JP3357743B2 - ビールの混濁安定性測定法および該測定法に使用するキット - Google Patents
ビールの混濁安定性測定法および該測定法に使用するキットInfo
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Description
原因物質のひとつであるHaze蛋白を、Haze蛋白
に特異的な抗体を用いて特異的に測定することにより、
ビールの混濁安定性を測定する方法および該方法に使用
するキットに関する。
て麦汁を得、この麦汁を酵母を用いて主発酵を行い、次
いで若ビールを後発酵(貯酒)工程に付し、濾過、ビン
詰め工程を経て製造されている。
製造されてから消費されるまでの間に濁りを生じないよ
うな、いわゆる「混濁安定性」がビールの品質上きわめ
て重要な項目である。
する生物学的混濁と、ビールの成分自体の変性による混
濁、つまり蛋白質成分とポリフェノールの会合によって
生じるHaze蛋白と総称される蛋白質成分(K. Asano
et al., ASBC Journal 40:147-154, 1982;J.A.Delcou
r et al., MBAA Technical Quarterly, 25:62-66, 198
8)の生成による非生物学的混濁の2つに大別出来る。
一般に、普通に生じうる混濁とは、この非生物学的混濁
である。
には、強制劣化試験を実施したり、実際に20℃で長期
保存して混濁安定度を測定し、評価を行なってきた。例
えば、後述する方法によって、試料の全混濁度を1週間
ごとに測定し、全混濁度の週ごとの測定値をグラフに描
き、全混濁度が100Helmとなる週を読み取り、こ
れをFTテスト値とする。そしてこのFTテスト値から
換算式を用いて混濁安定度を予測していた。しかしなが
ら、これらの方法では結果判定までに数日から数十週間
を必要とし、多大な労力と時間を必要とした。
特異的に測定する方法がないために、Haze蛋白によ
る混濁とその他の生物学的混濁とを区別して測定するこ
とができなかった。そのため、迅速かつ正確に混濁安定
性を予測する方法が色々試みられてきた(European Bre
wery Convention、Analytica-EBC、第4版、1987等参照)
が、いずれもHaze蛋白を簡単かつ特異的に定量する
ことはできず、満足する結果は得られなかった。
品及びビール製造工程におけるビール試料の混濁安定
性、更には製造過程で用いられているビール安定化剤の
評価を迅速かつ正確に測定する方法の開発が望まれてい
た。本発明は、ビールにおける混濁の原因物質のひとつ
であるHaze蛋白を、免疫学的手法を応用して特異的
に定量し、迅速かつ正確にビールの混濁安定性を測定す
る方法を提供することを目的とする。さらに本発明は該
方法に使用するキットを提供することを目的とする。
を抗原とし、該抗原から得られる抗体を用いる免疫学的
測定法によって、ビールの最終製品及びビールの製造工
程におけるビール試料中のHaze蛋白含有量を測定す
ることからなる、ビールの混濁安定性を測定する方法を
提供する。
するHaze蛋白は、常法に従い市販のビールを氷冷保
存してHaze蛋白を生成させ、これを濾過することに
より得られる。得られたHaze蛋白はSDS−ポリア
クリルアミド電気泳動および等電点電気泳動により、分
子量は約40000、等電点は4.0〜5.0の領域に
分布していることが判った。
にあたっては、常法(新生化学実験講座1、タンパク質
I、p389-397、1992参照)に従い、抗原(Haze蛋
白)を動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取す
ることにより得ることができる。なお、本発明において
得られたポリクローナル抗体の力価は10000uni
ts/mgであった。
るビール試料中に含まれるHaze蛋白をこのようにし
て得られた抗体を用いて免疫学的測定法によって測定す
る。
ELISA(Enzyme−linked Immun
osorbent Assay)に代表されるエンザイ
ムイムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、免疫蛍
光法、免疫比濁法などを含むが、特にELISA法が好
ましい。ELISA法としては酵素標識抗体を用いる標
準ELISA法を用いることができるが、特にアビジン
・ビオチンを用いる固相法によるELISA法(蛋白質
核酸 酵素、別冊No.31, p.13-26, 1987 参照)が好
ましい。このとき標識酵素としてはアビジン結合アルカ
リフォスファターゼを用い、第二抗体としてはビオチン
化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンを用いる。
る方法を以下に説明する。まず、試料吸着用緩衝液を用
いて、目的とする抗原(ビール試料)をマイクロプレー
トに分注してインキュベートし、上清を除去した後、洗
浄液を用いて洗浄する。同様に、ブロッキング溶液、抗
体、第二抗体、標識酵素の順に分注、インキュベート、
洗浄を繰り返す。最後に、基質溶液を分注し、室温で保
持した後、405nmにおける吸光度を測定し、別途H
aze蛋白の標準希釈系列から作成した検量線を用いる
ことにより、ビール試料に含まれるHaze蛋白の濃度
を算定することができる。
血清アルブミン(BSA)、ゼラチンあるいはオボアル
ブミンを含むPBS(−)緩衝液等を使用できる。洗浄
液としては、例えば、NaN3およびTween−20
を含むPBS(−)緩衝液、NaClおよびTween
−20を含むトリス緩衝化生理食塩水(TBS)等を使
用できる。また、ブロッキング溶液としては、例えば、
1〜3%BSAを含むPBS(−)緩衝液、1〜5%ス
キムミルクを含むPBS(−)緩衝液等を使用できる。
抗体は、ブロッキング用の溶液で0.01〜1.0μg
/mlに希釈して使用することができる。第二抗体の標
識酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、酸性フォ
スファターゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ等を用いる。また、基質溶液としては、例え
ば、標識酵素がアルカリフォスファターゼの場合にはp
−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩(PNPP)
を、β−ガラクトシダーゼの場合にはo−ニトロフェニ
ルβ−ガラクトシダーゼ等、標識酵素に合わせて適宜選
択し、使用することができる。
の製造工程におけるビール試料中のHaze蛋白含有量
を測定することにより、ビールの混濁安定性を評価する
ことができる。また、ビールの製造工程においては混濁
を防止して品質を保持するために各種安定化剤を加える
が、本発明の測定法はこのような安定化剤の効力判定等
にも利用することができる。
を提供する。本発明のキットには、Haze蛋白を抗原
として得られた抗体を含む。抗体は上記の希釈液中に希
釈された抗体希釈液、あるいは抗体凍結乾燥品の形であ
りうる。本発明のキットには、該抗体の他に、96ウェ
ルプレート、試料吸着用緩衝液、洗浄液、ブロッキング
溶液、基質溶液、第二抗体希釈液ならびに検量線グラフ
などを含む。
する。
トリー(株)社製)を、0℃で3日間氷冷保存してHa
ze蛋白を生成させる。このHaze蛋白を生成したビ
ールをさらに氷冷しながら、脱ガスを行う。脱ガスした
ビールをポアサイズ0.45μmのメンブランフィルタ
ー(Cellulose Nitrate,Advantec Toyo社製)を用いて
濾過して、Haze蛋白粗生成物を得る。このHaze
蛋白粗生成物を氷冷した4%エタノール水溶液で洗浄す
ることにより、Haze蛋白が得られる。
理食塩液(0.9w/w%NaCl水溶液)を用いて適
当な蛋白質濃度(1mg/ml)に調製する。これを完
全フロイントアジュバントと容量3:2の比率で混合し
て油中水型乳剤を作成する。日本白色家兎(SPF(sp
ecial pathogen free)、12週齢、雌)2匹に初回免
疫として抗原0.5mg/rabbit相当量を足蹠及び側腹
部皮下にそれぞれ注射する。追加免疫は、不完全フロイ
ントアジュバントを用いて同様に乳剤を作成して抗原
0.25mg/rabbit相当量を家兎の背部皮下に数カ所
に分けて注射する。追加免疫は、1週間から10日間の
間隔で3回実施する。最終免疫の約10日後に耳動脈又
は頚動脈から無菌的に全採血を行い、遠心分離機にかけ
て血漿を分離する。
0分間加熱処理し、2〜15℃で血漿に0.01M P
BS(−)緩衝液(0.1%NaN3を含む0.01M
リン酸緩衝化生理食塩水、pH7.4)を等容量加えて
希釈する。そこへ、予めアンモニア水で調製した飽和硫
酸アンモニウム水溶液(pH7.4)を希釈液と等容量
加える。これを高速冷却遠心機に掛けた後(4℃、30
分間、14000rpm;1000×G)、上清を除去する。沈渣に
生理食塩液を加えて完全に溶解させてから、透析又はSe
phadex G25M カラムに掛けて残存する硫酸アンモニウム
を除去する。硫酸アンモニウムの除去の確認は、ネスラ
ー試薬(ナカライテスク社製)を用いて行う。
gwerke;trichlorotrifluoroethane)を用いて透析内液
と等量の清透化剤を混合し、振盪後遠心し、内液層を分
取する。この脱脂操作を3回繰り返し、IgG粗画分
(ポリクローナル抗体画分)を得る。
法)によるビール試料中のHaze蛋白の定量 実施例2で得られたポリクローナル抗体をアビジン・ビ
オチンを用いた固相法によるELISA法に応用し(蛋
白質 核酸 酵素、別冊No.31、P13−26、1
987参照)、ビールに含まれるHaze蛋白の定量を
行なう。
ulbecco’s PBS(−)緩衝液)を用いて、
ビール試料を96ウェルマイクロプレートに分注して3
7℃で1時間インキュベートする。別途、Haze蛋白
の検量線を作成する目的で、Haze蛋白の標準希釈系
列を作成して上記と同様に試料吸着用緩衝液を用いて9
6ウェルマイクロプレートに分注してインキュベートす
る。
上清を除去し、洗浄液(NaN3及びTween−20
を含む0.01〜0.1M PBS(−)緩衝液)を用
いて3回洗浄した後、ブロッキング溶液(BSA及びN
aN3を含む0.01〜0.1M PBS(−)緩衝
液、pH7.5〜8.5)を200μl/wellずつ分注し
て、37℃で30分間インキュベートする。
及び0.05〜0.1%NaN3を含む0.01〜0.
1MPBS(−)緩衝液、pH7.5〜8.5)を用い
て実施例2で得られたポリクローナル抗体を希釈する
(抗体希釈液)。
浄後、抗体希釈液を100μl/wellずつ分注し、37℃
で1時間インキュベートする。
してビオチン化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン(1000倍希
釈、Amersham社製)を100μl/wellずつ分注し、37
℃で1時間インキュベートする。
て、アビジン結合アルカリフォスファターゼ(1000倍希
釈、Dakopatts社製)を100μl/wellずつ分注し、3
7℃で30分間インキュベートする。
回洗浄して、基質溶液(p−ニトロフェニルリン酸二ナ
トリウム塩(PNPP)をMgCl2を含むジエタノー
ルアミン溶液(pH9.0〜9.5)で希釈したもの)
を100μl/wellずつ分注し、室温もしくは37℃で1
0〜15分間保持した後、自動吸光度測定機を用いて4
05nmにおける吸光度を測定する。
し、Haze蛋白の検量線を作成する(図1)。この検
量線を用いることにより、各々のビール試料に含まれる
Haze蛋白の濃度を算定することができる。
SA法における結果が、抗原抗体反応に起因するものか
どうか検証する。
およびHaze蛋白溶液の希釈系列(10.5〜0.0
1μg/ml)をそれぞれ作成する。希釈液は、0.1
%BSAを含むPBS(−)緩衝液を用いる。なお、対
照陰性試料として希釈液を用いる。
抗体画分の5000倍希釈液を作成する(0.2μg/
ml)。
希釈液を等量混合する。反応は37℃で1時間行う。
を吸着させた96ウェルマイクロプレートに、上記条件
で反応させた混合液を分注し、実施例3に準拠して、反
応した抗体をELISA法にて検出し、405nmにお
ける吸光度を測定する。結果を図2に示す。
動はコントロールと一致し、ほぼ一定の値となった。一
方Haze抗原を用いたテスト群は、希釈系列の低い方
から高い方に移るに従い明らかに吸光度が上昇し、この
ポリクローナル抗体画分との間に抗原抗体反応があるこ
とがわかった。
剤を用いて処理し、得られたビールについて従来から実
施されている混濁安定性予測法(参考例1参照)と本発
明のELISA法による測定を行ない、比較した。ただ
し、従来の混濁安定性予測法においては全混濁度が10
0Helmを越える週まで測定を行ない、100Hel
mの時の週を読み取り、FTテスト値とし、このFTテ
スト値から換算値を用いて混濁安定度を予測するが、今
回は2週目まで測定し、ELISA法によるHaze蛋
白濃度との比較を行なった。
け、ここに6種類の通常用いられている安定化剤(A、
B、C、D、E、F)を一定量添加し、0℃で15分間
撹拌した。撹拌終了後、濾紙濾過し、炭酸ガスを調整後
瓶詰した。これを分析用試料とし、使用した。
LISA法によるHaze蛋白の量を横軸に、混濁度安
定性試験で得たHelm値を縦軸に示したものが図3で
ある。本発明のELISA法によるHaze蛋白濃度と
FT1週目、2週目の相関係数は、それぞれ0.95
0、0.964となり、非常に高い相関があることが確
認された。
例1に記載の方法によって永久混濁度を測定し、実施例
5で測定した本発明のELISA法と比較した。
結果を図4に示す。永久混濁度とELISA法によるH
aze蛋白濃度間の相関係数は、0.985となり、良
好な相関性が確認された。
(参考例2)、蛋白定量法(参考例3)参照)と実施例
5で測定したELISA法について比較を行なった。分
析用試料は、実施例5と同様にして作成した。
横軸に、窒素定量法(T−N法)および蛋白定量法(M
gSO4−N法)による窒素含量を縦軸に示したものが
図5である。従来の2種類の窒素定量法は、いずれの場
合もELISA法によるHaze蛋白濃度との相関性は
認められず、これらの方法ではHaze蛋白だけを特異
的に測定することはできないことを示している。
を均一にするために軽く撹拌する。気泡が消えるまで再
び0℃の恒温水槽に入れて数分間保持してから、速やか
に濁度計(Process-Photometer,Sigrist社製)を用い
て、560nmにおける混濁度を測定する。
方法 全混濁度を測定した試料を20℃の恒温水槽に入れて1
時間保持する。その後、軽く撹拌して気泡の消えるのを
待って濁度計により560nmにおける混濁度を測定す
る。
安定性の予測方法 全混濁度及び永久混濁度を測定した試料を測定保護箱に
入れて、50℃恒温器に5日間入れておく。その後、室
温に1時間放置後、0℃恒温水槽に48時間入れてお
き、上記方法に従い1週間後の全混濁度及び永久混濁度
を測定する。2週間後、3週間後と順次全混濁度及び永
久混濁度を測定し、測定は全混濁度が100Helmを
越えるまで継続する。
100Helmの時の週を読み取り、FTテスト値とす
る。このFTテスト値から換算値を用いて混濁安定度を
予測する。換算式はFTテスト値と経過時間により回帰
式を作成して換算式を求める(European Brewery Conve
ntion、Analytica-EBC、第4版、1987参照)。
クロケルダール法) ビール試料の窒素含有量をケルテック全窒素分析機で分
析する。
モニア態になり、硫酸との反応で硫酸アンモニウムの形
になる。そこへNaOH溶液を加えてから加熱するとア
ンモニアが遊離し、これを硼酸でトラップする。これを
濃度既知の硫酸で滴定することによって、窒素量を求め
る(European Brewery Convention、Analytica-EBC、第4
版、1987参照)。
法) ビール試料に硫酸マグネシウム水溶液を加えると、試料
中の高分子蛋白(分子量2600以上)が結合して巨大
分子となって沈殿する。この沈殿物を硫酸マグネシウム
水溶液を用いてよく洗浄してから、セミミクロケルダー
ル法により窒素含量を測定する(Brautechnische Analy
senmethoden Band II、p253-254、1979参照)。
においては、数日から数十週間の期間を必要とし、評価
結果を得るまでに、多大な労力と時間を必要とした。し
かし、本発明の免疫学的測定法を適用することによっ
て、迅速かつ正確に混濁安定性を測定することが可能に
なった。また、本発明の免疫学的測定法は、ビールの安
定化剤の効力判定等にも利用できる。
量曲線を示す。図中、RAH−1およびRAH−2は2
匹のウサギを用いて行ったそれぞれの結果を示す。
びHaze蛋白溶液のそれぞれについてウサギ2匹を用
いて行った、Haze蛋白吸収試験の結果を示す。
るHaze蛋白濃度の関係を示す。
ze蛋白濃度の関係を示す。
法によるHaze蛋白濃度の関係を示す。
Claims (4)
- 【請求項1】 Haze蛋白を抗原とし、該抗原から得
られる抗体を用いる免疫学的測定法によって、ビールの
最終製品及びビールの製造工程におけるビール試料中の
Haze蛋白含有量を測定することからなる、ビールの
混濁安定性を測定する方法。 - 【請求項2】 免疫学的測定法がELISA法である請
求項1記載の方法。 - 【請求項3】 分子量約40000、等電点4.0〜
5.0であるHaze蛋白を抗原とする請求項1記載の
方法。 - 【請求項4】 Haze蛋白を抗原とし、該抗原から得
られる抗体、ならびに96ウェルプレート、試料吸着用
緩衝液、洗浄液、ブロッキング溶液、基質溶液、第二抗
体希釈液および検量線グラフから選択される1または2
以上を含む、ビールの混濁安定性を測定するためのキッ
ト。
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
JP11280894A JP3357743B2 (ja) | 1994-05-26 | 1994-05-26 | ビールの混濁安定性測定法および該測定法に使用するキット |
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---|---|---|---|
JP11280894A JP3357743B2 (ja) | 1994-05-26 | 1994-05-26 | ビールの混濁安定性測定法および該測定法に使用するキット |
Publications (2)
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JPH07318558A JPH07318558A (ja) | 1995-12-08 |
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Family
ID=14596055
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP11280894A Expired - Fee Related JP3357743B2 (ja) | 1994-05-26 | 1994-05-26 | ビールの混濁安定性測定法および該測定法に使用するキット |
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JP4575822B2 (ja) * | 2005-03-29 | 2010-11-04 | サントリーホールディングス株式会社 | 醸造酒の混濁安定性を予測する方法 |
JP2006311831A (ja) * | 2005-05-09 | 2006-11-16 | Suntory Ltd | ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法 |
CN104165951B (zh) * | 2014-07-28 | 2016-05-11 | 北京燕京啤酒股份有限公司 | 一种啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量的测定方法 |
JP2021106540A (ja) * | 2019-12-27 | 2021-07-29 | サントリーホールディングス株式会社 | ビールテイスト飲料 |
-
1994
- 1994-05-26 JP JP11280894A patent/JP3357743B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J Am Soc Brow Chem,Vol.51,No.1(1993)p.21−28 |
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Publication number | Publication date |
---|---|
JPH07318558A (ja) | 1995-12-08 |
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