JPH073366B2 - 分光蛍光光度計 - Google Patents

分光蛍光光度計

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JPH073366B2
JPH073366B2 JP63039417A JP3941788A JPH073366B2 JP H073366 B2 JPH073366 B2 JP H073366B2 JP 63039417 A JP63039417 A JP 63039417A JP 3941788 A JP3941788 A JP 3941788A JP H073366 B2 JPH073366 B2 JP H073366B2
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wavelength
fluorescence
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peak
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裕之 越
実 大和田
久子 嶺岸
貴通 小野
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01JMEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28Investigating the spectrum
    • G01J3/44Raman spectrometry; Scattering spectrometry ; Fluorescence spectrometry
    • G01J3/4406Fluorescence spectrometry

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  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Spectrometry And Color Measurement (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、データ処理機能を有する分光蛍光光度計に係
り、特に励起,蛍光波長を試料の最適波長に固定して定
量測定を行なうのに好適な分光蛍光光度計に関する。
〔従来の技術〕
分光蛍光光度計において、最も基本的な測定条件は励起
波長,蛍光波長である。この設定動作について、従来の
装置は、特公昭62-31288号公報に記載のように励起波長
または蛍光波長の片方を固定し、他方について波長走査
を行ない、得られる試料のスペクトルの最大ピーク波長
に設定するようになつていた。
〔発明が解決しようとする課題〕
上記従来技術では、試料のスペクトルの最大ピーク波長
が、その試料に対する最適波長であるとの考え方に基づ
いている。この考え方は、試料濃度が高く、強い蛍光を
発する場合には問題がない。しかし、低濃度または、試
料からの蛍光量が微弱な場合には、溶媒のラマン散乱
光,励起光の高次散乱光などによるピークの方が、蛍光
によるピークより大きくなり、最大ピーク波長が最適波
長であるとは言えなくなる。本来、高感度分析を目的と
して蛍光光度計を使用することが多く、試料の蛍光量は
微弱な場合が多い。このため、操作者が最大ピーク波長
が最適波長でないこともあることを十分認識していない
場合には、最適波長の自動設定機能がかえつて測定条件
設定の誤操作を招くという問題があつた。
本発明の目的は、このような誤操作を防ぎ、効率的に真
の最適波長に設定可能な分光蛍光光度計を提供すること
にある。
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、回折格子を用いた励起側および蛍光側分光器
を備え、励起側分光器からの励起光を試料に照射し該試
料からの蛍光を蛍光側分光器を介して検知器で検知する
分光蛍光光度計において、蛍光側分光器をゼロ次に設定
する手段、この蛍光側分光器がゼロ次に設定された状態
で励起側分光器を波長走査したときの励起スペクトルに
おけるピーク波長を仮の励起波長として記憶する手段、
励起側分光器を上記仮の励起波長に固定し蛍光側分光器
を波長走査したときの第1の蛍光スペクトルにおける複
数のピークの波長を記憶する手段、励起側分光器を上記
仮の励起波長とは異なる励起波長に固定し蛍光側分光器
を波長走査したときの第2の蛍光スペクトルにおける複
数のピークの波長を記憶する手段、およびそれぞれ記憶
されている複数のピーク波長を比較し実質的に波長が一
致するピークの波長を最適蛍光波長として記憶する手段
を備えたことを特徴とする。
最適蛍光波長を見つけるときの励起側分光器における第
1の波長から第2の波長への波長シフト量は、任意に設
定できるが、好ましくは溶媒などバツクグラウンドとな
る物質のラマン散乱波長のシフト量未満とする。
〔作用〕
回折格子を用いた蛍光側分光器をゼロ次に設定し励起側
分光器を波長走査すると、試料から蛍光が発行されると
きに高いエネルギーとして検出されるので、蛍光ピーク
が得られる励起波長を決定することができる。蛍光によ
るピーク波長は励起波長の変化によらず蛍光量が変化す
るだけである。これに対して、溶媒のラマン散乱光,励
起光の高次散乱光などのピーク波長は励起波長を変化さ
せると、それに応じて変化する。従つて、この違いを利
用すれば、蛍光によるピークとその他によるピークを識
別することができる。
〔実施例〕
以下、本発明の一実施例を図面に基づいて説明する。第
1図において、Xeランプ1から出射された光束は、励起
側分光器2により単色光にされ、試料容器3に照射され
る。試料から発生される蛍光は蛍光側分光器4により波
長選択された後、検知器5により、その強度が測定され
る。検知器5から出力される信号は信号増幅器8により
増幅された後、データ処理を行なうためのコンピユータ
9に送られる。また、励起側分光器2は励起側波長駆動
系6を介してコンピユータ9により波長を制御されてお
り、同様に蛍光側分光器4は蛍光側波長駆動系7を介し
てコンピユータ9により波長を制御されている。ここ
で、励起側分光器2の波長を固定し、蛍光側分光器4の
波長を走査して得られるスペクトルが蛍光スペクトル、
逆の場合が励起スペクトルであり、コンピユータ9はこ
れらのスペクトルを記憶し、スペクトル中のピークを検
出する機能を持つ。
第2図に蛍光スペクトルを例にとり、実際に得られるス
ペクトルの詳細を示す。蛍光光度計で得られるスペクト
ルには、蛍光によるピークの他に、励起光の散乱光,ラ
マン散乱光が含まれる。また、回折格子を使つた分光器
を用いる場合には、励起光の2次散乱光,ラマン散乱の
2次光などの高次散乱光が含まれる。このようにピーク
を含むスペクトルの中から、測定対象である蛍光のピー
クを見つけるためには長い間の分析経験と蛍光光度計に
関する知識が必要であり、初心者には困難であつた。そ
こで、これらのピークの中から、目的とする蛍光のピー
クを以下のようにして、自動的に見出す機能を持たせ
た。蛍光によるピークと他のピークとを区別するために
は、第2図に示したように、励起波長を変化させた時
に、蛍光によるピークの波長は変化しないが、他のピー
ク波長は、励起波長の変化量に応じて変化するという性
質を用いている。
第3図に、蛍光によるピークを識別し、励起,蛍光波長
を試料の最適波長に設定する手順を示す。最初に、励起
波長のピークを見つけるために、蛍光波長を0次にセツ
トし、励起スペクトルを測定する。得られたスペクトル
の最大ピーク波長をEX1として記憶する。EX1は仮に決め
た波長であり、最適励起波長とは必ずしも一致しない。
(a)次に、励起波長をEX1に固定し、EX1+10nmから長
波長側の蛍光スペクトルを測定する。EX1+10nmから測
定するのは励起光の散乱光によるピークを除外するため
であり、蛍光光度計のスリツト幅などの条件により任意
に選択される。ここでは、スリツト幅を10nmにした時の
例を取つて以下説明を続ける。得られた蛍光スペクトル
のピークを検索し、大きい順から、W(1),W(2),……と
番号を付け、そのピーク波長を記憶する。(b)次に、
励起波長をEX1+10nmに固定し、再度EX1+10nmから長波
長側の蛍光スペクトルを測定する。得られたスペクトル
の各ピークに、WP(1),WP(2),……と番号を付けてその
波長を記憶する。W(1)から順に、WP(1),WP(2),……と
比較し、その差が11nm以内となるWPがあればW(1)を蛍光
側の最適波長EMWLとして記憶する。ない場合は、W(2)
W(3)……の順でWPと比較し、同様に差が11nm以内となる
WPがあれば、W(2),W(3)……をEMWLとする。ここで、蛍
光によるピークを見つけるのに、(b)と(c)のスペ
クトルで完全にピークが一致したものだけではなく、11
nm以内で一致したピークと幅を持たせているのは、他の
ピークと、蛍光のピークが重なつて、蛍光によるピーク
波長がシフトしていても、できる限り、もれなく蛍光ピ
ークを見つけるためである。この例で、励起波長を10nm
変化させた場合、励起光の2次散乱光の変化量は20nmで
あり、ラマン散乱光の変化量は、通常蛍光光度計の最短
波長である200nmで12nm、2次のラマン光では24nmであ
る。励起波長がより長波長側では、ラマン散乱光のシフ
ト量はさらに大きくなる。以上の理由により、11nm以内
とした。ここまでで、蛍光側の最適波長が見つかつた。
次に、励起側の最適波長を見つけるために、蛍光波長を
EMWLに固定し、EMWL−10nmまでの励起スペクトルを測定
し、得られたスペクトルのピークを検索し大きい順から
W(1),W(2),……と番号を付け、そのピーク波長を記憶
する。(d)次に、蛍光波長をEMWL+20nmに固定し、再
度EMWL−10nmまでの励起スペクトルを測定する。得られ
たスペクトルの各ピークにWP(1),WP(2)……と番号を付
けその波長を記憶する。(e)蛍光側と同様のWとWP
比較し、差が8nmのWPがあれば、そのWを励起側の最適
波長EXWLとする。(f)ここで、蛍光側のシフト量を20
nmとしたのは、蛍光側のシフト量に対して、励起スペク
トル上では1/2の値、即ち10nmのみ散乱光の波長が変化
するためである。このことから、最適波長を検知する基
準も8nm以内としている。以上で、励起,蛍光側の最適
波長を識別し、これらの波長に設定することができる。
ここで、励起側,蛍光側のシフト量,シフト方向,最適
波長を検知する基準は、適用する、蛍光光度計の諸条件
により最適値を検討すれば良い。
以上、サンプルの励起,蛍光波長の両方が未知の場合に
ついて手順を説明したが、いずれか一方の波長が既知の
場合には、未知側の波長検索のみ行なえば良い。この時
の手順は、励起側が既知の場合は、第3図(b)でEX1
=EXWLとし、(b),(c)の内容,蛍光側が既知の場
合には、(d),(e)の内容となる。
また、例えば第4図のように、蛍光波長が2次散乱光の
波長と重なり、前記実施例の内容では蛍光波長を識別で
きない場合には、前記実施例の出発点となる仮の励起波
長EX1を他の波長に設定して、再度、第3図の内容を実
行すれば良い。これは、励起波長を移動させれば、2次
散乱光の波長は移動するが、蛍光波長は移動しないた
め、両者を分離することができるためである。この時の
EX1は、蛍光波長を0次に設定した時の励起スペクトル
(第3図(a))で、2番目以下のピーク波長でも良い
し、単に任意波長分、前記実施例のEX1よりシフトさせ
た値でも良い。
〔発明の効果〕
本発明によれば、蛍光側分光器をゼロ次に設定して励起
側分光器を波長走査することにより、最適蛍光波長を探
索するにあたっての蛍光スペクトル測定用に適用すべき
励起波長を迅速に見つけることができる。また、第1の
蛍光スペクトルと第2の蛍光スペクトルで得られた複数
のピーク波長を比較しある程度の波長差があっても実質
的に一致するピークを求めることにより、蛍光ピークが
ラマン散乱光などの他のピークと重なることに起因して
波長シフトされている場合でも蛍光ピークを見落すこと
がない。これにより、分光蛍光光度計において最も基本
的な測定条件である励起波長,蛍光波長の設定操作を大
幅に簡略化でき、また、測定結果についての信頼性を向
上させる効果がある。
【図面の簡単な説明】
第1図の本発明の一実施例を実現するために必要な装置
構成を表わす図、第2図は本発明の基本原理を示す図、
第3図は本発明の一実施例の手順を示す図、第4図は2
次散乱光と蛍光が重なつた場合のスペクトル図である。 1…Xeランプ、2…励起側分光器、3…試料容器、4…
蛍光側分光器、5…検知器、6…励起波長駆動系、7…
蛍光波長駆動系、8…信号増幅器、9…コンピユータ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小野 貴通 茨城県勝田市市毛882番地 株式会社日立 製作所那珂工場内 (56)参考文献 特開 昭51−79388(JP,A) 実開 昭56−92936(JP,U)

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】回折格子を用いた励起側および蛍光側分光
    器を備え、励起側分光器からの励起光を試料に照射し該
    試料からの蛍光を蛍光側分光器を介して検知器で検知す
    る分光蛍光光度計において、上記蛍光側分光器をゼロ次
    に設定する手段、上記蛍光側分光器がゼロ次に設定され
    た状態で上記励起側分光器を波長走査したときの励起ス
    ペクトルにおけるピーク波長を仮の励起波長として記憶
    する手段、上記励起側分光器を上記仮の励起波長に固定
    し上記蛍光側分光器を波長走査したときの第1の蛍光ス
    ペクトルにおける複数のピークの波長を記憶する手段、
    上記励起側分光器を上記仮の励起波長とは異なる励起波
    長に固定し上記蛍光側分光器を波長走査したときの第2
    の蛍光スペクトルにおける複数のピークの波長を記憶す
    る手段、およびそれぞれ記憶されている複数のピーク波
    長を比較し実質的に波長が一致するピークの波長を最適
    蛍光波長として記憶する手段、を備えたことを特徴とす
    る分光蛍光光度計。
  2. 【請求項2】回折格子を用いた励起側および蛍光側分光
    器を備え、励起側分光器からの励起光を試料に照射し該
    試料からの蛍光を蛍光側分光器を介して検知器で検知す
    る分光蛍光光度計において、上記蛍光側分光器をゼロ次
    に設定する手段、上記蛍光側分光器がゼロ次に設定され
    た状態で上記励起側分光器を波長走査したときの励起ス
    ペクトルにおけるピーク波長を仮の励起波長として記憶
    する手段、上記励起側分光器を上記仮の励起波長に固定
    し上記蛍光側分光器を波長走査したときの第1の蛍光ス
    ペクトルにおける複数のピークの波長を記憶する手段、
    上記励起側分光器を上記仮の励起波長とは異なる励起波
    長に固定し上記蛍光側分光器を波長走査したときの第2
    の蛍光スペクトルにおける複数のピークの波長を記憶す
    る手段、それぞれ記憶されている複数のピーク波長を比
    較し実質的に波長が一致するピークの波長を最適蛍光波
    長として記憶する手段、および上記蛍光側分光器を上記
    最適蛍光波長に固定し上記励起側分光器を波長走査した
    ときの第1の励起スペクトルの複数のピーク波長と、上
    記蛍光側分光器を上記最適蛍光波長とは異なる蛍光波長
    に固定し上記励起側分光器を波長走査したときの第2の
    励起スペクトルの複数のピーク波長とを比較し、実質的
    に波長が一致するピーク波長を最適励起波長として上記
    励起側分光器を設定する手段、を備えたことを特徴とす
    る分光蛍光光度計。
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