JPH0728754B2 - Biochemical production method of optically active 4-hydroxycyclopentenones - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、（II）式で示される光学活性４−ヒドロキシ
シクロペンテノン類の生化学的製造方法に関する。更に
詳しくは、（Ｒ）体の４−ヒドロキシシクロペンテノン
類の生化学的製造方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a biochemical production method of optically active 4-hydroxycyclopentenones represented by the formula (II). More specifically, it relates to a biochemical method for producing 4-hydroxycyclopentenones of the (R) form.

従来技術および問題点 前記（II）式で示される４−ヒドロキシシクロペンテノ
ン類、特にその（Ｒ）体は農薬、香料あるいは医薬品な
どの中間体として有用であるが、特にプロスタグランデ
ィン誘導体の中間体として極めて重要であり、とりわけ
置換基Ｒがアリル基である４−ヒドロキシ−２−アリル
−２−シクロペンテノンは特開昭58−41836号公報に記
載されているように、抗血小板凝集作用など優れた薬理
作用を有するチアプロスタグランディン類への中間体と
して極めて重要な化合物であり、そのためには（Ｒ）体
含有率が97％以上の高い光学純度で該化合物を得ること
が必要とされる。Prior Art and Problems 4-hydroxycyclopentenones represented by the above formula (II), especially the (R) form thereof, are useful as intermediates for agricultural chemicals, fragrances, pharmaceuticals, etc. 4-hydroxy-2-allyl-2-cyclopentenone, which is extremely important for the body, and in which the substituent R is an allyl group, has an antiplatelet aggregation action as described in JP-A-58-41836. It is a very important compound as an intermediate to the thiaprostaglandins having excellent pharmacological action, and for that purpose, it is necessary to obtain the compound with a high optical purity of (R) isomer content of 97% or more. To be done.

従来、本発明の４−ヒドロキシシクロペンテノン類に類
似する化合物を得るための微生物酵素を用いた不斉加水
分解法が知られている。（特開昭60−12991号） しかし、この微生物酵素を用いた不斉加水分解法は、複
雑な工程や高価な試薬を必要としない点において優れた
方法であるが、微生物酵素の光学選択性が必ずしも厳格
ではないため、（Ｒ）体含有率97％以上の光学純度の光
学活性４−ヒドロキシシクロペンテノン類を工業的に有
利な収率で得ることは難しく、実用的製造方法とはなり
がたかった。即ち、光学選択性が厳格でない微生物酵素
を用いて（Ｒ）体含有率が97％以上の光学活性な４−ヒ
ドロキシシクロペンテノン類を得るためには不斉加水分
解反応時の加水分解率を低く抑える必要があった。その
ため、得られる光学活性な４−ヒドロキシシクロペンテ
ノン類の（Ｒ）体含有率が97％であることと工業的に有
利な収率で製造できるという二つの要求を同時に満たす
ことは不可能であった。Conventionally, an asymmetric hydrolysis method using a microbial enzyme for obtaining a compound similar to the 4-hydroxycyclopentenones of the present invention is known. (Japanese Patent Laid-Open No. 60-12991) However, this asymmetric hydrolysis method using a microbial enzyme is an excellent method in that it does not require complicated steps and expensive reagents. Is not so strict, it is difficult to obtain an optically active 4-hydroxycyclopentenone with an optical purity of (R) isomer content of 97% or more in an industrially advantageous yield, which is not a practical production method. I wanted That is, in order to obtain optically active 4-hydroxycyclopentenones having a (R) body content of 97% or more by using a microbial enzyme having a low optical selectivity, the hydrolysis rate during the asymmetric hydrolysis reaction should be adjusted. I needed to keep it low. Therefore, it is impossible to simultaneously satisfy the two requirements that the content of the (R) form of the obtained optically active 4-hydroxycyclopentenones is 97% and that the product can be produced in an industrially advantageous yield. there were.

問題解決の手段 本発明者らは、（Ｒ）体含有率が97％以上の光学純度が
高い光学活性４−ヒドロキシシクロペンテノン類を工業
的にも有利な収率で製造出来る光学活性４−ヒドロキシ
シクロペンテノン類の生化学的製造法を見い出すべく研
究を重ねた結果、（Ｉ）式で示されるラセミ体のシクロ
ペンテノンエステル類をアルスロバクター属、アルカリ
ゲネス属、クロモバクテリウム属またはシュードモナス
属に属する微生物の中から選ばれた微生物が産生する酵
素を用いて不斉加水分解し、（II）式の（Ｒ）体の４−
ヒドロキシシクロペンテノン類を90％以上含有する光学
活性４−ヒドロキシシクロペンテノン類を生成せしめ、
これを単離取得した後、（Ｖ）式で示される光学活性な
シクロペンテノンエステル類に転換し、この光学活性な
シクロペンテノンエステル類をアルスロバクター属、ア
ルカリゲネス属、クロモバクテリウム属またはシュード
モナス属に属する微生物の中から選ばれた微生物が産生
する酵素を用いて再度不斉加水分解することにより、
（Ｒ）体を97％以上含有する光学純度の高い４−ヒドロ
キシシクロペンテノン類を収率良く製造できる事を見出
し、本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventors have been able to produce optically active 4-hydroxycyclopentenones with an (R) -form content of 97% or more and high optical purity in an industrially advantageous yield. As a result of repeated studies to find out a biochemical production method of hydroxycyclopentenones, racemic cyclopentenone esters represented by the formula (I) were identified as Arthrobacter, Alcaligenes, Chromobacterium or Pseudomonas. Asymmetric hydrolysis using an enzyme produced by a microorganism selected from the microorganisms belonging to the genus,
Produces optically active 4-hydroxycyclopentenones containing 90% or more of hydroxycyclopentenones,
After isolating and obtaining this, it is converted into an optically active cyclopentenone ester represented by the formula (V), and this optically active cyclopentenone ester is converted into Arthrobacter, Alcaligenes, Chromobacterium or By asymmetric hydrolysis again using an enzyme produced by a microorganism selected from the microorganisms belonging to the genus Pseudomonas,
The inventors have found that 4-hydroxycyclopentenones containing 97% or more of (R) isomer and having high optical purity can be produced in high yield, and have completed the present invention.

以下、本発明を詳細に説明する。Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本発明において原料として用いられる前記（Ｉ）式で示
されるラセミ体のシクロペンテノンエステル類を構成す
るラセミ体の４−ヒドロキシシクロペンテノン類として
は、以下の化合物が例示される。The following compounds are exemplified as the racemic 4-hydroxycyclopentenones constituting the racemic cyclopentenone ester represented by the above formula (I) used as a raw material in the present invention.

２−エチル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテノン、 ２−ｎ−プロピル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテ
ノン、 ２−イソプロピル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテ
ノン、 ２−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテノ
ン、 ２−イソブチル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテノ
ン、 ２−ｎ−ペンチル−４−ヒドロキシ−２−シルロペンテ
ノン、 ２−イソペンチル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテ
ノン、 ２−ｎ−ヘキシル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテ
ノン、 ２−ｎ−ヘプチル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテ
ノン、 ２−アリル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテノン、 ２−プロパルギル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテ
ノン、 ２−（２−シス−ブテニル）−４−ヒドロキシ−２−シ
クロペンテノン、 ４−ヒドロキシ−２−（ω−ブチニル）−２−シクロペ
ンテノン、 ２−（２−シス−ペンテニル）−４−ヒドロキシ−２−
シクロペンテノン、 ２−（２−トランス−ペンテニル）−４−ヒドロキシ−
２−シクロペンテノン、 ２−（３−シス−ヘキセニル）−４−ヒドロキシ−２−
シクロペンテノン、 ２−（２−ペンチニル）−４−ヒドロキシ−２−シクロ
ペンテノン。2-ethyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone, 2-n-propyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone, 2-isopropyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone, 2-n-butyl- 4-hydroxy-2-cyclopentenone, 2-isobutyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone, 2-n-pentyl-4-hydroxy-2-sillopentenone, 2-isopentyl-4-hydroxy-2-cyclopen Tenon, 2-n-hexyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone, 2-n-heptyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone, 2-allyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone, 2- Propargyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone, 2- (2-cis-butenyl) -4-hydroxy-2-cyclopen Non, 4-hydroxy-2- (.omega.-butynyl) -2-cyclopentenone, 2- (2-cis - pentenyl) -4-hydroxy-2
Cyclopentenone, 2- (2-trans-pentenyl) -4-hydroxy-
2-cyclopentenone, 2- (3-cis-hexenyl) -4-hydroxy-2-
Cyclopentenone, 2- (2-pentynyl) -4-hydroxy-2-cyclopentenone.

これらの化合物のうち、特に有用性の高いものは、２−
アリル、２−プロパルギル、２−（２−シス−ブテニ
ル）、２−（ω−ブチニル）、２−（２−シス−ペンテ
ニル）、２−（２−トランス−ペンテニル）、２−（３
−シス−ヘキセニル）および２−（２−ペンチニ）−４
−ヒドロキシ−２−シクロペンテノンである。Among these compounds, particularly useful ones are 2-
Allyl, 2-propargyl, 2- (2-cis-butenyl), 2- (ω-butynyl), 2- (2-cis-pentenyl), 2- (2-trans-pentenyl), 2- (3
-Cis-hexenyl) and 2- (2-pentynyl) -4
-Hydroxy-2-cyclopentenone.

また、もう一方の構成成分である脂肪族カルボン酸類と
しては、例えば以下の化合物が例示される。Examples of the aliphatic carboxylic acids, which are the other component, include the following compounds.

酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、
ラウリン酸、パルミチン酸、クロル酢酸、ジクロル酢
酸。Acetic acid, propionic acid, butyric acid, caproic acid, caprylic acid,
Lauric acid, palmitic acid, chloroacetic acid, dichloroacetic acid.

かかるラセミ体の４−ヒドロキシシクロペンテノン類と
脂肪族カルボン酸類とのエステル化反応は、エステル製
造の常法が適用され、ラセミ体の４−ヒドロキシシクロ
ペンテノン類に脂肪族カルボン酸類の無水物あるいは脂
肪族カルボン酸類ハライドを溶媒の存在もしくは非存在
下に触媒を用いて反応させることにより実施される。For the esterification reaction of such racemic 4-hydroxycyclopentenones and aliphatic carboxylic acids, a conventional method for producing an ester is applied, and racemic 4-hydroxycyclopentenones are converted to aliphatic carboxylic acid anhydrides. Alternatively, it is carried out by reacting an aliphatic carboxylic acid halide with a catalyst in the presence or absence of a solvent.

この反応において、溶媒を使用する場合、その溶媒とし
ては例えばテトラヒドロフラン、エチルエーテル、アセ
トン、メチルエチルケトン、トルエン、ベンゼン、クロ
ルベンゼン、ジクロルメタン、ジクロルエタン、クロロ
ホルム、四塩化炭素、ジメチルホルムアミド、ヘキサン
等の脂肪族もしくは芳香族炭化水素、エーテル、ハロゲ
ン化炭化水素等の反応に不活な溶媒の単独または混合物
が挙げられる。その使用量については特に制限なく使用
することができる。When a solvent is used in this reaction, the solvent is, for example, tetrahydrofuran, ethyl ether, acetone, methyl ethyl ketone, toluene, benzene, chlorobenzene, dichloromethane, dichloroethane, chloroform, carbon tetrachloride, dimethylformamide, hexane or the like aliphatic or Solvents such as aromatic hydrocarbons, ethers and halogenated hydrocarbons which are inert to the reaction may be used alone or in a mixture. The amount used can be used without particular limitation.

反応に用いる脂肪族カルボン酸類は原料であるラセミ体
の４−ヒドロキシ−２−シクロペンテノン類に対応して
１当量以上必要であり、上限については特に制限はない
が、好ましくは１〜４当量である。The aliphatic carboxylic acid used in the reaction is required to be 1 equivalent or more corresponding to the racemic 4-hydroxy-2-cyclopentenone which is the raw material, and the upper limit is not particularly limited, but preferably 1 to 4 equivalents Is.

触媒としては、例えばトリエチルアミン、トリ−ｎ−ブ
チルアミン、ピリジン、ピコリン、炭酸ナトリウム、ナ
トリウムメチラート、炭酸水素カリウム等の有機あるい
は無機塩基性物質が挙げられる。その使用量は特に制限
されないが、通常ラセミ体の４−ヒドロキシシクロペン
テノン類に対して１〜５当量である。溶媒として有機ア
ミンを使用する場合は、該アミンが触媒として作用する
こともある。また、トルエンスルホン酸、メタンスルホ
ン酸、硫酸等の酸類を触媒として用いることもできる。Examples of the catalyst include organic or inorganic basic substances such as triethylamine, tri-n-butylamine, pyridine, picoline, sodium carbonate, sodium methylate and potassium hydrogencarbonate. The amount used is not particularly limited, but is usually 1 to 5 equivalents relative to racemic 4-hydroxycyclopentenones. When an organic amine is used as a solvent, the amine may act as a catalyst. Further, acids such as toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid and sulfuric acid can be used as a catalyst.

反応温度は通常−20〜150℃であるが、好ましくは−10
〜120℃の範囲である。反応時間については特に制限は
ない。The reaction temperature is usually -20 to 150 ° C, preferably -10
The range is to 120 ° C. The reaction time is not particularly limited.

このような反応によって、（Ｉ）式で示されるラセミ体
のシクロペンテノンエステル類が容易に、かつ高収率で
得られ、これらは通常の分離手段、例えば抽出、分液、
濃縮、蒸溜等により反応混合物から容易に単離すること
ができる。By such a reaction, racemic cyclopentenone esters represented by the formula (I) can be obtained easily and in a high yield, which can be obtained by a conventional separation means such as extraction, liquid separation,
It can be easily isolated from the reaction mixture by concentration, distillation and the like.

本発明で用いられるエステラーゼを生産する微生物とし
ては、（Ｉ）式で示されるラセミ体のシクロペンテノン
エステル類に作用して、（II）で示される（Ｒ）体のシ
クロペンテノン類を優先的に生成しうる能力を有するエ
ステラーゼを生産するアルスロバクター属、アルカリゲ
ネス属、クロモバクテリウム属またはシュードモナス属
に属する微生物の中から選ばれた微生物であればよく、
特に限定されるものではない（本発明におけるエステラ
ーゼとはリパーゼを含む広義のエスラーゼを意味す
る）。これらの微生物起源のエステラーゼの中には市販
のものがあり、容易に入手することが可能である。市販
のエステラーゼの具体例としては、シュードモナス属
（Pseudomonas fulorescens）のリパーゼ（リパーゼ
“P";天野製薬製、Biochemica et Biophysica Acta誌
488巻353〜358頁）、アルスロバクター・ウレアファシ
エンス・ノブ・バール（Arthrobacter ureafasiens no
v.var.）のリパーゼ（新日本化学製製）、クロモバクテ
リウム・ビスコサム（Chromobacterium viscosum）のリ
パーゼ（リパーゼ“LP";東洋醸造製、Agricaltural and
Biological Chemistry誌37巻999〜1005頁）、アルカリ
ゲネス属のリパーゼ（リパーゼ“PL";名糖産業製Agrica
ltural and Biological Chemistry誌46巻、1159〜1164
頁及び同誌46巻1743〜1750頁）等が挙げられる。As the esterase-producing microorganism used in the present invention, it acts on the racemic cyclopentenone ester represented by the formula (I) and preferentially prefers the (R) cyclopentenone represented by the (II). As long as it is a microorganism selected from the microorganisms belonging to Arthrobacter genus, Alcaligenes genus, Chromobacterium genus or Pseudomonas genus that produces an esterase having the ability to be generated,
There is no particular limitation (the esterase in the present invention means a broad sense esulase including lipase). Some of these esterases of microbial origin are commercially available and can be easily obtained. Specific examples of commercially available esterases include Pseudomonas fulorescens lipase (lipase “P”; Amano Pharmaceutical Co., Biochemica et Biophysica Acta magazine.
488, 353-358), Arthrobacter ureafasiens no.
v.var.) lipase (manufactured by Shin Nihon Kagaku), Chromobacterium viscosum lipase (lipase “LP”; Toyo Brewing, Agricultural and
Biological Chemistry, Vol. 37, 999-1005), lipase of the genera Alcaligenes (lipase "PL"; manufactured by Meito Sangyo)
ltural and Biological Chemistry 46, 1159-1164
Page and the same magazine 46: 1743-1750).

本発明の方法を実施するに際し、該シクロペンテノンエ
ステル類の不斉加水分解は、上記微生物を培養した培養
液、培養液から分離した菌体、エステラーゼを含有する
培養濾液、あるいは各種酵素分離法によって菌体または
培養濾液から分離した粗製エステラーゼ、生成エステラ
ーゼ及びエステラーゼ含有抽出液または濃縮液を含有す
る水溶液と該ラセミ体のシクロペンテノンエステル類を
混合し、撹拌または振盪することにより行なわれる。ま
た、固定化菌体あるいは固定化エステラーゼも使用する
ことができる。In carrying out the method of the present invention, the asymmetric hydrolysis of the cyclopentenone esters is carried out by a culture solution in which the above microorganism is cultured, cells separated from the culture solution, a culture filtrate containing esterase, or various enzyme separation methods. The racemic cyclopentenone esters are mixed with an aqueous solution containing a crude esterase, a produced esterase and an esterase-containing extract or a concentrated solution separated from the cells or the culture filtrate by stirring and shaking. Also, immobilized cells or immobilized esterase can be used.

該ラセミ体のシクロペンテノンエステル類の不斉加水分
解反応を行なう条件としては、反応温度は10〜70℃が適
当であり、通常は20〜50℃である。As the conditions for carrying out the asymmetric hydrolysis reaction of the racemic cyclopentenone esters, the reaction temperature is suitably 10 to 70 ° C, and usually 20 to 50 ° C.

反応中のpHは好アルカリ性菌の培養液やアルカリ性エス
テラーゼではpH8〜11,好アルカリ性でないエステラーゼ
ではpH5〜８が好ましい。また、加水分解反応によって
生成する有機カルボン酸を中和し、反応中のpHを一定に
保つために緩衝液の使用が好ましく、燐酸ナトリウム、
燐酸カリウム等の無機酸塩の緩衝液、酢酸ナトリウム、
クエン酸ナトリウム等の有機酸塩の緩衝液を使用するこ
とができる。The pH during the reaction is preferably pH 8 to 11 for the culture solution of the alkalophilic bacterium or alkaline esterase, and pH 5 to 8 for the non-alkalophilic esterase. In addition, it is preferable to use a buffer solution to neutralize the organic carboxylic acid produced by the hydrolysis reaction and keep the pH constant during the reaction, sodium phosphate,
Inorganic acid salt buffer such as potassium phosphate, sodium acetate,
A buffer of an organic acid salt such as sodium citrate can be used.

基質である該ラセミ体のシクロペンテノンエステル類の
使用濃度は反応液に対し0.1〜50重量％であり、好まし
くは0.5〜25重量％である。使用するエステラーゼの濃
度は、基質の重量に対して0.1〜50重量％である。The concentration of the racemic cyclopentenone ester as a substrate used is 0.1 to 50% by weight, preferably 0.5 to 25% by weight, based on the reaction solution. The concentration of esterase used is 0.1 to 50% by weight, based on the weight of the substrate.

ここで不斉加水分解反応は、生成する４−ヒドロキシシ
クロペンテノン類の（Ｒ）体含有率90％未満とならない
範囲で止めることが肝要で、通常は加水分解率が40〜60
％の範囲に達するまで行なわれる。Here, it is important to stop the asymmetric hydrolysis reaction within a range in which the content of the (R) isomer of the 4-hydroxycyclopentenones to be produced does not become less than 90%, and usually the hydrolysis rate is 40 to 60.
It is performed until the range of% is reached.

反応終了後、反応液から加水分解生成物及び加水分解残
を分離するためには、反応液を例えばメチルイソブチル
ケトン、酢酸エチル、エチルエーテル等の溶媒により抽
出処理し、有機層から溶媒を留去した後、濃縮残渣を更
に蒸溜するか、カラムクロマトグラフィーで処理する等
の方法により加水分解生成物である（Ｒ）体を90％以上
含有する光学活性な４−ヒドロキシシクロペンテノン類
と加水分解残である未反応のシクロペンテノンエステル
類をそれぞれ分離することができる。After the reaction is completed, in order to separate the hydrolysis product and the hydrolysis residue from the reaction solution, the reaction solution is subjected to an extraction treatment with a solvent such as methyl isobutyl ketone, ethyl acetate, ethyl ether, etc., and the solvent is distilled off from the organic layer. After that, the concentrated residue is further distilled, or treated by column chromatography or the like to hydrolyze the optically active 4-hydroxycyclopentenones containing 90% or more of the hydrolysis product (R) form. The remaining unreacted cyclopentenone esters can be separated respectively.

次に、ここに得られた（Ｒ）体を90％以上含有する光学
活性な４−ヒドロキシシクロペンテノン類を、前記した
ラセミ体の４−ヒドロキシシクロペンテノン類のエステ
ル化と同様にして、エステル化し、光学活性なシクロペ
ンテノンエステル類へと誘導する。この光学活性なシク
ロペンテノンエステル類を再び、前記のラセミ体のシク
ロペンテノンエステル類の不斉加水分解反応と同様の条
件で微生物エステラーゼを用いて不斉加水分解する。こ
の時の不斉加水分解反応は生成する４−ヒドロキシシク
ロペンテノン類の（Ｒ）体含有率が97％未満とならない
範囲で止められるが、通常は、加水分解率が70〜95％に
達するまで行なわれる。Next, the optically active 4-hydroxycyclopentenones containing 90% or more of the (R) form obtained here were treated in the same manner as the esterification of the racemic 4-hydroxycyclopentenones described above, Esterify to induce optically active cyclopentenone esters. The optically active cyclopentenone esters are again subjected to asymmetric hydrolysis using a microbial esterase under the same conditions as in the above-mentioned asymmetric hydrolysis reaction of racemic cyclopentenone esters. The asymmetric hydrolysis reaction at this time can be stopped within a range in which the content of the (R) isomer of the produced 4-hydroxycyclopentenones does not fall below 97%, but usually the hydrolysis rate reaches 70 to 95%. Up to.

反応終了後は、前記とまったく同様にして反応液から加
水分解生成物及び加水分解残の分離を行ない、ここに、
（Ｒ）体の含有率が97％以上の光学活性な４−ヒドロキ
シシクロペンテノン類を取得する。After completion of the reaction, the hydrolysis product and the hydrolysis residue are separated from the reaction solution in exactly the same manner as described above.
An optically active 4-hydroxycyclopentenone having a (R) content of 97% or more is obtained.

次に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれらによって限定されるものではない。Next, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.

実施例１ ラセミ体の２−アリル−４−アセトキシ−２−シクロペ
ンテノン68.6g、アルスロバクター属リパーゼ（新日本
化学製）140mg及び0.1M燐酸緩衝液（pH6.5）280gを混合
し、45℃で20時間激しく撹拌しつつ不斉加水分解反応を
行なった。反応終了時の加水分解率は43.4％であった。
なお、加水分解率の測定はガスクロマトグラフィー分析
により行なった。Example 1 68.6 g of racemic 2-allyl-4-acetoxy-2-cyclopentenone, 140 mg of Arthrobacter lipase (manufactured by Shin Nippon Kagaku) and 280 g of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5) were mixed, The asymmetric hydrolysis reaction was carried out with vigorous stirring at 45 ° C for 20 hours. The hydrolysis rate at the end of the reaction was 43.4%.
The hydrolysis rate was measured by gas chromatography analysis.

反応終了後、反応液に芒硝を加え、メチルイソブチルケ
トンで抽出を行なった。抽出液を濃縮し、濃縮残渣を酢
酸エチル：トルエン＝3.5（重量比）の混合溶媒にてカ
ラムクロマト精製を行ない、加水分解残渣である２−ア
リル−４−アセトキシ−２−シクロペンテノン38.8gと
加水分解生成物である２−アリル−４−ヒドロキシ−２
−シクロペンテノン22.4gを得た。ここで得られた２−
アリル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテノンを
（＋）−α−メトキシ−α−（トリフロロメチル）−フ
ェニル酢酸のエステルとした後、高速液体クロマトグラ
フィーにてジアステレオマーを分離し、光学異性体比を
測定した結果、（Ｒ）体含有率は91.8％であった。〔Ｒ
体:S体＝91.8:8.2〕。ここで得られた２−アリル−４−
ヒドロキシ−２−シクロペンテノン22.4gをメチルイソ
ブチルケトン30gに溶解し、無水酢酸18.8g及び硫酸0.09
gを加え、40℃で３時間撹拌し、アセチル化反応を行な
った。反応後、反応液に水100gを加えて抽出分離し、水
溶性成分を除去し、メチルイソブチルケトン溶液を回収
した。このメチルイソブチルケトン溶液を濃縮し、濃縮
残渣である２−アリル−４−アセトキシ−２−シクロペ
ンテノン29.2gを得た。ここに得られた２−アリル−４
−アセトキシ−２−シクロペンテノン29.2gとアルスロ
バクター属リパーゼ（新日本化学製）60mg及び0.1M燐酸
緩衝液100gを混合し、45℃で24時間激しく撹拌しつつ、
不斉加水分解反応を行なった。反応終了時の加水分解率
は73％であった。反応終了後、反応液に芒硝を加え、メ
チルイソブチルケトンで抽出を行なった。以後、前記と
同様にして濃縮、カラムクロマトグラブィー精製を行な
い、加水分解生成物である２−アリル−４−ヒドロキシ
−２−シクロペンテノン16.3gを取得した。ここで得ら
れた２−アリル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテノ
ンにつき、前記と同様にして、光学異性体比を測定した
結果、（Ｒ）体含有率は98.5％であった〔Ｒ体:S体＝9
8.5:1.5〕。また、収率は61％であった。（ここで、収
率とは原料として用いたラセミ体の２−アリル−４−ア
セトキシ−２−シクロペンテノン中の（Ｒ）−２−アリ
ル−４−アセトキシ−２−シクロペンテノンに対する製
造された（Ｒ）−２−アリル−４−ヒドロキシ−２−シ
クロペンテノンのモル比を意味する。） 参考例 ラセミ体の２−アリル−４−アセトキシ−２−シクロペ
ンテノン68.6g、アスルロバクター属リパーゼ（新日本
化学製）140mg及び0.1M燐酸緩衝液280gを混合し、45℃
で５時間激しく撹拌しつつ不斉加水分解反応を行なっ
た。以後、実施例１と同様にして加水分解生成物である
２−アリル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテノン1
5.4gを単離した。得られた２−アリル−４−ヒドロキシ
−２−シクロペンテノンにつき実施例１と同様にして、
光学異性体比を測定した結果、（Ｒ）体含有率は93.5％
であった〔Ｒ体:S体＝93.5:6.5〕。また、収率は55％で
あった。After the reaction was completed, Glauber's salt was added to the reaction solution, and extraction was performed with methyl isobutyl ketone. The extract was concentrated and the concentrated residue was purified by column chromatography with a mixed solvent of ethyl acetate: toluene = 3.5 (weight ratio) to give a hydrolysis residue of 2-allyl-4-acetoxy-2-cyclopentenone (38.8 g). And the hydrolysis product 2-allyl-4-hydroxy-2
22.4 g of cyclopentenone were obtained. 2- obtained here
After converting allyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone to an ester of (+)-α-methoxy-α- (trifluoromethyl) -phenylacetic acid, diastereomers were separated by high performance liquid chromatography to obtain an optical spectrum. As a result of measuring the isomer ratio, the content of the (R) isomer was 91.8%. [R
Body: S body = 91.8: 8.2]. 2-allyl-4-obtained here
Hydroxy-2-cyclopentenone 22.4 g was dissolved in methyl isobutyl ketone 30 g, acetic anhydride 18.8 g and sulfuric acid 0.09
g was added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 3 hours to carry out an acetylation reaction. After the reaction, 100 g of water was added to the reaction solution for extraction and separation, water-soluble components were removed, and a methyl isobutyl ketone solution was recovered. The methyl isobutyl ketone solution was concentrated to obtain 29.2 g of 2-allyl-4-acetoxy-2-cyclopentenone as a concentrated residue. 2-allyl-4 obtained here
-Acetoxy-2-cyclopentenone 29.2g and Arthrobacter lipase (manufactured by Shin Nippon Chemical Co., Ltd.) 60mg and 0.1M phosphate buffer 100g were mixed, while stirring vigorously at 45 ° C for 24 hours,
Asymmetric hydrolysis reaction was performed. The hydrolysis rate at the end of the reaction was 73%. After the reaction was completed, Glauber's salt was added to the reaction solution, and extraction was performed with methyl isobutyl ketone. Thereafter, concentration and column chromatographic purification were carried out in the same manner as described above to obtain 16.3 g of 2-allyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone as a hydrolysis product. With respect to the 2-allyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone obtained here, the optical isomer ratio was measured in the same manner as above, and as a result, the content of the (R) isomer was 98.5% [R isomer. : S body = 9
8.5: 1.5]. The yield was 61%. (Here, the yield refers to (R) -2-allyl-4-acetoxy-2-cyclopentenone in the racemic 2-allyl-4-acetoxy-2-cyclopentenone used as a raw material. (R) -2-allyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone in a molar ratio.) Reference Example Racemic 2-allyl-4-acetoxy-2-cyclopentenone 68.6 g, asulobacter Genus lipase (Nippon Kagaku) 140mg and 0.1M phosphate buffer 280g are mixed, 45 ℃
The asymmetric hydrolysis reaction was carried out for 5 hours with vigorous stirring. Thereafter, in the same manner as in Example 1, the hydrolysis product 2-allyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone 1 was obtained.
5.4 g was isolated. Regarding the obtained 2-allyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone, in the same manner as in Example 1,
As a result of measuring the optical isomer ratio, the (R) isomer content is 93.5%
[R body: S body = 93.5: 6.5]. The yield was 55%.

実施例２〜４ ラセミ体の２−アリル−４−アセトキシ−２−シクロペ
ンテノン30.0g、アルスロバクター属のリパーゼ0.24g及
び0.1M燐酸緩衝液（pH6.5）100gを混合し、40℃で激し
く撹拌しつつ不斉加水分解反応を行なった（加水分解率
42.0％）。反応終了後、実施例１と同様の操作を行な
い、加水分解生成物である２−アリル−４−ヒドロキシ
−２−シクロペンテノン9.67g（Ｒ体:S体＝92.5:7.5）
を得た後、２−アリル−４−アセトキシ−２−シクロペ
ンテノン（収量12.5g）へと誘導した。ここに得られた
２−アリル−４−アセトキシ−２−シクロペンテノン1g
と表１に記載の各リパーゼ及び0.1M燐酸緩衝液（pH6.
5）10gを混合し、激しく撹拌しつつ、40℃で８時間、不
斉加水分解反応を行なった。以後、実施例１と同様にし
て、光学活性２−アリル−４−ヒドロキシ−２−シクロ
ペンテノンを取得し、表１の結果を得た。Examples 2 to 4 Racemic 2-allyl-4-acetoxy-2-cyclopentenone (30.0 g), Arthrobacter lipase (0.24 g) and 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5) (100 g) were mixed at 40 ° C. The asymmetric hydrolysis reaction was performed with vigorous stirring (hydrolysis rate
42.0%). After completion of the reaction, the same operation as in Example 1 was carried out to obtain 9.67 g of 2-allyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone (R-form: S-form = 92.5: 7.5) which is a hydrolysis product.
After obtaining, it was induced to 2-allyl-4-acetoxy-2-cyclopentenone (yield 12.5 g). 1 g of 2-allyl-4-acetoxy-2-cyclopentenone obtained here
And each lipase and 0.1M phosphate buffer solution (pH 6.
5) 10 g were mixed and subjected to asymmetric hydrolysis reaction at 40 ° C. for 8 hours with vigorous stirring. Thereafter, optically active 2-allyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone was obtained in the same manner as in Example 1, and the results shown in Table 1 were obtained.

実施例５ ラセミ体の２−プロパルギル−４−アセトキシ−２−シ
クロペンテノン69.5g、シュードモナス属リパーゼ（天
野製薬製）300mgおよび0.1M燐酸緩衝液（pH6.5）280gを
混合し、30℃で20時間激しく撹拌しつつ不斉加水分解反
応を行なった。反応終了時の加水分解率は55％であっ
た。なお、加水分解率はガスクロマトグラフィー分析に
より行なった。反応終了後、反応液に芒硝を加え、メチ
ルイソブチルケトンで抽出を行なった。抽出液を濃縮
し、濃縮残渣を酢酸エチル：トルエン＝3.5（重量比）
の混合溶媒にてカラムクロマト精製を行ない、加水分解
残渣である２−プロパルギル−４−アセトキシ−２−シ
クロペンテノン30.7gと加水分解生成物である２−プロ
パルギル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテノン28.2
gを得た。ここで得られた２−プロパギル−４−ヒドロ
キシ−２−シクロペンテノを10mg採取し、（＋）−α−
メトキシ−α−（トリフロロメチル）−フェニル酢酸の
エステルとした後、高速液体クロマトグラフィーにてジ
アステレオマーを分離し、光学異性体比を測定した結
果、（Ｒ）体含有率は90.5％〔Ｒ体:S体＝90.5:9.5〕で
あった。 Example 5 69.5 g of racemic 2-propargyl-4-acetoxy-2-cyclopentenone, 300 mg of Pseudomonas lipase (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) and 280 g of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5) were mixed, and the mixture was mixed at 30 ° C. The asymmetric hydrolysis reaction was performed with vigorous stirring for 20 hours. The hydrolysis rate at the end of the reaction was 55%. The hydrolysis rate was determined by gas chromatography analysis. After the reaction was completed, Glauber's salt was added to the reaction solution, and extraction was performed with methyl isobutyl ketone. The extract was concentrated and the concentrated residue was converted to ethyl acetate: toluene = 3.5 (weight ratio)
Column chromatography purification with a mixed solvent of 2-propargyl-4-acetoxy-2-cyclopentenone, which is a hydrolysis residue, and 2-propargyl-4-hydroxy-2-cyclopentene, which is a hydrolysis product. Tenon 28.2
got g. 10 mg of 2-propargyl-4-hydroxy-2-cyclopenteno obtained here was collected, and (+)-α-
After forming the ester of methoxy-α- (trifluoromethyl) -phenylacetic acid, the diastereomers were separated by high performance liquid chromatography and the optical isomer ratio was measured. As a result, the content of the (R) product was 90.5% [ R form: S form = 90.5: 9.5].

更に、２−プロパル−４−ヒドロキシ−２−シクロペン
テノン28.2gをメチルイソブチルケトン30gに溶解し、無
水酢酸24.0g及び硫酸0.11gを加え、40℃で３時間溶解
し、アセチル化反応を行なった。反応後、反応液に水10
0gを加えて抽出分離し、水溶性分を除去し、メチルイソ
ブチルケトン溶液を回収した。このメチルイソブチルケ
トン溶液を濃縮し、濃縮残渣である２−プロパルギル−
４−アセトキシ−２−シクロペンテノン34.7gを得た。
ここに得られた２−プロパルギル−４−アセトキシ−２
−シクロペンテノン34.7gとシュードモナス属リパーゼ
（天野製薬製）170mg及び0.1M燐酸緩衝液100gを混合
し、30℃で24時間激しく撹拌しつつ、不斉加水分解反応
を行なった。反応終了時の加水分解率は73％であった。
反応終了後、反応液に芒硝を加え、メチルイソブチルケ
トンで抽出を行なった。以後、前記と同様にして濃縮、
カラムクロマトグラフィー精製を行ない加水分解生成物
である２−プロパルギル−４−ヒドロキシ−２−シクロ
ペンテノン19.3gを取得した。ここで得られた２−プロ
パルギル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテノンにつ
き、前記と同様にして、光学異性体比を測定した結果、
Ｒ体:S体＝99.5:0.5であった。また、収率は68.5gであ
った。（ここで、収率とは原料として用いたラセミ体の
２−プロパルギル−４−アセトキシ−２−シクロペンテ
ノンに含まれる（Ｒ）２−プロパルギル−４−アセトキ
シ−２−シクロペンテノン対する製造された（Ｒ）−２
−アリル−４−ヒドロキシ−２−シクロペンテノンのモ
ル比を意味する。） 実施例６〜８ ラセミ体の２−プロパルギル−４−アセトキシ−２−シ
クロペンテノン30.0g、シュードモナス属のリパーゼ200
mgおよび0.1M燐酸緩衝液（pH6.5）100gを混合し、40℃
で激しく撹拌しつつ不斉加水分解反応を行なった（加水
分解率53.5％）。反応終了後、実施例５と同様の操作を
行ない、加水分解生成物である２−プロパルギル−４−
ヒドロキシ−２−シクロペンテノン11.6g（Ｒ体:S体＝9
1.0:9.0を得た後２−プロパルギル−４−アセトキシ−
２−シクロペンテノン（収量14.6g）へと誘導した。こ
こに得られた２−プロパルギル−４−アセトキシ−２−
シクロペンテノン1gと表２に記載の各リパーゼ及び0.1M
燐酸緩衝液（pH6.5）10gを混合し、激しく撹拌しつつ、
40℃で８時間、不斉加水分解反応を行なった。以後、実
施例５と同様にして、光学活性２−プロパルギル−４−
ヒドロキシ−２−シクロペンテノンを取得し、表２の結
果を得た。Furthermore, 2-propal-4-hydroxy-2-cyclopentenone (28.2 g) was dissolved in methyl isobutyl ketone (30 g), acetic anhydride (24.0 g) and sulfuric acid (0.11 g) were added, and the mixture was dissolved at 40 ° C. for 3 hours to perform an acetylation reaction. It was After the reaction, add 10
0 g was added and the mixture was extracted and separated, the water-soluble component was removed, and the methyl isobutyl ketone solution was recovered. This methyl isobutyl ketone solution was concentrated to give a concentrated residue, 2-propargyl-
34.7 g of 4-acetoxy-2-cyclopentenone was obtained.
2-Propargyl-4-acetoxy-2 obtained here
-34.7 g of cyclopentenone, 170 mg of Pseudomonas lipase (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) and 100 g of 0.1 M phosphate buffer were mixed, and asymmetric hydrolysis reaction was carried out at 30 ° C for 24 hours with vigorous stirring. The hydrolysis rate at the end of the reaction was 73%.
After the reaction was completed, Glauber's salt was added to the reaction solution, and extraction was performed with methyl isobutyl ketone. After that, concentrate in the same manner as above,
Column chromatography purification was performed to obtain 19.3 g of 2-propargyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone as a hydrolysis product. For the 2-propargyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone obtained here, as a result of measuring the optical isomer ratio in the same manner as described above,
R form: S form = 99.5: 0.5. The yield was 68.5 g. (Here, the yield refers to the amount of (R) 2-propargyl-4-acetoxy-2-cyclopentenone contained in the racemic 2-propargyl-4-acetoxy-2-cyclopentenone used as a raw material. Was (R) -2
-Means the molar ratio of allyl-4-hydroxy-2-cyclopentenone. Examples 6-8 Racemic 2-propargyl-4-acetoxy-2-cyclopentenone 30.0 g, Pseudomonas lipase 200
Mix 100 mg of 0.1M phosphate buffer (pH 6.5) and 40 ℃
An asymmetric hydrolysis reaction was carried out with vigorous stirring (hydrolysis rate 53.5%). After completion of the reaction, the same operation as in Example 5 was carried out to give 2-propargyl-4- which is a hydrolysis product.
Hydroxy-2-cyclopentenone 11.6g (R body: S body = 9
After obtaining 1.0: 9.0 2-propargyl-4-acetoxy-
Derived to 2-cyclopentenone (yield 14.6g). 2-Propargyl-4-acetoxy-2-obtained here
Cyclopentenone 1 g and each lipase shown in Table 2 and 0.1M
While mixing 10 g of phosphate buffer (pH 6.5) and stirring vigorously,
The asymmetric hydrolysis reaction was carried out at 40 ° C. for 8 hours. Thereafter, in the same manner as in Example 5, optically active 2-propargyl-4-
Hydroxy-2-cyclopentenone was obtained and the results in Table 2 were obtained.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 植田 裕治 大阪府大阪市此花区春日出中３丁目11番98 号 住友化学工業株式会社内 (72)発明者 南井 正好 大阪府大阪市此花区春日出中３丁目11番98 号 住友化学工業株式会社内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification number Internal reference number FI Technical indication (C12P 41/00 C12R 1:38) (C12P 41/00 C12R 1:01) (72) Inventor Yuji Ueda 3-1198 Kasugade, Konohana-ku, Osaka-shi, Osaka Sumitomo Chemical Co., Ltd. (72) Inventor Masayoshi Minai 3--1198 Kasuga, Konohana-ku, Osaka, Osaka Sumitomo Chemical Co., Ltd. Within

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】（Ｉ）式 （式中、Ｒ′はハロゲンで置換されていてもよいアルキ
ル基、アルケニル基を、Ｒは炭素数１〜７の直鎖アルキ
ル基、アルケニル基、アルキニル基を示す。）で示され
るラセミ体のシクロペンテノンエステル類をアルスロバ
クター属、アルカリゲネス属、クロモバクテリウム属ま
たはシュードモナス属に属する微生物の中から選ばれた
微生物が産生する酵素を用いて不斉加水分解し、（II）
式 （式中、Ｒは前記と同じ意味であり、※印は不斉炭素を
示す。）で示される４−ヒドロキシシクロペンテノン類
の（Ｒ）体を90％以上含有する光学活性な４−ヒドロキ
シシクロペンテノン類を生成せしめ、この（Ｒ）体を90
％以上含有する光学活性な４−ヒドロキシシクロペンテ
ノン類を単離取得した後、（III）式で示される脂肪族
カルボン酸ハライド又は（IV）式で Ｒ′COX （III） （式中、Ｒ′は前記と同じ意味であり、Ｘは塩素原子あ
るいは臭素原子を表わす。） で示される脂肪族カルボン酸無水物を反応せしめ、得ら
れた（Ｖ）式 （式中、R,R′は前記と同じ意味であり、※印は前記と
同じ絶対配置を有する不斉炭素を表わす。） で示される光学活性なシクロペンテノンエステル類をア
ルスロバクター属、アルカリゲネス属、クロモバクテリ
ウム属またはシュードモナス属に属する微生物の中から
選ばれた微生物が産生する酵素を用いて不斉加水分解
し、（II）式で示される４−ヒドロキシシクロペンテノ
ン類の（Ｒ）体含量が97％以上である光学活性な４−ヒ
ドロキシシクロペンテノン類を取得することを特徴とす
る光学活性４−ヒドロキシシクロペンテノン類の生化学
的製造方法。1. Formula (I) (In the formula, R'represents an alkyl group or an alkenyl group which may be substituted with halogen, and R represents a linear alkyl group, an alkenyl group or an alkynyl group having 1 to 7 carbon atoms.) Asymmetric hydrolysis of cyclopentenone esters using an enzyme produced by a microorganism selected from those belonging to the genus Arthrobacter, Alcaligenes, Chromobacterium or Pseudomonas, (II)
formula (In the formula, R has the same meaning as described above, and * indicates an asymmetric carbon.) Optically active 4-hydroxy containing 90% or more of (R) form of 4-hydroxycyclopentenones Cyclopentenones are produced, and this (R) form is
% Of an optically active 4-hydroxycyclopentenone is isolated and obtained, and then an aliphatic carboxylic acid halide represented by the formula (III) or R′COX (III) represented by the formula (IV) is obtained. (In the formula, R'has the same meaning as described above, and X represents a chlorine atom or a bromine atom.) The formula (V) obtained by reacting an aliphatic carboxylic acid anhydride represented by (In the formula, R and R ′ have the same meanings as described above, and * represents an asymmetric carbon having the same absolute configuration as described above.) Is an optically active cyclopentenone ester represented by the genus Arthrobacter, Asymmetric hydrolysis is performed using an enzyme produced by a microorganism selected from microorganisms belonging to the genera Alcaligenes, Chromobacterium or Pseudomonas, and (R of 4-hydroxycyclopentenones represented by the formula (II) ) A biochemical production method of optically active 4-hydroxycyclopentenones, which comprises obtaining optically active 4-hydroxycyclopentenones having a body content of 97% or more.