JPH07318558A - ビールの混濁安定性測定法および該測定法に使用するキット - Google Patents
ビールの混濁安定性測定法および該測定法に使用するキットInfo
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Abstract
るHaze蛋白を、免疫学的手法を応用して特異的に定
量し、迅速かつ正確にビールの混濁安定性を測定する方
法を提供することを目的とする。 【構成】 Haze蛋白を抗原とし、該抗原から得られ
る抗体を用いる免疫学的測定法によって、ビールの最終
製品及びビールの製造工程におけるビール試料中のHa
ze蛋白含有量を測定することからなる、ビールの混濁
安定性を測定する方法、ならびに該方法に使用するキッ
ト。
Description
原因物質のひとつであるHaze蛋白を、Haze蛋白
に特異的な抗体を用いて特異的に測定することにより、
ビールの混濁安定性を測定する方法および該方法に使用
するキットに関する。
て麦汁を得、この麦汁を酵母を用いて主発酵を行い、次
いで若ビールを後発酵(貯酒)工程に付し、濾過、ビン
詰め工程を経て製造されている。
製造されてから消費されるまでの間に濁りを生じないよ
うな、いわゆる「混濁安定性」がビールの品質上きわめ
て重要な項目である。
する生物学的混濁と、ビールの成分自体の変性による混
濁、つまり蛋白質成分とポリフェノールの会合によって
生じるHaze蛋白と総称される蛋白質成分(K. Asano
et al., ASBC Journal 40:147-154, 1982;J.A.Delcou
r et al., MBAA Technical Quarterly, 25:62-66, 198
8)の生成による非生物学的混濁の2つに大別出来る。
一般に、普通に生じうる混濁とは、この非生物学的混濁
である。
には、強制劣化試験を実施したり、実際に20℃で長期
保存して混濁安定度を測定し、評価を行なってきた。例
えば、後述する方法によって、試料の全混濁度を1週間
ごとに測定し、全混濁度の週ごとの測定値をグラフに描
き、全混濁度が100Helmとなる週を読み取り、こ
れをFTテスト値とする。そしてこのFTテスト値から
換算式を用いて混濁安定度を予測していた。しかしなが
ら、これらの方法では結果判定までに数日から数十週間
を必要とし、多大な労力と時間を必要とした。
特異的に測定する方法がないために、Haze蛋白によ
る混濁とその他の生物学的混濁とを区別して測定するこ
とができなかった。そのため、迅速かつ正確に混濁安定
性を予測する方法が色々試みられてきた(European Bre
wery Convention、Analytica-EBC、第4版、1987等参照)
が、いずれもHaze蛋白を簡単かつ特異的に定量する
ことはできず、満足する結果は得られなかった。
品及びビール製造工程におけるビール試料の混濁安定
性、更には製造過程で用いられているビール安定化剤の
評価を迅速かつ正確に測定する方法の開発が望まれてい
た。本発明は、ビールにおける混濁の原因物質のひとつ
であるHaze蛋白を、免疫学的手法を応用して特異的
に定量し、迅速かつ正確にビールの混濁安定性を測定す
る方法を提供することを目的とする。さらに本発明は該
方法に使用するキットを提供することを目的とする。
を抗原とし、該抗原から得られる抗体を用いる免疫学的
測定法によって、ビールの最終製品及びビールの製造工
程におけるビール試料中のHaze蛋白含有量を測定す
ることからなる、ビールの混濁安定性を測定する方法を
提供する。
するHaze蛋白は、常法に従い市販のビールを氷冷保
存してHaze蛋白を生成させ、これを濾過することに
より得られる。得られたHaze蛋白はSDS−ポリア
クリルアミド電気泳動および等電点電気泳動により、分
子量は約40000、等電点は4.0〜5.0の領域に
分布していることが判った。
にあたっては、常法(新生化学実験講座1、タンパク質
I、p389-397、1992参照)に従い、抗原(Haze蛋
白)を動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取す
ることにより得ることができる。なお、本発明において
得られたポリクローナル抗体の力価は10000uni
ts/mgであった。
るビール試料中に含まれるHaze蛋白をこのようにし
て得られた抗体を用いて免疫学的測定法によって測定す
る。
ELISA(Enzyme−linked Immun
osorbent Assay)に代表されるエンザイ
ムイムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、免疫蛍
光法、免疫比濁法などを含むが、特にELISA法が好
ましい。ELISA法としては酵素標識抗体を用いる標
準ELISA法を用いることができるが、特にアビジン
・ビオチンを用いる固相法によるELISA法(蛋白質
核酸 酵素、別冊No.31, p.13-26, 1987 参照)が好
ましい。このとき標識酵素としてはアビジン結合アルカ
リフォスファターゼを用い、第二抗体としてはビオチン
化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンを用いる。
る方法を以下に説明する。まず、試料吸着用緩衝液を用
いて、目的とする抗原(ビール試料)をマイクロプレー
トに分注してインキュベートし、上清を除去した後、洗
浄液を用いて洗浄する。同様に、ブロッキング溶液、抗
体、第二抗体、標識酵素の順に分注、インキュベート、
洗浄を繰り返す。最後に、基質溶液を分注し、室温で保
持した後、405nmにおける吸光度を測定し、別途H
aze蛋白の標準希釈系列から作成した検量線を用いる
ことにより、ビール試料に含まれるHaze蛋白の濃度
を算定することができる。
血清アルブミン(BSA)、ゼラチンあるいはオボアル
ブミンを含むPBS(−)緩衝液等を使用できる。洗浄
液としては、例えば、NaN3およびTween−20
を含むPBS(−)緩衝液、NaClおよびTween
−20を含むトリス緩衝化生理食塩水(TBS)等を使
用できる。また、ブロッキング溶液としては、例えば、
1〜3%BSAを含むPBS(−)緩衝液、1〜5%ス
キムミルクを含むPBS(−)緩衝液等を使用できる。
抗体は、ブロッキング用の溶液で0.01〜1.0μg
/mlに希釈して使用することができる。第二抗体の標
識酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、酸性フォ
スファターゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ等を用いる。また、基質溶液としては、例え
ば、標識酵素がアルカリフォスファターゼの場合にはp
−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩(PNPP)
を、β−ガラクトシダーゼの場合にはo−ニトロフェニ
ルβ−ガラクトシダーゼ等、標識酵素に合わせて適宜選
択し、使用することができる。
の製造工程におけるビール試料中のHaze蛋白含有量
を測定することにより、ビールの混濁安定性を評価する
ことができる。また、ビールの製造工程においては混濁
を防止して品質を保持するために各種安定化剤を加える
が、本発明の測定法はこのような安定化剤の効力判定等
にも利用することができる。
を提供する。本発明のキットには、Haze蛋白を抗原
として得られた抗体を含む。抗体は上記の希釈液中に希
釈された抗体希釈液、あるいは抗体凍結乾燥品の形であ
りうる。本発明のキットには、該抗体の他に、96ウェ
ルプレート、試料吸着用緩衝液、洗浄液、ブロッキング
溶液、基質溶液、第二抗体希釈液ならびに検量線グラフ
などを含む。
する。
トリー(株)社製)を、0℃で3日間氷冷保存してHa
ze蛋白を生成させる。このHaze蛋白を生成したビ
ールをさらに氷冷しながら、脱ガスを行う。脱ガスした
ビールをポアサイズ0.45μmのメンブランフィルタ
ー(Cellulose Nitrate,Advantec Toyo社製)を用いて
濾過して、Haze蛋白粗生成物を得る。このHaze
蛋白粗生成物を氷冷した4%エタノール水溶液で洗浄す
ることにより、Haze蛋白が得られる。
理食塩液(0.9w/w%NaCl水溶液)を用いて適
当な蛋白質濃度(1mg/ml)に調製する。これを完
全フロイントアジュバントと容量3:2の比率で混合し
て油中水型乳剤を作成する。日本白色家兎(SPF(sp
ecial pathogen free)、12週齢、雌)2匹に初回免
疫として抗原0.5mg/rabbit相当量を足蹠及び側腹
部皮下にそれぞれ注射する。追加免疫は、不完全フロイ
ントアジュバントを用いて同様に乳剤を作成して抗原
0.25mg/rabbit相当量を家兎の背部皮下に数カ所
に分けて注射する。追加免疫は、1週間から10日間の
間隔で3回実施する。最終免疫の約10日後に耳動脈又
は頚動脈から無菌的に全採血を行い、遠心分離機にかけ
て血漿を分離する。
0分間加熱処理し、2〜15℃で血漿に0.01M P
BS(−)緩衝液(0.1%NaN3を含む0.01M
リン酸緩衝化生理食塩水、pH7.4)を等容量加えて
希釈する。そこへ、予めアンモニア水で調製した飽和硫
酸アンモニウム水溶液(pH7.4)を希釈液と等容量
加える。これを高速冷却遠心機に掛けた後(4℃、30
分間、14000rpm;1000×G)、上清を除去する。沈渣に
生理食塩液を加えて完全に溶解させてから、透析又はSe
phadex G25M カラムに掛けて残存する硫酸アンモニウム
を除去する。硫酸アンモニウムの除去の確認は、ネスラ
ー試薬(ナカライテスク社製)を用いて行う。
gwerke;trichlorotrifluoroethane)を用いて透析内液
と等量の清透化剤を混合し、振盪後遠心し、内液層を分
取する。この脱脂操作を3回繰り返し、IgG粗画分
(ポリクローナル抗体画分)を得る。
法)によるビール試料中のHaze蛋白の定量 実施例2で得られたポリクローナル抗体をアビジン・ビ
オチンを用いた固相法によるELISA法に応用し(蛋
白質 核酸 酵素、別冊No.31、P13−26、1
987参照)、ビールに含まれるHaze蛋白の定量を
行なう。
ulbecco’s PBS(−)緩衝液)を用いて、
ビール試料を96ウェルマイクロプレートに分注して3
7℃で1時間インキュベートする。別途、Haze蛋白
の検量線を作成する目的で、Haze蛋白の標準希釈系
列を作成して上記と同様に試料吸着用緩衝液を用いて9
6ウェルマイクロプレートに分注してインキュベートす
る。
上清を除去し、洗浄液(NaN3及びTween−20
を含む0.01〜0.1M PBS(−)緩衝液)を用
いて3回洗浄した後、ブロッキング溶液(BSA及びN
aN3を含む0.01〜0.1M PBS(−)緩衝
液、pH7.5〜8.5)を200μl/wellずつ分注し
て、37℃で30分間インキュベートする。
及び0.05〜0.1%NaN3を含む0.01〜0.
1MPBS(−)緩衝液、pH7.5〜8.5)を用い
て実施例2で得られたポリクローナル抗体を希釈する
(抗体希釈液)。
浄後、抗体希釈液を100μl/wellずつ分注し、37℃
で1時間インキュベートする。
してビオチン化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン(1000倍希
釈、Amersham社製)を100μl/wellずつ分注し、37
℃で1時間インキュベートする。
て、アビジン結合アルカリフォスファターゼ(1000倍希
釈、Dakopatts社製)を100μl/wellずつ分注し、3
7℃で30分間インキュベートする。
回洗浄して、基質溶液(p−ニトロフェニルリン酸二ナ
トリウム塩(PNPP)をMgCl2を含むジエタノー
ルアミン溶液(pH9.0〜9.5)で希釈したもの)
を100μl/wellずつ分注し、室温もしくは37℃で1
0〜15分間保持した後、自動吸光度測定機を用いて4
05nmにおける吸光度を測定する。
し、Haze蛋白の検量線を作成する(図1)。この検
量線を用いることにより、各々のビール試料に含まれる
Haze蛋白の濃度を算定することができる。
SA法における結果が、抗原抗体反応に起因するものか
どうか検証する。
およびHaze蛋白溶液の希釈系列(10.5〜0.0
1μg/ml)をそれぞれ作成する。希釈液は、0.1
%BSAを含むPBS(−)緩衝液を用いる。なお、対
照陰性試料として希釈液を用いる。
抗体画分の5000倍希釈液を作成する(0.2μg/
ml)。
希釈液を等量混合する。反応は37℃で1時間行う。
を吸着させた96ウェルマイクロプレートに、上記条件
で反応させた混合液を分注し、実施例3に準拠して、反
応した抗体をELISA法にて検出し、405nmにお
ける吸光度を測定する。結果を図2に示す。
動はコントロールと一致し、ほぼ一定の値となった。一
方Haze抗原を用いたテスト群は、希釈系列の低い方
から高い方に移るに従い明らかに吸光度が上昇し、この
ポリクローナル抗体画分との間に抗原抗体反応があるこ
とがわかった。
剤を用いて処理し、得られたビールについて従来から実
施されている混濁安定性予測法(参考例1参照)と本発
明のELISA法による測定を行ない、比較した。ただ
し、従来の混濁安定性予測法においては全混濁度が10
0Helmを越える週まで測定を行ない、100Hel
mの時の週を読み取り、FTテスト値とし、このFTテ
スト値から換算値を用いて混濁安定度を予測するが、今
回は2週目まで測定し、ELISA法によるHaze蛋
白濃度との比較を行なった。
け、ここに6種類の通常用いられている安定化剤(A、
B、C、D、E、F)を一定量添加し、0℃で15分間
撹拌した。撹拌終了後、濾紙濾過し、炭酸ガスを調整後
瓶詰した。これを分析用試料とし、使用した。
LISA法によるHaze蛋白の量を横軸に、混濁度安
定性試験で得たHelm値を縦軸に示したものが図3で
ある。本発明のELISA法によるHaze蛋白濃度と
FT1週目、2週目の相関係数は、それぞれ0.95
0、0.964となり、非常に高い相関があることが確
認された。
例1に記載の方法によって永久混濁度を測定し、実施例
5で測定した本発明のELISA法と比較した。
結果を図4に示す。永久混濁度とELISA法によるH
aze蛋白濃度間の相関係数は、0.985となり、良
好な相関性が確認された。
(参考例2)、蛋白定量法(参考例3)参照)と実施例
5で測定したELISA法について比較を行なった。分
析用試料は、実施例5と同様にして作成した。
横軸に、窒素定量法(T−N法)および蛋白定量法(M
gSO4−N法)による窒素含量を縦軸に示したものが
図5である。従来の2種類の窒素定量法は、いずれの場
合もELISA法によるHaze蛋白濃度との相関性は
認められず、これらの方法ではHaze蛋白だけを特異
的に測定することはできないことを示している。
を均一にするために軽く撹拌する。気泡が消えるまで再
び0℃の恒温水槽に入れて数分間保持してから、速やか
に濁度計(Process-Photometer,Sigrist社製)を用い
て、560nmにおける混濁度を測定する。
方法 全混濁度を測定した試料を20℃の恒温水槽に入れて1
時間保持する。その後、軽く撹拌して気泡の消えるのを
待って濁度計により560nmにおける混濁度を測定す
る。
安定性の予測方法 全混濁度及び永久混濁度を測定した試料を測定保護箱に
入れて、50℃恒温器に5日間入れておく。その後、室
温に1時間放置後、0℃恒温水槽に48時間入れてお
き、上記方法に従い1週間後の全混濁度及び永久混濁度
を測定する。2週間後、3週間後と順次全混濁度及び永
久混濁度を測定し、測定は全混濁度が100Helmを
越えるまで継続する。
100Helmの時の週を読み取り、FTテスト値とす
る。このFTテスト値から換算値を用いて混濁安定度を
予測する。換算式はFTテスト値と経過時間により回帰
式を作成して換算式を求める(European Brewery Conve
ntion、Analytica-EBC、第4版、1987参照)。
クロケルダール法) ビール試料の窒素含有量をケルテック全窒素分析機で分
析する。
モニア態になり、硫酸との反応で硫酸アンモニウムの形
になる。そこへNaOH溶液を加えてから加熱するとア
ンモニアが遊離し、これを硼酸でトラップする。これを
濃度既知の硫酸で滴定することによって、窒素量を求め
る(European Brewery Convention、Analytica-EBC、第4
版、1987参照)。
法) ビール試料に硫酸マグネシウム水溶液を加えると、試料
中の高分子蛋白(分子量2600以上)が結合して巨大
分子となって沈殿する。この沈殿物を硫酸マグネシウム
水溶液を用いてよく洗浄してから、セミミクロケルダー
ル法により窒素含量を測定する(Brautechnische Analy
senmethoden Band II、p253-254、1979参照)。
においては、数日から数十週間の期間を必要とし、評価
結果を得るまでに、多大な労力と時間を必要とした。し
かし、本発明の免疫学的測定法を適用することによっ
て、迅速かつ正確に混濁安定性を測定することが可能に
なった。また、本発明の免疫学的測定法は、ビールの安
定化剤の効力判定等にも利用できる。
量曲線を示す。図中、RAH−1およびRAH−2は2
匹のウサギを用いて行ったそれぞれの結果を示す。
びHaze蛋白溶液のそれぞれについてウサギ2匹を用
いて行った、Haze蛋白吸収試験の結果を示す。
るHaze蛋白濃度の関係を示す。
ze蛋白濃度の関係を示す。
法によるHaze蛋白濃度の関係を示す。
Claims (5)
- 【請求項1】 Haze蛋白を抗原とし、該抗原から得
られる抗体を用いる免疫学的測定法によって、ビールの
最終製品及びビールの製造工程におけるビール試料中の
Haze蛋白含有量を測定することからなる、ビールの
混濁安定性を測定する方法。 - 【請求項2】 免疫学的測定法がELISA法である請
求項1記載の方法。 - 【請求項3】 分子量約40000、等電点4.0〜
5.0であるHaze蛋白を抗原とする請求項1記載の
方法。 - 【請求項4】 請求項1記載の方法に使用するキット。
- 【請求項5】 Haze蛋白を抗原とし、該抗原から得
られる抗体、ならびに96ウェルプレート、試料吸着用
緩衝液、洗浄液、ブロッキング溶液、基質溶液、第二抗
体希釈液および検量線グラフから選択される1または2
以上を含む請求項4記載のキット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11280894A JP3357743B2 (ja) | 1994-05-26 | 1994-05-26 | ビールの混濁安定性測定法および該測定法に使用するキット |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07318558A true JPH07318558A (ja) | 1995-12-08 |
JP3357743B2 JP3357743B2 (ja) | 2002-12-16 |
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ID=14596055
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP11280894A Expired - Fee Related JP3357743B2 (ja) | 1994-05-26 | 1994-05-26 | ビールの混濁安定性測定法および該測定法に使用するキット |
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002243627A (ja) * | 2001-02-19 | 2002-08-28 | Asahi Breweries Ltd | 強制劣化装置及び混濁能予測方法 |
JP2006275751A (ja) * | 2005-03-29 | 2006-10-12 | Suntory Ltd | 醸造酒の混濁安定性を予測する方法 |
JP2006311831A (ja) * | 2005-05-09 | 2006-11-16 | Suntory Ltd | ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法 |
CN104165951A (zh) * | 2014-07-28 | 2014-11-26 | 北京燕京啤酒股份有限公司 | 一种啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量的测定方法 |
JP2021106540A (ja) * | 2019-12-27 | 2021-07-29 | サントリーホールディングス株式会社 | ビールテイスト飲料 |
-
1994
- 1994-05-26 JP JP11280894A patent/JP3357743B2/ja not_active Expired - Fee Related
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