PT2077279E

PT2077279E - Moléculas do receptor de linfopoietina estromal tímica e suas utilizações

Info

Publication number: PT2077279E
Application number: PT08022206T
Authority: PT
Inventors: Christiaan M Saris; Ming-Shi Chang
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2000-06-28
Filing date: 2001-06-28
Publication date: 2012-09-14
Also published as: EP1294879A2; CY1113145T1; US8344110B2; US20020068323A1; EP2077279A1; US20110305705A1; US20130084290A1; DK2077279T3; CA2413673A1; US8911730B2; JP2004519205A; AU7026601A; US7964713B2; AU2001270266B2; CA2413673C; ES2391124T3; WO2002000724A2; EP1294879B1; ES2317917T3; WO2002000724A3

Description

DESCRIÇÃO

"MOLÉCULAS DO RECEPTOR DE LINFOPOIETINA ESTROMAL TÍMICA E SUAS UTILIZAÇÕES"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se à utilização de um anticorpo antagonista ou seu fragmento que inibe a ligação de linfopoietina estromal timica (TSLP) ao polipéptido do receptor da linfopoietina estromal timica (TSLPR) in vitro. A invenção também se refere à utilização do referido anticorpo antagonista ou seu fragmento na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença, distúrbio ou estado relacionado com TSLP. A invenção também se refere ao referido anticorpo antagonista ou seu fragmento para utilização no tratamento de uma doença, distúrbio ou estado relacionado com TSLP.

Antecedentes da Invenção

Os avanços técnicos na identificação, clonagem, expressão e manipulação de moléculas de ácido nucleico e a decifração do genoma humano aceleraram grandemente a identificação de novas terapêuticas. As técnicas de rápida sequenciação de ácido nucleico podem, agora, produzir informação de sequência a velocidades sem precedentes e, ligadas com as análises computacionais, permitem o agrupamento de sequências de sobreposição em genomas parciais e integrais e a identificação de regiões codificando polipéptidos. Uma comparação de uma 1 sequência de aminoácidos prevista contra uma compilação de base de dados de sequências de aminoácidos conhecidas permite a determinação da extensão de homologia com sequências e/ou marcos estruturais anteriormente identificados. A clonagem e expressão de uma região codificando polipéptido de uma molécula de ácido nucleico proporciona um produto polipeptidico para análises estruturais e funcionais. A manipulação de moléculas de ácido nucleico e polipéptidos codificados pode conferir propriedades vantajosas num produto para utilização como um fármaco.

Apesar dos avanços técnicos na investigação genómica ao longo da última década, o potencial para o desenvolvimento de novas terapêuticas baseadas no genoma humano está ainda largamente não realizado. Muitos genes codificando terapêuticas polipeptidicas potencialmente benéficas ou aqueles codificando polipéptidos que podem actuar como "alvos" para moléculas terapêuticas, ainda não foram identificados. Consequentemente, são divulgados polipéptidos e moléculas de ácido nucleico codificando os mesmos que têm benefício diagnóstico ou terapêutico.

As citocinas regulam uma variedade de respostas celulares, incluindo proliferação, diferenciação e sobrevivência. Entre as diferentes classes de citocinas estão as citocinas de tipo I, que formam quatro estruturas de feixes helicoidais α que exibem uma topologia cima-cima-baixo-baixo (Bazan, 1990, Immunol. Today 11:350-54; Leonard e 0'Shea, 1998, Annu. Rev. Immunol. 16:293-322; Leonard, Fundamental Immunology 741-74 (Paul, ed., Lippincott Raven Publishers 4 ed., 1999)). As citocinas de tipo I incluem muitas interleucinas, tais como IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, EL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13 e IL-15, assim como outras moléculas hematologicamente activas, tais como GM-CSF, 2 eritropoietina, trombopoietina e moléculas, tais como hormona do crescimento e prolactina. A sinalização por citocina de tipo I envolve a interacção com homodímeros, heterodímeros ou oligómeros receptores de ordem superior da superfamília do receptor de citocina de tipo I. A ligação de ligando induz a dimerização ou oligomerização de ordem superior, resultando na sinalização a jusante envolvendo, em parte, a via Jak-STAT (Bazan, supra; Leonard e 0'Shea, supra; Leonard, supra). A linfopoietina estromal tímica (TSLP) é uma citocina cujas actividades biológicas se sobrepõem com as de IL-7. Por exemplo, a TSLP e IL-7 induzem a fosforilação de tirosina do factor de transcrição Stat5 (Isaksen et al., 1999, J. Immunol. 163:5971-77). A actividade de TSLP foi originalmente identificada no meio condicionado de uma linha celular estromal tímica que suportava o desenvolvimento de células B IgM+ murinas a partir de células progenitoras hematopoiéticas de fígado fetal (Friend et al., 1994 Exp. Hematol. 22:321-28). Além disso, a TSLP pode promover a linfopoiese de célula B em culturas de medula óssea de longo prazo e pode co-estimular timócitos e células T maduras (Friend et al., supra; Levin et al., 1999, J. Immunol. 162:677-83) . A TSLP também pode servir como um sinal extrínseco para rearranjar, de um modo específico, o lócus gama do receptor de células T (Candeias et al., 1997, Immunol. Lett. 57:9-14). Deste modo, o isolamento e caracterização do receptor de citocina para TSLP permitiriam a identificação de compostos úteis no tratamento de doenças ou estados relacionados com TSLP, tais como aqueles afectando o desenvolvimento de células B, desenvolvimento de células T, rearranjo do gene do receptor de células T ou a regulação do factor de transcrição Stat5. 3

Sumário da Invenção A invenção refere-se às seguintes formas de realização: 1. Utilização de um anticorpo antagonista ou seu fragmento que se liga especificamente ao polipéptido da SEQ ID N°: 6, para inibição da ligação da linfopoietina estromal timica (TSLP) ao receptor da linfopoietina estromal timica (TSLPR) in vitro. 2. Utilização de um anticorpo antagonista ou seu fragmento que se liga especificamente ao polipéptido da SEQ ID N°: 6 e que é capaz de inibir a ligação da linfopoietina estromal timica (TSLP) ao receptor da linfopoietina estromal timica (TSLPR), na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença, distúrbio ou estado relacionado com TSLP. 3. Anticorpo antagonista ou seu fragmento que se liga especif icamente ao polipéptido da SEQ ID N°: 6 e que é capaz de inibir a ligação da linfopoietina estromal timica (TSLP) ao receptor da linfopoietina estromal timica (TSLPR), para a utilização no tratamento de uma doença, distúrbio ou estado relacionado com TSLP. 4. Utilização de um anticorpo antagonista ou seu fragmento dos itens 1 a 3, em que o anticorpo é um anticorpo humanizado. 5. Utilização de um anticorpo antagonista ou seu fragmento dos itens 1 a 3, em que o anticorpo é um anticorpo humano. 6. Utilização de um anticorpo antagonista de qualquer um dos itens 1 a 5, em que o fragmento de anticorpo compreende uma ou mais regiões variáveis do referido anticorpo. 4 7. Utilização de um anticorpo antagonista ou seu fragmento de acordo com qualquer um dos itens 1 a 3, para inibição da activação do factor de transcrição Stat5. São aqui divulgadas novas moléculas de ácido nucleico de TSLPR e polipéptidos codificados. A invenção proporciona uma molécula isolada de ácido nucleico, compreendendo uma sequência nucleotídica seleccionada do grupo consistindo de: (a) sequência nucleotídica como mostrada em qualquer das SEQ ID N° : 1, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 10 ou SEQ ID N°: 11; (b) sequência nucleotídica codificando o polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (c) sequência nucleotídica que se hibrida, sob condições moderada ou altamente estringentes, ao complemento de (b) ou (c); e (d) sequência nucleotídica complementar a (b) ou (c). É aqui divulgada uma molécula isolada de ácido nucleico, compreendendo uma sequência nucleotídica seleccionada do grupo consistindo de: (a) sequência nucleotídica codificando um polipéptido que é, pelo menos, cerca de 70 por cento idêntico ao polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8, em que o polipéptido codificado tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; 5 (b) sequência nucleotídica codificando um variante alélico ou variante de excisão da sequência nucleotídica como mostrada em qualquer das SEQ ID N° : 1, SEQ ID N° : 4, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 10 ou SEQ ID N°: 11 ou (a); (c) região da sequência nucleotídica de qualquer das SEQ ID N° : 1, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 10 ou SEQ ID N° : 11, (a) ou (b) codificando um fragmento polipeptídico de, pelo menos, cerca de 25 resíduos de aminoácidos, em que o fragmento polipeptídico tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N° : 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8, ou é antigénico; (d) região da sequência nucleotídica de qualquer das SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 10 ou SEQ ID N° : 11 ou qualquer de (a)- (c) compreendendo um fragmento de, pelo menos, cerca de 16 nucleótidos; (e) sequência nucleotídica que se híbrida, sob condições moderadamente ou altamente estringentes, ao complemento de qualquer de (a) - (d) ; e (f) sequência nucleotídica complementar a qualquer de (a) - (d) . É aqui divulgada uma molécula isolada de ácido nucleico, compreendendo uma sequência nucleotídica seleccionada do grupo consistindo de: (a) sequência nucleotídica codificando um polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma substituição conservativa de aminoácido, em que o polipéptido codificado tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; 6 (b) sequência nucleotídica codificando um polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma inserção de aminoácido, em que o polipéptido codificado tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (c) sequência nucleotídica codificando um polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma deleção de aminoácido, em que o polipéptido codificado tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (d) sequência nucleotídica codificando um polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 que tem um truncamento C- e/ou N-terminal, em que o polipéptido codificado tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (e) sequência nucleotídica codificando um polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma modificação seleccionada do grupo consistindo de substituições de aminoácidos, inserções de aminoácidos, deleções de aminoácidos, truncamento C-terminal e truncamento N-terminal, em que o polipéptido codificado tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (f) sequência nucleotídica de qualquer de (a) - (e) compreendendo um fragmento de, pelo menos, cerca de 16 nucleótidos; (g) sequência nucleotídica que se híbrida, sob condições moderadamente ou altamente estringentes, ao complemento de qualquer de (a) - (f); e 7 (h) sequência nucleotídica complementar a qualquer de (a) - (e) . É aqui divulgado um polipéptido isolado, compreendendo a sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8. É aqui divulgado um polipéptido isolado, compreendendo a sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo de: (a) sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 3, SEQ ID N° : 6 ou SEQ ID N°: 9, opcionalmente compreendendo, ainda, uma metionina amino-terminal; (b) sequência de aminoácidos para um ortólogo de qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (c) sequência de aminoácidos que é, pelo menos, cerca de 70 por cento idêntica à sequência de aminoácidos das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8, em que o polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (d) fragmento da sequência de aminoácidos mostrada em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 compreendendo, pelo menos, cerca de 25 resíduos de aminoácidos, em que o fragmento tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N° : 2, SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N° : 8 ou é antigénico; e (e) sequência de aminoácidos para um variante alélico ou variante de excisão da sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N° : 2, SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N° : 8 ou qualquer de (a) - (c) . É aqui divulgado um polipéptido isolado, compreendendo a sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo de: (a) sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma substituição conservativa de aminoácido, em que o polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (b) sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma inserção de aminoácido, em que o polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (c) sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma deleção de aminoácido, em que o polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (d) sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ 1—1 U 3 o 8 que tem um truncamento C- e/ou N-terminal, em que o polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; e (e) sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma modificação seleccionada do grupo consistindo de substituições de aminoácidos, inserções de aminoácidos, deleções de aminoácidos, truncamento C-terminal e truncamento N-terminal, em que o polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N° : 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; 9

Também são divulgados polipéptidos de fusão, compreendendo as sequências de aminoácidos de TSLPR. É ainda aqui divulgado um vector de expressão compreendendo as moléculas de ácido nucleico isoladas como aqui mostradas, células hospedeiras recombinantes compreendendo as moléculas de ácido nucleico recombinantes como aqui mostradas e um método de produção de um polipéptido de TSLPR, compreendendo o cultivo das células hospedeiras e, opcionalmente, o isolamento do polipéptido assim produzido.

Também é aqui divulgado um animal transgénico não humano, compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando um polipéptido de TSLPR. As moléculas de ácido nucleico de TSLPR são introduzidas no animal, num modo que permite expressão e niveis aumentados de um polipéptido de TSLPR, que pode incluir níveis em circulação aumentados. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico de TSLPR são introduzidas no animal num modo que previne a expressão de polipéptido de TSLPR endógeno (i. e., produz um animal transgénico possuindo um knockout génico do polipéptido de TSLPR). 0 animal transgénico não humano é, de um modo preferido, um mamífero e, de um modo mais preferido, um roedor, tais como um rato ou um murganho.

Também são divulgados derivados dos polipéptidos de TSLPR da presente invenção. São ainda divulgados agentes de ligação selectiva, tais como anticorpos e péptidos, capazes de se ligarem especificamente aos polipéptidos de TSLPR da invenção. Esses anticorpos e péptidos podem ser agonistas ou antagonistas. 10

Também são aqui divulgadas composições farmacêuticas compreendendo os nucleótidos, polipéptidos ou agentes de ligação selectiva e um ou mais agentes de formulação farmaceuticamente aceitáveis. As composições farmacêuticas são utilizadas para proporcionar quantidades terapeuticamente eficazes dos nucleótidos ou polipéptidos que são aqui divulgados. Também são aqui divulgados métodos de utilização dos polipéptidos, moléculas de ácido nucleico e agentes de ligação selectiva.

Os polipéptidos de TSLPR e moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem ser utilizados para tratar, prevenir, melhorar e/ou detectar doenças e distúrbios, incluindo aqueles aqui mencionados. É aqui divulgado um método de ensaio de moléculas de teste para identificar uma molécula de teste que se liga a um polipéptido de TSLPR. 0 método compreende colocar em contacto um polipéptido de TSLPR com uma molécula de teste para determinar a extensão de ligação da molécula de teste ao polipéptido. 0 método compreende, ainda, determinar se essas moléculas de teste são agonistas ou antagonistas de um polipéptido de TSLPR. É ainda aqui divulgado um método de teste do impacto de moléculas na expressão do polipéptido de TSLPR ou na actividade do polipéptido de TSLPR.

Os métodos de regulação da expressão e modulação (i. e., aumentar ou diminuir) dos níveis de um polipéptido de TSLPR também são aqui divulgados. Um método compreende administrar a um animal uma molécula de ácido nucleico codificando um polipéptido de TSLPR. Noutro método, pode ser administrada uma molécula de ácido nucleico compreendendo elementos que regulam 11 ou modulam a expressão de um polipéptido de TSLPR. Exemplos destes métodos incluem terapia génica, terapia celular e terapia anti-sentido, como ainda aqui descrito.

Breve Descrição das Figuras

As Figuras 1A-1B ilustram a sequência nucleotidica do gene de TSLPR murino (SEQ ID N° : 1) e sequência de aminoácidos deduzida do polipéptido de TSLPR murino (SEQ ID N°: 2) . 0 péptido sinal (sublinhado) e domínio transmembranar (sublinhado duplo) previstos estão indicados; A Figura 2 ilustra um alinhamento de sequência de aminoácidos do polipéptido de TSLPR murino (sequência superior; SEQ ID N°: 2) e cadeia γ do receptor de citocina murino (γα) comum (sequência inferior; SEQ ID N°: 12). Estão indicados os resíduos idênticos (dentro de rectângulos), sítios potenciais de glicosilação ligada a N (*) e péptido sinal e domínio transmembranar previstos (sublinhado);

As Figuras 3A-3B ilustram a sequência nucleotidica do gene de TSLPR humano (SEQ ID N°: 4) e a sequência de aminoácidos deduzida do polipéptido de TSLPR humano (SEQ ID N°: 5) . Estão indicados o péptido sinal (sublinhado) e domínio transmembranar (sublinhado duplo) previstos;

As Figuras 4A-4B ilustram a sequência nucleotidica de TSLPR/FLAG humano (SEQ ID N°: 7) e a sequência de aminoácidos deduzida do polipéptido de TSLPR/FLAG humano (SEQ ID N°: 8). Estão indicados o péptido FLAG (a tracejado), péptido sinal (sublinhado) previsto e domínio transmembranar (sublinhado duplo) previsto; 12 A Figura 5 ilustra um alinhamento de sequência de aminoácidos do polipéptido de TSLPR murino (sequência superior; SEQ ID N°: 2) e polipéptido de TSLPR humano (sequência inferior; SEQ ID N°: 5).

As Figuras 6A-6C ilustram (A) tradução in vitro do polipéptido de TSLPR murino, (B) imunoprecipitação do polipéptido de TSLPR murino desde células NAG 8/7 e (C) análise de transferência de Northern de expressão de ARNm de TSLPR murino. A Figura 7 ilustra os resultados obtidos em ensaios de proliferação, utilizando células transfectadas com construções quiméricas de expressão para c-Kit/YG, c-Kit/TSLPR e c-Kit/β, ou c-Kit/Yc e c-Kit/β.

As Figuras 8A-8C ilustram os resultados obtidos em ensaios de marcação de afinidade, nos quais 125I-TSLP foi adicionado a células 293 transfectadas com construções de expressão para IL-7Ra murino, TSLPR murino, IL-7Rcx murino e TSLPR murino, ou IL-7Ra humano e TSLPR murino e, depois, reticuladas com DSS.

As Figuras 9A-9D ilustram os resultados obtidos em ensaios de ligação de deslocamento. A Figura 10 ilustra os resultados obtidos em ensaios CAT, nos quais células HepG2 foram co-transfectadas com construções de expressão para IL-7Roí e TSLPR, ou ycr e pHRRE-CAT. 13

Descrição Detalhada da Invenção

Os títulos das secções aqui utilizados são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitando a matéria descrita. Todas as referências citadas neste pedido são aqui expressamente incorporadas por referência.

Definições

As expressões "gene de TSLPR" ou "molécula de ácido nucleico de TSLPR" ou "polinucleótido de TSLPR" referem-se a uma molécula de ácido nucleico compreendendo ou consistindo de uma sequência nucleotidica como mostrada em qualquer das SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 10 ou SEQ ID N°: 11, uma sequência nucleotidica codificando o polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N° : 8 e moléculas de ácido nucleico como aqui definidas. A expressão "variante alélico do polipéptido de TSLPR" refere-se a uma de várias possíveis formas alternadas de ocorrência natural de um gene ocupando um determinado lócus num cromossoma de um organismo ou uma população de organismos. A expressão "variante de excisão do polipéptido de TSLPR" refere-se a uma molécula de ácido nucleico, habitualmente ARN, que é produzida por processamento alternativo de sequências intrónicas num transcrito de ARN de sequência de aminoácidos do polipéptido de TSLPR como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8. 14 A expressão "molécula isolada de ácido nucleico" refere-se a uma molécula de ácido nucleico da invenção que (1) foi separada de, pelo menos, cerca de 50 por cento de proteínas, lípidos, hidratos de carbono ou outros materiais com os quais se encontra naturalmente quando o ácido nucleico total é isolado das células fonte, (2) não está ligada à totalidade ou uma porção de um polinucleótido com o qual a "molécula isolada de ácido nucleico" está ligada na natureza, (3) está ligada de um modo operativo a um polinucleótido com o qual não está ligada na natureza ou (4) não ocorre na natureza como parte de uma sequência polinucleotídica maior. De um modo preferido, a molécula isolada de ácido nucleico da presente invenção é substancialmente isenta de qualquer ou quaisquer outras moléculas contaminantes de ácido nucleico ou outros contaminantes que se encontrados no seu ambiente natural que interfeririam com a sua utilização na produção polipeptídica ou sua utilização terapêutica, diagnóstica, profiláctica ou de investigação.

As expressões "sequência de ácidos nucleicos" ou "molécula de ácido nucleico" referem-se a uma sequência de ADN ou ARN. A expressão abrange moléculas formadas de qualquer dos análogos de bases conhecidos de ADN e ARN, tais como mas não limitados a 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinil-citosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxi-hidroxilmetilo) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboxi-metilaminometiluracilo, di-hidrouracilo, inosina, N6-iso-penteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2- metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, Νβ-metiladenina, 7-metilguanina, 15 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tiopracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonil-metiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, metiléster do ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster do ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina e 2,6-diaminopurina. 0 termo "vector" é utilizado para referir qualquer molécula (e. g., ácido nucleico, plasmideo ou vírus) utilizada para transferir informação de codificação para uma célula hospedeira. A expressão "vector de expressão" refere-se a um vector que é adequado para transformação de uma célula hospedeira e contém sequências de ácidos nucleicos que dirigem e/ou controlam a expressão de sequências de ácidos nucleicos heterólogas inseridas. A expressão inclui mas não está limitada a processos, tais como transcrição, tradução e excisão de ARN, se estiverem presentes intrões. A expressão "ligado de um modo operativo" é aqui utilizada para referir uma disposição de sequências flanqueadoras, em que as sequências flanqueadoras, assim descritas, estão configuradas ou agrupadas para realizarem a sua função habitual. Deste modo, uma sequência flanqueadora ligada de um modo operativo a uma sequência codificante pode ser capaz de efectuar a replicação, transcrição e/ou tradução da sequência codificante. Por exemplo, uma sequência codificante está ligada de um modo operativo a um promotor, quando o promotor é capaz de dirigir a transcrição dessa sequência codificante. Uma sequência flanqueadora não 16 necessita de ser contígua à sequência codificante, desde que funcione correctamente. Deste modo, por exemplo, sequências intervenientes não traduzidas, embora transcritas, podem estar presentes entre uma sequência promotora e a sequência codificante e a sequência promotora pode ser ainda considerada "ligada de um modo operativo" à sequência codificante. A expressão "célula hospedeira" é utilizada para referir uma célula que foi transformada, ou é capaz de ser transformada, com uma sequência de ácidos nucleicos e, depois, de expressar um gene seleccionado de interesse. A expressão inclui a descendência da célula parental, seja a descendência idêntica ou não em morfologia ou em composição genética à parental original, desde que o gene seleccionado esteja presente. A expressão "polipéptido de TSLPR" refere-se a um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N° : 2, SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N° : 8 e polipéptidos relacionados. Os polipéptidos relacionados incluem fragmentos de polipéptido de TSLPR, ortólogos de polipéptido de TSLPR, variantes de polipéptido de TSLPR e derivados de polipéptido de TSLPR que possuem, pelo menos, uma actividade do polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8. Os polipéptidos de TSLPR podem ser polipéptidos maduros, como aqui definido, e podem ou não ter resíduo de metionina amino-terminal, dependendo do método pelo qual são preparados. A expressão "fragmento de polipéptido de TSLPR" refere-se a um polipéptido que compreende um truncamento no terminal amino (com ou sem uma sequência líder) e/ou um truncamento no terminal carboxilo do polipéptido, como mostrado em qualquer das 17 SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8. A expressão "fragmento de polipéptido de TSLPR" também se refere a truncamentos amino-terminais e/ou carboxilo-terminais de ortólogos de polipéptido de TSLPR, derivados de polipéptido de TSLPR ou variantes de polipéptido de TSLPR, ou a truncamentos amino-terminais e/ou carboxilo-terminais dos polipéptidos codificados por variantes alélicos de polipéptido de TSLPR ou variantes de excisão de polipéptido de TSLPR. Os fragmentos de polipéptido de TSLPR podem resultar de excisão de ARN alternativa ou de actividade de protease in vivo. As formas ligadas a membrana de um polipéptido de TSLPR também estão contempladas pela presente invenção. Em formas de realização preferidas, os truncamentos e/ou deleções compreendem cerca de 10 aminoácidos, ou cerca de 20 aminoácidos, ou cerca de 50 aminoácidos, ou cerca de 75 aminoácidos, ou cerca de 100 aminoácidos ou mais de cerca de 100 aminoácidos. Os fragmentos polipeptidicos assim produzidos compreenderão cerca de 25 aminoácidos contíguos, ou cerca de 50 aminoácidos, ou cerca de 75 aminoácidos, ou cerca de 100 aminoácidos, ou cerca de 150 aminoácidos ou cerca de 200 aminoácidos. Esses fragmentos de polipéptido de TSLPR podem compreender, opcionalmente, um resíduo de metionina amino-terminal. Será entendido que esses fragmentos podem ser utilizados, por exemplo, para produzir anticorpos para polipéptidos de TSLPR. A expressão "ortólogo de polipéptido de TSLPR" refere-se a um polipéptido de outra espécie que corresponde à sequência de aminoácidos de polipéptido de TSLPR como mostrada em qualquer das SEQ ID N° : 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N° : 8. Por exemplo, os polipéptidos de TSLPR de murganho e humanos são considerados ortólogos entre si. 18 A expressão "variantes de polipéptido de TSLPR" refere-se a polipéptidos de TSLPR compreendendo sequências de aminoácidos tendo uma ou mais substituições, deleções (tais como deleções internas e/ou fragmentos de polipéptido de TSLPR) e/ou adições (tais como adições internas e/ou polipéptidos de fusão de TSLPR) de sequências de aminoácidos, em comparação com a sequência de aminoácidos de polipéptido de TSLPR mostrada em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 (com ou sem uma sequência líder). Os variantes podem ser de ocorrência natural (e. g., variantes alélicos de polipéptido de TSLPR, ortólogos de polipéptido de TSLPR e variantes de excisão de polipéptido de TSLPR) ou artificialmente construídos. Esses variantes de polipéptido de TSLPR podem ser preparados a partir das correspondentes moléculas de ácido nucleico tendo uma sequência de ADN que varia em conformidade com a sequência de ADN como mostrada em qualquer das SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 10 ou SEQ ID N°: 11. Em formas de realização preferidas, os variantes têm de 1 a 3, ou de 1 a 5, ou de 1 a 10, ou de 1 a 15, ou de 1 a 20, ou de 1 a 25, ou de 1 a 50, ou de 1 a 75, ou de 1 a 100, ou mais de 100 substituições, inserções, adições e/ou deleções de aminoácidos, em que as substituições podem ser conservativas ou não conservativas, ou qualquer sua combinação. A expressão "derivados de polipéptido de TSLPR" refere-se ao polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8, fragmentos de polipéptido de TSLPR, ortólogos de polipéptido de TSLPR ou variantes de polipéptido de TSLPR, como aqui definido, as quais foram quimicamente modificados. A expressão "derivados de polipéptido de TSLPR" também se refere aos polipéptidos codificados por variantes alélicos de polipéptido de TSLPR ou variantes de 19 excisão de polipéptido de TSLPR, como aqui definido, as quais foram quimicamente modificados. A expressão "polipéptido de TSLPR maduro" refere-se a um polipéptido de TSLPR desprovido de uma sequência líder. Um polipéptido de TSLPR maduro também pode incluir outras modificações, tais como processamento proteolitico do terminal amino (com ou sem uma sequência líder) e/ou do terminal carboxilo, clivagem de um polipéptido mais pequeno a partir de um precursor maior, glicosilação ligada a N e/ou ligada a 0 e semelhantes. Os polipéptidos de TSLPR maduros exemplificativos são representados pelas sequências de aminoácidos como mostradas em SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 6 e SEQ ID N°: 9. A expressão "polipéptido de fusão de TSLPR" refere-se a uma fusão de um ou mais aminoácidos (tais como uma proteína ou péptido heterólogo) no terminal amino ou carboxilo do polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8, fragmentos de polipéptido de TSLPR, ortólogos de polipéptido de TSLPR, variantes de polipéptido de TSLPR ou derivados de TSLPR, como aqui definido. A expressão "polipéptido de fusão de TSLPR" também se refere a uma fusão de um ou mais aminoácidos no terminal amino ou carboxilo do polipéptido codificado por variantes alélicos de polipéptido de TSLPR ou variantes de excisão de polipéptido de TSLPR, como aqui definido. A expressão "polipéptido de TSLPR biologicamente activo" refere-se a polipéptidos de TSLPR tendo, pelo menos, uma actividade caracteristica do polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8. Além disso, um polipéptido de TSLPR pode ser 20 activo como um imunogénio; isto é, o polipéptido de TSLPR contém, pelo menos, um epitopo para o qual podem ser deduzidos anticorpos. A expressão "polipéptido isolado" refere-se a um polipéptido da presente invenção que (1) foi separado de, pelo menos, cerca de 50 por cento de polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono ou outros materiais com os quais se encontra naturalmente quando isolado da célula fonte, (2) não está ligado (por interacção covalente ou não covalente) à totalidade ou uma porção de um polipéptido com o qual o "polipéptido isolado" está ligado na natureza, (3) está ligado de um modo operativo (por interacção covalente ou não covalente) a um polipéptido com o qual não está ligado na natureza ou (4) não ocorre na natureza. De um modo preferido, o polipéptido isolado é substancialmente isento de quaisquer outros polipéptidos contaminantes ou outros contaminantes que se encontram no seu ambiente natural que interfeririam com a sua utilização terapêutica, diagnóstica, profiláctica ou de investigação. O termo "identidade", como conhecido na técnica, refere-se a uma relação entre as sequências de duas ou mais moléculas polipeptídicas ou duas ou mais moléculas de ácidos nucleicos, como determinado pela comparação das sequências. Na técnica, "identidade", também significa o grau de parentesco de sequência entre moléculas de ácido nucleico ou polipéptidos, consoante o caso, como determinado pela correspondência entre segmentos de duas ou mais sequências nucleotidicas ou duas ou mais sequências de aminoácidos. A "identidade" mede a percentagem de correspondências idênticas entre a mais pequena de duas ou mais sequências com alinhamentos de lacunas (se existirem) abordados 21 por um particular modelo matemático ou programa de computador (i. e., "algoritmos"). 0 termo "semelhança" é um conceito relacionado mas, em comparação com "identidade", "semelhança" refere-se a uma medida de parentesco que inclui correspondências idênticas e correspondências de substituição conservativa. Se duas sequências polipeptidicas têm, por exemplo, 10/20 aminoácidos idênticos e as restantes são todas substituições não conservativas, então a percentagem de identidade e semelhança seriam ambas 50%. Se, no mesmo exemplo, existirem mais cinco posições onde existem substituições conservativas, então a percentagem de identidade permanece 50%, mas a percentagem de semelhança seria 75% (15/20). Por conseguinte, nos casos onde existem substituições conservativas, a percentagem de semelhança entre dois polipéptidos será superior à percentagem de identidade entre esses dois polipéptidos. A expressão "ocorrência natural" ou o termo "nativo", quando utilizado com respeito a materiais biológicos, tais como moléculas de ácidos nucleicos, polipéptidos, células hospedeiras e semelhantes, refere-se a materiais que se encontram na natureza e não são manipulados pelo homem. De um modo semelhante, "ocorrência não natural" ou " nao nativo", como aqui utilizado, refere-se a um material que não é encontrado na natureza ou que foi estruturalmente modificado ou sintetizado pelo homem.

As expressões "quantidade eficaz" e "quantidade terapeuticamente eficaz" referem-se, cada, a uma quantidade de um polipéptido de TSLPR ou molécula de ácido nucleico de TSLPR utilizada para suportar um nivel observável de uma ou mais 22 actividades biológicas dos polipéptidos de TSLPR, como aqui mostrado. A expressão "veiculo farmaceuticamente aceitável" ou "veiculo fisiologicamente aceitável", como aqui utilizado, refere-se a um ou mais materiais de formulação adequados para a realização ou melhoramento da distribuição do polipéptido de TSLPR, molécula de ácido nucleico de TSLPR ou agente de ligação selectiva de TSLPR como uma composição farmacêutica. A expressão "antigénio" refere-se a uma molécula ou uma porção de uma molécula capaz de ser ligada por um agente de ligação selectiva, tal como um anticorpo e, além disso, capaz de ser utilizada num animal para produzir anticorpos capazes de se ligarem a um epitopo desse antigénio. Um antigénio pode ter um ou mais epitopos. 0 termo "agente de ligação selectiva" refere-se a uma molécula ou moléculas tendo especificidade para um polipéptido de TSLPR. Como aqui utilizados, os termos, "específico" e "especificidade", referem-se à capacidade do agente de ligação selectiva se ligar a polipéptidos de TSLPR humanos e não se ligar a polipéptidos não TSLPR humanos. Contudo, será entendido, que os agentes de ligação selectiva também podem ligar-se a ortólogos do polipéptido, como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8, isto é, suas versões de interespécies, tais como polipéptidos de TSLPR de murganho e rato. 0 termo "transdução" é utilizado para referir a transferência de genes de uma bactéria para outra, habitualmente por um fago. "Transdução" também se refere à aquisição e 23 transferência de sequências celulares eucarióticas por retrovirus. 0 termo "transfecção" é utilizado para referir a absorção de ADN estranho ou exógeno por uma célula e uma célula foi "transfectada" quando o ADN exógeno foi introduzido no interior da membrana celular. Um número de técnicas de transfecção é bem conhecido na matéria e é aqui divulgado. Ver, e. g., Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier, 1986); e Chu et al., 1981, Gene 13:197. Essas técnicas podem ser utilizadas para introduzir uma ou mais fracções de ADN exógeno nas células hospedeiras adequadas. 0 termo "transformação", como aqui utilizado, refere-se a uma alteração nas características genéticas de uma célula e uma célula foi transformada quando foi modificada para conter um novo ADN. Por exemplo, uma célula é transformada se for geneticamente modificada a partir do seu estado nativo. A seguir à transfecção ou transdução, o ADN transformante pode recombinar-se com o da célula pela sua integração física num cromossoma da célula, pode ser mantido de modo transiente como um elemento epissomal sem ser replicado ou pode replicar-se independentemente como um plasmídeo. Uma célula é considerada como tendo sido transformada de um modo estável quando o ADN é replicado com a divisão da célula.

Parentesco de Moléculas de Ácido Nucleico e/ou Polipéptidos

Compreende-se que as moléculas de ácido nucleico relacionadas incluem variantes alélicos ou de excisão da molécula de ácido nucleico de qualquer das SEQ ID N° : 1, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 10 ou SEQ ID N°: 11 e incluem sequências que são complementares a qualquer das sequências nucleotidicas acima. As moléculas de ácido nucleico relacionadas também incluem uma sequência nucleotidica codificando um polipéptido compreendendo ou consistindo essencialmente numa substituição, modificação, adição e/ou deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos, em comparação com o polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8. Esses polipéptidos de TSLPR relacionados podem compreender, por exemplo, uma adição e/ou uma deleção de um ou mais sitios de glicosilação ligados a N ou ligados a O ou uma adição e/ou uma deleção de um ou mais resíduos de cisteína.

As moléculas de ácido nucleico relacionadas também incluem fragmentos de moléculas de ácido nucleico de TSLPR que codificam um polipéptido de, pelo menos, cerca de 25 aminoácidos contíguos, ou cerca de 50 aminoácidos, ou cerca de 75 aminoácidos, ou cerca de 100 aminoácidos, ou cerca de 150 aminoácidos, ou cerca de 200 aminoácidos, ou mais de 200 resíduos de aminoácidos do polipéptido de TSLPR de qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8.

Além disso, as moléculas de ácido nucleico de TSLPR relacionadas também incluem as moléculas que compreendem sequências nucleotidicas que se hibridam, sob condições moderadamente ou altamente estringentes, como aqui definido, com a sequência totalmente complementar da molécula de ácido nucleico de TSLPR de qualquer das SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 4, 25 SEQ ID N°: 7, SEQ ID N° : 10 ou SEQ ID N°: 11, ou de uma molécula codificando um polipéptido, cujo polipéptido compreende a sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N°: 8, ou de um fragmento de ácido nucleico como aqui definido, ou de um fragmento de ácido nucleico codificando um polipéptido como aqui definido . As sondas de hibridação podem ser preparadas utilizando as sequências de TSLPR aqui proporcionadas para rastrear bibliotecas de ADNc, ADN genómico ou sintético para sequências relacionadas. As regiões do ADN e/ou sequência de aminoácidos do polipéptido de TSLPR que exibem identidade significativa com sequências conhecidas são facilmente determinadas utilizando algoritmos de alinhamento de sequência, como aqui descrito, e as regiões podem ser utilizadas para conceber sondas para rastreio. A expressão "condições altamente estringentes" refere-se às condições que são concebidas para permitir a hibridação de cadeias de ADN cujas sequências são altamente complementares e para excluir a hibridação de ADN com erros-de-emparelhamento significativos. A estringência de hibridação é determinada, principalmente, por temperatura, força iónica e a concentração de agentes desnaturantes, tal como formamida. São exemplos de "condições altamente estringentes" para hibridação e lavagem cloreto de sódio a 0,015 M, citrato de sódio a 0,0015, a 65-68 °C, ou cloreto de sódio a 0,015 M, citrato de sódio a 0,0015 M e formamida a 50%, a 42 °C. Ver Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Clonlng: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practlcal Approach, Cap. 4 (IRL Press Limited).

Também podem ser utilizadas condições mais estringentes (tais como temperatura mais elevada, força iónica mais baixa, 26 formamida mais elevada ou outro agente desnaturante) , contudo, a taxa de hibridação será afectada. Para efeitos de redução da hibridação não específica e/ou de fundo, podem ser incluídos outros agentes na hibridação e tampões de lavagem. São exemplos a albumina de soro bovino a 0,1%, polivinilpirrolidona a 0,1%, pirofosfato de sódio a 0,1%, dodecilssulfato de sódio a 0,1%, NaDodS04 (SDS), ficoll, solução de Denhardt, ADN de esperma de salmão sonicado (ou outro ADN não complementar) e sulfato de dextrano, embora também possam ser utilizados outros agentes adequados. A concentração e tipos destes aditivos podem ser alterados, sem afectar substancialmente a estringência das condições de hibridação. As experiências de hibridação são habitualmente efectuadas a pH 6,8-7,4; contudo, a condições de força iónica típicas, a taxa de hibridação é quase independente do pH. Ver Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Cap. 4 (IRL Press Limited).

Os factores afectando a estabilidade de dúplice de ADN incluem composição de base, comprimento e grau de erro-de-emparelhamento de pares de bases. As condições de hibridação podem ser ajustadas por um especialista na técnica, para acomodar estas variáveis e permitir que os ADN de diferente parentesco de sequência formem híbridos. A temperatura de fusão de um dúplice de ADN perfeitamente emparelhado pode ser estimada pela seguinte equação:

Tm(°C) = 81,5 + 16, 6 (log[Na+] + 0,41(%G+C) - 600/N - 0, 72 (%formamida) onde N é o comprimento do dúplice formado, [Na+] é a concentração molar do ião de sódio na solução de hibridação ou lavagem, %G+C é a percentagem de bases (guanina+citosina) no híbrido. Para híbridos imperfeitamente emparelhados, a 27 temperatura de fusão é reduzida em, aproximadamente, 1 °C para cada 1% de erro-de-emparelhamento. A expressão "condições moderadamente estringentes" refere-se a condições sob as quais um dúplice de ADN, com um maior grau de erro-de-emparelhamento de pares de bases do que poderia ocorrer sob "condições altamente estringentes", é capaz de se formar. São exemplos de "condições moderadamente estringentes" típicas cloreto de sódio a 0,015 M, citrato de sódio a 0,0015 M, a 50-65 °C, ou cloreto de sódio a 0,015 M, citrato de sódio a 0,0015 M e formamida a 20%, a 37-50 °C. A título exemplificativo, "condições moderadamente estringentes" de 50 °C em ião de sódio a 0.015 M, permitirão cerca de 21% de erro-de-emparelhamento.

Será entendido pelos especialistas na técnica que não existe distinção absoluta entre "condições altamente estringentes" e "condições moderadamente estringentes". Por exemplo, a 0,015 M de ião de sódio (sem formamida), a temperatura de fusão de ADN longo perfeitamente emparelhado é cerca de 71 °c. Com uma lavagem a 65 °C (à mesma força iónica) , isto permitiria, aproximadamente, um erro-de-emparelhamento de 6%. Para capturar sequências mais distantemente relacionadas, um especialista na técnica pode, simplesmente, baixar a temperatura ou subir a força iónica.

Uma boa estimativa da temperatura de fusão em NaCl* a 1 M para sondas oligonucleotídicas até cerca de 20 nt é dada por:

Tm = 2 °C por par de bases A-T + 4 °C por par de bases G-C 28 *A concentração de ião de sódio em 6X citrato de sódio salino (SSC) é 1 M. Ver Suggs et al., Developmental Biology Using Purified Genes 683 (Brown e Fox, ed., 1981).

As condições de lavagem de elevada estringência para oligonucleótidos são, habitualmente, a uma temperatura de 0-5 °C abaixo da Tm do oligonucleótido em 6X SSC, 0,1% SDS.

Noutra forma de realização, as moléculas de ácido nucleico relacionadas compreendem ou consistem de uma sequência nucleotidica que é, pelo menos, cerca de 70 por cento idêntica à sequência nucleotidica como mostrada em qualquer das SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 10 ou SEQ ID N°: 11, ou compreendem ou consistem, essencialmente, numa sequência nucleotidica codificando um polipéptido que é, pelo menos, cerca de 70 por cento idêntico ao polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N° : 8. Em formas de realização preferidas, as sequências nucleotidicas são cerca de 75 por cento, ou cerca de 80 por cento, ou cerca de 85 por cento, ou cerca de 90 por cento, ou cerca de 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idênticas à sequência nucleotidica como mostrada em qualquer das SEQ ID N° : 1, SEQ ID N° : 4, SEQ ID N° : 7, SEQ ID N° : 10 ou SEQ ID N° : 11, ou as sequências nucleotidicas codificam um polipéptido que é cerca de 75 por cento, ou cerca de 80 por cento, ou cerca de 85 por cento, ou cerca de 90 por cento, ou cerca de 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntico à sequência polipeptidica como mostrada em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8. As moléculas de ácido nucleico relacionadas codificam polipéptidos possuindo, pelo menos, uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8. 29

As diferenças na sequência de ácidos nucleicos podem resultar em modificações conservativas e/ou não conservativas da sequência de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8.

As modificações conservativas na sequência de aminoácidos das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 (e as correspondentes modificações nos nucleótidos codificantes) produzirá um polipéptido tendo caracteristicas funcionais e químicas semelhantes às dos polipéptidos de TSLPR. Em contraste, as modificações substanciais nas caracteristicas funcionais e/ou químicas dos polipéptidos de TSLPR podem ser realizadas pela selecção de substituições na sequência de aminoácidos das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 que diferem significativamente no seu efeito na manutenção (a) da estrutura do esqueleto molecular na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrof obicidade da molécula no sitio alvo ou (c) do volume da cadeia lateral.

Por exemplo, uma "substituição conservativa de aminoácido" pode envolver uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo com um resíduo não nativo, de modo a que haja pouco ou nenhum efeito na polaridade ou carga do resíduo de aminoácido nessa posição. Além disso, qualquer resíduo nativo no polipéptido também pode ser substituído com alanina, como foi anteriormente descrito para "mutagénese de rastreio de alanina".

As substituições conservativas de aminoácidos também abrangem resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural, os quais são tipicamente incorporados por síntese peptídica química, em vez de por síntese em sistemas biológicos. Estas 30 incluem peptidomiméticos e outras formas reversas ou invertidas de fracções de aminoácidos.

Os residuos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base em propriedades comuns de cadeia lateral:

Ala, Vai, Leu, Ile; Thr; Arg; a orientação de cadeia

Gly, 1) hidrófobo: norleucina, Met, 2) hidrófilo neutro: Cys, Ser, 3) acidico: Asp, Glu; 4) básico: Asn, Gin, His, Lys, 5) residuos que influenciam Pro; e 6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

Por exemplo, as substituições não-conservativas podem envolver a troca de um membro de uma destas classes por um membro de outra classe. Esses residuos substituídos podem ser introduzidos dentro de regiões do polipéptido de TSLPR que são homólogas com polipéptidos de TSLPR não humanos ou em regiões não homólogas da molécula.

Na realização dessas alterações, pode ser considerado o índice hidropático dos aminoácidos. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático, com base nas suas características de hidrofobicidade e carga. Os índices hidropáticos são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5). 31 A importância do índice hidropático de aminoácidos na concessão de função biológica interactiva numa proteína é, em geral, compreendida na técnica (Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-31). Sabe-se que determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice hidropático ou pontuação semelhantes e reterem, ainda, uma actividade biológica semelhante. Na realização de alterações após o índice hidropático, é preferida a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estejam dentro de ±2, são preferidos de um modo particular os que estejam dentro de ±1 e são preferidos de um modo ainda mais particular aqueles dentro de ±0,5.

Também é compreendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser realizada eficazmente com base na hidrofilicidade, particularmente onde a proteína ou péptido equivalente biologicamente funcional, criado desse modo, se destine à utilização em formas de realização imunológicas, como no presente caso. A maior hidrofilicidade média local de uma proteína, como controlada pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com a sua imunogenicidade e antigenicidade, i. e., com uma propriedade biológica da proteína.

Os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos a estes resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (—0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (—2,5); e triptofano (-3,4). Na realização de alterações com base em valores de hidrofilicidade semelhantes, é preferida a 32 substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estejam dentro de ±2, são preferidos de um modo particular os que estejam dentro de ±1 e são preferidos de um modo ainda mais particular aqueles dentro de ±0,5. Também se podem identificar epitopos a partir de sequências de aminoácidos primárias com base em hidrofilicidade. Estas regiões também são referidas como "regiões de núcleo epitópico".

As substituições de aminoácidos desejadas (conservativas ou não conservativas) podem ser determinadas pelos especialistas na técnica, no momento que tais substituições sejam desejadas. Por exemplo, as substituições de aminoácidos podem ser utilizadas para identificar importantes resíduos do polipéptido de TSLPR ou para aumentar ou diminuir a afinidade dos polipéptidos de TSLPR aqui descritos. As substituições de aminoácidos exemplificativas são mostradas na Tabela I.

Tabela I

Substituições de Aminoácidos

Resíduos Originais Substituições Exemplificativas Substituições Preferidas Ala Vai, Leu, Ile Vai Arg Lys, Gin, Asn Lys Asn Gin Gin Asp Glu Glu Cys Ser, Ala Ser Gin Asn Asn Glu Asp Asp Gly Pro, Ala Ala 33 (continuação)

Substituições de Aminoácidos

Resíduos Originais Substituições Exemplificativas Substituições Preferidas His Asn, Gin, Lys, Arg Arg Ile Leu, Vai, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu Leu Norleucina, Ile, Vai, Met, Ala, Phe Ile Lys Arg, Ácido 1,4 Diamino-butírico, Gin, Asn Arg Met Leu, Phe, Ile Leu Phe Leu, Vai, Ile, Ala, Tyr Leu Pro Ala Gly Ser Thr, Ala, Cys Thr Thr Ser Ser Trp Tyr, Phe Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Vai Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu

Um especialista na técnica será capaz de determinar variantes adequados do polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N° : 2, SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N° : 8, utilizando técnicas bem conhecidas. Para a identificação de áreas adequadas da molécula que podem ser alteradas sem a destruição da actividade biológica, um especialista na técnica pode visar áreas que não se consideram importantes para actividade. Por exemplo, quando 34 são conhecidos polipéptidos semelhantes com actividades semelhantes da mesma espécie ou de outras espécies, um especialista na técnica pode comparar a sequência de aminoácidos de um polipéptido de TSLPR a esses polipéptidos semelhantes. Com essa comparação, podem identificar-se resíduos e porções das moléculas que são conservadas entre polipéptidos semelhantes. Será entendido que seria menos provável que as alterações em áreas da molécula de TSLPR que não são conservadas, em relação a esses polipéptidos semelhantes, afectassem adversamente a actividade biológica e/ou estrutura de um polipéptido de TSLPR. Um especialista na técnica também saberia que, mesmo em regiões relativamente conservadas, podem substituir-se aminoácidos quimicamente semelhantes pelos resíduos de ocorrência natural retendo, simultaneamente, a actividade (substituições conservativas de resíduos de aminoácidos). Por conseguinte, mesmo em áreas que possam ser importantes para actividade biológica ou para estrutura, podem ser submetidas a substituições conservativas de aminoácidos, sem destruição da actividade biológica ou sem afectar adversamente a estrutura polipeptídica.

Além disso, um especialista na técnica pode rever estudos de estrutura-função identificando resíduos em polipéptidos semelhantes que sejam importantes para actividade or estrutura. Devido a essa comparação, pode prever-se a importância de resíduos de aminoácidos num polipéptido de TSLPR que correspondem a resíduos de aminoácidos que são importantes para actividade ou estrutura em polipéptidos semelhantes. Um especialista na técnica pode optar por substituições de aminoácidos quimicamente semelhantes para esses importantes resíduos de aminoácidos previstos de polipéptidos de TSLPR. 35

Um especialista na técnica também pode analisar a estrutura tridimensional e sequência de aminoácidos em relação à estrutura em polipéptidos semelhantes. Devido a essa informação, um especialista na técnica pode prever o alinhamento de resíduos de aminoácidos de um polipéptido de TSLPR, com respeito à sua estrutura tridimensional. Um especialista na técnica pode escolher não realizar alterações radicais em resíduos de aminoácidos previstos como estando na superfície da proteína, visto que esses resíduos podem estar envolvidos em interacções importantes com outras moléculas. Além disso, um especialista na técnica pode produzir variantes de teste contendo uma única substituição de aminoácido em cada resíduo de aminoácido. Os variantes poderiam ser rastreados utilizando ensaios de actividade conhecidos dos especialistas na técnica. Esses variantes poderiam ser utilizados para reunir informação sobre variantes adequados. Por exemplo, se fosse identificado que uma alteração num resíduo de aminoácido particular resultasse em actividade destruída, indesejavelmente reduzida ou não adequada, variantes com essa alteração poderiam ser evitados. Por outras palavras, com base em informação reunida a partir dessas experiências de rotina, um especialista na técnica pode facilmente determinar os aminoácidos onde devem ser evitadas substituições adicionais, isoladamente ou em combinação com outras mutações.

Um número publicações científicas foi dedicado à previsão da estrutura secundária. Ver Moult, 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7:422-27; Chou et al., 1974, Biochemistry 13:222-45; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-22; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Áreas Mol. Biol. 47:45-48; Chou et al., 1978, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; e Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-84. Além disso, estão actualmente disponíveis 36 programas de computador para auxiliarem na previsão da estrutura secundária. Um método de previsão de estrutura secundária é baseado em modelação de homologia. Por exemplo, dois polipéptidos ou proteínas que tenham uma identidade de sequência superior a 30%, ou semelhança superior a 40%, têm, frequentemente, topologias estruturais semelhantes. O recente crescimento da base de dados estrutural de proteína (PDB) proporcionou previsibilidade melhorada da estrutura secundária, incluindo o número potencial de enrolamentos dentro da estrutura de um polipéptido ou proteína. Ver Holm et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27:244-47. Foi sugerido que existe um número limitado de enrolamentos num determinado polipéptido ou proteína e que, assim que um número crítico de estruturas tenha sido resolvido, a previsão estrutural tornar-se-á dramaticamente mais precisa (Brenner et al., 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:369-76).

Os métodos adicionais de previsão de estrutura secundária incluem "reconhecimento de enrolamento" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), "análise de perfil" (Bowie et al., 1991, Science, 253:164-70; Gribskov et al., 1990, Methods Enzymol. 183:146-59; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 84:4355-58) e "ligação evolutiva" (Ver Holm et al., supra, e Brenner et al., supra).

Os variantes de polipéptido de TSLPR preferidos incluem variantes de glicosilação, em que o número e/ou tipo de sítios de glicosilação foi alterado em comparação com a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer de SEQ ID N° : 2, SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N°: 8. Numa forma de realização, os variantes de polipéptido de TSLPR compreendem um número maior ou um menor de sítios de glicosilação ligados a N do que a sequência de 37 aminoácidos mostrada em qualquer das SEQ ID N° : 2, SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N°: 8. Um sítio de glicosilação ligada a N é caracterizado pela sequência: Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, na qual o resíduo de aminoácido, designado como X, pode ser qualquer resíduo de aminoácido, excepto prolina. A substituição de resíduos de aminoácidos para criar esta sequência proporciona um potencial novo sítio para a adição de uma cadeia de hidratos de carbono ligada a N. Alternativamente, as substituições que eliminam esta sequência removerão uma cadeia de hidratos de carbonos ligada a N existente. Também é proporcionado um rearranjo de cadeias de hidratos de carbono ligadas a N, em que são eliminados um ou mais sítios de glicosilação ligada a N (tipicamente, os que são de ocorrência natural) e são criados um ou mais novos sítios ligados a N. Os variantes de TSLPR preferidos adicionais incluem variantes de cisteína, em que um ou mais resíduos de cisteína são delecionados ou substituídos com outro aminoácido (e. g., serina), em comparação com a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8. Os variantes de cisteína são úteis quando os polipéptidos de TSLPR devem ser reenrolados numa conformação biologicamente activa, tal como após o isolamento de corpos de inclusão insolúveis. Os variantes de cisteína têm, em geral, menos resíduos de cisteína do que a proteína nativa e, tipicamente, têm um número par, para minimizar interacções resultando de cisteínas desemparelhadas.

As moléculas de ácido nucleico relacionadas compreendem ou consistem numa sequência nucleotídica codificando um polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma inserção de aminoácido e em que o polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8, ou uma sequência 38 nucleotídica codificando um polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma deleção de aminoácido e em que o polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N° : 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8. As moléculas de ácido nucleico relacionadas também compreendem ou consistem numa sequência nucleotidica codificando um polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N° : 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8, em que o polipéptido tem um truncamento carboxil- e/ou amino-terminal e, ainda, em que o polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8. As moléculas de ácido nucleico relacionadas também compreendem ou consistem numa sequência nucleotidica codificando um polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma modificação seleccionada do grupo consistindo de substituições de aminoácidos, inserções de aminoácidos, deleções de aminoácidos, truncamentos carboxilo-terminais e truncamentos amino-terminais e em que o polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8.

Além disso, o polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N° : 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N° : 8, ou outro polipéptido de TSLPR, pode estar fundido a um polipéptido homólogo para formar um homodimero ou a um polipéptido heterólogo para formar um heterodimero. Os péptidos e polipéptidos heterólogos incluem mas não estão limitados a: um epitopo para permitir a detecção e/ou isolamento de um polipéptido de fusão de TSLPR; uma proteína receptora transmembranar ou uma sua porção, tais como um domínio extracelular ou um domínio transmembranar e intracelular; um ligando ou uma sua porção que se liga a uma proteína receptora 39 transmembranar; uma enzima ou uma sua porção que é cataliticamente activa; um polipéptido ou péptido que promove a oligomerização, tais como um domínio de fecho-éclair de leucina; um polipéptido ou péptido que aumenta a estabilidade, tal como uma região constante de imunoglobulina; e um polipéptido que tem uma actividade terapêutica diferente do polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8, ou outro polipéptido de TSLPR.

As fusões podem ser preparadas no terminal amino ou no terminal carboxilo do polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer das SEQ ID N° : 2, SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N°: 8 ou outro polipéptido de TSLPR. As fusões podem ser directas, sem molécula ligante ou adaptadora, ou podem ser através de uma molécula ligante ou adaptadora. Uma molécula ligante ou adaptadora pode ser um ou mais resíduos de aminoácidos, tipicamente de cerca de 20 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos. Uma molécula ligante ou adaptadora também pode ser concebida com um sítio de clivagem para uma endonuclease de restrição de ADN ou para uma protease, para permitir a separação das fracções fundidas. Será entendido que uma vez construídos, os polipéptidos de fusão podem ser derivatizados de acordo com os métodos aqui descritos. É aqui divulgado o polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8, ou outro polipéptido de TSLPR, fundido a um ou mais domínios de uma região Fc de IgG humana. Os anticorpos compreendem duas partes funcionalmente independentes, um domínio variável, conhecido como "Fab" que se liga a um antigénio, e um domínio constante, conhecido como "Fc", que está envolvido em funções efectoras, 40 tais como activação do complemento e ataque por células fagocitárias. Um Fc tem uma longa meia-vida sérica, ao passo que um Fab é de vida curta. Capon et ai., 1989, Nature 337:525-31. Quando construído juntamente com uma proteína terapêutica, um domínio Fc pode proporcionar meia-vida mais longa ou incorporar funções tais como ligação de receptor de Fc, ligação de proteína A, fixação do complemento e talvez até transferência placentária. Jd. A Tabela II resume a utilização de determinadas fusões de Fc conhecidas na técnica.

Tabela II

Fusão de Fc com Proteínas Terapêuticas

Forma de Fc Parceiro de fusão Implicações terapêuticas Referência IgGl Terminal N de CD30-L doença de Hodgkin; linfoma anaplásico; leucemia de célula T Patente U.S. N° 5480981 Fcy2a murino IL-10 anti-inflamatório; rejeição de transplante Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-600 IgGl Receptor de TNF choque séptico Fisher et al., 1996, N. Engl. J. Med. 334:1697- 1702; Van Zee et al., 1996, J. Immunol. 156:2221-30 41 (continuação)

Fusão de Fc com Proteínas Terapêuticas

Forma de Fc Parceiro de fusão Implicações terapêuticas Referência IgG, IgA, IgM, Receptor inflamação, Patente U.S. ou IgE (excluindo o primeiro domínio) de TNF distúrbios auto-imunes N° 5808029 IgGl Receptor de CD4 SIDA Capon et al., 1989, Nature 337: 525-31 IgGl, IgG3 Terminal N de IL-2 anticancerígeno, antivírico Harvill et al., 1995, Immunotech. 1:95-105 IgGl Terminal C de OPG osteoartrite; densidade óssea Documento WO 97/23614 IgGl Terminal N de leptina anti-obesidade Documento PCT/US 97/23183, apresentado em 11 de Dezembro de 1997 Cyl de Ig humana CTLA-4 distúrbios auto-imunes Linsley, 1991, J. Exp. Med., 174:561-69

Num exemplo, uma articulação de IgG humana, CH2, e região CH3 pode ser fundida ao terminal amino ou terminal carboxilo dos polipéptidos de TSLPR utilizando métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Noutro exemplo, uma articulação de IgG humana, CH2, e região CH3 pode ser fundida ao terminal amino ou 42 terminal carboxilo de um fragmento de polipéptido de TSLPR (e. g.r a porção extracelular prevista do polipéptido de TSLPR). 0 polipéptido de fusão de TSLPR resultante pode ser purificado por utilização de uma coluna de afinidade de proteína A. Verificou-se que os péptidos e proteínas fundidos a uma região Fc exibem uma meia-vida substancialmente maior in vivo do que o equivalente não fundido. Também, uma fusão a uma região Fc permite a dimerização/multimerização do polipéptido de fusão. A região Fc pode ser uma região Fc de ocorrência natural ou pode ser alterada para melhorar determinadas qualidades, tais como qualidades terapêuticas, tempo de circulação ou agregação reduzida. A identidade e semelhança de moléculas de ácidos nucleicos e polipéptidos relacionados são facilmente calculadas por métodos conhecidos. Esses métodos incluem mas não estão limitados aos descritos em Computational Molecular Biology (A.M. Lesk, ed., Oxford University Press 1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (D.W. Smith, ed., Academic Press 1993); Computer Analysis of Sequence Data (Parte 1, A.M. Griffin e H.G. Griffin, ed., Humana Press 1994); G. von Heinle, Sequence Analysis in Molecular Biology (Academic Press 1987); Sequence Analysis Primer (M. Gribskov e J. Devereux, ed., M. Stockton Press 1991); e Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math., 48 :1073.

Os métodos preferidos para determinar a identidade e/ou semelhança são concebidos para proporcionarem a maior correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e semelhança são descritos em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de programa 43 de computador preferidos para determinar a identidade e semelhança entre duas sequências incluem mas não estão limitados ao pacote do programa GCG, incluindo GAP (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10). O programa BLASTX está publicamente disponível a partir do National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (Altschul et al., BLAST Manual (NCB NLM NIH, Bethesda, MD); Altschul et al., 1990, supra). O bem conhecido algoritmo de Smith Waterman também pode ser utilizado para determinar a identidade.

Determinados esquemas de alinhamento para alinhar duas sequências de aminoácidos podem resultar em correspondência de apenas uma curta região das duas sequências e esta pequena região alinhada pode ter identidade de sequência muito elevada, ainda que não exista relação significativa entre as duas sequências de comprimento completo. Consequentemente, numa forma de realização preferida, o método de alinhamento seleccionado (programa GAP) irá resultar num alinhamento que abrange, pelo menos, 50 aminoácidos contíguos do polipéptido reivindicado.

Por exemplo, utilizando o algoritmo de computador GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), dois polipéptidos para os quais a percentagem de identidade de sequência deva ser determinada, são alinhados para correspondência óptima dos seus respectivos aminoácidos (o "abrangência correspondida", como determinado pelo algoritmo). Uma penalidade de abertura de lacuna (que é calculada como 3X a diagonal média; onde a "diagonal média" é a média da diagonal da matriz de comparação sendo utilizada; a "diagonal" é a pontuação ou número atribuído a cada correspondência de aminoácido 44 perfeita pela matriz de comparação particular) e uma penalidade de extensão de lacuna (que é, habitualmente, 0,1X da penalidade de abertura de lacuna), assim como uma matriz de comparação, tais como PAM 250 ou BLOSUM 62, são utilizadas em conjunto com o algoritmo. Uma matriz de comparação padrão também é utilizada pelo algoritmo (ver Dayhoff et al., 5 Atlas of Protein Sequence and Structure (Sup. 3 1978) (matriz de comparação PAM250);

Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei USA 89:10915-19 (matriz de comparação BLOSUM 62)).

Os parâmetros preferidos para comparação de sequências polipeptidicas incluem os seguintes:

Algoritmo: Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48 : 443-53;

Matriz de comparação: BLOSUM 62 (Henikoff et al., supra);

Penalidade de Lacuna: 12

Penalidade de Comprimento de Lacuna: 4

Limiar de Semelhança: 0 O programa GAP é útil com os parâmetros acima. Os parâmetros mencionados acima são os parâmetros predefinidos para comparações polipeptidicas (juntamente com nenhuma penalidade para lacunas de extremidade) utilizando o algoritmo.

Os parâmetros preferidos para comparação de sequências de moléculas de ácido nucleico incluem os seguintes:

Algoritmo: Needleman e Wunsch, supra; 45

Matriz de comparação: correspondências = +10, não correspondências = 0

Penalidade de Lacuna: 50

Penalidade de Comprimento de Lacuna: 3 O programa GAP também é útil com os parâmetros acima. Os parâmetros mencionados acima são os parâmetros predefinidos para comparações de moléculas de ácido nucleico.

Podem ser utilizados outros algoritmos, penalidades de abertura de lacuna, penalidades de extensão de lacuna, matrizes de comparação e limiares de semelhança exemplificativos, incluindo os mostrados no Manual do Programa, Pacote Wisconsin, Versão 9, Setembro, 1997. As escolhas particulares a serem realizadas serão evidentes para os especialistas na técnica e dependerão da comparação específica a ser realizada, tais como ADN-com-ADN, proteína-com-proteína, proteína-com-ADN; e, além disso, se a comparação é entre pares de sequências dados (caso em que o GAP ou BestFit são, em geral, preferidos) ou entre uma sequência e uma base de dados de sequências de grandes dimensões (caso em que FASTA ou BLASTA são preferidos).

Moléculas de Ácido Nucleico

As moléculas de ácido nucleico codificando um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos de um polipéptido de TSLPR podem ser facilmente obtidas numa variedade de modos incluindo, sem limitação, síntese química, rastreio de biblioteca de ADNc ou genómica, rastreio de biblioteca de expressão e/ou amplificação de ADNc por PCR. 46

Os métodos de ADN recombinante aqui utilizados são, em geral, os mostrados em Sambrook et al., Molecular Clonlng: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) e/ou Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., ed., Green Publishers Inc. e Wiley and Sons 1994). São aqui divulgadas moléculas de ácido nucleico como aqui descritas e métodos para a obtenção dessas moléculas.

Onde um gene codificando a sequência de aminoácidos de um polipéptido de TSLPR tenha sido identificado a partir de uma espécie, a totalidade ou uma porção desse gene pode ser utilizada como uma sonda para identificar genes ortólogos ou relacionados da mesma espécie. As sondas ou iniciadores podem ser utilizados para rastrear bibliotecas de ADNc de diversas fontes de tecidos, que se considera que expressam o polipéptido de TSLPR. Além disso, parte ou a totalidade de uma molécula de ácido nucleico, tendo a sequência como mostrada em qualquer das SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 10 ou SEQ ID N°: 11, pode ser utilizada para rastrear uma biblioteca genómica para identificar e isolar um gene codificando a sequência de aminoácidos de um polipéptido de TSLPR.

Tipicamente, para o rastreio, serão empregues condições de estringência moderada ou elevada, para minimizar o número de falsos positivos obtidos do rastreio.

As moléculas de ácido nucleico codificando a sequência de aminoácidos de polipéptidos de TSLPR também podem ser identificadas por clonagem de expressão que emprega a detecção de clones positivos, com base numa propriedade da proteína expressa. Tipicamente, as bibliotecas de ácido nucleico são rastreadas pela ligação de um anticorpo ou outro parceiro de ligação (e. g., receptor ou ligando) a proteínas clonadas que são expressas e apresentadas na superfície de uma célula hospedeira. 0 anticorpo ou parceiro de ligação é modificado com um marcador detectável para identificar as células expressando o clone desejado.

As técnicas de expressão recombinante conduzidas de acordo com as descrições mostradas abaixo podem ser seguidas para produzir estes polinucleótidos e para expressar os polipéptidos codificados. Por exemplo, pela inserção de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos de um polipéptido de TSLPR num vector apropriado, um especialista na técnica pode facilmente produzir grandes quantidades da sequência nucleotidica desejada. As sequências podem, depois, ser utilizadas para produzir sondas de detecção ou iniciadores de amplificação. Alternativamente, um polinucleótido codificando a sequência de aminoácidos de um polipéptido de TSLPR pode ser inserido num vector de expressão. Pela introdução do vector de expressão num hospedeiro apropriado, o polipéptido de TSLPR codificado pode ser produzido em grandes quantidades.

Outro método para obtenção de uma sequência de ácidos nucleicos adequada é a reacção de polimerização em cadeia (PCR). Neste método, o ADNc é preparado a partir de ARN poli(A)+ ou ARN total utilizando a enzima transcritase reversa. Dois iniciadores, tipicamente complementares a duas regiões separadas de ADNc codificando a sequência de aminoácidos de um polipéptido de TSLPR são, depois, adicionados ao ADNc, juntamente com uma polimerase, tal como Taq polimerase, e a polimerase amplifica a região de ADNc entre os dois iniciadores.

Outro meio de preparação de uma molécula de ácido nucleico codificando a sequência de aminoácidos de um polipéptido de 48 TSLPR é a síntese química, utilizando métodos bem conhecidos do especialista na técnica, tal como os descritos por Engels et al., 1989, Angew. Chem. Intl. Ed. 28:716-34. Estes métodos incluem, inter alia, os métodos de fosfotriéster, fosforamidito e H-fosfonato, para a síntese de ácido nucleico. Um método preferido para essa síntese química é a síntese suportada por polímero utilizando a química do fosforamidito padrão.

Tipicamente, o ADN codificando a sequência de aminoácidos de um polipéptido de TSLPR terá várias centenas de nucleótidos em comprimento. Os ácidos nucleicos superiores a cerca de 100 nucleótidos podem ser sintetizados como vários fragmentos utilizando estes métodos. Os fragmentos podem, depois, ser ligados entre si para formar a sequência nucleotídica de comprimento completo de um gene de TSLPR. Habitualmente, o fragmento de ADN codificando a terminação amino do polipéptido terá um ATG, que codifica um resíduo de metionina. Esta metionina pode ou não estar presente na forma madura do polipéptido de TSLPR, dependendo se o polipéptido produzido na célula hospedeira for concebido para ser segregado desde essa célula. Também podem ser utilizados outros métodos conhecidos dos especialistas na técnica.

Em determinadas formas de realização, os variantes de ácido nucleico contêm codões que foram alterados para expressão óptima de um polipéptido de TSLPR numa determinada célula hospedeira. As alterações de codão particulares dependerão do polipéptido de TSLPR e célula hospedeira seleccionados para expressão. Essa "optimização de codão" pode ser efectuada por uma variedade de métodos, por exemplo, pela selecção de codões que são preferidos para utilização em genes altamente expressos numa determinada célula hospedeira. Podem ser utilizados os algoritmos de computador que incorporam tabelas de frequência de codão, tal 49 como "Eco_high. Cod", para preferência de codão de genes bacterianos altamente expressos e são proporcionados pela Versão 9.0 do Pacote da University of Wisconsin (Genetics Computer Group, Madison, WI). Outras tabelas de frequência de codão úteis incluem "Celegans_high.cod", "Celegans_low.cod", "Drosophila_high.cod", "Human_high.cod", "Maize_high.cod" e "Yeast_high.cod".

Em alguns casos, pode ser desejável preparar moléculas de ácido nucleico codificando variantes de polipéptido de TSLPR. As moléculas de ácido nucleico codificando variantes podem ser produzidas utilizando mutagénese dirigida pontual, amplificação por PCR ou outros métodos apropriados, onde o iniciador ou iniciadores têm as mutações pontuais desejadas (ver Sambrook et al., supra, e Ausubel et al., supra, para descrições de técnicas de mutagénese) . A síntese química utilizando os métodos descritos por Engels et al., supra, também pode ser utilizada para preparar esses variantes. Também podem ser utilizados outros métodos conhecidos dos especialistas na técnica.

Vectores e Células Hospedeiras

Uma molécula de ácido nucleico codificando a sequência de aminoácidos de um polipéptido de TSLPR é inserida num vector de expressão apropriado utilizando técnicas de ligação padrão. O vector é, tipicamente, seleccionado para ser funcional na célula hospedeira particular empregue (i. e., o vector é compatível com a maquinaria da célula hospedeira, de modo a que possa ocorrer a amplificação do gene e/ou expressão do gene). Uma molécula de ácido nucleico codificando a sequência de aminoácidos de um polipéptido de TSLPR pode ser amplificada/expressa em células 50 hospedeiras procariotas, de levedura, de insecto (sistemas de baculovirus) e/ou eucarióticas. A selecção da célula hospedeira dependerá, em parte, se um polipéptido de TSLPR deve ser modificado pós-tradução (e. g., glicosilado e/ou fosforilado). Se assim for, as células hospedeiras de levedura, de insecto ou mamífero são preferidas. Para uma revisão dos vectores de expressão, ver Meth. Enz., vol. 185 (D.V. Goeddel, ed., Academic Press 19 9 0) .

Tipicamente, os vectores de expressão utilizados em qualquer das células hospedeiras conterão sequências para manutenção plasmídica e para clonagem e expressão de sequências nucleotídicas exógenas. Essas sequências, colectivamente referidas como "sequências flanqueadoras", em determinadas formas de realização incluirão, tipicamente, uma ou mais das seguintes sequências nucleotidicas: um promotor, uma ou mais sequências estimuladoras, uma origem de replicação, uma sequência de terminação transcricional, uma sequência intrónica completa contendo um sitio dador e aceitador de excisão, uma sequência codificando uma sequência líder para secreção polipeptídica, um sítio de ligação de ribossoma, uma sequência de poliadenilação, uma região poliadaptadora para inserir o ácido nucleico codificando o polipéptido a ser expresso e um elemento marcador seleccionável. Cada destas sequências é discutida abaixo.

Opcionalmente, o vector pode conter uma sequência codificando um "marcador", i. e., uma molécula oligonucleotídica localizada na extremidade 5' ou 3' da sequência codificando o polipéptido de TSLPR; a sequência oligonucleotídica codifica poliHis (tal como hexaHis) ou outro "marcador", tal como FLAG, HA (vírus da influenza de hemaglutinina) , ou myc, para as quais 51 existem anticorpos comercialmente disponíveis. Este marcador está, tipicamente, fundido ao polipéptido após expressão do polipéptido e pode servir como um meio para purificação de afinidade do polipéptido de TSLPR a partir da célula hospedeira. A purificação de afinidade pode ser alcançada, por exemplo, por cromatografia de coluna, utilizando anticorpos contra o marcador como uma matriz de afinidade. Opcionalmente, o marcador pode ser subsequentemente removido do polipéptido de TSLPR por diversos meios, tal como utilizando determinadas peptidases para clivagem.

As sequências flanqueadoras podem ser homólogas (i. e., da mesma espécie e/ou estirpe que a célula hospedeira), heterólogas (i. e., de uma espécie excluindo a espécie ou estirpe da célula hospedeira), híbridas (i. e., uma combinação de sequências flanqueadoras de mais do que uma fonte) , ou sintéticas, ou as sequências flanqueadoras podem ser sequências nativas que, normalmente, funcionam para regular a expressão do polipéptido de TSLPR. Como tal, a fonte de uma sequência flanqueadora pode ser qualquer organismo procariótico ou eucariótico, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado ou qualquer planta, desde que a sequência flanqueadora seja funcional e possa ser activada pela maquinaria da célula hospedeira.

As sequências flanqueadoras úteis nos vectores desta invenção podem ser obtidas por qualquer de vários métodos bem conhecidos na técnica. Tipicamente, as sequências flanqueadoras úteis no presente - excluindo as sequências flanqueadoras do gene de TSLPR - terão sido anteriormente identificadas por mapeamento e/ou por digestão de endonuclease de restrição e podem, deste modo, ser isoladas da fonte de tecido conveniente, utilizando as endonucleases de restrição apropriadas. Em alguns 52 casos, a sequência nucleotídica total de uma sequência flanqueadora pode ser conhecida. Aqui, a sequência flanqueadora pode ser sintetizada utilizando os métodos aqui descritos para a síntese ou clonaqem de ácido nucleico.

Se a totalidade ou apenas uma porção da sequência flanqueadora for conhecida, pode ser obtida utilizando PCR e/ou pelo rastreio de uma biblioteca genómica com um oligonucleótido adequado e/ou seu fragmento de sequência flanqueadora ou de outra espécie. Se a sequência flanqueadora não for conhecida, um fragmento de ADN contendo uma sequência flanqueadora pode ser isolado de um pedaço de ADN maior que pode conter, por exemplo, uma sequência codificante ou mesmo outro gene ou genes. 0 isolamento pode ser realizado por digestão de endonuclease de restrição para produzir o fragmento de ADN conveniente, seguido de isolamento utilizando purificação em gel de agarose, cromatograf ia de coluna Qiagen(R> (Chatsworth, CA) ou outros métodos conhecidos do especialista na técnica. A selecção de enzimas adequadas para realizar esta finalidade será facilmente evidente para alguém com conhecimentos gerais na técnica.

Uma origem de replicação é, tipicamente, uma parte dos vectores de expressão procarióticos adquiridos comercialmente e a origem auxilia na amplificação do vector numa célula hospedeira. A amplificação do vector até um determinado número de cópia pode, em alguns casos, ser importante para a expressão óptima de um polipéptido de TSLPR. Se o vector de escolha não contiver um sítio de origem de replicação, pode ser quimicamente sintetizado com base numa sequência conhecida e ligado ao vector. Por exemplo, a origem de replicação do plasmídeo pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) é adequada para a maioria das bactérias gram-negativas e diversas origens (e. g., SV40, 53 polioma, adenovírus, vírus da estomatite vesicular (VSV) ou papilomavírus, tais como HPV ou BPV) são úteis para a clonagem de vectores em células de mamífero. Em geral, o componente de origem de replicação não é necessário para vectores de expressão mamíferos (por exemplo, a origem de SV40 é, frequentemente, utilizada apenas porque contém o promotor precoce).

Uma sequência de terminação de transcrição está tipicamente localizada em 3' da extremidade de uma região codificante polipeptídica e serve para terminar a transcrição. Habitualmente, uma sequência de terminação de transcrição em células procariotas é um fragmento rico em G-C, seguido de uma sequência poli-T. Embora a sequência seja facilmente clonada a partir de uma biblioteca ou mesmo comercialmente adquirida como parte de um vector, também pode ser facilmente sintetizada utilizando métodos para síntese de ácido nucleico, tal como os aqui descritos.

Um elemento génico marcador seleccionável codifica uma proteína necessária para a sobrevivência e crescimento de uma célula hospedeira, cultivada num meio de cultura selectivo. Os genes marcadores de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e. g., ampicilina, tetraciclina ou canamicina, para células hospedeiras procariotas; (b) complementam deficiências auxotróficas da célula; ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos. São marcadores seleccionáveis preferidos, o gene de resistência à canamicina, o gene de resistência à ampicilina e o gene de resistência à tetraciclina. Um gene de resistência à neomicina também pode ser utilizado para selecção em células hospedeiras procariotas e eucarióticas. 54

Podem ser utilizados outros genes de selecção para amplificar o gene que irá ser expresso. A amplificação é o processo em que os genes, cuja procura para a produção de uma proteína crítica para o crescimento é maior, são reiterados em tandem nos cromossomas de produções sucessivas de células recombinantes. Os exemplos de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero incluem a di-hidrofolato redutase (DHFR) e timidina cinase. Os transformantes de células de mamífero são colocados sob pressão de selecção, em que só os transformantes estão excepcionalmente adaptados a sobreviverem, em virtude do gene de selecção presente no vector. A pressão de selecção é imposta pelo cultivo das células transformadas, sob condições nas quais a concentração do agente de selecção no meio é sucessivamente alterada conduzindo, desse modo, à amplificação do gene de selecção e do ADN que codifica um polipéptido de TSLPR. Como resultado, quantidades aumentadas de polipéptido de TSLPR são sintetizadas a partir do ADN amplificado.

Um sítio de ligação de ribossoma é, habitualmente, necessário para a iniciação de tradução de ARNm e é caracterizado por uma sequência de Shine-Dalgarno (procariotas) ou uma sequência de Kozak (eucariotas). 0 elemento está, tipicamente, localizado 3' em relação ao promotor e 5' em relação à sequência codificante de um polipéptido de TSLPR a ser expresso. A sequência de Shine-Dalgarno é variada mas é, tipicamente, uma polipurina (i. e., tendo um elevado teor de A-G) . Foram identificadas muitas sequências de Shine-Dalgarno, cada qual pode ser facilmente sintetizada utilizando os métodos aqui mostrados e utilizada num vector procariótico.

Uma sequência líder, ou sinal, pode ser utilizada para dirigir um polipéptido de TSLPR para o exterior da célula 55 hospedeira. Tipicamente, uma sequência nucleotidica codificando a sequência de sinal é posicionada na região codificante de uma molécula de ácido nucleico de TSLPR ou directamente na extremidade 5' de uma região codificante de polipéptido de TSLPR. Foram identificadas muitas sequências de sinal e qualquer das que sejam funcionais na célula hospedeira seleccionada pode ser utilizada em conjunto com uma molécula de ácido nucleico de TSLPR. Por conseguinte, uma sequência de sinal pode ser homóloga (de ocorrência natural) ou heteróloga à molécula de ácido nucleico de TSLPR. Além disso, uma sequência de sinal pode ser quimicamente sintetizada utilizando os métodos aqui descritos. Na maioria dos casos, a secreção de um polipéptido de TSLPR a partir da célula hospedeira, por meio da presença de um péptido sinal, resultará na remoção do péptido sinal do polipéptido de TSLPR segregado. A sequência de sinal pode ser um componente do vector ou pode ser uma parte de uma molécula de ácido nucleico de TSLPR que está inserida no vector. É aqui divulgada a utilização de uma sequência nucleotidica codificando uma sequência de sinal de polipéptido de TSLPR nativa, unida a uma região codificante de polipéptido de TSLPR, ou uma sequência nucleotidica codificando uma sequência de sinal heteróloga, ligada a uma região codificante de polipéptido de TSLPR. A sequência de sinal heteróloga seleccionada deve ser tal que seja reconhecida e processada, i. e., clivada por uma peptidase sinal, pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procariotas que não reconhecem e processam a sequência de sinal de polipéptido de TSLPR nativa, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procariota, seleccionada, por exemplo, do grupo de fosfatase alcalina, penicilinase ou líderes da enterotoxina II termoestável. Para secreção de levedura, a sequência de sinal de polipéptido de 56 TSLPR nativa pode ser substituída pela invertase de levedura, factor alfa ou líderes da fosfatase ácida. Na expressão de célula de mamífero, a sequência de sinal nativa é satisfatória, embora outras sequências sinal mamífero possam ser adequadas.

Em alguns casos, tal como se a glicosilação for desejada num sistema de expressão de célula hospedeira eucariótica, podem manipular-se as diversas pré-sequências para melhorar a glicosilação ou rendimento. Por exemplo, pode alterar-se o sítio de clivagem de peptidase de um péptido sinal particular ou adicionar pro-sequências, que também podem afectar a glicosilação. 0 produto proteico final pode ter, na posição -1 (em relação ao primeiro aminoácido da proteína madura) , um ou mais aminoácidos adicionais incidentes à expressão, que podem não ter sido totalmente removidos. Por exemplo, o produto proteico final pode ter um ou dois resíduos de aminoácidos verificados no sítio de clivagem de peptidase, conjugados ao terminal amino. Alternativamente, a utilização de alguns sítios de clivagem enzimática pode resultar numa forma ligeiramente truncada do polipéptido de TSLPR desejado, se a enzima cortar nessa área no polipéptido maduro.

Em muitos casos, a transcrição de uma molécula de ácido nucleico é aumentada pela presença de um ou mais intrões no vector; tal é particularmente verdadeiro se um polipéptido for produzido em células hospedeiras eucarióticas, especialmente células hospedeiras de mamífero. Os intrões utilizados podem ser de ocorrência natural no gene de TSLPR, especialmente se o gene utilizado for uma sequência genómica de comprimento completo ou um seu fragmento. Se o intrão não for de ocorrência natural dentro do gene (como para a maioria dos ADNc), o intrão pode ser obtido de outra fonte. A posição do intrão com respeito a 57 sequências flanqueadoras e ao gene de TSLPR é, em geral, importante, visto que, para ser eficaz, o intrão deve ser transcrito. Deste modo, quando uma molécula de ADNc de TSLPR está a ser transcrita, a posição preferida para o intrão é 3' em relação ao sitio de iniciação de transcrição e 5' em relação à sequência de terminação de transcrição de poli-A. De um modo preferido, o intrão ou intrões estarão localizados num ou noutro lado (i. e., 5' ou 3') do ADNc, de modo a que não interrompam a sequência codificante. Qualquer intrão de qualquer fonte, incluindo organismos virais, procarióticos e eucarióticos (planta ou animal), pode ser utilizado para realizar esta invenção, desde que seja compatível com a célula hospedeira dentro da qual é inserido. Também estão aqui incluídos intrões sintéticos. Opcionalmente, pode ser utilizado mais de um intrão no vector.

Os vectores de expressão e clonagem da presente invenção conterão, tipicamente, um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e ligado, de um modo operativo, à molécula codificando o polipéptido de TSLPR. Os promotores são sequências não transcritas localizadas a montante (i. e., 5') em relação ao codão de iniciação de um gene estrutural (em geral, dentro de cerca de 100 a 1000 pb) que controlam a transcrição do gene estrutural. Os promotores são agrupados, de modo convencional, en uma de duas classes: promotores indutiveis e promotores constitutivos. Os promotores indutiveis iniciam níveis aumentados de transcrição a partir de ADN sob o seu controlo, em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, tais como a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração na temperatura. Os promotores constitutivos, por outro lado, iniciam a produção contínua de produto génico; isto é, existe pouco ou nenhum controlo sobre a expressão génica. Um grande 58 número de promotores, reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras, é bem conhecido na técnica. Um promotor adequado está ligado, de um modo operativo, ao ADN codificando um polipéptido de TSLPR pela remoção do promotor do ADN fonte por digestão de restrição enzimática e inserção da sequência promotora desejada no vector. A sequência promotora de TSLPR nativa pode ser utilizada para dirigir a amplificação e/ou expressão de uma molécula de ácido nucleico de TSLPR. Prefere-se um promotor heterólogo, contudo, se permitir uma maior transcrição e rendimentos superiores da proteína expressa, em comparação com o promotor nativo, e se for compatível com o sistema celular hospedeiro que foi seleccionado para utilização.

Os promotores adequados para utilização com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas promotores da lactamase beta e lactose; fosfatase alcalina; um sistema promotor do triptofano (trp); e promotores híbridos, tal como o promotor tac. Também são adequados outros promotores bacterianos conhecidos. As suas sequências foram publicadas possibilitando, desse modo, a um especialista na técnica ligá-los à sequência de ADN desejado, utilizando ligantes ou adaptadores como necessário para fornecer quaisquer sítios de restrição úteis.

Os promotores adequados para utilização com hospedeiros de levedura também são bem conhecidos na técnica. Estimuladores de levedura são utilizados, de um modo vantajoso, com promotores de levedura. Os promotores adequados para utilização com células hospedeiras de mamífero são bem conhecidos e incluem mas não estão limitados aos obtidos dos genomas de vírus, tais como poliomavírus, vírus da varíola das aves de capoeira, adenovírus (tal como Adenovírus 2), papilomavírus bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e, de 59 um modo muito preferido, Vírus Símio 40 (SV40). Outros promotores mamíferos adequados incluem promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, promotores do choque térmico e o promotor da actina.

Promotores adicionais que podem ser de interesse no controlo da expressão génica de TSLPR incluem mas não estão limitados a: a região promotora precoce de SV40 (Bemoist e Chambon, 1981, Nature 290:304-10); o promotor CMV; o promotor contido na repetição terminal longa 3' do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22 : 787-97); o promotor da timidina cinase de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:144-45); as sequências regulatórias do gene da metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); vectores de expressão procarióticos, tal como o promotor da lactamase beta (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75:3727-31); ou o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80:21-25). Também são de interesse as seguintes regiões de controlo transcricional animal, que exibem especificidade de tecido e foram utilizadas em animais transgénicos: a região de controlo do gene da elastase I que é activa em células acinosas pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring

Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987,

Hepatology 7:425-515); a região de controlo do gene da insulina que é activa em células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); a região de controlo do gene da imunoglobulina que é activa em células linfóides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-58; Adames et al., 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-44); a região de controlo do vírus do tumor mamário de murganho que é activa em células testiculares, da mama, linfóides e mastócitos (Leder et al., 60 1986, Cell 45:485-95); a região de controlo do gene da albumina que é activa no figado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devei. 1:268-76); a região de controlo do gene da alfa-feto-proteina que é activa no figado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); a região de controlo do gene da alfa-l-antitripsina que é activa no figado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devei. 1:161-71); a região de controlo do gene da globina beta que é activa em células mielóides (Mogram et al., 1985 , Nature 315:338-40; Kollias et al., 1986 , Cell 46:89-94); a região de controlo do gene da proteína básica de mielina que é activa em células oligodendrocíticas no cérebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-12); a região de controlo do gene da cadeia leve de miosina 2 que é activa no músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-86); e a região de controlo do gene da hormona de libertação gonadotrópica que é activa no hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-78).

Uma sequência estimuladora pode ser inserida no vector para aumentar a transcrição de um ADN codificando um polipéptido de TSLPR da presente invenção por eucariotas superiores. Os estimuladores são elementos actuadores em cis de ADN, habitualmente cerca de 10-300 pb em comprimento, que actuam no promotor para aumentar a transcrição. Os estimuladores são independentes relativamente à orientação e posição. Foram verificados 5' e 3' em relação à unidade de transcrição. São conhecidas várias sequências estimuladoras disponíveis a partir de genes mamíferos (e. g., globina, elastase, albumina, alfa-feto-proteína e insulina). Tipicamente, contudo, será utilizado um estimulador de um vírus. O estimulador de SV40, o estimulador do promotor precoce de citomegalovírus, o estimulador de polioma e estimuladores de adenovírus são 61 elementos estimuladores exemplificativos para a activação de promotores eucarióticos. Embora um estimulador possa ser excisado para o vector, numa posição 5' ou 3' em relação a uma molécula de ácido nucleico de TSLPR, está tipicamente localizado num sitio a 5' do promotor.

Os vectores de expressão da invenção podem ser construídos a partir de um vector de partida, tal como um vector comercialmente disponível. Esses vectores podem ou não conter a totalidade das sequências flanqueadoras desejadas. Se uma ou mais das sequências flanqueadoras aqui descritas não estiverem já presentes no vector, podem ser individualmente obtidas e ligadas ao vector. Os métodos utilizados para a obtenção de cada das sequências flanqueadoras são bem conhecidos dos especialistas na técnica.

Os vectores preferidos para a realização desta invenção são os que são compatíveis com células hospedeiras bacterianas, de insecto e mamífero. Esses vectores incluem, inter alia, pCRII, pCR3 e pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA), pBSII (Stratagene, La Jolla, CA), pET15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , pEGFP-N2 (Clontech, Paio Alto, CA) , pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSR-alpha (Pub. do pedido PCT N° WO 90/14363) e pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, N.I.).

Vectores adequados adicionais incluem mas não estão limitados a cosmídeos, plasmídeos ou vírus modificados, mas será entendido que o sistema vector deve ser compatível com a célula hospedeira seleccionada. Esses vectores incluem mas não estão limitados a plasmídeos, tal como derivados do plasmídeo Bluescript (um fagemídeo baseado em ColEl de elevado número de cópia; Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA) , plasmídeos de 62 clonagem de PCR concebidos para clonagem de produtos de PCR amplificados por Taq (e. g., Kit TOPO™ TA Cloning(R) e derivados do plasmídeo PCR2.1(R); Invitrogen) e vectores mamíferos, de levedura ou de vírus, tal como um sistema de expressão de baculovírus (derivados do plasmídeo pBacPAK; Clontech).

Depois de o vector ter sido construído e uma molécula de ácido nucleico codificando um polipéptido de TSLPR ter sido inserida no sítio conveniente do vector, o vector completo pode ser inserido numa célula hospedeira adequada para amplificação e/ou expressão polipeptídica. A transformação de um vector de expressão para um polipéptido de TSLPR dentro de uma célula hospedeira seleccionada pode ser alcançada por métodos bem conhecidos, incluindo métodos tais como transfecção, infecção, cloreto de cálcio, electroporação, micro-injecção, lipofecção, método de DEAE-dextrano ou outras técnicas conhecidas. 0 método seleccionado será, em parte, uma função do tipo de célula hospedeira a ser utilizada. Estes e outros métodos adequados são bem conhecidos do especialista na técnica e são mostrados, por exemplo, em Sambrook et al., supra.

As células hospedeiras podem ser células hospedeiras procariotas (tal como E. coli) ou células hospedeiras eucarióticas (tais como uma célula de levedura, insecto ou de vertebrado). A célula hospedeira, quando cultivada sob condições apropriadas, sintetiza um polipéptido de TSLPR que pode ser subsequentemente recolhido do meio de cultura (se a célula hospedeira o segregar para o meio) ou directamente da célula hospedeira que o produz (se não for segregado) . A selecção de uma célula hospedeira apropriada dependerá de diversos factores, tais como níveis de expressão desejados, modificações polipeptídicas que sejam desejáveis ou necessárias para 63 actividade (tais como glicosilação ou fosforilação) e facilidade de enrolamento numa molécula biologicamente activa. É conhecido na técnica um número de células hospedeiras adequadas e muitas estão disponíveis a partir da American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA. Os exemplos incluem mas não estão limitados a células de mamífero, tais como células de ovário de hámster Chinês (CHO), células CHO DHFR(-) (Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 97:4216-20), células de rim embrionário humano (HEK) 293 ou 293T ou células 3T3. A selecção de células hospedeiras de mamífero adequadas e métodos para transformação, cultura, amplificação, rastreio, produção de produto e purificação são conhecidas na técnica. Outras linhas celulares mamífero adequadas são as linhas celulares COS-1 e COS-7 de macaco e a linha celular CV-1. Células hospedeiras de mamífero exemplificativas adicionais incluem linhas celulares de primata e linhas celulares de roedor, incluindo linhas celulares transformadas. Também são adequadas células diplóides normais, estirpes celulares derivadas de cultura in vitro de tecido primário, assim como explantes primários. As células candidatas podem ser genotipicamente deficientes no gene de selecção ou podem conter um gene de selecção actuando de modo dominante. Outras linhas celulares de mamífero adequadas, incluem mas não estão limitadas a células de neuroblastoma N2A de murganho, HeLa, células L-929 de murganho, linhas 3T3 derivadas de murganhos Swiss, Balb-c ou NIH, linhas celulares de hámster BHK ou HaK. Cada destas linhas celulares é conhecida e está disponível para os especialistas na técnica da expressão proteica. São identicamente úteis como células hospedeiras adequadas para a presente invenção as células bacterianas. Por exemplo, as 64 diversas estirpes de E. coli (e. g., HB101, DH5a, DH10 e MC1061) são bem conhecidas como células hospedeiras no campo da biotecnologia. Também podem ser empregues neste método diversas estirpes de B. subtilis, Pseudomonas spp., outros Bacillus spp., Streptomyces spp. e semelhantes.

Muitas estirpes de células de levedura conhecidas dos especialistas na técnica também estão disponíveis como células hospedeiras para a expressão dos polipéptidos da presente invenção. As células de levedura preferidas incluem, por exemplo, Saccharomyces cerivisae e Pichia pastoris.

Além disso, onde desejado, podem ser utilizados sistemas de células de insecto nos métodos da presente invenção. Esses sistemas estão descritos, por exemplo, em Kitts et al., 1993, Biotechniques, 14:810-17; Lucklow, 1993, Curr. Opin. Biotechnol. 4:564-72; e Lucklow et al., 1993, J. Virol., 67:4566-79. As células de insecto preferidas são Sf-9 e Hi5 (Invitrogen).

Também podem utilizar-se animais transgénicos para expressar polipéptidos de TSLPR glicosilados. Por exemplo, pode utilizar-se um animal transgénico produzindo leite (uma vaca ou cabra, por exemplo) e obter-se o presente polipéptido glicosilado no leite do animal. Também podem utilizar-se plantas para produzir polipéptidos de TSLPR, contudo, em geral, a glicosilação ocorrendo em plantas é diferente da produzida em células de mamífero e pode resultar num produto glicosilado que não é adequado para utilização terapêutica humana.

Produção Polipeptídica 65

As células hospedeiras compreendendo um vector de expressão de polipéptido de TSLPR podem ser cultivadas utilizando meios padrão bem conhecidos do especialista na técnica. Os meios conterão, habitualmente, todos os nutrientes necessários para o crescimento e sobrevivência das células. Os meios adequados para o cultivo de células E. coli incluem, por exemplo, Luria Broth (LB) e/ou Terrific Broth (TB). Os meios adequados para o cultivo de células eucarióticas incluem o meio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640), Meio Mínimo Essencial (MEM) e/ou Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), podendo todos eles ser suplementados com soro e/ou factores de crescimento conforme necessário para a linha celular particular sendo cultivada. Um meio adequado para culturas de insecto é o meio de Grace suplementado com yeastolate, hidrolisado de lactalbumina e/ou soro de vitelo fetal, conforme necessário.

Tipicamente, um antibiótico ou outro composto útil para crescimento selectivo de células transfectadas ou transformadas é adicionado como um suplemento aos meios. O composto a ser utilizado será seleccionado pelo elemento marcador seleccionável presente no plasmídeo com o qual a célula hospedeira foi transformada. Por exemplo, se o elemento marcador seleccionável for resistência à canamicina, o composto adicionado ao meio de cultura será a canamicina. Outros compostos para crescimento selectivo incluem ampicilina, tetraciclina e neomicina. A quantidade de um polipéptido de TSLPR produzido por uma célula hospedeira pode ser avaliada utilizando métodos padrão conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, sem limitação, análise de transferência de Western, electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, electroforese em gel não desnaturante, separação de Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC), 66 imunoprecipitação e/ou ensaios de actividade, tal como ensaios de deslocamento de gel de ligação de ADN.

Se um polipéptido de TSLPR foi concebido para ser segregado das células hospedeiras, a maioria do polipéptido pode ser encontrada no meio de cultura celular. Se, contudo, o polipéptido de TSLPR não for segregado das células hospedeiras, estará presente no citoplasma e/ou no núcleo (para células hospedeiras eucarióticas) ou no citosol (para células hospedeiras de bactérias gram-negativas).

Para um polipéptido de TSLPR situado no citoplasma e/ou núcleo da célula hospedeira (para células hospedeiras eucarióticas) ou no citosol (para células hospedeiras bacterianas) , o material intracelular (incluindo corpos de inclusão para bactérias gram-negativas) pode ser extraído da célula hospedeira utilizando qualquer técnica padrão conhecida do especialista na técnica. Por exemplo, as células hospedeiras podem ser lisadas para libertarem o conteúdo do periplasma/citoplasma por prensa Francesa, homogeneização e/ou sonicação, seguida de centrifugação.

Se um polipéptido de TSLPR formou corpos de inclusão no citosol, os corpos de inclusão podem, frequentemente, ligar-se às membranas celulares internas e/ou externas e, deste modo, após centrifugação, encontrar-se-ão, principalmente, no material de sedimento. 0 material de sedimento pode, depois, ser tratado a extremos de pH ou com um agente caotrópico, tais como um detergente, guanidina, derivados de guanidina, ureia ou derivados de ureia na presença de um agente de redução, tal como ditiotreitol, a pH alcalino ou tris carboxietilo fosfina, a pH ácido, para libertar, desagregar e solubilizar os corpos de 67 inclusão. 0 polipéptido de TSLPR solubilizado pode, depois, ser analisado utilizando electroforese em gel, imunoprecipitação ou semelhantes. Se for desejado isolar o polipéptido de TSLPR, o isolamento pode ser alcançado utilizando métodos padrão, tal como os aqui descritos e em Marston et al., 1990, Meth. Enz., 182:264-75.

Em alguns casos, após isolamento, um polipéptido de TSLPR pode não ser biologicamente activo. Podem ser utilizados diversos métodos para "reenrolamento" ou conversão do polipéptido na sua estrutura terciária e produção de ligações dissulfureto para restaurar a actividade biológica. Esses métodos incluem expor o polipéptido solubilizado a um pH habitualmente acima de 7 e na presença de uma concentração particular de um caotrópico. A selecção do caotrópico é muito semelhante às escolhas utilizadas para solubilização de corpos de inclusão mas, habitualmente, o caotrópico é utilizado a uma concentração inferior e não é necessariamente a mesma que a dos caotrópicos utilizados para a solubilização. Na maioria dos casos, a solução de reenrolamento/oxidação também conterá um agente de redução, ou o agente de redução mais a sua forma oxidada, numa razão específica, para produzir um potencial redox particular permitindo a ocorrência de rearranjo de dissulfureto na formação das pontes de cisteína da proteína. Alguns dos pares redox geralmente utilizados incluem cisteína/cistamina, glutationo (GSH)/ditiobis GSH, cloreto cúprico, ditiotreitol (DTT)/ditiano e 2-2-mercaptoetanol(bME)/ditio-b(ME). Em muitos casos, pode ser utilizado um co-solvente ou pode ser necessário aumentar a eficiência do reenrolamento e os reagentes mais comuns utilizados para este efeito incluem glicerol, polietilenoglicol de diversos pesos moleculares, arginina e semelhantes. 68

Se os corpos de inclusão não forem formados num grau significativo após expressão de um polipéptido de TSLPR, então, após centrifugação do homogeneizado celular, o polipéptido encontrar-se-á, principalmente, no sobrenadante. 0 polipéptido pode ser ainda isolado do sobrenadante utilizando métodos, tal como os agui descritos. A purificação de um polipéptido de TSLPR a partir da solução pode ser alcançada utilizando uma variedade de técnicas. Se o polipéptido foi sintetizado de modo a gue contenha um marcador, tal como Hexa-histidina (polipéptido de TSLPR/hexaHis) ou outro péptido pequeno, tais como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) ou myc (Invitrogen) , no seu terminal carboxilo ou amino, pode ser purificado num processo de uma etapa pela passagem da solução através de uma coluna de afinidade onde a matriz de coluna tem uma elevada afinidade para o marcador.

Por exemplo, a poli-histidina liga-se com grande afinidade e especificidade a níquel. Deste modo, uma coluna de afinidade de níquel (tal como as colunas de níquel Qiagen®) pode ser utilizada para purificação do polipéptido de TSLPR/poliHis. Ver, e. g., Current Protocols in Molecular Biology § 10.11.8 (Ausubel et ai., ed., Green Publishers Inc. e Wiley and Sons 1993).

Além disso, os polipéptidos de TSLPR podem ser purificados através da utilização de um anticorpo monoclonal que é capaz de reconhecer e ligar-se, de um modo específico, a um polipéptido de TSLPR.

Outros processos adequados para purificação incluem, sem limitação, cromatografia de afinidade, cromatografia de 69 imunoafinidade, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de crivo molecular, HPLC, electroforese (incluindo electroforese em gel nativa), seguida de eluição em gel e focalização isoeléctrica preparativa (máquina/técnica "Isoprime", Hoefer Scientific, San Francisco, CA) . Em alguns casos, duas ou mais técnicas de purificação podem ser combinadas para se alcançar pureza aumentada.

Os polipéptidos de TSLPR também podem ser preparados por métodos de síntese química (tal como síntese peptídica de fase sólida) utilizando técnicas conhecidas na matéria, tais como as mostradas por Merrifield et al., 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149; Houghten et al., 1985, Proc Natl Acad. Sei. USA 82:5132; e Stewart e Young , Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co. 1984) Esses polipéptidos podem ser sintetizados com ou sem uma metionina no terminal amino. Os polipéptidos de TSLPR quimicamente sintetizados podem ser oxidados utilizando métodos mostrados nestas referências para formar pontes dissulfureto. Espera-se que os polipéptidos de TSLPR quimicamente sintetizados tenham actividade biológica comparável à dos polipéptidos de TSLPR correspondentes produzidos recombinantemente ou purificados de fontes naturais e, deste modo, podem ser utilizados, com o mesmo significado, com um polipéptido de TSLPR recombinante ou natural.

Outro meio para se obter polipéptido de TSLPR é por meio de purificação de amostras biológicas, tais como tecidos e/ou fluidos fonte, nos quais o polipéptido de TSLPR se encontra naturalmente. Essa purificação pode ser conduzida utilizando métodos para purificação de proteína como aqui descrito. A presença do polipéptido de TSLPR durante a purificação pode ser monitorizada, por exemplo, utilizando um anticorpo preparado 70 contra polipéptido de TSLPR produzido recombinantemente ou os seus fragmentos peptídicos.

Um número de métodos adicionais para a produção de ácidos nucleicos e polipéptidos é conhecido na técnica e os métodos podem ser utilizados para produzir polipéptidos tendo especificidade para polipéptido de TSLPR. Ver, e. g., Roberts et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 94:12297-303, que descreve a produção de proteínas de fusão entre um ARNm e o seu péptido codificado. Ver também, Roberts, 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:268-73. Além disso, a Patente U.S. N° 5824469 descreve métodos para a obtenção de oligonucleótidos capazes de efectuarem uma função biológica específica. O processo envolve a produção de um agregado heterogéneo de oligonucleótidos, cada tendo uma sequência aleatorizada 5', uma sequência pré-seleccionada central e uma sequência aleatorizada 3'. O agregado heterogéneo resultante é introduzido numa população de células que não exibem a função biológica desejada. As subpopulações das células são, depois, rastreadas para aquelas que exibem uma função biológica predeterminada. Dessa subpopulaçao, os oligonucleótidos capazes de efectuarem a função biológica desejada são isolados.

As Patentes U.S. N° 5763192; 5814476; 5723323; e 5817483 descrevem processos para a produção de péptidos ou polipéptidos. Isto é realizado pela produção de genes estocásticos ou seus fragmentos e, depois, introdução destes genes em células hospedeiras que produzem uma ou mais proteínas codificadas pelos genes estocásticos. As células hospedeiras são, depois, rastreadas para identificar os clones produzindo péptidos ou polipéptidos tendo a actividade desejada. 71

Outro método para a produção de péptidos ou polipéptidos é descrito no documento PCT/US98/20094 (WO99/15650) , apresentado por Athersys, Inc., conhecido como "Random Activation of Gene Expression for Gene Discovery" (RAGE-GD), o processo envolve a activação de expressão génica endógena ou sobreexpressão de um gene por métodos de recombinação in situ. Por exemplo, a expressão de um gene endógeno é activada ou aumentada pela integração de uma sequência reguladora na célula alvo que é capaz de activar a expressão do gene por recombinação não homóloga ou ilegítima. 0 ADN alvo é, em primeiro lugar, submetido a radiação e inserido um promotor genético. 0 promotor localiza, eventualmente, uma ruptura na frente de um gene, iniciando a transcrição do gene. Isto resulta na expressão do péptido ou polipéptido desejado.

Será entendido que estes métodos também podem ser utilizados para criar bibliotecas abrangentes de expressão de polipéptido de TSLPR que, subsequentemente, podem ser utilizadas para rastreio fenotípico de alta capacidade numa variedade de ensaios, tais como ensaios bioquímicos, ensaios celulares e ensaios de organismos intactos (e. g., planta, murganho, etc.). 72 Síntese

Será entendido pelos especialistas na técnica que as moléculas de ácido nucleico e polipeptídicas aqui descritas podem ser produzidas por meios recombinantes e outros.

Agentes de Ligação Selectiva A expressão "agente de ligação selectiva" refere-se a uma molécula que tem especificidade para um ou mais polipéptidos de TSLPR. Os agentes de ligação selectiva adequados incluem mas não estão limitados a anticorpos e seus derivados, polipéptidos e moléculas pequenas. Os agentes de ligação selectiva adequados podem ser preparados utilizando métodos conhecidos na técnica. Um agente de ligação selectiva de polipéptido de TSLPR exemplificativo da presente invenção é capaz de se ligar a uma determinada porção do polipéptido de TSLPR inibindo, desse modo, a ligação do polipéptido a um receptor de polipéptido de TSLPR.

Os agentes de ligação selectiva, tais como anticorpos e fragmentos de anticorpo que se ligam a polipéptidos de TSLPR, estão dentro do âmbito da presente invenção. Os anticorpos podem ser policlonais, incluindo policlonal mono-específico; monoclonal (MAb); recombinantes; quiméricos; humanizados, tal como enxertado com a região determinante de complementaridade (CDR); humanos; de cadeia única; e/ou bi-específicos; assim como fragmentos; variantes; ou seus derivados. Os fragmentos de anticorpo incluem as porções do anticorpo que se ligam a um epitopo no polipéptido de TSLPR. Os exemplos desses fragmentos incluem fragmentos Fab e F(ab') produzidos por clivagem enzimática de anticorpos de comprimento completo. Outros 73 fragmentos de ligação incluem os gerados por técnicas de ADN recombinante, tal como a expressão de plasmídeos recombinantes contendo sequências de ácidos nucleicos codificando regiões variáveis de anticorpo.

Os anticorpos policlonais dirigidos para um polipéptido de TSLPR são, em geral, produzidos em animais (e. g., coelhos ou murganhos), por meio de múltiplas injecções subcutâneas ou intraperitoneais de polipéptido de TSLPR e um adjuvante. Pode ser útil conjugar um polipéptido de TSLPR a uma proteína transportadora que seja imunogénica na espécie a ser imunizada, tais como hemocianina da lapa californiana, soro, albumina, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja. Também, agentes agregantes, tal como alúmen, são utilizados para melhorar a resposta imunitária. Após imunização, os animais são sangrados e o soro é ensaiado para título de anticorpo anti-TSLPR.

Os anticorpos monoclonais dirigidos para polipéptidos de TSLPR são produzidos utilizando qualquer método que proporcione a produção de moléculas de anticorpo por linhas celulares continuas em cultura. Os exemplos de métodos adequados para a preparação de anticorpos monoclonais incluem os métodos de hibridoma de Kohler et al., 1975, Nature 256:495-97 e o método de hibridoma de célula B humana (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63 (Mareei Dekker, Inc., 1987).

Também são proporcionadas pela invenção linhas celulares de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais reactivos com os polipéptidos de TSLPR. 74

Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser modificados para utilização como terapêutica. Uma forma de realização é um anticorpo "quimérico", no qual uma porção da cadeia pesada (H) e/ou leve (L) é idêntica ou homóloga a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a um sequência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo. Também estão incluídos fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a actividade biológica desejada. Ver a Patente U.S. N° 4816567; Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. 81:6851-55.

Noutra forma de realização, um anticorpo monoclonal da invenção é um anticorpo "humanizado". Os métodos para a humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Ver as Patentes U.S. N° 5585089 e 5693762. Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos dentro de si a partir de uma fonte que é não humana. A humanização pode ser realizada, por exemplo, utilizando os métodos descritos na técnica (Jones et al., 1986, Nature 321:522-25; Riechmann et al., 1998, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-36), pela substituição de, pelo menos, uma porção da região determinante de complementaridade de roedor pelas correspondentes regiões de um anticorpo humano.

Também estão abrangidos pela invenção anticorpos humanos que se ligam a polipéptidos de TSLPR. Utilizando animais transgénicos (e. g., murganhos) que são capazes de produzirem um repertório de anticorpos humanos, na ausência da produção de 75 imunoglobulina endógena, esses anticorpos são produzidos por imunização com um antigénio de polipéptido de TSLPR (i. e., tendo, pelo menos, 6 aminoácidos contíguos), opcionalmente conjugados a um transportador. Ver, e. g., Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei . 90 :2551- -55; Jakobovits et al., 1993, Nature 362 :255-58,- Bruggermann et al., 1993, Year in

Immuno. 7:33. Num método, esses animais transgénicos são produzidos pela incapacitação dos loci endógenos codificando aí as cadeias pesada e leve de imunoglobulina e inserção de loci codificando proteínas de cadeia pesada e leve humanas dentro do seu genoma. Os animais parcialmente modificados, isto é, aqueles tendo menos do que o complemento total de modificações são, depois, cruzados para se obter um animal tendo a totalidade das modificações desejadas do sistema imunitário. Quando administrados com um imunogénio, estes animais transgénicos produzem anticorpos com sequências de aminoácidos humanas (em vez de, e. g., murinas), incluindo regiões variáveis que são imunoespecíficas para estes antigénios. Ver os Pedidos PCT N° PCT/US96/05928 e PCT/US93/06926. Métodos adicionais são descritos na Patente U.S. N° 5545807, Pedido PCT N° PCT/US91/245 e PCT/GB89/01207 e nas Patentes Europeias N° 546073B1 e 546073A1. Os anticorpos humanos também podem ser produzidos pela expressão de ADN recombinante em células hospedeiras ou por expressão em células de hibridoma, como aqui descrito.

Numa forma de realização alternativa, os anticorpos humanos também podem ser produzidos desde bibliotecas de fago (Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581). Estes processos mimetizam a selecção imunitária através da apresentação de repertórios de anticorpo na superfície do bacteriófago filamentoso e subsequente selecção de fago pela sua ligação a um antigénio de 76 escolha. Essa técnica é descrita no Pedido PCT N° PCT/US98/17364, que descreve o isolamento de anticorpos agonistas de elevada afinidade e funcionais para receptores MPL-e msk- utilizando essa abordagem.

Os anticorpos quiméricos, enxertados com CDR e humanizados são, tipicamente, produzidos por métodos recombinantes. Os ácidos nucleicos codificando os anticorpos são introduzidos em células hospedeiras e expressos utilizando materiais e processos aqui descritos. Numa forma de realização preferida, os anticorpos são produzidos em células hospedeiras de mamífero, tal como células CHO. Os anticorpos monoclonais (e. g., humanos) podem ser produzidos pela expressão de ADN recombinante em células hospedeiras ou por expressão em células de hibridoma, como aqui descrito.

Os anticorpos anti-TSLPR da invenção podem ser empregues em qualquer método de ensaio conhecido, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios de sanduíche directos e indirectos e ensaios de imunoprecipitação (Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)) para a detecção e quantificação de polipéptidos de TSLPR. Os anticorpos ligar-se-ão a polipéptidos de TSLPR com uma afinidade que é apropriada para o método de ensaio que é empregue.

Para aplicações de diagnóstico, em determinadas formas de realização, os anticorpos anti-TSLPR podem ser marcados com uma fracção detectável. A fracção detectável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir, directa ou indirectamente, um sinal detectável. Por exemplo, a fracção detectável pode ser um radioisótopo, tais como 3H, 14C, 32P, 35S, 125I, 99Tc, 311In ou 67Ga; um composto fluorescente ou quimioluminescente, tais como 77 isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina; ou uma enzima, tais como fosfatase alcalina, β-galactosidase ou peroxidase de rábano (Bayer, et al., 1990, Meth. Enz. 184:138-63) .

Os ensaios de ligação competitiva baseiam-se na capacidade de um padrão marcado (e. g., um polipéptido de TSLPR, ou uma sua porção imunologicamente reactiva) competir com o analito da amostra de teste (um polipéptido de TSLPR) para ligação com uma quantidade limitada de anticorpo anti-TSLPR. A quantidade de um polipéptido de TSLPR na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que fica ligado aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que fica ligado, os anticorpos são, tipicamente, insolubilizados, antes ou após a competição, de modo a que o padrão e analito que estão ligados aos anticorpos possam ser convenientemente separados do padrão e analito que permanecem não ligados.

Os ensaios de sanduiche envolvem, tipicamente, a utilização de dois anticorpos, cada capaz de ligação a uma porção imunogénica diferente, ou epitopo, da proteína a ser detectada e/ou quantificada. Num ensaio de sanduíche, o analito da amostra de teste é, tipicamente, ligado por um primeiro anticorpo que está imobilizado num suporte sólido e, a seguir, um segundo anticorpo liga-se ao analito formando, deste modo, um complexo tripartido insolúvel. Ver, e. g., a Patente U.S. N° 4376110. O segundo anticorpo pode, ele próprio, ser marcado com uma fracção detectável (ensaio de sanduíche directo) ou pode ser medido utilizando um anticorpo anti-imunoglobulina que é marcado com uma fracção detectável (ensaio de sanduíche indirecto) . Por exemplo, um tipo de ensaio de sanduíche é um ensaio de 78 imunoabsorção enzimática (ELISA), caso em que a fracção detectável é uma enzima.

Os agentes de ligação selectiva, incluindo anticorpos anti-TSLPR, também são úteis para imagiologia in vivo. Um anticorpo marcado com uma fracção detectável pode ser administrado a um animal, de um modo preferido no sangue e a presença e localização do anticorpo marcado no hospedeiro ensaiadas. 0 anticorpo pode ser marcado com qualquer fracção que seja detectável num animal, por ressonância magnética nuclear, radiologia ou outros meios de detecção conhecidos na técnica.

Os agentes de ligação selectiva da invenção, incluindo anticorpos, podem ser utilizados como terapêutica. Estes agentes terapêuticos são, em geral, agonistas ou antagonistas, na medida em que estimulam ou reduzem, respectivamente, pelo menos, uma das actividades biológicas de um polipéptido de TSLPR. Numa forma de realização, os anticorpos antagonistas da invenção são anticorpos, ou os seus fragmentos de ligação, que são capazes de ligação específica a um polipéptido de TSLPR e que são capazes de inibição ou eliminação da actividade funcional de um polipéptido de TSLPR in vivo ou in vitro. Em formas de realização preferidas, o agente de ligação selectiva, e. g., um anticorpo antagonista, inibirá a actividade funcional de um polipéptido de TSLPR em, pelo menos, cerca de 50% e, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 80%. Noutra forma de realização, o agente de ligação selectiva pode ser um anticorpo polipeptidico anti-TSLPR que é capaz de interagir com um parceiro de ligação de polipéptido de TSLPR (um ligando ou receptor) inibindo ou eliminando, desse modo, a actividade de polipéptido de TSLPR in vitro ou in vivo. Os agentes de ligação selectiva, incluindo anticorpos polipeptídicos anti-TSLPR 79 agonistas e antagonistas, são identificados por ensaios de rastreio que são bem conhecidos na técnica.

Também é aqui divulgado um kit compreendendo agentes de ligação selectiva de TSLPR (tal como anticorpos) e outros reagentes úteis para a detecção de níveis de polipéptido de TSLPR nas amostras biológicas. Esses reagentes podem incluir um marcador detectável, soro de bloqueio, amostras de controlo positivo e negativo e reagentes de detecção.

Micromatrizes

Será entendido que a tecnologia de micromatriz de ADN pode ser utilizada de acordo com a presente invenção. As micromatrizes de ADN são matrizes miniatura, de alta densidade, de ácidos nucleicos posicionados num suporte sólido, tal como vidro. Cada célula ou elemento da matriz contém numerosas cópias de uma única espécie de ácido nucleico que actua como um alvo para hibridação com uma sequência de ácidos nucleicos complementar (e. g. , ARNm) . Na definição de perfil de expressão utilizando a tecnologia de micromatriz de ADN, o ARNm é, em primeiro lugar, extraído de uma amostra de célula ou tecido e, depois, convertido enzimaticamente em ADNc marcado de modo fluorescente. Este material é hibridado à micromatriz e o ADNc não ligado é removido por lavagem. A expressão de genes discretos representados na matriz é, depois, visualizada pela quantificação da quantidade de ADNc marcado que está ligado especificamente a cada molécula de ácido nucleico alvo. Deste modo, a expressão de milhares de genes pode ser quantificada num modo paralelo, de alta capacidade, a partir de uma única amostra de material biológico. 80

Esta definição de perfil de expressão de alta capacidade tem uma ampla gama de aplicações com respeito às moléculas de TSLPR da invenção, incluindo mas não limitadas a: identificação e validação de genes relacionados com doenças de TSLPR como alvos para terapêutica; toxicologia molecular de moléculas de TSLPR relacionadas e seus inibidores; estratificação de populações e produção de marcadores substitutos para ensaios clinicos; e melhoramento da identificação de fármacos de moléculas pequenas de polipéptidos de TSLPR relacionados, pelo auxilio na identificação de compostos selectivos em rastreios de alta capacidade.

Derivados Químicos

Os derivados quimicamente modificados de polipéptidos de TSLPR podem ser preparados por um especialista na técnica, dadas as divulgações aqui descritas. Os derivados de polipéptido de TSLPR são modificados num modo que é diferente, no tipo ou localização, das moléculas naturalmente conjugadas ao polipéptido. Os derivados podem incluir moléculas formadas pela deleção de um ou mais grupos químicos naturalmente conjugados. 0 polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8, ou outro polipéptido de TSLPR, pode ser modificado pela conjugação covalente de um ou mais polímeros. Por exemplo, o polímero seleccionado é, tipicamente, solúvel em água, de modo que a proteína à qual está conjugado não precipite num ambiente aquoso, tal como um ambiente fisiológico. Uma mistura de polímeros está incluída no âmbito de polímeros adequados. De um modo preferido, para utilização terapêutica da preparação de produto final, o polímero será farmaceuticamente aceitável. 81

Cada dos polímeros pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. Os polímeros têm cada, tipicamente, um peso molecular médio compreendido entre cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa (o termo "cerca de" indicando que, em preparações de um polímero solúvel em áqua, algumas moléculas pesarão mais, outras menos, do que o peso molecular referido). 0 peso molecular médio de cada polímero é, de um modo preferido, entre cerca de 5 kDa e cerca de 50 kDa, de um modo mais preferido entre cerca de 12 kDa e cerca de 40 kDa e, de um modo muito preferido, entre cerca de 20 kDa e cerca de 35 kDa.

Os polímeros solúveis em água adequados ou as suas misturas incluem mas não estão limitados a hidratos de carbono ligados a N ou ligados a O, açúcares, fosfatos, polietilenoglicol (PEG) (incluindo as formas de PEG que têm sido utilizadas para derivatizar proteínas, incluindo mono-(Ci-Cio), alcoxi- ou ariloxi-polietilenoglicol), monometoxipolietilenoglicol, dextrano (tal como dextrano de baixo peso molecular de, por exemplo, cerca de 6 kD), celulose, ou outros polímeros à base de hidratos de carbono, poli-(N-vinilpirrolidona) polietilenoglicol, homopolímeros de propilenoglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (e. g., glicerol) e álcool polivinílico. Também são aqui divulgadas moléculas de reticulação bifuncional que podem ser utilizadas para preparar multímeros de polipéptido de TSLPR covalentemente conjugados.

Em geral, a derivatização química pode ser realizada sob qualquer condição adequada utilizada para fazer reagir uma proteína com uma molécula polimérica activada. Os métodos para a preparação de derivados químicos de polipéptidos compreenderão, em geral, as etapas de: (a) fazer reagir o polipéptido com a 82 molécula polimérica activada (tal como um éster reactivo ou derivado aldeído da molécula polimérica) sob condições pelo que o polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8, ou outro polipéptido de TSLPR, fica conjugado a uma ou mais moléculas poliméricas e (b) obtenção dos produtos de reacção. As condições óptimas de reacção serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e no resultado desejado. Por exemplo, quanto maior a razão de moléculas poliméricas para proteína, maior a percentagem de molécula polimérica conjugada. Numa forma de realização, o derivado de polipéptido de TSLPR pode ter uma única fracção de molécula polimérica no terminal amino. Ver, e. g., a Patente U.S. N° 5234784. A peguilação de um polipéptido pode ser especificamente efectuada utilizando qualquer das reacções de peguilação conhecidas na técnica. Essas reacções são descritas, por exemplo, nas seguintes referências: Francis et al., 1992, Focus on Growth Factors 3:4-10; Patentes Europeias N° 0154316 e 0401384; e Patente U.S. N° 4179337. Por exemplo, a peguilação pode ser efectuada por meio de uma reacção de acilação ou uma reacção de alquilação com uma molécula de polietilenoglicol reactiva (ou um polímero solúvel em água reactivo análogo), como aqui descrito. Para as reacções de acilação, um polímero seleccionado deve ter um único grupo éster reactivo. Para alquilação redutora, um polímero seleccionado deve ter um único grupo aldeído reactivo. Um aldeído reactivo é, por exemplo, propionaldeído de polietilenoglicol, que é estável em água, ou os seus derivados de mono alcoxilo ou ariloxilo Ci-Cio (ver a Patente U.S. N° 5252714). 83

Os polipéptidos de TSLPR podem ser quimicamente ligados a biotina. As moléculas de biotina/polipéptido de TSLPR são, depois, deixadas ligar-se a avidina, resultando em moléculas tetravalentes de avidina/biotina/polipéptido de TSLPR. Os polipéptidos de TSLPR também podem ser covalentemente ligados a dinitrofenol (DNP) ou trinitrofenol (TNP) e os conjugados resultantes precipitados com anti-DNP ou anti-TNP-IgM, para formar conjugados decaméricos com uma valência de 10.

Em geral, as condições que podem ser aliviadas ou moduladas pela administração dos presentes derivados de polipéptido de TSLPR, incluem as aqui descritas para polipéptidos de TSLPR. Contudo, os derivados de polipéptido de TSLPR aqui divulgados podem ter actividades adicionais, actividade biológica melhorada ou reduzida ou outras caracteristicas, tais como meia-vida aumentada ou diminuída, em comparação com as moléculas não derivatizadas.

Animais Não Humanos Geneticamente Manipulados

Estão ainda incluídos dentro do âmbito da presente invenção animais não humanos, tais como murganhos, ratos ou outros roedores; coelhos, cabras, ovelhas ou outros animais de criação, nos quais os genes codificando o polipéptido de TSLPR nativo foram dissociados (i. e., "knockout") , de modo a que o nível de expressão do polipéptido de TSLPR seja significativamente diminuído ou completamente abolido. Esses animais podem ser preparados utilizando técnicas e métodos, tal como os descritos na Patente U.S. N° 5557032. 84 São ainda aqui divulgados animais não humanos, tais como murganhos, ratos ou outros roedores; coelhos, cabras, ovelhas ou outros animais de criação, nos quais a forma nativa de um gene de TSLPR para esse animal, ou um gene de TSLPR heterólogo, é sobreexpressa pelo animal criando, desse modo, um animal "transgénico". Esses animais transgénicos podem ser preparados utilizando métodos bem conhecidos, tal como os descritos na Patente U.S. N° 5489743 e Pub. do pedido PCT N° WO 94/28122. São ainda aqui divulgados animais não humanos, nos quais o promotor para um ou mais dos polipéptidos de TSLPR da presente invenção está activado ou inactivado (e. g., pela utilização de métodos de recombinação homóloga) para alterar o nível de expressão de um ou mais dos polipéptidos de TSLPR nativos.

Estes animais não humanos podem ser utilizados para rastreio de fármacos candidatos. Nesse rastreio, o impacto de um fármaco candidato no animal pode ser medido. Por exemplo, os fármacos candidatos podem diminuir ou aumentar a expressão do gene de TSLPR. Em determinadas formas de realização, a quantidade de polipéptido de TSLPR que é produzida pode ser medida após a exposição do animal ao fármaco candidato. Além disso, pode detectar-se o impacto real do fármaco candidato no animal. Por exemplo, a sobreexpressão de um gene particular pode resultar ou estar associada a uma doença ou estado patológico. Nesses casos, pode testar-se a capacidade de um fármaco candidato diminuir a expressão do gene ou a sua capacidade para prevenir ou inibir um estado patológico. Noutros exemplos, a produção de um produto metabólico particular, tal como um fragmento de um polipéptido, pode resultar ou estar associada a uma doença ou estado patológico. Nesses casos, pode testar-se a capacidade de um fármaco candidato diminuir a produção desse 85 produto metabólico ou a sua capacidade para prevenir ou inibir um estado patológico.

Ensaio para Outros Moduladores da Actividade de Polipéptido de TSLPR

Em algumas situações, pode ser desejável identificar moléculas que sejam moduladores, i. e., agonistas ou antagonistas, da actividade do polipéptido de TSLPR. As moléculas naturais ou sintéticas que modulam polipéptido de TSLPR podem ser identificadas utilizando um ou mais ensaios de rastreio, tal como os aqui descritos. Essas moléculas podem ser administradas num modo ex vivo ou num modo in vivo por injecção ou por distribuição oral, dispositivo de implantação ou semelhantes. "Molécula de teste" refere-se a uma molécula que está sob avaliação para a capacidade de modular (i. e., aumentar ou diminuir) a actividade de um polipéptido de TSLPR. De um modo mais comum, uma molécula de teste interagirá directamente com um polipéptido de TSLPR. Contudo, também está contemplado que uma molécula de teste também pode modular a actividade de polipéptido de TSLPR indirectamente, tal como pela afectação da expressão génica de TSLPR, ou pela ligação a um parceiro de ligação de polipéptido de TSLPR (e. g., receptor ou ligando). Numa forma de realização, uma molécula de teste ligar-se-á a um polipéptido de TSLPR com uma afinidade constante de, pelo menos, cerca de 1CT6 M, de um modo preferido cerca de 1CT8 M, de um modo mais preferido cerca de 1CT9 M e, de um modo ainda mais preferido, cerca de 1CT10 M. 86

Os métodos para identificar compostos que interagem com polipéptidos de TSLPR estão abrangidos pela presente invenção. Em determinadas formas de realização, um polipéptido de TSLPR é incubado com uma molécula de teste sob condições que permitem a interacção da molécula de teste com um polipéptido de TSLPR e é medida a extensão da interacção. A molécula de teste pode ser rastreada numa forma substancialmente purificada ou numa mistura em bruto.

Em determinadas formas de realização, um agonista ou antagonista de polipéptido de TSLPR pode ser uma proteina, péptido, hidrato de carbono, lipido ou molécula de baixo peso molecular que interage com polipéptido de TSLPR para regular a sua actividade. As moléculas que regulam a expressão de polipéptido de TSLPR incluem ácidos nucleicos que são complementares a ácidos nucleicos codificando um polipéptido de TSLPR, ou são complementares a sequências de ácido nucleico que dirigem ou controlam a expressão de polipéptido de TSLPR e que actuam como reguladores anti-sentido da expressão.

Assim que uma molécula de teste tenha sido identificada como interagindo com um polipéptido de TSLPR, a molécula pode ser ainda avaliada quanto à sua capacidade para aumentar ou diminuir a actividade de polipéptido de TSLPR. A medição da interacção de uma molécula de teste com polipéptido de TSLPR pode ser efectuada em vários formatos, incluindo ensaios de ligação de base celular, ensaios de ligação de membrana, ensaios de fase de solução e imunoensaios. Em geral, uma molécula de teste é incubada com um polipéptido de TSLPR durante um período de tempo especificado e a actividade de polipéptido de TSLPR é determinada por um ou mais ensaios para medição da actividade biológica. 87 A interacção de moléculas de teste com polipéptidos de TSLPR também pode ser ensaiada directamente, utilizando anticorpos policlonais ou monoclonais num imunoensaio. Alternativamente, as formas modificadas de polipéptidos de TSLPR contendo caudas epitópicas, como aqui descrito, podem ser utilizadas em solução e imunoensaios.

No caso dos polipéptidos de TSLPR exibirem actividade biológica através de uma interacção com um parceiro de ligação (e. g., um receptor ou um ligando), pode ser utilizada uma variedade de ensaios in vitro para medir a ligação de um polipéptido de TSLPR ao correspondente parceiro de ligação (tal como um agente de ligação selectiva, receptor ou ligando). Estes ensaios podem ser utilizados para rastrear moléculas de teste para a sua capacidade de aumentarem ou diminuírem a taxa e/ou a extensão da ligação de um polipéptido de TSLPR ao seu parceiro de ligação. Num ensaio, um polipéptido de TSLPR é imobilizado nos poços de uma placa de microtitulação. 0 parceiro de ligação de polipéptido de TSLPR marcado radioactivamente (por exemplo, parceiro de ligação de polipéptido de TSLPR iodado) e uma molécula de teste podem, depois, ser adicionados um de cada vez (em qualquer ordem) ou simultaneamente aos poços. Após incubação, os poços podem ser lavados e contados para radioactividade, utilizando um contador de cintilação, para determinar a extensão com que o parceiro de ligação se liga ao polipéptido de TSLPR. Tipicamente, uma molécula será testada ao longo de uma gama de concentrações e uma série de poços de controlo, desprovidos de um ou mais elementos dos ensaios de teste, pode ser utilizada para exactidão na avaliação dos resultados. Uma alternativa a este método envolve a reversão das "posições" da proteína, i. e., imobilização do parceiro de ligação de polipéptido de TSLPR nos poços da placa de 88 microtitulação, incubação com a molécula de teste e polipéptido de TSLPR marcado radioactivamente e determinação da extensão de ligação de polipéptido de TSLPR. Ver, e. g., Current Protocols in Molecular Blology, cap. 18 (Ausubel et al., ed., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1995).

Como uma alternativa à marcação radioactiva, um polipéptido de TSLPR, ou seu parceiro de ligação, pode ser conjugado a biotina e a presença de proteína biotinilada pode, depois, ser detectada utilizando estreptavidina ligada a uma enzima, tais como peroxidase de rábano (HRP) ou fosfatase alcalina (AP), que pode ser detectada colorimetricamente, ou por marcação fluorescente de estreptavidina. Um anticorpo dirigido para um polipéptido de TSLPR ou para um parceiro de ligação de polipéptido de TSLPR e que está conjugado a biotina, também pode ser utilizado para efeitos de detecção após incubação do complexo com estreptavidina ligada a enzima ligada a AP ou HRP.

Um polipéptido de TSLPR ou um parceiro de ligação de polipéptido de TSLPR também pode ser imobilizado por conjugação a esferas de agarose, esferas acrílicas ou outros tipos desses substratos inertes de fase sólida. Um complexo de substrato-proteína pode ser colocado numa solução contendo a proteína complementar e o composto de teste. Após incubação, as esferas podem ser precipitadas por centrifugação e a quantidade de ligação entre um polipéptido de TSLPR e seu parceiro de ligação pode ser avaliada utilizando os métodos aqui descritos. Alternativamente, o complexo de substrato-proteína pode ser imobilizado numa coluna com a molécula de teste e proteína complementar passando através da coluna. A formação de um complexo entre um polipéptido de TSLPR e seu parceiro de ligação 89 pode, depois, ser avaliada utilizando qualquer das técnicas aqui descritas (e. g., marcação radioactiva ou ligação de anticorpo) .

Outro ensaio in vitro que é útil para a identificação de uma molécula de teste, que aumenta ou diminui a formação de um complexo entre uma proteína de ligação de polipéptido de TSLPR e um parceiro de ligação de polipéptido de TSLPR, é o sistema detector de ressonância de plasmónio de superfície, tal como o sistema de ensaio BIAcore (Pharmacia, Piscataway, NJ). 0 sistema BIAcore é utilizado como especificado pelo fabricante. Este ensaio envolve, essencialmente, a ligação covalente do polipéptido de TSLPR ou um parceiro de ligação de polipéptido de TSLPR a um chip sensor revestido por dextrano que se situa num detector. 0 composto de teste e a outra proteína complementar podem, depois, ser injectados, simultaneamente ou sequencialmente, dentro da câmara contendo o chip sensor. A quantidade de proteína complementar que se liga pode ser avaliada com base na alteração na massa molecular que está fisicamente associada ao lado revestido por dextrano do chip sensor, com a alteração na massa molecular sendo medida pelo sistema detector.

Em alguns casos, pode ser desejável avaliar dois ou mais compostos de teste em conjunto quanto à sua capacidade de aumentarem ou diminuírem a formação de um complexo entre um polipéptido de TSLPR e um parceiro de ligação de polipéptido de TSLPR. Nestes casos, os ensaios aqui mostrados podem ser facilmente modificados pela adição desse(s) composto(s) de teste, simultaneamente ou subsequente ao primeiro composto de teste. 0 restante das etapas no ensaio é como aqui mostrado. 90

Os ensaios in vitro, tal como os aqui descritos, podem ser utilizados, de um modo vantajoso, para rastrear um grande número de compostos para um efeito na formação de um complexo entre um polipéptido de TSLPR e parceiro de ligação de polipéptido de TSLPR. Os ensaios podem ser automatizados para rastrear compostos gerados nas bibliotecas de apresentação fágica, de péptidos sintéticos e de síntese química.

Os compostos que aumentam ou diminuem a formação de um complexo entre um polipéptido de TSLPR e um parceiro de ligação de polipéptido de TSLPR também podem ser rastreados em cultura celular, utilizando células e linhas celulares expressando polipéptido de TSLPR ou parceiro de ligação de polipéptido de TSLPR. As células e linhas celulares podem ser obtidas de qualquer mamífero mas, de um modo preferido, serão de fonte humana ou outro primata, canina ou roedora. A ligação de um polipéptido de TSLPR a células expressando parceiro de ligação de polipéptido de TSLPR à superfície é avaliada na presença ou ausência de moléculas de teste e a extensão da ligação pode ser determinada, por exemplo, por citometria de fluxo, utilizando um anticorpo biotinilado para um parceiro de ligação de polipéptido de TSLPR. Os ensaios de cultura celular podem ser utilizados para, de um modo vantajoso, avaliar, ainda, compostos que dão positivo em ensaios de ligação de proteína aqui descritos.

As culturas celulares também podem ser utilizadas para rastrear o impacto de um fármaco candidato. Por exemplo, os fármacos candidatos podem diminuir ou aumentar a expressão do gene de TSLPR. Em determinadas formas de realização, a quantidade de polipéptido de TSLPR ou um fragmento de polipéptido de TSLPR que é produzida pode ser medida após exposição da cultura celular ao fármaco candidato. Em 91 determinadas formas de realização, pode detectar-se o impacto real do fármaco candidato na cultura celular. Por exemplo, a sobreexpressão de um gene particular pode ter um impacto particular na cultura celular. Nesses casos, pode testar-se a capacidade de um fármaco candidato aumentar ou diminuir a expressão do gene ou sua capacidade para prevenir ou inibir um impacto particular na cultura celular. Noutros exemplos, a produção de um produto metabólico particular, tal como um fragmento de um polipéptido, pode resultar ou estar associada a uma doença ou estado patológico. Nesses casos, pode testar-se a capacidade de um fármaco candidato diminuir a produção desse produto metabólico numa cultura celular.

Proteínas de Internalização A sequência de proteína tat (de VIH) pode ser utilizada para internalizar proteínas dentro de uma célula. Ver, e. g., Falwell et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91:664-68. Por exemplo, uma sequência de 11 aminoácidos (Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R; SEQ ID N°: 13) da proteína tat de VIH (designado "domínio de transdução de proteína" ou TAT PDT) foi descrita como mediando a distribuição através da membrana citoplasmática e da membrana nuclear de uma célula. Ver Schwarze et al., 1999, Science 285:1569-72; e Nagahara et al., 1998, Nat. Med. 4:1449-52. Nestes processos, construções de FITC (G-G-G-G-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R marcada com FITC; SEQ ID N° : 14), que penetram em tecidos após administração intraperitoneal, são preparadas e a ligação dessas construções a células é detectada por análise de triagem celular de activação fluorescente (FACS). As células tratadas com uma proteína de fusão tat-β-gal demonstrarão a actividade de β-gal. Após injecção, a expressão 92 dessa construção pode ser detectada num número de tecidos, incluindo tecido de fígado, rim, pulmão, coração e cérebro. Considera-se que essas construções sofrem algum grau de desenrolamento, de modo a entrarem na célula e, como tal, podem requerer um reenrolamento após entrada na célula.

Será, deste modo, entendido que a sequência de proteína tat pode ser utilizada para internalizar um polipéptido desejado dentro de uma célula. Por exemplo, utilizando a sequência de proteína tat, um antagonista de TSLPR (tais como um agente de ligação selectiva anti-TSLPR, molécula pequena, receptor solúvel ou oligonucleótido anti-sentido) pode ser administrado intracelularmente para inibir a actividade de uma molécula de TSLPR. Como aqui utilizado, o termo "molécula de TSLPR" refere-se a moléculas de ácido nucleico de TSLPR e polipéptidos de TSLPR, como aqui definido. Onde desejado, a própria proteína de TSLPR também pode ser administrada internamente a uma célula utilizando estes processos. Ver também, Straus, 1999, Science 285:1466-67.

Identificação de Fonte Celular Utilizando Polipéptido de

TSLPR

De acordo com determinadas formas de realização da invenção, pode ser útil poder ser-se capaz de determinar a fonte de um determinado tipo de célula associado a um polipéptido de TSLPR. Por exemplo, pode ser útil determinar a origem de uma doença ou estado patológico como um auxílio na selecção de uma terapia apropriada. Em determinadas formas de realização, os ácidos nucleicos codificando um polipéptido de TSLPR podem ser utilizados como uma sonda para identificar células aqui 93 descritas, pelo rastreio dos ácidos nucleicos das células com essa sonda. Noutras formas de realização, podem utilizar-se anticorpos polipeptidicos anti-TSLPR para testar para a presença de polipéptido de TSLPR em células e, deste modo, determinar se essas células são dos tipos aqui descritos.

Composições e Administração de Polipéptido de TSLPR

As composições terapêuticas estão dentro do âmbito da presente invenção. Essas composições farmacêuticas de polipéptido de TSLPR podem compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido de TSLPR ou uma molécula de ácido nucleico de TSLPR, em mistura com um agente de formulação farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável, seleccionado para adequação com o modo de administração. As composições farmacêuticas podem compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes de ligação selectiva de polipéptido de TSLPR, em mistura com um agente de formulação farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável, seleccionado para adequação com o modo de administração.

De um modo preferido, os materiais de formulação aceitáveis são não tóxicos para os receptores às dosagens e concentrações empregues. A composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificação, manutenção ou conservação, por exemplo, do pH, osmolaridade, viscosidade, claridade, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou libertação, adsorção ou penetração da composição. Os materiais de formulação adequados incluem mas não estão 94 limitados a aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina), antimicrobianos, antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio), tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos), agentes de volume (tais como manitol ou glicina), agentes quelantes (tal como ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA)), agentes complexantes (tais como cafeína, polivinilpirrolidona, ciclodextrina beta ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina), espessantes, monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono (tais como glucose, manose or dextrinas), proteínas (tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas), agentes corantes, aromatizantes e de diluição, agentes emulsionantes, polímeros hidrófilos (tal como polivinilpirrolidona), polipéptidos de baixo peso molecular, contra-iões de formação de sal (tal como sódio), conservantes (tais como cloreto de benzalcónio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, cloro-hexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogénio) , solventes (tais como glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol), álcoois de açúcar (tais como manitol ou sorbitol), agentes de suspensão, surfactantes ou agentes molhantes (tais como pluronics; PEG; ésteres de sorbitano; polissorbato, tais como polissorbato 20 ou polissorbato 80; triton; trometamina; lecitina; colesterol ou tiloxapal), agentes de melhoramento de estabilidade (tais como sacarose ou sorbitol), agentes de melhoramento de tonicidade (tais como halogenetos de metal alcalino - de um modo preferido cloreto de sódio ou potássio - ou manitol sorbitol), transportadores de distribuição, diluentes, excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. Ver Remington's Pharmaceutical Sciences (18a Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990. 95 A composição farmacêutica óptima será determinada por um especialista na técnica, dependendo, por exemplo, da via de administração pretendida, formato de distribuição e dosagem desejada. Ver, e. g., Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Essas composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de libertação in vivo e taxa de depuração in vivo da molécula de TSLPR. 0 transportador ou veículo primário, numa composição farmacêutica, pode ser aquoso ou não aquoso em natureza. Por exemplo, um transportador ou veículo adequado para injecção pode ser água, solução salina fisiológica ou fluido cerebrospinal artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parentérica. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica são veículos exemplificativos adicionais. Outras composições farmacêuticas exemplificativas compreendem tampão TRIS, de pH de cerca 7,0-8,5 ou tampão acetato, de pH de cerca 4,0-5,5, que podem ainda incluir sorbitol ou um substituto adequado. Numa forma de realização da presente invenção, as composições de polipéptido de TSLPR podem ser preparadas para armazenamento pela mistura da composição seleccionada, tendo o grau de pureza desejado, com agentes de formulação opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra), na forma de um bolo liofilizado ou uma solução aquosa. Além disso, o produto de polipéptido de TSLPR, pode ser formulado como um liofilizado, utilizando excipientes apropriados, tal como sacarose.

As composições farmacêuticas de polipéptido de TSLPR podem ser seleccionadas para distribuição parentérica. Alternativamente, as composições podem ser seleccionadas para inalação ou para distribuição através do aparelho digestivo, tal 96 como oralmente. A preparação dessas composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro do conhecimento da técnica.

Os componentes de formulação estão presentes em concentrações que são aceitáveis para o local de administração. Por exemplo, são utilizados tampões para manter a composição a pH fisiológico ou a pH ligeiramente inferior, tipicamente numa gama de pH desde cerca de 5 a cerca de 8.

Quando a administração parentérica for contemplada, as composições terapêuticas para utilização nesta invenção podem ser na forma de uma solução aquosa apirogénica, parentericamente aceitável, compreendendo a molécula de TSLPR desejada num veiculo farmaceuticamente aceitável. Um veiculo particularmente adequado para injecção parentérica é água destilada estéril, na qual uma molécula de TSLPR é formulada como uma solução estéril, isotónica, conveniente preservada. Ainda outra preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, tais como microsferas injectáveis, partículas bio-erodíveis, compostos poliméricos (tais como ácido poliláctico ou ácido poliglicólico), esferas ou lipossomas, que proporcionam libertação controlada ou prolongada do produto que pode, depois, ser distribuído por meio de uma injecção de depósito. 0 ácido hialurónico também pode ser utilizado e este pode ter o efeito de promover duração prolongada na circulação. Outros meios adequados para a introdução da molécula desejada incluem dispositivos de distribuição de fármaco implantáveis.

Numa forma de realização, uma composição farmacêutica pode ser formulada para inalação. Por exemplo, o polipéptido de TSLPR pode ser formulado como um pó seco para inalação. As soluções de 97 inalação de polipéptido ou molécula de ácido nucleico de TSLPR também podem ser formuladas com um propulsor para distribuição de aerossol. Ainda noutra forma de realização, as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar é ainda descrita na Pub. do pedido PCT N° WO 94/20069, que descreve a distribuição pulmonar de proteínas quimicamente modificadas.

Também está contemplado que determinadas formulações podem ser administradas oralmente. Numa forma de realização da presente invenção, os polipéptidos de TSLPR que são administrados deste modo podem ser formulados com ou sem esses veículos habitualmente utilizados na manipulação de formas de dosagem sólidas, tais como comprimidos e cápsulas. Por exemplo, uma cápsula pode ser concebida para libertar a porção activa da formulação no ponto no aparelho gastrointestinal, quando a biodisponibilidade está maximizada e a degradação pré-sistémica está minimizada. Podem ser incluídos agentes adicionais para facilitar a absorção do polipéptido de TSLPR. Também podem ser empregues diluentes, aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimidos e aglutinantes.

Outra composição farmacêutica pode envolver uma quantidade eficaz de polipéptidos de TSLPR numa mistura com excipientes não tóxicos que sejam adequados para a preparação de comprimidos. Pela dissolução dos comprimidos em água estéril, ou outro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas na forma de dose unitária. Os excipientes adequados incluem mas não estão limitados a diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, tais como amido, gelatina ou acácia; ou 98 agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.

Composições farmacêuticas de polipéptido de TSLPR adicionais serão evidentes para os especialistas na técnica, incluindo formulações envolvendo polipéptidos de TSLPR em formulações de distribuição prolongada ou controlada. As técnicas para a formulação de uma variedade de outros meios de distribuição prolongada ou controlada, tais como transportadores lipossomais, microparticulas bio-erodiveis ou esferas porosas e injecções de depósito, também são conhecidas dos especialistas na técnica. Ver, e. g., o documento PCT/US93/00829, que descreve a libertação controlada de microparticulas poliméricas porosas para a distribuição de composições farmacêuticas.

Exemplos adicionais de preparações de libertação prolongada incluem matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos perfilados, e. g., películas ou microcápsulas. As matrizes de libertação prolongada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactidas (Patente U.S. N° 3773919 e Patente Europeia N° 058481, copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-56), poli(2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 e Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), acetato de etileno vinílico (Langer et al., supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (Patente Europeia N° 133988). As composições de libertação prolongada também podem incluir lipossomas que podem ser preparados por qualquer de vários métodos conhecidos na técnica. Ver, e. g., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3688-92; e Patentes Europeias N° 036676, 088046 e 143949. 99 A composição farmacêutica de TSLPR a ser utilizada para administração in vivo, tipicamente, deve ser estéril. Esta pode ser alcançada por filtração, através de membranas de filtração estéreis. Se a composição for liofilizada, a esterilização utilizando este método pode ser conduzida antes ou a seguir à liofilização e reconstituição. A composição para administração parentérica pode ser armazenada na forma liofilizada ou numa solução. Além disso, as composições parentéricas são, em geral, colocadas dentro de um recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou um frasquino tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica.

Assim que a composição farmacêutica tiver sido formulada, pode ser armazenada em frascos-ampola estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólida ou como um pó desidratado ou liofilizado. Essas formulações podem ser armazenadas numa forma pronta a utilizar ou numa forma (e. g.r liofilizada) requerendo reconstituição antes da administração.

Numa forma de realização especifica, a presente invenção é dirigida a kits para a produção de uma unidade de administração de dose única. Os kits podem conter, cada, um primeiro recipiente tendo uma proteína seca e um segundo recipiente tendo uma formulação aquosa. Também estão incluídos dentro do âmbito desta invenção kits contendo seringas pré-cheias de câmara única e múltipla (e. g., seringas de liquido e liosseringas). A quantidade eficaz de uma composição farmacêutica de TSLPR a ser empregue terapeuticamente dependerá, por exemplo, do contexto terapêutico e objectivos. Um especialista na técnica entenderá que os níveis de dosagem apropriados para tratamento 100 irão, assim, variar, dependendo, em parte, da molécula distribuída, da indicação para a qual a molécula de TSLPR está sendo utilizada, da via de administração e do tamanho (peso corporal, superfície corporal ou tamanho do órgão) e estado (a idade e saúde geral) do doente. Consequentemente, o clínico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico óptimo. Uma dosagem típica pode variar desde cerca de 0,1 pg/kg a até cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores mencionados acima. Noutras formas de realização, a dosagem pode variar desde 0,1 pg/kg até cerca de 100 mg/kg; ou 1 pg/kg até cerca de 100 mg/kg; ou 5 pg/kg até cerca de 100 mg/kg. A frequência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos da molécula de TSLPR na formulação sendo utilizada. Tipicamente, um clínico administrará a composição até ser atingida uma dosagem que alcance o efeito desejado. A composição pode, por conseguinte, ser administrada como uma dose única, como duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo, ou como uma infusão contínua por meio de um dispositivo de implantação ou cateter. O refinamento adicional da dosagem apropriada é rotineiramente realizado por alguém com conhecimentos gerais na técnica e está dentro do âmbito das tarefas rotineiramente realizadas pelos mesmos. As dosagens apropriadas podem ser apuradas através da utilização de dados de dose-resposta apropriados. A via de administração da composição farmacêutica está em conformidade com métodos conhecidos, e. g., oralmente; através de injecção pelas vias intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparênquimatosa), intracerebroventricular, 101 intramuscular, intra-ocular, intra-arterial, intraportal ou intralesional; por sistemas de libertação prolongada; ou por dispositivos de implantação. Quando desejado, as composições podem ser administradas por injecção de bólus ou continuamente por infusão ou por dispositivo de implantação.

Alternativamente ou além disso, a composição também pode ser administrada localmente, por meio de implantação de uma membrana, esponja ou outro material apropriado, sobre o qual a molécula desejada foi absorvida ou encapsulada. Se for utilizado um dispositivo de implantação, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado e a distribuição da molécula desejada pode ser por meio de difusão, bólus de libertação temporizada ou administração continua.

Em alguns casos, pode ser desejável utilizar composições farmacêuticas de polipéptido de TSLPR num modo ex vivo. Nesses casos, células, tecidos ou órgãos que tenham sido removidos do doente, são mostrados a composições farmacêuticas de polipéptido de TSLPR, após o que as células, tecidos e/ou órgãos são subsequentemente implantadas de volta no doente.

Noutros casos, um polipéptido de TSLPR pode ser distribuído pela implantação de determinadas células que foram geneticamente manipuladas, utilizando métodos, tais como os aqui descritos, para expressar e segregar o polipéptido de TSLPR. Essas células podem ser células animais ou humanas e podem ser autólogas, heterólogas ou xenógenas. Opcionalmente, as células podem ser imortalizadas. De modo a diminuir a probabilidade de uma resposta imunológica, as células podem ser encapsuladas para evitar a infiltração de tecidos circundantes. Os materiais de encapsulação são, tipicamente, invólucros ou membranas 102 biocompatíveis, semipermeáveis poliméricos que permitem a libertação do produto(s) de proteína mas previnem a destruição das células pelo sistema imunitário do doente ou por outros factores prejudiciais dos tecidos circundantes.

Como aqui discutido, pode ser desejável tratar populações celulares isoladas (tais como células estaminais, linfócitos, glóbulos vermelhos, condrócitos, neurónios e semelhantes) com um ou mais polipéptidos de TSLPR. Isto pode ser alcançado pela exposição das células isoladas directamente ao polipéptido, onde está numa forma que é permeável à membrana celular.

Também são divulgadas células e métodos (e. g., recombinação homóloga e/ou outros métodos de produção recombinante) para a produção in vitro de polipéptidos terapêuticos e para a produção e distribuição de polipéptidos terapêuticos por terapia génica ou terapia celular. Os métodos de recombinação homóloga e outros métodos de recombinação podem ser utilizados para modificar uma célula que contém um gene de TSLPR, normalmente, transcricionalmente silencioso, ou um gene subexpresso e, desse modo, produzir uma célula que expressa quantidades terapeuticamente eficazes de polipéptidos de TSLPR. A recombinação homóloga é uma técnica originalmente desenvolvida para sequenciar genes para induzir ou corrigir mutações em genes transcricionalmente activos. Kucherlapati, 1989, Prog. in Nucl. Acid Res. & Mol. Biol. 36:301. A técnica básica foi desenvolvida como um método para a introdução de mutações específicas em regiões específicas do genoma de mamífero (Thomas et ai., 1986, Cell 44:419-28; Thomas e Capecchi, 1987, Cell 51:503-12; Doetschman et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:8583-87) ou para corrigir mutações 103 específicas dentro de genes defeituosos (Doetschman et al., 1987, Nature 330:576-78). As técnicas de recombinação homóloga exemplificativas são descritas na Patente U.S. N° 5272071; Patentes Europeias N° 9193051 e 505500; documento PCT/US90/07642 e PCT Pub N° WO 91/09955).

Através de recombinação homóloga, uma sequência de ADN a ser inserida no genoma pode ser dirigida para uma região específica do gene de interesse pela sua conjugação a ADN alvo. O ADN alvo é uma sequência nucleotídica que é complementar (homóloga) a uma região do ADN genómico. Pedaços pequenos de ADN alvo que são complementares a uma região específica do genoma são colocados em contacto com a cadeia parental durante o processo de replicação de ADN. É uma propriedade geral do ADN que foi inserido numa célula hibridar-se e, por conseguinte, recombinar-se com outros pedaços de ADN endógeno através de regiões homólogas partilhadas. Se esta cadeia complementar for conjugada a um oligonucleótido que contenha uma mutação ou uma sequência diferente ou um nucleótido adicional, também esta é incorporada na cadeia sintetizada de novo, como resultado da recombinação. Como resultado da função de revisão, é possível que a nova sequência de ADN sirva como o molde. Deste modo, o ADN transferido é incorporado no genoma.

Conjugadas a estes pedaços de ADN alvo estão regiões de ADN que podem interagir ou controlar a expressão de um polipéptido de TSLPR, e. g. , sequências flanqueadoras. Por exemplo, um elemento promotor/estimulador, um supressor ou um elemento modulatório de transcrição exógeno é inserido no genoma da célula hospedeira pretendida, em proximidade e orientação suficientes, para influenciar a transcrição de ADN codificando o polipéptido de TSLPR desejado. O elemento de controlo controla 104 uma porção do ADN presente no genoma da célula hospedeira. Deste modo, a expressão do polipéptido de TSLPR desejado pode ser alcançada, não por transfecção do ADN que codifica o próprio gene de TSLPR, mas antes pela utilização de ADN alvo (contendo regiões de homologia com o gene de interesse endógeno) ligado com segmentos regulatórios de ADN que proporcionam a sequência génica endógena com sinais reconhecíveis para transcrição de um gene de TSLPR.

Num método exemplificativo, a expressão de um gene visado desejado numa célula (i. e., um gene celular endógeno desejado) é alterada por meio de recombinação homóloga para dentro do genoma celular num sítio pré-seleccionado, pela introdução de ADN que inclui, pelo menos, uma sequência regulatória, um exão e um sítio dador de excisão. Estes componentes são introduzidos no ADN cromossómico (genómico) de modo a que isto, com efeito, resulte na produção de uma nova unidade de transcrição (na qual a sequência regulatória, o exão e o sítio dador de excisão presentes na construção de ADN estão operativamente ligados ao gene endógeno). Como resultado da introdução destes componentes dentro do ADN cromossómico, a expressão do gene endógeno desejado é alterada. A expressão génica alterada, como aqui descrito, abrange a activação (ou causando a expressão) de um gene que é normalmente silencioso (não expresso) na célula como obtida, assim como o aumento da expressão de um gene que não é expresso a níveis fisiologicamente significativos nas células como obtidas. As formas de realização abrangem, ainda, a alteração do padrão de regulação ou indução, de modo a que seja diferente do padrão de regulação ou indução que ocorre na célula como obtida, e a 105 redução (incluindo eliminação) da expressão de um gene que é expresso na célula como obtida.

Um método pelo qual a recombinação homóloga pode ser utilizada para aumentar, ou causar, a produção de polipéptido de TSLPR a partir de um gene de TSLPR endógeno de uma célula envolve, em primeiro lugar, a utilização de recombinação homóloga para colocar uma sequência de recombinação de um sistema de recombinação especifico de sitio (e. g., Cre/loxP, FLP/FRT) (Sauer, 1994, Curr. Opin. Biotechnol., 5:521-27; Sauer, 1993, Methods Enzymol., 225:890-900) a montante (i. e., a 5') da região codificante de polipéptido de TSLPR genómico endógeno da célula. Um plasmideo contendo um sitio de recombinação homólogo ao sitio que foi colocado imediatamente a montante da região codificante de polipéptido de TSLPR genómico é introduzido na linha celular modificada, juntamente com a enzima recombinase apropriada. Esta recombinase causa a integração do plasmideo, por meio do sitio de recombinação do plasmideo, no sitio de recombinação localizado imediatamente a montante da região codificante de polipéptido de TSLPR genómico na linha celular (Baubonis e Sauer, 1993, Nucleic Acids Res. 21:2025-29; 0'Gorman et al., 1991, Science 251:1351-55). Quaisquer sequências flanqueadoras, conhecidas por aumentarem a transcrição (e. g., estimulador/promotor, intrão, estimulador de tradução), se posicionadas de modo apropriado neste plasmideo, integrar-se-iam de modo a criarem uma unidade transcricional nova ou modificada, resultando na produção de novo ou aumentada de polipéptido de TSLPR a partir do gene de TSLPR endógeno da célula.

Um método adicional para utilizar a linha celular, no qual a sequência de recombinação especifica de sitio foi colocada imediatamente a montante da região codificante de polipéptido de 106 TSLPR genómico endógeno da célula, é a utilização de recombinação homóloga para introduzir um segundo sítio de recombinação noutro local no genoma da linha celular. A enzima recombinase apropriada é, depois, introduzida na linha celular de dois sítios de recombinação, causando um evento de recombinação (deleção, inversão e translocação) (Sauer, 1994,

Curr. Opin. Biotechnol., 5:521-27; Sauer, 1993, Methods

Enzymol., 225:890-900) que criaria uma unidade transcricional nova ou modificada, resultando na produção de novo ou aumentada de polipéptido de TSLPR a partir do gene de TSLPR endógeno da célula.

Uma abordagem adicional para aumentar, ou causar, a expressão de polipéptido de TSLPR a partir de um gene de TSLPR endógeno de uma célula envolve aumentar, ou causar, a expressão de um gene ou genes (e. g., factores de transcrição) e/ou diminuir a expressão de um gene ou genes (e. g., repressores transcricionais) num modo que resulte na produção de novo ou aumentada de polipéptido de TSLPR a partir do gene de TSLPR endógeno da célula. Este método inclui a introdução de um polipéptido de ocorrência não natural (e. g., um polipéptido compreendendo um domínio de ligação de ADN específico de sítio fundido a um domínio de factor transcricional) na célula, de modo a que resulte a produção de novo ou aumentada de polipéptido de TSLPR a partir do gene de TSLPR endógeno da célula. São ainda divulgadas construções de ADN úteis no método de alteração da expressão de um gene alvo. Em determinadas formas de realização, as construções de ADN exemplificativas compreendem: (a) uma ou mais sequências alvo, (b) uma sequência regulatória, (c) um exão e (d) um sítio dador de excisão não 107 emparelhado. A sequência alvo na construção de ADN dirige a integração de elementos (a) - (d) num gene alvo numa célula, de modo a que os elementos (b) - (d) estejam operativamente ligados a sequências do gene alvo endógeno. Noutra forma de realização, as construções de ADN compreendem: (a) uma ou mais sequências alvo, (b) uma sequência regulatória, (c) um exão, (d) um sitio dador de excisão, (e) um intrao e (f) um sitio aceitador de excisão, em que a sequência alvo dirige a integração de elementos (a) - (f) de modo a que os elementos de (b) - (f) estejam operativamente ligados ao gene endógeno. A sequência alvo é homóloga ao sítio pré- seleccionado no ADN cromossómico celular com o qual deve ocorrer a recombinação homóloga. Na construção, o exão está, em geral, a 3' da sequência regulatória e o sitio dador de excisão está a 3' do exão.

Se a sequência de um gene particular for conhecida, tal como a sequência de ácidos nucleicos do polipéptido de TSLPR aqui apresentado, um pedaço de ADN que é complementar a uma região seleccionada do gene pode ser sintetizado ou, de outro modo, obtido, tal como por restrição apropriada do ADN nativo em sítios de reconhecimento específicos ligando a região de interesse. Este pedaço serve como uma sequência alvo após inserção na célula e hibridar-se-á à sua região homóloga dentro do genoma. Se esta hibridação ocorrer durante a replicação de ADN, este pedaço de ADN, e qualquer sequência adicional a ele conjugada, actuará como um fragmento de Okazaki e será incorporado dentro da cadeia de ADN filha sintetizada de novo. Os nucleótidos codificando um polipéptido de TSLPR, cujos nucleótidos podem ser utilizados como sequências alvo, também são aqui divulgados. 108 A terapia celular de polipéptido de TSLPR, e. g., a implantação de células produzindo polipéptidos de TSLPR, também está contemplada. Esta forma de realização envolve a implantação de células capazes de sintetizar e segregar uma forma biologicamente activa de polipéptido de TSLPR. Essas células produzindo polipéptido de TSLPR podem ser células que são produtores naturais de polipéptidos de TSLPR ou podem ser células recombinantes, cuja capacidade para produzirem polipéptidos de TSLPR foi aumentada por transformação com um gene codificando o polipéptido de TSLPR desejado ou com um gene aumentando a expressão de polipéptido de TSLPR. Essa modificação pode ser alcançada por meio de um vector adequado para a distribuição do gene, assim como a promoção da sua expressão e secreção. De modo a minimizar uma potencial reacção imunológica em doentes que são administrados com um polipéptido de TSLPR, como pode ocorrer com a administração de um polipéptido de uma espécie estranha, prefere-se que as células naturais produzindo polipéptido de TSLPR sejam de origem humana e produzam polipéptido de TSLPR humano. Do mesmo modo, prefere-se que as células recombinantes produzindo polipéptido de TSLPR sejam transformadas com um vector de expressão contendo um gene codificando um polipéptido de TSLPR humano.

As células implantadas podem ser encapsuladas para evitar a infiltração de tecido circundante. As células animais, humanas ou não humanas, podem ser implantadas em doentes em invólucros ou membranas biocompativeis, semipermeáveis poliméricos que permitem a libertação de polipéptido de TSLPR, mas que previnem a destruição das células pelo sistema imunitário do doente ou por outros factores prejudiciais do tecido circundante. Alternativamente, as próprias células do doente, transformadas 109 para produzirem polipéptidos de TSLPR ex vivo, podem ser implantadas directamente no doente sem essa encapsulação.

As técnicas para a encapsulação de células vivas são conhecidas na matéria e a preparação das células encapsuladas e a sua implantação em doentes pode ser rotineiramente alcançada. Por exemplo, Baetge et al. (Pub. do pedido PCT N° WO 95/05452 e PCT/US94/09299) descrevem cápsulas de membrana contendo células geneticamente manipuladas para a distribuição eficaz de moléculas biologicamente activas. As cápsulas são biocompativeis e são facilmente recuperáveis. As cápsulas encapsulam células transfectadas com moléculas de ADN recombinante, compreendendo sequências de ADN codificando para moléculas biologicamente activas, operativamente ligadas a promotores que não estão sujeitos a regulação negativa in vivo, após implantação dentro num hospedeiro mamifero. Os dispositivos proporcionam a distribuição das moléculas de células vivas para sítios específicos num receptor. Além disso, ver as Patentes U.S. N° 4892538; 5011472; e 5106627. Um sistema para encapsulação de células vivas é descrito na Pub. do pedido PCT N° WO 91/10425 (Aebischer et al.). Ver, também, o pedido Pub. do PCT N° WO 91/10470 (Aebischer et al.); Winn et al. , 1991, Exper. Neurol. 113 : 322 — 29; Aebischer et al., 1991, Exper. Neurol. 111:269-75; e Tresco et al., 1992, ASAIO 38:17-23 • Também está prevista a distribuição de terapia génica in vivo e in vitro de polipéptidos de TSLPR. Um exemplo de uma técnica de terapia génica é utilizar o gene de TSLPR (ADN genómico, ADNc e/ou ADN sintético) codificando um polipéptido de TSLPR, que pode estar ligado, de um modo operativo, a um promotor constitutivo ou indutível, para formar uma "construção de ADN de terapia génica". O promotor pode ser homólogo ou 110 heterólogo em relação ao gene de TSLPR endógeno, desde que seja activo no tipo de célula ou tecido no qual a construção será inserida. Outros componentes da construção de ADN de terapia génica podem, opcionalmente, incluir moléculas de ADN concebidas para integração especifica de sitio (e. g, sequências endógenas úteis para recombinação homóloga), promotores, estimuladores ou silenciadores específicos de tecido, moléculas de ADN capazes de proporcionarem uma vantagem selectiva em relação à célula parental, moléculas de ADN úteis como marcadores para identificar células transformadas, sistemas de selecção negativa, agentes de ligação específicos de célula (como, por exemplo, para o alvejamento celular), factores de internalização específicos de célula, factores de transcrição melhorando a expressão a partir de um vector e factores possibilitando a produção de vector.

Uma construção de ADN de terapia génica pode, depois, ser introduzida em células (ex vivo ou in vivo) utilizando vectores virais ou não virais. Um meio para a introdução da construção de ADN de terapia génica é por meio de vectores virais, como aqui descrito. Determinados vectores, tais como vectores retrovirais, distribuirão a construção de ADN no ADN cromossómico das células e o gene pode integrar-se dentro do ADN cromossómico. Outros vectores funcionarão como epissomas e a construção de ADN de terapia génica permanecerá no citoplasma.

Ainda noutras formas de realização, podem ser incluídos elementos reguladores para a expressão controlada do gene de TSLPR na célula alvo. Esses elementos são ligados em resposta a um efector apropriado. Deste modo, um polipéptido terapêutico pode ser expresso quando desejado. Um meio de controlo convencional envolve a utilização de dimerizadores ou rapalogos 111 de molécula pequena para dimerizar proteínas quiméricas que contêm um domínio de liqação de molécula pequena e um domínio capaz de iniciar um processo biolóqico, tais como uma proteína de ligação de ADN ou proteína de activação transcricional (ver os documentos PCT Pub. N° WO 96/41865, WO 97/31898 e WO 97/31899). A dimerização das proteínas pode ser utilizada para iniciar a transcrição do transgene.

Uma tecnologia de regulação alternativa utiliza um método de armazenamento de proteínas expressas do gene de interesse na célula como um agregado ou aglomerado. 0 gene de interesse é expresso como uma proteína de fusão que inclui um domínio de agregação condicional que resulta na retenção da proteína agregada no retículo endoplasmático. As proteínas armazenadas são estáveis e inactivas na célula. As proteínas podem ser libertadas, contudo, pela administração de um fármaco (e. g., ligando de molécula pequena) que remove o domínio de agregação condicional e, desse modo, desagrega, de um modo específico, os agregados ou aglomerados, para que as proteínas possam ser segregadas da célula. Ver Aridor et al., 2000, Science 287:816- 17 e Rivera et al., 2000, Science 287:826-30.

Outros meios de controlo adequados ou interruptores génicos incluem mas não estão limitados aos sistemas aqui descritos. A mifepristona (RU486) é utilizada como um antagonista de progesterona. A ligação de um domínio de ligação de ligando de receptor de progesterona modificado ao antagonista da progesterona activa a transcrição, pela formação de um dímero de dois factores de transcrição que, depois, passa para o núcleo para se ligar ao ADN. O domínio de ligação de ligando é modificado para eliminar a capacidade do receptor se ligar ao ligando natural. O sistema de receptor de hormona esteróide 112 modificado é ainda descrito na Patente U.S. N° 5364791 e documentos PCT Pub. N° WO 96/40911 e WO 97/10337.

Ainda outro sistema de controlo utiliza ecdisona (uma hormona esteróide da mosca da fruta) que se liga e activa um receptor de ecdisona (receptor citoplasmático). O receptor, depois, transloca-se para o núcleo para se ligar a um elemento de resposta de ADN especifico (promotor do gene responsivo de ecdisona). O receptor de ecdisona inclui um domínio de transactivação, domínio de ligação de ADN e domínio de ligação de ligando para iniciar a transcrição. O sistema de ecdisona é ainda descrito na Patente U.S. N° 5514578 e Pub. PCT N° WO 97/38117, WO 96/37609 e WO 93/03162.

Outro meio de controlo utiliza um transactivador positivo controlável por tetraciclina. Este sistema envolve um domínio de ligação de ADN de proteína repressora tet mutado (alterações nos aminoácidos R-4 de tet mutados que resultaram numa proteína transactivadora de tetraciclina reversa, i. e., liga-se a um operador tet na presença de tetraciclina) ligado a um polipéptido que activa a transcrição. Esses sistemas são descritos nas Patentes U.S. N° 5464758, 5650298 e 5654168.

Sistemas de controlo de expressão e construções de ácido nucleico adicionais são descritos nas Patentes U.S. N° 5741679 e 5834186 de Innovir Laboratories Inc. A terapia génica in vivo pode ser alcançada pela introdução do gene codificando polipéptido de TSLPR em células, por meio de injecção local de uma molécula de ácido nucleico de TSLPR ou por outros vectores de distribuição, virais ou não virais, apropriados. Hefti 1994, Neurobiology 25:1418-35. Por exemplo, 113 uma molécula de ácido nucleico codificando um polipéptido de TSLPR pode estar contida num vector de vírus adeno-associado (AAV) para distribuição nas células alvo (ver, e. g., Johnson, documentos Pub. PCT N° WO 95/34670; Pedido Pedido PCT N° PCT/US95/07178) . 0 genoma de AAV recombinante, tipicamente, contém sequências repetidas terminais invertidas de AAV flanqueando uma sequência de ADN codificando um polipéptido de TSLPR ligado, de um modo operativo, a sequências promotoras e de poliadenilação funcionais.

Vectores virais adequados alternativos incluem mas não estão limitados a vectores de retrovírus, adenovírus, vírus herpes simplex, lentivírus, vírus da hepatite, parvovírus, papovavírus, poxvirus, alfavírus, coronavírus, rabdovírus, paramixovírus e vírus do papiloma. A Patente U.S. N° 5672344 descreve um sistema de transferência génica de mediação virai in vivo, envolvendo um vector de HSV-1 neurotrófico recombinante. A Patente U.S. N° 5399346 proporciona exemplos de um processo para proporcionar a um doente uma proteína terapêutica, pela distribuição de células humanas que foram tratadas in vitro para inserirem um segmento de ADN codificando uma proteína terapêutica. Métodos e materiais adicionais para a prática de técnicas de terapia génica são descritos nas Patentes U.S. N° 5631236 (envolvendo vectores adenovirais), 5672510 (envolvendo vectores retrovirais), 5635399 (envolvendo vectores retrovirais expressando citocinas).

Os métodos de distribuição não virai incluem mas não estão limitados a transferência mediada por lipossoma, distribuição de ADN livre (injecção directa), transferência mediada por receptor (complexo ligando-ADN), electroporação, precipitação por fosfato de cálcio e bombardeamento de micropartícuias (e. g., canhão de 114 genes). Os materiais e métodos de terapia génica também podem incluir promotores indutíveis, promotores-estimuladores específicos de tecido, sequências de ADN concebidas para integração específica de sítio, sequências de ADN capazes de proporcionarem uma vantagem selectiva em relação à célula parental, marcadores para identificar células transformadas, sistemas de selecção negativa e sistemas de controlo de expressão (medidas de segurança), agentes de ligação específicos de célula (para sequencição celular), factores de internalização específicos de célula e factores de transcrição para melhorar a expressão por um vector, assim como métodos de preparação de vectores. Esses métodos e materiais adicionais para a prática de técnicas de terapia génica são descritos nas Patentes U.S. N° 4970154 (envolvendo técnicas de electroporação) , 5679559 (descrevendo um sistema contendo lipoproteína para distribuição génica), 5676954 (envolvendo transportadores lipossomais) , 5593875 (descrevendo métodos para transfecção por fosfato de cálcio) e 4945050 (descrevendo um processo em que partículas biologicamente activas são propelidas em células a uma velocidade pela qual as partículas penetram a superfície das células e se tornam incorporadas dentro do interior das células) e Pub. do pedido PCT N° WO 96/40958 (envolvendo ligandos nucleares).

Também está contemplado que a terapia génica de TSLPR ou terapia celular pode ainda incluir a distribuição de um ou mais polipéptido(s) adicional ou adicionais na(s) mesma(s) ou numa célula(s) diferente (s) . Essas células podem ser separadamente introduzidas no doente, ou as células podem estar contidas num único dispositivo implantável, tal como a membrana de encapsulação descrita acima, ou as células podem ser separadamente modificadas por meio de vectores virais. 115

Um meio para aumentar a expressão endógena de polipéptido de TSLPR numa célula por meio de terapia génica é inserir um ou mais elementos estimuladores no promotor do polipéptido de TSLPR, onde os elementos estimuladores podem servir para aumentar a actividade transcricional do gene de TSLPR. Os elementos estimuladores utilizados serão seleccionados com base no tecido no qual se deseja activar o gene - serão seleccionados os elementos estimuladores conhecidos por conferirem a activação de promotor nesse tecido. Por exemplo, se um gene codificando um polipéptido de TSLPR for para ser "ligado" em células T, pode ser utilizado o elemento estimulador do promotor lck. Aqui, a porção funcional do elemento transcricional a ser adicionado pode ser inserida num fragmento de ADN contendo o promotor do polipéptido de TSLPR (e, opcionalmente, inserido num vector e/ou sequências 5' e/ou 3' flanqueadoras) utilizando técnicas de clonagem padrão. Esta construção, conhecida como uma "construção de recombinação homóloga", pode, depois, ser introduzida dentro das células desejadas, ex vivo ou in vivo. A terapia génica também pode ser utilizada para diminuir a expressão de polipéptido de TSLPR, pela modificação da sequência nucleotídica do promotor endógeno. Essa modificação é, tipicamente, alcançada por meio de métodos de recombinação homóloga. Por exemplo, uma molécula de ADN contendo a totalidade ou uma porção do promotor do gene de TSLPR seleccionado para inactivação pode ser manipulada para remover e/ou substituir pedaços do promotor que regula a transcrição. Por exemplo, a caixa TATA e/ou o sitio de ligação de um activador transcricional do promotor podem ser delecionados utilizando técnicas padrão de biologia molecular; essa deleção pode inibir a actividade promotora reprimindo, desse modo, a transcrição do correspondente gene de TSLPR. A deleção da caixa TATA ou do 116 sítio de ligação do activador de transcrição no promotor pode ser alcançada pela produção de uma construção de ADN, compreendendo a totalidade ou a porção relevante do promotor do polipéptido de TSLPR (da mesma espécie ou de uma espécie relacionada com o gene de TSLPR a ser regulado) , na qual um ou mais dos nucleótidos da caixa TATA e/ou do sítio de ligação activador transcricional são mutados por meio de substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais nucleótidos. Como resultado, a caixa TATA e/ou sítio de ligação do activador têm actividade diminuída ou são tornados completamente inactivos. Esta construção, que também conterá, tipicamente, pelo menos, cerca de 500 bases de ADN que correspondem às sequências de ADN 5' e 3' (endógenas) nativas adjacentes ao segmento promotor que foi modificado, pode ser introduzida dentro de células apropriadas (ex vivo ou in vivo), directamente ou por meio de um vector virai, como aqui descrito. Tipicamente, a integração da construção dentro de ADN genómico das células será por meio de recombinação homóloga, onde as sequências de ADN 5' e 3' na construção promotora podem servir para auxiliar a integrar a região promotora modificada por meio de hibridação no ADN cromossómico endógeno.

Utilizações Terapêuticas

As moléculas de ácido nucleico de TSLPR, polipéptidos e os seus agonistas e antagonistas podem ser utilizadas para tratar, diagnosticar, melhorar ou prevenir um número doenças, distúrbios ou estados, incluindo doenças, distúrbios ou estados relacionados com TSLP. As doenças, distúrbios ou estados relacionados com TSLP podem estar relacionados com desenvolvimento de célula B, desenvolvimento de célula T, 117 rearranjo do gene do receptor de célula T ou regulação do factor de transcrição Stat5. As doenças causadas ou mediadas por níveis indesejáveis de TSLP estão abrangidas dentro do âmbito da invenção. Os níveis indesejáveis incluem níveis excessivos de TSLP e níveis subnormais de TSLP.

Os agonistas e antagonistas de polipéptido de TSLPR incluem as moléculas que regulam a actividade de polipéptido de TSLPR e aumentam ou diminuem, pelo menos, uma actividade da forma madura do polipéptido de TSLPR. Os agonistas ou antagonistas podem ser co-factores, tais como uma proteína, péptido, hidrato de carbono, lípido ou molécula de baixo peso molecular, que interagem com polipéptido de TSLPR e, desse modo, regulam a sua actividade. Potenciais agonistas ou antagonistas polipeptídicos incluem anticorpos que reagem com formas solúveis ou ligadas a membrana de polipéptidos de TSLPR que compreendem parte ou a totalidade dos domínios extracelulares das referidas proteínas. As moléculas que regulam a expressão de polipéptido de TSLPR, tipicamente, incluem ácidos nucleicos codificando polipéptido de TSLPR que podem actuar como reguladores anti-sentido da expressão.

As moléculas de ácido nucleico de TSLPR, polipéptidos e seus agonistas e antagonistas podem ser utilizadas (simultaneamente ou sequencialmente) em combinação com uma ou mais citocinas, factores de crescimento, antibióticos, anti-inflamatórios e/ou agentes quimioterapêuticos, conforme apropriado para o estado a ser tratado. 118

Outras doenças ou distúrbios causados ou mediados por níveis indesejáveis de polipéptidos de TSLPR estão abrangidos dentro do âmbito da invenção. Os níveis indesejáveis incluem níveis excessivos de polipéptidos de TSLPR e níveis subnormais de polipéptidos TSLPR.

Utilizações de Ácidos Nucleicos e Polipéptidos de TSLPR

As moléculas de ácido nucleico da invenção (incluindo as que elas mesmas não codificam polipéptidos biologicamente activos) podem ser utilizadas para mapear a localização do gene de TSLPR e genes relacionados nos cromossomas. 0 mapeamento pode ser realizado por técnicas conhecidas na matéria, tais como amplificação por PCR e hibridação in situ.

As moléculas de ácido nucleico de TSLPR (incluindo as que elas mesmas não codificam polipéptidos biologicamente activos) podem ser úteis como sondas de hibridação em ensaios de diagnóstico para testar, qualitativamente ou quantitativamente, para a presença de uma molécula de ácido nucleico de TSLPR em amostras de tecido ou fluidos corporais de mamífero.

Também podem ser empregues outros métodos onde seja desejável inibir a actividade de um ou mais polipéptidos de TSLPR. Essa inibição pode ser efectuada por moléculas de ácido nucleico que são complementares e se hibridam a sequências de controlo de expressão (formação de hélice tripla) ou a ARNm de TSLPR. Por exemplo, as moléculas de ADN ou ARN anti-sentido que têm uma sequência que é complementar a, pelo menos, uma porção de um gene de TSLPR, podem ser introduzidas na célula. As sondas anti-sentido podem ser concebidas por técnicas disponíveis 119 utilizando a sequência do gene de TSLPR aqui divulgada. Tipicamente, cada dessas moléculas anti-sentido será complementar ao sitio de iniciação (extremidade 5') de cada gene de TSLPR seleccionado. Quando a molécula anti-sentido, depois, se híbrida ao correspondente ARNm de TSLPR, a tradução deste ARNm é prevenida ou reduzida. Os inibidores anti-sentido proporcionam informação referente à diminuição ou ausência de um polipéptido de TSLPR numa célula ou organismo.

Alternativamente, a terapia génica pode ser empregue para criar um inibidor dominante negativo de um ou mais polipéptidos de TSLPR. Nesta situação, o ADN codificando um polipéptido mutante de cada polipéptido de TSLPR seleccionado, pode ser preparado e introduzido dentro nas células de um doente, utilizando métodos virais ou não virais, como aqui descrito. Cada desses mutantes é, tipicamente, concebido para competir com polipéptido endógeno no seu papel biológico.

Além disso, um polipéptido de TSLPR, biologicamente activo ou não, pode ser utilizado como um imunogénio, isto é, o polipéptido contém, pelo menos, um epitopo para o qual podem ser deduzidos anticorpos. Os agentes de ligação selectiva que se ligam a um polipéptido de TSLPR (como aqui descrito) podem ser utilizados para efeitos de diagnóstico in vivo e in vitro, incluindo mas não limitados à utilização na forma marcada para detectar a presença de polipéptido de TSLPR numa amostra de fluido corporal ou celular. Os anticorpos também podem ser utilizados para prevenir, tratar ou diagnosticar um número de doenças e distúrbios, incluindo os aqui enumerados. Os anticorpos podem ligar-se a um polipéptido de TSLPR de modo a diminuir ou bloquear, pelo menos, uma actividade característica de um polipéptido de TSLPR, ou podem ligar-se a um polipéptido 120 para aumentar, pelo menos, uma actividade característica de um polipéptido de TSLPR (incluindo pelo aumento da farmacocinética do polipéptido de TSLPR).

Os ácidos nucleicos de TSLPR murino e humano da presente invenção também são ferramentas úteis para o isolamento dos correspondentes genes de polipéptido de TSLPR cromossómico. Por exemplo, ADN cromossómico de murganho contendo sequências de TSLPR pode ser utilizado para construir murganhos knockout permitindo, desse modo, uma examinação do papel in vivo para o polipéptido de TSLPR. 0 ADN genómico de TSLPR humano pode ser utilizado para identificar doenças de degeneração de tecidos transmitidas por via hereditária.

Pretende-se que os seguintes exemplos sejam apenas para efeitos de ilustração e não devem, em nenhuma instância, ser considerados como limitando o âmbito da invenção.

Exemplo 1: Clonagem dos Genes de Polipéptido de TSLPR Murinos e Humanos

Em geral, os materiais e métodos, como descritos em Sambrook et al., supra, foram utilizados para clonar e analisar os genes codificando polipéptidos de TSLPR murinos e humanos.

As sequências codificando o polipéptido de TSLPR murino foram identificadas numa pesquisa BLAST de uma base de dados EST, utilizando sequências correspondendo ao domínio citoplasmático do receptor de eritropoietina. Várias EST murinas de sobreposição, que codificam uma nova molécula do receptor de citocina de tipo I, foram obtidas na pesquisa BLAST. 121

Verificou-se que o domínio citoplasmático do receptor de citocina codificado por estas sequências partilha semelhança significativa com o da cadeia γ do receptor de citocina comum (γ0) , o receptor de eritropoietina e a cadeia oí do receptor de IL-9 . A cadeia γ do receptor de citocina comum é uma subunidade essencial dos receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15 (Noguchi et al., 1993, Science 262:1877-80; Kondo et al., 1994, Science 263:1453-54; Kondo et al., 1993, Science 262:1874-77;

Russell et al., 1994, Science 266:1042-45; Takeshita et al., 1992, Science 257:379-82; Russell et al., 1993, Science 262:1880-83; Giri et al., 1994, EMBO J. 13:2822-30; Kimura et al., 1995, Int. Immunol. 7:115-20). A mutação de γ0 em humanos pode resultar em imunodeficiência combinada grave ligada a X (Noguchi et al., 1993, Cell 73:147-57; Leonard et al., 1995, Immunol. Rev. 148:97-114).

Visto que nenhuma das sequências EST identificadas na pesquisa BLAST continha a fase de leitura aberta integral para polipéptido de TSLPR, uma biblioteca de embrião de murganho foi rastreada para se obter um ADNc de comprimento completo. A colónia positiva contendo o inserto mais comprido foi utilizada para preparar ADN plasmídico por métodos padrão. O inserto de ADNc desta colónia tinha 2 kb em comprimento. A análise de sequência de ADN confirmou que o clone continha a fase de leitura integral para polipéptido de TSLPR. A análise de sequência do ADNc de comprimento completo para polipéptido de TSLPR murino indicou que o gene compreende uma fase de leitura aberta de 1110 pb codificando uma proteína de 370 aminoácidos e possuindo um potencial péptido sinal de 122 17 aminoácidos em comprimento no seu terminal amino (Figuras 1A-1B; péptido sinal previsto indicado por sublinhado). Verificou-se que a fase de leitura aberta codifica uma proteina transmembranar de tipo I, tendo dois potenciais sitios de glicosilação ligada a N e um domínio citoplasmático de 104 aminoácidos contendo um único resíduo de tirosina.

Em contraste, ο γ0 murino compreende 369 aminoácidos e tem um domínio citoplasmático de 86 aminoácidos contendo dois resíduos de tirosina (Kumaki et al., 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 193:356-63; Cao et al., 1993, Proc. Natl. Acad.

Sei. U.S.A. 90:8464-68; Kobayash et al., 1993, Gene 130:303-04). A Figura 2 ilustra um alinhamento de sequência de aminoácidos do polipéptido de TSLPR murino (sequência superior) e γα murino (sequência inferior). Verificou-se que, ao nível de aminoácido, o polipéptido de TSLPR murino partilha 26% de identidade de sequência e 47% de semelhança de sequência com γα. A sequência do polipéptido de TSLPR murino é algo atípica para os receptores de citocina de tipo I, na medida em que apenas uma par de cisteínas é conservado e o motivo W-S-X-W-S (SEQ ID N° : 15) está substituído por um motivo W-T-A-V-T (SEQ ID N°: 16) . O peso molecular previsto do polipéptido de TSLPR murino é 37 kD.

As sequências codificando o polipéptido de TSLPR humano foram identificadas numa pesquisa BLAST de uma base de dados proprietária de sequências de ADNc (Amgen, Thousand Oaks, CA) , utilizando a sequência de ácidos nucleicos de TSLPR murino como uma sequência de pesquisa. Foram identificados nesta pesquisa dois clones contendo sequências de ADNc humano e partilhando a maior homologia com a sequência de ácidos nucleicos de TSLPR murino: 9604927 (SEQ ID N°: 10) e 9508990 (SEQ ID N°: 11). A análise de sequência do ADNc de comprimento completo para 123 polipéptido de TSLPR humano (como contido no Clone 9604927) indicou que o gene de TSLPR humano compreende uma fase de leitura aberta de 1113 pb codificando uma proteína de 371 aminoácidos e possuindo um potencial péptido sinal de 22 aminoácidos de compriment na seu terminação amino (Figuras 3A-3B; péptido sinal previsto indicado por sublinhado). O clone 9508990 contém uma fase de leitura aberta de 1137 pb codificando uma proteína de 379 aminoácidos (Figuras 4A-4B). Este clone compreende, essencialmente, a sequência de polipéptido de TSLPR de comprimento completo humano e 8 aminoácidos adicionais no terminal carboxilo, correspondendo ao epitopo FLAG. A Figura 5 ilustra um alinhamento de sequência de aminoácidos do polipéptido de TSLPR murino (sequência superior) e polipéptido de TSLPR humano (sequência inferior). A disponibilidade de sequências de ácido nucleico e aminoácidos de TSLPR murino e humano auxiliará, ainda, na elucidação das vias de transdução de sinal utilizadas por TSLP.

Exemplo 2: Expressão de Polipéptido de TSLPR

Uma construção de ADNc codificando a fase de leitura aberta integral para TSLPR murino foi transcrita e traduzida in vitro, na presença de 35S-metionina e o produto resolvido por SDS-PAGE. A Figura 6A ilustra um autorradiograma do gel, no qual foi obtida uma única espécie de, aproximadamente, 40 kD. A Figura 6B ilustra a imunoprecipitação de polipéptido de TSLPR murino na linha celular pré-célula B dependente do factor de crescimento, NAG8/7, utilizando um anti-soro policlonal de coelho deduzido contra o domínio extracelular do polipéptido de 124 TSLPR murino. O anti-soro policlonal de coelho foi produzido contra a proteína de fusão do polipéptido de TSLPR murino-Glutationo transferase S, que foi clonada no vector de expressão pGEX4T2 (Pharmacia) e expressa em bactérias. Antes da marcação metabólica, as células NAG8/7 foram cultivadas em RPMI suplementado com soro bovino fetal a 10%, antibióticos e TSLP.

As células NAG8/7 foram metabolicamente marcadas com 35S-metionina e cisteína, lisadas em Tris a 50 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, Triton X-100 a 1% e inibidores de protease e os lisados incubados, de um dia para o outro, com anti-soro policlonal de coelho (pista 2) ou soro pré-imune (pista 1). Os complexos imunes foram capturados com proteína G sepharosel, lavados em tampão de lise e, depois, resolvidos por SDS-PAGE. O anti-soro policlonal imunoprecipitou especificamente uma ampla banda de, aproximadamente, 50 kD numa linha celular de pré-célula B, NAG8/7 (Figura 6B) . O maior tamanho do produto imunoprecipitado, em comparação com o produto gerado por tradução in vitro, é consistente com a adição de fracções de hidratos de carbono ligadas a N no domínio extracelular. A análise de citometria de fluxo de células 293 transfectadas e várias linhas celulares hematopoiéticas (i. e., 32D, BaF3 e WEHI-3) confirmou que o TSLPR murino foi expresso na superfície celular.

Exemplo 3: Expressão de ARNm de TSLPR

A distribuição tecidular de TSLPR murino foi examinada por análise de transferência de Northern. Uma transferência de Northern de múltiplos tecidos de murganho (Clontech, Paio Alto, CA) foi rastreada com uma sonda de ADNc de TSLPR marcada com 32P utilizando técnicas padrão. Os transcritos de ARNm de TSLPR 125 murino foram detectados em quase todos os tecidos examinados, com os níveis mais elevados de expressão sendo detectados no pulmão, fígado e testículo (Figura 6C) . Os níveis mais baixos de expressão foram detectados no coração, cérebro, baço e músculo esquelético. Dois transcritos de, aproximadamente, 2 kb e 2,2 kb foram detectados em alguns tecidos, ao passo que apenas um único transcrito de, aproximadamente, 2 kb foi detectado em outros tecidos. A ampla distribuição tecidular de ARNm de TSLPR murino difere do padrão linfo-hematopoiético relativamente restringido da expressão observada para yc. A expressão de ARNm de TSLPR pode ser localizada por hibridação in situ como se segue. Um painel de tecidos embrionário e normal de murganho adulto é fixo em paraformaldeído a 4%, embebido em parafina e seccionado a 5 pm. Os tecidos seccionados são permeabilizados em HC1 a 0,2 M, digeridos com Proteinase K e acetilados com trietanolamina e anidrido acético. As secções são pré-hibridadas, durante 1 hora, a 60 °C, em solução de hibridação (NaCl a 300 mM, Tris-HCl a 20 mM, pH 8,0, EDTA a 5 mM, solução de Denhardt IX, SDS a 0,2%, DTT a 10 mM, ARNt a 0,25 mg/mL, poliA a 25 pg/mL, poliC a 25 pg/mL e formamida a 50%) e, depois, hibridadas, de um dia para o outro, a 60 °C, na mesma solução contendo dextrano a 10% e 2 x 104 cpm/pL de uma ribossonda anti-sentido marcada com 33P complementar ao gene de TSLPR humano. A ribosonda é obtida por transcrição in vitro de um clone contendo sequências de ADNc de TSLPR humano utilizando técnicas padrão.

Após hibridação, as secções são enxaguadas em solução de hibridação, tratadas com RNaseA para digerir sonda não hibridada e, depois, lavadas em 0,1X SSC, a 55 °C, durante 30 minutos. As secções são, depois, imersas em emulsão de NTB-2 (Kodak, 126

Rochester, NY) , mostradas durante 3 semanas, a 4 °C, desenvolvidas e contrastadas com hematoxilina e eosina. A morfologia tecidular e sinal de hibridação são simultaneamente analisados por iluminação de campo escuro e padrão para cérebro (uma secção sagital e duas coronais), aparelho gastrointestinal (esófago, estômago, duodeno, jejuno, ileo, cólon proximal e cólon distai), pituitária, fígado, pulmão, coração, baço, timo, nódulos linfáticos, rim, ad-renal, bexiga, pâncreas, glândula salivar, órgãos reprodutivos masculinos e femininos (ovário, oviduto e útero nos femininos; e testículo, epidídimo, próstata, vesícula seminal e vaso deferente nos masculinos), BAT e WAT (subcutâneo, perirenal), osso (fémur), pele, mama e músculo esquelético.

Exemplo 4; Actividade Biológica do Polipéptido de TSLPR Murino A semelhança entre polipéptido de TSLPR murino e o receptor de eritropoietina sugeriu que o TSLPR murino, à semelhança do receptor de eritropoietina, poderia ser activado por homodimerização. Isto foi examinado num ensaio de proliferação utilizando, uma construção quimérica derivada dos domínios extracelular e transmembranar do receptor c-Kit e do domínio citoplasmático do polipéptido de TSLPR murino. Para produzir esta construção, os domínios extracelular e transmembranar de c-Kit e o domínio citoplasmático de TSLPR foram amplificados por PCR e ligados dentro do vector retroviral pMX-IRES-GFP, utilizando técnicas padrão.

As células CTLL2 dependentes de IL-2 foram transfectadas, de um modo estável, com construções de expressão codificando 127 c-Kit/TSLPR e c-Kit/β, c-Kit/β e c-Kit/γ ou apenas c-Kit/γ. As construções para c-Kit/β e c-Kit/γ eram como descrito por Nelson et al., 1994, Nature 369:333-36. Após transfecção, as células CTLL2 foram privadas de IL-2, transferidas para placas de 48 poços, a 10000 células/poço, e cultivadas na ausência ou presença do Factor de Células Estaminais (SCF), o ligando para c-Kit. As células foram contadas após 7 dias de crescimento em cultura. A Figura 7 ilustra que, quando IL-2 foi substituída por SCF, as células CTLL2 expressando, de um modo estável, c-Kit/polipéptido de TSLPR quimérico não foram capazes de crescer, sugerindo que a homodimerização simples do domínio citoplasmático do polipéptido de TSLPR murino é insuficiente para induzir um sinal proliferativo. Resultados semelhantes foram obtidos em experiências de proliferação utilizando um c-Kit/polipéptido γα quimérico (Nelson et al., supra). Além disso, quando as células CTLL2 foram co-transfectadas com c-Kit/TSLPR e c-Kit/β, as células ainda não eram capazes de proliferar. Contudo, as células CTLL2 co-transfectadas com c-Kit/β e c-Kit/γ foram capazes de proliferar após incubação com SCF. Isto sugeriu que o domínio citoplasmático da cadeia de ΙΕ-2Κβ não poderia cooperar com o domínio citoplasmático do polipéptido de TSLPR murino para iniciar a proliferação e que o polipéptido de TSLPR murino poderá oligomerizar com qualquer outro receptor para participar na transdução de sinal. A semelhança entre polipéptido de TSLPR murino e γ0 sugere que o TSLPR murino pode ter a capacidade de se ligar a alguns dos membros da subfamília de citocinas IL-2. Isto foi examinado num ensaio de marcação de afinidade, utilizando IL-2, IL-4, IL-7 e IL-15 marcadas com 125I. Antes da adição de uma citocina 128 marcada com 125I, as células 293 foram reconstituídas com as subunidades específicas de citocina IL-2Rp, IL-4Roí ou IL-7Roí, na presença de γ0 ou polipéptido de TSLPR murino. Nenhum dos ligandos examinados exibiu ligação quando o TSLPR murino foi co-expresso com uma subunidade específica de citocina, ainda que os ligandos se ligassem de um modo eficiente, quando γ0 era co-expresso com uma subunidade específica de citocina. Isto sugeriu que o polipéptido de TSLPR murino se ligou a uma nova citocina ou se ligou a uma citocina conhecida, em conjunto com uma subunidade nova ou não testada. A linfopoietina estromal tímica (TSLP) é uma citocina cujas actividades biológicas se sobrepõem com as de IL-7. A actividade de TSLP foi originalmente identificada no meio condicionado de uma linha celular estromal tímica que suportava o desenvolvimento de células B IgM+ murinas a partir de células progenitoras hematopoiéticas de fígado fetal (Friend et al., 1994 Exp. Hematol. 22:321-28). Além disso, a TSLP pode promover a linfopoiese de célula B em culturas de medula óssea de longo prazo e pode co-estimular timócitos e células T maduras (Friend et al., supra; Levin et al., 1999, J. Immunol. 162:677-83).

Embora a IL-7 também possua estas actividades (Suda et al., 1989, Blood 74:1936-41; Lee et al., 1989, J. Immunol. 142:3875-83; Sudo et al., 1989, J. Exp. Med. 170:333-38), a TSLP é única, na medida em que promove a linfopoiese B para o estádio de célula B imatura IgM+, enquanto a IL-7 facilita, principalmente, a produção de células pré-B IgNT (Levin et al., supra; Candeias et al., 1997, Immunity 6:501-08). Uma possível explicação para as actividades biológicas sobrepostas de IL-7 e TSLP é que a TSLP sinaliza por meio de um receptor contendo a cadeia IL-7Ra (Levin et al., supra). Contudo, experiências de 129 inibição de anticorpo indicaram que a TSLP não requer que yc exerça os seus efeitos (Levin et ai., supra). Estes resultados sugerem que a TSLP ligar-se-ia a polipéptido de TSLPR murino na presença de IL-7Roí. A ligação de TSLP ao polipéptido de TSLPR na presença de IL-7Ra foi examinada em ensaios de marcação de afinidade. Os ensaios de marcação de afinidade foram realizados pela adição de 1-5 nM de TSLP marcada com 125I a 5 x 106 células 293 transfectadas com construções de expressão para IL-7Roí murino, polipéptido de TSLPR murino, IL-7Ra murino e polipéptido de TSLPR murino, ou IL-7Ra humano e polipéptido de TSLPR murino. A TSLP iodada foi preparada pela adição de IODO-GEN (Pierce, Rockford, IL) e 125I, a 2 mCi, a 1 pg de TSLP. Uma actividade especifica de, aproximadamente, 200-300 pCi/pg foi obtida por este método. Antes da marcação de afinidade, as células 293 foram transfectadas de um modo transiente, utilizando o método do fosfato de cálcio (Eppendorf-5 Prime, Boulder, CO) . Após uma incubação de 2 horas com 125I-TSLP, as células foram

intercruzadas com suberato de disuccinimidilo a 0,1 mg/mL (Pierce), lisadas em tampão de lise e os lisados resolvidos por SDS-PAGE.

Como mostrado na Figura 8A, 125I-TSLP ligou-se ao heterodimero de IL-7Ra murino e polipéptido de TSLPR murino (pista 4) . A banda superior corresponde a IL-7Roí murino intercruzado e a banda inferior corresponde a polipéptido de TSLPR murino intercruzado. Além disso, 125I-TSLP também se ligou ao heterodimero de IL-7Ra humano e polipéptido de TSLPR murino (pista 5). Não foi observada ligação de TSLP com IL-7Ra murino isoladamente (pista 2). 130

Os ensaios de marcação de afinidade também foram realizados utilizando uma versão marcada com FLAG de polipéptido de TSLPR murino. 0 polipéptido de TSLPR-FLAG murino foi derivado por amplificação por PCR de um fragmento contendo a região codificante de polipéptido de TSLPR, utilizando um iniciador 3' contendo a sequência correspondendo ao epitopo FLAG. Este produto de PCR foi, depois, subclonado no pCR3.1 (Invitrogen) e o clone resultante analisado por sequenciação. Os ensaios de marcação de afinidade foram realizadas como aqui descrito, com a excepção de que os lisados celulares foram imunoprecipitados com um anticorpo M2 monoclonal anti-FLAG. Como mostrado na Figura 8B, após imunoprecipitação de TSLPR, foi observada uma banda de TSLPR intercruzada (pista 1), indicando que a TSLP exibe fraca ligação a TSLPR isoladamente.

Para examinar se a IL-7 murina poderia competir por ligação de TSLP em células expressando polipéptido de TSLPR e IL-7Ra, foram realizados ensaios de competição. Os lisados celulares foram analisados como aqui descrito, com a excepção de que foram adicionadas quantidades crescentes de IL-7 murina não marcada com 125I-TSLP. Como mostrado na Figura 8C, um excesso de IL-7 murina inibiu a ligação de TSLP ao heterodímero IL-7Ra/polipéptido de TSLPR. Os ensaios de marcação de afinidade ilustraram a cooperatividade de IL-7Rcx e polipéptido de TSLPR murino para ligação a TSLP. Estes ensaios também estabeleceram que a IL-7 pode competir pela ligação de TSLP, que tem implicações para potencial competição entre estas duas citocinas in vivo. A ligação de TSLP a células 293 transfectadas com IL-7Ra murino e polipéptido de TSLPR murino, ou apenas IL-7Roí murino, foi analisada num ensaio de deslocamento de ligação. Após duas 131 lavagens, 1 x 106 células 293 transfectadas foram incubadas numa quantidade constante de TSLP marcada com 125I (aproximadamente, 20000 cpm) e quantidades variáveis de TSLP não marcada. Após uma incubação de 3 horas, as células tratadas foram separadas do meio por centrifugação em azeite e N-butilftalato. A radioactividade de ligação celular foi medida utilizando um contador gama.

Como mostrado na Figura 9A, foi observada ligação não especifica de 125I-TSLP com células transfectadas apenas com IL-7Roí murino (ou apenas vector) , enquanto a ligação especifica de 125I-TSLP foi observada com células transfectadas com IL-7Ra e polipéptido de TSLPR, com excesso de TSLP não marcada competindo por ligação de 125I-TSLP. As células transfectadas apenas com polipéptido de TSLPR exibiram ligação muito baixa. A análise dos dados de ligação por transformação de Scatchard foi realizada utilizando o programa de computador LIGAND (Munson e Rodbard, 1980, Anal. Biochem. 107:220-39). O Kd para a ligação de TSLP a células expressando polipéptido de TSLPR e IL-7Rcx foi determinado como sendo, aproximadamente, 13 nM (Figura 9B) . Em sete experiências independentes, verificou-se que o Kd variou de 1,2 a 40 nM. Devido à actividade de ligação muito baixa de TSLP para células expressando apenas polipéptido de TSLPR, não foi possível determinar o Kd para estas células. Os ensaios de deslocamento de ligação também foram realizados utilizando células NAG8/7, que expressam de um modo constitutivo receptores de TSLP e proliferam em resposta a TSLP (Friend et al., supra; Levin et al., supra). Nestes ensaios de deslocamento de ligação, 5 x 106 células NAG8/7 foram incubadas numa quantidade constante de TSLP marcada com 125I (aproximadamente, 180000 cpm) e quantidades variáveis de TSLP não marcada. O restante do ensaio foi realizado como aqui descrito. Como mostrado na Figura 9C, a 132 transformação de Scatchard de dados de ligação obtidos utilizando células NAG8/7 sugere que as células expressam uma única classe de receptores tendo um Kd de, aproximadamente, 2,2 nM - resultados que são semelhantes aos obtidos utilizando as células 293 transfectadas.

Os ensaios de deslocamento de ligação também foram realizados para comparar o deslocamento de TSLP marcada com 125I por IL-7 ou TSLP não marcada em células 293 transf ectadas com polipéptido de TSLPR e IL-7Ra. A Figura 9D ilustra que a IL-7 murina compete por ligação ao polipéptido de TSLPR.

Foi anteriormente mostrado que o tratamento de células NAG8/7 com IL-7 ou TSLP activa STAT5 (Friend et ai., supra;

Levin et al., supra) . 0 possível papel do polipéptido de TSLPR na activação de STAT5 foi analisado em ensaios CAT utilizando células HepG2. As construções de expressão para IL-7Ra e TSLPR, ou IL-7Rcx e Yc, foram introduzidas em células HepG2 com o vector pHRRE-CAT por transfecção por fosfato de cálcio. 0 vector pHRRE-CAT contém oito cópias em tandem do elemento de resposta do receptor de hematopoietina de citocina de 27 pb e STAT5b (Ziegler et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25:399-404). As células transfectadas foram deixadas recuperar, de um dia para o outro, após o que as células foram tripsinizadas e plaqueadas em placas de cultura de 6 poços. As células foram deixadas aderir às placas, durante uma incubação de 24 horas e as células foram, depois, incubadas em meio isento de soro contendo 100 ng/mL de IL-7 ou TSLP, durante 24 horas adicionais. 133 A actividade de CAT e factor de estimulação após normalização para eficiências de transfecção são mostradas na Figura 10. Não se verificou aumento na actividade de CAT após

estimulação de TSLP na presença apenas de IL-7Roí (pista 2) ou com IL-7Ra e yc (pista 7) . Contudo, se o polipéptido de TSLPR fosse co-transfectado, observava-se um aumento dramático na actividade de CAT após estimulação de TSLP (pista 5) . Isto demonstra que a presença de polipéptido de TSLPR é requerida para a sinalização de TSLP. Embora a co-transf ecção de yc e IL-7Ra não tivesse efeito na actividade repórter dependente de TSLP, esta combinação mediou, de modo eficaz, a activação repórter dependente de IL-7 (pista 9).

Um número de cadeias de receptor de citocina é partilhado por mais de uma citocina. Os exemplos mais bem conhecidos são gpl30, que é partilhado por IL-6, IL-11, factor neurotrópico ciliar, factor inibitório de leucemia, oncostatina M e cardiotrofina-1 (Hirano et al., 1997, Cytokine Growth Factor

Rev. 8:241-52; Taga e Kishimoto, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15:797-819), βα, que é partilhado por IL- 3, IL-5 e GM-CSF (Miyajima et al., 1997, Leukemia 11 :418-22; Guthridge et al., 1998, Stem Cells 16:301- 13; Burdach et al., 1998, Curr. Opin. Hematol. 5:177-80) e Yc, que é partilhado por IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15 (Noguchi et al., 1993, Science 262:1877-80; Kondo et al., 1994, supra; Kondo et al., 1993, supra; Russell et al., 1994, supra; Takeshita et al., supra; Russell et al., 1993, supra; Giri et al., supra; Kimura et al., supra). A lista de cadeias de receptor de citocina que servem como componentes de mais de um receptor de citocina inclui ΙΕ-2Ρβ, que é um componente dos receptores de IL-2 e IL-15 e IL-4Ra, que é um componente dos receptores de IL-4 e IL-13. A subunidade IL-7Rcx de receptor de citocina pode ser agora adicionada a esta lista, 134 visto que os dados aqui apresentados demonstram que esta subunidade é um componente dos receptores de IL-7 e TSLP. A observação de defeitos no desenvolvimento de células T e células B em murganhos I17~/ (von Freeden-Jeffrey et al., 1995, J. Exp. Med. 181:1519-26) sugere que a TSLP não pode compensar totalmente para a perda de IL-7. Uma examinação da cooperação funcional de IL-7Roí na sinalização de TSLP pode ajudar a explicar as diferenças no desenvolvimento de células B em murganhos e Xl7~/_ (Candeias et al., 1997, Irrmunity 6:501-08; von Freeden-Jeffrey et al., supra; Peschon et al., 1994, J. Exp. Med. 180:1955-60; He et al., 1997, J. Immunol. 158:2592-99). A caracterização adicional do polipéptido de TSLPR ajudará nesta investigação.

Exemplo 5: Produção de Polipéptidos de TSLPR A. Expressão de Polipéptidos de TSLPR em Bactérias O PCR é utilizado para amplificar sequências molde de ADN codificando um polipéptido de TSLPR, utilizando iniciadores correspondendo às extremidades 5' e 3' da sequência. Os produtos de ADN amplificado podem ser modificados para conterem sítios de restrição enzimática, para permitir a inserção em vectores de expressão. Os produtos de PCR são purificados em gel e inseridos eme vectores de expressão utilizando metodologia de ADN recombinante padrão. Um vector exemplificativo, tal como pAMG21 (ATCC n° 98113), contendo o promotor lux e um gene codificando resistência à canamicina, é digerido com Bam Hl e Nde I para clonagem direccional de ADN inserido. A mistura ligada é transformada dentro de uma estirpe hospedeira de E. coli por 135 electroporação e os transformantes são seleccionados para resistência à canamicina. 0 ADN plasmídico de colónias seleccionadas é isolado e submetido a sequenciação de ADN para confirmar a presença do inserto.

As células hospedeiras transformadas são incubadas em meio 2xYT contendo canamicina a 30 pg/mL, a 30 °C, antes da indução. A expressão génica é induzida pela adição de N-(3-oxo-hexanoil)-dl-homosserina lactona, para uma concentração final de 30 ng/mL, seguida de incubação a 30 °C ou 37 °C, durante seis horas. A expressão do polipéptido de TSLPR é avaliada por centrifugação da cultura, ressuspensão e lise dos sedimentos bacterianos e análise de proteínas de célula hospedeira por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida.

Os corpos de inclusão contendo polipéptido de TSLPR são purificados como se segue. As células bacterianas são sedimentadas por centrifugação e ressuspensas em água. A suspensão celular é lisada por sonicação e sedimentada por centrifugação, a 195000 xg, durante 5 a 10 minutos. O sobrenadante é descartado e o sedimento é lavado e transferido para um homogeneizador. O sedimento é homogeneizado em 5 mL de uma solução de Percoll (Percoll líquido a 75% e NaCl a 0,15 M) até uniformemente suspenso e, depois, diluído e centrifugado, a 21600 xg, durante 30 minutos. As fracções de gradiente contendo os corpos de inclusão são recuperadas e agregadas. Os corpos de inclusão isolados são analisados por SDS-PAGE.

Uma única banda num gel de SDS poliacrilamida, correspondendo a polipéptido de TSLPR produzido por E. coli, é excisada do gel e a sequência de aminoácidos N-terminal é 136 determinada, essencialmente, como descrito por Matsudaira et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:10-35. B. Expressão de Polipéptido de TSLPR em Células de mamífero O PCR é utilizado para amplificar sequências molde de ADN codificando um polipéptido de TSLPR, utilizando iniciadores correspondendo às extremidades 5' e 3' da sequência. Os produtos de ADN amplificado podem ser modificados para conterem sítios de restrição enzimática, para permitir a inserção em vectores de expressão. Os produtos de PCR são purificados em gel e inseridos em vectores de expressão utilizando metodologia de ADN recombinante padrão. Um vector de expressão exemplificativo, pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contém uma origem de replicação do vírus de Epstein-Barr, pode ser utilizado para a expressão dos polipéptidos de TSLPR em células 293-EBNA-l. Os produtos de PCR amplificados e purificados em gel são ligados no vector pCEP4 e introduzidos nas células 293-EBNA por lipofecção. As células transfectadas são seleccionadas em higromicina a 100 pg/mL e as culturas resistentes a fármaco resultantes são cultivadas até confluência. As células são, depois, cultivadas em meios isentos de soro, durante 72 horas. Os meios condicionados são removidos e a expressão de polipéptido de TSLPR é analisada por SDS-PAGE. A expressão de polipéptido de TSLPR pode ser detectada por coloração de prata. Alternativamente, o polipéptido de TSLPR é produzido como uma proteína de fusão com um marcador epitópico, tais como um domínio constante de IgG ou um epitopo FLAG, que pode pode ser detectada por análise de transferência de Western utilizando anticorpos para o marcador peptídico. 137

Os polipéptidos de TSLPR podem ser excisados de um gel de SDS-poliacrilamida, ou as proteínas de fusão de TSLPR são purificadas por cromatografia de afinidade para o marcador epitópico e submetidas a análise de sequência de aminoácidos N-terminal, como aqui descrito. C. Expressão e Purificação de Polipéptido de TSLPR em Células de Mamífero

As construções de expressão de polipéptido de TSLPR são introduzidas dentro de células 293 EBNA ou CHO, utilizando um protocolo de lipofecção ou fosfato de cálcio.

Para se conduzirem estudos funcionais nos polipéptidos de TSLPR que são produzidos, são produzidas grandes quantidades de meios condicionados a partir de um agregado de clones de 293 EBNA seleccionados por higromicina. As células são cultivadas em Triple Flasks de 500 cm, da Nunc, até confluência de 80%, antes de se trocar para meios isentos de soro, uma semana antes da recolha dos meios. Os meios condicionados são recolhidos e congelados, a -20 °C, até à purificação.

Os meios condicionados são purificados por cromatografia de afinidade, como descrito abaixo. Os meios são descongelados e, depois, passados através de um filtro de 0,2 pm. Uma coluna de Proteína G é equilibrada com PBS, a pH 7,0 e, depois, carregada com os meios filtrados. A coluna é lavada com PBS até que a absorvência a A280 atinja uma linha de base. O polipéptido de TSLPR é eluído da coluna com Glicina-HCl a 0,1 M, a pH 2,7 e imediatamente neutralizado com Tris-HCl a 1 M, a pH 8,5. As 138 fracções contendo polipéptido de TSLPR são agregadas, dialisadas em PBS e armazenadas a -70 °C.

Para clivagem de Factor Xa do polipéptido de fusão polipéptido de TSLPR humano-Fc, a proteína purificada por cromatografia de afinidade é dialisada em Tris-HCl a 50 mM, NaCl a 100 mM, CaCl2 a 2 mM, a pH 8,0. O Factor Xa de protease de restrição é adicionado à proteína dialisada, a 1/100 (p/p) e a amostra é digerida, de um dia para o outro, à temperatura ambiente.

Exemplo 6: Produção de Anticorpos Anti-Polipéptido de TSLPR

Os anticorpos para polipéptidos de TSLPR podem ser obtidos por imunização com proteína purificada ou com péptidos de TSLPR por síntese biológica ou química. Os processos adequados para a produção de anticorpos incluem os descritos em Hudson e Bay, Practical Immunology (2a ed., Blackwell Scientific Publications).

Num processo para a produção de anticorpos, os animais (tipicamente murganhos ou coelhos) são injectados com um antigénio de TSLPR (tal como um polipéptido de TSLPR) e aqueles com níveis suficientes de títulos séricos, como determinado por ELISA, são seleccionados para a produção de hibridoma. Os baços dos animais imunizados são recolhidos e preparados como suspensões de células únicas, a partir das quais os esplenócitos são recuperados. Os esplenócitos são fundidos a células de mieloma de murganho (tal como células Sp2/0-Agl4) são, em primeiro lugar, incubados em DMEM com penicilina a 200 U/mL, sulfato de estreptomicina a 200 pg/mL e glutamina a 4 mM e são, 139 depois, incubados em meio de selecção HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina). Após selecção, os sobrenadantes de cultura de tecidos são retirados de cada poço de fusão e testados para produção de anticorpo anti-TSLPR por ELISA.

Também podem ser empregues processos alternativos para a obtenção de anticorpos anti-TSLPR, tais como a imunização de murganhos transgénicos albergando loci de Ig humana para a produção de anticorpos humanos e o rastreio de bibliotecas de anticorpos sintéticos, tal como os produzidos por mutagénese de um domínio variável de anticorpo.

Exemplo 7: Expressão de Polipéptido de TSLPR em Murganhos Transgénicos

Para avaliar a actividade biológica do polipéptido de TSLPR, é preparada uma construção codificando uma proteína de fusão de polipéptido de TSLPR/Fc, sob o controlo de um promotor de ApoE específico de fígado. Espera-se que a distribuição desta construção cause alterações patológicas que sejam informativas quanto à função do polipéptido de TSLPR. De modo semelhante, é preparada uma construção contendo o polipéptido de TSLPR de comprimento completo, sob o controlo do promotor da actina beta. Espera-se que a distribuição desta construção resulte em expressão ubíqua.

Para produzir estas construções, é utilizado PCR para amplificar sequências molde de ADN codificando um polipéptido de TSLPR, utilizando iniciadores que correspondem às extremidades 5' e 3' da sequência desejada e que incorporam sítios de restrição enzimática, para permitir a inserção do produto 140 amplificado num vector de expressão. Após amplificação, os produtos de PCR são purificados em gel, digeridos com as enzimas de restrição apropriadas e ligados num vector de expressão utilizando técnicas de ADN recombinante padrão. Por exemplo, as sequências de polipéptido de TSLPR amplificadas podem ser clonadas num vector de expressão, sob o controlo do promotor de actina β humana, como descrito por Graham et al., 1997, Nature Genetics, 17:272-74 e Ray et al., 1991, Genes Dev. 5:2265-73.

Após ligação, as misturas reaccionais são utilizadas para transformar uma estirpe hospedeira de E. coli por electroporação e os transformantes são seleccionados para resistência a fármacos. 0 ADN plasmidico de colónias seleccionadas é isolado e submetido a sequenciação de ADN para confirmar a presença de um inserto apropriado e ausência de mutação. 0 vector de expressão de polipéptido de TSLPR é purificado através de duas séries de centrifugação de gradiente de densidade de CsCl, clivado com uma enzima de restrição adequada e o fragmento linearizado contendo o transgene do polipéptido de TSLPR é purificado por electroforese em gel. 0 fragmento purificado é ressuspenso em Tris a 5 mM, pH 7,4, e EDTA a 0,2 nM, a uma concentração de 2 mg/mL.

Os embriões de célula única de murganhos cruzados BDF1 x BDF1 são injectados como descrito (Pub. do pedido PCT N° WO 97/23614). Os embriões são cultivados, de um dia para o outro, numa incubadora de CO2 e 15-20 embriões de duas células são transferidos para os ovidutos de um murganho fêmea CD1 pseudoprenhe. A descendência obtida da implantação de embriões microinjectados é rastreada por amplificação por PCR do transgene integrado em amostras de ADN genómico como se segue. Pedaços de orelha são digeridos em 20 mL de tampão de orelha 141 (Tris a 20 mM, pH 8,0, EDTA a 10 mM, SDS a 0,5% e proteinase K, a 500 mg/mL) , a 55 °C, de um dia para o outro. A amostra é, depois, diluída com 200 mL de TE e 2 mL da amostra de orelha são utilizados numa reacção de PCR utilizando iniciadores apropriados. Às 8 semanas de idade, animais fundadores transgénicos e animais de controlo são sacrificados para necropsia e análise patológica. Porções do baço são removidas e ARN celular total isolado dos baços utilizando o Kit Total RNA Extraction (Qiagen) e a expressão de transgene determinada por RT-PCR. O ARN recuperado dos baços é convertido em ADNc utilizando o SuperScript™ Preamplification System (Gibco-BRL), como se segue. Um iniciador adequado, situado na sequência do vector de expressão e 3' em relação ao transgene do polipéptido de TSLPR,

é utilizado para iniciar a síntese de ADNc a partir dos transcritos do transgene. Dez mg de ARN total de baço de fundadores transgénicos e controlos são incubados i com 1 mM de iniciador, durante 10 minutos, a 70 °C e colocados em gelo . A reacção é, depois, suplementada com Tris-HCl a 10 mM, pH 8,3, KC1 a 50 mM, MgCl2 a 2,5 mM, 10 mM de cada dNTP, DTT a 0,1 mM e 200 U de transcritase reversa SuperScript II. Após incubação, durante 50 minutos, a 42 °C, a reacção é interrompida por aquecimento, durante 15 minutos, a 72 °C e digerida com 2 U de RNase H, durante 20 minutos, a 37 °C. As amostras são, depois, amplificadas por PCR utilizando iniciadores específicos para polipéptido de TSLPR. A determinação dos fenótipos de murganhos Tslp~f~ ou Tslpr~/~ também ajudará na definição do papel exacto da TSLP. 142

Exemplo 8: Actividade Biológica de Polipéptido de TSLPR em Murganhos Transqénicos

Antes da eutanásia, os animais transgénicos são pesados, anestesiados por isofluorano e o sangue retirado por punção cardíaca. As amostras são submetidas a hematologia e análise química sérica. A radiografia é realizada após exsanguinação terminal. Após dissecção grosseira, os principais órgãos viscerais são submetidos a análise de peso.

Após dissecção grosseira, os tecidos (i. e., fígado, baço, pâncreas, estômago, o aparelho gastrointestinal integral, rim, órgãos reprodutivos, pele e glândulas mamárias, osso, cérebro, coração, pulmão, timo, traqueia, esófago, tiróide, ad-renais, bexiga urinária, nódulos linfáticos e músculo esquelético) são removidos e fixos em Zn-Formalina a 10% tamponada, para examinação histológica. Após fixação, os tecidos são processados em blocos de parafina e são obtidas secções de 3 mm. Todas as secções são coradas com hematoxilina e eosina e são, depois, submetidas a análise histológica. O baço, nódulo linfático e placas de Peyer dos murganhos transgénicos e de controlo são submetidos a análise de imuno-histologia com anticorpos específicos de células B e células T, como se segue. As secções embebidas em parafina, fixas em formalina, são desparafinadas e hidratadas em água desionizada. As secções são neutralizadas com peróxido de hidrogénio a 3%, bloqueadas com Protein Block (Lipshaw,

Pittsburgh, PA) e incubadas em B220 e CD3 anti-murganho monoclonal de rato (Harlan, Indianapolis, IN). A ligação de anticorpo é detectada por imunoglobulinas anti-rato de coelho biotiniladas e estreptavidina conjugada a peroxidase (BioGenex, 143

San Ramon, CA) com DAB como cromogéneo (BioTek, Santa Barbara, CA). As secções são contrastadas com hematoxilina.

Após necropsia, MLN e secções de baço e timo de animais transgénicos e ninhadas de controlo são removidos. As suspensões de células únicas são preparadas por trituração suave dos tecidos com a extremidade achatada de uma seringa contra o fundo de um filtro celular de nylon de 100 mm (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). As células são lavadas duas vezes, contadas e, aproximadamente, 1 x 106 células de cada tecido são, depois, incubadas, durante 10 minutos, com 0,5 pg de bloco Fc de CD16/32 (FcyIII/II), num volume de 20 pL. As amostras são, depois, coradas, durante 30 minutos, a 2-8 °C, num volume de 100 pL de PBS (desprovido de Ca+ e Mg+) , albumina de soro bovino a 0,1% e azida de sódio a 0,01% com 0,5 pg de anticorpo de anticorpos monoclonais conjugados a FITC ou PE contra CD90.2 (Thy-1.2), CD45R (B220), CDllb (Mac-1), Gr-1, CD4 ou CD8 (PharMingen, San

Diego, CA). Após ligação de anticorpo, as células são lavadas e, depois, analisadas por citometria de fluxo num FACScan (Becton Dickinson).

Os seguintes itens são divulgados (1.) Uma molécula isolada de ácido nucleico, compreendendo uma sequência nucleotídica seleccionada do grupo consistindo de: (a) sequência nucleotídica como mostrada em qualquer das SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 10 ou SEQ ID N°: 11; (b) sequência nucleotídica codificando o polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; 144 (c) sequência nucleotídica que se híbrida, sob condições moderadamente ou altamente estringentes, ao complemento de (b) ou (c) ; e (d) sequência nucleotídica complementar a (b) ou (c). (2.) Uma molécula isolada de ácido nucleico, compreendendo uma sequência nucleotídica seleccionada do grupo consistindo de: (a) sequência nucleotídica codificando um polipéptido que é, pelo menos, cerca de 70 por cento idêntico ao polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N°: 8, em que o polipéptido codificado tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (b) sequência nucleotídica codificando um variante alélico ou variante de excisão da sequência nucleotídica como mostrada em qualquer das SEQ ID N° : 4, SEQ ID N° : 7, SEQ ID N°: 10 ou SEQ ID N°: 11 ou (a); (c) região da sequência nucleotídica de qualquer das SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 10 OU SEQ ID N° : 11, (a) ou (b) codificando um fragmento polipeptídico de, pelo menos, cerca de 25 resíduos de aminoácidos, em que o fragmento polipeptídico tem uma actividade do polipéptido codificado como mostrado nas SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N° : 8, ou é antigénico; (d) região da sequência nucleotídica de qualquer das SEQ ID N° : 4, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 10 ou SEQ ID N°: 11, 145 ou qualquer de (a) - (c) , compreendendo um fragmento de, pelo menos, cerca de 16 nucleótidos; (e) sequência nucleotídica que se hibrida, sob condições moderadamente ou altamente estringentes, ao complemento de qualquer de (a) - (d); e (f) sequência nucleotídica complementar a qualquer de (a) - (d) . (3.) Uma molécula isolada de ácido nucleico, compreendendo uma sequência nucleotídica seleccionada do grupo consistindo de: (a) sequência nucleotídica codificando um polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma substituição conservativa de aminoácido, em que o polipéptido codificado tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N° : 8; (b) sequência nucleotídica codificando um polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N° : 8 com, pelo menos, uma inserção de aminoácido, em que o polipéptido codificado tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (c) sequência nucleotídica codificando um polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma deleção de aminoácido, em que o polipéptido codificado tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; 146 (d) sequência nucleotídica codificando um polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 que tem um truncamento C- e/ou N-terminal, em que o polipéptido codificado tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N° : 8; (e) sequência nucleotídica codificando um polipéptido como mostrado em qualquer das SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N° : 8 com, pelo menos, uma modificação seleccionada do grupo consistindo de substituições de aminoácidos, inserções de aminoácidos, deleções de aminoácidos, truncamento C-terminal e truncamento N-terminal, em que o polipéptido codificado tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (f) sequência nucleotídica de qualquer de (a) - (e) compreendendo um fragmento de, pelo menos, cerca de 16 nucleótidos; (g) sequência nucleotídica que se híbrida, sob condições moderadamente ou altamente estringentes, ao complemento de qualquer de (a) - (f) ; e (h) sequência nucleotídica complementar a qualquer de (a) - (e) . (4. ) qualquer

Um vector compreendendo a molécula de ácido nucleico de dos Itens 1, 2 ou 3. (5.) Uma célula hospedeira compreendendo o vector do Item 4. 147 (6.) A célula hospedeira do Item 5 que é uma célula eucariótica. (7.) A célula hospedeira do Item 5 que é uma célula procariota. (8.) Um processo de produção de um polipéptido de TSLPR, compreendendo o cultivo da célula hospedeira do Item 5, sob condições adequadas à expressão do polipéptido e, opcionalmente, o isolamento do polipéptido da cultura. (9.) Um polipéptido produzido pelo processo do Item 8. (10.) O processo do Item 8, em que a molécula de ácido nucleico compreende ADN promotor diferente do ADN promotor para o polipéptido de TSLPR nativo operativamente ligado ao ADN codificando o polipéptido de TSLPR. (11.) A molécula isolada de ácido nucleico de acordo com o Item 2, em que a percentagem de identidade é determinada utilizando um programa de computador seleccionado do grupo consistindo de GAP, BLASTN, FASTA, BLASTA, BLASTX, BestFit e do algoritmo de Smith Waterman. (12.) Um processo para determinar se um composto inibe a actividade de polipéptido de TSLPR ou produção de polipéptido de TSLPR, compreendendo expor uma célula de acordo com qualquer dos Itens 5, 6 ou 7 ao composto e medir a actividade de polipéptido de TSLPR ou produção de polipéptido de TSLPR na referida célula. (13.) Um polipéptido isolado, compreendendo a sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8. 148 (14.) Um polipéptido isolado, compreendendo a sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo de: (a) sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 6 ou SEQ ID N°: 9, opcionalmente compreendendo, ainda, uma metionina amino-terminal; (b) sequência de aminoácidos para um ortólogo de qualquer das SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (c) sequência de aminoácidos que é, pelo menos, cerca de 70 por cento idêntica à sequência de aminoácidos das SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N° : 8, em que o polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (d) fragmento da sequência de aminoácidos mostrada em qualquer das SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 compreendendo, pelo menos, cerca de 25 resíduos de aminoácidos, em que o fragmento tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8, ou é antigénico; e (e) sequência de aminoácidos para um variante alélico ou variante de excisão da sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 ou qualquer de (a) - (c) . (15.) Um polipéptido isolado, compreendendo a sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo de: 149 (a) sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma substituição conservativa de aminoácido, em que o polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (b) sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma inserção de aminoácido, em que o polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (c) sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 com, pelo menos, uma deleção de aminoácido, em que o polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N° : 8; (d) sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8 que tem um truncamento C- e/ou N-terminal, em que o polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; e (e) sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N° : 8 com, pelo menos, uma modificação seleccionada do grupo consistindo de substituições de aminoácidos, inserções de aminoácidos, deleçoes de aminoácidos, truncamento C-terminal e truncamento Ei terminal, em que o pol ipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8; (16.) Um polipéptido isolado codificado pela molécula de ácido nucleico de qualquer dos Itens 1, 2 ou 3, em que o 150 polipéptido tem uma actividade do polipéptido mostrado nas SEQ ID N°: 5 OU SEQ ID N°: 8. (17.) 0 polipéptido isolado de acordo com o Item 14, em que a percentagem de identidade é determinada utilizando um programa de computador seleccionado do grupo consistindo de GAP, BLASTP, FASTA, BLASTA, BLASTX, BestFit e do algoritmo de Smith-Waterman. (18.) Um agente de ligação selectiva ou seu fragmento que se liga especificamente ao polipéptido de qualquer dos Itens 13, 14 ou 15. (19.) 0 agente de ligação selectiva ou seu fragmento do Item 18 que se liga especificamente ao polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N° : 5 ou SEQ ID N° : 8, ou um seu fragmento. (20. ) 0 agente de ligação selectiva do Item 18 que é um anticorpo ou seu fragmento. (21. ) 0 agente de ligaçao selectiva do Item 18 que é um anticorpo humanizado. (22. ) 0 agente de ligação selectiva do Item 18 que é um anticorpo humano ou seu fragmento. (23. ) 0 agente de ligação selectiva do Item 18 que é um anticorpo policlonal ou seu fragmento. (24. ) 0 agente de ligação selectiva do Item 18 que é um anticorpo monoclonal ou seu fragmento. 151 (25.) 0 agente de ligação selectiva do Item 18 que é um anticorpo quimérico ou seu fragmento. (26.) 0 agente de ligação selectiva do Item 18 que é um anticorpo enxertado com CDR ou seu fragmento. (27.) 0 agente de ligaçao selectiva do Item 18 que é um anticorpo anti-idiotípico ou seu fragmento. (28.) 0 agente de ligação selectiva do Item 18 que é um fragmento de região variável. (29.) 0 fragmento de regiac i variável do Item 28 que é um fragmento Fab ou um Fab' . (30.) Um agente de ligação selectiva ou seu fragmento compreendendo, pelo menos, uma região determinante de complementaridade com especificidade para um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8. (31.) 0 agente de ligação selectiva do Item 18 que está ligado a um marcador detectável. (32.) 0 agente de ligação selectiva do Item 18 que antagoniza actividade biológica de polipéptido de TSLPR. (33.) Um método para o tratamento, prevenção ou melhoramento de uma doença, estado ou distúrbio relacioando com polipéptido de TSLPR, compreendendo administrar a um doente uma quantidade eficaz de um agente de ligação selectiva de acordo com o Item 18 . 152 (34.) Um agente de ligação selectiva produzido por imunização de um animal com um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos das SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 8. (35.) Um hibridoma que produz um agente de ligação selectiva capaz de se ligar a um polipéptido de acordo com qualquer dos Itens 1, 2 ou 3. (36.) Um método de detecção ou quantificação da quantidade de polipéptido de TSLPR utilizando o anticorpo anti-TSLPR ou fragmento do Item 18. (37.) Uma composição compreendendo o polipéptido de qualquer dos Itens 13, 14 ou 15 e um agente de formulação farmaceuticamente aceitável. (38.) A composição do Item 37, em que o agente de formulação farmaceuticamente aceitável é um veiculo, adjuvante, solubilizante, estabilizante ou antioxidante. (39.) A composição do Item 37, em que o polipéptido compreende a sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 6 ou SEQ ID N°: 9. (40.) Um polipéptido compreendendo um derivado do polipéptido de qualquer dos Itens 13, 14 ou 15. (41.) O polipéptido do Item 40 que é covalentemente modificado com um polímero solúvel em água. (42.) O polipéptido do Item 41, em que o polímero solúvel em água é seleccionado do grupo consistindo de polietilenoglicol, 153 monometoxipolietilenoglicol, dextrano, celulose, poli-(N-vinilpirrolidona) polietilenoglicol, homopolimeros de propilenoglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados e álcool polivinilico. (43.) Uma composição compreendendo uma molécula de ácido nucleico de qualguer dos Itens 1, 2 ou 3 e um agente de formulação farmaceuticamente aceitável. (44.) A composição do Item 43, em que a referida molécula de ácido nucleico está contida num vector virai. (45.) Um vector virai compreendendo uma molécula de ácido nucleico de qualquer dos Itens 1, 2 ou 3. (46.) Um polipéptido de fusão compreendendo o polipéptido de qualquer dos Itens 13, 14 ou 15 fundido a uma sequência de aminoácidos heteróloga. (47.) 0 polipéptido de fusão do Item 46, em que a sequência de aminoácidos heteróloga é um domínio constante de IgG ou seu fragmento. (48.) Um método para o tratamento, prevenção ou melhoramento de um estado médico, compreendendo administrar a um doente o polipéptido de qualquer dos Itens 13, 14 ou 15, ou o polipéptido codificado pelo ácido nucleico de qualquer dos Itens 1, 2 ou 3. (49.) Um método de diagnóstico de um estado patológico ou uma susceptibilidade a um estado patológico num indivíduo, compreendendo: 154 (a) determinar a presença ou quantidade de expressão do polipéptido de qualquer dos Itens 13, 14 ou 15, ou o polipéptido codificado pela molécula de ácido nucleico de qualquer dos Itens 1, 2 ou 3 numa amostra; e (b) diagnosticar um estado patológico ou uma susceptibilidade a um estado patológico, com base na presença ou quantidade de expressão do polipéptido. (50.) Um dispositivo, compreendendo: (a) uma membrana adequada para implantação; e (b) células encapsuladas na referida membrana, em que as referidas células segregam uma proteína de qualquer dos Itens 13, 14 ou 15; e a referida membrana é permeável à referida proteína e impermeável a materiais prejudiciais às referidas células. (51.) Um método de identificar um composto que se liga a um polipéptido de TSLPR, compreendendo: (a) colocar em contacto o polipéptido de qualquer dos Itens 13, 14 ou 15 com um composto; e (b) determinar a extensão da ligação do polipéptido de TSLPR ao composto. (52.) O método do Item 51, compreendendo, ainda, determinar a actividade do polipéptido quando ligado ao composto. 155 (53.) Um método de modulação dos níveis de um polipéptido num animal, compreendendo administrar ao animal a molécula de ácido nucleico de qualquer dos Itens 1, 2 ou 3. (54.) Um mamífero não humano transqénico, compreendendo a molécula de ácido nucleico de qualquer dos Itens 1, 2 ou 3. (55.) Um processo para determinar se um composto inibe a actividade de polipéptido de TSLPR ou produção de polipéptido de TSLPR, compreendendo expor um mamífero transgénico de acordo com o Item 54 ao composto e medir a actividade de polipéptido de TSLPR ou produção de polipéptido de TSLPR no referido mamífero. (56.) Uma molécula de ácido nucleico de qualquer dos Itens 1, 2 ou 3 conjugada a um suporte sólido. (57.) Uma matriz de moléculas de ácido nucleico compreendendo, pelo menos, uma molécula de ácido nucleico de qualquer dos Itens 1, 2 ou 3. 156

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Saris, Chris

Chang, Ming-Shi <120> Moléculas do Receptor de Linfopoietina Estromal Tímica e Suas Utilizações

<130> 00-514-C <140> <141> <150> 60/214866 <151> 2000-06-28 <160> 16 <170> Patentln Ver. 2.0

<210> 1 <211> 1409 <212> ADN <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (162)..(1274) <220> <221> péptido_sinal <222> (162)..(213) 157 <2 2 0> <221> característica_misc <222> (891)..(953) <223> Sequência codificante prevista de domínio transmembranar <400> 1 ccccttcctc gccgacccct gaccccgccc cgccccgccc acccaggggc ccagacctga 60 gcggcggcca ggtcgcgggt gacgtcacag ggccgttgcc ccatccgtcc cgtggcctgg 120 acggacagag ctgaggcagg ggaataaccg cgagtgctga g atg gca tgg gca ctc 176

Met Ala Trp Ala Leu 1 5 gcg gcg gca gcg gcg gcg gcg 224 Ala 15 Ala Ala Ala Ala Ala 20 Ala gtc gtc tgc cat gac ctg gag 272 Val Val Cys His Asp 35 Leu Glu ccc gac cac cac age gcc aac 320 Pro Asp His His 50 Ser Ala Asn ggc gcc ctg caa ccc tgc ccg 368 Gly Ala Leu 65 Gin Pro Cys Pro act tcc ggg tgc ate ctc ccc 416 Thr Ser 80 Gly Cys Ile Leu Pro 85 gca ctg cgc gac gga ggc ggg 464 Ala 95 Leu Arg Asp Gly Gly 100 Gly gcg tcc gcc tgg ctg aag ccc 512 Ala Ser Ala Trp Leu 115 Lys Pro tgg aca cca gac ggg gac gtg 560 Trp Thr Pro Asp 130 Gly Asp Val ctg ggc ctg gac tac gag gtg 608 Leu Gly Leu 145 Asp Tyr Glu Val gcg gtc ate ctc ctg cct cgg ctc ctt Ala Vai Ile Leu Leu Pro Arg Leu Leu 10 gcg gtg acg tea cgg ggt gat gtc aca Ala Vai Thr Ser Arg Gly Asp Val Thr 25 30 acg gtg gag gtc acg tgg ggc teg ggc Thr Vai Glu Val Thr Trp Gly Ser Gly 40 45 ttg age ctg gag ttc cgt tat ggt act Leu Ser Leu Glu Phe Arg Tyr Gly Thr 55 60 cga tat ttc ctg tcc ggc gct ggt gtc Arg Tyr Phe Leu Ser Gly Ala Gly Val 70 75 gcg gcg agg gcg ggg ctg ctg gag ctg Ala Ala Arg Ala Gly Leu Leu Glu Leu 90 gcc atg gtg ttt aag gct agg cag cgc Ala Met Vai Phe Lys Ala Arg Gin Arg 105 110 cgc cca cct tgg aat gtg acg ctg ctc Arg Pro Pro Trp Asn Val Thr Leu Leu 120 125 act gtc tcc tgg cct gcc cac tcc tac Thr Vai Ser Trp Pro Ala His Ser Tyr 135 140 158 cag cac cgg gag age aat gac gat gag gac gcc tgg cag acg acc tea 656 Gin His Arg Glu Ser Asn Asp Asp Glu Asp Ala Trp Gin Thr Thr Ser 150 155 160 165 ggg ccc tgc tgt gac ttg aca gtg ggc ggg ctc gac ccc gcg ege tgc 704 Gly Pro Cys Cys Asp Leu Thr Vai Gly Gly Leu Asp Pro Ala Arg Cys 170 175 180 tat gac ttc cgg gtt cgg gcg teg ccc cgg gcc gcg oac tat ggc ctg 752 Tyr Asp Phe Arg Vai Arg Ala Ser Pro Arg Ala Ala His Tyr Gly Leu 185 190 195 gag gcg cag cct age gag tgg aca gcg gtg aca agg ctt tcc ggg gca 800 Glu Ala Gin Pro Ser Glu Trp Thr Ala Val Thr Arg Leu Ser Gly Ala 200 205 210 gca tcc gcg ggt gac ccc tgc gcc gcc cac ctt ccc ccc cta gcc tcc 843 Ala Ser Ala Gly Asp Pro Cys Ala Ala His Leu Pro Pro Leu Ala Ser 215 220 225 tgt acc gca age ccc gcc cca tcc ccg gcc ctg gcc ccg ccc ctc ctg 896 Cys Thr Ala Ser Pro Ala Pro Ser Pro Ala Leu Ala Pro Pro Leu Leu 230 235 240 245 ccc ctg ggc tgc ggc cta gca gcg ctg ctg aca ctg tcc ctg ctc ctg 944 Pro Leu Gly Cys Gly Leu Ala Ala Leu Leu Thr Leu Ser Leu Leu Leu 250 255 260 gcc gcc ctg agg ctt ege agg gtg aaa gat gcg ctg ctg ccc tgc gtc 992 Ala Ala Leu Arg Leu Arg Arg Vai Lys Asp Ala Leu Leu Pro Cys Val 265 270 275 cct gac ccc age ggc tcc ttc cct gga ctc ttt gag aag cat cac ggg 1040 Pro Asp Pro Ser Gly Ser Phe Pro Gly Leu Phe Glu Lys His His Gly 280 285 290 aac ttc cag gcc tgg att gcg gac gcc cag gcc aca gcc ccg cca gcc 1088 Asn Phe Gin Ala Trp Ile Ala Asp Ala Gin Ala Thr Ala Pro Pro Ala 295 300 305 agg acc gag gag gaa gat gac ctc ate cac ccc aag gct aag agg gtg 1136 Arg Thr Glu Glu Glu Asp Asp Leu Ile His Pro Lys Ala Lys Arg Val 310 315 320 325 gag ccc gag gat ggc acc tcc ctc tgc acc gtg cca agg cca ccc age 1184 Glu Pro Glu Asp Gly Thr Ser Leu Cys Thr Val Pro Arg Pro Pro Ser 330 335 340 ttc gag cca agg ggg ccg gga ggc <399 gcc atg gtg tea gtg ggc ggg 1232 Phe Glu Pro Arg Gly Pro Gly Gly Gly Ala Met Val Ser Val Gly Gly 345 350 355 gcc acg ttc atg gtg ggc gac age ggc tac atg acc ctg tga 1274 Ala Thr Phe Met Vai Gly Asp Ser Gly Tyr Met Thr Leu 360 365 370 ccttgaagtc actgccagtc tatacttcag gctgaggtca cttcctgtct ttaaataatt 1334 caaactcaca aatcctgtgc ctgtctgtat gcaaatgtgg tcacgaatat tcaaataaaa 1394 tgcaaatgct atgct 1409 159

<210> 2 <211> 370 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2

Met Ala Trp Ala Leu Ala Vai Ile Leu Leu Pro Arg Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Vai Thr Ser Arg Gly Asp Vai Thr Vai Vai 20 25 30 Cys His Asp Leu Glu Thr Vai Glu Vai Thr Trp Gly Ser Gly Pro Asp 35 40 45 His His Ser Ala Asn Leu Ser Leu Glu Phe Arg Tyr Gly Thr Gly Ala 50 55 60 Leu Gin Pro Cys Pro Arg Tyr Phe Leu Ser Gly Ala Gly Vai Thr Ser 65 70 75 80 Gly Cys Ile Leu Pro Ala Ala Arg Ala Gly Leu Leu Glu Leu Ala Leu 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Gly Ala Met Vai Phe Lys Ala Arg Gin Arg Ala Ser 100 105 110

Ala Trp Leu Lys Pro Arg Pro Pro Trp Asn Vai Thr Leu Leu Trp Thr 115 120 125 Pro Asp Gly Asp Vai Thr Vai Ser Trp Pro Ala His Ser Tyr Leu Gly 130 135 140 Leu Asp Tyr Glu Vai Gin His Arg Glu Ser Asn Asp Asp Glu Asp Ala 145 150 155 160 Trp Gin Thr Thr Ser Gly Pro Cys Cys Asp Leu Thr Vai Gly Gly Leu 165 170 175 Asp Pro Ala Arg Cys Tyr Asp Phe Arg Vai Arg Ala Ser Pro Arg Ala 180 185 190 Ala His Tyr Gly Leu Glu Ala Gin Pro Ser Glu Trp Thr Ala Vai Thr 195 200 205 Arg Leu Ser Gly Ala Ala Ser Ala Gly Asp Pro Cys Ala Ala His Leu 210 215 220 Pro Pro Leu Ala Ser Cys Thr Ala Ser Pro Ala Pro Ser Pro Ala Leu 225 230 235 240 160

Ala Pro Pro Leu Leu Pro Leu Gly Cys Gly Leu Ala Ala Leu Leu Thr 245 250 255 Leu Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Arg Leu Arg Arg Vai Lys Asp Ala 260 265 270 Leu Leu Pro Cys Vai Pro Asp Pro Ser Gly Ser Phe Pro Gly Leu Phe 275 280 285 Glu Lys His His Gly Asn Phe Gin Ala Trp Ile Ala Asp Ala Gin Ala 290 295 300 Thr Ala Pro Pro Ala Arg Thr Glu Glu Glu Asp Asp Leu Ile His Pro 305 310 315 320 Lys Ala Lys Arg Vai Glu Pro Glu Asp Gly Thr Ser Leu Cys Thr Vai 325 330 335 Pro Arg Pro Pro Ser Phe Glu Pro Arg Gly Pro Gly Gly Gly Ala Met 340 345 350 Vai Ser Vai Gly Gly Ala Thr Phe Met Vai Gly Asp Ser Gly Tyr Met 355 360 365

Thr Leu 370

<210> 3 <211> 353 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> TRANSMEM <222> (227)..(247) <400> 3

Ala Ala Ala Ala Ala Vai Thr Ser Arg Gly Asp Vai Thr Vai Vai Cys 1 5 10 15 His Asp Leu Glu Thr Vai Glu Vai Thr Trp Gly Ser Gly Pro Asp His 20 25 30 His Ser Ala Asn Leu Ser Leu Glu Phe Arg Tyr Gly Thr Gly Ala Leu 35 40 45 161

Gin Pro Cys Pro Arg Tyr Phe Leu Ser Gly Ala Gly Vai Thr Ser Gly 50 55 60 Cys Ile Leu Pro Ala Ala Arg Ala Gly Leu Leu Glu Leu Ala Leu Arg 65 70 75 80 Asp Gly Gly Gly Ala Met Vai Phe Lys Ala Arg Gin Arg Ala Ser Ala 85 90 95 Trp Leu Lys Pro Arg Pro Pro Trp Asn Vai Thr Leu Leu Trp Thr Pro 100 105 110 Asp Gly Asp Vai Thr Vai Ser Trp Pro Ala His Ser Tyr Leu Gly Leu 115 120 125 Asp Tyr Glu Vai Gin His Arg Glu Ser Asn Asp Asp Glu Asp Ala Trp 130 135 140 Gin Thr Thr Ser Gly Pro Cys Cys Asp Leu Thr Vai Gly Gly Leu Asp 145 150 155 160 Pro Ala Arg Cys Tyr Asp Phe Arg Vai Arg Ala Ser Pro Arg Ala Ala 165 170 175 His Tyr Gly Leu Glu Ala Gin Pro Ser Glu Trp Thr Ala Vai Thr Arg 180 185 190 Leu Ser Gly Ala Ala Ser Ala Gly Asp Pro Cys Ala Ala His Leu Pro 195 200 205 Pro Leu Ala Ser Cys Thr Ala Ser Pro Ala Pro Ser Pro Ala Leu Ala 210 215 220 Pro Pro Leu Leu Pro Leu Gly Cys Gly Leu Ala Ala Leu Leu Thr Leu 225 230 235 240 Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Arg Leu Arg Arg Vai Lys Asp Ala Leu 245 250 255 Leu Pro Cys Vai Pro Asp Pro Ser Gly Ser Phe Pro Gly Leu Phe Glu 260 265 270 Lys His His Gly Asn Phe Gin Ala Trp Ile Ala Asp Ala Gin Ala Thr 275 280 285 Ala Pro Pro Ala Arg Thr Glu Glu Glu Asp Asp Leu Ile His Pro Lys 290 295 300 Ala Lys Arg Vai Glu Pro Glu Asp Gly Thr Ser Leu Cys Thr Vai Pro 305 310 315 320 162

Arg Pro Pro Ser Phe Glu Pro Arg Gly Pro Gly Gly Gly Ala Met Vai 325 330 335

Ser Vai Gly Gly Ala Thr Phe Met Vai Gly Asp Ser Gly Tyr Met Thr 340 345 350

Leu <210> 4 <211> 1116

<212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1) .. (1116) <220> <221> péptido_sinal <222> (1)..(66) <220> <221> característica_misc <222> (694)..(756) <223> Sequência codificante prevista de domínio transmembranar <400> 4 atg ggg cgg ctg gtt ctg ctg tgg gga gct gee gtc ttt ctg ctg gga 48 Met Gly Arg Leu Vai Leu Leu Trp Gly Ala Ala Vai Phe Leu Leu Gly 1 5 10 15 ggc tgg atg gct ttg ggg caa gga gga gea gea gaa gga gta cag att 96 Gly Trp Met Ala Leu Gly Gin Gly Gly Ala Ala Glu Gly Vai Gin Ile 20 25 30 cag ate ate tac ttc aat tta gaa acc gtg cag gtg aca tgg aat gee 144 Gin Ile Ile Tyr Phe Asn Leu Glu Thr Vai Gin Vai Thr Trp Asn Ala 35 40 45 163 age aaa tac tcc agg acc aac ctg act ttc cac tac aga ttc aac ggt 192 Ser Lys Tyr Ser Arg Thr Asn Leu Thr Phe His Tyr Arg Phe Asn Gly 50 55 60 gat gag gee tat gac cag tgc acc aac tac ctt etc cag gaa ggt cac 240 Asp Glu Ala Tyr Asp Gin Cys Thr Asn Tyr Leu Leu Gin Glu Gly His 65 70 75 80 a et tea ggg tgc etc et a gac gea gag cag cga gac gac att etc tat 288 Thr Ser Gly Cys Leu Leu Asp Ala Glu Gin Arg Asp Asp Ile Leu Tyr 85 90 95 ttc tcc ate agg aat ggg acg cac ccc gtt ttc acc gea agt ege tgg 336 Phe Ser Ile Arg Asn Gly Thr His Pro Vai Phe Thr Ala Ser Arg Trp 100 105 110 atg gtt tat tac ctg aaa ccc agt tcc ccg aag cac gtg aga ttt teg 384 Met Vai Tyr Tyr Leu Lys Pro Ser Ser Pro Lys His Vai Arg Phe Ser 115 120 125 tgg cat cag gat gea gtg acg gtg acg tgt tet gac ctg tcc tac ggg 432 Trp His Gin Asp Ala Vai Thr Vai Thr Cys Ser Asp Leu Ser Tyr Gly 130 135 140 gat etc etc tat gag gtt cag tac cgg age ccc ttc gac acc gag tgg 480 Asp Leu Leu Tyr Glu Vai Gin Tyr Arg Ser Pro Phe Asp Thr Glu Trp 145 150 155 160 cag tcc aaa cag gaa aat acc tgc aac gtc acc ata gaa ggc ttg gat 528 Gin Ser Lys Gin Glu Asn Thr Cys Asn Vai Thr Ile Glu Gly Leu Asp 165 170 175 gee gag aag tgt tac tet ttc tgg gtc agg gtg aag gct atg gag gat 576 Ala Glu Lys Cys Tyr Ser Phe Trp Vai Arg Vai Lys Ala Met Glu Asp 180 185 190 gta tat ggg cca gac aca tac cca age gac tgg tea gag gtg aca tgc 624 Vai Tyr Gly Pro Asp Thr Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Glu Vai Thr Cys 195 200 205 tgg cag aga ggc gag att cgg gat gee tgt gea gag aca cca acg cct 672 Trp Gin Arg Gly Glu Ile Arg Asp Ala Cys Ala Glu Thr Pro Thr Pro 210 215 220 ccc aaa cca aag ctg tcc aaa ttt att tta att tcc age ctg gee ate 720 Pro Lys Pro Lys Leu Ser Lys Phe Ile Leu Ile Ser Ser Leu Ala Ile 225 230 235 240 ctt ctg atg gtg tet etc etc ctt ctg tet tta tgg aaa tta tgg aga 768 Leu Leu Met Vai Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Trp Lys Leu Trp Arg 245 250 255 gtg aag aag ttt etc att ccc age gtg cca gac ccg aaa tcc ate ttc 816 Vai Lys Lys Phe Leu Ile Pro Ser Vai Pro Asp Pro Lys Ser Ile Phe 260 265 270 164 864 ccc ggg etc ttt gag ata cac caa ggg Pro Gly Leu Phe Glu Ile His Gin Gly 275 280 gac acc cag aac gtg gee cac etc cac Asp Thr Gin Asn Vai Ala His Leu His 290 295 gaa agt ggc ccc gag gag ccc ctg gta Glu Ser Gly Pro Glu Glu Pro Leu Vai 305 310 gee gag tet ccc agg atg ctg gac cca Ala Glu Ser Pro Arg Met Leu Asp Pro 325 tet ggg gga tcc etc cag ctt ccc cac Ser Gly Gly Ser Leu Gin Leu Pro His 340 345 gtg gtc aca ate ggg ggc ttc acc ttt Vai Vai Thr Ile Gly Gly Phe Thr Phe 355 360 gtg gcg ttg tga Vai Ala Leu 370 aac ttc cag gag tgg ate aca Asn Phe Gin Glu Trp Ile Thr 285 aag atg gea ggt gea gag caa 912 Lys Met Ala Gly Ala Glu Gin 300 gtc cag ttg gee aag act gaa 960 Vai Gin Leu Ala Lys Thr Glu 315 320 cag acc gag gag aaa gag gee 1008 Gin Thr Glu Glu Lys Glu Ala 330 335 cag ccc etc caa ggc ggt gat 1056 Gin Pro Leu Gin Gly Gly Asp 350 gtg atg aat gac ege tcc tac 1104 Vai Met Asn Asp Arg Ser Tyr 365 1116

<210> 5 <211> 371 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Met Gly Arg Leu Vai Leu Leu Trp Gly Ala Ala Vai Phe Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Trp Met Ala Leu Gly Gin Gly Gly Ala Ala Glu Gly Vai Gin Ile 20 25 30 Gin Ile Ile Tyr Phe Asn Leu Glu Thr Vai Gin Vai Thr Trp Asn Ala 35 40 45 Ser Lys Tyr Ser Arg Thr Asn Leu Thr Phe His Tyr Arg Phe Asn Gly 50 55 60 Asp Glu Ala Tyr Asp Gin Cys Thr Asn Tyr Leu Leu Gin Glu Gly His 65 70 75 80 165

Thr Ser Gly Cys Leu Leu Asp Ala Glu Gin Arg Asp Asp Ile Leu Tyr 85 90 95 Phe Ser Ile Arg Asn Gly Thr His Pro Vai Phe Thr Ala Ser Arg Trp 100 105 110 Met Vai Tyr Tyr Leu Lys Pro Ser Ser Pro Lys His Vai Arg Phe Ser 115 120 125 Trp His Gin Asp Ala Vai Thr Vai Thr Cys Ser Asp Leu Ser Tyr Gly 130 135 140 Asp Leu Leu Tyr Glu Vai Gin Tyr Arg Ser Pro Phe Asp Thr Glu Trp 145 150 155 160 Gin Ser Lys Gin Glu Asn Thr Cys Asn Vai Thr Ile Glu Gly Leu Asp 165 170 175 Ala Glu Lys Cys Tyr Ser Phe Trp Vai Arg Vai Lys Ala Met Glu Asp 180 185 190 Vai Tyr Gly Pro Asp Thr Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Glu Vai Thr Cys 195 200 205 Trp Gin Arg Gly Glu Ile Arg Asp Ala Cys Ala Glu Thr Pro Thr Pro 210 215 220 Pro Lys Pro Lys Leu Ser Lys Phe Ile Leu Ile Ser Ser Leu Ala Ile 225 230 235 240 Leu Leu Met Vai Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Trp Lys Leu Trp Arg 245 250 255 Vai Lys Lys Phe Leu Ile Pro Ser Vai Pro Asp Pro Lys Ser Ile Phe 260 265 270 Pro Gly Leu Phe Glu Ile His Gin Gly Asn Phe Gin Glu Trp Ile Thr 275 280 285 Asp Thr Gin Asn Vai Ala His Leu His Lys Met Ala Gly Ala Glu Gin 290 295 300 Glu Ser Gly Pro Glu Glu Pro Leu Vai Vai Gin Leu Ala Lys Thr Glu 305 310 315 320 Ala Glu Ser Pro Arg Met Leu Asp Pro Gin Thr Glu Glu Lys Glu Ala 325 330 335 Ser Gly Gly Ser Leu Gin Leu Pro His Gin Pro Leu Gin Gly Gly Asp 340 345 350 166

Vai Vai Thr Ile Gly Gly Phe Thr Phe Vai Met Asn Asp Arg Ser Tyr 355 360 365

Vai Ala Leu 370

<210> 6 <211> 349 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> TRANSMEM <222> (210) .. (230) <400> 6

Gin Gly Gly Ala Ala Glu Gly Vai Gin Ile Gin Ile Ile Tyr Phe Asn 15 10 15

Leu Glu Thr Vai Gin Vai Thr Trp Asn Ala Ser Lys Tyr Ser Arg Thr 20 25 30

Asn Leu Thr Phe His Tyr Arg Phe Asn Gly Asp Glu Ala Tyr Asp Gin 35 40 45

Cys Thr Asn Tyr Leu Leu Gin Glu Gly His Thr Ser Gly Cys Leu Leu 50 55 60

Asp Ala Glu Gin Arg Asp Asp Ile Leu Tyr Phe Ser Ile Arg Asn Gly 65 70 75 80

Thr His Pro Vai Phe Thr Ala Ser Arg Trp Met Vai Tyr Tyr Leu Lys 85 90 95

Pro Ser Ser Pro Lys His Vai Arg Phe Ser Trp His Gin Asp Ala Vai 100 105 110

Thr Vai Thr Cys Ser Asp Leu Ser Tyr Gly Asp Leu Leu Tyr Glu Vai 115 120 125

Gin Tyr Arg Ser Pro Phe Asp Thr Glu Trp Gin Ser Lys Gin Glu Asn 130 135 140 167

Thr Cys Asn Val Thr Ile Glu Gly Leu Asp Ala Glu Lys Cys Tyr Ser 145 150 155 160 Phe Trp Vai Arg Val Lys Ala Met Glu Asp Val Tyr Gly Pro Asp Thr 165 170 175 Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Glu Val Thr Cys Trp Gin Arg Gly Glu Ile 180 185 190 Arg Asp Ala Cys Ala Glu Thr Pro Thr Pro Pro Lys Pro Lys Leu Ser 195 200 205 Lys Phe Ile Leu Ile Ser Ser Leu Ala Ile Leu Leu Met Val Ser Leu 210 215 220 Leu Leu Leu Ser Leu Trp Lys Leu Trp Arg Val Lys Lys Phe Leu Ile 225 230 235 240 Pro Ser Val Pro Asp Pro Lys Ser Ile Phe Pro Gly Leu Phe Glu Ile 245 250 255 His Gin Gly Asn Phe Gin Glu Trp Ile Thr Asp Thr Gin Asn Val Ala 260 265 270 His Leu His Lys Met Ala Gly Ala Glu Gin Glu Ser Gly Pro Glu Glu 275 280 285 Pro Leu Val Val Gin Leu Ala Lys Thr Glu Ala Glu Ser Pro Arg Met 290 295 300 Leu Asp Pro Gin Thr Glu Glu Lys Glu Ala Ser Gly Gly Ser Leu Gin 305 310 315 320 Leu Pro His Gin Pro Leu Gin Gly Gly Asp Val Val Thr Ile Gly Gly 325 330 335 Phe Thr Phe Val Met Asn Asp Arg Ser Tyr Val Ala Leu 340 345

<210> 7 <211> 1140 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: TSLPR-FLAG Humano 168 <220>

<221> CDS <222> (1)..(1140) <220> <221> péptido_sinal <222> (1)..(66) <220> <221> característica__misc <222> (694)..(756) <223> Sequência codificante prevista de domínio transmembranar <220> <221> característica_misc <222> (1114)..(1140)

<223> Sequência codificante de FLAG <400> 7 atg ggg cgg ctg gtt ctg ctg tgg gga gct gee gtc ttt ctg ctg gga 48 Met Gly Arg Leu Vai Leu Leu Trp Gly Ala Ala Vai Phe Leu Leu Gly 1 5 10 15 ggc tgg atg gct ttg ggg caa gga gga gea gea gaa gga gta cag att 96 Gly Trp Met Ala Leu Gly Gin Gly Gly Ala Ala Glu Gly Vai Gin Ile 20 25 30 cag ate ate tac ttc aat tta gaa acc gtg cag gtg aca tgg aat gee 144 Gin Ile Ile Tyr Phe Asn Leu Glu Thr Vai Gin Vai Thr Trp Asn Ala 35 40 45 age aaa tac tcc agg acc aac ctg act ttc cac tac aga ttc aac ggt 192 Ser Lys Tyr Ser Arg Thr Asn Leu Thr Phe Hls Tyr Arg Phe Asn Gly 50 55 60 gat gag gee tat gac cag tgc acc aac tac ctt ctc cag gaa ggt cac 240 Asp Glu Ala Tyr Asp Gin Cys Thr Asn Tyr Leu Leu Gin Glu Gly His 65 70 75 80 169 act tca ggg tgc ctc cta gac gea gag cag cga gac gac att ctc tat 288 Thr Ser Gly Cys Leu Leu A.sp Ala Glu Gin Arg Asp Asp Ile Leu 1 Tyr 85 90 95 ttc tcc ate agg aat ggg acg cac ccc gtt ttc acc gea agt ege tgg 336 Phe Ser Ile Arg Asn Gly Thr His Pro Vai Phe Thr Ala Ser Arg Trp 100 105 110 atg gtt tat tac ctg aaa ccc agt tcc ccg aag cac gtg aga ttt teg 384 Met Vai Tyr Tyr Leu Lys Pro Ser Ser Pro Lys His Vai Arg Phe Ser 115 120 125 tgg cat cag gat gea gtg acg gtg acg tgt tet gac ctg tcc tac ggg 432 Trp His Gin Asp Ala Vai Thr Vai Thr Cys Ser Asp Leu Ser Tyr Gly 130 135 140 gat ctc ctc tat gag gtt cag tac cgg age ccc ttc gac acc gag tgg 480 Asp Leu Leu Tyr Glu Vai Gin Tyr Arg Ser Pro Phe Asp Thr Glu Trp 145 150 155 160 cag tcc aaa cag gaa aat acc tgc aac gtc acc ata gaa ggc ttg gat 528 Gin Ser Lys Gin Glu Asn Thr Cys Asn Vai Thr Ile Glu Gly Leu Asp 165 170 175 gcc gag aag tgt tac tet ttc tgg gtc agg gtg aag gct atg gag gat 576 Ala Glu Lys Cys Tyr Ser Phe Trp Vai Arg Vai Lys Ala Met Glu Asp 180 185 190 gta tat ggg cca gac aca tac cca age gac tgg tca gag gtg aca tgc 624 Vai Tyr Gly Pro Asp Thr Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Glu Vai Thr Cys 195 200 205 tgg cag aga ggc gag att cgg gat gcc tgt gea gag aca cca acg cct 672 Trp Gin Arg Gly Glu Ile Arg Asp Ala Cys Ala Glu Thr Pro Thr Pro 210 215 220 ccc aaa cca aag ctg tcc aaa ttt att tta att tcc age ctg o 0 ate 720 Pro Lys Pro Lys Leu Ser Lys Phe Ile Leu Ile Ser Ser Leu Ala Ile 225 230 235 240 ctt ctg atg gtg tet ctc ctc ctt ctg tet tta tgg aaa tta tgg aga 768 Leu Leu Met Vai Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Trp Lys Leu Trp Arg 245 250 255 gtg aag aag ttt ctc att ccc age gtg cca gac ccg aaa tcc ate ttc 816 Vai Lys Lys Phe Leu Ile Pro Ser Vai Pro Asp Pro Lys Ser Ile Phe 260 265 270 ccc ggg ctc ttt gag ata cac caa ggg aac ttc cag gag tgg ate aca 864 Pro Gly Leu Phe Glu Ile His Gin Gly Asn Phe Gin Glu Trp Ile Thr 275 280 285 170 912 gac acc cag aac gtg gcc cac ctc cac aag atg gca ggt gca gag caa Asp Thr Gin Asn Vai Ala His Leu His Lys Met Ala Gly Ala Glu Gin 290 295 300 gaa Glu 305 agt Ser ggc Gly ccc Pro gag Glu gag Glu 310 ccc Pro ctg Leu gta Vai gtc Vai cag Gin 315 ttg gcc Leu Ala aag Lys act Thr gaa Glu 320 960 gcc Ala gag Glu tct Ser ccc Pro agg Arg 325 atg Met ctg Leu gac Asp cca Pro cag Gin 330 acc Thr gag Glu gag Glu aaa Lys gag Glu 335 gcc Ala 1008 tct Ser ggg Gly gga Gly tcc Ser 340 ctc Leu cag Gin ctt Leu ccc Pro cac His 345 cag Gin ccc Pro ctc Leu caa Gin ggc ggt gat Gly Gly Asp 350 1056 gtg Vai gtc Vai aca Thr 355 ate Ile ggg Gly ggc Gly ttc Phe acc Thr 360 ttt Phe gtg Vai atg Met aat gac Asn Asp 365 ege Arg tcc Ser tac Tyr 1104 gtg Vai gcg Ala 370 ttg Leu gac Asp tac Tyr aag Lys gac Asp 375 gac Asp gat Asp gac Asp aag Lys tag 1140

<210> 8 <211> 379 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: TSLPR-FLAG Humano <400> 8

Met Gly Arg Leu Vai Leu Leu Trp Gly Ala Ala Vai Phe Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Trp Met Ala Leu Gly Gin Gly Gly Ala Ala Glu Gly Vai Gin Ile 20 25 30 Gin Ile Ile Tyr Phe Asn Leu Glu Thr Vai Gin Vai Thr Trp Asn Ala 35 40 45 Ser Lys Tyr Ser Arg Thr Asn Leu Thr Phe His Tyr Arg Phe Asn Gly 50 55 60 Asp Glu Ala Tyr Asp Gin Cys Thr Asn Tyr Leu Leu Gin Glu Gly His 65 70 75 80 171

Thr Ser Gly Cys Leu Leu Asp Ala Glu Gin Arg Asp Asp Ile Leu Tyr 85 90 95 Phe Ser Ile Arg Asn Gly Thr His Pro Vai Phe Thr Ala Ser Arg Trp 100 105 110 Met Vai Tyr Tyr Leu Lys Pro Ser Ser Pro Lys His Vai Arg Phe Ser 115 120 125 Trp His Gin Asp Ala Vai Thr Vai Thr Cys Ser Asp Leu Ser Tyr Gly 130 135 140 Asp Leu Leu Tyr Glu Vai Gin Tyr Arg Ser Pro Phe Asp Thr Glu Trp 145 150 155 160 Gin Ser Lys Gin Glu Asn Thr Cys Asn Vai Thr Ile Glu Gly Leu Asp 165 170 175 Ala Glu Lys Cys Tyr Ser Phe Trp Vai Arg Vai Lys Ala Met Glu Asp 180 185 190 Vai Tyr Gly Pro Asp Thr Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Glu Vai Thr Cys 195 200 205 Trp Gin Arg Gly Glu Ile Arg Asp Ala Cys Ala Glu Thr Pro Thr Pro 210 215 220 Pro Lys Pro Lys Leu Ser Lys Phe Ile Leu Ile Ser Ser Leu Ala Ile 225 230 235 240 Leu Leu Met Vai Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Trp Lys Leu Trp Arg 245 250 255 Vai Lys Lys Phe Leu Ile Pro Ser Vai Pro Asp Pro Lys Ser Ile Phe 260 265 270 Pro Gly Leu Phe Glu Ile His Gin Gly Asn Phe Gin Glu Trp Ile Thr 275 280 285 Asp Thr Gin Asn Vai Ala His Leu His Lys Met Ala Gly Ala Glu Gin 290 295 300 Glu Ser Gly Pro Glu Glu Pro Leu Vai Vai Gin Leu Ala Lys Thr Glu 305 310 315 320 Ala Glu Ser Pro Arg Met Leu Asp Pro Gin Thr Glu Glu Lys Glu Ala 325 330 335 Ser Gly Gly Ser Leu Gin Leu Pro His Gin Pro Leu Gin Gly Gly Asp 340 345 350 172

Vai Vai Thr Ile Gly Gly Phe Thr Phe Vai Met Asn Asp Arg Ser Tyr 355 360 365

Vai Ala Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 370 375

<210> 9 <211> 357 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: TSLPR-FLAG Humano <220> <221> TRANSMEM <222> (210) . . (230) <220> <221> DOMÍNIO <222> (350)..(357)

<223> Sequência de FLAG <400> 9

Gin 1 Gly Gly Ala Ala 5 Glu Gly Vai Gin Ile 10 Gin Ile Ile Tyr Phe 15 Asn Leu Glu Thr Vai 20 Gin Vai Thr Trp Asn 25 Ala Ser Lys Tyr Ser 30 Arg Thr Asn Leu Thr 35 Phe His Tyr Arg Phe 40 Asn Gly Asp Glu Ala 45 Tyr Asp Gin Cys Thr 50 Asn Tyr Leu Leu Gin 55 Glu Gly His Thr Ser 60 Gly Cys Leu Leu 173

Asp Ala Glu Gin Arg Asp Asp Ile Leu Tyr Phe Ser Ile Arg Asn Gly 65 70 75 80 Thr His Pro Vai Phe Thr Ala Ser Arg Trp Met Vai Tyr Tyr Leu Lys 85 90 95 Pro Ser Ser Pro Lys His Vai Arg Phe Ser Trp His Gin Asp Ala Vai 100 105 110 Thr Vai Thr Cys Ser Asp Leu Ser Tyr Gly Asp Leu Leu Tyr Glu Vai 115 120 125 Gin Tyr Arg Ser Pro Phe Asp Thr Glu Trp Gin Ser Lys Gin Glu Asn 130 135 140 Thr Cys Asn Vai Thr Ile Glu Gly Leu Asp Ala Glu Lys Cys Tyr Ser 145 150 155 160 Phe Trp Vai Arg Vai Lys Ala Met Glu Asp Vai Tyr Gly Pro Asp Thr 165 170 175 Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Glu Vai Thr Cys Trp Gin Arg Gly Glu Ile 180 185 190 Arg Asp Ala Cys Ala Glu Thr Pro Thr Pro Pro Lys Pro Lys Leu Ser 195 200 205 Lys Phe Ile Leu Ile Ser Ser Leu Ala Ile Leu Leu Met Vai Ser Leu 210 215 220 Leu Leu Leu Ser Leu Trp Lys Leu Trp Arg Vai Lys Lys Phe Leu Ile 225 230 235 240 Pro Ser Vai Pro Asp Pro Lys Ser Ile Phe Pro Gly Leu Phe Glu Ile 245 250 255 His Gin Gly Asn Phe Gin Glu Trp Ile Thr Asp Thr Gin Asn Vai Ala 260 265 270 hís : Leu His Lys Met Ala Gly Ala Glu Gin Glu Ser Gly Pro Glu Glu 275 280 285 Pro ; Leu Vai Vai Gin Leu Ala Lys Thr Glu Ala Glu Ser Pro Arg Met 290 295 300 Leu . Asp Pro Gin Thr Glu Glu Lys Glu Ala Ser Gly Gly Ser Leu Gin 305 310 315 320 Leu Pro His Gin Pro Leu Gin Gly Gly Asp Vai Vai Thr Ile Gly Gly 325 330 335 174

Phe Thr Phe Vai Met Asn Asp Arg Ser Tyr Vai Ala LeuÍAsp Tyr Lys 340 345 350

Asp Asp Asp Asp Lys 355 <210> 10 <211> 1379 <212> ADN <213> Sequência <220> <223> Descrição contendo <220> <221> caracteri <222> (D · · (68) <223> Sequência <220> <221> péptido_s <222> (70)..(13 <220> <221> caracteri <222> (763)..(8 <223> Sequência transmembranar 175 <2 2 0> <221> característica_misc <222> (1186)..(1379) <223> Sequência de vector <400> 10 ggatccacta gtaacggccg ccagtgtgct ggaattctgc agatatccat cacactggcg 60 gccgccacca tggggcggct ggttctgctg tggggagctg ccgtctttct gctgggaggc 120 tggatggctt tggggcaagg aggagcagca gaaggagtac agattcagat catctacttc 180 aatttagaaa ccgtgcaggt gacatggaat gccagcaaat actccaggac caacctgact 240 ttccactaca gattcaacgg tgatgaggcc tatgaccagt gcaccaacta ccttctccag 300 gaaggtcaca cttcagggtg cctcctagac gcagagcagc gagacgacat tctctatttc 360 tccatcagga atgggacgca ccccgttttc accgcaagtc gctggatggt ttattacctg 420 aaacocagtt ccccgaagca cgtgagattt tcgtggcatc aggatgcagt gacggtgacg 480 tgttctgacc tgtcctacgg ggatctcctc tatgaggttc agtaccggag ccccttcgac 540 accgagtggc agtccaaaca ggaaaatacc tgcaacgtca ccatagaagg cttggatgcc 600 gagaagtgtt actctttctg ggtcagggtg aaggctatgg aggatgtata tgggccagac 660 acatacccaa gcgactggtc agaggtgaca tgctggcaga gaggcgagat tcgggatgcc 720 tgtgcagaga caccaacgcc tcccaaacca aagctgtcca aatttatttt aatttccagc 780 ctggccatcc ttctgatggt gtctctcctc cttctgtctt tatggaaatt atggagagtg 840 aagaagtttc tcattcccag cgtgccagac ccgaaatcca tcttccccgg gctctttgag 900 atacaccaag ggaacttcca ggagtggatc acagacaccc agaacgtggc ccacctccac 960 aagatggcag gtgcagagca agaaagtggc cccgaggagc ccctggtagt ccagttggcc 1020 aagactgaag ccgagtctcc caggatgctg gacccacaga ccgaggagaa agaggcctct 1080 gggggatccc tccagcttcc ccaccagccc ctccaaggcg gtgatgtggt cacaatcggg 1140 ggcttcacct ttgtgatgaa tgaccgctcc tacgtggcgt tgtgatctaa agggccctat 1200 tctatactgt cacctaaatg ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg 1260 ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaat gtgccactcc 1320 cactgtcctt tcctaataaa atgaagaaat tgcatccgca ttgtctgagt aggtgtcta 1379 176

<210> 11 <211> 1415 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Clone 9508990 contendo a sequência de TSLPR-FLAG humana <220> <221> caracteristica_misc <222> (1)..(60) <223> Sequência de vector <220> <221> péptido_sinal <222> (62)..(127) <220> <221> caracteristica_misc <222> (755)..(817) <223> Sequência codificante prevista de domínio transmembranar <220> <221> caracteristica_misc <222> (1175)..(1201)

<223> Sequência codificante de FLAG 177 <220> <221> característica_misc <222> (1202)..(1415) <223> Sequência de vector <400> 11 ggatccacta gtaacggccg ccagtgtgct ggaattctgc agatatccat cacactggcc 60 catggggcgg ctggttctgc tgtggggagc tgccgtcttt ctgctgggag gctggatggc 120 tttggggcaa ggaggagcag cagaaggagt acagattcag atcatctact tcaatttaga 180 aaccgtgcag gtgacatgga atgccagcaa atactccagg accaacctga ctttccacta 240 cagattcaac ggtgatgagg cctatgacca gtgcaccaac taccttctcc aggaaggtca 300 cacttcaggg tgcctcctag acgcagagca gcgagacgac attctctatt tctccatcag 360 gaatgggacg caccccgttt tcaccgcaag tcgctggatg gtttattacc tgaaacccag 420 ttccccgaag cacgtgagat tttcgtggca tcaggatgca gtgacggtga cgtgttctga 480 cctgtcctac ggggatctcc tctatgaggt tcagtaccgg agccccttcg acaccgagtg 540 gcagtccaaa caggaaaata cctgcaacgt caccatagaa ggcttggatg ccgagaagtg 600 ttactctttc tgggtcaggg tgaaggctat ggaggatgta tatgggccag acacataccc 660 aagcgactgg tcagaggtga catgctggca gagaggcgag attcgggatg cctgtgcaga 720 gacaccaacg cctcccaaac caaagctgtc caaatttatt ttaatttcca gcctggccat 780 ccttctgatg gtgtctctcc tccttctgtc tttatggaaa ttatggagag tgaagaagtt 840 tctcattccc agcgtgccag acccgaaatc catcttcccc gggctctttg agatacacca 900 agggaacttc caggagtgga tcacagacac ccagaacgtg gcccacctcc acaagatggc 960 aggtgcagag caagaaagtg gccccgagga gcccctggta gtccagttgg ccaagactga 1020 agccgagtct cccaggatgc tggacccaca gaccgaggag aaagaggcct ctgggggatc 1080 cctccagctt ccccaccagc ccctccaagg cggtgatgtg gtcacaatcg ggggcttcac 1140 ctttgtgatg aatgaccgct cctacgtggc gttggactac aaggacgacg atgacaagta 1200 gtctagaggg ccctattcta tagtgtcacc taaatgctag agctcgctga tcagactcga 1260 ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 1320 tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 1380 tgagtaggtg tcattctatt etggggggtg gcgtt 1415 178 <210> 12 <211> 369 <212> PRT <213> Mus musculus <40 0> 12

Met Leu Lys Leu Leu Leu Ser Pro Arg Ser Phe Leu Vai Leu Gin Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Arg Ala Gly Trp Ser Ser Lys Vai Leu Met Ser Ser Ala 20 25 30 As η Glu Asp Ile Lys Ala Asp Leu Ile Leu Thr Ser Thr Ala Pro Glu 35 40 45 His Leu Ser Ala Pro Thr Leu Pro Leu Pro Glu Vai Gin Cys Phe Vai 50 55 60 Phe Asn Ile Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro 65 70 75 80 Gin Ala Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Arg Tyr Lys Vai Ser Asp Asn 85 90 95 Asn Thr Phe Gin Glu Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Lys Glu Ile Thr 100 105 110 Ser Gly Cys Gin Ile Gin Lys Glu Asp Ile Gin Leu Tyr Gin Thr Phe 115 120 125 Vai Vai Gin Leu Gin Asp Pro Gin Lys Pro Gin Arg Arg Ala Vai Gin 130 135 140 Lys Leu Asn Leu Gin Asn Leu Vai Ile Pro Arg Ala Pro Glu Asn Leu 145 150 155 160 Thr Leu Ser Asn Leu Ser Glu Ser Gin Leu Glu Leu Arg Trp Lys Ser 165 170 175 Arg His Ile Lys Glu Arg Cys Leu Gin Tyr Leu Vai Gin Tyr Arg Ser 180 185 190 Asn Arg Asp Arg Ser Trp Thr Glu Leu Ile Vai Asn His Glu Pro Arg 195 200 205 Phe Ser Leu Pro Ser Vai Asp Glu Leu Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Vai 210 215 220 Arg Ser Arg Tyr Asn Pro Ile Cys Gly Ser Ser Gin Gin Trp Ser Lys 225 230 235 240 179

Trp Ser Gin Pro Vai His Trp Gly Ser His Thr Vai Glu Glu Asn Pro 245 250 255 Ser Leu Phe Ala Leu Glu Ala Vai Leu Ile Pro Vai Gly Thr Met Gly 260 265 270 Leu Ile Ile Thr Leu Ile Phe Vai Tyr Cys Trp Leu Glu Arg Met Pro 275 280 285 Pro Ile Pro Pro Ile Lys Asn Leu Glu Asp Leu Vai Thr Glu Tyr Gin 290 295 300 Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Vai Ser Lys Gly Leu Thr Glu Ser 305 310 315 320 Leu Gin Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Phe Cys His Vai Ser Glu Ile Pro 325 330 335 Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Gly Ser Pro Cys Ser 340 345 350 Leu His Ser Pro Tyr Trp Pro Pro Pro Cys Tyr Ser Leu Lys Pro Glu 355 360 365 Ala

<210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana de tipo 1 <400> 13

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 15 io

<210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial 180 <220>

<220> Domínio de tat de VIH <223> Descrição de Sequência Artificial: internalização derivado da protein <400> 14

Arg Arg Arg 15

Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin 15 10

<210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

Motivo conservado

<223> Descrição de Sequência Artificial: do receptor de citocina de tipo I <220> <221> INCERTO <222> (3) de ocorrência <223> "Xaa" pode ser qualquer aminoácido natural <400> 15

Trp Ser Xaa Trp Ser 1 5

<210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial 181 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Motivo substituindo o motivo conservado do receptor de citocina de tipo I no polipéptido de TSLPR murino <400> 16

Trp Thr Ala Vai Thr 1 5

Lisboa, 7 de Setembro de 2012 182

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um anticorpo antagonista ou seu fragmento que se liga especificamente ao polipéptido da SEQ ID N°: 6, para inibição da ligação da linfopoietina estromal timica (TSLP) ao receptor da linfopoietina estromal timica (TSLPR) in vitro.
2. Utilização de um anticorpo antagonista ou seu fragmento que se liga especificamente ao polipéptido da SEQ ID N°: 6 e que é capaz de inibir a ligação da linfopoietina estromal timica (TSLP) ao receptor da linfopoietina estromal timica (TSLPR), na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença, distúrbio ou estado relacionado com TSLP.
3. Anticorpo antagonista ou seu fragmento que se liga especificamente ao polipéptido da SEQ ID N°: 6 e que é capaz de inibir a ligação da linfopoietina estromal timica (TSLP) ao receptor da linfopoietina estromal timica (TSLPR), para a utilização no tratamento de uma doença, distúrbio ou estado relacionado com TSLP.
4. Utilização de um anticorpo reivindicações 1 ou 2, ou fragmento da reivindicação de doença relacionada com anticorpo humanizado.
5. Utilização de um anticorpo reivindicações 1 ou 2, ou fragmento da reivindicação antagonista ou seu fragmento das um anticorpo antagonista ou seu 3, para utilização no tratamento TSLP, em que o anticorpo é um antagonista ou seu fragmento das um anticorpo antagonista ou seu 3, para utilização no tratamento 1 de doença relacionada com TSLP, em que o anticorpo é um anticorpo humano.
6. Utilização de um anticorpo antagonista de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 4, 5 ou um anticorpo antagonista ou seu fragmento das reivindicações 3-5, para utilização no tratamento de doença relacionada com TSLP, em que o fragmento de anticorpo compreende uma ou mais regiões variáveis do referido anticorpo.
7. Utilização de um anticorpo antagonista ou seu fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, ou um anticorpo antagonista ou seu fragmento da reivindicação 3, para utilização no tratamento de doença relacionada com TSLP, para inibição da activação do factor de transcrição Stat5. Lisboa, 7 de Setembro de 2012 2