JPH07330611A

JPH07330611A - ホスホリパーゼａ２阻害剤及びコレステロール吸収阻害剤

Info

Publication number: JPH07330611A
Application number: JP14222794A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Hatano; 博籏野; Wakae Mori; 稚恵森; Ritsuo Aiyama; 律男相山; Haruji Sawada; 治司澤田; Tsuneichi Watanabe; 常一渡辺; Teruo Yokokura; 輝男横倉
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 1994-06-02
Filing date: 1994-06-02
Publication date: 1995-12-19

Abstract

(57)【要約】【目的】小腸内でのコレステロールエマルジョンのミ
セルへの移行を抑制することにより、腸管からのコレス
テロールの吸収を抑制するため、ホスホリパーゼA₂を有
効に阻害するすることのできる新規なホスホリパーゼA₂
阻害剤、及び、新規なコレステロール吸収阻害剤を得
る。【構成】米ヌカなどより得られるγ−オリザノール、
又は、フェルラ酸のβ−シトステロールエステルを有効
成分とするホスホリパーゼA₂阻害剤である。フェルラ酸
のβ−シトステロールエステルを有効成分とするコレス
テロール吸収阻害剤である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リン脂質を特異的に分
解するホスホリパーゼA₂の活性を阻害するホスホリパー
ゼA₂阻害剤、及びホスホリパーゼA₂阻害によって、コレ
ステロールの吸収を阻害するコレステロール吸収阻害剤
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ホスホリパーゼA₂はホスファチド2-アシ
ルハイドロラーゼの一般名であり、リン脂質に特異的に
作用する酵素である。ホスホリパーゼA₂は1,2-ジアシル
グリセロールリン脂質の C-2位の脂肪酸エステルを加水
分解してリゾグリセロリン脂質および遊離脂肪酸を生成
する。ホスホリパーゼA₂は多くの生物の細胞中に、また
ホ乳類の膵液，蛇毒，蜂毒などの分泌液中に含まれてお
りいくつかのタイプに分類されている。コレステロール
代謝に関係している膵液中のホスホリパーゼA₂は消化酵
素として知られている。

【０００３】ところで、コレステロールは、細胞の常成
分として細胞膜、オルガネラ膜、ミエリン鞘などの構成
成分をなすと共に、胆汁、性腺ホルモン、副腎皮質ホル
モン、ビタミンＤなどの前駆体となる重要な脂質である
が、高コレステロール含有食品の長期の摂取によって、
脂質代謝異常をきたし、動脈硬化，高脂血症，肝臓疾患
等の疾病の原因ともなっている。

【０００４】小腸から吸収されるこのコレステロールに
は外因性（即ち、食餌由来）および内因性（即ち、胆汁
由来、脱落消化管粘膜細胞由来）のものがある。これら
はいずれもエステル型ではなく遊離型のコレステロール
として吸収される。胆汁中に含まれる胆汁酸はグリシン
およびタウリンと結合した抱合胆汁酸となっており、あ
る濃度以上では胆汁酸ミセルを形成する。

【０００５】一方、食餌中性脂肪（トリグリセライド）
は、膵液中のリパーゼにより加水分解を受け、モノグリ
セライドと遊離脂肪酸とになり、前述の胆汁酸ミセルに
溶解されるようになる。このように脂肪の加水分解物を
溶解したミセルを混合ミセルと呼ぶが、混合ミセルはコ
レステロールはじめ各種の脂肪性成分をよく溶解する性
質を持つ。リン脂質もコレステロールの混合ミセルへの
移行に非常に大きな役割を担っている。リン脂質は膵液
中のホスホリパーゼA₂によりリゾリン脂質と遊離脂肪酸
とに加水分解される。

【０００６】このリゾリン脂質は、リン脂質に比べ乳化
作用が非常に強く、エマルジョン状態にあるコレステロ
ールの混合ミセルへの移行を促進する。エマルジョン状
態では小腸上皮細胞を覆っている不攪乱水層(UWL) を通
過できないコレステロールは、混合ミセルになるとこの
層を通過できるようになり、小腸上皮細胞内に吸収され
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ところで、脂質代謝異
常による動脈硬化，高脂血症，肝臓疾患等の疾病に対す
る薬物としては、コレステロールの分離促進・吸収阻
止、生合成阻止を目的としたものが主流となっている。
現在、コレステロール吸収阻害剤として植物ステロー
ル、ニコチン酸製剤が知られている。

【０００８】本発明者らは、副作用が少なく、生体内で
安全で、新規なコレステロール吸収抑制物質の開発を目
的として鋭意努力の結果、コレステロールの吸収抑制に
はホスホリパーゼA₂を阻害することが有効であると考
え、本発明を成すに至った。

【０００９】即ち、本発明は、小腸内でのコレステロー
ルエマルジョンのミセルへの移行を抑制することによ
り、腸管からのコレステロールの吸収を抑制するため、
ホスホリパーゼA₂を有効に阻害するすることのできる副
作用が少なく、生体内で安全で、新規なホスホリパーゼ
A₂阻害剤、及び、このホスホリパーゼA₂阻害によって、
コレステロールの吸収を阻害する副作用が少なく、生体
内で安全で、新規なコレステロール吸収阻害剤を得るこ
とを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本請求項１に記載の発明
に係るホスホリパーゼA₂阻害剤は、γ−オリザノールを
有効成分とするものである。

【００１１】本請求項２に記載の発明に係るホスホリパ
ーゼA₂阻害剤は、フェルラ酸のβ−シトステロールエス
テルを有効成分とするものである。

【００１２】本請求項３に記載の発明に係るコレステロ
ール吸収阻害剤は、フェルラ酸のβ−シトステロールエ
ステルを有効成分とするものである。

【００１３】

【作用】前述のように、小腸におけるコレステロール吸
収のメカニズムとしては、以下の段階を経て吸収される
ことが知られている。即ち、コレステロールは膵液中の
ホスホリパーゼA₂によりリン脂質から生成するリゾ型リ
ン脂質の強い乳化作用により、他の脂質成分とともに大
きさ 300〜1000μｍの混濁したエマルジョンから３〜10
μｍの透明な混合ミセルとなる。混合ミセルに移行した
コレステロールは水溶性を獲得し、小腸上皮の不攪乱水
層(UWL) と呼ばれる 0.5ｍｍ以下の薄い水の層を通過で
きるようになり、小腸上皮細胞内に取込まれる。

【００１４】従って、膵液中のホスホリパーゼA₂を阻害
することができればコレステロールが混合ミセルへ移行
するのが妨げられ、小腸上皮でのコレステロールの吸収
を抑制できると考えられた。そこで、膵液中ホスホリパ
ーゼA₂を阻害することを作用機作とする新しいコレステ
ロール吸収抑制物質の開発を目的とし、各種天然物から
スクリーニングを行った。その結果、米ヌカなどに含ま
れるγ−オリザノールにホスホリパーゼA₂阻害活性を見
いだした。

【００１５】ところで、γ−オリザノールは更年期障
害、自律神経失調症等の治療薬として使用されている
（石原実，伊藤祐正，中北武男，前濱俊之，稗田茂雄，
山本幸次郎，上野昇：更年期障害に対するγ−オリザノ
ールの臨床効果，日本産科婦人科科学会雑誌，34：2,24
3-251,1982）が、γ−オリザノール及びその構成成分で
あるフェルラ酸の各種ステロールエステルがホスホリパ
ーゼA₂阻害作用を有するという知見については一切報告
されていない。

【００１６】即ち、本発明１においては、米ヌカなどよ
り得られるγ−オリザノールを有効成分とするホスホリ
パーゼA₂阻害剤である。このため、ホスホリパーゼA₂を
有効に阻害するすることができる。ホスホリパーゼA₂を
阻害することにより、小腸内で、コレステロールエマル
ジョンのミセルへの移行を抑制することにより腸管から
のコレステロールの吸収を抑制することができ、動脈硬
化，高脂血症，肝臓疾患等の疾病に対して有効である。
また、このγ−オリザノールは、米ヌカなどの食品中に
含有されているため、副作用が少なく、生体内で安全で
ある。

【００１７】ところで、このγ−オリザノールは、フェ
ルラ酸のファイトステロールエステルであり、ファイト
ステロールの違いによって５種が知られている。その５
種とは、次の化１〜化５に示すように、Ａ；カンペスチ
ロール，Ｂ；β−シトステロール，Ｃ；サイクロアルタ
ノール，Ｄ；サイクロアルテノール，Ｅ；24−メチレン
サイクロアルタノールである。

【００１８】

【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【化５】

【００１９】本発明におけるγ−オリザノールは、米ヌ
カ等の高含有食品よりｎ−ヘキサンやエタノール等の有
機溶媒を用いて、抽出したものを用いることができる。
また、各々のフェルラ酸のファイトステロールエステル
を合成して、用いることもできる。

【００２０】本発明では、更に、これらγ−オリザノー
ルの成分のうち、フェルラ酸β−シトステロールエステ
ルを合成し、同じくホスホリパーゼA₂阻害活性を有する
ことを見いだした。

【００２１】即ち、本発明２においては、フェルラ酸の
β−シトステロールエステルを有効成分とするホスホリ
パーゼA₂阻害剤である。このため、ホスホリパーゼA₂を
有効に阻害するすることができる。また、このフェルラ
酸のβ−シトステロールエステルは、米ヌカなどの食品
中に含有されているγ−オリザノールの一成分であるた
め、副作用が少なく、生体内で安全である。

【００２２】また、本発明３においては、フェルラ酸の
β−シトステロールエステルを有効成分とするコレステ
ロール吸収阻害剤である。このため、ホスホリパーゼA₂
を阻害することにより、小腸内で、コレステロールエマ
ルジョンのミセルへの移行を抑制することにより腸管か
らのコレステロールの吸収を抑制することができ、動脈
硬化，高脂血症，肝臓疾患等の疾病に対して有効であ
る。また、このフェルラ酸のβ−シトステロールエステ
ルは、米ヌカなどの食品中に含有されているγ−オリザ
ノールの一成分であるため、副作用が少なく、生体内で
安全である。

【００２３】前述したホスホリパーゼA₂阻害剤及びコレ
ステロール吸収阻害剤は、投与の際には単独あるいは薬
理的に許容される担体などと共に、経口的に使用され
る。経口的な製剤としては例えば錠剤、カプセル剤、顆
粒剤、粉末剤、トローチ剤、シロップ剤などが上げられ
る。

【００２４】錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、トロ
ーチ剤などの固型の組成物においては、デンプン、ラク
トース、カルボキシメチルセルロース、沈降炭酸カルシ
ウムなどの賦形剤、アラビアゴム、トラガントゴム、ゼ
ラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
スなどの結合剤、アルギン酸、コーンスターチなどの崩
壊剤、ステアリン酸マグネシウム、含水二酸化ケイ素、
軽質無水ケイ酸などの滑沢剤、サッカロースなどの甘味
剤、メントールなどのフレーバ剤などを含有することが
できる。

【００２５】シロップ剤など液状の組成においては、ソ
ルビトール、ゼラチン、メチルセルロース、植物油、乳
化剤のほか、甘味剤、フレーバー剤、着色剤などを含有
することができる。これら製剤中には１〜95重量％の有
効成分を含有するのが望ましい。

【００２６】

【実施例】

実施例１．γ−オリザノールの精製米ヌカよりｎ−ヘキサンを用いてγ−オリザノールの粗
画分を抽出した。粗画分に適当量のエタノールを加え、
60分間加熱還流を行った。反応終了後熱時濾過を行って
不溶物を除き、濾液が冷えた後に再び濾過を行い結晶を
濾取した。さらに結晶をエタノールで再結晶してγ−オ
リザノールを精製した。

【００２７】実施例２．フェルラ酸β−シトステロール
エステルの合成フェルラ酸β−シトステロールエステルは佐藤らの方法
（Radioisotopes,30,156-158,1981 ）を参考に合成し
た。即ち、フェルラ酸（1.15g ）を無水酢酸およびピリ
ジンと共に一夜放置し、アセチル化を行った。

【００２８】アセチル化したフェルラ酸1.21g に適当量
の塩化チオニルを加え、80℃、無水にてガスが発生しな
くなるまで攪拌した。ガスの発生がおさまったら、攪拌
しながら減圧下で溶媒を留去し、無水エーテルを加え更
に減圧下で攪拌しつつ留去を繰り返した。

【００２９】完全に溶媒を留去したらピリジンに溶解し
た（酸クロライドの生成）。6.5gのβ−シトステロール
無水ピリジンに溶解し、室温で攪拌しながら少量ずつ酸
クロライドを加えていった。室温で48時間攪拌後、１Ｎ
塩酸を加え水−酢酸エチル型にて分配した。酢酸エチル
層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後濃
縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分画、
アセチル化したフェルラ酸のβ−シトステロールエステ
ルを得た。

【００３０】これを15mlのベンゼンに懸濁し、0.1 Ｎ水
酸化カリウムを溶解したメタノール150mlと共に50℃に
て30分間攪拌した。反応後、直ちに氷水で冷却し酢酸を
加え沈殿を濾取した。沈殿をメタノールで洗浄し、減圧
下にて乾燥後ベンゼン−ヘキサンで再結晶し、1.01g の
フェルラ酸β−シトステロールエステルを得た。

【００３１】実施例３．ホスホリパーゼA₂に対する阻害
作用ホスホリパーゼA₂阻害活性の測定は以下のように行っ
た。緩衝液は 100mMトリス−塩酸（ｐＨ 8.5）（メルク
社）、５mM塩化カルシウム（和光純薬工業社）、0.1%ト
リトンＸ-100（シグマ社）、を使用した。ホスホリパー
ゼA₂としてブタ膵臓由来ホスホリパーゼA₂（べーリンガ
ー社）を用いた。

【００３２】反応系は全量 500μｌで 408nmol/ml ホス
ファチジルコリン，1,2-ジパルミトイル（シグマ社）、
925 Bq ホスファチジルコリン，1,2-ジ[1-¹⁴C] パルミ
トイル（アマシャム社）、 202 nmol/mlリゾホスファチ
ジルコリンパルミトイル（シグマ社）、被験試料および
10μｇホスホリパーゼA₂を加え、40℃で20分間反応を行
った。

【００３３】2N塩酸50μｌを添加して反応を停止し、ク
ロロホルム：メタノール(2:1) ５ml，水 500μｌを添加
し、振盪抽出を２度行った。抽出液を別のチューブに移
し、乾固した後に少量のクロロホルム：メタノール(2:
1) でシリカゲルプレート（アルミニウムシート）（メ
ルク社）にスポットし、クロロホルム：メタノール：28
％アンモニア水（60:35:5 ）で展開した。展開後ベータ
スコープ（ベータジェン社）で¹⁴C でラベルされたホス
ファチジルコリン（ＰＣ）から生成したリゾホスファチ
ジルコリン（ＬＰＣ）量を測定した。

【００３４】被験試料の代わりに10μｌのジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて同様の操作を行い、ブラ
ンクとした。また、ポジティブコントロールとして、ホ
スホリパーゼA₂阻害作用を有するキナクリン（メパクリ
ン）、及び、クロルプロマジンを用いた。

【００３５】尚、ホスホリパーゼA₂阻害率は、ＬＰＣの
生成阻害率により算出した。具体的には、下記の式より
求めた。ホスホリパーゼA₂阻害率（％）＝(1-(被験試料における
LPC生成量／ブランクにおける LPC生成量))×100 結果を、次の表１に示す。

【００３６】

【表１】

【００３７】表１に示す通り、γ−オリザノール及びフ
ェルラ酸β−シトステロールエステルは、キナクリン，
クロルプロマジンより阻害活性が強いことが示された。

【００３８】実施例４．フェルラ酸βシトステロールエ
ステルによるコレステロールエマルジョンの混合ミセル
化抑制作用緩衝液には 200mMトリス塩酸（ｐＨ８．５）（メルク
社）、５mM塩化カルシウム（和光純薬工業社）、0.1 ％
トリトン X-100（シグマ社）、を使用した。ホスホリパ
ーゼA₂としてブタ膵臓由来ホスホリパーゼA₂（ベーリン
ガー社）を用いた。反応系は全量 600μｌでコレステロ
ール（シグマ社）３mg、卵黄由来のホスファチジルコリ
ン（シグマ社）58mg、胆汁酸塩（シグマ社）18mg、異な
った量の被験試料（フェルラ酸β−シトステロールエス
テル 250μｇ、 500μｇ）およびホスホリパーゼA₂15μ
ｇを添加し、40℃で 100ストローク／分で振盪しながら
反応を行った。

【００３９】反応開始より、20分後から 100分後まで20
分毎に 670ｎｍにおける吸光度を測定した。被験試料を
添加しない系をブランク、酵素を添加しなかった系を酵
素未添加として同様の操作を行った。

【００４０】各反応系の吸光度（ 670ｎｍ）の結果を次
の表２に示す。尚、被験試料(500μg)の一部、及び、酵
素未添加のものは、すべての反応時間において、吸光度
が 4.500以上となり、測定不能となった。また、蒸留水
及び緩衝液の 670ｎｍでの吸光度は、各々0.053 及び0.
052 であった。

【００４１】

【表２】

【００４２】また、図１は表２のブランク，被験試料(2
50μg)，被験試料(500μg)の結果をグラフに示したもの
であり、縦軸は 670ｎｍの吸光度、横軸は反応時間
（分）を示す。

【００４３】表２及び図１に示す通り、被験試料の添加
量に応じてコレステロールエマルジョンの混合ミセル化
抑制作用が認識された。また、酵素未添加を除くすべて
の反応系では、反応時間に応じて、混合ミセル化抑制作
用は弱くなり、ミセルの形成は促されることも解った。

【００４４】実施例５．製剤前述のように、γ−オリザノール、フェルラ酸β−シト
ステロールエステルは、ホスホリパーゼA₂を阻害するこ
とによりコレステロールエマルジョンの混合ミセルへの
移行を抑制し、小腸におけるコレステロールの吸収を抑
制することが期待される。

【００４５】これらγ−オリザノール、フェルラ酸β−
シトステロールエステルの投与の際には単独あるいは薬
理的に許容される担体などと共に、経口的に使用され
る。経口的な製剤としては例えば錠剤、カプセル剤、顆
粒剤、粉末剤、トローチ剤、シロップ剤などが上げられ
る。

【００４６】実際にフェルラ酸β−シトステロールエス
テルを用いて、製剤化を行った。次の表３に示す組成の
各化合物を混和機で混和し、打錠して0.5gの錠剤1000個
を製造した。

【００４７】

【表３】

【００４８】以上のように、米ヌカ等に含まれるγ−オ
リザノール、フェルラ酸β−シトステロールエステルを
有効成分として含有し、膵液中のホスホリパーゼA₂を阻
害し、コレステロールの混合ミセル形成を抑制すること
ができ、食品又は医療の分野での利用が大いに期待され
るものである。

【００４９】

【発明の効果】本発明は以上説明したとおり、本発明の
ホスホリパーゼA₂阻害剤及びコレステロール吸収阻害剤
は、ホスホリパーゼA₂を有効に阻害するすることができ
る。ホスホリパーゼA₂を阻害することにより、小腸内
で、コレステロールエマルジョンのミセルへの移行を抑
制することにより腸管からのコレステロールの吸収を抑
制することができ、動脈硬化，高脂血症，肝臓疾患等の
疾病に対して有効である。また、これらの主成分は、米
ヌカなどの食品中に含有されているため、副作用が少な
く、生体内で安全であるという効果がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】フェルラ酸βシトステロールエステルによるコ
レステロールエマルジョンの混合ミセル化抑制作用の反
応時間に対する吸光度変化を示す線図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者澤田治司東京都港区東新橋１丁目１番19号株式会社ヤクルト本社内 (72)発明者渡辺常一東京都港区東新橋１丁目１番19号株式会社ヤクルト本社内 (72)発明者横倉輝男東京都港区東新橋１丁目１番19号株式会社ヤクルト本社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 γ−オリザノールを有効成分とするホス
ホリパーゼA₂阻害剤。
【請求項２】フェルラ酸のβ−シトステロールエステ
ルを有効成分とするホスホリパーゼA₂阻害剤。
【請求項３】フェルラ酸のβ−シトステロールエステ
ルを有効成分とするコレステロール吸収阻害剤。