JPH0750108B2 - 免疫反応測定法 - Google Patents
免疫反応測定法Info
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- JPH0750108B2 JPH0750108B2 JP63330231A JP33023188A JPH0750108B2 JP H0750108 B2 JPH0750108 B2 JP H0750108B2 JP 63330231 A JP63330231 A JP 63330231A JP 33023188 A JP33023188 A JP 33023188A JP H0750108 B2 JPH0750108 B2 JP H0750108B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は高感度で非特異反応が少ない免疫反応測定法に
関する。
関する。
（従来の技術） 各種生体成分から特定の被測定物質を検出もしくは定量
するために抗原抗体反応が利用されている。例えば，抗
原もしくは抗体である被測定物質に対する抗体もしくは
抗原を担持させたラテックスなどを試薬として凝集反応
を測定することにより被測定物質の測定がなされる。こ
のような免疫反応の測定方法としては，上記のように凝
集反応を光学的もしくは肉眼により目視観察する方法，
酵素免疫測定法（EIA），放射免疫測定法（RIA）など各
種方法が知られている。
するために抗原抗体反応が利用されている。例えば，抗
原もしくは抗体である被測定物質に対する抗体もしくは
抗原を担持させたラテックスなどを試薬として凝集反応
を測定することにより被測定物質の測定がなされる。こ
のような免疫反応の測定方法としては，上記のように凝
集反応を光学的もしくは肉眼により目視観察する方法，
酵素免疫測定法（EIA），放射免疫測定法（RIA）など各
種方法が知られている。
これらの免疫反応の測定法において，抗原抗体反応を促
進させ，あるいは微量成分を効果的に測定することを目
的として種々の添加剤が用いられている。例えば，反応
系にポリエチレングリコールやデキストランを添加する
方法が採用されている。これらは水溶性もしくは親水性
のポリマーであり，これらを加えることにより疎水性相
互作用により進行する抗原抗体反応が促進される。例え
ば，これらの化合物を加えることによりラテックス試薬
の凝集反応が促進される。しかし，これらの化合物によ
り反応系における非特異反応もまた促進されるため，バ
ックグラウンド値が上がる。そのため，バックグラウン
ド値を越える量の測定値でないと検出することができな
い。つまり多量の試料を必要とする。従って，この方法
は，短時間で反応を進行させることは可能であるが，非
特異反応を抑制するには充分な方法とはいえない。さら
に，使用されるポリエチレングリコールの市販品は,290
nm付近に吸収を有する不純物を含有することが多い。そ
のため，使用前に精製する必要があり，取扱いが煩雑と
なる。
進させ，あるいは微量成分を効果的に測定することを目
的として種々の添加剤が用いられている。例えば，反応
系にポリエチレングリコールやデキストランを添加する
方法が採用されている。これらは水溶性もしくは親水性
のポリマーであり，これらを加えることにより疎水性相
互作用により進行する抗原抗体反応が促進される。例え
ば，これらの化合物を加えることによりラテックス試薬
の凝集反応が促進される。しかし，これらの化合物によ
り反応系における非特異反応もまた促進されるため，バ
ックグラウンド値が上がる。そのため，バックグラウン
ド値を越える量の測定値でないと検出することができな
い。つまり多量の試料を必要とする。従って，この方法
は，短時間で反応を進行させることは可能であるが，非
特異反応を抑制するには充分な方法とはいえない。さら
に，使用されるポリエチレングリコールの市販品は,290
nm付近に吸収を有する不純物を含有することが多い。そ
のため，使用前に精製する必要があり，取扱いが煩雑と
なる。
（発明が解決しようとする課題） 本発明は，上記従来の問題点を解決するものであり，そ
の目的とするところは，非特異反応が抑制されかつ高感
度の得られる免疫反応測定法を提供することにある。
の目的とするところは，非特異反応が抑制されかつ高感
度の得られる免疫反応測定法を提供することにある。
（課題を解決するための手段） 本発明の免疫反応測定法は，抗原または抗体でなる被測
定物質を該抗原または抗体に対する抗体または抗原を用
いて測定する方法であって，該免疫反応の反応系にはア
ルキル化多糖類が0.1〜0.5％（W/W）の割合で存在し，
そのことにより上記目的が達成される。
定物質を該抗原または抗体に対する抗体または抗原を用
いて測定する方法であって，該免疫反応の反応系にはア
ルキル化多糖類が0.1〜0.5％（W/W）の割合で存在し，
そのことにより上記目的が達成される。
本発明に用いられるアルキル化多糖類としては，メチル
基，エチル基などの炭素数１〜５のアルキル基を有する
多糖類であって，水溶性の化合物が用いられる。それに
は，例えば，メチルセルロース，エチルセルロースなど
がある。アルキル化多糖類の分子量は1,000〜500,000が
適当である。分子量が大きすぎると水に溶解させたとき
の粘度が高くなるため，取り扱いが困難となる。水に溶
解させたときの粘度が適当になるように,2種以上のアル
キル化多糖類を組み合わせて用いることも可能である。
基，エチル基などの炭素数１〜５のアルキル基を有する
多糖類であって，水溶性の化合物が用いられる。それに
は，例えば，メチルセルロース，エチルセルロースなど
がある。アルキル化多糖類の分子量は1,000〜500,000が
適当である。分子量が大きすぎると水に溶解させたとき
の粘度が高くなるため，取り扱いが困難となる。水に溶
解させたときの粘度が適当になるように,2種以上のアル
キル化多糖類を組み合わせて用いることも可能である。
本発明により測定されるべき物質は特に限定されず，一
般に抗原抗体反応を利用して測定し得る生理活性物質は
いずれも測定が可能である。被測定物質としては，タン
パク，脂質などがあり，それには例えば，各種抗原，レ
セプター，酵素などが挙げられる。具体的には,HBs抗
体,HBc抗体，梅毒抗体（トレポネーマ抗原および脂質抗
原に対する抗体），抗HIV（ヒト免疫不全ウィルス）抗
体，抗ATLA（成人Ｔ細胞白血病関連抗原）抗体などの，
感染症に関係する抗体が挙げられる。
般に抗原抗体反応を利用して測定し得る生理活性物質は
いずれも測定が可能である。被測定物質としては，タン
パク，脂質などがあり，それには例えば，各種抗原，レ
セプター，酵素などが挙げられる。具体的には,HBs抗
体,HBc抗体，梅毒抗体（トレポネーマ抗原および脂質抗
原に対する抗体），抗HIV（ヒト免疫不全ウィルス）抗
体，抗ATLA（成人Ｔ細胞白血病関連抗原）抗体などの，
感染症に関係する抗体が挙げられる。
本発明により被測定物質を測定する場合の測定系は特に
限定されず，通常の免疫比濁法,EIA,RIA,血球凝集法な
どが利用され得る。例えば，ラテックス試薬を用いた免
疫反応により被測定物質を測定する場合には，被測定物
質である抗原または抗体に対する抗体または抗原を含有
するラテックス試薬にあらかじめアルキル化多糖類を添
加しておく。このような試薬を用いて免疫凝集反応を行
ない，生じた凝集の程度を光学的に観察もしくは目視観
察することにより被測定物質が測定され得る。あるい
は，アルキル化多糖類を含まないラテックスを使用する
ことも可能で，この場合には免疫反応時にアルキル化多
糖類が該反応系に存在するようにすればよい。例えば，
検体にあらかじめアルキル化多糖類を添加しておく方
法；使用する緩衝液にアルキル化多糖類を加えておく方
法などがあり，特に限定されない。本発明の免疫反応測
定法においては，ラテックス試薬にあらかじめアルキル
化多糖類を添加しておく方法であれ，アルキル化多糖類
を含まないラテックス試薬を使用し免疫反応時にアルキ
ル化多糖類を該反応系に存在させる方法であれ，アルキ
ル化多糖類を免疫反応時の反応系に0.1〜0.5％（W/W）
の割合で存在させる。
限定されず，通常の免疫比濁法,EIA,RIA,血球凝集法な
どが利用され得る。例えば，ラテックス試薬を用いた免
疫反応により被測定物質を測定する場合には，被測定物
質である抗原または抗体に対する抗体または抗原を含有
するラテックス試薬にあらかじめアルキル化多糖類を添
加しておく。このような試薬を用いて免疫凝集反応を行
ない，生じた凝集の程度を光学的に観察もしくは目視観
察することにより被測定物質が測定され得る。あるい
は，アルキル化多糖類を含まないラテックスを使用する
ことも可能で，この場合には免疫反応時にアルキル化多
糖類が該反応系に存在するようにすればよい。例えば，
検体にあらかじめアルキル化多糖類を添加しておく方
法；使用する緩衝液にアルキル化多糖類を加えておく方
法などがあり，特に限定されない。本発明の免疫反応測
定法においては，ラテックス試薬にあらかじめアルキル
化多糖類を添加しておく方法であれ，アルキル化多糖類
を含まないラテックス試薬を使用し免疫反応時にアルキ
ル化多糖類を該反応系に存在させる方法であれ，アルキ
ル化多糖類を免疫反応時の反応系に0.1〜0.5％（W/W）
の割合で存在させる。
上記免疫反応の条件は通常の場合と同様であり，反応媒
体としては，被測定物質の種類に応じた各種緩衝液が用
いられる。この緩衝液は，被測定物質を失活させること
がなく，かつ抗原抗体反応を阻害しないようなイオン強
度やpHを有するものであればよい。反応時には，さらに
測定系の特異性を高めるために，塩化コリン,EDTAなど
を添加することも可能である。
体としては，被測定物質の種類に応じた各種緩衝液が用
いられる。この緩衝液は，被測定物質を失活させること
がなく，かつ抗原抗体反応を阻害しないようなイオン強
度やpHを有するものであればよい。反応時には，さらに
測定系の特異性を高めるために，塩化コリン,EDTAなど
を添加することも可能である。
本発明によれば，アルキル化多糖類の働きにより，免疫
反応における非特異反応が抑制され，かつ高感度に被測
定物質が測定され得る。以下に，本発明の実施例を述
べ，その効果を具体的に説明する。
反応における非特異反応が抑制され，かつ高感度に被測
定物質が測定され得る。以下に，本発明の実施例を述
べ，その効果を具体的に説明する。
（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。
実施例１ （凝集板を用いたマニュアル法による梅毒抗体の測定） 梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体の測定を行なった。
本実施例においては，次に挙げる試薬および測定用検体
を使用した。後述の実施例２〜６および比較例１〜６に
おいても，特に指示されない限り，同名の試薬および検
体については，同様のものを使用した。
本実施例においては，次に挙げる試薬および測定用検体
を使用した。後述の実施例２〜６および比較例１〜６に
おいても，特に指示されない限り，同名の試薬および検
体については，同様のものを使用した。
PBS（リン酸緩衝液）：リン酸一ナトリウム（２水和
物），リン酸二ナトリウム（２水和物）および塩化ナト
リウムを，リン酸および塩化ナトリウムの終濃度がそれ
ぞれ0.02Mおよび0.15M,pHが7.4となるように精製水に加
えて，調製を行なった。
物），リン酸二ナトリウム（２水和物）および塩化ナト
リウムを，リン酸および塩化ナトリウムの終濃度がそれ
ぞれ0.02Mおよび0.15M,pHが7.4となるように精製水に加
えて，調製を行なった。
１％BSA・PBS:PBSに試薬特級BSA（ウシ血清アルブミ
ン）を１％（W/W）となるように溶解させて調製した。
ン）を１％（W/W）となるように溶解させて調製した。
１％トリトンＸ−100:リン酸緩衝液にトリトンＸ−100
を１％（W/W）となるように溶解させた。
を１％（W/W）となるように溶解させた。
0.3％メチルセルロース:1％BSA・PBSにメチルセルロー
ス（半井化学社製；平均粘度100cps）を0.3％（W/W）と
なるように溶解させた。
ス（半井化学社製；平均粘度100cps）を0.3％（W/W）と
なるように溶解させた。
0.3％エチルセルロース:1％BSA・PBSにエチルセルロー
ス（半井化学社製；平均粘度40cps）を0.3％（W/W）と
なるように溶解させた。
ス（半井化学社製；平均粘度40cps）を0.3％（W/W）と
なるように溶解させた。
３％ポリエチレングリコール:1％BSA・PBSにポリエチレ
ングリコール（半井化学社製；平均分子量6000）を３％
（W/W）となるように溶解させた。
ングリコール（半井化学社製；平均分子量6000）を３％
（W/W）となるように溶解させた。
３％デキストラン:1％BSA・PBSにデキストラン（和光純
薬社製）を３％（W/W）となるように溶解させた。
薬社製）を３％（W/W）となるように溶解させた。
梅毒抗原液：家兎睾丸中で10〜14日間培養したトレポネ
ーマ パリダム［Treponema pallidum;CDC（Center fo
r Disease Control,Public Health Service,U.S.Depart
ment of Health,Education and Welfare,Atlanta,Georg
ia）より入手したものを家兎睾丸に接種し，継代培養し
たものを用いた］を生理食塩水中に109個菌体/mlとなる
ように懸濁した菌体懸濁液1mlを採り，リン酸緩衝液中
で遠心分離（6,000rpm×５分,3回）することにより洗浄
した。次いで，得られた沈澱に１％トリトンＸ−100を1
ml添加し,37℃にて30分間インキュベートした。その
後，これを超遠心分離機にかけて（50,000rpm×１時
間）上清を採取し,1％トリトンＸ−100で1,000倍希釈し
て使用した。
ーマ パリダム［Treponema pallidum;CDC（Center fo
r Disease Control,Public Health Service,U.S.Depart
ment of Health,Education and Welfare,Atlanta,Georg
ia）より入手したものを家兎睾丸に接種し，継代培養し
たものを用いた］を生理食塩水中に109個菌体/mlとなる
ように懸濁した菌体懸濁液1mlを採り，リン酸緩衝液中
で遠心分離（6,000rpm×５分,3回）することにより洗浄
した。次いで，得られた沈澱に１％トリトンＸ−100を1
ml添加し,37℃にて30分間インキュベートした。その
後，これを超遠心分離機にかけて（50,000rpm×１時
間）上清を採取し,1％トリトンＸ−100で1,000倍希釈し
て使用した。
梅毒陽性家兎血清：トレポネーマ パリダムを睾丸に接
種後45日間飼育した家兎から血清を採取した。この血清
を１％BSA・PBSで100倍,200倍および400倍に希釈して使
用した。
種後45日間飼育した家兎から血清を採取した。この血清
を１％BSA・PBSで100倍,200倍および400倍に希釈して使
用した。
正常家兎血清：トレポネーマ パリダムを接種されてい
ない家兎から採取した血清を用いた。市販のTPHAキット
（セロディアTP;富士レビオ製）を用いてタイターを測
定したところ，結果は陰性を示した。この血清を１％BS
A・PBSで100倍から400倍に希釈して用いた。
ない家兎から採取した血清を用いた。市販のTPHAキット
（セロディアTP;富士レビオ製）を用いてタイターを測
定したところ，結果は陰性を示した。この血清を１％BS
A・PBSで100倍から400倍に希釈して用いた。
ラテックス：積水化学工業（株）製の粒径0.23μｍのポ
リスチレンラテックス（固形分10％）を用いた。
リスチレンラテックス（固形分10％）を用いた。
（Ａ）ラテックスへの梅毒抗原の感作：ラテックス100
μと，梅毒抗原液400μとを速やかに混合し，室温
で攪拌した。１時間後に１％BSA・PBSを5ml加え,15000r
pmで１時間遠心した。これを２回繰り返してラテックス
を洗浄した。洗浄後のペレットを2mlの0.3％メチルセル
ロースあるいは0.3％エチルセルロースに懸濁させ，よ
く分散して固形分0.5％のラテックス試薬を得た。これ
を４℃にて保存した。
μと，梅毒抗原液400μとを速やかに混合し，室温
で攪拌した。１時間後に１％BSA・PBSを5ml加え,15000r
pmで１時間遠心した。これを２回繰り返してラテックス
を洗浄した。洗浄後のペレットを2mlの0.3％メチルセル
ロースあるいは0.3％エチルセルロースに懸濁させ，よ
く分散して固形分0.5％のラテックス試薬を得た。これ
を４℃にて保存した。
（Ｂ）梅毒抗体の測定：梅毒陽性家兎血清と（Ａ）項で
得られたラテックス試薬とを50μずつ凝集観察板上に
採り，混合・攪拌したのち３分間反応させた。対照とし
て，正常家兎血清についても同様に反応を行なった。ラ
テックス試薬の凝集を目視観察した。凝集した検体を陽
性，凝集の認められなかった検体を陰性とした。その結
果を表１に示す。表１において＋および＋＋は陽性（＋
＋は凝集の度合が大きい），±は偽陽性，そして−は陰
性を示す。
得られたラテックス試薬とを50μずつ凝集観察板上に
採り，混合・攪拌したのち３分間反応させた。対照とし
て，正常家兎血清についても同様に反応を行なった。ラ
テックス試薬の凝集を目視観察した。凝集した検体を陽
性，凝集の認められなかった検体を陰性とした。その結
果を表１に示す。表１において＋および＋＋は陽性（＋
＋は凝集の度合が大きい），±は偽陽性，そして−は陰
性を示す。
比較例１ 0.3％メチルセルロースの代わりに１％BSA・PBS,3％ポ
リエチレングルコールまたは３％デキストランを用いて
実施例１と同様に反応を行なった。その結果を表１に示
す。
リエチレングルコールまたは３％デキストランを用いて
実施例１と同様に反応を行なった。その結果を表１に示
す。
表１から，ラテックス試薬において，本発明の免疫反応
測定法を用いると，従来の試薬では偽陽性が生じる検体
でも，非特異反応を起こすことなく正確に測定し得るこ
とが明らかである。
測定法を用いると，従来の試薬では偽陽性が生じる検体
でも，非特異反応を起こすことなく正確に測定し得るこ
とが明らかである。
実施例２ （全自動分析装置を用いた梅毒抗体の測定） 実施例１と同様の検体および試薬を用い，日立7050型全
自動分析装置により測定を行なった。但し，ラテックス
試薬にはメチルセルロース（またはエチルセルロース）
は加えず,1％BSA・PBSで希釈して固形分0.25％に調整し
た。後述の希釈液としては0.3％メチルセルロースまた
は0.3％エチルセルロースを使用した。測定条件は次の
とおりである。
自動分析装置により測定を行なった。但し，ラテックス
試薬にはメチルセルロース（またはエチルセルロース）
は加えず,1％BSA・PBSで希釈して固形分0.25％に調整し
た。後述の希釈液としては0.3％メチルセルロースまた
は0.3％エチルセルロースを使用した。測定条件は次の
とおりである。
検体容量 20μ ラテックス試薬（R2） 50μ 希釈液（R1） 350μ 測定波長 570nm 検体20μをとり、これに希釈液（R1）350μを加え
た。これにラテックス試薬50μを添加後、この溶液を
攪拌・混合した。そして、該ラテックス試薬の添加から
80秒後と320秒後の波長570nmにおける吸光度の差（ΔOD
570）を分光光度計で読み採り、この吸光度の変化量を
表２に示した（ｎ＝４の平均値）。なお、この抗原抗体
反応は37℃で行なった。梅毒陽性家兎血清の希釈倍率と
△OD570との関係を，比較例２の結果とあわせて第１図
に示す。第１図および後述の第２図において●はメチル
セルロースを用いた場合の測定値，そして○はエチルセ
ルロースを用いた場合の測定値を示す。なお，表２およ
び後述の表５に示した吸光度の変化量の数値は，日立70
50型全自動分析装置からの出力値を表示したものであ
る。
た。これにラテックス試薬50μを添加後、この溶液を
攪拌・混合した。そして、該ラテックス試薬の添加から
80秒後と320秒後の波長570nmにおける吸光度の差（ΔOD
570）を分光光度計で読み採り、この吸光度の変化量を
表２に示した（ｎ＝４の平均値）。なお、この抗原抗体
反応は37℃で行なった。梅毒陽性家兎血清の希釈倍率と
△OD570との関係を，比較例２の結果とあわせて第１図
に示す。第１図および後述の第２図において●はメチル
セルロースを用いた場合の測定値，そして○はエチルセ
ルロースを用いた場合の測定値を示す。なお，表２およ
び後述の表５に示した吸光度の変化量の数値は，日立70
50型全自動分析装置からの出力値を表示したものであ
る。
比較例２ 希釈液として,1％BSA・PBS,3％ポリエチレングリコール
または３％デキストランを用いたこと以外は実施例２と
同様である。その結果を表２および第１図に示す。
または３％デキストランを用いたこと以外は実施例２と
同様である。その結果を表２および第１図に示す。
第１図および後述の第２図において△は１％BSA・PBS,
▲はポリエチレングリコール（PEG6000），そして□は
３％デキストランを用いた場合の測定値を示す。
▲はポリエチレングリコール（PEG6000），そして□は
３％デキストランを用いた場合の測定値を示す。
表２および第１図の結果から明らかなように，本発明に
よれば従来の方法では凝集が認められなかった高希釈率
の陽性血清においても，陽性と判定し得る程度の高い感
度が得られた。さらに，非特異反応による凝集が認めら
れない。このように，特異性が高く，高感度の測定が達
成された。
よれば従来の方法では凝集が認められなかった高希釈率
の陽性血清においても，陽性と判定し得る程度の高い感
度が得られた。さらに，非特異反応による凝集が認めら
れない。このように，特異性が高く，高感度の測定が達
成された。
実施例３ （ELRSAによる梅毒抗体の測定） 実施例１に挙げられた試薬および検体に加えて，本実施
例では，さらに次の試薬およびプレートを用いた。
例では，さらに次の試薬およびプレートを用いた。
ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG:ペルオキシダーゼ標
識抗ウサギIgG（マイルズ・ラボラトリーズ社）を１％B
SA・PBSで1,000倍に希釈して用いた。
識抗ウサギIgG（マイルズ・ラボラトリーズ社）を１％B
SA・PBSで1,000倍に希釈して用いた。
ペルオキシダーゼ基質：リン酸−クエン酸緩衝液にｏ−
フェニレンジアミン（２塩酸塩）を2mg/ml,そして過酸
化水素水を0.03％（H2O2）となるように加えた。基質の
調製は使用直前に行った。
フェニレンジアミン（２塩酸塩）を2mg/ml,そして過酸
化水素水を0.03％（H2O2）となるように加えた。基質の
調製は使用直前に行った。
（Ａ）抗原の固定化：梅毒抗原液をマイクロタイタープ
レートの各ウェルに,50μずつ分注し，室温で１時間
インキュベートした。ウェルを１％BSA・PBS200μで
１回洗浄した後,1％BSA・PBS200μを加えて室温で１
時間インキュベートし，ブロッキングを行った。その
後,1％BSA・PBSを吸引除去し，直ちにELISA分析に使用
した。
レートの各ウェルに,50μずつ分注し，室温で１時間
インキュベートした。ウェルを１％BSA・PBS200μで
１回洗浄した後,1％BSA・PBS200μを加えて室温で１
時間インキュベートし，ブロッキングを行った。その
後,1％BSA・PBSを吸引除去し，直ちにELISA分析に使用
した。
（Ｂ）梅毒抗体の測定:1％BSA・PBSの代わりに,0.3％メ
チルセルロースまたは0.3％エチルセルロースを用いて1
00,200および400倍に希釈した梅毒陽性家兎血清を第１
抗体溶液とした。これを各ウェルに50μずつ分注し，
室温で１時間インキュベートした。対照として，正常家
兎血清を同様に希釈した溶液を調製し，これを用いて同
様に分注，インキュベートした。
チルセルロースまたは0.3％エチルセルロースを用いて1
00,200および400倍に希釈した梅毒陽性家兎血清を第１
抗体溶液とした。これを各ウェルに50μずつ分注し，
室温で１時間インキュベートした。対照として，正常家
兎血清を同様に希釈した溶液を調製し，これを用いて同
様に分注，インキュベートした。
１時間後に，反応液を吸引除去し,1％BSA・PBS200μ
で３回洗浄したのち，ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIg
G（第２抗体溶液）を各ウェルに50μずつ分注した。
室温で１時間インキュベートした後，反応液を吸引除去
し,1％BSA・PBS200μで３回洗浄した。
で３回洗浄したのち，ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIg
G（第２抗体溶液）を各ウェルに50μずつ分注した。
室温で１時間インキュベートした後，反応液を吸引除去
し,1％BSA・PBS200μで３回洗浄した。
各ウェルに直ちにペルオキシダーゼ基質100μずつを
分注し，室温で１分間インキュベートした。基質ブラン
クとして，第１抗体および第２抗体のいずれも添加して
いないウェルを用意し，同様に基質液を添加してインキ
ュベートした。インキュベート後,1N硫酸を100μづつ
分注し，酵素反応を停止させた。各ウェルの酵素反応時
間が一定となるように操作を行った。反応停止後，マイ
クロタイタープレートリーダー（MTP−100,コロナ社
製）により，基質ブランクを対照として,492nmの吸光度
を測定した。その結果を表３に示す（ｎ＝４の平均
値）。
分注し，室温で１分間インキュベートした。基質ブラン
クとして，第１抗体および第２抗体のいずれも添加して
いないウェルを用意し，同様に基質液を添加してインキ
ュベートした。インキュベート後,1N硫酸を100μづつ
分注し，酵素反応を停止させた。各ウェルの酵素反応時
間が一定となるように操作を行った。反応停止後，マイ
クロタイタープレートリーダー（MTP−100,コロナ社
製）により，基質ブランクを対照として,492nmの吸光度
を測定した。その結果を表３に示す（ｎ＝４の平均
値）。
比較例３ 梅毒陽性血清の希釈液として１％BSA・PBS,3％ポリエチ
レングリコールまたは３％デキストランを用いたこと以
外は実施例３と同様である。その結果を表３に示す。
レングリコールまたは３％デキストランを用いたこと以
外は実施例３と同様である。その結果を表３に示す。
表３の結果から明らかなように，本発明によれば，従来
の方法では抑制できなかった正常家兎血清での非特異反
応を吸光度０から0.005の間に低下させることが可能と
なる。陽性血清に関しては，抗原・抗体反応を特異的に
促進した結果，感度をほぼ３倍またはそれ以上に向上さ
せることが可能となった。
の方法では抑制できなかった正常家兎血清での非特異反
応を吸光度０から0.005の間に低下させることが可能と
なる。陽性血清に関しては，抗原・抗体反応を特異的に
促進した結果，感度をほぼ３倍またはそれ以上に向上さ
せることが可能となった。
実施例４ （凝集板を用いたマニュアル法によるHBs抗体の測定） 本実施例において，実施例１と同一名の試薬は実施例１
と同様に調製を行なった。その他の試薬の調製法を次に
示す。
と同様に調製を行なった。その他の試薬の調製法を次に
示す。
HBs抗原液：ヒト血漿よりアフィニティークロマトグラ
フィーにより精製した精製HBs抗原を使用した。抗原は
リン酸緩衝液に溶解し，濃度をローリー法により測定し
た。使用直前に，リン酸緩衝液により希釈し，濃度を１
〜10μg/mlとなるように調整し，これをHBs抗原液とし
た。
フィーにより精製した精製HBs抗原を使用した。抗原は
リン酸緩衝液に溶解し，濃度をローリー法により測定し
た。使用直前に，リン酸緩衝液により希釈し，濃度を１
〜10μg/mlとなるように調整し，これをHBs抗原液とし
た。
HBs陽性家兎血清：精製HBs抗原を，フロイントの完全ア
ジュバントとともに家兎に免疫して得られた抗血清を，
正常ヒト血清を結合させたカラムで吸収操作をしてから
用いた。正常ヒト血清を結合させたカラムはCNBr活性化
セファロースCL4B（ファルマシア社）を用い，メーカー
（ファルマシア）の使用説明書に従って行った。吸収操
作を行った抗HBs血清は,1％BSA・PBSにより,100から400
倍に希釈して用いた。
ジュバントとともに家兎に免疫して得られた抗血清を，
正常ヒト血清を結合させたカラムで吸収操作をしてから
用いた。正常ヒト血清を結合させたカラムはCNBr活性化
セファロースCL4B（ファルマシア社）を用い，メーカー
（ファルマシア）の使用説明書に従って行った。吸収操
作を行った抗HBs血清は,1％BSA・PBSにより,100から400
倍に希釈して用いた。
（Ａ）ラテックスへのHBs抗原の感作：ラテックス100μ
と,HBs抗原液400μとを速やかに混合し，室温で攪
拌した。１時間後に１％BSA・PBSを5ml加え,15000rpmで
１時間遠心した。これを２回繰り返してラテックスを洗
浄した。洗浄後のペレットを2mlの0.3％メチルセルロー
スあるいは0.3％エチルセルロースに懸濁させ，よく分
散して固形分0.5％のラテックス試薬を得た。これを４
℃にて保存した。
と,HBs抗原液400μとを速やかに混合し，室温で攪
拌した。１時間後に１％BSA・PBSを5ml加え,15000rpmで
１時間遠心した。これを２回繰り返してラテックスを洗
浄した。洗浄後のペレットを2mlの0.3％メチルセルロー
スあるいは0.3％エチルセルロースに懸濁させ，よく分
散して固形分0.5％のラテックス試薬を得た。これを４
℃にて保存した。
（Ｂ）HBs抗体の測定 HBs陽性家兎血清と本実施例（Ａ）項で得られたラテッ
クス試薬とを50μずつ凝集観察板上に採り，混合・攪
拌したのち３分間反応させた。対照として，正常家兎血
清についても同様に反応を行なった。ラテックス試薬の
凝集を実施例１と同様に行なった。その結果を表４に示
す。
クス試薬とを50μずつ凝集観察板上に採り，混合・攪
拌したのち３分間反応させた。対照として，正常家兎血
清についても同様に反応を行なった。ラテックス試薬の
凝集を実施例１と同様に行なった。その結果を表４に示
す。
比較例４ 0.3％メチルセルロースの代わりに１％BSA・PBS,3％ポ
リエチレングリコールまたは３％デキストランを用いて
実施例４と同様に反応を行なった。その結果を表４に示
す。
リエチレングリコールまたは３％デキストランを用いて
実施例４と同様に反応を行なった。その結果を表４に示
す。
表４から明らかなように，本発明によれば従来の方法で
は偽陽性が生じる検体でも，特異性高く診断することが
可能である。
は偽陽性が生じる検体でも，特異性高く診断することが
可能である。
実施例５ （全自動分析装置を用いたHBs抗体の測定） 実施例４の検体および試薬を用い，実施例２の方法に従
ってHBs抗体の測定を行なった。ラテックス試薬につい
ても実施例２と同様に0.25％とし，希釈液に0.3％メチ
ルセルロースまたは0.3％エチルセルロースを使用し
た。その結果を表５および第２図に示す。
ってHBs抗体の測定を行なった。ラテックス試薬につい
ても実施例２と同様に0.25％とし，希釈液に0.3％メチ
ルセルロースまたは0.3％エチルセルロースを使用し
た。その結果を表５および第２図に示す。
比較例５ 希釈液として,1％BSA・PBS,3％ポリエチレングリコール
または３％デキストランを用いたこと以外は実施例５と
同様である。その結果を表５および第２図に示す。
または３％デキストランを用いたこと以外は実施例５と
同様である。その結果を表５および第２図に示す。
表５および第２図の結果から明らかなように，本発明に
よれば従来の方法では凝集が認められなかった高希釈率
の陽性血清においても，陽性と判定し得る強度の高い感
度が得られた。さらに，非特異反応による凝集が認めら
れない。このために，特異性が高く，高感度の測定が達
成された。
よれば従来の方法では凝集が認められなかった高希釈率
の陽性血清においても，陽性と判定し得る強度の高い感
度が得られた。さらに，非特異反応による凝集が認めら
れない。このために，特異性が高く，高感度の測定が達
成された。
実施例６ （EIAによるインスリンの測定） 本実施例において，実施例１と同一名の試薬は実施例１
と同様に調製を行なった。EIAキットおよび検体は，次
のキットおよび血清を使用した。
と同様に調製を行なった。EIAキットおよび検体は，次
のキットおよび血清を使用した。
インスリン測定用EIAキット:INSULIN〔MITSUI〕II（カ
イノス社製）。
イノス社製）。
インスリン高値血清：インスリン濃度が高値の血清で、
他のインスリン測定用キット［Insulin B−Test Wako
（和光純薬社製）］により，インスリンを含有すること
が確認されている血清。
他のインスリン測定用キット［Insulin B−Test Wako
（和光純薬社製）］により，インスリンを含有すること
が確認されている血清。
キット構成品である酵素標識抗体溶液中に，メチルセル
ロースまたはエチルセルロースを添加し，終濃度が0.3
％（W/W）となるようにした。この酵素標識抗体溶液を
使用し，カイノス社のキットの使用添付書に従って，イ
ンスリン高値血清について，インスリン濃度の測定を行
った。対照として，他のインスリン測定法（Insulin B
−Test Wako）によりインスリン濃度が低値（10μU/ml
以下）であると確認されたインスリン低値血清も同時に
測定した。420nmにおける吸光度（ｎ＝４の平均値）を
表６に示す。
ロースまたはエチルセルロースを添加し，終濃度が0.3
％（W/W）となるようにした。この酵素標識抗体溶液を
使用し，カイノス社のキットの使用添付書に従って，イ
ンスリン高値血清について，インスリン濃度の測定を行
った。対照として，他のインスリン測定法（Insulin B
−Test Wako）によりインスリン濃度が低値（10μU/ml
以下）であると確認されたインスリン低値血清も同時に
測定した。420nmにおける吸光度（ｎ＝４の平均値）を
表６に示す。
比較例６ 実施例６において，酵素標識抗体にメチルセルロースあ
るいはエチルセルロースを添加しない場合，メチルセル
ロースあるいはエチルセルロースの代わりにポリエチレ
ングリコールまたはデキストランを終濃度が３％となる
ように添加した場合についてそれぞれ測定を行なった。
その結果を表６に示す。
るいはエチルセルロースを添加しない場合，メチルセル
ロースあるいはエチルセルロースの代わりにポリエチレ
ングリコールまたはデキストランを終濃度が３％となる
ように添加した場合についてそれぞれ測定を行なった。
その結果を表６に示す。
表６から明らかなように，本発明の免疫反応測定法を用
いると，非特異反応が抑制され，かつバックグラウンド
値を低下させることが可能である。
いると，非特異反応が抑制され，かつバックグラウンド
値を低下させることが可能である。
（発明の効果） 本発明によれば，このように，免疫反応を利用した被測
定物質の測定において，非特異反応が抑制され，かつ高
感度に被測定物質が測定され得る。本発明は，ラテック
ス試薬を利用した免疫測定法,EIA,RIAなどに利用され
得，各種生理活性物質が効果的に測定され得る。
定物質の測定において，非特異反応が抑制され，かつ高
感度に被測定物質が測定され得る。本発明は，ラテック
ス試薬を利用した免疫測定法,EIA,RIAなどに利用され
得，各種生理活性物質が効果的に測定され得る。
第１図および第２図は，本発明により血清中の梅毒抗体
およびHBs抗体をそれぞれ測定したときの，血清希釈倍
率と測定の結果得られる吸光度と関係を示すグラフであ
る。
およびHBs抗体をそれぞれ測定したときの，血清希釈倍
率と測定の結果得られる吸光度と関係を示すグラフであ
る。
Claims (1)
- 【請求項１】抗原または抗体でなる被測定物質を該抗原
または抗体に対する抗体または抗原を用いて測定する免
疫反応測定法であって，該免疫反応の反応系にアルキル
化多糖類を0.1〜0.5％（W/W）の割合で存在させる，免
疫反応測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63330231A JPH0750108B2 (ja) | 1988-12-26 | 1988-12-26 | 免疫反応測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63330231A JPH0750108B2 (ja) | 1988-12-26 | 1988-12-26 | 免疫反応測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02173567A JPH02173567A (ja) | 1990-07-05 |
| JPH0750108B2 true JPH0750108B2 (ja) | 1995-05-31 |
Family
ID=18230323
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63330231A Expired - Fee Related JPH0750108B2 (ja) | 1988-12-26 | 1988-12-26 | 免疫反応測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0750108B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69229551T2 (de) * | 1991-05-30 | 2000-01-27 | Abbott Laboratories, Abbott Park | Reagenzien, die einen nichtspezifischen bindungshemmer in einem ioneneinfang-assay enthalten |
| AU2002313319B2 (en) | 2001-07-02 | 2007-05-10 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Carrier particle latex for assay reagent and assay reagent |
| CN114689852A (zh) * | 2020-12-31 | 2022-07-01 | 广东菲鹏生物有限公司 | 一种hiv标记稀释剂、试剂盒及其制备方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56158947A (en) * | 1980-04-15 | 1981-12-08 | Technicon Instr | Coagulation reaction immunologic inspection |
| JPS57182169A (en) * | 1981-05-02 | 1982-11-09 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Measuring method for antigen-antibody reaction |
| JPS61271461A (ja) * | 1985-05-28 | 1986-12-01 | Olympus Optical Co Ltd | 再使用可能な免疫吸着体 |
| JPS6316266A (ja) * | 1986-07-09 | 1988-01-23 | Toyobo Co Ltd | 自己抗体測定用試薬組成物 |
| JPH0750110A (ja) * | 1991-09-27 | 1995-02-21 | Kazuo Ikezaki | 導電性複合フィルムの作製方法 |
-
1988
- 1988-12-26 JP JP63330231A patent/JPH0750108B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56158947A (en) * | 1980-04-15 | 1981-12-08 | Technicon Instr | Coagulation reaction immunologic inspection |
| JPS57182169A (en) * | 1981-05-02 | 1982-11-09 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Measuring method for antigen-antibody reaction |
| JPS61271461A (ja) * | 1985-05-28 | 1986-12-01 | Olympus Optical Co Ltd | 再使用可能な免疫吸着体 |
| JPS6316266A (ja) * | 1986-07-09 | 1988-01-23 | Toyobo Co Ltd | 自己抗体測定用試薬組成物 |
| JPH0750110A (ja) * | 1991-09-27 | 1995-02-21 | Kazuo Ikezaki | 導電性複合フィルムの作製方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02173567A (ja) | 1990-07-05 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |