JPH0746100B2 - Cell fixing / preservation solution - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細胞診検体の固定に適した細胞固定液に関し、
細胞の核と細胞質を良好な形態に固定し、さらにその形
態をかなりの期間保存しうるものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial field of use] The present invention relates to a cell fixative suitable for fixing a cytological specimen,
It can fix the nucleus and cytoplasm of cells to a good morphology and preserve the morphology for a considerable period of time.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

喀痰や子宮膣部から綿棒で採取された粘液性の検体中に
は無数の細胞が含まれており、その中に前癌状態の異型
細胞や癌細胞が含まれていないかどうかを検査するのが
細胞診であり、この細胞診は、現代の癌の早期発見に重
要な役割を担っている。この細胞診には顕微鏡が用いら
れてきたが、近年はそれに加えて、細胞を秒速数百個ま
たはそれ以上のスピードで流して測定するところの自動
細胞分析・分離装置であるフローサイトメトリー（flow
cytometry）を用いて行う自動化細胞診も適用されよう
としている。顕微鏡あるいはフローサイトメトリーを用
いた細胞診のいずれの場合でも、細胞が正確に診断され
るためには、検体中の細胞が良好な状態に固定されるこ
とが極めて重要で、固定が不良な場合は、癌細胞が見落
とされたり、逆に癌細胞でないものが癌細胞と見誤られ
たりする。Mucus samples taken with a swab from sputum or vagina contain a myriad of cells, which should be examined for precancerous atypical cells and cancer cells. Is a cytology, and this cytology plays an important role in early detection of modern cancer. A microscope has been used for this cytodiagnosis, but in recent years, in addition to this, flow cytometry (flow cytometry) is an automatic cell analysis and separation device that measures by flowing cells at a speed of several hundreds per second or more.
Automated cytology using cytometry is also about to be applied. In either case of cytodiagnosis using a microscope or flow cytometry, it is extremely important that the cells in the sample be fixed in good condition in order to accurately diagnose the cells, and if the fixation is poor. In some cases, cancer cells are overlooked, and conversely, non-cancer cells are mistaken for cancer cells.

細胞診の一般的な固定法は、検体をスライドグラスに直
接塗抹してそれが乾かぬうちに迅速に固定液に入れて固
定する方法（塗抹標本の湿潤固定法）がとられ、その固
定液としては95％エタノールが用いられる。しかし、入
院していない患者や集団検診の被検者について肺癌の喀
痰細胞診を行う場合は、病院を受信した際に直ちに痰が
喀出できるとは限らない。むしろ痰は起床時に出やす
く、またこの起床時の痰は、就寝中に肺内から遊離した
細胞を豊かに蓄えているので細胞診に最も適している。
この起床時の痰を病院に持参した後に固定を行うのでは
時間が経ち過ぎ、細胞に変性が加わっていて固定が不良
であり、細胞診が不正確となる。このような場合、適切
な喀痰用の細胞固定液があって細胞を直ちに固定できれ
ば、起床時の喀痰を自宅でその固定液に入れて保存し、
後日病院へ持参出来るので好都合である。しかし、喀痰
を95％エタノール固定液に入れると、喀痰の粘液が表層
から凝固し、凝固した表層は、固定液が内部へ浸透する
のを妨害して内部の細胞の固定を不良とするばかりでな
く、喀痰をスライドグラスに薄く延ばして塗抹すること
をも妨げて更に標本の質を悪くする。また、フローサイ
トメトリーによる自動化細胞診の場合には、細胞の固定
状態が不均一なために測定誤差が大きくなったり、凝固
した粘液塊が装置のノズルを詰らせて分析不能となるな
どの重大な支障を生ずる。The general fixing method for cytodiagnosis is a method of directly smearing a sample on a slide glass and quickly fixing it in a fixative before it dries (wet fixing method of smear). Is used as 95% ethanol. However, when performing sputum cytology for lung cancer on patients who are not hospitalized or subjects who undergo mass screening, it is not always possible to expect sputum to be produced immediately upon receiving the hospital. Rather, sputum is more likely to appear when waking up, and this sputum when waking up is most suitable for cytology because it abundantly stores cells released from the lungs during sleep.
If the sputum when waking up is brought to the hospital and then fixed, it will take too much time and the cells will be degenerated and the fixation will be poor, resulting in inaccurate cytodiagnosis. In such a case, if there is a suitable cell fixative for sputum and the cells can be fixed immediately, put the sputum at wake up in the fixative at home and store it,
It is convenient because you can bring it to the hospital at a later date. However, when sputum is put into a 95% ethanol fixative solution, the mucus of sputum coagulates from the surface layer, and the coagulated surface layer prevents the fixative solution from penetrating into the interior and causes immobilization of cells inside. It also prevents the sputum from being spread thinly on a slide glass and smearing it, further worsening the quality of the specimen. Moreover, in the case of automated cytodiagnosis by flow cytometry, the measurement error becomes large due to the non-uniform fixation of cells, and the coagulated mucus clogs the nozzle of the device, making it impossible to analyze. Cause serious trouble.

肺癌検診のために、喀痰用の固定液を最初に導入したの
は米国のサコマノ（Saccomanno、1963）であり、我が国
においても、このサコマノ液がしばしば用いられてい
る。このサコマノ液は、50％エタノール水にカーボワッ
クス（ポリエチレングリコール1540）が２％の割りに添
加された簡単な組成のものである。この液の中に喀痰を
吐き出して一定時間固定したあと、検査室においてブレ
ンダーにかけて強く撹拌して粘液を機械的に破壊して細
胞を遊離させ、遊離した細胞を遠心沈澱して収集し、こ
れをスライドグラスに塗抹して塗抹標本を作り、染色を
施して顕微鏡診断を行うことになる。この液は、エタノ
ール濃度が50％と少し高い上にカーボワックスを含むた
め、固定中に細胞の収縮や核の濃縮が起り、そのため細
胞の詳細な内部構造が読み取り難く、慣れないと細胞診
断に支障を来す欠点がある。また、フローサイトメトリ
ーによる自動化細胞診においては、この液が粘液溶解剤
を含まないために、溶けずに残っている粘液が装置のノ
ズルを詰らせて測定が不能となったり、また細胞集塊が
生じ易いために、細胞一個一個の測定が不能となるなど
の重大な支障をきたす。従って、このサコマノ液は、フ
ローサイトメトリーによる自動化細胞診にとっては特に
不適切な固定液である。Saccomanno (1963) of the United States first introduced a fixative for sputum for lung cancer screening, and this sacomano fluid is often used in Japan. This sacomano liquid has a simple composition in which carbowax (polyethylene glycol 1540) is added to 2% of 50% ethanol water. After sputum is discharged into this liquid and fixed for a certain period of time, it is stirred in a laboratory with a blender to stir vigorously to mechanically disrupt the mucus and release the cells, which are then collected by centrifugation and collection. A smear will be made by smearing on a slide glass, and staining will be performed for microscopic diagnosis. Since this solution has a slightly high ethanol concentration of 50% and contains carbowax, it causes contraction of cells and concentration of nuclei during fixation, which makes it difficult to read the detailed internal structure of cells and makes it difficult to diagnose cells unless used. There is a drawback that causes trouble. In addition, in automated cytodiagnosis by flow cytometry, since this solution does not contain a mucolytic agent, the remaining unmelted mucus clogs the nozzle of the device, making measurement impossible, and collecting cells. Since clumps are likely to occur, it causes serious problems such as the inability to measure individual cells. Therefore, this sacomano fluid is a particularly inappropriate fixative for automated cytodiagnosis by flow cytometry.

近年、我が国において、粘液溶解性の核痰用固定液が開
発されて市販されるようになったが、これらはいずれも
サコマノ液と同様に２％のカーボンワックスを含む50％
エタノール水を基本とし、粘液溶解剤を添加したもので
ある。粘液溶解剤として、東北大学抗酸菌研究所式（サ
ーマル社発売）はＮアセチル−Ｌシスティン（Ｎ−acet
yl−Ｌ−cysteine）を用い、大阪府成人病センター式
（松浪ガラス社発売）はジチオトレイトール（dithiotr
eitol）を用い、またYM式核痰固定液（武藤純薬社製、
特許出願中とのこと）はジハイドロキシ ジチオールブ
タン（dihydroxy dithiolbuthan）や酵素を加えたもの
とされている。Recently, mucus-soluble fixatives for sputum have been developed and put on the market in Japan, but all of them contain 50% of carbon wax containing 2% like Sacomano liquid.
It is based on ethanol water with the addition of a mucolytic agent. As a mucolytic agent, Tohoku University Mycobacterial Research Institute formula (released by Thermal Co.) is N-acetyl-L cystine (N-acet).
yl-L-cysteine) was used for the Osaka Adult Disease Center ceremony (released by Matsunami Glass Co., Ltd.).
eitol), and YM-type nuclear sputum fixative (Muto Pure Chemicals Co., Ltd.,
(Patent pending) is said to have added dihydroxy dithiolbuthan and enzyme.

〔本発明が解決しようとする問題点〕[Problems to be Solved by the Present Invention]

近年、肺癌患者の急造に関連して喀痰細胞診への需要も
急増し、老人医療法の改正によって昭和62年度から成人
の肺癌検診が義務付けられることになると、喀痰細胞診
への需要増加にさらに拍車がかかる情勢である。しか
し、肺癌検診のための喀痰細胞診は、子宮癌検診の細胞
診に比べて、正常細胞の数が著しく多くて異常細胞の含
有率は少ない特徴のために、顕微鏡による診断は著しく
労力がかかる作業である上、この技術に習熟した細胞診
士や指導医の数も少ない。そこで労力節減のため、近年
は、フローサイトメトリーを用いた自動化細胞診の開発
が強力に推進されている。これは、バラバラにした細胞
を螢光染色して溶液中に浮遊させておき、この細胞を装
置の中を高速で流しながらレーザー光線を当てて螢光を
発生させ、細胞一個ずつからの螢光量を測定して細胞を
定量するものであるから、喀痰などの粘液性の検体の場
合はその粘液を溶解し、細胞を分散した浮遊状態として
固定（浮遊固定）し得る固定液が不可欠である。また、
集団検診において多数被検者の喀痰をそれぞれ固定液に
入れて回収する場合は、通常は数日間は固定液に入れた
まま保存されることが多いので、この間に細胞の変性が
進行する危険もある。そのような場合に、細胞の固定性
と共に細胞構造の保存性も良好な固定・保存液が望まれ
る。そのような液があれば、肺癌の集団検診にも便利に
利用出来るし、また子宮癌についての集団検診において
も、検診医は、綿棒を一々その場でスライドグラスに塗
抹をせずとも、綿棒を固定液に投入しておけばよいので
手間を省け、かつ塗抹時に起り易い塗抹標本の乾燥とい
う重大な障害からも逃れることが出来て好都合である。In recent years, the demand for sputum cytology has increased sharply in connection with the rapid development of lung cancer patients, and if the revision of the Geriatric Medical Law requires adult lung cancer screening from 1987, the demand for sputum cytology will further increase. It is an accelerating situation. However, sputum cytology for lung cancer screening is significantly more laborious than microdiagnosis for uterine cancer screening because of the features of significantly higher number of normal cells and lower content of abnormal cells. In addition to the work, there are few cytologists and instructors who are familiar with this technique. Therefore, in order to save labor, the development of automated cytodiagnosis using flow cytometry has been strongly promoted in recent years. This is because the disaggregated cells are fluorescently stained and suspended in a solution, and while these cells are flowing through the device at high speed, a laser beam is applied to generate fluorescence, and the amount of fluorescence from each cell is measured. Since the cells are quantified by measurement, in the case of a mucous specimen such as sputum, a fixative that can dissolve the mucus and fix the cells in a suspended state (floating fixation) is indispensable. Also,
When collecting sputum of a large number of subjects in fixatives in mass screening, it is usually stored in fixative for several days, so there is also a risk that cell degeneration will progress during this period. is there. In such a case, a fixative / preservative solution that has good cell fixability and cell structure preservability is desired. With such a liquid, it can be conveniently used for mass screening for lung cancer, and also in mass screening for uterine cancer, the medical doctor does not have to smear each swab on the slide glass on the spot. Since it is sufficient to add the liquid to the fixative, it is convenient to save time and to avoid the serious obstacle of drying the smear, which is likely to occur during smearing.

細胞の固定・保存性の良否は細胞の診断精度に重大な影
響を及ぼし、これが不良の検体では診断が不能となった
り、誤診が生じたりするので、細胞診を担当する関係者
には非常に関心が高い。このような細胞の固定・保存液
に関して要求される事項を纏めると以下の通りである。The quality of cell fixation / preservation has a significant effect on the diagnostic accuracy of cells, which may result in a diagnosis failure or misdiagnosis for defective specimens. High interest. The items required for such a cell fixing / preserving solution are summarized below.

1.粘液溶解性： 検体中の粘液は、一般に固定液に触れると凝固し、凝固
した粘液は、固定液の粘液塊内浸透を阻害して細胞の固
定を不均等として細胞分析上の誤差を生み、また粘液塊
がフローサイトメトリーのノズルを詰らせて分析を不能
とする。従って、粘液性の強い検体の場合、固定中に粘
液が溶解される固定液が望まれる。1. Mucus solubility: Mucus in a sample generally coagulates when it comes into contact with the fixative, and the coagulated mucus inhibits the permeation of the fixative into the mucus mass and causes improper cell fixation, resulting in errors in cell analysis. Birth and mucus block the flow cytometry nozzles, rendering analysis impossible. Therefore, in the case of a specimen with strong mucus properties, a fixative solution in which mucus is dissolved during fixation is desired.

2.DNAと蛋白質の固定： 顕微鏡による診断に際しては、核の大きさやその内部構
造、および核／細胞質比が診断の対象となり、またフロ
ーサイトメトリーによる自動化細胞診に際しては、核の
DNA量および細胞のDNA量／蛋白量比が定量の対象となる
ので、核（DNA）と細胞質（蛋白質）との両者が共に良
く固定され、かつ保存されなければならない。2. Immobilization of DNA and protein: The size of the nucleus, its internal structure, and the nucleus / cytoplasm ratio are the targets for diagnosis under a microscope, and the number of the nucleus is determined during automated cytodiagnosis by flow cytometry.
Since the DNA amount and the DNA amount / protein amount ratio of cells are the objects of quantification, both the nucleus (DNA) and the cytoplasm (protein) must be well fixed and preserved.

3.固定による細胞の収縮や凝集の防止： 細胞の固定は確実でなければならないが、固定を強化す
ると、細胞が収縮あるいは濃縮して顕微鏡的診断が困難
になったり、また細胞同士が凝集して細胞集塊を作り、
これがフローサイトメトリーのノズルを詰らせて測定が
不能になったりするので、固定の強度はほどほどでなけ
ればならない。3. Prevention of contraction and aggregation of cells due to fixation: Although fixation of cells must be reliable, if fixation is strengthened, cells contract or concentrate, making microscopic diagnosis difficult, or agglomeration of cells. To make a cell mass,
This can clog the flow cytometry nozzles and render the measurements impossible, so the strength of the fixation should be moderate.

4.固定液の毒性： 肺癌の集団検診の際は、喀痰の固定液を容器に入れて被
検者に配布することになるが、家庭に配布された固定液
を誤って子供などが飲むという万一の事故も考慮する
と、その固定液の毒性は低くなければならない。4. Toxicity of fixative: During mass screening for lung cancer, sputum fixative is placed in a container and distributed to the subjects, but the fixative distributed at home is mistakenly taken by children. Considering an accident, the fixative must have low toxicity.

5.固定した細胞の保存性： 集団検診の際は、大量が検体の一時に集められ、これら
が順次検査されるので、その間の数日から２週間ぐらい
は固定液の中で細胞構造が保存されねばならない。5. Preservation of fixed cells: In mass screening, a large amount of cells are collected at one time, and these are examined sequentially, so the cell structure is preserved in the fixative for several days to two weeks. Must be done.

近年わが国で市販されている各種の喀痰固定液を検討し
たが、0.2％アセチルシステインを50％エタノール水に
添加した東北大学抗酸菌研究所式の固定液は、追試の結
果、粘液溶解性は良好であるが、本出願者がフローサイ
トメトリーによる自動化細胞診用に開発したDNA蛋白同
時定量用螢光染色液の成分であるヘマトポルフィリンと
アセチルシスティンとが反応を起して褐色の絮状沈澱物
を生じ、該染色液による染色が傷害されることが欠点で
あった。次にジハイドロキシ ジチオールブタンを用い
たYM喀痰固定液（武藤純薬株式会社製、特許出願中）を
検討したが、これは粘液溶解性の点ではＮアセチルＬシ
スティン使用の固定液と同等と思われたが、独特の悪臭
があり、痰を吐きだそうとして口を容器に近づけると、
卵が腐ったような悪臭が鼻をつく。ある地域の集団検診
で、これを配られた被検者のうちには、この固定液の悪
臭から固定液が腐っていると思い、固定液を捨てたもの
がいたとする報告も伝えられた。またジハイドロキシ
ジチオールブタンの毒性が不明な点、酵素を用いている
ので約３カ月の有効期間しかなく高価であるなどの点に
も問題がある。ジチオトレイトールを用いた大阪成人病
センター式の喀痰固定液については今回は実験していな
いが、ジチオトレイトールはＮアセチルＬシスティン同
様去痰剤として用いられる薬物であり、使用量も少ない
ので毒性面では問題がないものと思われるが、高価であ
る点、価格面での問題がある。We examined various sputum fixatives that are commercially available in Japan in recent years, but the fixative of the Tohoku University Mycobacteria Research Institute type that added 0.2% acetyl cysteine to 50% ethanol water showed mucus solubility as a result of additional tests. Although good, hematoporphyrin, which is a component of a fluorescent staining solution for simultaneous quantification of DNA proteins developed by the applicant for automated cytodiagnosis by flow cytometry, reacts with acetylcystine to cause a brown wavy precipitate. However, it is a drawback that the product is produced and the dyeing by the dyeing solution is damaged. Next, we examined a YM sputum fixative using dihydroxydithiol butane (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., patent pending), which is considered to be equivalent to a fixative using N-acetyl L-cystine in terms of mucolytic solubility. However, there is a peculiar foul odor, and when I put my mouth close to the container to spit out sputum,
The stench of rotten eggs makes me sick. According to a group medical examination in a certain area, some of the subjects who were given this thought that the fixative was rotten due to the malodor of the fixative, and some had discarded the fixative. . Dihydroxy
There is also a problem in that the toxicity of dithiolbutane is unknown, and because it uses an enzyme, it has an effective period of about 3 months and is expensive. We have not conducted an experiment on the sputum fixative of the Osaka Adult Disease Center type using dithiothreitol, but dithiothreitol is a drug used as an expectorant like N-acetyl-L-cystine, so its toxicity is low. There seems to be no problem, but there are problems in that it is expensive and in terms of price.

本発明は、上述のような欠点がなく、喀痰等の細胞診検
体の固定において、細胞の核と細胞質を良好な形態に固
定し、更にその形態をかなりの期間維持しうる固定・保
存液を提供することを目的とし、さらに、フローサイト
メトリーと細胞螢光染色法とを用いた自動化細胞診にも
適した固定・保存液を提供することを目的とする。The present invention does not have the above-mentioned drawbacks, and in the fixation of cytological specimens such as sputum, it fixes the nucleus and cytoplasm of cells in a good form, and further provides a fixative / preservative solution capable of maintaining the form for a considerable period of time. Further, it is an object of the present invention to provide a fixing / preserving solution suitable for automated cytodiagnosis using flow cytometry and cell fluorescent staining.

〔問題点を解決するための手段〕[Means for solving problems]

上記目的は、エチルアルコールと食塩と庶糖又はプロピ
レングリコールのいずれか一方とを含有する緩衝液を細
胞の固定及び保存に用いることにより達成される。さら
に、粘液性の細胞診検体の固定・保存には、上記緩衝液
に粘液溶解剤として本発明者が見出した新規な粘液溶解
剤メチルシスティンを加えた固定・保存液を用いれば粘
液が良く溶け、細胞の核及び細胞質が良好に固定され、
しかもフローサイトメトリーと細胞螢光染色法を用いた
自動化細胞診にも適する。The above object is achieved by using a buffer solution containing ethyl alcohol, sodium chloride, and either sucrose or propylene glycol for fixing and storing cells. Further, for the fixation / preservation of a mucous cytodiagnosis specimen, the use of a fixative / preservative solution obtained by adding methylcystine, a novel mucolytic agent found by the present inventors as a mucolytic agent, to the above-mentioned buffer solution will dissolve the mucus well. , The nucleus and cytoplasm of cells are well fixed,
Moreover, it is also suitable for automated cytodiagnosis using flow cytometry and cytofluorescence staining.

以下に固定・保存液に要求される性質と関連して各成分
の説明を行う。Each component is explained below in relation to the properties required for the fixing / preserving solution.

１）粘液溶解性の問題 本発明者は、フローサイトメトリーと細胞の螢光染色に
よる細胞診の自動化を開発している途上に、当該染色板
と反応しない粘液溶解剤を種々検討した結果、メチルシ
スティンを見出した。メチルシスティンは塩酸塩は、化
学的にはmethylβ−mercaptoalanine hydrochloride,HS
CH₂C（NH₂）COO−CH₃・HClであり、かっては去痰剤とし
て用いられたことがある。多数の患者の喀痰を用いて検
討の結果、固定液にメチルシスティンを0.1〜0.2％添加
したものでは、粘液がよく溶け、細胞固定効果も良好
で、固定液に時に悪臭もなく、また長期の保存にも変質
や効力減退を示さなかった。1) Problem of mucolytic property The present inventor, while developing automated cytodiagnosis by flow cytometry and fluorescent staining of cells, investigated various mucolytic agents that do not react with the stained plate, I found Sistine. Methylcystine is a chemical compound that is chemically methylβ-mercaptoalanine hydrochloride, HS
CH ₂ C (NH ₂₎ a COO-CH ₃ · HCl, is selfish sometimes used as an expectorant agent. As a result of a study using sputum of a large number of patients, a solution containing 0.1 to 0.2% of methyl cystine in the fixative solution dissolves the mucus well, has a good cell fixing effect, and the fixative solution does not sometimes have a bad odor and has a long-term effect. The preservation did not show deterioration or diminished efficacy.

なお、粘液性の少ない検体の細胞固定には、粘液溶解剤
を用いる必要はなく、以下に述べる各成分を含む緩衝液
を用いれば十分である。It should be noted that it is not necessary to use a mucolytic agent for cell fixation of a specimen having a low mucus property, and it is sufficient to use a buffer solution containing each component described below.

また、フローサイトメトリーによる分析の際には、粘液
溶解と細胞分散の目的で、検体を入れた固定液を高速ブ
レンダーで激しく振盪するが、その際に無数の細かな気
泡が生じ、これが粘液塊を覆ったり粘液塊の中にとじこ
められたりして粘液と粘液溶解剤との接触を妨害するの
で、シリコンレジン製剤であるアンチフォームを消泡剤
として加え、良い結果を得た。シリコンレジンは消泡剤
として、ビール、ブドー酒、しょうゆ、乳製品、果物ジ
ュースなどの各種の食品の濃縮、発酵、および蒸溜工程
などに用いられ、作業の能率化や製品の均一化などに役
立っており、食品中の本品の残留量は50ppm以上と定め
られている。実験の結果、シリコンレジンの消泡作用は
10ppmで充分に発現し、30ppm以上ではシリコンレジンの
不溶解分が残るので無駄であった。When analyzing by flow cytometry, the fixed solution containing the sample is vigorously shaken with a high-speed blender for the purpose of mucus lysis and cell dispersion. The antifoam, which is a silicone resin formulation, was added as an antifoaming agent, as it covered the syrup and was entangled in the mucus lump to prevent contact between the mucus and the mucolytic agent, and good results were obtained. Silicone resin is used as an antifoaming agent in the concentration, fermentation, and distillation processes of various foods such as beer, budo, soy sauce, dairy products, and fruit juices, and is useful for streamlining work and making products uniform. Therefore, the residual amount of this product in food is specified to be 50 ppm or more. As a result of the experiment, the defoaming effect of silicone resin is
At 10 ppm, it was fully expressed, and at 30 ppm or more, the insoluble portion of the silicon resin remained, so it was wasted.

２）核（DNA）と細胞質（蛋白質）の固定の問題 後述のように、固定液の主剤として適したエタノール
は、粘液を凝固させたり細胞を凝集させたりする点から
濃度が低い方がよい。しかし、固定液のエタノールの濃
度を低くした場合は、エタノールの固定効果が減弱する
のでそれを補強しなければならない。固定剤としてはグ
ルタールアルデヒドやホルマリンなど種々あるものの、
集団検診用の固定液に課せられる安全性を考慮にいれる
と、そのような毒性の強いものは使用できない。2) Fixation of Nucleus (DNA) and Cytoplasm (Protein) As described below, ethanol, which is suitable as the main component of the fixative, should have a low concentration in terms of coagulating mucus and aggregating cells. However, if the concentration of ethanol in the fixative is lowered, the fixing effect of ethanol is diminished and it must be reinforced. Although there are various fixatives such as glutaraldehyde and formalin,
Considering the safety imposed on fixatives for mass screening, such highly toxic ones cannot be used.

先ず核の固定であるが、核の主成分はDNAであり、低濃
度エタノールによる固定ではDNAが完全に凝固せず一部
が可溶性となって消失する。一方、DNAは生理的濃度の
食塩の存在下でその溶解度を最も減ずるので、この性質
を利用して、固定液に食塩を生理的濃度に加えることに
よってDNA溶解度を最低とし、エタノールによるDNAの固
定を補強した。食塩の濃度は0.8〜0.9％が好ましい。First of all, the nucleus is fixed, but the main component of the nucleus is DNA, and fixing with low-concentration ethanol does not completely solidify the DNA, but a part thereof becomes soluble and disappears. On the other hand, since DNA has the lowest solubility in the presence of physiological salt concentration, this property is utilized to minimize the DNA solubility by adding salt to the fixative at physiological concentration, and fix the DNA with ethanol. Reinforced. The salt concentration is preferably 0.8 to 0.9%.

次に細胞質の固定であるが、細胞質の蛋白質を凝固固定
する物質はエタノールの他に数多くあるが、これらの固
定剤は粘液をも凝固するので不向きである。また、細胞
質が完全に凝固固定された細胞は、恰もゆで卵のように
丸く硬化し、スライドグラスの上に貼りつきにくく、染
色の操作中にスライドグラスから脱落し易い。もし、癌
細胞が脱落すると、それは癌の偽陰性誤診（false nega
tive diagnosis）という重大な失敗をおかすことにな
る。また、細胞が、めだま焼き卵のようにスライドグラ
ス上に薄く延ばされた時には、その核や細胞質の内部構
造が顕微鏡で明瞭に観察できて診断が容易であるが、蛋
白が強く凝固されてゆで卵のように丸く硬化した場合は
観察しがたく診断も難しくなる。従って、細胞固定は、
細胞がその本来の軟らかさが或る程度残って固定され、
細胞がスライドグラスに塗抹された際に薄く伸ばし得る
ことが必要であり、30−40％の低濃度エタノールはその
ような軟らかな固定に適している。しかし、このような
低濃度エタノール中では、水分が細胞内に流入して細胞
は膨化する。この水分流入を防止する最も簡単な方法は
細胞から脱水をすることであり、そのための単純な物質
としては庶糖、グリセリン、あるいはプロピレングリコ
ールなどがある。そのうち庶糖は、安価で毒性はなく、
また寒冷や高温からの細胞庇護作用や、顕微鏡標本を作
る際に乾燥防止の作用もあるところから推奨される物質
である。庶糖を固定液に添加する場合の適正濃度は、実
験の結果は２％であった。また庶糖をプロピレングリコ
ールで置き換えても効果は同等であった。プロピレング
リコールの濃度は1.5〜２％が好ましい。Next, regarding cytoplasmic fixation, there are many substances other than ethanol that coagulate and fix cytoplasmic proteins, but these fixatives are not suitable because they also coagulate mucus. In addition, cells in which the cytoplasm is completely coagulated and fixed are hardened like hard-boiled eggs, hard to stick to the slide glass, and easily fall off from the slide glass during the staining operation. If the cancer cells are shed, it is a false negative diagnosis of cancer.
will make a serious mistake called tive diagnosis). In addition, when cells are thinly spread on a slide glass like a medama-yaki egg, the internal structure of the nucleus and cytoplasm can be clearly observed with a microscope for easy diagnosis, but the protein is strongly coagulated. When hardened like a boiled egg, it is hard to observe and difficult to diagnose. Therefore, cell fixation is
The cells are fixed with some of their original softness remaining,
It is necessary that the cells can be thinly spread when smeared on a glass slide, and 30-40% low-concentration ethanol is suitable for such soft fixation. However, in such low-concentration ethanol, water flows into the cells and the cells swell. The simplest way to prevent this influx of water is to dehydrate cells, and simple substances therefor include sucrose, glycerin, or propylene glycol. Of these, saccharose is cheap and non-toxic,
In addition, it is a recommended substance because it also has an action of protecting cells from cold and high temperatures and an action of preventing dryness when making a microscope sample. The appropriate concentration when sucrose was added to the fixative was 2% as a result of the experiment. Even if sucrose was replaced with propylene glycol, the effect was the same. The concentration of propylene glycol is preferably 1.5 to 2%.

３）細胞の収縮と凝集の防止の問題 細胞固定のための主剤としてのエタノールは、毒性が低
い点からも優れた固定剤であるが、サコマノ液ならびに
我が国で用いられている前記の３種類の粘液溶解性の固
定液はいずれもエタノール濃度が50％であり、この濃度
では粘液の凝固や細胞の凝集が起きやすい。従って、喀
痰の適切な固定のためには、エタノールの濃度をさらに
低くすると共に、固定効果をエタノール以外の物質でも
補強するのが望ましい。適正なエタノール濃度に関して
は、本発明者らは、エールリッヒ腹水癌細胞を各種の濃
度のエタノール水に入れて放置した後に、顕微鏡で細胞
形態を観察する実験により、エタノール濃度は30−40％
が良いと結論した。3) Problem of preventing cell contraction and aggregation Ethanol, which is the main agent for cell fixation, is an excellent fixative because of its low toxicity. However, it is one of the above-mentioned three types used in Sacomano solution and Japan. The mucus-soluble fixatives all have an ethanol concentration of 50%, and at this concentration, mucus coagulation and cell aggregation tend to occur. Therefore, in order to properly fix sputum, it is desirable to further lower the concentration of ethanol and reinforce the fixing effect with substances other than ethanol. Regarding the proper ethanol concentration, the present inventors found that the Ehrlich ascites tumor cells were placed in various concentrations of ethanol water and allowed to stand, and then the cell morphology was observed by a microscope, whereby the ethanol concentration was 30-40%.
Concluded that it is good.

４）固定液の毒性の問題 粘液溶解剤のメチルシスティンは、去痰剤としても用い
られる薬物であり、本固定液に用いられる量はごく僅か
なので毒性面からは問題にならない。また、エタノール
の濃度はホワイトリッカーやウイスキーと同等の30−40
％であり、その毒性は少なくとも50％エタノールによる
ものよりは軽い。そのほかの成分は燐酸緩衝液、食塩、
庶糖および、食品添加物としての許容濃度内のプロピレ
ングリコールとシリコンレジンであり、いずれも毒性の
心配はない。4) Toxicity problem of fixative solution Methylcystine, a mucolytic agent, is a drug that is also used as an expectorant, and since the amount used in this fixative solution is very small, it does not pose a problem in terms of toxicity. Also, the concentration of ethanol is 30-40, which is equivalent to that of white lickers and whiskey.
%, And its toxicity is at least less than with 50% ethanol. Other components are phosphate buffer, salt,
Sucrose, propylene glycol and silicone resin within the permissible concentrations as food additives, and there is no concern about toxicity.

５）細胞の保存性 固定した細胞の保存のためには緩衝液とすることが必要
であり、燐酸緩衝液が一般的であるが、これに限定され
ない。5) Preservation of cells It is necessary to use a buffer solution for preservation of fixed cells, and a phosphate buffer solution is generally used, but it is not limited thereto.

６）本固定液の調合法 上記の検討の結果、必要な諸成分を含む本固定液の調合
法の一例としては、0.8〜0.9％の食塩を含む0.01モル燐
酸緩衝液（0.01モル燐酸緩衝生理的食塩水、phosphate
buffered saline solution）（以下、PBSと略称）に、
メチルシスティンを0.2％、庶糖もしくはプロピレング
リコールを２％、水溶性アンチフォームを10ppm、エタ
ノールを40％、それぞれ最終濃度になるように加えれば
よい。6) Preparation method of the present fixative As a result of the above examination, as an example of the preparation method of the present fixative containing necessary components, 0.01 mol phosphate buffer solution containing 0.8 to 0.9% of salt (0.01 mol phosphate buffer physiological Saline, phosphate
buffered saline solution) (hereinafter abbreviated as PBS),
Methylcystine may be added at 0.2%, sucrose or propylene glycol at 2%, water-soluble antiform at 10 ppm, and ethanol at 40% so that the final concentrations are respectively added.

７）本固定液の使用法 本発明の固定液の具体的な使用法としては肺癌検診にお
いては、喀痰を吐き出すための専用の容器に本固定液を
入れて喀痰用固定液として製品化しておき、これを予め
被検者に１−３本ずつ配布しておいて起床時の痰を喀出
させ、それを容器ごと後日巡回して回収するか、または
郵送などの方法で回収し、また、子宮癌検診において
は、綿棒がそのまま投入できる専用の容器に本固定液を
入れたものを子宮癌検診用固定液として製品化してお
き、これに検診医が被検者の子宮膣部を擦過した綿棒を
投入させ、回収する。回収した固定液を検査室に運び、
そこで遠心沈澱して細胞を収集し、それの塗抹標本につ
き顕微鏡診断を行うか、あるいは細胞浮遊液を作ってフ
ローサイトメトリーによる自動化細胞診を行うことにな
る。7) Method of using this fixative As a specific method of using the fixative of the present invention, in the lung cancer screening, the fixative is put into a dedicated container for exhaling sputum and commercialized as a fixative for sputum. , 1 to 3 pieces of this were distributed to the subject in advance, and sputum when waking up was sputed out, and it was patrolled with a container at a later date and collected, or collected by a method such as mail, and the uterus In cancer screening, a fixed container for swabs containing the fixed solution is commercialized as a fixative for uterine cancer screening, and a swab swiped on the uterine vagina of the subject by the screening doctor. , And collect. Bring the recovered fixative to the laboratory,
Therefore, cells are collected by centrifugation and microscopic diagnosis is performed on the smear, or automated cytodiagnosis by flow cytometry is performed by preparing a cell suspension.

例えば、喀痰の固定の場合は、喀痰を本固定液中に吐き
出したあと、手でよく振盪しておく。２日〜１週間の固
定の後、高速ブレンダーで約２分間振盪し、遠心沈澱
し、顕微鏡標本作成の場合は、残渣をピペットでスライ
ドグラスに移し、一昼夜乾燥した後、95％エタノールま
たはスプレー式による再固定を行う。フローサイトメト
リーによる自動化細胞診の場合は、残渣を１回燐酸緩衝
液で洗浄したのち、螢光染色を施して分析に供する。For example, in the case of fixing sputum, the sputum is spit into the fixative solution and shaken by hand. After fixing for 2 days to 1 week, shake with a high-speed blender for about 2 minutes, and then perform centrifugal precipitation. When preparing a microscope sample, transfer the residue to a slide glass with a pipette and dry overnight, then use 95% ethanol or spray type. Re-fix with. In the case of automated cytodiagnosis by flow cytometry, the residue is washed once with a phosphate buffer solution, and then subjected to fluorescent staining for analysis.

〔実施例〕〔Example〕

実験例 １）固定液中のエタノール濃度の低濃度の限界を定める
実験 エタノールの50、40、30、20％水溶液、および対照液と
してサコマノ液（エタノール濃度は50％）を準備し、各
溶液に一定数のエールリッヒ腹水癌細胞を入れて室温に
一昼夜放置し、自動遠沈塗抹装置（オートスメア）によ
り塗抹標本を作製し、パパニコロー染色を施して顕微鏡
観察を行った。Experimental example 1) Experiment to determine the lower limit of the ethanol concentration in the fixed solution Prepare 50, 40, 30, 20% aqueous solution of ethanol, and sacomano solution (ethanol concentration is 50%) as a control solution. A certain number of Ehrlich's ascites tumor cells were placed and allowed to stand at room temperature for one day, and smeared specimens were prepared by an automatic centrifuge smearing device (auto smear), stained with Papanicolaou, and observed under a microscope.

〔結果〕 エタノール濃度が50％のものとサコマノ液に
固定したエールリッヒ腹水癌細胞は、エタノール濃度が
50％と濃いため、細胞凝集や細胞収縮の傾向が見られ
（第１図）、20％のものでは細胞の膨化が見られ、40％
および30％のものではそのような現象は見られなかっ
た。[Results] Ehrlich's ascites tumor cells fixed to Sacomano's solution with an ethanol concentration of 50% had an ethanol concentration of
Since the concentration is as high as 50%, there is a tendency for cell aggregation and cell contraction (Fig. 1), and for 20%, swelling of cells is observed, and 40%.
And 30% did not show such a phenomenon.

２）30％エタノール水に添加する食塩の濃度の適正値を
定める実験 食塩はDNAの溶解を抑制するので、その濃度の適正値を
知るため、40％エタノール水に食塩をそれぞれ、０、0.
2、0.4、0.6、0.8％添加したものを準備し、これにエー
ルリッヒ腹水癌細胞を室温で一昼夜固定し、塗抹標本を
作製し、パパニコロー染色を施して顕微鏡で観察すると
ともに、一部の細胞を電子顕微鏡で観察した。2) Experiments to determine the appropriate concentration of salt added to 30% ethanol water Since salt inhibits the dissolution of DNA, 40% ethanol water was added with 0.
2, 0.4, 0.6, 0.8% was added, and Ehrlich's ascites tumor cells were fixed at room temperature for one day, and smears were prepared.Papanicolaou staining was performed and observed under a microscope. It was observed with an electron microscope.

〔結果〕 食塩濃度が０、0.2および0.4％のものでは、
0.8％のものに比べて核の染色性がうすく、0.6％ではそ
の中間であった。また電子顕微鏡（2000倍）では核の内
部構造が0.8％のものではよく保たれていた（第２
図）。[Results] With salt concentrations of 0, 0.2 and 0.4%,
The dyeability of nuclei was lighter than that of 0.8%, and was 0.6% in the middle. Also, under an electron microscope (2000 times), the internal structure of the nucleus was well maintained at 0.8% (second
Figure).

３）0.8％食塩添加の30％エタノール水にさらに添加す
る庶遠の濃度の適正値を定める実験 庶糖は細胞に流入する水分を制限して蛋白の固定を促進
するので、0.8％食塩を添加した30％エタノールに、庶
糖をそれぞれ０、２、４、６、８％添加したものを準備
し、これにエールリッヒ腹水癌細胞を室温で一昼夜固定
し、塗抹標本を作製し、パパニコロー染色を施して顕微
鏡で観察した。3) Experiment to determine an appropriate value for the concentration of saccharose added to 30% ethanol water supplemented with 0.8% salt Since sucrose limits the water flowing into cells and promotes protein fixation, 0.8% salt was added. Prepare 30% ethanol containing 0, 2, 4, 6, 8% of sucrose, and fix Ehrlich's ascites tumor cells at room temperature for 24 hours to prepare a smear, and apply Papanicolaou staining to the microscope. Observed at.

〔結果〕 庶糖濃度が０％のものでは細胞質が膨化して
おり、８％のものでは最も収縮しており（第３図）、６
および４％でも多少収縮しており、２％のものが膨化も
収縮も見られず、もっともよい細胞形態を示した（第４
図）。細胞も核もほどよく拡がり、第３図と比較すると
核の内部構造が明瞭に読み取れる。[Results] When the sucrose concentration was 0%, the cytoplasm was swollen, and when the sucrose concentration was 8%, it was the most contracted (Fig. 3).
And 4% also showed some contraction, and 2% showed neither swelling nor contraction, indicating the best cell morphology (4th
Figure). Both cells and nuclei spread well, and the internal structure of the nucleus can be clearly read in comparison with FIG.

４）0.8％食塩ならびに２％庶糖を添加した30％エタノ
ールの溶媒としてのPBSのモル濃度を定める実験 燐酸緩衝生理的食塩水（PBS）液は、蒸溜水より細胞保
存の作用が優れているのでこれを固定液の溶媒として用
いることとし、固定液にいれた検体を冷蔵庫保存する際
の燐酸塩の結晶析出のない濃度を検討した。4) Experiment to determine the molar concentration of PBS as a solvent for 30% ethanol supplemented with 0.8% sodium chloride and 2% sucrose Phosphate buffered physiological saline (PBS) solution has a better cell preservation effect than distilled water. By using this as a solvent for the fixative, the concentration of the phosphate-precipitated crystals not precipitating when the sample in the fixative was stored in a refrigerator was examined.

〔結果〕 実験に用いられることが多い0.06モル濃度の
PBS溶媒とした場合は、これに喀痰を入れた場合も入れ
ない場合も、冷蔵庫中で冷やすと直ちに板状結晶が析出
し、この結晶は液を常温に戻しても溶解しなかった。し
かし、0.01モル濃度のPBSを溶媒として用いた固定液で
は、数カ月間冷蔵庫中で保存しても結晶の析出は見られ
なかった。[Results] Often used in experiments,
In the case of using the PBS solvent, whether or not sputum was added thereto, immediately after cooling in a refrigerator, plate-like crystals were precipitated, and the crystals did not dissolve even when the liquid was returned to room temperature. However, with the fixative containing 0.01 molar PBS as a solvent, no crystal precipitation was observed even after storage in the refrigerator for several months.

５）喀痰の年液溶解剤のメチルシスティンの濃度を定め
る実験 喀痰の粘液溶解のために固定液に添加する粘液溶解剤の
メチルシスティンの適正濃度を知るため、30％エタノー
ル・PBSに、メチルシスティンを０、0.5、0.1、0.2、0.
5％それぞれ添加したものを準備し、これに患者の喀痰
を入れ、室温で３日間放置したものを手で約20秒間振盪
し、粘液の溶解性を目で観察した。5) An experiment to determine the concentration of methylcystine, an agent for dissolving sputum annual liquid. To determine the appropriate concentration of methylcystine, a mucolytic agent to be added to the fixative solution to dissolve the mucus in sputum, use 30% ethanol / PBS and methylcystine. To 0, 0.5, 0.1, 0.2, 0.
5% of each was prepared, sputum of the patient was put therein, and the one left at room temperature for 3 days was shaken by hand for about 20 seconds, and the solubility of mucus was visually observed.

〔結果〕 メチルシスティンの濃度が０および0.05％の
ものでは粘液の溶解は不十分で（第５図）、0.1％以上
の濃度で粘液溶解が発現した（第６図）。[Results] When the concentration of methylcystine was 0 or 0.05%, the dissolution of mucus was insufficient (Fig. 5), and the dissolution of mucus was exhibited at a concentration of 0.1% or more (Fig. 6).

第６図の写真はメチルシスティンを添加しない固定液
（30％エタノール・PBS）で固定した喀痰の塗抹染色標
本の顕微鏡写真（100倍）である。The photograph in FIG. 6 is a micrograph (100 ×) of a smear-stained specimen of sputum fixed with a fixing solution (30% ethanol / PBS) containing no methylcystine.

画面の下1/3に横に走る線条は粘液で、これに細胞がか
らめられていて、分散していない。The striae running laterally in the lower third of the screen is mucus, and cells are entangled in it, which is not dispersed.

第７図の写真はメチルシスティンを0.2％添加した固定
液（30％エタノール・PBS）で固定した喀痰の塗抹染色
標本の顕微鏡写真（100倍）である。The photograph in Fig. 7 is a micrograph (100 times) of a smear-stained specimen of sputum fixed with a fixative solution (30% ethanol / PBS) containing 0.2% methyl cystine.

粘液が溶解して、細胞は良く分散している。ひときわ大
型の細胞は肺癌細胞である。The mucus is lysed and the cells are well dispersed. The exceptionally large cells are lung cancer cells.

６）固定液の消泡剤として添加するシリコン製剤の効果
をみる実験 固定液に固定した喀痰は、それの粘液溶解と細胞分散の
目的のため、容器ごとに高速ブレンダーにかけて毎分約
6000回の振動を与えるが、この際に固定液が強く泡立
ち、この気泡が喀痰の周囲を取り巻き、固定液との接触
を妨害する。そこでシリコン製剤の消泡剤を用いること
とし、その商品であるアンチフォームを食品添加剤とし
て認可されている濃度の10ppm添加した固定液（２％庶
糖を添加した30％エタノール・PBS）と、アンチフォー
ムを添加してない固定液と準備し、これらに喀痰を入れ
て高速ブレンダーにより２分間振盪したところ、アンチ
フォームを添加したものが明らかに気泡の発生が少な
く、また消泡も早く、粘液溶解も優れていた。6) Experiment to see the effect of silicone formulation added as an antifoaming agent for the fixative Sputum fixed on the fixative is placed in a high-speed blender for about 5 minutes per minute for the purpose of mucus dissolution and cell dispersion.
Vibration is given 6000 times, at which time the fixative foams strongly and the bubbles surround the sputum and interfere with contact with the fixative. Therefore, we decided to use an antifoaming agent of silicon preparation, and fixed solution (30% ethanol / PBS with 2% sucrose added) containing the antifoam product, which is the product approved, at a concentration of 10 ppm approved as a food additive. Prepared with fixative without added foam, put sputum in them and shook for 2 minutes with high speed blender. Those with added antifoam had less obvious air bubbles, faster defoaming and mucus dissolution. Was also excellent.

７）細胞の乾燥防止のために添加するプロピレングリコ
ールの実際の効果にみる実験 喀痰の固定液による固定後は、これをスライドグラスに
塗抹して、染色に移る前に一晩乾燥するのであるが、そ
の際に細胞が乾燥しすぎると染色性が悪くなるので、そ
れを防止するため、プロピレングリコールの湿潤作用の
効果も調べたところ、プロピレングリコールが添加して
あるものの染色性のほうが、これを添加してないものよ
り優れていた。尚、プロピレングリコールの濃度は1.5
〜２％が適当であり、この濃度は食品添加物としての許
容濃度である３％以内であるので、固定液の毒性面から
も問題とならない。7) Experiments to see the actual effect of propylene glycol added to prevent the cells from drying After fixing sputum with a fixative solution, smear this on a slide glass and dry overnight before staining. , In that case, if the cells are too dry, the stainability deteriorates, so in order to prevent it, the effect of the wetting action of propylene glycol was also examined, and the stainability of propylene glycol added was It was superior to the one without addition. The concentration of propylene glycol is 1.5.
〜2% is suitable, and since this concentration is within the allowable concentration of 3% as a food additive, there is no problem in view of toxicity of the fixative.

実施例 固定液（0.2％メチルシスティン、0.8％食塩、２％プロ
ピレングリコールおよび10ppmアンチフォームを添加し
た40％エタノール・PBS）（固定液に喀痰を吐き出す
と、唾液が加わって固定液のエタノール濃度が薄まるの
で、エタノール濃度は40％とした）の喀痰の粘液溶解
性、細胞凝集性および細胞固定効果をみる実験： 完成した固定液の総合的な効果をみるため、126名の患
者の喀痰につき、喀痰を入れた直後にこれを手で振盪し
た時と３日後に高速ブレンダーで振盪した場合の喀痰溶
解性、細胞の分散および固定効果などを検討した。（表
１） 〔結果〕 高速ブレンダーで振動後は、１例の喀痰を除
き、粘液溶解が認められた。粘液溶解が不能であった１
例は、高度に血性であったために血液が粘液をまき込ん
で凝固したものであった。Example Fixative solution (40% ethanol / PBS supplemented with 0.2% methyl cystine, 0.8% sodium chloride, 2% propylene glycol and 10 ppm antifoam) (When sputum was exhaled into the fixative solution, saliva was added to increase the ethanol concentration in the fixative solution. Experiments to examine the mucolytic, cell-aggregating and cell-fixing effects of sputum (the ethanol concentration was 40% since it diminished): To see the overall effect of the completed fixative solution, the sputum of 126 patients The sputum solubilities, cell dispersal and fixation effects, etc., were investigated when the sputum was shaken by hand immediately after it was put in and when shaken with a high speed blender 3 days later. (Table 1) [Results] After vibrating with a high-speed blender, mucus dissolution was observed except for one case of sputum. Mucus dissolution was impossible 1
The example was that the blood was so bloody that it clogged with mucus.

また、顕微鏡所見上、細胞の分散は良好で、細胞質およ
び核の構造は１カ月以上保存したものでも優れていた。 Also, microscopically, the cells were well dispersed, and the cytoplasm and nucleus structures were excellent even when stored for 1 month or longer.

第７図〜第10図の写真は完成した本固定液で固定し、40
日間冷蔵庫で保存された喀痰中の肺癌細胞の顕微鏡写真
（400倍）である。細胞質も核もその構造が極めてよく
保たれている。第７図と第８図は肺の扁平上皮癌細胞の
写真で、第９図と第10図は肺の腺癌細胞の写真である。The photographs in Figs. 7 to 10 are fixed with the completed permanent fixative,
It is a microscope photograph (400 times) of lung cancer cells in sputum stored in the refrigerator for one day. The structure of the cytoplasm and the nucleus is very well maintained. FIGS. 7 and 8 are photographs of lung squamous cell carcinoma cells, and FIGS. 9 and 10 are photographs of lung adenocarcinoma cells.

〔発明の効果〕〔The invention's effect〕

以上説明したように、本発明の固定・保存液を用いれ
ば、細胞の収縮や凝集がみられず、細胞の核及び細胞質
の構造を良好な形態に固定でき、また固定された細胞の
保存性にもすぐれているので、喀痰等の細胞診検体の固
定に適し、特に肺癌検診の際の喀痰の固定・保存液とし
て利用価値が高い。さらに、粘液溶解剤としてメチルシ
スティンを加えれば粘液を溶解して細胞を分散させ、細
胞固定効果も良好であり、しかもこれは螢光染色液と反
応しないため、フローサイトメトリーと細胞螢光染色法
とを用いた自動化細胞診にも適する固定・保存液を提供
しうる。As described above, when the fixative / preservative solution of the present invention is used, cell contraction and aggregation are not observed, the structure of the cell nucleus and cytoplasm can be fixed in a good form, and the preservability of the fixed cell is maintained. Since it is excellent, it is suitable for immobilizing cytological specimens such as sputum, and is particularly useful as a solution for fixing and preserving sputum during lung cancer screening. Furthermore, if methylcystine is added as a mucolytic agent, the mucus will be dissolved and the cells will be dispersed, and the cell fixing effect will also be good, and since it does not react with the fluorescent staining solution, flow cytometry and cell fluorescent staining methods It is possible to provide a fixing / preserving solution suitable for automated cytodiagnosis using and.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

第１図はサコマノ液で固定したエールリッヒ腹水癌細胞
の顕微鏡写真。 第２図は0.8％食塩添加の30％エタノール水で固定した
エールリッヒ腹水癌細胞の核の電子顕微鏡写真（2,000
倍）。 第３図は0.8％食塩添加の30％エタノール水に更に８％
の庶糖を添加した液で固定したエールリッヒ腹水癌細胞
の顕微鏡写真。 第４図は0.8％食塩添加の30％エタノール水に更に２％
の庶糖を添加した液で固定したエールリッヒ腹水癌細胞
の顕微鏡写真。 第５図はメチルシスティンを添加しない固定液（30％エ
タノール・PBS）で固定した喀痰の塗抹染色標本の顕微
鏡写真（100倍）。 第６図はメチルシスティンを0.2％添加した固定液（30
％エタノール・PBS）で固定した喀痰の塗抹染色標本の
顕微鏡写真（100倍）。 第７図〜第10図は、本発明固定液で固定し、40日間冷蔵
庫で保存された喀痰中の肺癌細胞の顕微鏡写真（400
倍）。第７図と第８図は肺の扁平上皮癌細胞の写真で、
第９図と第10図は肺の腺癌細胞の写真。Figure 1 is a micrograph of Ehrlich's ascites tumor cells fixed with Sacomano's solution. Figure 2 shows electron micrographs of nuclei of Ehrlich ascites tumor cells fixed with 30% ethanol water containing 0.8% sodium chloride (2,000
Times). Figure 3 shows a further 8% in 30% ethanol water with 0.8% salt addition.
Photomicrographs of Ehrlich ascites tumor cells fixed with a solution containing sucrose. Figure 4 shows a further 2% in 30% ethanol water with 0.8% salt addition.
Photomicrographs of Ehrlich ascites tumor cells fixed with a solution containing sucrose. Figure 5 is a photomicrograph (100x) of a smear-stained specimen of sputum fixed with a fixative (30% ethanol / PBS) containing no methylcystine. Figure 6 shows a fixative containing 30% methyl cystine (30%
Micrograph (100x) of smear-stained specimen of sputum fixed with% ethanol / PBS). 7 to 10 are micrographs of lung cancer cells in sputum fixed with the fixative of the present invention and stored in a refrigerator for 40 days (400
Times). Figures 7 and 8 are photographs of lung squamous cell carcinoma cells.
Figures 9 and 10 are photographs of lung adenocarcinoma cells.

Claims (8)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】エチルアルコールと食塩と庶糖又はプロピ
レングリコールのいずれか一方とを含有する緩衝液から
成る細胞固定・保存液。1. A cell fixing / preserving solution comprising a buffer solution containing ethyl alcohol, sodium chloride, and either sucrose or propylene glycol. 【請求項２】緩衝液が燐酸緩衝液であることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の細胞固定・保存液。2. The cell fixing / preserving solution according to claim 1, wherein the buffer solution is a phosphate buffer solution. 【請求項３】エチルアルコールの濃度が30〜40％、食塩
の濃度が0.8〜0.9％、庶糖の濃度が２％、プロピレング
リコールの濃度が1.5〜２％であり、燐酸緩衝液の燐酸
塩濃度が0.01モルであることを特徴とする特許請求の範
囲第２項記載の細胞固定・保存液。3. The concentration of ethyl alcohol is 30-40%, the concentration of common salt is 0.8-0.9%, the concentration of sucrose is 2%, the concentration of propylene glycol is 1.5-2%, and the phosphate concentration of the phosphate buffer solution is 3. Is 0.01 mol, The cell fixing / preserving solution according to claim 2, characterized in that 【請求項４】エチルアルコールと食塩と庶糖又はプロピ
レングリコールのいずれか一方と粘液溶解剤としてのメ
チルシスティンとを含有する緩衝液から成る細胞固定・
保存液。4. A cell fixing / composition comprising a buffer solution containing ethyl alcohol, sodium chloride, either sucrose or propylene glycol, and methylcystine as a mucolytic agent.
Preservative solution. 【請求項５】緩衝液が燐酸緩衝液であることを特徴とす
る特許請求の範囲第４項記載の細胞固定・保存液。5. The cell fixing / preserving solution according to claim 4, wherein the buffer solution is a phosphate buffer solution. 【請求項６】エチルアルコールの濃度が30〜40％、食塩
の濃度が0.8〜0.9％、庶糖の濃度が２％、プロピレング
リコールの濃度が1.5〜２％、メチルシスティンの濃度
が0.1〜0.2％であり、燐酸緩衝液の燐酸塩濃度が0.01モ
ルであることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の
細胞固定・保存液。6. The concentration of ethyl alcohol is 30-40%, the concentration of sodium chloride is 0.8-0.9%, the concentration of sucrose is 2%, the concentration of propylene glycol is 1.5-2%, and the concentration of methylcystine is 0.1-0.2%. The cell fixing / preserving solution according to claim 5, wherein the phosphate concentration of the phosphate buffer is 0.01 mol. 【請求項７】さらにシリコン性消泡剤を含有することを
特徴とする特許請求の範囲第４項記載の細胞固定・保存
液。7. The cell fixing / preserving solution according to claim 4, further comprising a silicone antifoaming agent. 【請求項８】シリコン性消泡剤の含有量が30〜50ppmで
あることを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の細胞
固定・保存液。8. The cell fixing / preserving solution according to claim 7, wherein the content of the silicone antifoaming agent is 30 to 50 ppm.