88.698[1991])。ステロイドレセプターにもとづく調節系のひとつ
の興味ある特徴は、リガンド結合領域によりコントロールできるタイプの活性に
おける顕著な柔軟性である。
lex A、c−fos、GAL4及びc −ayeのような構造的に異なった
DNA結合蛋白の活性は、ステロイド・レセプター・リガンド結合領域と融合さ
れるとホルモン依存的となる(P、J、 Godowski、D、Picard
及びに、 R,Yamamoto、5cienD、Picard S、J、5
alser 及びに、 R,YaIIlamoto、 Ce1l 54,107
3[1988];G、Superti−Furga、G、Bergers、 D
、Picard 及びM、Busslinger、Proc、 Natl、 A
cad、 Sci、 U、 S、 A、 88.5114[1991])。
キメラ蛋白はトランスアクチベーション領域の付加又は削除によって更に修飾さ
れる。すなわち、DHR23α融合遺伝子は、cis−作用の調節配列及びその
同族体DNA結合領域が同定されている実質上すべての遺伝子の発現を調節すべ
く構築できることが期待される。
本発明の方法において使用が予想される遺伝子はたとえば、哺乳類の中で治療必
要濃度よりも低値で存在するサイトカイン、ホルモン、構造蛋白、酵素及び核酸
である。サイトカインやホルモンの例としてはポリペプチド、たとえば生長ホル
モン、インシュリン類似の生長因子、インターロイキン、ヒト生長ホルモン、N
−メチオニル化されたヒト生長ホルモン、ウシ生長ホルモン、副甲状腺ホルモン
、チロキシン、インスリン、プロインスリン、レラキンン、ブロレラキシン、グ
リコ蛋白ホルモン例えば濾胞刺戟ホルモン(FSH)、甲状腺刺戟ホルモン(T
SH)、副甲状腺刺戟ホルモン及び黄体形成ホルモン(L H)、造血成長因子
、肝成長因子、センイ芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍
壊死因子(−α及び−β)、ミュラ一式阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペ
プチド、グルカゴン、インヒビン、アクチビン、導管内皮成長因子、インテグリ
ン、トロンボポイエチン、エリスロポイエチン、神経成長因子たとえばNGF−
β、血小板成長因子、造血成長因子、組織因子蛋白、ミュラ一式阻害物質、マウ
スゴナドトロピン関連ペプチド、トランスフォーミング成長因子(TGF)たと
えばTGF−α及びTGF−β、インスリン様成長因子−■及び−II、潜在性
関連ペプチド、エリスロポイエチン、骨誘発因子、インターフェロンたとえばイ
ンターフェロン−α、−β及び−γ、コロニー刺戟因子(C3Fs)たとえばM
−CS F、 GM−CSF及びG−CS F、インターロイキン(ILs)た
とえばI L−1,I L−2゜I L−3,I L−4,I L−5,I L
−6,I L−7,I L−8及びその他のポリペプチド因子である。
酵素の例は次のようである。すなわち組織プラスミノーゲン活性酵素(TPA)
、ウロキナーゼ、エラスターゼ、アデノシンデアミナーゼ、ボンベシン、因子I
X。
因子Vlll、トロンビン、エンケファリナーゼ、β−ラクタマーゼ、スーパー
オキサイドジスムターゼ、逆転写酵素、RNa5e、 D Na5e、そして次
のものに関与する酵素、すなわち解糖、クレブスサイクル、糖新生、尿素サイク
ル、酸化的リン酸化、及び次のものの合成や分解、すなわちプリン、ピリミジン
、核酸重合体、コレステロール、蛋白、グリコゲン、脂肪酸、炭水化物、リン脂
質、糖蛋白又は脂質。
構造蛋白の例は次のようである。すなわち肺界面活性物質、アルブミン、抗体、
担体蛋白、糖蛋白ホルモンレセプター、CD−4、インスリン様成長因子が結合
する蛋白、カルシトニン、因子Vlll、抗体、蛋白A又はD1リウマチ因子、
ウィルス抗原、HIV包膜蛋白GP・120がGP・140、免疫グロブリン、
血清蛋白及び改善量存在するすべての蛋白。
核酸の例はセンス鎖及びアンチセンス鎖のDNAやRNAである。RNAとして
は、リポソームRNA、メツセンジャーRNA、転移RNA、手植RNA及び酵
素機能をもつか又はそれに関与するRNAのような、いかなるものであっても良
い。本発明の方法は、アンチセンス又はサプレッサー核酸として作用したり天然
に産する哺乳類核酸の活性を阻害したりする核酸の生成に応用できる。そのよう
な核酸は、ウィルス性疾患、がん及び蛋白その他の代謝産物の過剰生産を処置す
るために特に治療的有効性をもつ。
0mn1tzほか(D、 M、 0mn1tz、R,W、 Moreadith
及びP、 Leder、 PNAs88.698[1991])は形質転換マ
ウスの異種遺伝子の発現を調節するための二成分系を述べている。この系におい
ては、酵母GAL4蛋白を発現する「トランスアクチベーター」株は、UAS配
列でコントロールされる転写的にサイレントなトランス遺伝子(transge
ne)を含む「標的」株と交雑される。この交雑の二遺伝子的子孫は、同一の組
織中の両方のトランス遺伝子を発現する。DHR23α又はDHR23β遺伝子
融合を含む二遺伝子系は内因性及び外因性遺伝子の存在量、時間コース及び/又
は組織特異的発現を制御するための一般的方法を提供するであろう。たとえば、
EcREsにより制御されたトランス遺伝子の組織特異的の及び発生的調節の発
現は、発現DHR23αを適当な組織特異性エンハンサ−で標的化して得られる
ものと期待される。「標的」遺伝子をもっEcREの発現は、そのアクチベータ
ーをエフジステロイドで「スイッチ・オン」させることによって適当な回数だけ
誘発されるものと期待される。形質転換動物の遺伝子の組織と発育制御をなしう
るこの系の開発は、「遺伝子ノックアウト」工学にもとづく戦略を相補する重要
なアプローチを提供する。
この方法のために適当な哺乳類細胞は、無処理の哺乳動物に含まれているものを
包含する。それは分化された及びされてない細胞の両方を包含する。哺乳類細胞
という用語は更に、哺乳類の組織から誘導された一次細胞培養及び樹立細胞系を
も包含する。好ましい哺乳類細胞系の例は293細胞系及びCHO細胞系である
。
エフジステロイドの治療用組成物と投与エフジステロイドは、エフジステロイド
の転写管理下にある遺伝子を含む形質転換哺乳類又は哺乳類細胞に投与できる。
たとえば哺乳類にポリペプチドを発現させる遺伝子療法は、これ迄に不十分な量
を生産した。そのようなポリペプチドを以下に述べる。
エフジステロイドの治療用処方物は、所望の純度のエフジステロイドのサブユニ
ットを任意の生理的に許容される担体、稀釈剤又は安定剤(Remington
’s Pharmacentical S ciences、既出)と混合し、
凍結乾燥ケーク又は水溶液として保存する。許容される担体、稀釈剤又は安定剤
は、使用濃度や用量で患者に無害であり、例えば次のようである。緩衝剤たとえ
ばリン酸塩、クエン酸塩その他の有機酸;抗酸化剤たとえばアスコルビン酸:低
分子量(約1o残基より少ない)ポリペプチド:蛋白たとえば血清アルブミン、
ゼラチン又は免疫グロブリン:親水性ポリマーたとえばポリビニルピロリドン:
アミノ酸たとえばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン
:単糖類、三糖類及びその他の炭水化物たとえばグルコース、マンノース又はデ
キストリン;キレート剤たとえばEDTA。
糖アルコールたとえばマンニトール又はソルビトール:塩形成性の対イオンたと
エバナトリウム、及び/又は非イオン性界面活性剤たとえばツイーン、プルロニ
クス又はポリエチレングリコール(PEG)。
インビボ投与に用いるエフジステロイドは無菌でなければならない。これは凍結
乾燥や再構成の前又はあとで、無菌濾過膜で濾過することによって容易に達成さ
れる。エフジステロイドは通常は凍結乾燥形態又は溶液として保存される。治療
用のエフジステロイド組成物はふつう、無菌アクセス容器、たとえば皮下注射用
の針で貫通可能な栓のあるバイアルか静脈注射用の溶液容器中に入れられる。
エフジステロイドの投与ルートは公知の方法による。たとえば静脈内、腹腔内、
脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は傷害部位内への注射若くは注入又は下記のよう
な持続放出系による。エフジステロイドは注入又は全量一時注射によって連続的
に投与される。
持続放出剤の適当な例は、エフジステロイドを含有する固形の水と不親和性のポ
リマーの半透過性マトリックスであり、該マトリックスは有形の材料たとえばフ
ィルム又はマイクロカプセルの形状である。持続放出マトリックスの例は次のよ
うである。すなわちポリエステル、ヒドロゲル[たとえばlangetほか、J
、Biミリレート]、ポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(アメリカ特許
3.773゜919及びEP58.481)、L−グルタミン酸とγ−エチルー
し一グルタメートのコポリ7− (S 1dIIlanほか、Biopoly+
5ers、22.547−556[1983])。
非分解性のエチレン−ビニルアセテート(L angerほか、既出)、分解性
の酪酸−グリコール酸コポリマーたとえばLupron Depot(商標)(
酪酸−グリコール酸コポリマーとりューブロリド・アセテートから成る注射可能
の微小球)及びポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸(EP133,988)
。
持続放出剤の他の例は、埋め込み(entrapped)タイプのエフジステロ
イドである。エフジステロイドを含むリポソームは、それ自体公知の方法で製造
される。
4030−4034(1980):EP52.322:EP36.676:EP
88.046;EP143.949;EP142.641+特願昭58−118
008:アメリ力特許4.485.045並びに4.544.545:及びEP
102,324゜ふつうリポソームは小さい(約200−800人)単層タイプ
で、その中の脂質含量は約30モル%コレステロールより大でなく、選択された
比率が最適のエフジステロイド治療のために調節される。
治療に用いるエフジステロイドの有効量は、たとえば治療対称、投与方法、エフ
ジステロイドで誘発されるポリペプチドの活性及び患者の体調といったものに依
存する。したがって治療を行う者にとっては、最適の治療効果を得るに必要なよ
うに用量をきめ投与方法を変更することが必要であろう。典型的な一日用量は上
述の要因に応じて約1μg/kgがら100mg/kg又はそれ以上の範囲内で
あろう。典型的には、用量が目的とする効果に達するまで医師はエフジステロイ
ドを投与するであろう。この治療法の進め方は、誘発されたポリペプチドの活性
や存在を通常の試験法で容易にモニターされる。
所望のポリペプチド又は核酸をコード化したDNA配列の発現を促進するように
位置ぎめされたエツジステロイドDNA結合領域及び入手できるエフジステロイ
ドレセプターが標的細胞集団内にあるときは、エフジステロイド組成物は形質転
換哺乳類又は形質転換哺乳類細胞培養物に投与される。DHR23αのようなエ
フジステロイドレセプターは、エツジステロイドレセプターDNA結合部位を含
む遺伝子の転写を有力かつ選択的調節剤として作用する。DHR23αのような
エフジステロイドの活性は、そのDNA結合又はトランスアクチベーション領域
を他の天然に存在する遺伝子で置換することにより更に修飾することが出来、そ
れによってエフジステロイドは池の天然に存在する遺伝子やその生産する生成物
をコントロールすることを容易とする。しかしキメラ型のエフジステロイドレセ
プターは尚も同様のリガンドを結合−し、それらは融合トランスアクチベーショ
ン領域で特定化された異種DNA結合領域で特定化した遺伝子の発現を誘発する
。
哺乳類細胞の形質転換は標準的方法を用いて達成される。形質転換哺乳類細胞に
適するベクターは、哺乳類細胞で発現しつるウィルス及び哺乳類DNAを包含す
る。
以下に実施例を限定の目的でなく説明の目的のために記載する。
実施例I DHR23αコード化DNAのクローニング部分的DHR23配列(
W、S eegraves、論文、スタッフォード大学[1988])にもとづ
くオリゴヌクレオチド・プローブを、ショウジヨウバエの初期のサナギの幼虫か
ら得たcDNAライブラリーをスクリーニングするために使用する。DHR23
αクローンの推定アミノ酸配列を図IAに示す。DHR23αとステロイドレセ
プタースーパーファミリーのうちの他のもの5間の相同性の最も高い領域は、D
NA結合領域に対応するシスティンに富んだ領域(残基264−329)中に見
出される(図IB)。推定リガンド結合領域は、レチノイン酸及び甲状腺ホルモ
ンレセプター並びにビタミンDレセプターとの限定された相同性を共有する。
N−末端領域(残既1−263)は、どんなステロイドレセプターとも顕著な相
同性を共存しない。本発明者はさらに、示差スプライソングによって起ると思わ
れるこの蛋白の第二の形態(DIR23β)を同定した。DHR23βは、DN
Aやリガンド結合領域においてDHR23αと同一であるが、但し234コのア
ミノ酸の無関係のN−末端領域をもっている。
図IAはDHR23αcDNΔクローンのヌクレオチド及び誘導アミノ酸配列を
示す。左と右の数字はそれぞれヌクレオチド及びアミノ酸残基をあられす。上流
のイン−フレーム(in−frame)停止コドンはアンダーラインをつけてあ
り、開始コドンとして選ばれる。イニシエーターのメチオニンは、翻訳開始のた
めのショウジヨウバエ共通配列と一致する。推定DNA結合領域に対応する保存
アミノ酸はアンダーラインをつけである。DIR23αクローン全体を単離する
ために、ンヨウノヨウバエの三齢幼虫ライブラリーからの〜60.000ファー
ジを、Seegraves(スタッフォード大学論文、1988)の部分DHR
23a配列の109〜158及び1820〜1869ヌクレオチドに対応する2
つの5 Q−marオリゴヌクレオチドでスクリーニングした。8つの明瞭なり
ローンが単離され、PCR分析でさらに特徴づけられ、そして2つの最大の挿入
断片が決定された。配列決定の結果を図IAに示す。
案施例2 @乳類細胞におけるDHR23aポリペプチドの発現と活性本発明者
は、ネズミの哺乳類腫瘍ウィルス(MTV)プロモーター及びクロラムフェニコ
ール・アセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子に結合したEcREsを含
むリポータ−遺伝子の転写を促進するエフジステロイドで処理した哺乳類細胞の
中で、DHR23αが機能できるか否かを決定した。ヒトの293の細胞を、D
HR23αをエンコードしたR3Vにもとづ(発現ベクター及びMTVプロモー
ターとCATの構築に結合したショウジヨウバエH327プロモーター(G。
Riddihough及びH,R,B、Pelham、EMBOJ、旦、372
9[1987])からのエクジソン応答要素(EcRE)の4つのコピーを含む
リポータ−遺伝子Ec4M−7?C○とで共トランスフェクションした。エフジ
ステロイドα又は2O−OHエクジソンポリボジンB1ポナステロンA又はムリ
ステロンAと共に、又はなしで培養した細胞からの抽出物の中でCAT活性を測
定した。α−エクジソン、20−OHエクジソン及びボリボジンBの何れもが、
哺乳類細胞中でDHR23αのアゴニストとして作用しなかった。反対に、ムリ
ステロンへで処理した細胞の中ではリポータ−遺伝子の発現は著しく増大し、な
おポナステロンA処理の場合はその程度がすこし小さかった(図2)。この誘発
はリポータ−遺伝子中のEcREの存在に依存する。何故ならばDHR23αは
、グルココルチコイド・レセプター(GRE、図2)か又はエストロゲンレセプ
ター(ERE、図6)との結合部位を含むリポータ−遺伝子の発現を調節しない
からである。すなわち哺乳類細胞ではDHR23αは、リポータ−遺伝子を含む
EcREからの発現を選択的に促進するためにエフジステロイド依存的に作用す
る。
特定のエクジステロイ′ドは哺乳類細胞内のDHR23αレセプターのアゴニス
トである。ヒトの293の細胞を、2.5μgの発現プラスミドpR3V、DH
R23α又は親発現プラスミドpR8V(コントロール)及び0.5μgsのリ
ポータ−プラスミドpEcnM−ttco(EcRE)若くはI)04M−77
CO(GRE)で共トランスフェクションする。トランスフェクション効率のコ
ントロールとして、コントロールプラスミドpR8V、hGHo、5μgsをト
ランスフェクション混合物中に含める。l・ランスフエクションの後に、細胞を
α−エクジソン(alpha)、2O−OHエクジソン(20−OH)、ボリポ
ジンB (pp B )、ポナステロンA(ponA)又はムリステロインA(
murA)と共に、又はなしで(−)処理する。すべてのりガント補候は1μM
11度で添加する。CAT抽出物をトランスフェクションのあと48時間培養し
、アッセイをり、 R,Cavener、Nucl、 Ac1ds Res、1
5.1353−13601987)に記載のようにして行う。数値は、hGHの
発現に標準化し、3つの独立した実験の平均値を図2に示す。誘発倍数とは、添
加リガンドの不存在下に培養した細胞の抽出物中のリポータ−遺伝子の発現で分
けたホルモンで培養した細胞中の該リポータ−遺伝子の発現レベルを表わす。
DHR23αの活性に対する哺乳類ホルモンの影響を図3に示す。細胞をDIR
23α発現ベクターとEc4M、、Coリポータ−遺伝子でトランスフェクトし
、そして次のホルモン(1μM)と共に、又はなしで(−)処理する。
すなわちムリステロンA(murA)、デキサメサゾン(Dex)、17β−エ
ストラジオール(E2)、アルドステロン(Aldo)、コルチコステロン(C
art)、ヒドロキシコルチコステロン(OH−Cort)、甲状腺ホルモン(
T3)、プロメゲストン(Pr。
meg)又は1,25−ジヒドロキシビタミンDs(VD3)。図2について上
述したようにしてリポータ−遺伝子活性を測定した。レチノイン酸はまたDHR
23αのアゴニストとして作用しなかった。
キメラ遺伝子構築及び得られた発現レセプター蛋白のウェスタンプロットの図式
的表現を図4A及びIBに示す。図4八でレセプター構築はそのn−末端トラン
スアクチベーンヨンの起源DNA結合及びリガンド結合領域を記載した三部分命
名法に従フて示しである。“G”及び“Ec”はそれぞれグルココルチコイドレ
セプター及びDHR23αをあられす。“E”は、DNA結合特異性をエストロ
ゲンレセプターのそれに変える(K、 Umesono 及びR,Evans、
Ce1l 57,1139 [1989];M、 Danielsen、 L、
Hinck 及びG、 Ringold、Ce11.5ユ、1131[198
9])2コのアミノ酸置換(G458E及び5459G)によるラット・グルコ
コルチコイド・レセプターDNA結合領域の誘導体をあられす。“X”(枠内の
)はEscherichia coli LexA蛋白のDNA結合領域(アミ
ノ酸1〜87)をあられす。“V”(影付き枠内)は、アミノ酸(153−40
6)がH5VVP16蛋白(アミノ酸411−490)の転写活性領域で置換さ
れたGRN−末端領域の誘導体をあられす。GGEc構築は、GGG(アミノ酸
528−795)のりガント結合領域をDHR23α(アミノ酸329−878
)のリガンド結合領域で置換して構築した。同様に、GXEcの構築のためには
、GXGのリガンド結合領域(P、J、 Godowski、D、Picard
及びに、 R,Yan+amoto、5cience 241.812[19
88]ではNLxCとなっている)をDHR23aリガンド結合領域で置換した
。
図4Bでは、トランスフェクトした細胞のレセプター蛋白の蓄積は、酵素結合抗
体で検出したウェスタンプロットで示しである。全細胞抽出物は、次の融合蛋白
をコード化したレセプター発現プラスミドでトランスフェクトして48時間後に
作った。すなわちレーン1.EcEcEc;レーン2.GGG;レーン3.GG
Ec;レーン4.VGEc:レーン5.G″E″G;レーン6、G”E″Ec:
レーン7.GXG:レーン8.GXEc;レーン9.VXEc、 プロットは、
ラットのグルココルチコイド・レセプター(30)のN−末端領域のエピドーム
を認識するモノクローナル抗体BuGR2と反応させ、次いでセイヨウワサビ・
パーオキシダーゼとカップルしたマウス抗体に対するヒツジ抗血清と反応させる
。分子マーカーの位置が示しである。
レセプター蛋白で誘発した転写物のRNase保護分析を図5に示す。全RNA
は、DHR23(Z(ECECEC)、GGG又はGGEc及びリポータ−遺伝
子G4M−7tGoでコード化した発現プラスミドでトランスフェクトした48
時あとで細胞から製造する。このリポータ−遺伝子に、MTVプロモーター・ヒ
ト生長ホルモン遺伝子構築の一77位で融合された4つのGREsを含んでいる
。アッセイには全RNAの50βgsを用いた。04M−7?COの377塩基
保護バンド位置及び内部コントロール遺伝子からの294塩基保護バンド(CM
Vエンハンサ−/プロモーター構築からの発現)を夫々黒及び白の矢印で示す。
キメラ・レセプターによるEREsの誘発を図6に示す。細胞は、MTvプロモ
ーターに融合した4つのEREsを含むところのE4M−,7Co及びDHR2
3α(ECECEC)、G”E”G又はG”E”Ecのうちの何れかをコード化
した発現プラスミドでトランスフェクトされた。細胞はムリステロンA(M)又
はデキサメサゾン(D)と共に、又はなしで(−)培養した。リポータ−遺伝子
活性を、上述の図2について述べたようにして測定した。
以下の表1にキメラレセプターによるグルココルチコイド・レセプター(GRE
)応答遺伝子の誘発を示す。293の細胞を、指示したレセプター蛋白及びリポ
ータ−遺伝子G4M、□COでコード化したエフェクター・プラスミドをトラン
スフェクトした。これらのトランスフェクトされた細胞は、添加ホルモンなしく
−)か、ムリステロンA(M)と共にか又はdex(D)と共に培養した。リポ
ータ−遺伝子活性は、上記図2で述べたようにしてめた。「誘発倍数」とは、添
加リガンドの不存在下に培養した細胞からの抽出物中のリポータ−遺伝子の発現
で分けられたホルモンで培養した細胞の該リポータ−遺伝子の発現のレベルを表
わすものである。
表1 キメラレセプターによるグルココルチコイドレセプターの誘発レセプター
−M D
EcEcEc 1.0(領2) 0.9(0,2) NTGGG 1.0(0,
3) 1.0(0,3) 347GGEc 1.7(領3) 798(57)
NTVGEc 4.7(0,8) 3117(240) NTレセプター・Le
x融合蛋白による転写活性を表2に示す。指示レセプター蛋白をコードしたエフ
ェクター・プラスミドは、1ex−オペレーターを含有する(X4C−sscO
)か又は欠除する(QC−*5CO)リポータ−遺伝子でトランスフェクトされ
た。「対照」とは、レセプターcDNAを含まない「エフェクター」プラスミド
でトランスフェクトされた細胞をあられす。細胞はムリステロンAと共に(+)
又はなしで(−)培養した。誘発倍数は既述のようにしてめた。標準偏差をカッ
コ内に示す。
表2 キメラレセプターによる転写活性X 4C−s s COOC−s s
COレセプター −+
対照 1.0(0,3) 1.1(0,3) 1.0(0,2) 1.1(0,
4)EcEcEc 1.2(0,2) 1.4(0,1) NT NTGXG
1.0(0,1) 1.1(0,2) NT NTG X Ec 1.0(0,
2) 44.3(8,3) 0.7(0,2) 0.9(0,3)VXEc 4
.7(1,3) 563 (61) 0.8(0,4) 1.0(0,2)本発
明は好ましい実施態様について必要的に記述してきたけれども、この明細書を読
んだ当業者はその精神と範囲から逸脱することなく、ここに記載の内容について
種々の変更、均等物の置換及び改変をなし得るであろう。従って、本発明はここ
に特異的に記述した以外の方法で実施することができる。その故にここに特許証
によって与えられる保護は、添付の特許請求の範囲とその均等範囲によってのみ
限定をうける。
配列表
(1)一般的情報
(i) 特許出願人:ジェネンテク、インコーポレイテッド(ii) 発明の名
称:哺乳類の細胞における遺伝子のエフジステロイド依存調節
(iii)配列の数=1
(iv) 連絡先・
(^)名宛人:ジェネンテク、インコーポレイテッド(B)通り、ポイント・サ
ン・ブルーノ・ブールバード460番(C)市:サウス・サン・フラッジスコ(
D)州:カリフォルニア
(E)国、アメリカ合衆国
(F)ZIP:94080
(V)コンピューター解読書式:
(^)媒体型:5.25インチ、360Kbフロツピーデイスク(B)コンピュ
ーター+IBMPC適合(C)オペレーティング・システム: PC−DO8/
MS−DO8(D)ソフトウェア: patin (ジェネンテク)(vfi)
本出願のデータ:
(^)出願番号、未 定
(B)出願日:1992年8月3日
(0分類:未 定
(viii)弁理士/代理人情報:
(A) 氏名: フィッツ、リニー・エイ(B)登録番号:35.136
(C)参照/整理番号二607
(ix)電話連絡先情報:
(^)電話番号:415/225−1489(B)ファックス番号: 415/
952−9881(C)テレックス番号: 910/371−7168(2)配
列番号1の情報
(i)配列の特徴:
(^)長さ・2970塩基
(B)型:核酸
(C) Hの数ニー末鎖
(D)トポロジー・直鎖状
(xi)配列:配列番号I
AAGCTTCTTG TCCCCAGCCG ACGCTAAGTG AAC
GGAAAACGGCCACAAAA 50CGGCGACTAT CGGCT
GCCAG AGG ATG AAG CGG CGCTGG TCG 91M
et Lys Arg Arg Trp SerAACAACGGCGGCTT
CATG CGCCTA CCG GAG GAG TCG TCC130^s
n AsnGly Gly Phe IJet Arg Leu Pro Gl
u Glu Ser SerTCG GAG GTCACG TCCTCC丁C
G AACGGG CTCGTCCTG CCC169Ser Glu Val
Thr Ser Ser Ser Asn Gly Leu Val Leu
Pr。
TCG GGG CTG AACATG TCG CCCTCG TCG CT
G GACTCG CAC208Ser Gly Val Asn Met S
er Pro Ser Ser Leu Asp Ser HisGACTAT
TGCGAT CAG GACCTT TGG CTCTGCGGCAACG
AG 247^sp Tyr Cys Asp Gin Asp Leu Tr
p Leu Cys Gly Asn GluTCCGGT TCG m GG
CGGCTCCAACGGCCAT GGCCTA AAT 286Ser G
ly Ser Phe Gly Gly Ser Asn Gly阻s Gly
Leu AsnCAG CAG CAG CAG AGCGTCATCACG
CTGα℃^TG CACGGG 325Gin Gin Gin Gin
Ser Val Ile Thr Leu Ala Met His GlyT
GCTCCAGCACT CTG CCCGCG CAG ACA ACCAT
CATT CCG 364Cys Ser Ser Thr LeiIPro
Ala Gin Thr Thr Ile Ile Pr。
ATCAACGGCAACGCG AAT GGG AAT GGA GGCT
CCACC^^T40311e Asn Gly Asn Ala Asn G
ly Asn Gly Gly Ser Thr AsnGGCCAA TAT
GTG CCG GGT GCCACCAAT CTG GGA GCG T
rG 442Gly Gin Tyr Val Pro Gly^la Thr
Asn Leu Gly Ala LeuGCCAACGGG ATG CT
CAAT GGG GGCCTCAAT GGA ATG CAG 481Al
a Asn Gly Met Leu Asn Gly Gly Leu As
n Gly Met G1nCAA CAG ATT CAG AAT GGC
CACGGCCTCATCAACTCCACA 520Gin Gin Ile
Gin Asn Gly His Gly Leu Ile Asn Ser
ThrACG CCCTCA ACG CCG ACCACCCCG CTC
CACCTT CAG CAG 559Thr Pro Ser Thr Pr
o Thr Thr Pro Leu His Leu Gin G1nAAC
CTG GGG GGCGCG GGCGGCGGCGGT ATCGGG G
G^^TG 598^sn Leu Gly Gly Ala Gly Gly
Gly Gly Ile Gly Gly MetGGT ATT CTr
CACCACGCG AAT GGCACCCCA AAT GGCCTr 6
37Gly lie Leu His Ir1s Ala Asn Gly T
hr Pro^sn Gly LeuATCGGA GTr GTG GGA
GGCGGCGGCGGA GTA GGT CTT GGA 67611e
Gly Val Val Gly Gly Gly Gly Gly Val
Gly Leu GlyGTA GGCGGA GGCGGA GTG GGA
GGCCTG GGA ATG CAG CAC715Val Gly Gl
y Gly Gly Val Gly Gly Leu Gly Met Gi
n HisACA CCCCGA AGCGAT TCG GTG A訂TCT
ATA TCT TCA GGT 754Thr Pro^rg Ser A
sp Ser Val Asn Ser Ile Ser Ser GlyCG
CGAT GAT CTCTCG CCT TCG AGCAGCTTG AA
CGGA TAC793Arg Asp Asp Leu Ser Pro S
er Ser Ser Leu Asn Gly Tyr特表平7−50192
8 (1Q)
TCG GCG^^CGAA AGCTGCGAT GCG AAG AAG
AGCAAG AAG 832Ser Ala Asn Glu Ser Cy
s Asp^la Lys Lys Ser Lys LysGGA CCT
GCG CCA CGG GTG CAA GAG GAG CTG TGCC
TG GTT 871Gly Pro^la Pro Arg Val Gin
Glu Glu Leu Cys Leu Va1TGCGGCGACAGG
GCCTCCGGCTACCACTACAAG GCCCTC910Cys
Gly Asp Arg^la Ser Gly Tyr His Tyr A
sn Ala Leu^CCTGT GAG GGCTGCAAG GGG 丁
TCm CGA CGCAGCGTr 949Thr Cys Glu Gly
Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Va1
ACG AAG AGCGCCGTCTACTGCTGCAAG TrCGGG
α;CGCC988Thr Lys Ser Ala Van、 Tyr Cy
s Cys Lys Phe Gly Arg AlaTGCG^^ATG G
ACATG TACATG AGG CGA AAG TGT CAG GAG
1027Cys Glu Met Asp Met Tyr Met Arg
Arg Lys Cys Gin GluTGCCGCCTG AAA AA
G TGCCTG GCCGTG GGT ATG CGG CCG 1066
Cys Arg Leu Lys Lys Cys Leu^la Val G
ly Met Arg Pr。
GAA TGCGTCGTCCCG GAG AACCAA TGT GCG
ATG AAG CGG 1105Glu Cys Val Val Pro
Glu Asn Gin Cys^la Met Lys ArgCGCGAA
AAG AAG GCCCAG AAG GAG AAG GAC^^A A
TG ACC1144^rg Glu Lys Lys Ala Gin Ly
s Glu Lys Asp Lys Met Thr^CT TCG CCG
AGCTCT CAG CAT GGCGGCAAT GGCAGCTTG
1183Thr Ser Pro Ser Ser Gin His Gly
Gly Asn Gly Ser LeuGCCTCT GGT GGCGGC
CAA GACTTT GTT AAG AAG GAG ATr 1222^
1a Ser Gly Gly Gly Gin Asp Phe Val L
ys Lys Glu l1eCTT GACC7丁 ATCACA TGCG
AG CCG CCCCAG CAT GCCACT 1261Leu Asp
Leu Met Thr Cys Glu Pro Pro Gin His
Ala Thr311t5 390 395
ATT CCG CTA CTA CCT GAT G^^^TA TTG G
CC^^G TGT CAA130011e Pro Leu Leu Pro
^sp Glu Ile Leu Ala Lys Cys G1nGCG C
GC^^丁 ATA CCT TCCTTA ACCTACAAT 、CAG
TTG GCC1339^1a Arg Asn Ile Pro Ser L
eu Thr Tyr Asn Gln Leu^1aGTT ATA TAC
AAG TTA ATT TGG TACCAG GAT GGCTAT GA
G 1378Val Ile Tyr Lys Leu Ile Trp Ty
r Gin Asp Gly Tyr GluCAG CCA TCT GAA
GAG GAT CTCAGG CGT ATA ATG AGT CAA1
417Gin Pro Ser Glu Glu Asp Leu Arg A
rg Ile Met Ser G1nCCCGAT GAG AACGAG
AGCCAA ACG GACGTCAGCTn CGG 1456Pro A
sp Glu Asn Glu Ser Gin Thr Asp Val、
Ser Phe ArgCAT AT^^CCGAG ATA ACCATA
CTCACG GTCCAG TTG ATT 1495)1is Ile T
hr Glu Ile Thr Ile Leu Thr Val Gin L
eu l1eGTT GAG TTT GCT AAA GGT CTA CC
A GCG TTT ACA AAG ATA 1534Val Glu Ph
e Ala Lys Gly Leu Pro^la Phe Thr Lys
l1eCCCCAG GAG GACCAG ATCACG TTA CT^
^^G GCCTGCTCG 1573Pro Gln Glu Asp G1
.n Ile Thr Leu Leu Lys^la Cys 5er490
495 、 500
TCG GAG GTG ATG ATG CTG CGT ATG GCA
CGA CGCTAT GAC1612Ser Glu Val Met Me
t Leu Arg Met^ia Arg Arg Tyr AspCACA
GCTCG GACTCA ATA TTCTTCGCG AAT AAT A
GA TCA 1651tlis Ser Ser Asp Ser Ile
Phe Phe Ala Asn Asn Arg 5erTAT ACG C
GG GAT 丁CT TACAAA ATCGCCGGA ATG GCT
GAT 1690Tyr Thr Arg Asp Ser Tyr 1.ys
Met^la、 Gly Met Ala AspAACATT GAA G
ACCTG CTG CAT TTCTGCCGCCAA ATG TTC17
29^sn Ile Glu Asp Leu Leu His Phe Cy
s Arg Gin Met PheTCG ATG AAG GTG GAC
AACGTCGAA TACGCG CTT CTCACT 1768Ser
Met Lys Val Asp Asn Vat Glu Tyr^1aLe
uLeu ThrGCC^TT GTG ATCTTCTCG GACCGG
CCG GGCCTG GAG AAG 1807^1a Ile Val I
le Phe Ser Asp Arg Pro Gly Leu Glu L
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CTACATCGAC1846Ala Gin Leu Val Glu Al
a Ile Gin Ser Tyr Tyr Ile Asp511!0 5
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ACG CTA CGCATT TAT ATA CTCAACCGCCACT
GCGGCGAC1g85Thr Leu Arg Ile Tyr Ile
Leu Asn Arg His Cys Gly AspTCA ATG A
GCCTCGTCTrCTACGCA AAG CTG CTCTCG ATC
1924Ser Met Ser Leu Vat Phe Tyr Ala
Lys Leu Leu Ser l1eCTCACCGAG CTG CGT
ACG C1’G GGCAACCAG 1.^CCC刀GAG 1963L
eu Thr Glu Leu Arg Thr Leu G]、y^sn G
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CTCAAA AACCGCAAA CTGα:ff 2002麗et Cys
Phe Ser Leu Lys Leu Lys Asn Arg Lys
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AAG TTCCTCGAG GAG ATCTGG GACGTT CAT
GCCATCCCG 2041Lys Phe Leu Glu Glu Il
e Trp Asp Val 1lis Ala Ile Pr。
匡^TCG GTCCAG TCG CACCTT CAG ATT ACCC
AG GAG GAG 2080Pro Ser Val Gin Ser H
is Leu Gin Ile Thr Gin Glu GluAACGAG
CGT CTCGAG CGG GCT GAG CGT ATG CGG
GCA TCG 2119Asn Glu Arg Leu Glu Arg^
la Glu Arg Met Arg^la 5erGTT GGG GGC
GCCATT ACCGCCGGCATT GAT TGCGACTCT 21
58Val Gly Gly^la Ile Thr^]、a Gly Ile
Asp Cys Asp 5erαI TCCACT TCG GCG GC
G GCA GCCGCG GCCCAG CAT CAG 2197^1a
Ser Thr Ser Ala^la Ala^la Ala^la Gin
His G1nCCT CAG CCT CAG CCCcAG CCCCA
^α:CTCCTCCCTG ACC2236Pro Gin Pro Gin
Pro Gin Pro Gin Pro Ser Ser Leu Thr
CAG AACGAT TCCCAG CACCAG ACA CAG CCG
CAG CTA CAA 2275Gin Asn Asp Ser Gin
His Gin 丁hr Gin Pro Gin Leu G1nCCT
CAG CTA CCAα:T CAA CTG CAA GGT CAA C
TG CAAα:C2314Pro Gin Leu Pro Pro Gin
Leu Gin Gly Gin Leu Gin Pr。
CAG CTCCAA CCA CAG CTT CAG ACG CAA C
TCCAG CCA CAG 2353Gin Leu Gin Pro Gi
n Leu Gin Thr Gin Leu Gin Pro G1nATT
CAA CCA CAG CCA CAG CTCCTT CCCGTCTC
CGCT CCC239211e Gin Pro Gin Pro Gin
Leu Leu Pro Val Ser Ala Pr。
GTG CCCGCCTCCGTA ACCGCA CCT GGT TCCT
TG TCCGCG 2431Val Pro^la Ser Val Thr
Ala Pro Gly Ser Leu Ser AlaGTCAGT A
CG AGCAGCGAA TACATG GGCGGA AGT GCG G
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t Gly Gly Ser Ala^1aATA GGA CCCATCAC
G CCG GCA ACCACCAGCAGT ATCACG 250911
e Gly Pro Ile Thr Pro^la Thr Thr Ser
Ser Ile ThrGCT GCCGTT ACCGCT AGCTCC
ACCACA TCA GCG GTA CCG 2548Ala Ala V
al Thr Ala Ser Ser Thr Thr Ser^la Va
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^TG GGCAACGGA GTT GGA GTCGGT GTT GGG
GTG GGCGGC25B7Met Gly Asn Gly Val G
ly val Gly Val Gly Val Gly GlyAACGTC
AGCATG TAT GCG AAG CCCCAG ACG GCG AT
G GCC2626^sn Val Ser Met Tyr^la Lys
Pro Gin Thr Ala l1et AlaTTG ATG GGT
GTA GCCCTG CAT TCG CACCAA GAG CAG CT
r 2665Leu Met Gly Val Ala Leu His Se
r His Gin Glu Gin LeuATCGGG GGA GTG
GCG GTT AAG TCG GAG CACTCG ACG ACT 2
70411e Gly Gly Val^la Val Lys Ser Gl
u His Ser Thr ThrGCA TAG CAGGCGCAGA
GTCAGCTCCA CCAACATCACCACCAC^ACA 2750
la
TCGACGTCCT GCTGGAGTAG AAAGCGCAGCTGAA
CCCACA CAGACAT^GG 2800GGAAATGGGG AAG
TrCTCTCCAGAGAGTTCGAGr、CGA^CT^^ATAGT^
^A 2850AAGTGAATAA TrAATGGACA AGCGTAA
AAT GCAGnAm AGTCTTAAGC2900CTGCAAATAT
TAαゴATTAT TCATACAAAT T^^CATATAA TAC
AGCCTAT 2950TAACAATrACGCT^^AGCTr 297
0AAGCTrCTTG TCCCCAGCCG ACGCTAAGTG AA
CGGAAAACGGCCACAAAA 50CGGCGACTAT CGGC
TGCCAG AGG ATG AAG CGG CGCTGG TCG 91
FIG、 IA−1
FIG、 IA−2
GCCTCT GGT GGCGGCCM GACTTT GTT AAG M
G GAG ATT 1222ATT CCG CTA CTA CCT GA
T GM ATA TTG GCCAAG TGT CM 1300GTT A
TA TACAAG TTA ATT TGG TACCAG GAT GGC
TAT GAG 1378CAG CCA TCT GM GAG GAT C
TCAGG CGT ATA ATG AGT CM 1417CAT ATA
ACCGAG ATA ACCATA CTCACG GTCCAG TTG
ATT 1495His Ile Thr Glu Ile Thr Ile
Leu Thr Val Gin Leu l1eGTT GAG TTT
GCT AAA GGT CTA CCA GCG TTT ACA MG A
TA 1534TCGACGTCCT GCTGGAGTAG AAAGCGC
AGCTGMCCCACA CAGACATAGG 2800GGAAATGG
GG AAGTTCTCTCCAGAGAGTTCGAGCCGAACT AA
ATAGTAM 2850AAGTGMTAA TTMTGGACA AGCG
TAMAT GCAGTTATTT AGTCTTAAGC2900CTGCM
ATAT TACCTATTAT TCATACAAAT TAACATATA
A TACAGCCTAT 2950TAACAATTACGCTAAAGCT
T 2970FIG、 IA−6
■口口
■り寸Cr)(′V、IT−
レーン レセプター 活性化 DNA リガンドFIG、 4A
FIG、 4B
□レセプター −一一一一一一一一一一一0H
Claims (27)
- 1.エクジステロイドを哺乳類の細胞内でエクジステロイド・レセプターポリペ プチドと接触させることからなる哺乳動物細胞内で遺伝子発現を誘発する方法で あって、該哺乳類細胞がそのリガンド・エクジステロイドと一緒のときは該エク ジステロイド・レセプターのためのDNA結合配列を更に含んでいること、およ びレセプター・リガンド−DNA結合配列複合物の生成が遺伝子発現を誘発する ことから成る方法。
- 2.該エクジステロイドが25−水酸基を含まない請求項1の方法。
- 3.該エクジステロイドが5位に電子求引性基を含む請求項2の方法。
- 4.該エクジステロイドが11位に電子求引性基を含む請求項2の方法。
- 5.該電子求引性基がヒドロキシル、ケトン、スルフヒドラル、ナイトレート、 ナイトライト、フッ素、臭素、ヨウ素及び塩素より成る群から選ばれる請求項3 の法。
- 6.該電子求引性基がヒドロキシル、ケトン、スルフヒドラル、ナイトレート、 ナイトライト、フッ素、臭素、ヨウ素及び塩素より成る群から選ばれる請求項4 の方法。
- 7.該エクジステロイドがムリステロンA、5−デヒドロキシムリステロンA、 11−デヒドロキシムリステロンA及びポナステロンより成る群から選ばれる請 求項2の方法。
- 8.該DNA結合配列が更に真核生物遺伝子をコードしたDNA配列を含んでい る請求項1の方法。
- 9.該真核生物遺伝子が、サイトカイン、酵素、構造ポリペプチド、DNA及び RNAより成る群から選ばれたポリペプチド又は核酸をコード化している請求項 8の方法。
- 10.該サイトカインが成長ホルモン、インスリン様成長因子、インターロイキ ン、ヒト成長ホルモン、N−メチオニル・ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン 、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、レラキシン、 プロレラキシン、糖蛋白ホルモンたとえば濾胞刺戟ホルモン(FSH)、甲状腺 刺戟ホルモン(TSH)、副甲状腺ホルモン及び黄体形成ホルモン(LH)、造 血成長因子、肝成長因子、繊維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲ ン、腫瘍壊死因子−α及び−β、ムレリアン阻害物質、マウス・ゴナドトロピン 関連ペプチド、グルカゴン、インヒビン、アクチビン、血管内皮細胞成長因子、 インテグリン、トロンボポイエチン、エリスロポイエチン、神経成長因子たとえ ばNGF−β、血小板成長因子、造血成長因子、組織因子蛋白、ムレリアン阻害 物質、マウス・ゴナドトロピン関連ペプチド、トランスフォーミング成長因子( TGF)たとえばTGF−α及びTGF−β、インスリン様成長因子−I及び− II、潜在性関連ペプチド、エリスロポイエチン、骨誘発性因子、インターフェ ロン−α,−β及び−γ、コロニー刺戟因子(CSF)M−CSF、GM−CS F及びG−CSF、インターロイキン(ILs)IL−1,IL−2,IL−3 ,IL−4,IL−5,IL−6,IL−7,IL−8及びその他のポリペプチ ド因子から選ばれる請求項8の方法。
- 11.該酵素が組織プラスミノーゲン・アクチバーゼ(TPA)、ウロキナーゼ 、エラスターゼ、アデノシンデアミナーゼ、ボンベシン、因子IX、因子VII I、トロンビン、エンケファリナーゼ、β−ラクタマ−ゼ、スーパーオキシド、 ジスムターゼ、逆転写酵素、RNアーゼ、DNアーゼ、あるいは糖分解、クレブ スサイクル、糖新生、尿素サイクル、酸化的リン酸化を触媒する酵素、またはプ リン類、ピリミジン類、核酸ポリマー類、コレステロール、蛋白、グリコゲン、 脂肪酸、炭水化物、燐脂質、糖蛋白ないしは脂質を合成または分解する酵素から 選ばれる請求項8の方法。
- 12.該構造ポリペプチドが肺界面活性物質、アルブミン、抗体、担体蛋白、輸 送蛋白、糖蛋白ホルモンレセプター、CD−4、インスリン様成長因子が結合す る蛋白、カルシトニン、因子VIII、抗体、蛋白A又はD、リウマチ因子、ウ イルス抗原、HIVエンベロープ蛋白GP−120ならびにGP−140、免疫 グロブリン、血清蛋白及びすべての細胞骨格ポリペプチドから選ばれる請求項8 の方法。
- 13.該核酸がDNA及びRNAである請求項8の方法。
- 14.該哺乳類細胞が哺乳動物のなかにある請求項1の方法。
- 15.該哺乳動物がヒトである請求項14の方法。
- 16.以下から成る、所望の蛋白の製造方法、すなわちa)エクジステロイドを 哺乳類の細胞内で、そしてエクジステロイド・レセプターとリガンドの複合体の 転写調節下でエクジステロイド・レセプターポリペプチドと接触させること、但 しこゝに該哺乳類の細胞は更に(1)そのリガンド・エクジステロイドと一緒の ときは該エクジステロイドレセプクーの結合特異性をもつ第一のDNA結合配列 及び(2)該DNA結合配列と異種の所望の蛋白をコード化した第二のDNA配 列を含むものとし;そしてb)該細胞を培養しそして該所望の蛋白を生産するこ と。
- 17.該哺乳類の細胞が哺乳動物のなかにある請求項16の方法。
- 18.該所望の蛋白がサイトカイン類、酵素及び構造ポリペプチドから選ばれた ものである請求項16の方法。
- 19.該エクジステロイドがムリステロンA、5−デヒドロキシムリステロンA 、11−デヒドロキシムリステロンA及びポナステロンから選ばれたものである 請求項16の方法。
- 20.以下から成る、形質転換哺乳動物の内因性又は異種遺伝子の調節方法、す なわち a)エクジステロイドを哺乳類の細胞内で、そしてエクジステロイド・レセプタ ーとリガンドの複合体の転写調節下でエクジステロイド・レセプターポリペプチ ドと接触させること、但しここに該哺乳類の細胞は更に(1)そのリガンド・エ クジステロイドと一緒のときは該エクジステロイドレセプターの結合特異性をも つ第一のDNA結合配列及び(2)該DNA結合配列と異種の所望の遺伝子産物 をコード化した第二のDNA配列を含むものとし;そしてb)該細胞を培養しそ して該所望の遺伝子産物を生産すること。
- 21.該エクジステロイドレセプターがムリステロンAとの結合親和性をもって いる請求項20の方法。
- 22.該エクジステロイドが25位に水酸基をもっていない請求項20の方法。
- 23.該エクジステロイドかムリステロンA、5−デヒドロキシムリステロンA 、11−デヒドロキシムリステロンA及びポナステロンから選ばれたものである 請求項22の方法。
- 24.以下から成る、哺乳類の細胞に異種のポリペプチドをコード化したDNA 配列を含む該哺乳類の細胞の中で、そしてエクジステロイド・レセプターの転写 調節下で、遺伝子発現を調節する方法、すなわちa)該哺乳類の細胞を形質転換 してエクジステロイド・レセプター融合ポリペプチドを発現すること、但しここ に該融合ポリペプチドは異種トランスアクチベーション領域を含むものとし;そ して b)該形質転換された哺乳類の細胞を、該エクジステロイドレセプターを活性化 するエクジステロイドと接触させること。
- 25.該トランスアクチベーション領域がヘルペスウイルスVP16酸性活性化 領域、lexA、c−fos、GAL4及びc−mycから選ばれたものである 請求項24の方法。
- 26.該エクジステロイドがムリステロンA、5−デヒドロキシムリステロンA 、11−デヒドロキシムリステロンA及びポナステロンから選ばれたものである 請求項24の方法。
- 27.該エクジステロイド・レセプターがDHR23αである請求項24の方法 。
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