JPH07223969A - チオエーテル結合体の製造法 - Google Patents
チオエーテル結合体の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ドキソルビシンと免疫グロブリンとのチオエ
ーテル結合体の製造方法を提供する。 【構成】 精製され還元された形態のＢＲ９６モノクロ
ーナル抗体をドキソルビシンの６−マレイミドカプロイ
ルヒドラゾンに結合させ、ついで得られた結合体を精製
することを特徴とする、式： 【化１】
ーテル結合体の製造方法を提供する。 【構成】 精製され還元された形態のＢＲ９６モノクロ
ーナル抗体をドキソルビシンの６−マレイミドカプロイ
ルヒドラゾンに結合させ、ついで得られた結合体を精製
することを特徴とする、式： 【化１】
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ドキソルビシンと免疫
グロブリンとのチオエーテル結合体の製造方法に関す
る。
グロブリンとのチオエーテル結合体の製造方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】細胞
毒性試薬を抗体に連結する２官能性化合物が知られてい
る。これら化合物は、腫瘍関連抗原に向けられた免疫結
合体を生成するのにとりわけ有用である。そのような免
疫結合体によって、毒性薬物を腫瘍細胞に選択的に送り
込むことができる（たとえば、ハーメンチン（Ｈerment
in）およびセイラー（Ｓeiler）、“Ｉnvestigations
Ｗith Ｍonoclonal Ａntibody Ｄrug Ｃonjugates”、
Ｂehring Ｉnsti.Ｍitl.８２：１９７〜２１５（１９８
８）；ガレゴ（Ｇallego）ら、“Ｐreparation of Ｆou
r Ｄaunomycin−Ｍonoclonal Ａntibody ７９１Ｔ／３
６ Ｃonjugates Ｗith Ａnti−Ｔumor Ａctivity”Ｉn
t.Ｊ.Ｃancer３３：７３７〜７４４（１９８４）；アー
ノン（Ａrnon）ら、“Ｉn Ｖitro and Ｉn Ｖivo Ｅffi
cacy of Ｃonjugates of Ｄaunomycin ｗith Ａnti−Ｔ
umor Ａntibodies”Ｉmmunological Ｒev.６２：５〜２
７（１９８２）を参照）。
毒性試薬を抗体に連結する２官能性化合物が知られてい
る。これら化合物は、腫瘍関連抗原に向けられた免疫結
合体を生成するのにとりわけ有用である。そのような免
疫結合体によって、毒性薬物を腫瘍細胞に選択的に送り
込むことができる（たとえば、ハーメンチン（Ｈerment
in）およびセイラー（Ｓeiler）、“Ｉnvestigations
Ｗith Ｍonoclonal Ａntibody Ｄrug Ｃonjugates”、
Ｂehring Ｉnsti.Ｍitl.８２：１９７〜２１５（１９８
８）；ガレゴ（Ｇallego）ら、“Ｐreparation of Ｆou
r Ｄaunomycin−Ｍonoclonal Ａntibody ７９１Ｔ／３
６ Ｃonjugates Ｗith Ａnti−Ｔumor Ａctivity”Ｉn
t.Ｊ.Ｃancer３３：７３７〜７４４（１９８４）；アー
ノン（Ａrnon）ら、“Ｉn Ｖitro and Ｉn Ｖivo Ｅffi
cacy of Ｃonjugates of Ｄaunomycin ｗith Ａnti−Ｔ
umor Ａntibodies”Ｉmmunological Ｒev.６２：５〜２
７（１９８２）を参照）。
【０００３】グリーンフィールド（Ｇreenfield）ら
は、最近、アシルヒドラジン化合物、すなわち、アシル
ヒドラゾン結合を介してアンスラサイクリン分子の１３
−ケト位に結合した３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オニルヒドラジドを含有する酸感受性の免疫結合体の生
成、および該アンスラサイクリン誘導体の抗体分子への
結合を記載している（グリーンフィールドら、ヨーロッ
パ特許出願公開ＥＰ ０３２８ １４７号（１９８９年８
月１６日公開、継続中の米国特許出願第０７／２７０,
５０９号（１９８８年１１月１６日出願）および米国特
許出願第０７／１５５,１８１号（１９８８年２月１１
日出願、現在放棄）に対応））。この後者の文献はま
た、特定のチオエーテル−含有リンカーおよび結合体
（ヒドラゾンチオエーテル含有免疫結合体を含む）をも
開示している。
は、最近、アシルヒドラジン化合物、すなわち、アシル
ヒドラゾン結合を介してアンスラサイクリン分子の１３
−ケト位に結合した３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オニルヒドラジドを含有する酸感受性の免疫結合体の生
成、および該アンスラサイクリン誘導体の抗体分子への
結合を記載している（グリーンフィールドら、ヨーロッ
パ特許出願公開ＥＰ ０３２８ １４７号（１９８９年８
月１６日公開、継続中の米国特許出願第０７／２７０,
５０９号（１９８８年１１月１６日出願）および米国特
許出願第０７／１５５,１８１号（１９８８年２月１１
日出願、現在放棄）に対応））。この後者の文献はま
た、特定のチオエーテル−含有リンカーおよび結合体
（ヒドラゾンチオエーテル含有免疫結合体を含む）をも
開示している。
【０００４】カネコ（Ｋaneko）ら（米国特許出願第０
７／５２２,９９６号（１９９０年５月１４日出願、ヨ
ーロッパ特許出願公開第ＥＰ Ａ ０ ４５７ ２５０号
（１９９１年１１月２１日公開）に対応））はまた、ア
ンスラサイクリン分子のＣ−１３位でアシルヒドラゾン
結合により２官能性リンカーに結合したアンスラサイク
リン抗生物質を含有する結合体の生成を記載している。
彼らの発明において、該リンカーは反応性のピリジニル
ジチオ−またはオルト−ニトロフェニルジチオ−基を含
んでおり、該基により該リンカーは細胞反応性のリガン
ドに結合した適当な基と反応して完全な結合体を生成す
る。
７／５２２,９９６号（１９９０年５月１４日出願、ヨ
ーロッパ特許出願公開第ＥＰ Ａ ０ ４５７ ２５０号
（１９９１年１１月２１日公開）に対応））はまた、ア
ンスラサイクリン分子のＣ−１３位でアシルヒドラゾン
結合により２官能性リンカーに結合したアンスラサイク
リン抗生物質を含有する結合体の生成を記載している。
彼らの発明において、該リンカーは反応性のピリジニル
ジチオ−またはオルト−ニトロフェニルジチオ−基を含
んでおり、該基により該リンカーは細胞反応性のリガン
ドに結合した適当な基と反応して完全な結合体を生成す
る。
【０００５】ウイルナー（Ｄ.Ｗillner）らによって１
９９２年１月２３日に出願された米国特許出願第８２
４,９５１号（参照のため本明細書に引用する）には、
治療学的に活性な薬剤分子を選択された標的細胞集団を
認識し得るリガンドに連結させるために酸感受性の結合
を用いた治療学的に活性な結合体の調製法が開示されて
いる。
９９２年１月２３日に出願された米国特許出願第８２
４,９５１号（参照のため本明細書に引用する）には、
治療学的に活性な薬剤分子を選択された標的細胞集団を
認識し得るリガンドに連結させるために酸感受性の結合
を用いた治療学的に活性な結合体の調製法が開示されて
いる。
【０００６】ウイルナーらによって生成された結合体
は、式（Ｉ）：
は、式（Ｉ）：
【化１４】 （式中、Ｄは薬剤残基；ｎは１〜１０；ｐは１〜６；Ｙ
はＯまたはＮＨ2 +Ｃｌ-；ｚは０または１；ｑは約１〜
約１０；ｘはリガンド；Ａはマイケル付加による付加物
残基）の一般構造を有する。
はＯまたはＮＨ2 +Ｃｌ-；ｚは０または１；ｑは約１〜
約１０；ｘはリガンド；Ａはマイケル付加による付加物
残基）の一般構造を有する。
【０００７】好ましい態様において、薬剤であるアンス
ラサイクリン、好ましくはアドリアマイシン（ドキソル
ビシン）は、該アンスラサイクリン化合物の１３−ケト
位においてアシルヒドラゾン結合により結合体のリンカ
ー部分に結合する。ついで、リガンド（還元された抗
体、好ましくはキメラＢＲ９６抗体である）をリンカ
ー、好ましくはマレイミド基によりアンスラサイクリン
化合物に結合させる。特に好ましい態様においては、こ
の連結は、抗体上の還元されたジスルフィド基（すなわ
ち、遊離のスルフヒドリル基（−ＳＨ））を介して起こ
る。
ラサイクリン、好ましくはアドリアマイシン（ドキソル
ビシン）は、該アンスラサイクリン化合物の１３−ケト
位においてアシルヒドラゾン結合により結合体のリンカ
ー部分に結合する。ついで、リガンド（還元された抗
体、好ましくはキメラＢＲ９６抗体である）をリンカ
ー、好ましくはマレイミド基によりアンスラサイクリン
化合物に結合させる。特に好ましい態様においては、こ
の連結は、抗体上の還元されたジスルフィド基（すなわ
ち、遊離のスルフヒドリル基（−ＳＨ））を介して起こ
る。
【０００８】上記結合体の好ましい調製法において、ウ
イルナーらの上記米国特許出願にに開示されているよう
に、リガンドＭＡｂ−（ＳＨ）8上のスルフヒドリル基
を式（ＩＩｂ）：
イルナーらの上記米国特許出願にに開示されているよう
に、リガンドＭＡｂ−（ＳＨ）8上のスルフヒドリル基
を式（ＩＩｂ）：
【化１５】 で示される中間体のマイケル付加レセプターと直接反応
させて式（Ｉａ）：
させて式（Ｉａ）：
【化１６】 で示される最終結合体を生成させる。この方法を用い、
一般に約１〜約１０の薬剤分子を各リガンドに連結させ
ることができる。それゆえ、式（Ｉａ）においてｑは約
１〜約１０である。
一般に約１〜約１０の薬剤分子を各リガンドに連結させ
ることができる。それゆえ、式（Ｉａ）においてｑは約
１〜約１０である。
【０００９】ウイルナーらの上記米国特許出願に記載さ
れているように、式（ＩＩｂ）の中間体マイケル付加レ
セプター含有ヒドラゾン薬剤誘導体の調製は、方法Ａ：
れているように、式（ＩＩｂ）の中間体マイケル付加レ
セプター含有ヒドラゾン薬剤誘導体の調製は、方法Ａ：
【化１７】 （式中、Ｄはドキソルビシン、Ｒはマレイミド残基）に
示される一般的方法により、使用したマイケル付加レセ
プター残基に応じて、薬剤（または誘導体化薬剤）をマ
イケル付加レセプターを含有するヒドラジドと反応させ
ることにより行うことができる。
示される一般的方法により、使用したマイケル付加レセ
プター残基に応じて、薬剤（または誘導体化薬剤）をマ
イケル付加レセプターを含有するヒドラジドと反応させ
ることにより行うことができる。
【００１０】スルフヒドリル含有リガンド（ＩＩＩ）
（ＭＡｂ−（ＳＨ）8）は、たとえば、ジチオトレイト
ール（ＤＴＴ）などの還元剤を用い、天然分子（ＩＩ）
中のジスルフィド結合：
（ＭＡｂ−（ＳＨ）8）は、たとえば、ジチオトレイト
ール（ＤＴＴ）などの還元剤を用い、天然分子（ＩＩ）
中のジスルフィド結合：
【化１８】 を還元することにより調製することができる。
【００１１】結合反応が完了した後、結合体を公知の透
析、クロマトグラフィー法および／または濾過法を用い
て単離および精製することができる。結合体を含有する
最終溶液は、通常、凍結乾燥して、安全に貯蔵および輸
送が可能な乾燥した安定な形態で結合体を提供すること
ができる。凍結乾燥した生成物は、最終的に滅菌水また
は投与用の他の適当な希釈液で再構成することができ
る。別法として、最終の生成物をたとえば液体窒素で凍
結し、投与の前に解凍し周囲温度とすることができる。
析、クロマトグラフィー法および／または濾過法を用い
て単離および精製することができる。結合体を含有する
最終溶液は、通常、凍結乾燥して、安全に貯蔵および輸
送が可能な乾燥した安定な形態で結合体を提供すること
ができる。凍結乾燥した生成物は、最終的に滅菌水また
は投与用の他の適当な希釈液で再構成することができ
る。別法として、最終の生成物をたとえば液体窒素で凍
結し、投与の前に解凍し周囲温度とすることができる。
【００１２】ウイルナーらによって開示されているよう
に、第一の好ましい態様において、式（ＩＩｂ）のドキ
ソルビシンヒドラゾンは、ドキソルビシンをマレイミド
−（Ｃ1−Ｃ10）−アルキルヒドラジドまたはその塩と
反応させることにより調製する。この反応は一般に２工
程で行う。まず、マレイミド−（Ｃ1−Ｃ10）−アルキ
ルヒドラジドまたはその塩を調製する。たとえば、クロ
マトグラフィーおよび／または結晶化によって精製した
後、ヒドラジドの遊離の塩基かまたは塩をドキソルビシ
ン塩と反応させる。反応溶液を濃縮した後、式（ＩＩ
ｂ）のマレイミド−含有ヒドラゾン反応生成物を回収
し、所望なら標準精製法により精製する。
に、第一の好ましい態様において、式（ＩＩｂ）のドキ
ソルビシンヒドラゾンは、ドキソルビシンをマレイミド
−（Ｃ1−Ｃ10）−アルキルヒドラジドまたはその塩と
反応させることにより調製する。この反応は一般に２工
程で行う。まず、マレイミド−（Ｃ1−Ｃ10）−アルキ
ルヒドラジドまたはその塩を調製する。たとえば、クロ
マトグラフィーおよび／または結晶化によって精製した
後、ヒドラジドの遊離の塩基かまたは塩をドキソルビシ
ン塩と反応させる。反応溶液を濃縮した後、式（ＩＩ
ｂ）のマレイミド−含有ヒドラゾン反応生成物を回収
し、所望なら標準精製法により精製する。
【００１３】ついで、上記ヒドラゾンを、最も好ましく
は少なくとも１のジスルフィド結合が還元されて少なく
とも１のスルフヒドリル基を生成している抗体と反応さ
せる。特に好ましいリガンドは、以下に記載するよう
に、「緩んだ（relaxed）抗体」である。遊離のスルフ
ヒドリル基を調製するための好ましい還元剤はＤＴＴで
ある。
は少なくとも１のジスルフィド結合が還元されて少なく
とも１のスルフヒドリル基を生成している抗体と反応さ
せる。特に好ましいリガンドは、以下に記載するよう
に、「緩んだ（relaxed）抗体」である。遊離のスルフ
ヒドリル基を調製するための好ましい還元剤はＤＴＴで
ある。
【００１４】「緩んだ」抗体とは、１または２以上、好
ましくは４のジスルフィド橋が還元された抗体である。
最も好ましくは、緩んだ抗体は、少なくとも４のジスル
フィド橋が還元された抗体である。緩んだ（すなわち、
還元された）抗体を調製するための好ましい方法におい
て、とりわけＤＴＴを用いた還元、および反応生成物の
精製を酸素の不在下、不活性雰囲気下、たとえば窒素ま
たはアルゴン下で行う。
ましくは４のジスルフィド橋が還元された抗体である。
最も好ましくは、緩んだ抗体は、少なくとも４のジスル
フィド橋が還元された抗体である。緩んだ（すなわち、
還元された）抗体を調製するための好ましい方法におい
て、とりわけＤＴＴを用いた還元、および反応生成物の
精製を酸素の不在下、不活性雰囲気下、たとえば窒素ま
たはアルゴン下で行う。
【００１５】ウイルナーらによって記載されているよう
に、別法において、反応を周囲温度で行うが、起こるか
もしれない還元されたジスルフィド結合の再酸化を克服
するため、充分に多量の還元剤、好ましくはＤＴＴを用
いる。いずれの場合も、生成物の精製は反応完了後でき
るだけ速やかに行い、最も好ましくはアルゴンや窒素ブ
ランケット（blanket）などの不活性雰囲気下で行う。
しかしながら、遊離のスルフヒドリルを含有するリガン
ドの好ましい調製法は、反応から大気酸素を排除して行
う方法である。これらいずれかの方法により調製された
抗体は、「緩んだ」抗体とよばれる。しかしながら、調
製した生成物は、できるだけ速やかにその後の反応に使
用するか、または酸素に暴露されない条件下、好ましく
は不活性雰囲気下、約０℃で貯蔵すべきである。
に、別法において、反応を周囲温度で行うが、起こるか
もしれない還元されたジスルフィド結合の再酸化を克服
するため、充分に多量の還元剤、好ましくはＤＴＴを用
いる。いずれの場合も、生成物の精製は反応完了後でき
るだけ速やかに行い、最も好ましくはアルゴンや窒素ブ
ランケット（blanket）などの不活性雰囲気下で行う。
しかしながら、遊離のスルフヒドリルを含有するリガン
ドの好ましい調製法は、反応から大気酸素を排除して行
う方法である。これらいずれかの方法により調製された
抗体は、「緩んだ」抗体とよばれる。しかしながら、調
製した生成物は、できるだけ速やかにその後の反応に使
用するか、または酸素に暴露されない条件下、好ましく
は不活性雰囲気下、約０℃で貯蔵すべきである。
【００１６】反応から酸素を排除した方法（すなわち、
反応を不活性雰囲気下で行う）において、リガンド（抗
体）をモル過剰のＤＴＴとともに約３０分〜約４時間、
好ましくは約３時間インキュベートする。ＤＴＴ／リガ
ンド比は、所望のスルフヒドリル基の数に応じて、約
１：１〜約２０：１、好ましくは約４：１〜約１０：
１、最も好ましくは約５：１〜約７：１の範囲であって
よい。酸素の存在下で行う還元に対しては、リガンドに
対するＤＴＴのモル比は、約５０：１〜約４００：１、
好ましくは約２００：１〜約３００：１の範囲であって
よい。後者の反応は、約２０℃〜約５０℃の温度（好ま
しい温度は約３７℃である）にて約１〜約４時間、好ま
しくは１.５時間行う。反応は、約６〜約８、好ましく
は約７〜７.５のｐＨで行う。ついで、生成物を透析、
濾過および／またはクロマトグラフィーなどの標準精製
法を用いて精製する。好ましい精製法はダイアフィルト
レーション（diafiltration）である。精製および貯蔵
の間のスルフヒドリル基の再酸化を防ぐため、生成物を
不活性雰囲気下に維持して約０℃で酸素への暴露を排除
するのが好ましい。
反応を不活性雰囲気下で行う）において、リガンド（抗
体）をモル過剰のＤＴＴとともに約３０分〜約４時間、
好ましくは約３時間インキュベートする。ＤＴＴ／リガ
ンド比は、所望のスルフヒドリル基の数に応じて、約
１：１〜約２０：１、好ましくは約４：１〜約１０：
１、最も好ましくは約５：１〜約７：１の範囲であって
よい。酸素の存在下で行う還元に対しては、リガンドに
対するＤＴＴのモル比は、約５０：１〜約４００：１、
好ましくは約２００：１〜約３００：１の範囲であって
よい。後者の反応は、約２０℃〜約５０℃の温度（好ま
しい温度は約３７℃である）にて約１〜約４時間、好ま
しくは１.５時間行う。反応は、約６〜約８、好ましく
は約７〜７.５のｐＨで行う。ついで、生成物を透析、
濾過および／またはクロマトグラフィーなどの標準精製
法を用いて精製する。好ましい精製法はダイアフィルト
レーション（diafiltration）である。精製および貯蔵
の間のスルフヒドリル基の再酸化を防ぐため、生成物を
不活性雰囲気下に維持して約０℃で酸素への暴露を排除
するのが好ましい。
【００１７】式（Ｉａ）の最終結合体を調製するため、
上記還元された抗体を式（ＩＩｂ）のヒドラゾン中間体
と反応させる。この反応は、不活性雰囲気下、約０℃〜
約１０℃、好ましくは約４℃の温度にて約６〜約８、好
ましくは約７.５のｐＨで行う。免疫結合体またはチオ
エーテル結合体の精製は、透析、濾過またはクロマトグ
ラフィーなどの標準法を用いて行う。
上記還元された抗体を式（ＩＩｂ）のヒドラゾン中間体
と反応させる。この反応は、不活性雰囲気下、約０℃〜
約１０℃、好ましくは約４℃の温度にて約６〜約８、好
ましくは約７.５のｐＨで行う。免疫結合体またはチオ
エーテル結合体の精製は、透析、濾過またはクロマトグ
ラフィーなどの標準法を用いて行う。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、式
（Ｉ）：
（Ｉ）：
【化１９】 （式中、ｎは約１〜約１０の整数；ｑは約４〜約１０、
好ましくは７〜９の整数；ＭＡｂは、ＢＲ９６抗体を含
む免疫グロブリン（モノクローナルまたはポリクローナ
ル抗体、好ましくはモノクローナル抗体）リガンド）で
示される比較的純粋な形態のチオエーテル結合体の製造
方法であって、（ａ）約４〜約６.５、好ましくは約５
〜約６の範囲のｐＨを有するクエン酸緩衝溶液中の式
（ＩＩ）：
好ましくは７〜９の整数；ＭＡｂは、ＢＲ９６抗体を含
む免疫グロブリン（モノクローナルまたはポリクローナ
ル抗体、好ましくはモノクローナル抗体）リガンド）で
示される比較的純粋な形態のチオエーテル結合体の製造
方法であって、（ａ）約４〜約６.５、好ましくは約５
〜約６の範囲のｐＨを有するクエン酸緩衝溶液中の式
（ＩＩ）：
【化２０】 で示される免疫グロブリンチオエーテルを用意し、
（ｂ）上記クエン酸緩衝免疫グロブリンチオエーテル
（ＩＩ）を約６〜約１０、好ましくは約８〜約１０のｐ
Ｈを有するリン酸緩衝溶液で処理して約６〜約９、好ま
しくは約７〜約８のｐＨを有する免疫グロブリンチオエ
ーテルの緩衝溶液を得、（ｃ）還元工程において、上記
緩衝免疫グロブリンチオエーテルを約６〜約１０、好ま
しくは約７〜約８の範囲のｐＨを有する還元剤、好まし
くはジチオトレイトール（ＤＴＴ）のリン酸緩衝溶液で
アルゴンなどの不活性雰囲気下で処理して約６〜約９、
好ましくは約７〜約８の範囲のｐＨを有する式（ＩＩ
Ｉ）： ＭＡｂ−（ＳＨ）6〜9（好ましくは７〜９） の還元された免疫グロブリンチオエーテルの緩衝溶液を
生成させ、（ｄ）還元された形態の免疫グロブリンの上
記溶液を低温度、たとえば約−５〜約２５℃、好ましく
は約０℃にて不活性雰囲気下でダイアフィルトレーショ
ンし、（ｅ）上記ダイアフィルトレーション精製工程の
間に、還元された免疫グロブリンの緩衝溶液を任意に濃
縮し、（ｆ）結合工程において、上記還元された免疫グ
ロブリンのダイアフィルトレーションし精製した溶液を
式（ＩＶ）：
（ｂ）上記クエン酸緩衝免疫グロブリンチオエーテル
（ＩＩ）を約６〜約１０、好ましくは約８〜約１０のｐ
Ｈを有するリン酸緩衝溶液で処理して約６〜約９、好ま
しくは約７〜約８のｐＨを有する免疫グロブリンチオエ
ーテルの緩衝溶液を得、（ｃ）還元工程において、上記
緩衝免疫グロブリンチオエーテルを約６〜約１０、好ま
しくは約７〜約８の範囲のｐＨを有する還元剤、好まし
くはジチオトレイトール（ＤＴＴ）のリン酸緩衝溶液で
アルゴンなどの不活性雰囲気下で処理して約６〜約９、
好ましくは約７〜約８の範囲のｐＨを有する式（ＩＩ
Ｉ）： ＭＡｂ−（ＳＨ）6〜9（好ましくは７〜９） の還元された免疫グロブリンチオエーテルの緩衝溶液を
生成させ、（ｄ）還元された形態の免疫グロブリンの上
記溶液を低温度、たとえば約−５〜約２５℃、好ましく
は約０℃にて不活性雰囲気下でダイアフィルトレーショ
ンし、（ｅ）上記ダイアフィルトレーション精製工程の
間に、還元された免疫グロブリンの緩衝溶液を任意に濃
縮し、（ｆ）結合工程において、上記還元された免疫グ
ロブリンのダイアフィルトレーションし精製した溶液を
式（ＩＶ）：
【化２１】 （式中、ｎは前記と同じ）で示されるドキソルビシンヒ
ドラゾンの溶液と不活性雰囲気下で反応させて粗製のチ
オエーテル結合体（Ｉ）を生成させ、好ましくは、該反
応をアルゴン雰囲気下、約１０〜約６０分間行い、還元
された免疫グロブリンチオエーテルの各チオールに対し
て約１.０〜約１.５当量を与える量でドキソルビシンヒ
ドラゾンを用い、（ｇ）該チオエーテル結合体（Ｉ）を
精製し、ついで（ｈ）該チオエーテル結合体（Ｉ）を比
較的純粋な形態で回収することを特徴とする方法が提供
される。
ドラゾンの溶液と不活性雰囲気下で反応させて粗製のチ
オエーテル結合体（Ｉ）を生成させ、好ましくは、該反
応をアルゴン雰囲気下、約１０〜約６０分間行い、還元
された免疫グロブリンチオエーテルの各チオールに対し
て約１.０〜約１.５当量を与える量でドキソルビシンヒ
ドラゾンを用い、（ｇ）該チオエーテル結合体（Ｉ）を
精製し、ついで（ｈ）該チオエーテル結合体（Ｉ）を比
較的純粋な形態で回収することを特徴とする方法が提供
される。
【００１９】上記方法は、以下に詳細に記載する反応式
ＩＩＩおよびＩＶに概略を示してある。本発明の他の態
様において、チオエーテル結合体（Ｉ）を比較的純粋な
形態で調製するための第二の方法が提供され、該方法
は、（ａ）緩衝液交換反応において、クエン酸緩衝免疫
グロブリンチオエーテル（ＩＩ）（約５〜約６のｐＨ）
を約６〜約１０、好ましくは約６〜約９、さらに好まし
くは約７〜約８の範囲のｐＨを有するリン酸緩衝液の溶
液でダイアフィルトレーションして約６〜約９、好まし
くは約７〜約８の範囲のｐＨを有する免疫グロブリンチ
オエーテルのリン酸緩衝溶液を得、（ｂ）上記ダイアフ
ィルトレーション工程（ａ）の前または後に免疫グロブ
リンチオエーテルの溶液を任意に濃縮し、（ｃ）還元工
程において、上記免疫グロブリンチオエーテルのリン酸
緩衝溶液をジチオトレイトール（ＤＴＴ）や２−メルカ
プトエタノール、好ましくはジチオトレイトール（ＤＴ
Ｔ）などの還元剤のリン酸緩衝溶液（好ましくはＭＡ
ｂ：ＤＴＴ＝１：５のモル比）でアルゴンなどの不活性
雰囲気下で処理して、還元された免疫グロブリン（ＩＩ
Ｉ）の緩衝溶液を生成させ、（ｄ）上記還元された免疫
グロブリン（ＩＩＩ）のリン酸緩衝溶液をドキソルビシ
ンヒドラゾン（ＩＶ）の溶液とアルゴンなどの不活性雰
囲気下で反応させて粗製のチオエーテル結合体（Ｉ）を
生成させ、（ｅ）該粗製のチオエーテル結合体（Ｉ）を
精製し、ついで（ｆ）該チオエーテル結合体（Ｉ）を比
較的純粋な形態で回収することを特徴とする。
ＩＩＩおよびＩＶに概略を示してある。本発明の他の態
様において、チオエーテル結合体（Ｉ）を比較的純粋な
形態で調製するための第二の方法が提供され、該方法
は、（ａ）緩衝液交換反応において、クエン酸緩衝免疫
グロブリンチオエーテル（ＩＩ）（約５〜約６のｐＨ）
を約６〜約１０、好ましくは約６〜約９、さらに好まし
くは約７〜約８の範囲のｐＨを有するリン酸緩衝液の溶
液でダイアフィルトレーションして約６〜約９、好まし
くは約７〜約８の範囲のｐＨを有する免疫グロブリンチ
オエーテルのリン酸緩衝溶液を得、（ｂ）上記ダイアフ
ィルトレーション工程（ａ）の前または後に免疫グロブ
リンチオエーテルの溶液を任意に濃縮し、（ｃ）還元工
程において、上記免疫グロブリンチオエーテルのリン酸
緩衝溶液をジチオトレイトール（ＤＴＴ）や２−メルカ
プトエタノール、好ましくはジチオトレイトール（ＤＴ
Ｔ）などの還元剤のリン酸緩衝溶液（好ましくはＭＡ
ｂ：ＤＴＴ＝１：５のモル比）でアルゴンなどの不活性
雰囲気下で処理して、還元された免疫グロブリン（ＩＩ
Ｉ）の緩衝溶液を生成させ、（ｄ）上記還元された免疫
グロブリン（ＩＩＩ）のリン酸緩衝溶液をドキソルビシ
ンヒドラゾン（ＩＶ）の溶液とアルゴンなどの不活性雰
囲気下で反応させて粗製のチオエーテル結合体（Ｉ）を
生成させ、（ｅ）該粗製のチオエーテル結合体（Ｉ）を
精製し、ついで（ｆ）該チオエーテル結合体（Ｉ）を比
較的純粋な形態で回収することを特徴とする。
【００２０】上記反応法は、以下に詳細に記載する反応
式ＩＩＩおよびＶに示してある。反応式ＩＶおよびＶに
概略を示した方法のいずれにおいても、緩衝液、免疫グ
ロブリンチオエーテルおよび／または反応容器中に存在
するかもしれない金属不純物を除去するため、免疫グロ
ブリンチオエーテルのリン酸緩衝溶液をエチレンジアミ
ン四酢酸などのキレート化剤で任意に処理してよい。
式ＩＩＩおよびＶに示してある。反応式ＩＶおよびＶに
概略を示した方法のいずれにおいても、緩衝液、免疫グ
ロブリンチオエーテルおよび／または反応容器中に存在
するかもしれない金属不純物を除去するため、免疫グロ
ブリンチオエーテルのリン酸緩衝溶液をエチレンジアミ
ン四酢酸などのキレート化剤で任意に処理してよい。
【００２１】上記方法において、免疫グロブリンチオエ
ーテル（ＩＩ）のｐＨは、（ＩＩＩ）に還元する前に約
７〜約８に調節することが必須である。第一の方法（反
応式ＩＶ）においては、もともと（クエン酸緩衝液で）
約５〜約６の範囲であったチオエーテル（ＩＩ）のｐＨ
をリン酸緩衝液を添加することにより（リン酸緩衝液
で）約７〜約８の範囲に変え、この方法によって得られ
た還元されたチオエーテル（ＩＩＩ）を還元の前または
還元の間にクエン酸からリン酸への緩衝液交換に供する
が、第二の方法（反応式Ｖ）では、もともと（クエン酸
緩衝液で）約５〜約６の範囲であったチオエーテル（Ｉ
Ｉ）のｐＨを還元前のダイアフィルトレーション工程で
（リン酸緩衝液で）約７〜約８の範囲に変える。
ーテル（ＩＩ）のｐＨは、（ＩＩＩ）に還元する前に約
７〜約８に調節することが必須である。第一の方法（反
応式ＩＶ）においては、もともと（クエン酸緩衝液で）
約５〜約６の範囲であったチオエーテル（ＩＩ）のｐＨ
をリン酸緩衝液を添加することにより（リン酸緩衝液
で）約７〜約８の範囲に変え、この方法によって得られ
た還元されたチオエーテル（ＩＩＩ）を還元の前または
還元の間にクエン酸からリン酸への緩衝液交換に供する
が、第二の方法（反応式Ｖ）では、もともと（クエン酸
緩衝液で）約５〜約６の範囲であったチオエーテル（Ｉ
Ｉ）のｐＨを還元前のダイアフィルトレーション工程で
（リン酸緩衝液で）約７〜約８の範囲に変える。
【００２２】加えて、本発明によれば、粗製のチオエー
テル結合体（Ｉ）を、そのような物質を精製するのにか
つて用いられたことのない幾つかの異なる新規方法を用
いて精製する。精製のための第一の新規方法において
は、まず、粗製のチオエーテル結合体（Ｉ）を該溶液を
清澄化するためにたとえば酢酸セルロース膜を用いた濾
過に供し、ついで低温にて炭素または活性炭と混合し、
以下に詳細に記載するようにして濾過する。
テル結合体（Ｉ）を、そのような物質を精製するのにか
つて用いられたことのない幾つかの異なる新規方法を用
いて精製する。精製のための第一の新規方法において
は、まず、粗製のチオエーテル結合体（Ｉ）を該溶液を
清澄化するためにたとえば酢酸セルロース膜を用いた濾
過に供し、ついで低温にて炭素または活性炭と混合し、
以下に詳細に記載するようにして濾過する。
【００２３】精製のための第二の新規方法においては、
粗製のチオエーテル結合体（Ｉ）をバッチ法にてバイオ
−ビーズTM（ＢＩＯ−ＢＥＡＤＳTM）ＳＭ−２（疎水性
相互反応を促進するために使用、バイオ−ラド・ラボラ
トリーズ、リッチモンド、カリフォルニア州）で処理／
精製し、ついで濾過し、実質的に純粋な形態で回収す
る。精製のための第三の新規方法においては、粗製のチ
オエーテル結合体（Ｉ）をゲル濾過、イオン交換または
疎水性相互反応を用いたカラムクロマトグラフィーによ
り精製する。セファデックスTM（ＳＥＰＨＡＤＥＸTM）
Ｇ−２５（ゲル濾過媒体）がゲル濾過のための好ましい
媒体であり、ＣＭセファデックスTM（ ＳＥＰＨＡＤＥ
ＸTM）Ｃ−２５がイオン交換のための好ましい媒体であ
り、バイオ−ビーズTM（ＢＩＯ−ＢＥＡＤＳTM）が疎水
性相互反応のために好ましい。
粗製のチオエーテル結合体（Ｉ）をバッチ法にてバイオ
−ビーズTM（ＢＩＯ−ＢＥＡＤＳTM）ＳＭ−２（疎水性
相互反応を促進するために使用、バイオ−ラド・ラボラ
トリーズ、リッチモンド、カリフォルニア州）で処理／
精製し、ついで濾過し、実質的に純粋な形態で回収す
る。精製のための第三の新規方法においては、粗製のチ
オエーテル結合体（Ｉ）をゲル濾過、イオン交換または
疎水性相互反応を用いたカラムクロマトグラフィーによ
り精製する。セファデックスTM（ＳＥＰＨＡＤＥＸTM）
Ｇ−２５（ゲル濾過媒体）がゲル濾過のための好ましい
媒体であり、ＣＭセファデックスTM（ ＳＥＰＨＡＤＥ
ＸTM）Ｃ−２５がイオン交換のための好ましい媒体であ
り、バイオ−ビーズTM（ＢＩＯ−ＢＥＡＤＳTM）が疎水
性相互反応のために好ましい。
【００２４】精製のための第四の新規方法においては、
好ましくは再生酢酸セルロース膜を用いたアミコン撹拌
セル（Ａmicon Ｓtirred Ｃells）、再生酢酸セルロー
スカートリッジを用いたアミコンＣＨ２ＲＳダイアライ
ザー、またはポリエーテルスルホンカセットを用いたフ
ィルトロンセントラセット（Ｆiltron Ｃentrasette）
を用い、ダイアフィルトレーションまたは透析により粗
製のチオエーテル結合体（Ｉ）を精製する。精製はま
た、粗製のチオエーテル結合体（Ｉ）をポリスルホンま
たは親水化ポリアクリロニトリルに通すことによっても
行なうことができる。
好ましくは再生酢酸セルロース膜を用いたアミコン撹拌
セル（Ａmicon Ｓtirred Ｃells）、再生酢酸セルロー
スカートリッジを用いたアミコンＣＨ２ＲＳダイアライ
ザー、またはポリエーテルスルホンカセットを用いたフ
ィルトロンセントラセット（Ｆiltron Ｃentrasette）
を用い、ダイアフィルトレーションまたは透析により粗
製のチオエーテル結合体（Ｉ）を精製する。精製はま
た、粗製のチオエーテル結合体（Ｉ）をポリスルホンま
たは親水化ポリアクリロニトリルに通すことによっても
行なうことができる。
【００２５】加えて、本発明によれば、式（Ｉ）のチオ
エーテル結合体の調製に使用する中間体の製造方法が提
供され、該方法は、以下の反応式Ｉに概略が示されてお
り、以下の工程を包含する： （ａ）無水マレイン酸（Ａ）を式（Ｂ）： Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ （式中、ｎは約１〜約１０の整数、好ましくは５）で示
されるアミノ酸と弱有機酸、好ましくは酢酸の存在下で
反応させて式（Ｃ）：
エーテル結合体の調製に使用する中間体の製造方法が提
供され、該方法は、以下の反応式Ｉに概略が示されてお
り、以下の工程を包含する： （ａ）無水マレイン酸（Ａ）を式（Ｂ）： Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ （式中、ｎは約１〜約１０の整数、好ましくは５）で示
されるアミノ酸と弱有機酸、好ましくは酢酸の存在下で
反応させて式（Ｃ）：
【化２２】 で示される酸縮合生成物を生成させ、（ｂ）該酸（Ｃ）
を弱有機塩基、好ましくはトリエチルアミンおよび不活
性有機溶媒、好ましくはアセトニトリルの存在下でシリ
ル化剤、好ましくはクロロトリメチルシランなどの環化
剤で処理して式（Ｄ）：
を弱有機塩基、好ましくはトリエチルアミンおよび不活
性有機溶媒、好ましくはアセトニトリルの存在下でシリ
ル化剤、好ましくはクロロトリメチルシランなどの環化
剤で処理して式（Ｄ）：
【化２３】 で示される化合物（好ましくはマレイミドカプロン酸で
ある）を生成させ、（ｃ）該化合物（Ｄ）を結晶化に供
して環化し結晶化した酸（Ｄ）を生成させ、（ｄ）上記
環化し結晶化した酸（Ｄ）をＮ−メチルモルホリン、お
よびテトラヒドロフランなどの不活性有機溶媒、および
アルキルカルバゼート、好ましくはｔ−ブチルカルバゼ
ートの存在下、カップリング試薬、好ましくはクロロギ
酸イソブチルと反応させることによってカップリング反
応に供して式（Ｅ）：
ある）を生成させ、（ｃ）該化合物（Ｄ）を結晶化に供
して環化し結晶化した酸（Ｄ）を生成させ、（ｄ）上記
環化し結晶化した酸（Ｄ）をＮ−メチルモルホリン、お
よびテトラヒドロフランなどの不活性有機溶媒、および
アルキルカルバゼート、好ましくはｔ−ブチルカルバゼ
ートの存在下、カップリング試薬、好ましくはクロロギ
酸イソブチルと反応させることによってカップリング反
応に供して式（Ｅ）：
【化２４】 で示されるカルバゼート（Ｅ）を生成させ、ついで
（ｅ）酸、好ましくはトリフルオロ酢酸で処理すること
によってカルバゼート（Ｅ）を脱保護して式（Ｆ）：
（ｅ）酸、好ましくはトリフルオロ酢酸で処理すること
によってカルバゼート（Ｅ）を脱保護して式（Ｆ）：
【化２５】 で示される中間体ヒドラジド塩を生成させる。
【００２６】別法として、酸（Ｄ）はまた、氷酢酸また
はギ酸やプロピオン酸などの他の酸中の酸（Ｂ）の溶液
を氷酢酸中の無水マレイン酸（Ａ）の溶液とアルゴンや
窒素などの不活性雰囲気下で反応させて直接酸（Ｄ）を
生成させることによっても調製することができる。反応
式ＩＩからわかるように、ウイルナーらの米国特許出願
第８２４,９５１号（１９９２年１月２３日出願）に記
載されているようにして、ついでドキソルビシン・ＨＣ
ｌ（Ｇ）をヒドラジド塩（Ｆ）と縮合させてドキソルビ
シンヒドラゾン（ＩＶ）を生成させる。本発明の方法
は、以下に示す反応式Ｉ〜Ｖ（本発明の好ましい態様を
例示する）に従って行うことができる。
はギ酸やプロピオン酸などの他の酸中の酸（Ｂ）の溶液
を氷酢酸中の無水マレイン酸（Ａ）の溶液とアルゴンや
窒素などの不活性雰囲気下で反応させて直接酸（Ｄ）を
生成させることによっても調製することができる。反応
式ＩＩからわかるように、ウイルナーらの米国特許出願
第８２４,９５１号（１９９２年１月２３日出願）に記
載されているようにして、ついでドキソルビシン・ＨＣ
ｌ（Ｇ）をヒドラジド塩（Ｆ）と縮合させてドキソルビ
シンヒドラゾン（ＩＶ）を生成させる。本発明の方法
は、以下に示す反応式Ｉ〜Ｖ（本発明の好ましい態様を
例示する）に従って行うことができる。
【００２７】反応式Ｉ
【化２６】
【００２８】反応式ＩＩ
【化２７】
【００２９】反応式ＩＩＩ
【化２８】 結合体Ｉ
【化２９】
【００３０】反応式ＩＶ 結合法（Ｉ）
【化３０】
【００３１】反応式Ｖ 結合法（ＩＩ）
【化３１】
【００３２】反応式Ｉからわかるように、出発物質のヒ
ドラジド塩（Ｆ）の調製は、酢酸、ギ酸またはプロピオ
ン酸などの弱酸、好ましくは酢酸中の無水マレイン酸
（Ａ）の溶液を、酢酸または化合物（Ａ）が溶解する他
の酸のいずれかなどの弱い有機酸、好ましくは酢酸中の
アミノ酸（Ｂ）（６−アミノカプロン酸（式（Ｂ）にお
いてｎが５）であるのが好ましい）の溶液と反応させて
二酸（diacid）（Ｃ）を生成させることにより行う。上
記反応は、約５：１〜約０.５：１、好ましくは約２：
１〜約１：１の範囲のＢ：Ａのモル比、および約１〜約
１０時間、好ましくは約３〜約５時間の範囲の反応時間
を用いて行う。
ドラジド塩（Ｆ）の調製は、酢酸、ギ酸またはプロピオ
ン酸などの弱酸、好ましくは酢酸中の無水マレイン酸
（Ａ）の溶液を、酢酸または化合物（Ａ）が溶解する他
の酸のいずれかなどの弱い有機酸、好ましくは酢酸中の
アミノ酸（Ｂ）（６−アミノカプロン酸（式（Ｂ）にお
いてｎが５）であるのが好ましい）の溶液と反応させて
二酸（diacid）（Ｃ）を生成させることにより行う。上
記反応は、約５：１〜約０.５：１、好ましくは約２：
１〜約１：１の範囲のＢ：Ａのモル比、および約１〜約
１０時間、好ましくは約３〜約５時間の範囲の反応時間
を用いて行う。
【００３３】アセトニトリル、ジエチルエーテル、テト
ラヒドロフラン、ジメチルホルムアミドまたはトルエン
などの不活性有機溶媒中に溶解した二酸（Ｃ）を、クロ
ロトリメチルシラン（ＴＭＳＣｌ）、ヘキサメチルジシ
ラザンまたは同様のシリル化剤などの環化剤、好ましく
はクロロトリメチルシラン、およびトリエチルアミンま
たはジイソプロピルエチルアミンなどの弱い有機塩基、
好ましくはトリエチルアミンで処理する。上記環化反応
は、約１０：１〜約１：１、好ましくは約５：１〜約
３：１の範囲の環化剤：二酸（Ｃ）のモル比を用い、約
２５〜約１１０℃、好ましくは約５０〜約９０℃の範囲
の温度にて約１〜約１０時間、好ましくは約３〜約５時
間行う。
ラヒドロフラン、ジメチルホルムアミドまたはトルエン
などの不活性有機溶媒中に溶解した二酸（Ｃ）を、クロ
ロトリメチルシラン（ＴＭＳＣｌ）、ヘキサメチルジシ
ラザンまたは同様のシリル化剤などの環化剤、好ましく
はクロロトリメチルシラン、およびトリエチルアミンま
たはジイソプロピルエチルアミンなどの弱い有機塩基、
好ましくはトリエチルアミンで処理する。上記環化反応
は、約１０：１〜約１：１、好ましくは約５：１〜約
３：１の範囲の環化剤：二酸（Ｃ）のモル比を用い、約
２５〜約１１０℃、好ましくは約５０〜約９０℃の範囲
の温度にて約１〜約１０時間、好ましくは約３〜約５時
間行う。
【００３４】得られた酸（Ｄ）（マレイミドカプロン酸
が好ましい）は、カラムクロマトグラフィーの必要なく
実質的に純粋な形態で単離することができる。好ましい
単離法は、たとえば酢酸エチルとヘキサン、またはアセ
トンとイソプロピルエーテルを用いた結晶化である。別
法として、酸（Ｄ）はまた、氷酢酸、ギ酸またはプロピ
オン酸、好ましくは氷酢酸中の無水マレイン酸（Ａ）の
溶液、および氷酢酸、ギ酸、プロピオン酸または無水酢
酸、好ましくは氷酢酸中のアミノ酸（Ｂ）の溶液をアル
ゴンまたは窒素などの不活性雰囲気下、好ましくはアル
ゴン下で反応させることにより１工程で調製することも
できる。化合物（Ａ）および（Ｂ）は、酸（Ｄ）の調製
のための上記２工程法に記載したモル比で用いる。この
反応は、約２５〜約１５０℃、好ましくは約１００〜約
１２５℃の範囲の温度にて約１〜約１０時間、好ましく
は約３〜約５時間行う。
が好ましい）は、カラムクロマトグラフィーの必要なく
実質的に純粋な形態で単離することができる。好ましい
単離法は、たとえば酢酸エチルとヘキサン、またはアセ
トンとイソプロピルエーテルを用いた結晶化である。別
法として、酸（Ｄ）はまた、氷酢酸、ギ酸またはプロピ
オン酸、好ましくは氷酢酸中の無水マレイン酸（Ａ）の
溶液、および氷酢酸、ギ酸、プロピオン酸または無水酢
酸、好ましくは氷酢酸中のアミノ酸（Ｂ）の溶液をアル
ゴンまたは窒素などの不活性雰囲気下、好ましくはアル
ゴン下で反応させることにより１工程で調製することも
できる。化合物（Ａ）および（Ｂ）は、酸（Ｄ）の調製
のための上記２工程法に記載したモル比で用いる。この
反応は、約２５〜約１５０℃、好ましくは約１００〜約
１２５℃の範囲の温度にて約１〜約１０時間、好ましく
は約３〜約５時間行う。
【００３５】環化酸（Ｄ）を以下のようにしてカップリ
ング反応に供してカルバゼート（Ｅ）を生成させる：約
−１５〜約１５℃、好ましくは約０〜約４℃の範囲の低
温度のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジエチルエーテ
ルまたはアセトニトリルなどの無水不活性有機溶媒中の
酸（Ｄ）の溶液を、酸（Ｄ）の場合に列挙したものなど
の無水溶媒、好ましくはＴＨＦ中の４−メチルモルホリ
ン、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミ
ンの溶液、および酸（Ｄ）の場合に列挙したものなどの
無水溶媒、好ましくはＴＨＦ中の約−５〜約５℃、好ま
しくは約０〜約４℃の範囲の温度のクロロギ酸イソブチ
ルまたはピバロイルクロライドなどのクロロギ酸アルキ
ルの溶液で処理する。その後、酸（Ｄ）の場合に列挙し
たものなどの無水溶媒、好ましくはＴＨＦ中のアルキル
カルバゼート、好ましくはｔ−ブチルカルバゼートの溶
液を上記反応混合物に加える。この反応は、約０〜約２
５℃、好ましくは約４〜約２５℃の範囲の温度にて約１
０〜約３０時間、好ましくは約１０〜約２４時間行う。
４−メチルモルホリンまたはその等価物、クロロギ酸ア
ルキルおよびアルキルカルバゼートは、それぞれ独立に
約０.５：１〜約５：１、好ましくは約２：１〜約１：
１の範囲の酸（Ｄ）に対するモル比で用いられる。カル
バゼート（Ｅ）は、酢酸エチルとヘキサンまたは他の混
合溶媒で結晶化することにより単離することができる。
ング反応に供してカルバゼート（Ｅ）を生成させる：約
−１５〜約１５℃、好ましくは約０〜約４℃の範囲の低
温度のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジエチルエーテ
ルまたはアセトニトリルなどの無水不活性有機溶媒中の
酸（Ｄ）の溶液を、酸（Ｄ）の場合に列挙したものなど
の無水溶媒、好ましくはＴＨＦ中の４−メチルモルホリ
ン、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミ
ンの溶液、および酸（Ｄ）の場合に列挙したものなどの
無水溶媒、好ましくはＴＨＦ中の約−５〜約５℃、好ま
しくは約０〜約４℃の範囲の温度のクロロギ酸イソブチ
ルまたはピバロイルクロライドなどのクロロギ酸アルキ
ルの溶液で処理する。その後、酸（Ｄ）の場合に列挙し
たものなどの無水溶媒、好ましくはＴＨＦ中のアルキル
カルバゼート、好ましくはｔ−ブチルカルバゼートの溶
液を上記反応混合物に加える。この反応は、約０〜約２
５℃、好ましくは約４〜約２５℃の範囲の温度にて約１
０〜約３０時間、好ましくは約１０〜約２４時間行う。
４−メチルモルホリンまたはその等価物、クロロギ酸ア
ルキルおよびアルキルカルバゼートは、それぞれ独立に
約０.５：１〜約５：１、好ましくは約２：１〜約１：
１の範囲の酸（Ｄ）に対するモル比で用いられる。カル
バゼート（Ｅ）は、酢酸エチルとヘキサンまたは他の混
合溶媒で結晶化することにより単離することができる。
【００３６】ついで、得られたカルバゼート（Ｅ）をト
リフルオロ酢酸、塩酸、ｐ−トルエンスルホン酸または
臭化水素酸などの酸と約−１５〜約２５℃、好ましくは
約０〜約４℃の範囲の温度にて約１〜約２４時間、好ま
しくは約２〜約５時間反応させることにより脱保護す
る。好ましいマレイミドカプロイルヒドラジドＴＦＡ塩
の単離は、ｔ−ブチルメチルエーテルまたはジエチルエ
ーテルで沈殿させることにより行うことができる。
リフルオロ酢酸、塩酸、ｐ−トルエンスルホン酸または
臭化水素酸などの酸と約−１５〜約２５℃、好ましくは
約０〜約４℃の範囲の温度にて約１〜約２４時間、好ま
しくは約２〜約５時間反応させることにより脱保護す
る。好ましいマレイミドカプロイルヒドラジドＴＦＡ塩
の単離は、ｔ−ブチルメチルエーテルまたはジエチルエ
ーテルで沈殿させることにより行うことができる。
【００３７】反応式ＩＩを参照すると、ドキソルビシン
のヒドラゾン（ＩＶ）の調製は、ドキソルビシン塩酸塩
（Ｇ）、ヒドラジド塩（Ｆ）（好ましくはマレイミドカ
プロイルヒドラジド塩）、およびメタノール、エタノー
ルまたはイソプロパノールなどのアルコール、好ましく
はメタノール中のトリフルオロ酢酸、塩酸または酢酸な
どの酸、好ましくはトリフルオロ酢酸を暗所、アルゴン
または窒素などの不活性雰囲気下、好ましくはアルゴン
下で反応させることにより行う。この反応は、約１〜約
１０時間、好ましくは約３〜約５時間行う。
のヒドラゾン（ＩＶ）の調製は、ドキソルビシン塩酸塩
（Ｇ）、ヒドラジド塩（Ｆ）（好ましくはマレイミドカ
プロイルヒドラジド塩）、およびメタノール、エタノー
ルまたはイソプロパノールなどのアルコール、好ましく
はメタノール中のトリフルオロ酢酸、塩酸または酢酸な
どの酸、好ましくはトリフルオロ酢酸を暗所、アルゴン
または窒素などの不活性雰囲気下、好ましくはアルゴン
下で反応させることにより行う。この反応は、約１〜約
１０時間、好ましくは約３〜約５時間行う。
【００３８】ドキソルビシンヒドラゾン生成物（ＩＶ）
は、酢酸エチル、アセトニトリルまたはテトラヒドロフ
ランなどを低下温度、たとえば約０〜約１０℃、好まし
くは約２〜約４℃の範囲の温度で加えることにより直接
沈殿させることにより単離することができ、濾過により
回収し、生成物をメタノール／酢酸エチル混合物などの
***媒ついでアセトニトリルで洗浄し、真空下で乾燥さ
せることができる。つぎに、反応式ＩＩＩおよびＩＶを
参照すると、式（Ｉ）のドキソルビシンＢＲ９６結合体
は本発明の方法の第一の態様において以下にようにして
調製される：
は、酢酸エチル、アセトニトリルまたはテトラヒドロフ
ランなどを低下温度、たとえば約０〜約１０℃、好まし
くは約２〜約４℃の範囲の温度で加えることにより直接
沈殿させることにより単離することができ、濾過により
回収し、生成物をメタノール／酢酸エチル混合物などの
***媒ついでアセトニトリルで洗浄し、真空下で乾燥さ
せることができる。つぎに、反応式ＩＩＩおよびＩＶを
参照すると、式（Ｉ）のドキソルビシンＢＲ９６結合体
は本発明の方法の第一の態様において以下にようにして
調製される：
【００３９】約８〜約１０、好ましくは約８.５〜約９.
５の範囲のｐＨを有するアルカリ金属リン酸塩、二塩基
性リン酸ナトリウムの溶液（Ｎａ2ＨＰＯ4を注射用水
（ＷＦＩ）中に溶解することにより調製）を、クエン酸
緩衝液（ＣＢＳ）（好ましくは約１０〜約７５ｍＭのク
エン酸ナトリウムおよび約５０〜約５００ｍＭの塩化ナ
トリウム）中のモノクローナル抗体ＢＲ９６（式（Ｉ
Ｉ））の溶液に加える。上記クエン酸緩衝液（ＣＢＳ）
は約４〜約６.５、好ましくは約５〜約６.５、さらに好
ましくは約５〜約６の範囲のｐＨを有し、約６〜約９、
好ましくは約７〜約８の範囲のｐＨを有するＢＲ９６Ｍ
Ａｂの溶液を与えるであろう。得られたＢＲ９６ＭＡｂ
の溶液にアルゴンをパージしてＯ2含量を約１０％未
満、好ましくは約５％未満に下げる。
５の範囲のｐＨを有するアルカリ金属リン酸塩、二塩基
性リン酸ナトリウムの溶液（Ｎａ2ＨＰＯ4を注射用水
（ＷＦＩ）中に溶解することにより調製）を、クエン酸
緩衝液（ＣＢＳ）（好ましくは約１０〜約７５ｍＭのク
エン酸ナトリウムおよび約５０〜約５００ｍＭの塩化ナ
トリウム）中のモノクローナル抗体ＢＲ９６（式（Ｉ
Ｉ））の溶液に加える。上記クエン酸緩衝液（ＣＢＳ）
は約４〜約６.５、好ましくは約５〜約６.５、さらに好
ましくは約５〜約６の範囲のｐＨを有し、約６〜約９、
好ましくは約７〜約８の範囲のｐＨを有するＢＲ９６Ｍ
Ａｂの溶液を与えるであろう。得られたＢＲ９６ＭＡｂ
の溶液にアルゴンをパージしてＯ2含量を約１０％未
満、好ましくは約５％未満に下げる。
【００４０】リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中のジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）または２−メルカプトエタノールなど
の還元剤、好ましくはジチオトレイトール（ＤＴＴ）の
溶液を調製する。上記ＰＢＳ緩衝液は、約６〜約１０、
好ましくは約７〜約８の範囲のｐＨを有し、約１〜約２
５ｍＭのリン酸ナトリウムおよび約５０〜約２５０ｍＭ
の塩化ナトリウム（約０.００５Ｍ〜約０.０２Ｍのリン
酸ナトリウムおよび約０.０５Ｍ〜約０.２Ｍの塩化ナト
リウム）から生成されるであろう（約１〜約５ｍＭのＮ
ａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ、約５〜約１５ｍＭのＮａ2ＨＰ
Ｏ4、約５０〜約２００ｍＭのＮａＣｌ 全量１リットルの水 約７.０〜約８.０のｐＨが達成されるまで添加した１Ｎ
ＮａＯＨから調製）。
トール（ＤＴＴ）または２−メルカプトエタノールなど
の還元剤、好ましくはジチオトレイトール（ＤＴＴ）の
溶液を調製する。上記ＰＢＳ緩衝液は、約６〜約１０、
好ましくは約７〜約８の範囲のｐＨを有し、約１〜約２
５ｍＭのリン酸ナトリウムおよび約５０〜約２５０ｍＭ
の塩化ナトリウム（約０.００５Ｍ〜約０.０２Ｍのリン
酸ナトリウムおよび約０.０５Ｍ〜約０.２Ｍの塩化ナト
リウム）から生成されるであろう（約１〜約５ｍＭのＮ
ａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ、約５〜約１５ｍＭのＮａ2ＨＰ
Ｏ4、約５０〜約２００ｍＭのＮａＣｌ 全量１リットルの水 約７.０〜約８.０のｐＨが達成されるまで添加した１Ｎ
ＮａＯＨから調製）。
【００４１】別法として、リン酸緩衝液はまた、約５０
〜約２００ｍＭ（約０.０４〜約０.４重量％）のＫＣ
ｌ、約５〜約１５ｍＭ（約０.４〜約４重量％）のＮａ2
ＨＰＯ4、約１〜約５ｍＭ（約０.０４〜約０.４重量
％）のＫＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ、全量１リットルの水、約７
〜約８のｐＨが達成されるまで添加した１Ｎ ＫＯＨか
ら生成されていてよい。
〜約２００ｍＭ（約０.０４〜約０.４重量％）のＫＣ
ｌ、約５〜約１５ｍＭ（約０.４〜約４重量％）のＮａ2
ＨＰＯ4、約１〜約５ｍＭ（約０.０４〜約０.４重量
％）のＫＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ、全量１リットルの水、約７
〜約８のｐＨが達成されるまで添加した１Ｎ ＫＯＨか
ら生成されていてよい。
【００４２】リン酸緩衝液中の還元剤、好ましくはＤＴ
Ｔの溶液を、ＢＲ９６ＭＡｂ（ＩＩ）の溶液と、約１
０：１〜約５：１、好ましくは約９：１〜約６：１の範
囲の還元剤：ＢＲ９６ＭＡｂ（ＩＩ）の比で約２５〜約
４５℃、好ましくは約３０〜約４０℃の温度にて約１〜
約５時間、好ましくは約２〜約３時間反応させる。上記
反応は、不活性雰囲気下、好ましくはアルゴン下で行
う。得られた還元されたＢＲ９６ＭＡｂ（ＩＩＩ）： ＭＡｂ−（ＳＨ）7〜9 をアルゴンパージしたリン酸緩衝液と混合し、ついでウ
オーターズ（Ｗaters）、アミコン（Ａmicon）またはフ
ィルトロン（Ｆiltron）ダイアフィルトレーション系を
用いてダイアフィルトレーション／濃縮に供して不純物
を除去する。
Ｔの溶液を、ＢＲ９６ＭＡｂ（ＩＩ）の溶液と、約１
０：１〜約５：１、好ましくは約９：１〜約６：１の範
囲の還元剤：ＢＲ９６ＭＡｂ（ＩＩ）の比で約２５〜約
４５℃、好ましくは約３０〜約４０℃の温度にて約１〜
約５時間、好ましくは約２〜約３時間反応させる。上記
反応は、不活性雰囲気下、好ましくはアルゴン下で行
う。得られた還元されたＢＲ９６ＭＡｂ（ＩＩＩ）： ＭＡｂ−（ＳＨ）7〜9 をアルゴンパージしたリン酸緩衝液と混合し、ついでウ
オーターズ（Ｗaters）、アミコン（Ａmicon）またはフ
ィルトロン（Ｆiltron）ダイアフィルトレーション系を
用いてダイアフィルトレーション／濃縮に供して不純物
を除去する。
【００４３】ついで、精製し還元したＢＲ９６ＭＡｂを
アルゴンなどの不活性雰囲気下、約−５〜約２５℃、好
ましくは約０〜約５℃の温度にて約１：４〜約１：１
１、好ましくは約１：８〜約１：１０の範囲の還元され
たＢＲ９６ＭＡｂ：ドキソルビシンヒドラゾン（ＩＶ）
のモル比でドキソルビシンヒドラゾン（ＩＶ）との結合
に供する。反応式ＩＩＩおよびＶを参照すると、式
（Ｉ）のドキソルビシンＢＲ９６結合体は本発明の方法
の第二の態様において以下のようにして調製される：
アルゴンなどの不活性雰囲気下、約−５〜約２５℃、好
ましくは約０〜約５℃の温度にて約１：４〜約１：１
１、好ましくは約１：８〜約１：１０の範囲の還元され
たＢＲ９６ＭＡｂ：ドキソルビシンヒドラゾン（ＩＶ）
のモル比でドキソルビシンヒドラゾン（ＩＶ）との結合
に供する。反応式ＩＩＩおよびＶを参照すると、式
（Ｉ）のドキソルビシンＢＲ９６結合体は本発明の方法
の第二の態様において以下のようにして調製される：
【００４４】クエン酸緩衝食塩水（ＣＢＳ）（本発明の
方法の第一の態様に関して記載したもの）（該クエン酸
緩衝液は約４〜約６、好ましくは約５.０〜約５.５の範
囲のｐＨを有する）中のＢＲ９６ＭＡｂ（ＩＩ）の溶液
を、本明細書に記載する透析膜、好ましくはフィルトロ
ンミニセット（Ｍinisette）を用いたリン酸緩衝液（Ｐ
ＢＳ）（本発明の方法の第一の態様に関して記載したも
の）を用いたダイアフィルトレーションに供する（約
０.５：１〜約０.１２５：１、好ましくは約０.３３：
１〜約０.２：１の範囲のクエン酸緩衝ＢＲ９６ＭＡ
ｂ：リン酸緩衝液の１：５比を用いる）。得られたリン
酸緩衝ＢＲ９６ＭＡｂ（ＩＩ）（約５〜１５ｍｇ／ｍｌ
の濃度を有する）を還元剤、好ましくはリン酸緩衝液中
のジチオトレイトール（ＤＴＴ）の溶液で処理する（約
０.１：１〜約１：１、好ましくは約０.１２：１〜約
０.２：１の範囲の（ＩＩ）：ＤＴＴのモル比を用い
る）。上記反応は、約２５〜約４５℃、好ましくは約３
０〜約４０℃の温度にてアルゴンなどの不活性雰囲気
下、約１〜約６時間、好ましくは約３〜約４時間行う。
方法の第一の態様に関して記載したもの）（該クエン酸
緩衝液は約４〜約６、好ましくは約５.０〜約５.５の範
囲のｐＨを有する）中のＢＲ９６ＭＡｂ（ＩＩ）の溶液
を、本明細書に記載する透析膜、好ましくはフィルトロ
ンミニセット（Ｍinisette）を用いたリン酸緩衝液（Ｐ
ＢＳ）（本発明の方法の第一の態様に関して記載したも
の）を用いたダイアフィルトレーションに供する（約
０.５：１〜約０.１２５：１、好ましくは約０.３３：
１〜約０.２：１の範囲のクエン酸緩衝ＢＲ９６ＭＡ
ｂ：リン酸緩衝液の１：５比を用いる）。得られたリン
酸緩衝ＢＲ９６ＭＡｂ（ＩＩ）（約５〜１５ｍｇ／ｍｌ
の濃度を有する）を還元剤、好ましくはリン酸緩衝液中
のジチオトレイトール（ＤＴＴ）の溶液で処理する（約
０.１：１〜約１：１、好ましくは約０.１２：１〜約
０.２：１の範囲の（ＩＩ）：ＤＴＴのモル比を用い
る）。上記反応は、約２５〜約４５℃、好ましくは約３
０〜約４０℃の温度にてアルゴンなどの不活性雰囲気
下、約１〜約６時間、好ましくは約３〜約４時間行う。
【００４５】ついで、還元されたＢＲ９６ＭＡｂ（ＩＩ
Ｉ）を上記第一の態様に関して記載した（反応式ＩＶ）
のと同様にしてドキソルビシンヒドラゾン（ＩＶ）と反
応させて粗製の結合体（Ｉ）（本明細書の記載に従って
精製することができる）を生成させる。上記から明らか
なように、本発明の方法の第一の態様では、免疫グロブ
リンチオエーテル（ＩＩ）を還元した後、還元された抗
体（ＩＩＩ）をドキソルビシンヒドラゾン（ＩＶ）と結
合する前に緩衝液交換（リン酸緩衝液による処理）およ
び精製に供するが、本発明の方法の第二の態様では、免
疫グロブリンチオエーテル（ＩＩ）を（ＩＩＩ）に還元
した後、ヒドラゾン（ＩＶ）との結合工程を直接進行さ
せる。
Ｉ）を上記第一の態様に関して記載した（反応式ＩＶ）
のと同様にしてドキソルビシンヒドラゾン（ＩＶ）と反
応させて粗製の結合体（Ｉ）（本明細書の記載に従って
精製することができる）を生成させる。上記から明らか
なように、本発明の方法の第一の態様では、免疫グロブ
リンチオエーテル（ＩＩ）を還元した後、還元された抗
体（ＩＩＩ）をドキソルビシンヒドラゾン（ＩＶ）と結
合する前に緩衝液交換（リン酸緩衝液による処理）およ
び精製に供するが、本発明の方法の第二の態様では、免
疫グロブリンチオエーテル（ＩＩ）を（ＩＩＩ）に還元
した後、ヒドラゾン（ＩＶ）との結合工程を直接進行さ
せる。
【００４６】本発明の方法の第二の態様は、クエン酸緩
衝免疫グロブリンチオエーテル（ＩＩ）の濃縮を任意に
包含していてよく、該濃縮は、所望の濃度、好ましくは
約１０ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌの範囲の免疫グロ
ブリンチオエーテルの濃度を達成するに必要なだけダイ
アフィルトレーション（透析）工程を継続することによ
って行う。第二の態様において、使用する還元剤（ＤＴ
Ｔ）の量を減らすかわりに反応を完了させるための時間
を長くすることができることも注意すべきである。
衝免疫グロブリンチオエーテル（ＩＩ）の濃縮を任意に
包含していてよく、該濃縮は、所望の濃度、好ましくは
約１０ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌの範囲の免疫グロ
ブリンチオエーテルの濃度を達成するに必要なだけダイ
アフィルトレーション（透析）工程を継続することによ
って行う。第二の態様において、使用する還元剤（ＤＴ
Ｔ）の量を減らすかわりに反応を完了させるための時間
を長くすることができることも注意すべきである。
【００４７】本発明によれば、反応式ＩＶおよびＶで得
られた粗製の結合体（Ｉ）は、活性炭、カラムクロマト
グラフィー、透析および／またはバイオ−ビーズTMの使
用を含む本明細書に記載する技術のいずれかにより精製
することができる。たとえば、粗製の結合体を酢酸セル
ロース膜で濾過することによって清澄化し、ついでアル
ゴンなどの不活性雰囲気下、約０〜約２０℃、好ましく
は約０〜約５℃の範囲の温度にて処理することができ
る。
られた粗製の結合体（Ｉ）は、活性炭、カラムクロマト
グラフィー、透析および／またはバイオ−ビーズTMの使
用を含む本明細書に記載する技術のいずれかにより精製
することができる。たとえば、粗製の結合体を酢酸セル
ロース膜で濾過することによって清澄化し、ついでアル
ゴンなどの不活性雰囲気下、約０〜約２０℃、好ましく
は約０〜約５℃の範囲の温度にて処理することができ
る。
【００４８】本発明に使用するのに適した活性炭の例と
しては以下のものが挙げられる： １．ノリットTM（ＮＯＲＩＴTM）ＳＸ−３（好ましい） ２．ダルコTM（ＤＡＲＣＯTM）Ｇ６０ ３．ＡＤＰTMプルベライズド（ＰＵＬＶＥＲＩＺＥＤ） ４．ノリットTMＡスープラ（ＳＵＰＲＡ） ５．ノリットTMＢスープラ ６．ノリットTMＵＳＰ２２
しては以下のものが挙げられる： １．ノリットTM（ＮＯＲＩＴTM）ＳＸ−３（好ましい） ２．ダルコTM（ＤＡＲＣＯTM）Ｇ６０ ３．ＡＤＰTMプルベライズド（ＰＵＬＶＥＲＩＺＥＤ） ４．ノリットTMＡスープラ（ＳＵＰＲＡ） ５．ノリットTMＢスープラ ６．ノリットTMＵＳＰ２２
【００４９】別法として、本発明によれば、粗製の結合
体（Ｉ）は以下のいずれかを用いたダイアフィルトレー
ションまたは透析により精製することができる：ダイアフィルトレーション １．小スケール（＜３.０ｇスケール） （ａ）再生酢酸セルロース膜を用いたアミコン撹拌セル （ｂ）ポリエーテルスルホン膜を用いたフィルトロン撹
拌セル（Ｆiltron Ｓtirred Ｃells） ２．大スケール（＞３.０ｇスケール） （ａ）再生酢酸セルローススパイラル（Ｓpiral）カー
トリッジを用いたアミコンＣＨ２ＲＳダイアライザー
（好ましい） （ｂ）再生酢酸セルローススパイラルカートリッジを用
いたアミコンＤＣ１０Ｌダイアライザー （ｃ）ポリエーテルスルホンカセットを用いたフィルト
ロンミニセット （ｄ）ポリエーテルスルホンカセットを用いたフィルト
ロンセントラセット
体（Ｉ）は以下のいずれかを用いたダイアフィルトレー
ションまたは透析により精製することができる：ダイアフィルトレーション １．小スケール（＜３.０ｇスケール） （ａ）再生酢酸セルロース膜を用いたアミコン撹拌セル （ｂ）ポリエーテルスルホン膜を用いたフィルトロン撹
拌セル（Ｆiltron Ｓtirred Ｃells） ２．大スケール（＞３.０ｇスケール） （ａ）再生酢酸セルローススパイラル（Ｓpiral）カー
トリッジを用いたアミコンＣＨ２ＲＳダイアライザー
（好ましい） （ｂ）再生酢酸セルローススパイラルカートリッジを用
いたアミコンＤＣ１０Ｌダイアライザー （ｃ）ポリエーテルスルホンカセットを用いたフィルト
ロンミニセット （ｄ）ポリエーテルスルホンカセットを用いたフィルト
ロンセントラセット
【００５０】結合体（Ｉ）のダイアフィルトレーション
は、アルゴン雰囲気下、約０〜約２５℃の範囲の温度に
て行う。加えて、本発明によれば、粗製の結合体（Ｉ）
の精製はまた、カラムクロマトグラフィーまたは好まし
くはバッチ法においてバイオ−ビーズTMを用いることに
より行うことができ、その際、粗製の結合体および好ま
しくはバイオ−ビーズTMＳＭ−２（ポリスチレンジビニ
ルベンゼン，バイオ−ラド・ラボラトリーズ）をアルゴ
ンなどの不活性雰囲気下、約０〜約２５℃、好ましくは
約０〜約５℃の温度にて約５〜約１２０分、好ましくは
約１０〜約３０分一緒に撹拌する。
は、アルゴン雰囲気下、約０〜約２５℃の範囲の温度に
て行う。加えて、本発明によれば、粗製の結合体（Ｉ）
の精製はまた、カラムクロマトグラフィーまたは好まし
くはバッチ法においてバイオ−ビーズTMを用いることに
より行うことができ、その際、粗製の結合体および好ま
しくはバイオ−ビーズTMＳＭ−２（ポリスチレンジビニ
ルベンゼン，バイオ−ラド・ラボラトリーズ）をアルゴ
ンなどの不活性雰囲気下、約０〜約２５℃、好ましくは
約０〜約５℃の温度にて約５〜約１２０分、好ましくは
約１０〜約３０分一緒に撹拌する。
【００５１】さらに、本発明によれば、粗製の結合体
（Ｉ）はまた、以下のカラムクロマトグラフィーを用い
て精製することができる。 Ｉ．以下のいずれかのゲルを用いたゲル濾過： １．セファデックスTM（ＳＥＰＨＡＤＥＸTM）Ｇ−２５
ミーディアム（ＭＥＤＩＵＭ） ２．セファデックスTMＧ−５０ミーディアム ３．セファデックスTMＧ−２５スーパーファイン（ＳＵ
ＰＥＲ ＦＩＮＥ）（ＳＦ） ４．セファクリルTM（ＳＥＰＨＡＣＲＹＬTM）Ｓ−１０
０ＨＲ ５．スーパーローズTM（ＳＵＰＥＲＯＳＥTM）１２ＰＧ ６．ウルトラゲルTM（ＵＬＴＲＡＧＥＬTM）ＡｃＡ２０
２ ７．トリスアクリルTM（ＴＲＹＳＡＣＲＹＬTM）ＧＦ０
５； ＩＩ．以下のいずれかのゲルを用いたイオン交換： １．ＣＭセファロースTM（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥTM）ファ
ーストフロー（ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ） ２．ＣＭセファデックスTMＧ−２５ ３．ＣＭセファデックスTMＧ−５０；または ＩＩＩ．以下のいずれかを用いた疎水性相互反応： １．バイオ−ビーズTMＳＭ−２ ２．バイオ−ビーズTMＳＭ−７ ３．バイオ−ビーズTMＳＭ−１６ ４．フェニルセファロースTM６ファーストフロー
（Ｉ）はまた、以下のカラムクロマトグラフィーを用い
て精製することができる。 Ｉ．以下のいずれかのゲルを用いたゲル濾過： １．セファデックスTM（ＳＥＰＨＡＤＥＸTM）Ｇ−２５
ミーディアム（ＭＥＤＩＵＭ） ２．セファデックスTMＧ−５０ミーディアム ３．セファデックスTMＧ−２５スーパーファイン（ＳＵ
ＰＥＲ ＦＩＮＥ）（ＳＦ） ４．セファクリルTM（ＳＥＰＨＡＣＲＹＬTM）Ｓ−１０
０ＨＲ ５．スーパーローズTM（ＳＵＰＥＲＯＳＥTM）１２ＰＧ ６．ウルトラゲルTM（ＵＬＴＲＡＧＥＬTM）ＡｃＡ２０
２ ７．トリスアクリルTM（ＴＲＹＳＡＣＲＹＬTM）ＧＦ０
５； ＩＩ．以下のいずれかのゲルを用いたイオン交換： １．ＣＭセファロースTM（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥTM）ファ
ーストフロー（ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ） ２．ＣＭセファデックスTMＧ−２５ ３．ＣＭセファデックスTMＧ−５０；または ＩＩＩ．以下のいずれかを用いた疎水性相互反応： １．バイオ−ビーズTMＳＭ−２ ２．バイオ−ビーズTMＳＭ−７ ３．バイオ−ビーズTMＳＭ−１６ ４．フェニルセファロースTM６ファーストフロー
【００５２】結合体（Ｉ）の精製にはＣＭセファデック
スTMＣ−５０、セファデックスTMＧ−２５ＳＦおよびＣ
ＭセファデックスTMＣ−２５が好ましい。ＣＭセファデ
ックスTMＣ−２５は、大スケールの精製、たとえば５.
０グラムまたはそれより大きいスケールの精製に特に好
ましい。カラムクロマトグラフィーによる結合体（Ｉ）
の精製は以下のようにして行う：リン酸緩衝液（約７〜
約８の範囲のｐＨ）中の粗製の結合体（Ｉ）を約０〜約
５℃の温度にてカラムに負荷する。約４５〜約８５ｍｌ
／分の容積流速にて結合体をリン酸緩衝液で溶出する。
スTMＣ−５０、セファデックスTMＧ−２５ＳＦおよびＣ
ＭセファデックスTMＣ−２５が好ましい。ＣＭセファデ
ックスTMＣ−２５は、大スケールの精製、たとえば５.
０グラムまたはそれより大きいスケールの精製に特に好
ましい。カラムクロマトグラフィーによる結合体（Ｉ）
の精製は以下のようにして行う：リン酸緩衝液（約７〜
約８の範囲のｐＨ）中の粗製の結合体（Ｉ）を約０〜約
５℃の温度にてカラムに負荷する。約４５〜約８５ｍｌ
／分の容積流速にて結合体をリン酸緩衝液で溶出する。
【００５３】好ましい態様に関しては、本発明の方法の
最も好ましい側面は、薬剤残基がアドリアマイシン（ド
キソルビシン）であり、リガンド部分がＢＲ９６ＭＡ
ｂ、緩んだＢＲ９６抗体、キメラＢＲ９６ＭＡｂおよび
抗原認識性のその断片から選ばれる式（Ｉ）の免疫結合
体の調製である。この態様に最も好ましいリガンドはキ
メラＢＲ９６ＭＡｂ、とりわけ緩んだキメラＢＲ９６Ｍ
Ａｂ、および抗原認識性のその断片である。
最も好ましい側面は、薬剤残基がアドリアマイシン（ド
キソルビシン）であり、リガンド部分がＢＲ９６ＭＡ
ｂ、緩んだＢＲ９６抗体、キメラＢＲ９６ＭＡｂおよび
抗原認識性のその断片から選ばれる式（Ｉ）の免疫結合
体の調製である。この態様に最も好ましいリガンドはキ
メラＢＲ９６ＭＡｂ、とりわけ緩んだキメラＢＲ９６Ｍ
Ａｂ、および抗原認識性のその断片である。
【００５４】本発明の方法によって調製した結合体は選
択された細胞集団を標的することができ、ドキソルビシ
ン（アドリアマイシン）またはその誘導体の場合と同じ
疾患状態（癌などの新生物形成疾患、ウイルスまたは他
の病原による感染症、自己免疫疾患およびアドリアマイ
シンを使用する他の疾患状態を含む）を治療するのに用
いることができる。
択された細胞集団を標的することができ、ドキソルビシ
ン（アドリアマイシン）またはその誘導体の場合と同じ
疾患状態（癌などの新生物形成疾患、ウイルスまたは他
の病原による感染症、自己免疫疾患およびアドリアマイ
シンを使用する他の疾患状態を含む）を治療するのに用
いることができる。
【００５５】本発明の方法によって調製した結合体は、
式（Ｉ）の結合体および薬理学的に許容し得る担体、賦
形剤または希釈剤を含有する医薬処方物の形態で患者に
投与する。本明細書において使用する「薬理学的に許容
し得る」とは、たとえばヒト、ウマ、ブタ、ウシ、マウ
ス、イヌ、ネコ、または他の哺乳動物、並びにトリまた
は他の温血動物を含む温血動物の治療または診断に有用
な剤であることをいう。好ましい投与経路は、非経口、
とりわけ静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、またはリンパ
管内経路である。そのような処方物は、当業者によく知
られた担体、希釈剤または賦形剤を用いて調製すること
ができる。この点に関しては、たとえば、レミングトン
ズ・ファーマシューティカル・サイエンスィズ（Ｒemin
gton'sＰharmaceutical Ｓciences）、第１６版、１９
８０、マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍack Ｐ
ublishing Ｃompany）（オソル（Ｏsol）ら編）を参
照。そのような組成物には、血清タンパク質、たとえば
ヒト血清アルブミンなどのタンパク質、リン酸塩や他の
塩などの緩衝液または緩衝物質、または電解質などが含
まれていてよい。適当な希釈剤としては、たとえば、滅
菌水、等張食塩水、デキストロースの希水溶液、ポリヒ
ドロキシアルコールまたはそのようなアルコールの混合
物、たとえばグリセリン、プロピレングリコール、ポリ
エチレングリコールなどが挙げられる。処方物には、フ
ェネチルアルコール、メチルおよびプロピルパラベン、
チメロサールなどの保存剤が含まれていてよい。所望な
ら、処方物には０.０５〜約０.２０重量％の抗酸化剤、
たとえばメタ重亜硫酸ナトリウムや重亜硫酸ナトリウム
などが含まれていてよい。
式（Ｉ）の結合体および薬理学的に許容し得る担体、賦
形剤または希釈剤を含有する医薬処方物の形態で患者に
投与する。本明細書において使用する「薬理学的に許容
し得る」とは、たとえばヒト、ウマ、ブタ、ウシ、マウ
ス、イヌ、ネコ、または他の哺乳動物、並びにトリまた
は他の温血動物を含む温血動物の治療または診断に有用
な剤であることをいう。好ましい投与経路は、非経口、
とりわけ静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、またはリンパ
管内経路である。そのような処方物は、当業者によく知
られた担体、希釈剤または賦形剤を用いて調製すること
ができる。この点に関しては、たとえば、レミングトン
ズ・ファーマシューティカル・サイエンスィズ（Ｒemin
gton'sＰharmaceutical Ｓciences）、第１６版、１９
８０、マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍack Ｐ
ublishing Ｃompany）（オソル（Ｏsol）ら編）を参
照。そのような組成物には、血清タンパク質、たとえば
ヒト血清アルブミンなどのタンパク質、リン酸塩や他の
塩などの緩衝液または緩衝物質、または電解質などが含
まれていてよい。適当な希釈剤としては、たとえば、滅
菌水、等張食塩水、デキストロースの希水溶液、ポリヒ
ドロキシアルコールまたはそのようなアルコールの混合
物、たとえばグリセリン、プロピレングリコール、ポリ
エチレングリコールなどが挙げられる。処方物には、フ
ェネチルアルコール、メチルおよびプロピルパラベン、
チメロサールなどの保存剤が含まれていてよい。所望な
ら、処方物には０.０５〜約０.２０重量％の抗酸化剤、
たとえばメタ重亜硫酸ナトリウムや重亜硫酸ナトリウム
などが含まれていてよい。
【００５６】静脈内投与の場合、患者に投与する量が約
０.０１〜約１ｇの所望の結合体（Ｉ）となるように処
方物を調製するのが好ましい。好ましくは、投与する量
は約０.２ｇ〜約１ｇの結合体（Ｉ）の範囲であろう。
結合体（Ｉ）は、治療すべき疾患状態、修飾すべき生物
学的作用、結合体の投与方法、患者の年齢、体重および
状態並びに処置する医師によって決定されるべき他の因
子などの因子に応じ、広範囲の投与量にわたって有効で
ある。それゆえ、所定の患者に投与すべき量は個々のケ
ース毎に決定すべきである。
０.０１〜約１ｇの所望の結合体（Ｉ）となるように処
方物を調製するのが好ましい。好ましくは、投与する量
は約０.２ｇ〜約１ｇの結合体（Ｉ）の範囲であろう。
結合体（Ｉ）は、治療すべき疾患状態、修飾すべき生物
学的作用、結合体の投与方法、患者の年齢、体重および
状態並びに処置する医師によって決定されるべき他の因
子などの因子に応じ、広範囲の投与量にわたって有効で
ある。それゆえ、所定の患者に投与すべき量は個々のケ
ース毎に決定すべきである。
【００５７】
【実施例】以下の実施例では特定の試薬および反応条件
を用いたが、本発明の範囲に包含される修飾を施し得る
ことを当業者は評価するであろう。以下の実施例は本発
明の好ましい態様を説明するものにすぎない。実施例１ ２,５−ジヒドロ−２,５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−
１−ヘキサン酸 Ａ．（Ｚ）−６−［（３−カルボキシ−１−オキソ−２
−プロペニル）アミノ］ヘキサン酸： 氷酢酸（１００ｍ
ｌ）中の無水マレイン酸（１５.０ｇ、０.１５モル）の
溶液を室温にて氷酢酸（１００ｍｌ）中の６−アミノカ
プロン酸（１９.６５ｇ、０.１５モル）の溶液に約１５
分間かけて加え、室温にて３時間撹拌した。得られた白
色沈殿を濾過し、冷水で洗浄し、５０℃にて真空オーブ
ン中、２日間乾燥させて標記化合物（３３.００ｇ）を
９５％の収率で得た。この物質をさらに精製することな
く次の工程に用いた。 融点：１７０〜１７２℃ ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.４７、シリカゲル、ＭｅＯＨ−ＣＨ
Ｃｌ3＝１：１、ＰＭＡスプレーにより視覚化
を用いたが、本発明の範囲に包含される修飾を施し得る
ことを当業者は評価するであろう。以下の実施例は本発
明の好ましい態様を説明するものにすぎない。実施例１ ２,５−ジヒドロ−２,５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−
１−ヘキサン酸 Ａ．（Ｚ）−６−［（３−カルボキシ−１−オキソ−２
−プロペニル）アミノ］ヘキサン酸： 氷酢酸（１００ｍ
ｌ）中の無水マレイン酸（１５.０ｇ、０.１５モル）の
溶液を室温にて氷酢酸（１００ｍｌ）中の６−アミノカ
プロン酸（１９.６５ｇ、０.１５モル）の溶液に約１５
分間かけて加え、室温にて３時間撹拌した。得られた白
色沈殿を濾過し、冷水で洗浄し、５０℃にて真空オーブ
ン中、２日間乾燥させて標記化合物（３３.００ｇ）を
９５％の収率で得た。この物質をさらに精製することな
く次の工程に用いた。 融点：１７０〜１７２℃ ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.４７、シリカゲル、ＭｅＯＨ−ＣＨ
Ｃｌ3＝１：１、ＰＭＡスプレーにより視覚化
【００５８】Ｂ．２,５−ジヒドロ−２,５−ジオキソ−
１Ｈ−ピロール−１−ヘキサン酸：アセトニトリル（９
０ｍｌ）中の工程Ａの化合物（３ｇ、０.０１３モル）
の溶液に室温にてクロロトリメチルシラン（８.３ｍ
ｌ、０.０６５モル）およびトリエチルアミン（９ｍ
ｌ、０.０６ミリモル）を順番に滴下した。ついで、得
られた均一な溶液を還流温度にて７時間加熱した。室温
に冷却した後、沈殿した固体（トリエチルアミン塩酸
塩）を濾過し、濾液を真空下で濃縮して褐色の固体を得
た。この残渣をジクロロメタン（７５ｍｌ）中に溶解
し、中性ノリット（１.５ｇ）とともに２０分間沸騰さ
せた。これをセライトのベッドで濾過し、熱ジクロロメ
タン（２５ｍｌ）で洗浄した。コンバインした濾液を真
空濃縮して生成物（１.４ｇ；５０％）を得た。この粗
製の生成物をアセトンおよびイソプロピルエーテル
（１：２）を用いて結晶化して標記化合物（０.９１
ｇ）を３２％の収率で得た。 融点：８３〜８５℃ ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.２６、シリカゲル、ＭｅＯＨ−ＣＨ
Ｃｌ3＝５：９５、ＰＭＡスプレーにより視覚化
１Ｈ−ピロール−１−ヘキサン酸：アセトニトリル（９
０ｍｌ）中の工程Ａの化合物（３ｇ、０.０１３モル）
の溶液に室温にてクロロトリメチルシラン（８.３ｍ
ｌ、０.０６５モル）およびトリエチルアミン（９ｍ
ｌ、０.０６ミリモル）を順番に滴下した。ついで、得
られた均一な溶液を還流温度にて７時間加熱した。室温
に冷却した後、沈殿した固体（トリエチルアミン塩酸
塩）を濾過し、濾液を真空下で濃縮して褐色の固体を得
た。この残渣をジクロロメタン（７５ｍｌ）中に溶解
し、中性ノリット（１.５ｇ）とともに２０分間沸騰さ
せた。これをセライトのベッドで濾過し、熱ジクロロメ
タン（２５ｍｌ）で洗浄した。コンバインした濾液を真
空濃縮して生成物（１.４ｇ；５０％）を得た。この粗
製の生成物をアセトンおよびイソプロピルエーテル
（１：２）を用いて結晶化して標記化合物（０.９１
ｇ）を３２％の収率で得た。 融点：８３〜８５℃ ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.２６、シリカゲル、ＭｅＯＨ−ＣＨ
Ｃｌ3＝５：９５、ＰＭＡスプレーにより視覚化
【００５９】実施例２ ドキソルビシン（Ｄｏｘ）の６−マレイミドカプロイル
ヒドラゾン Ａ．２,５−ジヒドロ−２,５−ジオキソ−１Ｈ−ピロー
ル−１−ヘキサン酸： 氷酢酸（１００ｍｌ）中の６−ア
ミノカプロン酸（２０ｇ、０.１５３モル）の溶液をア
ルゴン下、室温にて氷酢酸（３００ｍｌ）中の無水マレ
イン酸（１５.０ｇ、０.１５３モル）の溶液に１０分間
かけて加えた。室温で３時間撹拌した後、白色の不均一
な反応混合物を５時間還流した。酢酸のほとんどをロー
タリーエバポレーター上、５０℃にて真空下、除去し
た。減圧下、トルエンとともに共蒸留することにより残
留酢酸を除去した。得られた褐色の残渣（４０ｇ）をジ
クロロメタン（２５０ｍｌ）中に溶解し、中性活性炭
（２０ｇ）とともに２０分間沸騰させた。この熱混合物
をセライトのベッドで濾過し、熱ジクロロメタン（２×
７５ｍｌ）で洗浄した。コンバインした濾液を真空濃縮
して粗製の生成物（３３ｇ）を黄褐色の固体として得
た。この粗製の生成物をＥｔＯＡｃおよびヘキサン
（１：１）から結晶化させて生成物（１３ｇ）を３つの
部分で得た。これをＥｔＯＡｃおよびヘキサン（１：
１）から再結晶させてマレイミドカプロン酸（９.８
ｇ）を３０％の収率で得た。 融点：８２〜８４℃ ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.２５、シリカゲル、ＭｅＯＨ−ＣＨ
Ｃｌ3＝５：９５、ＰＭＡスプレーにより視覚化
ヒドラゾン Ａ．２,５−ジヒドロ−２,５−ジオキソ−１Ｈ−ピロー
ル−１−ヘキサン酸： 氷酢酸（１００ｍｌ）中の６−ア
ミノカプロン酸（２０ｇ、０.１５３モル）の溶液をア
ルゴン下、室温にて氷酢酸（３００ｍｌ）中の無水マレ
イン酸（１５.０ｇ、０.１５３モル）の溶液に１０分間
かけて加えた。室温で３時間撹拌した後、白色の不均一
な反応混合物を５時間還流した。酢酸のほとんどをロー
タリーエバポレーター上、５０℃にて真空下、除去し
た。減圧下、トルエンとともに共蒸留することにより残
留酢酸を除去した。得られた褐色の残渣（４０ｇ）をジ
クロロメタン（２５０ｍｌ）中に溶解し、中性活性炭
（２０ｇ）とともに２０分間沸騰させた。この熱混合物
をセライトのベッドで濾過し、熱ジクロロメタン（２×
７５ｍｌ）で洗浄した。コンバインした濾液を真空濃縮
して粗製の生成物（３３ｇ）を黄褐色の固体として得
た。この粗製の生成物をＥｔＯＡｃおよびヘキサン
（１：１）から結晶化させて生成物（１３ｇ）を３つの
部分で得た。これをＥｔＯＡｃおよびヘキサン（１：
１）から再結晶させてマレイミドカプロン酸（９.８
ｇ）を３０％の収率で得た。 融点：８２〜８４℃ ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.２５、シリカゲル、ＭｅＯＨ−ＣＨ
Ｃｌ3＝５：９５、ＰＭＡスプレーにより視覚化
【００６０】Ｂ．２−［６−（２,５−ジオキソ−１Ｈ
−ピロール−１−イル）−１−オキソヘキシル］ヒドラ
ジンカルボン酸１,１−ジメチルエチルエステル：無水
ＴＨＦ（５００ｍｌ）中の工程Ａの化合物（１５.０
ｇ、７０ミリモル）の溶液に、０〜４℃にて無水ＴＨＦ
（２０ｍｌ）中の４−メチルモルホリン（７.７ｍｌ、
７０ミリモル）の溶液および無水ＴＨＦ（２０ｍｌ）中
のクロロギ酸イソブチル（９.１ｍｌ、７０ミリモル）
の溶液を順番に加えた。０℃で１５分間撹拌した後、反
応液に無水ＴＨＦ（３０ｍｌ）中のｔ−ブチルカルバゼ
ート（９.２４ｇ、７０ミリモル）の溶液をゆっくりと
加えた（約１０分間）。この黄色がかった不均一混合物
を０℃で１時間、ついで室温で２４時間撹拌した。反応
の進行をＴＬＣによりモニターした。反応混合物を濃縮
乾固した。得られた残渣をＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）中
に溶解し、水（２×１００ｍｌ）、氷冷した０.０１Ｎ
ＨＣｌ（１００ｍｌ）、５％重炭酸ナトリウム（１００
ｍｌ）および水（２×１００ｍｌ）で順番に洗浄した。
これを乾燥し（無水ＭｇＳＯ4）、濾過し、ロータリー
エバポレーター上で濃縮して粗製の生成物を黄色の油状
物（１９.７５ｇ）として得、これを３５％ＥｔＯＡｃ
／ヘキサン、５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンおよび７５％
ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで順番に溶出するフラッシュクロ
マトグラフィー（シリカゲル２３０〜４００メッシュ）
により精製した。適当な画分をプールし、真空下で濃縮
して標記カルバゼート（１９.６ｇ（８５％））を粘性
の油状物として得た。 ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.２８（Ｓ.Ｍ.Ｒｆ＝０.３５）、シリ
カゲル、ＭｅＯＨ−ヘキサン＝７：３、ＰＭＡスプレー
により視覚化
−ピロール−１−イル）−１−オキソヘキシル］ヒドラ
ジンカルボン酸１,１−ジメチルエチルエステル：無水
ＴＨＦ（５００ｍｌ）中の工程Ａの化合物（１５.０
ｇ、７０ミリモル）の溶液に、０〜４℃にて無水ＴＨＦ
（２０ｍｌ）中の４−メチルモルホリン（７.７ｍｌ、
７０ミリモル）の溶液および無水ＴＨＦ（２０ｍｌ）中
のクロロギ酸イソブチル（９.１ｍｌ、７０ミリモル）
の溶液を順番に加えた。０℃で１５分間撹拌した後、反
応液に無水ＴＨＦ（３０ｍｌ）中のｔ−ブチルカルバゼ
ート（９.２４ｇ、７０ミリモル）の溶液をゆっくりと
加えた（約１０分間）。この黄色がかった不均一混合物
を０℃で１時間、ついで室温で２４時間撹拌した。反応
の進行をＴＬＣによりモニターした。反応混合物を濃縮
乾固した。得られた残渣をＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）中
に溶解し、水（２×１００ｍｌ）、氷冷した０.０１Ｎ
ＨＣｌ（１００ｍｌ）、５％重炭酸ナトリウム（１００
ｍｌ）および水（２×１００ｍｌ）で順番に洗浄した。
これを乾燥し（無水ＭｇＳＯ4）、濾過し、ロータリー
エバポレーター上で濃縮して粗製の生成物を黄色の油状
物（１９.７５ｇ）として得、これを３５％ＥｔＯＡｃ
／ヘキサン、５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンおよび７５％
ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで順番に溶出するフラッシュクロ
マトグラフィー（シリカゲル２３０〜４００メッシュ）
により精製した。適当な画分をプールし、真空下で濃縮
して標記カルバゼート（１９.６ｇ（８５％））を粘性
の油状物として得た。 ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.２８（Ｓ.Ｍ.Ｒｆ＝０.３５）、シリ
カゲル、ＭｅＯＨ−ヘキサン＝７：３、ＰＭＡスプレー
により視覚化
【００６１】Ｃ．２,５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−
１−ヘキサン酸ヒドラジド、トリフルオロ酢酸塩：工程
Ｂのカルバゼート（１６.９ｇ）を０℃にてトリフルオ
ロ酢酸（６０ｍｌ）中に溶解し、同温度にて３時間撹拌
した。過剰のトリフルオロ酢酸をロータリーエバポレー
ター上、高真空下で３０℃にて除去した。得られた油状
の残渣を０℃にてエーテル（１５０ｍｌ）でトリチュレ
ートし、同温度で２時間撹拌した。得られた白色の残渣
を濾過し、エーテル（５０ｍｌ）で洗浄し、高真空下で
一夜乾燥させて工程Ｃの化合物（１５.０ｇ；工程Ａの
化合物から６５.３％）を得た。 融点：１０７〜１１０℃ ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.３５（Ｓ.Ｍ.Ｒｆ＝０.６０）、シリ
カゲル、ＭｅＯＨ−ＣＨ2Ｃｌ2＝１：９、ＰＭＡスプレ
ーにより視覚化
１−ヘキサン酸ヒドラジド、トリフルオロ酢酸塩：工程
Ｂのカルバゼート（１６.９ｇ）を０℃にてトリフルオ
ロ酢酸（６０ｍｌ）中に溶解し、同温度にて３時間撹拌
した。過剰のトリフルオロ酢酸をロータリーエバポレー
ター上、高真空下で３０℃にて除去した。得られた油状
の残渣を０℃にてエーテル（１５０ｍｌ）でトリチュレ
ートし、同温度で２時間撹拌した。得られた白色の残渣
を濾過し、エーテル（５０ｍｌ）で洗浄し、高真空下で
一夜乾燥させて工程Ｃの化合物（１５.０ｇ；工程Ａの
化合物から６５.３％）を得た。 融点：１０７〜１１０℃ ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.３５（Ｓ.Ｍ.Ｒｆ＝０.６０）、シリ
カゲル、ＭｅＯＨ−ＣＨ2Ｃｌ2＝１：９、ＰＭＡスプレ
ーにより視覚化
【００６２】Ｄ．ドキソルビシンの６−マレイミドカプ
ロイルヒドラゾン：無水メタノール（１.８Ｌ）中のド
キソルビシン塩酸塩（５.０ｇ、８.６ミリモル）、工程
Ｃのマレイミドカプロイルヒドラジド塩（８.７５ｇ、
２５.８１ミリモル）およびトリフルオロ酢酸（０.５ｍ
ｌ、６.４９ミリモル）の混合物を暗所、室温、アルゴ
ン下にて１６時間撹拌した。反応の進行を逆相ＨＰＬＣ
によりモニターした。反応がほぼ完了した後、混合物を
暗所、ロータリーエバポレーター上、３０℃、減圧下に
て約２００ｍｌに直接濃縮した。この生成物のメタノー
ル性溶液に撹拌しながら無水アセトニトリル（２Ｌ）を
ゆっくり加えて標記化合物を沈殿させた。これを０〜４
℃に１２時間保持して完全に沈殿させた。生成物を中孔
フリットディスクを有するブフナー漏斗で濾過した。得
られた暗赤色の生成物を冷ＭｅＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１：
９）の混合物（５００ｍｌ）で洗浄し、３〜４時間真空
乾燥して標記ドキソルビシンヒドラゾン（６.３６ｇ、
９３％）を得た。上記生成物をメタノール（約２００ｍ
ｌ）中に溶解し、上記と同様にアセトニトリル（２Ｌ）
で再沈殿させることによりさらに精製した。濾過後の単
離および乾燥により標記化合物（５.４２ｇ；８２％）
を得た。 融点：１８２〜１８４℃ ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.４６、シリカゲル、ＭｅＯＨ−ＣＨ
Ｃｌ3−ＡｃＯＨ＝３：７：０.１、２回溶出、ＵＶ、Ｐ
ＭＡおよびＡＡスプレーにより視覚化、ＨＰＬＣ：ＨＩ
９５.４％（Ｒｔ＝１５.９２）、ＩＩ２.９％ドキソル
ビシン塩酸塩
ロイルヒドラゾン：無水メタノール（１.８Ｌ）中のド
キソルビシン塩酸塩（５.０ｇ、８.６ミリモル）、工程
Ｃのマレイミドカプロイルヒドラジド塩（８.７５ｇ、
２５.８１ミリモル）およびトリフルオロ酢酸（０.５ｍ
ｌ、６.４９ミリモル）の混合物を暗所、室温、アルゴ
ン下にて１６時間撹拌した。反応の進行を逆相ＨＰＬＣ
によりモニターした。反応がほぼ完了した後、混合物を
暗所、ロータリーエバポレーター上、３０℃、減圧下に
て約２００ｍｌに直接濃縮した。この生成物のメタノー
ル性溶液に撹拌しながら無水アセトニトリル（２Ｌ）を
ゆっくり加えて標記化合物を沈殿させた。これを０〜４
℃に１２時間保持して完全に沈殿させた。生成物を中孔
フリットディスクを有するブフナー漏斗で濾過した。得
られた暗赤色の生成物を冷ＭｅＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１：
９）の混合物（５００ｍｌ）で洗浄し、３〜４時間真空
乾燥して標記ドキソルビシンヒドラゾン（６.３６ｇ、
９３％）を得た。上記生成物をメタノール（約２００ｍ
ｌ）中に溶解し、上記と同様にアセトニトリル（２Ｌ）
で再沈殿させることによりさらに精製した。濾過後の単
離および乾燥により標記化合物（５.４２ｇ；８２％）
を得た。 融点：１８２〜１８４℃ ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.４６、シリカゲル、ＭｅＯＨ−ＣＨ
Ｃｌ3−ＡｃＯＨ＝３：７：０.１、２回溶出、ＵＶ、Ｐ
ＭＡおよびＡＡスプレーにより視覚化、ＨＰＬＣ：ＨＩ
９５.４％（Ｒｔ＝１５.９２）、ＩＩ２.９％ドキソル
ビシン塩酸塩
【００６３】実施例３ ドキソルビシンの６−マレイミドカプロイルヒドラゾン ５Ｌ容３つ首丸底フラスコ中の無水メタノール（４００
ｍｌ）中のドキソルビシン塩酸塩（１０.０ｇ、１７.２
４ミリモル）の冷却し（氷水浴）撹拌した赤色の懸濁液
に、実施例２工程Ｃのマレイミドカプロイルヒドラジド
トリフルオロ酢酸塩（１７.５３ｇ、５１.７２ミリモ
ル）を一度に加え、ついで無水メタノール（４０μｌ）
中のトリフルオロ酢酸（８μｌ、０.１ミリモル）を加
えた。得られた混合物を同温度にて５時間撹拌した。反
応完了後、温度を０〜４℃に保持し、添加漏斗を用いて
３時間、穏やかに撹拌しながら酢酸エチル（４Ｌ）を注
意深く加えた。得られた赤色の沈殿を中孔フリットディ
スクを有するブフナー漏斗上で濾過した。得られた明赤
色の固体を冷（０〜４℃）ＭｅＯＨ−ＥｔＯＡｃ（１：
９）の混合物（６×２００ｍｌ）、ついでアセトニトリ
ル（６×２００ｍｌ）で洗浄した。生成物を５００ｍｌ
容のビーカー中に移し、２４時間真空（〜０.３ｍｍＨ
ｇ）乾燥して標記ドキソルビシンヒドラゾン（１３.２
３ｇ）を得た。上記生成物をさらに２４時間真空乾燥し
て（〜０.３ｍｍＨｇ、４５℃）１３.１３ｇを９７％の
収率（ＨＩ９９.４％、ＩＲ０.４％（ドキソルビシン）
および０.２％（未知の不純物））で得た。
ｍｌ）中のドキソルビシン塩酸塩（１０.０ｇ、１７.２
４ミリモル）の冷却し（氷水浴）撹拌した赤色の懸濁液
に、実施例２工程Ｃのマレイミドカプロイルヒドラジド
トリフルオロ酢酸塩（１７.５３ｇ、５１.７２ミリモ
ル）を一度に加え、ついで無水メタノール（４０μｌ）
中のトリフルオロ酢酸（８μｌ、０.１ミリモル）を加
えた。得られた混合物を同温度にて５時間撹拌した。反
応完了後、温度を０〜４℃に保持し、添加漏斗を用いて
３時間、穏やかに撹拌しながら酢酸エチル（４Ｌ）を注
意深く加えた。得られた赤色の沈殿を中孔フリットディ
スクを有するブフナー漏斗上で濾過した。得られた明赤
色の固体を冷（０〜４℃）ＭｅＯＨ−ＥｔＯＡｃ（１：
９）の混合物（６×２００ｍｌ）、ついでアセトニトリ
ル（６×２００ｍｌ）で洗浄した。生成物を５００ｍｌ
容のビーカー中に移し、２４時間真空（〜０.３ｍｍＨ
ｇ）乾燥して標記ドキソルビシンヒドラゾン（１３.２
３ｇ）を得た。上記生成物をさらに２４時間真空乾燥し
て（〜０.３ｍｍＨｇ、４５℃）１３.１３ｇを９７％の
収率（ＨＩ９９.４％、ＩＲ０.４％（ドキソルビシン）
および０.２％（未知の不純物））で得た。
【００６４】実施例４ ドキソルビシン−ＢＲ９６結合体（ドキソルビシンの６
−マレイミドカプロイルヒドラゾンに結合させたＢＲ９
６モノクローナル抗体） １．ＤＴＴを用いたＢＲ９６の還元によるＢＲ９６ＭＡ
ｂ（ＳＨ）7-9の生成： ３つ首１２Ｌ容丸底フラスコに
入れたクエン酸緩衝食塩水（ＣＢＳ緩衝液、２５ｍＭク
エン酸ナトリウムおよび２５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐ
Ｈ５.５）中のモノクローナル抗体ＢＲ９６の機械的に
撹拌した溶液（６０００ｍｌ、濃度＝〜１０ｍｇ／ｍ
ｌ）にリン酸ナトリウム（二塩基姓、〜２１５５ｍｌ、
ｐＨ〜９.０）の飽和溶液を約２０分間かけて最終ｐＨ
が７.７１となるように加えた。この溶液に、超純度滅
菌濾過アルゴンを約１時間絶えずパージした。パージの
終了時点で抗体溶液中に溶解した酸素は５％未満であっ
た。抗体濃度（７.３２７ｍｇ／ｍｌ、５９.７６ｇ、
０.３７３４ミリモル）を測定した（ａ）。これにジチ
オトレイトール（ＤＴＴ）の溶液（２６２.５ｍｌ、Ｐ
ＢＳ（ｂ）中に０.０１Ｍ、２.６２５ミリモル、７.０
３モル当量）を撹拌しながら室温にて約５分間かけて加
えた。ついで、この反応混合物をアルゴン下、３６〜３
８℃（内部温度）の水浴中で２時間穏やかに撹拌して還
元を完了させた。還元した抗体溶液をダイアフィルトレ
ーションのために冷室（４℃）に移した。
−マレイミドカプロイルヒドラゾンに結合させたＢＲ９
６モノクローナル抗体） １．ＤＴＴを用いたＢＲ９６の還元によるＢＲ９６ＭＡ
ｂ（ＳＨ）7-9の生成： ３つ首１２Ｌ容丸底フラスコに
入れたクエン酸緩衝食塩水（ＣＢＳ緩衝液、２５ｍＭク
エン酸ナトリウムおよび２５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐ
Ｈ５.５）中のモノクローナル抗体ＢＲ９６の機械的に
撹拌した溶液（６０００ｍｌ、濃度＝〜１０ｍｇ／ｍ
ｌ）にリン酸ナトリウム（二塩基姓、〜２１５５ｍｌ、
ｐＨ〜９.０）の飽和溶液を約２０分間かけて最終ｐＨ
が７.７１となるように加えた。この溶液に、超純度滅
菌濾過アルゴンを約１時間絶えずパージした。パージの
終了時点で抗体溶液中に溶解した酸素は５％未満であっ
た。抗体濃度（７.３２７ｍｇ／ｍｌ、５９.７６ｇ、
０.３７３４ミリモル）を測定した（ａ）。これにジチ
オトレイトール（ＤＴＴ）の溶液（２６２.５ｍｌ、Ｐ
ＢＳ（ｂ）中に０.０１Ｍ、２.６２５ミリモル、７.０
３モル当量）を撹拌しながら室温にて約５分間かけて加
えた。ついで、この反応混合物をアルゴン下、３６〜３
８℃（内部温度）の水浴中で２時間穏やかに撹拌して還
元を完了させた。還元した抗体溶液をダイアフィルトレ
ーションのために冷室（４℃）に移した。
【００６５】（注）： ａ：抗体濃度の測定は、パーキンエルマーラムダ６ＵＶ
／可視分光光度計および２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度
を用いて行った；１ｍｇ／ｍｌ＝１.４吸光度単位。抗
体のモル濃度は以下のようにして計算した。 ＭＣ（抗体）＝（ｍｇ／ｍｌ）／１６００００ （式中、１６００００は抗体の分子量である） ｂ：ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７.８；０.０１Ｍリン酸ナト
リウムおよび０.１Ｍ塩化ナトリウム）の調製は以下の
ようにして行った。 ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ ０.１４ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4 １.２８ｇ ＮａＣｌ ５.８５ｇ 水（ＷＦＩ） 全量１リットル １Ｎ ＮａＯＨ 〜０.５ｍｌ（ｐＨが７.８
になるまで添加） ０.２２μ酢酸セルロース膜で濾過。
／可視分光光度計および２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度
を用いて行った；１ｍｇ／ｍｌ＝１.４吸光度単位。抗
体のモル濃度は以下のようにして計算した。 ＭＣ（抗体）＝（ｍｇ／ｍｌ）／１６００００ （式中、１６００００は抗体の分子量である） ｂ：ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７.８；０.０１Ｍリン酸ナト
リウムおよび０.１Ｍ塩化ナトリウム）の調製は以下の
ようにして行った。 ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ ０.１４ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4 １.２８ｇ ＮａＣｌ ５.８５ｇ 水（ＷＦＩ） 全量１リットル １Ｎ ＮａＯＨ 〜０.５ｍｌ（ｐＨが７.８
になるまで添加） ０.２２μ酢酸セルロース膜で濾過。
【００６６】２．還元されたＢＲ９６のダイアフィルト
レーション：工程１の還元された抗体をアルゴン雰囲気
下で蠕動ポンプで送ることにより、アルゴンパージした
ＰＢＳ緩衝液（３リットル）を入れた栓付き２０Ｌ容ポ
リプロピレン大型ガラスびんに移した。上記大型ガラス
びん中に得られた溶液（〜１１Ｌ）をアルゴン雰囲気
下、フィルトロンセントラセット（ｃ）ダイアフィルト
レーション／濃縮ユニットを用いて約６Ｌに濃縮した。
ついで、この濃縮溶液（６Ｌ）をマグネチックスターラ
ーで穏やかに撹拌しながらアルゴンパージしたＰＢＳ緩
衝液でダイアフィルトレーションした。濾液の流速は約
１.１Ｌ／分であった。全部で５容量（３０Ｌ）のダイ
アフィルトレーションの後、還元された抗体（５５２０
ｍｌ）をアルゴン雰囲気下で３つ首１２Ｌ容丸底モート
ンフラスコに移した。ＳＨのモル濃度（ｄ）および抗体
のモル濃度（ａ）を決定した。
レーション：工程１の還元された抗体をアルゴン雰囲気
下で蠕動ポンプで送ることにより、アルゴンパージした
ＰＢＳ緩衝液（３リットル）を入れた栓付き２０Ｌ容ポ
リプロピレン大型ガラスびんに移した。上記大型ガラス
びん中に得られた溶液（〜１１Ｌ）をアルゴン雰囲気
下、フィルトロンセントラセット（ｃ）ダイアフィルト
レーション／濃縮ユニットを用いて約６Ｌに濃縮した。
ついで、この濃縮溶液（６Ｌ）をマグネチックスターラ
ーで穏やかに撹拌しながらアルゴンパージしたＰＢＳ緩
衝液でダイアフィルトレーションした。濾液の流速は約
１.１Ｌ／分であった。全部で５容量（３０Ｌ）のダイ
アフィルトレーションの後、還元された抗体（５５２０
ｍｌ）をアルゴン雰囲気下で３つ首１２Ｌ容丸底モート
ンフラスコに移した。ＳＨのモル濃度（ｄ）および抗体
のモル濃度（ａ）を決定した。
【００６７】（注）： ｃ：３１６Ｌステンレス鋼でできたセントラセットダイ
アフィルトレーションユニットをフィルトロンから購入
した。１０平方フィートの全表面積を有する２つのオメ
ガ３０Ｋ膜（ポリエーテルスルホン製）を用いた。１
５.９ｍｍバイオプレーン（Ｂioprene）管を付したワト
ソン−マーロウ（Ｗatson−Ｍarlow）６０４Ｓ／Ｒ蠕動
ポンプを用い、抗体溶液を貯蔵部から該ユニットにポン
プで流した。圧力は２０ｐｓｉ未満であった。 ｄ：チオール基のモル濃度の決定はエルマン（Ｅllma
n）法に従って行った（Ａnal.Ｂiochem.９４、７５〜８
１、１９７９）。反応混合物（０．１ｍｌ）をＰＢＳ緩
衝液で１ｍｌに希釈し、エルマン試薬（１００ミリモル
リン酸ナトリウム（二塩基性）（ｐＨ７.００）中の５,
５’−ジチオ−ビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）
の５０ミリモル溶液）（０.０２５ｍｌ）で処理した。
ブランクのＰＢＳ緩衝液（１ｍｌ）もＤＴＮＢ（０.０
２５ｍｌ）で同様に処理した。５分後、試料およびブラ
ンクの吸光度（Ａ）を４１２ｎｍで測定し、チオールの
モル濃度（ＭＣSH）を以下の等式に従って決定した。 ＭＣSH＝［（Ａ（試料）−Ａ（ブランク））×１０］／
１.４１５×１０4 （式中、１０は希釈係数、１.４１５×１０4は２−ニト
ロ−５−チオ安息香酸のジアニオンのモル吸光係数） 抗体に対するチオール基のモル比（ＭＲ）は以下のよう
にして計算した。 ＭＲ＝ＭＣSH／ＭＣ（抗体）
アフィルトレーションユニットをフィルトロンから購入
した。１０平方フィートの全表面積を有する２つのオメ
ガ３０Ｋ膜（ポリエーテルスルホン製）を用いた。１
５.９ｍｍバイオプレーン（Ｂioprene）管を付したワト
ソン−マーロウ（Ｗatson−Ｍarlow）６０４Ｓ／Ｒ蠕動
ポンプを用い、抗体溶液を貯蔵部から該ユニットにポン
プで流した。圧力は２０ｐｓｉ未満であった。 ｄ：チオール基のモル濃度の決定はエルマン（Ｅllma
n）法に従って行った（Ａnal.Ｂiochem.９４、７５〜８
１、１９７９）。反応混合物（０．１ｍｌ）をＰＢＳ緩
衝液で１ｍｌに希釈し、エルマン試薬（１００ミリモル
リン酸ナトリウム（二塩基性）（ｐＨ７.００）中の５,
５’−ジチオ−ビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）
の５０ミリモル溶液）（０.０２５ｍｌ）で処理した。
ブランクのＰＢＳ緩衝液（１ｍｌ）もＤＴＮＢ（０.０
２５ｍｌ）で同様に処理した。５分後、試料およびブラ
ンクの吸光度（Ａ）を４１２ｎｍで測定し、チオールの
モル濃度（ＭＣSH）を以下の等式に従って決定した。 ＭＣSH＝［（Ａ（試料）−Ａ（ブランク））×１０］／
１.４１５×１０4 （式中、１０は希釈係数、１.４１５×１０4は２−ニト
ロ−５−チオ安息香酸のジアニオンのモル吸光係数） 抗体に対するチオール基のモル比（ＭＲ）は以下のよう
にして計算した。 ＭＲ＝ＭＣSH／ＭＣ（抗体）
【００６８】３．還元されたＢＲ９６の結合：上記還元
しダイアフィルトレーションした抗体の機械的撹拌溶液
に、アルゴン下、５℃にてドキソルビシンヒドラゾン
（実施例３で調製したものなど）の水（ＷＦＩ）溶液
（Ｈ2Ｏ（６１１ｍｌ）、３.６８ミリモル、３.０５
ｇ、ＨＩ９５％）を約１０分間かけてゆっくりと加え
た。同温度で２０分間撹拌した後、得られた粗製の生成
物を０.８μおよび０.２μ酢酸セルロース膜の２つのカ
プセルにポンプで通すことにより清澄化させた。３つ首
の１２Ｌ容丸底フラスコに入れた粗製の生成物の溶液
に、活性炭（３０ｇ）を一度に加え、アルゴン下、５℃
にて１５分間撹拌した（１）。生成物を２つの真空濾過
ユニット（１Ｌコーニング真空濾過（Ｃorning Ｖacuum
Ｆiltration）ユニット、０.４５μついで０.２２μ）
で濾過した。標記生成物（６３５０ｍｌ）を、栓付き１
０Ｌ容ポリプロピレン製大型ガラスびん中に一時的に貯
蔵した。ついで、抗体濃度およびドキソルビシンのモル
濃度（それゆえ、ドキソルビシンに対する抗体のＭＲ）
を決定した（２）。結合体のｐＨは７.４８であり、抗
体濃度は９.１ｍｇ／ｍｌであり、モル比は８.４９であ
った。上記結合体を２つの部分に分けた。 部分Ｉ：２８３０ｍｌ 部分ＩＩ：３５２０ｍｌ（この部分は実施例１１におい
て用いた） ついで、部分Ｉを液体窒素中で滅菌プラスチックびん中
に２８×１００ｍｌおよび５×５ｍｌとして凍結させ、
−８０〜−８５℃で貯蔵した。
しダイアフィルトレーションした抗体の機械的撹拌溶液
に、アルゴン下、５℃にてドキソルビシンヒドラゾン
（実施例３で調製したものなど）の水（ＷＦＩ）溶液
（Ｈ2Ｏ（６１１ｍｌ）、３.６８ミリモル、３.０５
ｇ、ＨＩ９５％）を約１０分間かけてゆっくりと加え
た。同温度で２０分間撹拌した後、得られた粗製の生成
物を０.８μおよび０.２μ酢酸セルロース膜の２つのカ
プセルにポンプで通すことにより清澄化させた。３つ首
の１２Ｌ容丸底フラスコに入れた粗製の生成物の溶液
に、活性炭（３０ｇ）を一度に加え、アルゴン下、５℃
にて１５分間撹拌した（１）。生成物を２つの真空濾過
ユニット（１Ｌコーニング真空濾過（Ｃorning Ｖacuum
Ｆiltration）ユニット、０.４５μついで０.２２μ）
で濾過した。標記生成物（６３５０ｍｌ）を、栓付き１
０Ｌ容ポリプロピレン製大型ガラスびん中に一時的に貯
蔵した。ついで、抗体濃度およびドキソルビシンのモル
濃度（それゆえ、ドキソルビシンに対する抗体のＭＲ）
を決定した（２）。結合体のｐＨは７.４８であり、抗
体濃度は９.１ｍｇ／ｍｌであり、モル比は８.４９であ
った。上記結合体を２つの部分に分けた。 部分Ｉ：２８３０ｍｌ 部分ＩＩ：３５２０ｍｌ（この部分は実施例１１におい
て用いた） ついで、部分Ｉを液体窒素中で滅菌プラスチックびん中
に２８×１００ｍｌおよび５×５ｍｌとして凍結させ、
−８０〜−８５℃で貯蔵した。
【００６９】（注）： １：活性炭（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆ
isher Ｓcientific）、カタログ＃Ｃ１７０−５００、
ノリット、中性）を洗浄液のｐＨが７.４の一定となる
まで撹拌しながらＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７.４）で洗浄
し、真空オーブン中で乾燥させた。 ２：結合体中の抗体の濃度（ｍｇ／ｍｌ）の決定は、以
下の等式に従い、２８０ｎｍにおけるドキソルビシンの
吸光度の補正をしながら同波長における吸光度により上
記と同様にして行った。 ［Ａ280−（０.７２４×Ａ495）］／１.４ （式中、０.７２４は２８０ｎｍにおけるドキソルビシ
ンの吸光度の補正係数であり、１.４は抗体の吸光度単
位である）。ドキソルビシンのモル濃度は以下の等式に
より決定した。 ＭＣ（ドキソルビシン）＝Ａ495／８.０３×１０3 （式中、８.０３×１０3はドキソルビシンの４９５ｎｍ
におけるモル吸光係数である） 結合体のモル比（ＭＲ）は、以下の等式により計算し
た。 ＭＣ（ドキソルビシン）／ＭＣ（抗体）
isher Ｓcientific）、カタログ＃Ｃ１７０−５００、
ノリット、中性）を洗浄液のｐＨが７.４の一定となる
まで撹拌しながらＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７.４）で洗浄
し、真空オーブン中で乾燥させた。 ２：結合体中の抗体の濃度（ｍｇ／ｍｌ）の決定は、以
下の等式に従い、２８０ｎｍにおけるドキソルビシンの
吸光度の補正をしながら同波長における吸光度により上
記と同様にして行った。 ［Ａ280−（０.７２４×Ａ495）］／１.４ （式中、０.７２４は２８０ｎｍにおけるドキソルビシ
ンの吸光度の補正係数であり、１.４は抗体の吸光度単
位である）。ドキソルビシンのモル濃度は以下の等式に
より決定した。 ＭＣ（ドキソルビシン）＝Ａ495／８.０３×１０3 （式中、８.０３×１０3はドキソルビシンの４９５ｎｍ
におけるモル吸光係数である） 結合体のモル比（ＭＲ）は、以下の等式により計算し
た。 ＭＣ（ドキソルビシン）／ＭＣ（抗体）
【００７０】実施例５ ドキソルビシン−ＢＲ９６結合体（ドキソルビシンの６
−マレイミドカプロイルヒドラゾンに結合したＢＲ９６
モノクローナル抗体） 滅菌プラスチックびん中のモノクローナル抗体ＢＲ９６
の溶液（３２５ｍｌ、クエン酸緩衝食塩水（ａ）中の濃
度＝９.７３ｍｇ／ｍｌ）に、ジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）の溶液（１３.８４ｍｌ、ＰＢＳ緩衝液中に０.０
１Ｍ、０.１３８４ミリモル（ｂ））を滴下した。この
混合物を３７℃（内部温度）の水浴中、アルゴン雰囲気
下で３時間穏やかに撹拌して還元を完了させた。抗体に
対するチオール基のモル比（ＭＲ）を最初、およびその
後１時間ごとに決定した（実施例５に記載したようにし
て）（鎖間Ｓ−Ｓ結合の完全な還元を保証するため、Ｍ
Ｒは約１４にしておくべきである（ｃ））。緩んだ（還
元された）抗体を、冷室（４℃）中、オメガ接線膜（Ｏ
mega tangential membrane）に適合させたフィルトロン
ミニセット（ｄ）に連結した５Ｌ容貯蔵部に移した。還
元された抗体をＰＢＳ（ｂ）緩衝液（ｐＨ７.４）（２
Ｌ）で希釈し、約３５０ｍｌにダイアフィルトレーショ
ン／濃縮した（ｅ）。ついで、溶液をアルゴン雰囲気
下、清浄な滅菌プラスチック容器に移した。抗体濃度お
よびチオール基のモル濃度（それゆえ、抗体に対するチ
オール基のＭＲ）を上記のようにして決定した。
−マレイミドカプロイルヒドラゾンに結合したＢＲ９６
モノクローナル抗体） 滅菌プラスチックびん中のモノクローナル抗体ＢＲ９６
の溶液（３２５ｍｌ、クエン酸緩衝食塩水（ａ）中の濃
度＝９.７３ｍｇ／ｍｌ）に、ジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）の溶液（１３.８４ｍｌ、ＰＢＳ緩衝液中に０.０
１Ｍ、０.１３８４ミリモル（ｂ））を滴下した。この
混合物を３７℃（内部温度）の水浴中、アルゴン雰囲気
下で３時間穏やかに撹拌して還元を完了させた。抗体に
対するチオール基のモル比（ＭＲ）を最初、およびその
後１時間ごとに決定した（実施例５に記載したようにし
て）（鎖間Ｓ−Ｓ結合の完全な還元を保証するため、Ｍ
Ｒは約１４にしておくべきである（ｃ））。緩んだ（還
元された）抗体を、冷室（４℃）中、オメガ接線膜（Ｏ
mega tangential membrane）に適合させたフィルトロン
ミニセット（ｄ）に連結した５Ｌ容貯蔵部に移した。還
元された抗体をＰＢＳ（ｂ）緩衝液（ｐＨ７.４）（２
Ｌ）で希釈し、約３５０ｍｌにダイアフィルトレーショ
ン／濃縮した（ｅ）。ついで、溶液をアルゴン雰囲気
下、清浄な滅菌プラスチック容器に移した。抗体濃度お
よびチオール基のモル濃度（それゆえ、抗体に対するチ
オール基のＭＲ）を上記のようにして決定した。
【００７１】ドキソルビシンヒドラゾンの前以て冷却し
た溶液（実施例３に記載のようにして調製）（２７.０
６ｍｌ、水中の０.００６３Ｍ溶液、０.１７２ミリモ
ル、各チオール基に対して１.１当量（ｆ））を冷室
（４℃）中で穏やかに撹拌しながら上記緩んだ抗体にア
ルゴンの定常流下で加えた。添加３０分後、赤い結合体
溶液を酢酸セルロースフィルター（０.４５μついで０.
２２μ）で洗練濾過し（polish filtered）、得られた
濾液（３５０ｍｌ）を以下の３つの部分に分けた：部分
１（１５０ｍｌ）、部分２（１００ｍｌ）および部分３
（１００ｍｌ）。部分１（１５０ｍｌ）を活性炭（ｇ）
（０.７５ｇ）とともに冷室中、アルゴン雰囲気下で撹
拌し、酢酸セルロース膜（０.２２μ）で濾過して標記
結合体を得た。ついで、抗体濃度およびドキソルビシン
のモル濃度（それゆえ、ドキソルビシンに対する抗体の
ＭＲ）を実施例５の記載と同様にして決定した。抗体の
濃度は８.１８ｍｇ／ｍｌであった。モル比は７.９６で
あり、ｐＨは７.２２であった。結合体を液体窒素中、
滅菌プラスチックびん中で４×５ｍｌおよび３×４０ｍ
ｌとして凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
た溶液（実施例３に記載のようにして調製）（２７.０
６ｍｌ、水中の０.００６３Ｍ溶液、０.１７２ミリモ
ル、各チオール基に対して１.１当量（ｆ））を冷室
（４℃）中で穏やかに撹拌しながら上記緩んだ抗体にア
ルゴンの定常流下で加えた。添加３０分後、赤い結合体
溶液を酢酸セルロースフィルター（０.４５μついで０.
２２μ）で洗練濾過し（polish filtered）、得られた
濾液（３５０ｍｌ）を以下の３つの部分に分けた：部分
１（１５０ｍｌ）、部分２（１００ｍｌ）および部分３
（１００ｍｌ）。部分１（１５０ｍｌ）を活性炭（ｇ）
（０.７５ｇ）とともに冷室中、アルゴン雰囲気下で撹
拌し、酢酸セルロース膜（０.２２μ）で濾過して標記
結合体を得た。ついで、抗体濃度およびドキソルビシン
のモル濃度（それゆえ、ドキソルビシンに対する抗体の
ＭＲ）を実施例５の記載と同様にして決定した。抗体の
濃度は８.１８ｍｇ／ｍｌであった。モル比は７.９６で
あり、ｐＨは７.２２であった。結合体を液体窒素中、
滅菌プラスチックびん中で４×５ｍｌおよび３×４０ｍ
ｌとして凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【００７２】（注）： ａ：クエン酸緩衝液（２５ｍＭクエン酸ナトリウムおよ
び２５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５.５）中のＢＲ９
６のｐＨを飽和二塩基性リン酸ナトリウム（ｐＨ９.
０、約１０ｍｌ）で７.４１に調節した。 ｂ：ＰＢＳ緩衝液をギブコ・ラボラトリーズから購入
し、以下のようにして修飾した：ＰＢＳ緩衝液（塩化カ
リウム（２.００ｇ）、リン酸カリウム一塩基性（２.０
０ｇ）、塩化ナトリウム（８０.００ｇ）およびリン酸
ナトリウム二塩基性（２１.６０ｇ）を含有）（５００
ｍｌ）を注射用水（ＷＦＩ）で５Ｌに希釈し、１Ｎ水酸
化ナトリウムでｐＨを７.４に調節し、得られた溶液を
０.２２μ酢酸セルロース膜で濾過した。 ｃ：おそらく反応混合物中の痕跡量の金属の存在のため
にＭＲが低くなる場合には、ＤＴＴをさらに加えるべき
である。還元はまた、抗体中に存在する酸化性金属をキ
レートするためにＥＤＴＡ（ＰＢＳ緩衝液中の１ｍＭ溶
液）の存在下で行うこともできる。
び２５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５.５）中のＢＲ９
６のｐＨを飽和二塩基性リン酸ナトリウム（ｐＨ９.
０、約１０ｍｌ）で７.４１に調節した。 ｂ：ＰＢＳ緩衝液をギブコ・ラボラトリーズから購入
し、以下のようにして修飾した：ＰＢＳ緩衝液（塩化カ
リウム（２.００ｇ）、リン酸カリウム一塩基性（２.０
０ｇ）、塩化ナトリウム（８０.００ｇ）およびリン酸
ナトリウム二塩基性（２１.６０ｇ）を含有）（５００
ｍｌ）を注射用水（ＷＦＩ）で５Ｌに希釈し、１Ｎ水酸
化ナトリウムでｐＨを７.４に調節し、得られた溶液を
０.２２μ酢酸セルロース膜で濾過した。 ｃ：おそらく反応混合物中の痕跡量の金属の存在のため
にＭＲが低くなる場合には、ＤＴＴをさらに加えるべき
である。還元はまた、抗体中に存在する酸化性金属をキ
レートするためにＥＤＴＡ（ＰＢＳ緩衝液中の１ｍＭ溶
液）の存在下で行うこともできる。
【００７３】ｄ：ミニセットおよびオメガ接線膜はフィ
ルトロンから購入した。この膜は、３０,０００ＭＷの
カットオフを有するポリエーテルスルホンからできてい
る。この溶液をワトソン−マーロウ６０４Ｓ／Ｒ蠕動ポ
ンプを用い、２５〜３０ｐｓｉにて超濾過システムにポ
ンプで送りこんだ。 ｅ：ダイアフィルトレーション／濃縮速度は６５ｍｌ／
分であった。抗体に対するチオールのＭＲについて溶出
液をモニターした。約１.６Ｌが溶出された後、溶出液
のＭＲは０.４４であった。この時点までに大部分の酸
化されたＤＴＴおよび過剰のＤＴＴが反応混合物から除
去されたものと思われた。 ｆ：必要なドキソルビシンヒドラゾンの容量を以下の等
式に従って計算した。 ［（チオールのモル濃度）×（緩んだ抗体の容量）×
１.１］／６.３×１０-3 （式中、６.３×１０-3はドキソルビシンヒドラゾン溶
液のモル濃度であり、１.１は各チオール基に対するド
キソルビシンヒドラゾンの当量数である） ｇ：洗浄液のｐＨが７.４で一定となるまで、活性炭
（フィッシャー・サイエンティフィック、カタログ＃７
４４０−４４−０、ノリット、中性）を撹拌しながらＰ
ＢＳ緩衝液（ｐＨ７.４）で洗浄し、真空乾燥させた。
ルトロンから購入した。この膜は、３０,０００ＭＷの
カットオフを有するポリエーテルスルホンからできてい
る。この溶液をワトソン−マーロウ６０４Ｓ／Ｒ蠕動ポ
ンプを用い、２５〜３０ｐｓｉにて超濾過システムにポ
ンプで送りこんだ。 ｅ：ダイアフィルトレーション／濃縮速度は６５ｍｌ／
分であった。抗体に対するチオールのＭＲについて溶出
液をモニターした。約１.６Ｌが溶出された後、溶出液
のＭＲは０.４４であった。この時点までに大部分の酸
化されたＤＴＴおよび過剰のＤＴＴが反応混合物から除
去されたものと思われた。 ｆ：必要なドキソルビシンヒドラゾンの容量を以下の等
式に従って計算した。 ［（チオールのモル濃度）×（緩んだ抗体の容量）×
１.１］／６.３×１０-3 （式中、６.３×１０-3はドキソルビシンヒドラゾン溶
液のモル濃度であり、１.１は各チオール基に対するド
キソルビシンヒドラゾンの当量数である） ｇ：洗浄液のｐＨが７.４で一定となるまで、活性炭
（フィッシャー・サイエンティフィック、カタログ＃７
４４０−４４−０、ノリット、中性）を撹拌しながらＰ
ＢＳ緩衝液（ｐＨ７.４）で洗浄し、真空乾燥させた。
【００７４】実施例６ ドキソルビシンＢＲ９６結合体（ドキソルビシンの６−
マレイミドカプロイルヒドラゾンへ結合したＢＲ９６モ
ノクローナル抗体）の任意の製造手順 クエン酸緩衝液（ｐＨ５.４）からリン酸緩衝液（ｐＨ
７.８）への緩衝液交換： ＢＲ９６ＭＡｂをクエン酸緩
衝食塩水（ＣＢＳ）中に供給した（１）。ＤＴＴ還元す
る前に、２つのカセット（３）と適合したフィルトロン
ミニセットを用い、ＣＢＳ緩衝液中のＢＲ９６を５容量
のＰＢＳ緩衝液（２）でダイアフィルトレーションし
た。
マレイミドカプロイルヒドラゾンへ結合したＢＲ９６モ
ノクローナル抗体）の任意の製造手順 クエン酸緩衝液（ｐＨ５.４）からリン酸緩衝液（ｐＨ
７.８）への緩衝液交換： ＢＲ９６ＭＡｂをクエン酸緩
衝食塩水（ＣＢＳ）中に供給した（１）。ＤＴＴ還元す
る前に、２つのカセット（３）と適合したフィルトロン
ミニセットを用い、ＣＢＳ緩衝液中のＢＲ９６を５容量
のＰＢＳ緩衝液（２）でダイアフィルトレーションし
た。
【００７５】結合体の調製：３つ首丸底フラスコ中の上
記モノクローナル抗体ＢＲ９６の溶液（４８０ｍｌ、ｐ
Ｈ７.７６、０.０３２ミリモル、濃度＝リン酸緩衝食塩
水（２）中に１０.７７ｍｇ／ｍｌ）に、撹拌しながら
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の溶液（１６.２ｍｌ、
ＰＢＳ緩衝液中に０.０１Ｍ、０.１６２ミリモル、５.
０モル当量）を約２〜３分かけて加えた。混合物を３７
℃（内部温度）の水浴中、アルゴン雰囲気下で４時間穏
やかに撹拌して還元を完了させた。ついで、反応混合物
を氷浴中で冷却した。ドキソルビシンヒドラゾンの前以
て冷却した溶液（実施例３に記載のようにして調製、５
６ｍｌ、水中の０.００６３Ｍ溶液、０.３５６ミリモ
ル）を還元された抗体に撹拌しながらアルゴンの一定流
下、０〜４℃にてゆっくりと加えた。添加２０分後、赤
い結合体溶液を酢酸セルロース膜（０.４５μ、ついで
０.２２μ）で洗練濾過した。得られた濾液（５１０ｍ
ｌ）を活性炭（４）（７.０ｇ）とともに０〜４℃の氷
浴中、アルゴン雰囲気下で１５分間撹拌した。これを２
つの酢酸セルロース膜（０.４５μ、ついで０.２２μ）
で濾過して標記結合体（４９５ｍｌ）を得た。ついで、
実施例４に記載のようにして抗体濃度およびドキソルビ
シンのモル濃度（それゆえ、ドキソルビシンに対する抗
体のＭＲ）を決定した。抗体濃度は８.４２ｍｇ／ｍｌ
であった。モル比は８.２６であり、ｐＨは７.４４であ
った。ついで、結合体を液体窒素中、滅菌プラスチック
びん中で４×１００ｍｌ、５×５ｍｌおよび２×３５ｍ
ｌとして凍結させ、−８０℃にて貯蔵した。
記モノクローナル抗体ＢＲ９６の溶液（４８０ｍｌ、ｐ
Ｈ７.７６、０.０３２ミリモル、濃度＝リン酸緩衝食塩
水（２）中に１０.７７ｍｇ／ｍｌ）に、撹拌しながら
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の溶液（１６.２ｍｌ、
ＰＢＳ緩衝液中に０.０１Ｍ、０.１６２ミリモル、５.
０モル当量）を約２〜３分かけて加えた。混合物を３７
℃（内部温度）の水浴中、アルゴン雰囲気下で４時間穏
やかに撹拌して還元を完了させた。ついで、反応混合物
を氷浴中で冷却した。ドキソルビシンヒドラゾンの前以
て冷却した溶液（実施例３に記載のようにして調製、５
６ｍｌ、水中の０.００６３Ｍ溶液、０.３５６ミリモ
ル）を還元された抗体に撹拌しながらアルゴンの一定流
下、０〜４℃にてゆっくりと加えた。添加２０分後、赤
い結合体溶液を酢酸セルロース膜（０.４５μ、ついで
０.２２μ）で洗練濾過した。得られた濾液（５１０ｍ
ｌ）を活性炭（４）（７.０ｇ）とともに０〜４℃の氷
浴中、アルゴン雰囲気下で１５分間撹拌した。これを２
つの酢酸セルロース膜（０.４５μ、ついで０.２２μ）
で濾過して標記結合体（４９５ｍｌ）を得た。ついで、
実施例４に記載のようにして抗体濃度およびドキソルビ
シンのモル濃度（それゆえ、ドキソルビシンに対する抗
体のＭＲ）を決定した。抗体濃度は８.４２ｍｇ／ｍｌ
であった。モル比は８.２６であり、ｐＨは７.４４であ
った。ついで、結合体を液体窒素中、滅菌プラスチック
びん中で４×１００ｍｌ、５×５ｍｌおよび２×３５ｍ
ｌとして凍結させ、−８０℃にて貯蔵した。
【００７６】（注）： １．クエン酸緩衝液（２５ｍＭクエン酸ナトリウムおよ
び２５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５.５）中のＢＲ９
６ ２．ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７.８、０.０１Ｍリン酸ナトリ
ウムおよび０.１Ｍ塩化ナトリウム）は以下のようにし
て調製した。 ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ ０.１４ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4 １.２８ｇ ＮａＣｌ ５.８５ｇ 水（ＷＦＩ） 全量１リットル １Ｎ ＮａＯＨ 〜０.７ｍｌ（ｐＨが７.８に
なるまで添加） ０.２２μ酢酸セルロース膜で濾過。 ３．カセットは、３０,０００ＭＷのカットオフを有す
るポリエーテルスルホンでできている。 ４．洗浄液のｐＨが７.４で一定となるまで、活性炭
（フィッシャー・サイエンティフィック、カタログ＃７
４４０−４４−０、ノリット、中性）を撹拌しながらＰ
ＢＳ緩衝液（ｐＨ７.４）で洗浄し、真空乾燥させた。
び２５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５.５）中のＢＲ９
６ ２．ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７.８、０.０１Ｍリン酸ナトリ
ウムおよび０.１Ｍ塩化ナトリウム）は以下のようにし
て調製した。 ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ ０.１４ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4 １.２８ｇ ＮａＣｌ ５.８５ｇ 水（ＷＦＩ） 全量１リットル １Ｎ ＮａＯＨ 〜０.７ｍｌ（ｐＨが７.８に
なるまで添加） ０.２２μ酢酸セルロース膜で濾過。 ３．カセットは、３０,０００ＭＷのカットオフを有す
るポリエーテルスルホンでできている。 ４．洗浄液のｐＨが７.４で一定となるまで、活性炭
（フィッシャー・サイエンティフィック、カタログ＃７
４４０−４４−０、ノリット、中性）を撹拌しながらＰ
ＢＳ緩衝液（ｐＨ７.４）で洗浄し、真空乾燥させた。
【００７７】実施例７ バイオ−ビーズTMを用いたドキソルビシン−ＢＲ９６結
合体の精製 粗製の結合体（活性炭精製を行うことなく実施例４また
は５で調製したものなど）をバッチ法においてバイオ−
ビーズTMＳＭ−２により以下のようにして精製した。上
記粗製の結合体（１００ｍｌ）およびバイオ−ビーズTM
ＳＭ−２（５０.０ｇ）を冷室（４℃）中の滅菌ポリス
チレンフラスコ中、アルゴン雰囲気下で３０分間撹拌し
た。結合体溶液を酢酸セルロースフィルター（０.２２
μ）で濾過し、実施例４と同様にしてＭＲ（抗体に対す
る薬剤のモル比）を測定したところ８.１２であること
がわかり、抗体濃度は６.７４ｍｇ／ｍｌであった。つ
いで、結合体を液体窒素中、滅菌プラスチックびん中で
２×５ｍｌおよび２×４０ｍｌとして凍結し、−８０℃
で貯蔵した。 １．ポリスチレン−ジビニルベンゼン製のバイオ−ビー
ズTM（タイプ：ＳＭ−２）をバイオ−ラド・ラボラトリ
ーズから購入した。使用前に、０.５Ｎ水酸化ナトリウ
ム、水（中性になるまで）、メタノールおよび水で順番
に洗浄し、最後に冷室中でＰＢＳ緩衝液で平衡化した
（約２時間）。
合体の精製 粗製の結合体（活性炭精製を行うことなく実施例４また
は５で調製したものなど）をバッチ法においてバイオ−
ビーズTMＳＭ−２により以下のようにして精製した。上
記粗製の結合体（１００ｍｌ）およびバイオ−ビーズTM
ＳＭ−２（５０.０ｇ）を冷室（４℃）中の滅菌ポリス
チレンフラスコ中、アルゴン雰囲気下で３０分間撹拌し
た。結合体溶液を酢酸セルロースフィルター（０.２２
μ）で濾過し、実施例４と同様にしてＭＲ（抗体に対す
る薬剤のモル比）を測定したところ８.１２であること
がわかり、抗体濃度は６.７４ｍｇ／ｍｌであった。つ
いで、結合体を液体窒素中、滅菌プラスチックびん中で
２×５ｍｌおよび２×４０ｍｌとして凍結し、−８０℃
で貯蔵した。 １．ポリスチレン−ジビニルベンゼン製のバイオ−ビー
ズTM（タイプ：ＳＭ−２）をバイオ−ラド・ラボラトリ
ーズから購入した。使用前に、０.５Ｎ水酸化ナトリウ
ム、水（中性になるまで）、メタノールおよび水で順番
に洗浄し、最後に冷室中でＰＢＳ緩衝液で平衡化した
（約２時間）。
【００７８】実施例８ 透析によるドキソルビシン−ＢＲ９６結合体の精製 活性炭精製を行うことなく実施例４で調製したものなど
の粗製の結合体（３５０ｍｌ）をダイアフィルトレーシ
ョンにより以下のようにして精製した。上記結合体を、
ＹＭ３０スパイラルカートリッジを適合したアミコンＣ
Ｈ２ＲＳダイアライザーの貯蔵部に移し、冷室中、アル
ゴン雰囲気下でダイアフィルトレーションした。濾液の
流速は〜２０ｍｌ／分であった。結合体を滅菌ナルジー
ン（Ｎalgene）ＰＥＴＥびんに移した。ついで、抗体濃
度およびドキソルビシンのモル濃度（それゆえ、ドキソ
ルビシンに対する抗体のＭＲ）を決定した。結合体のｐ
Ｈは７.６であった。抗体濃度は９.２ｍｇ／ｍｌであ
り、モル比は８.２５であった。生成物を液体窒素中、
滅菌プラスチックびん中で３×１００ｍｌ、１×２０ｍ
ｌおよび２×５ｍｌとして凍結させ、−８０℃で貯蔵し
た。
の粗製の結合体（３５０ｍｌ）をダイアフィルトレーシ
ョンにより以下のようにして精製した。上記結合体を、
ＹＭ３０スパイラルカートリッジを適合したアミコンＣ
Ｈ２ＲＳダイアライザーの貯蔵部に移し、冷室中、アル
ゴン雰囲気下でダイアフィルトレーションした。濾液の
流速は〜２０ｍｌ／分であった。結合体を滅菌ナルジー
ン（Ｎalgene）ＰＥＴＥびんに移した。ついで、抗体濃
度およびドキソルビシンのモル濃度（それゆえ、ドキソ
ルビシンに対する抗体のＭＲ）を決定した。結合体のｐ
Ｈは７.６であった。抗体濃度は９.２ｍｇ／ｍｌであ
り、モル比は８.２５であった。生成物を液体窒素中、
滅菌プラスチックびん中で３×１００ｍｌ、１×２０ｍ
ｌおよび２×５ｍｌとして凍結させ、−８０℃で貯蔵し
た。
【００７９】実施例９ カチオン交換によるドキソルビシン−ＢＲ９６結合体の
精製 Ａ．樹脂の調製、カラムの充填および平衡化： ＣＭセフ
ァロースTMＣ−２５（１）（５００ｇ）を０.５Ｎ Ｎａ
Ｃｌ（２Ｌ）中、室温にて２時間膨潤させた。上澄みの
水性層をデカントした後、湿潤樹脂をＰＢＳ緩衝液
（２）（４Ｌ）中、室温で２日間貯蔵した。ＰＢＳ緩衝
液をデカントし、１Ｎ ＮａＣｌ（３Ｌ）で置換し、１
６時間後、膨潤した樹脂（３）を用いてカラムを充填し
た。組み立てた（assembled）ＢＰＧ１００（ファルマ
シア）カラム（４）を、まず１Ｎ ＮａＣｌで濯いだ。
１Ｎ ＮａＣｌ（全容量３Ｌ）中の膨潤したＣＭセファ
デックスＣ−２５樹脂をゆっくりとカラム中に注ぎ、充
填した。ついで、このカラムをＰＢＳ緩衝液（３容量）
で溶出／洗浄することにより平衡化した（５）。カラム
の試験はアセトンおよび１Ｎ ＮａＣｌを用いて行った
（６）。充填カラムを〜４℃にて２日間貯蔵して使用前
に平衡化した。
精製 Ａ．樹脂の調製、カラムの充填および平衡化： ＣＭセフ
ァロースTMＣ−２５（１）（５００ｇ）を０.５Ｎ Ｎａ
Ｃｌ（２Ｌ）中、室温にて２時間膨潤させた。上澄みの
水性層をデカントした後、湿潤樹脂をＰＢＳ緩衝液
（２）（４Ｌ）中、室温で２日間貯蔵した。ＰＢＳ緩衝
液をデカントし、１Ｎ ＮａＣｌ（３Ｌ）で置換し、１
６時間後、膨潤した樹脂（３）を用いてカラムを充填し
た。組み立てた（assembled）ＢＰＧ１００（ファルマ
シア）カラム（４）を、まず１Ｎ ＮａＣｌで濯いだ。
１Ｎ ＮａＣｌ（全容量３Ｌ）中の膨潤したＣＭセファ
デックスＣ−２５樹脂をゆっくりとカラム中に注ぎ、充
填した。ついで、このカラムをＰＢＳ緩衝液（３容量）
で溶出／洗浄することにより平衡化した（５）。カラム
の試験はアセトンおよび１Ｎ ＮａＣｌを用いて行った
（６）。充填カラムを〜４℃にて２日間貯蔵して使用前
に平衡化した。
【００８０】Ｂ．結合体の精製：ＰＢＳ緩衝液中の新た
に調製した粗製の結合体（７）（活性炭精製することな
く実施例４で調製したものなど）（濃度（８）＝１０.
５ｍｇ／ｍｌ、ＭＲ＝１０.０；４３０ｍｌ）を蠕動ポ
ンプを用い、３５ｍｌ／分の容量流速にて４℃で約１２
分かけて上記カラムに負荷した（９）。結合体を約６０
ｍｌの流速にてＰＢＳ緩衝液で溶出した。約９分で溶出
液を３つの画分にて回収した；最初に４０ｍｌの画分、
ついで単一画分として４６５ｍｌの結合体の主要部分、
および最後に６５ｍｌの非常に希薄な第三の画分。 上記画分のＵＶ分析の結果： 画分 Ｉ ＩＩ ＩＩＩ 回収した容量（ｍＬ） ４０ ４６５ ６５ タンパク質（ｇ） ０.１ ４.３６ ０.０９ ＭＲ ６.８４ ７.６４ ８.１６ 回収％ ２.０ ９６.０ ２.０
に調製した粗製の結合体（７）（活性炭精製することな
く実施例４で調製したものなど）（濃度（８）＝１０.
５ｍｇ／ｍｌ、ＭＲ＝１０.０；４３０ｍｌ）を蠕動ポ
ンプを用い、３５ｍｌ／分の容量流速にて４℃で約１２
分かけて上記カラムに負荷した（９）。結合体を約６０
ｍｌの流速にてＰＢＳ緩衝液で溶出した。約９分で溶出
液を３つの画分にて回収した；最初に４０ｍｌの画分、
ついで単一画分として４６５ｍｌの結合体の主要部分、
および最後に６５ｍｌの非常に希薄な第三の画分。 上記画分のＵＶ分析の結果： 画分 Ｉ ＩＩ ＩＩＩ 回収した容量（ｍＬ） ４０ ４６５ ６５ タンパク質（ｇ） ０.１ ４.３６ ０.０９ ＭＲ ６.８４ ７.６４ ８.１６ 回収％ ２.０ ９６.０ ２.０
【００８１】Ｃ．カラムの再生および平衡化：結合体が
溶出された後、カラムを１Ｎ ＮａＣｌ（３容量）で洗
浄し、ついでＰＢＳ緩衝液（３容量）で洗浄／溶出する
ことにより再生した（１０）。 （注）： １．ＣＭセファデックスTMＣ−２５は、排除限界＝３×
１０4、ビーズ直径＝４０〜１２５μｍおよび全イオン
容量＝４〜５μモル／ｍＬを有する修飾したセファデッ
クスTMＧ−２５弱カチオン交換樹脂である。 ２．ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ＝７.
５）：ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ０.００１１７Ｍ；Ｎａ2Ｈ
ＰＯ4 ０.００９Ｍ；ＮａＣｌ ０.１Ｍ；イオン強度０.
１２８２；伝導率９.３９ｍＳ ３．５００ｇの樹脂を２８００ｍｌに膨潤させた。 ４．カラムの大きさ：Ｌ＝３６ｃｍ；Ｄ＝１０ｃｍ；ベ
ッド容量＝〜２８００ｍｌ ５．カラムを室温で充填および平衡化し、４℃の冷室に
移した。結合体を負荷する前にカラムをこの温度で１６
時間平衡化した。 流速（２８ｐｓｉ）：［容量］＝２１５ｍｌ／分；［線
形］＝２.７４ｍＬ／分／ｃｍ2
溶出された後、カラムを１Ｎ ＮａＣｌ（３容量）で洗
浄し、ついでＰＢＳ緩衝液（３容量）で洗浄／溶出する
ことにより再生した（１０）。 （注）： １．ＣＭセファデックスTMＣ−２５は、排除限界＝３×
１０4、ビーズ直径＝４０〜１２５μｍおよび全イオン
容量＝４〜５μモル／ｍＬを有する修飾したセファデッ
クスTMＧ−２５弱カチオン交換樹脂である。 ２．ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ＝７.
５）：ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ０.００１１７Ｍ；Ｎａ2Ｈ
ＰＯ4 ０.００９Ｍ；ＮａＣｌ ０.１Ｍ；イオン強度０.
１２８２；伝導率９.３９ｍＳ ３．５００ｇの樹脂を２８００ｍｌに膨潤させた。 ４．カラムの大きさ：Ｌ＝３６ｃｍ；Ｄ＝１０ｃｍ；ベ
ッド容量＝〜２８００ｍｌ ５．カラムを室温で充填および平衡化し、４℃の冷室に
移した。結合体を負荷する前にカラムをこの温度で１６
時間平衡化した。 流速（２８ｐｓｉ）：［容量］＝２１５ｍｌ／分；［線
形］＝２.７４ｍＬ／分／ｃｍ2
【００８２】６．この場合のＨＥＴＰは０.０７２であ
った。０.１と０.０１の間の値が許容できる数値である
（ファルマシア）。ＨＥＴＰ（理論段高さ）＝Ｌ／Ｎ
（式中、Ｌ＝ベッド高（ｃｍ）、Ｎ＝理論段数）。Ｎ＝
５.５４（Ｖｅ／Ｗ1/2）2（式中、Ｖｅ＝溶出容量（ｍ
Ｌ）、Ｗ1/2＝半分の高さにおけるピーク幅（ｍＬ）） ７．カラムに充填する前に粗製の結合体を酢酸セルロー
ス膜（プレフィルター０.４４μ、ついで０.２２μ）で
洗練濾過した。 ８．抗体のモル濃度（ｍｇ／ｍｌ）はＰＥラムダ６ＵＶ
／可視分光光度計を用いて決定した。 ＭＣ（抗体）＝［Ａ280−（０.７２４−Ａ495）］／１.
４ （式中、０.７２４は２８０ｎｍにおけるドキソルビシ
ンの吸光度の補正係数であり、１.４は２８０ｎｍにお
ける抗体のＵＶ吸光度である） ９．物質負荷比（ベッド容量：結合体の容量）＝６.
５：１ １０．カラムの再生および平衡化には約１.５〜２時間
かかった。しかしながら、カラムを３回使用した後、樹
脂の上端部に明瞭な赤い薄層が観察された。カラム再生
法によっては、この赤色は完全には取り除かれなかっ
た。再生および平衡化の後の溶出液のＵＶ吸光度は、２
８０ｎｍおよび４９５ｎｍにおいて０の読み取りを示し
た。
った。０.１と０.０１の間の値が許容できる数値である
（ファルマシア）。ＨＥＴＰ（理論段高さ）＝Ｌ／Ｎ
（式中、Ｌ＝ベッド高（ｃｍ）、Ｎ＝理論段数）。Ｎ＝
５.５４（Ｖｅ／Ｗ1/2）2（式中、Ｖｅ＝溶出容量（ｍ
Ｌ）、Ｗ1/2＝半分の高さにおけるピーク幅（ｍＬ）） ７．カラムに充填する前に粗製の結合体を酢酸セルロー
ス膜（プレフィルター０.４４μ、ついで０.２２μ）で
洗練濾過した。 ８．抗体のモル濃度（ｍｇ／ｍｌ）はＰＥラムダ６ＵＶ
／可視分光光度計を用いて決定した。 ＭＣ（抗体）＝［Ａ280−（０.７２４−Ａ495）］／１.
４ （式中、０.７２４は２８０ｎｍにおけるドキソルビシ
ンの吸光度の補正係数であり、１.４は２８０ｎｍにお
ける抗体のＵＶ吸光度である） ９．物質負荷比（ベッド容量：結合体の容量）＝６.
５：１ １０．カラムの再生および平衡化には約１.５〜２時間
かかった。しかしながら、カラムを３回使用した後、樹
脂の上端部に明瞭な赤い薄層が観察された。カラム再生
法によっては、この赤色は完全には取り除かれなかっ
た。再生および平衡化の後の溶出液のＵＶ吸光度は、２
８０ｎｍおよび４９５ｎｍにおいて０の読み取りを示し
た。
【００８３】実施例１０ カラムクロマトグラフィーによるドキソルビシン−ＢＲ
９６結合体の精製 カラムの調製： ＣＭセファデックスTMＣ−２５樹脂（実
施例９に記載のもの）の調製、カラムの充填、最初の洗
浄および再生は実施例９に記載してある。結合体の精製： ＰＢＳ緩衝液（実施例９に記載のもの）
中の新たに調製した粗製の結合体（活性炭精製すること
なく実施例４で調製したものなど）（濃度＝９.０１ｍ
ｇ／ｍＬおよびＭＲ＝１２.３１；４３０ｍＬ）を、蠕
動ポンプを用い、約９分間、５０ｍｌ／分の容量流速に
て上記カラム（実施例９に記載したもの；４℃にて１６
時間平衡化）に負荷した。結合体をＰＢＳ緩衝液で約６
０ｍｌ／分の流速にて溶出した。溶出液を約９分間、３
つの画分にて回収した：最初に４０ｍｌの画分、ついで
４５０ｍｌ画分にて結合体の主要部分、および最後に６
０ｍｌの非常に希薄な第三の画分。
９６結合体の精製 カラムの調製： ＣＭセファデックスTMＣ−２５樹脂（実
施例９に記載のもの）の調製、カラムの充填、最初の洗
浄および再生は実施例９に記載してある。結合体の精製： ＰＢＳ緩衝液（実施例９に記載のもの）
中の新たに調製した粗製の結合体（活性炭精製すること
なく実施例４で調製したものなど）（濃度＝９.０１ｍ
ｇ／ｍＬおよびＭＲ＝１２.３１；４３０ｍＬ）を、蠕
動ポンプを用い、約９分間、５０ｍｌ／分の容量流速に
て上記カラム（実施例９に記載したもの；４℃にて１６
時間平衡化）に負荷した。結合体をＰＢＳ緩衝液で約６
０ｍｌ／分の流速にて溶出した。溶出液を約９分間、３
つの画分にて回収した：最初に４０ｍｌの画分、ついで
４５０ｍｌ画分にて結合体の主要部分、および最後に６
０ｍｌの非常に希薄な第三の画分。
【００８４】 上記画分のＵＶ分析の結果： 画分 Ｉ ＩＩ ＩＩＩ 回収した容量（ｍＬ） ４０ ４５０ ６５ タンパク質（ｇ） ０.０８ ３.６６ ０.０８ ＭＲ ７.７ ８.４２ ８.４１ 回収％ ２.０ ９５.０ ２.０ カラムの再生および平衡化：結合体を溶出した後、カラ
ムを１Ｎ ＮａＣｌ（３容量）で洗浄し、ついでＰＢＳ
緩衝液（３容量）で洗浄／溶出することにより再生した
（実施例９に記載のようにして）。
ムを１Ｎ ＮａＣｌ（３容量）で洗浄し、ついでＰＢＳ
緩衝液（３容量）で洗浄／溶出することにより再生した
（実施例９に記載のようにして）。
【００８５】実施例１１ ダイアフィルトレーションによるドキソルビシン−ＢＲ
９６結合体の濃縮 実施例４において調製したものなどの精製した結合体
（３５２０ｍｌ；濃度は８.５ｍｇ／ｍｌ）を、以下の
ようにして濃縮した。上記結合体を、ＹＭ３０再生酢酸
セルローススパイラルカートリッジに適合したアミコン
ＣＨ２ＲＳダイアライザー上の貯蔵部に移し、冷室中、
アルゴン雰囲気下で濃縮した。流速は〜２０ｍｌ／分で
あった。結合体を約１７８５ｍｌ（濃度は１７.３ｍｇ
／ｍｌ）に濃縮し、滅菌ナルジーンＰＥＴＥびんに移し
た。抗体濃度およびドキソルビシンのモル濃度（それゆ
え、ドキソルビシンに対する抗体のＭＲ）を決定した。
結合体のｐＨは７.７であった。抗体濃度は１７.３ｍｇ
／ｍｌであり、モル比は８.３９であった。生成物を液
体窒素中、滅菌プラスチックびん中で１７×１００ｍ
ｌ、１×５５ｍｌおよび６×５ｍｌとして凍結し、−８
０℃で貯蔵した。
９６結合体の濃縮 実施例４において調製したものなどの精製した結合体
（３５２０ｍｌ；濃度は８.５ｍｇ／ｍｌ）を、以下の
ようにして濃縮した。上記結合体を、ＹＭ３０再生酢酸
セルローススパイラルカートリッジに適合したアミコン
ＣＨ２ＲＳダイアライザー上の貯蔵部に移し、冷室中、
アルゴン雰囲気下で濃縮した。流速は〜２０ｍｌ／分で
あった。結合体を約１７８５ｍｌ（濃度は１７.３ｍｇ
／ｍｌ）に濃縮し、滅菌ナルジーンＰＥＴＥびんに移し
た。抗体濃度およびドキソルビシンのモル濃度（それゆ
え、ドキソルビシンに対する抗体のＭＲ）を決定した。
結合体のｐＨは７.７であった。抗体濃度は１７.３ｍｇ
／ｍｌであり、モル比は８.３９であった。生成物を液
体窒素中、滅菌プラスチックびん中で１７×１００ｍ
ｌ、１×５５ｍｌおよび６×５ｍｌとして凍結し、−８
０℃で貯蔵した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヤダギリ・ペンドリ アメリカ合衆国ニュージャージー州マタワ ン、ウィンストン・ドライブ108番 (72)発明者 クマール・ジー・ガダマセッティ アメリカ合衆国ニュージャージー州プリン ストン・ジャンクション、リード・ドライ ブ・サウス62番 (72)発明者 ウェン−セン・リ アメリカ合衆国ニュージャージー州マール ボロ、ホリー・ヒル・ロード３番 (72)発明者 リチャード・エイチ・ミューラー アメリカ合衆国ニュージャージー州リンゴ ーズ、リンドバーク・ロード66番
Claims (39)
- 【請求項１】 式： 【化１】 （式中、ｎは約１〜約１０の整数；ｑは４〜１０；ＭＡ
ｂは、緩んだキメラＢＲ９６抗体、ＢＲ９６抗体、キメ
ラＢＲ９６抗体または緩んだＢＲ９６抗体である免疫グ
ロブリン、またはその抗原結合性断片）で示されるチオ
エーテル結合体の製造法であって、第一の方法として、
（ａ）約６〜約９の範囲のｐＨを有するリン酸緩衝液を
含有する式： ＭＡｂ−（ＳＨ）6〜9 の還元された形態の免疫グロブリンチオエーテルの緩衝
溶液を用意し、（ｂ）上記還元された形態の免疫グロブ
リンチオエーテルの緩衝溶液を不活性雰囲気下でダイア
フィルトレーションしてダイアフィルトレーションした
溶液を得、（ｃ）上記免疫グロブリンチオエーテルのダ
イアフィルトレーションした溶液を式： 【化２】 （式中、ｎは前記と同じ）で示されるドキソルビシンヒ
ドラゾンの溶液と不活性雰囲気下で反応させて粗製のチ
オエーテル結合体を生成させ、ついで（ｄ）該チオエー
テル結合体を精製するか；または第二の方法として、
（ａ）式： 【化３】 で示される免疫グロブリンチオエーテルのダイアフィル
トレーションしたリン酸緩衝溶液であって約６〜約９の
範囲のｐＨを有するものを用意し、（ｂ）該免疫グロブ
リンチオエーテルのリン酸緩衝溶液を還元剤のリン酸緩
衝溶液で不活性雰囲気下で処理して式： ＭＡｂ−（ＳＨ）6〜9 で示される還元された免疫グロブリンチオエーテルの緩
衝溶液を生成させ、（ｃ）該還元された免疫グロブリン
チオエーテルの緩衝溶液を式： 【化４】 （式中、ｎは前記と同じ）で示されるドキソルビシンヒ
ドラゾンの溶液と不活性雰囲気下で反応させて粗製のチ
オエーテル結合体を生成させ、ついで（ｄ）該チオエー
テル結合体を精製することを特徴とする方法。 - 【請求項２】 第一の方法において、該還元された形態
の免疫グロブリンチオエーテルの緩衝溶液の調製を、
（ａ）約４〜約６の範囲のｐＨを有するクエン酸緩衝液
中の式： 【化５】 で示される免疫グロブリンチオエーテルを用意し、
（ｂ）該緩衝免疫グロブリンチオエーテルを約６〜約１
０の範囲のｐＨを有するリン酸緩衝溶液で処理して約６
〜約９の範囲のｐＨを有する免疫グロブリンチオエーテ
ルの緩衝溶液を得、ついで（ｃ）該緩衝免疫グロブリン
チオエーテルを還元剤のリン酸緩衝溶液で不活性雰囲気
下で処理して還元された免疫グロブリンチオエーテルの
緩衝溶液を生成させることによって行う、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項３】 ｎが５であり、ＭＡｂが緩んだキメラＢ
Ｒ９６抗体である請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 還元剤がジチオトレイトールである請求
項２に記載の方法。 - 【請求項５】 緩衝免疫グロブリンチオエーテルと緩衝
還元剤との反応を、約２５〜約４５℃の範囲の温度にて
アルゴン雰囲気下、約１〜約５時間行う請求項２に記載
の方法。 - 【請求項６】 還元された免疫グロブリンチオエーテル
の緩衝溶液のダイアフィルトレーションを約−５〜約２
５℃の範囲の温度にてアルゴン雰囲気下で行う請求項１
に記載の方法。 - 【請求項７】 免疫グロブリンチオエーテルのダイアフ
ィルトレーションした溶液とドキソルビシンヒドラゾン
との反応を、約−５〜約２５℃の範囲の温度にてアルゴ
ン雰囲気下、約１０〜約６０分間行う、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項８】 還元剤を免疫グロブリンチオエーテルと
の約１０：１〜約５：１の範囲のモル比で用いる請求項
２に記載の方法。 - 【請求項９】 還元された免疫グロブリンチオエーテル
とドキソルビシンヒドラゾンとのモル比が約１：４〜約
１：１１の範囲である請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 ドキソルビシンヒドラゾンを、還元さ
れた免疫グロブリンチオエーテルの各チオールに対して
約１.０〜約１.５当量を与える量で用いる請求項１に記
載の方法。 - 【請求項１１】 クエン酸緩衝食塩水が、約１０ｍＭ〜
約７５ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび約５０ｍＭ〜約
５００ｍＭの塩化ナトリウムからなり、ｐＨが約５〜約
６.５である請求項２に記載の方法。 - 【請求項１２】 リン酸緩衝液がアルカリ金属リン酸塩
緩衝液である請求項２に記載の方法。 - 【請求項１３】 リン酸緩衝食塩水が、約０.００５Ｍ
〜約０.０２Ｍリン酸ナトリウムおよび約０.０５Ｍ〜約
０.２Ｍ塩化ナトリウムからなり、ｐＨが約７〜８であ
る請求項２に記載の方法。 - 【請求項１４】 リン酸緩衝食塩水が、約０.０４〜約
０.４重量％のＫＣｌ、約０.４〜約４重量％のＮａ2Ｈ
ＰＯ4、および約０.０４〜約０.４重量％のＫＨ2ＰＯ4
・Ｈ2Ｏからなる請求項２に記載の方法。 - 【請求項１５】 粗製のチオエーテル結合体の精製を、
該粗製の結合体を濾過し、該濾過した結合体を炭素また
は活性炭で処理することにより行う、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１６】 粗製のチオエーテル結合体の精製を膜
濾過により行う請求項１に記載の方法。 - 【請求項１７】 粗製のチオエーテル結合体の精製を、
該結合体を再生酢酸セルロース、ポリエーテル−スルホ
ン、ポリスルホンまたは親水化ポリアクリロニトリルに
通すことにより行う、請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 粗製のチオエーテル結合体の精製をビ
ーズを用いて行う請求項１に記載の方法。 - 【請求項１９】 該ビーズをバッチ法で用いる請求項１
８に記載の方法。 - 【請求項２０】 粗製のチオエーテル結合体の精製を、
該結合体をゲルまたは樹脂濾過媒体を含有するクロマト
グラフィーカラムに通すか、または該結合体をイオン交
換カラムに通すことにより行う、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項２１】 粗製のチオエーテル結合体の精製を、
ゲル濾過、イオン交換、または疎水性相互作用により行
う請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２２】 第二の方法において、式： 【化６】 で示される免疫グロブリンチオエーテルのダイアフィル
トレーションしたリン酸緩衝溶液の調製を、（ａ）約４
〜約６の範囲のｐＨを有するクエン酸緩衝食塩水中の免
疫グロブリンチオエーテルの溶液を用意し、（ｂ）該ク
エン酸緩衝免疫グロブリンチオエーテルを約６〜約９の
範囲のｐＨを有するリン酸緩衝液でダイアフィルトレー
ションして、約６〜約９の範囲のｐＨを有する免疫グロ
ブリンチオエーテルのダイアフィルトレーションしたリ
ン酸緩衝溶液を得ることにより行う請求項１に記載の方
法。 - 【請求項２３】 第二の方法において、ダイアフィルト
レーション工程の前にクエン酸緩衝免疫グロブリンチオ
エーテルの溶液を約１０ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌ
免疫グロブリンチオエーテルに濃縮する、請求項２２に
記載の方法。 - 【請求項２４】 免疫グロブリンチオエーテルのリン酸
緩衝溶液をキレート化剤で処理して、該免疫グロブリン
チオエーテル、リン酸緩衝剤または両者中に存在する金
属不純物を除去する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２５】 式： 【化７】 （式中、ｎは１〜１０）で示されるヒドラジド酸塩化合
物の製造法であって、（ａ）式： 【化８】 で示される結晶形の環状酸をアルキルカルバゼートを含
むカップリング試薬で処理することによってカップリン
グ反応に供して式： 【化９】 で示されるカルバゼートを生成させ、ついで（ｂ）上記
カルバゼート中間体を酸と反応させることにより脱保護
してヒドラジド酸塩を生成させることを特徴とする方
法。 - 【請求項２６】 出発物質の環状酸の調製を、（ａ）無
水マレイン酸を弱有機酸の存在下、式： Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ で示されるアミノ酸と反応させて式： 【化１０】 で示される酸縮合生成物を生成させ、ついで（ｂ）上記
酸を弱有機塩基および不活性有機溶媒の存在下、環化剤
で処理して式： 【化１１】 で示される環状酸を生成させることにより行う、請求項
２５に記載の方法。 - 【請求項２７】 出発物質の環状酸の調製を、無水マレ
イン酸を有機酸の存在下、式： Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ で示されるアミノ酸と不活性雰囲気下で反応させること
により行う、請求項２５に記載の方法。 - 【請求項２８】 無水マレイン酸をアミノカプロン酸で
あるアミノ酸と反応させる、請求項２６に記載の方法。 - 【請求項２９】 無水マレイン酸とアミノカプロン酸と
の反応を酢酸の存在下で行う請求項２８に記載の方法。 - 【請求項３０】 酸縮合生成物の環化に用いる環化剤が
クロロトリメチルシランまたはヘキサメチルジシラザン
であり、弱有機塩基がトリエチルアミンまたはジイソプ
ロピルエチルアミンであり、不活性有機溶媒がアセトニ
トリルであり、マレイミドカプロン酸を生成する、請求
項２９に記載の方法。 - 【請求項３１】 マレイミドカプロン酸を酢酸エチルお
よびヘキサンを用いて結晶化させる請求項３０に記載の
方法。 - 【請求項３２】 環化を約７０〜約１００℃の範囲の温
度で行う請求項３０に記載の方法。 - 【請求項３３】 環化酸のカップリングに用いるカップ
リング試薬がｔ−ブチルカルバゼート、Ｎ−メチルモル
ホリンおよびクロロギ酸イソブチルおよび不活性有機溶
媒を包含し、カルバゼート中間体を生成する請求項２５
に記載の方法。 - 【請求項３４】 カルバゼート中間体の単離を酢酸エチ
ルおよびヘキサンを用いた結晶化により行う請求項３３
に記載の方法。 - 【請求項３５】 カルバゼート中間体をトリフルオロ酢
酸と反応させて対応トリフルオロ酢酸塩を生成させる
か、または塩酸と反応させて対応塩酸塩を生成させるこ
とによって脱保護する、請求項２５に記載の方法。 - 【請求項３６】 マレイミドカプロン酸をＮ−メチルモ
ルホリン、クロロギ酸イソブチルおよび不活性有機溶媒
で処理し、ついでｔ−ブチルカルバゼートと不活性有機
溶媒の存在下で処理することによって該酸をカップリン
グ反応に供することを特徴とする、式： 【化１２】 で示されるｔ−ブチルカルバゼート中間体の製造法。 - 【請求項３７】 ダイアフィルトレーション法を用いる
ことを特徴とする、請求項１に記載の精製ドキソルビシ
ン−ＢＲ９６結合体を約１０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／
ｍｌの所望の濃度に濃縮する方法。 - 【請求項３８】 ドキソルビシン塩酸塩を式： 【化１３】 で示されるヒドラジド酸塩と酸およびアルコール溶媒の
存在下、不活性雰囲気下で反応させてドキソルビシンヒ
ドラゾンを生成させ、ついで該ドキソルビシンヒドラゾ
ンを単離することを特徴とする、請求項１に記載のドキ
ソルビシンヒドラゾンの製造法。 - 【請求項３９】 ドキソルビシンヒドラゾンの単離を、
該ドキソルビシンヒドラゾンを酢酸エチル、アセトニト
リルまたはテトラヒドロフランと低温にて反応させ、つ
いで濾過してドキソルビシンヒドラゾンを回収し、つい
で任意に該ヒドラゾンを***媒で洗浄することにより行
う、請求項３８に記載の方法。
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