JPH07213283A - トレハロース遊離酵素とその製造方法並びに用途 - Google Patents

トレハロース遊離酵素とその製造方法並びに用途

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JPH07213283A
JPH07213283A JP6079291A JP7929194A JPH07213283A JP H07213283 A JPH07213283 A JP H07213283A JP 6079291 A JP6079291 A JP 6079291A JP 7929194 A JP7929194 A JP 7929194A JP H07213283 A JPH07213283 A JP H07213283A
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和彦 丸田
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Toshio Miyake
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01141—4-Alpha-D-{(1->4)-alpha-D-glucano} trehalose trehalohydrolase (3.2.1.141)
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    • A61Q17/04—Topical preparations for affording protection against sunlight or other radiation; Topical sun tanning preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 還元性澱粉部分分解物からトレハロースを製
造するためのトレハロース遊離酵素とその製造方法並び
にその用途の確立を目的とする。 【構成】 本発明は、新規トレハロース遊離酵素とその
製造方法、それを産生する微生物、加えて、還元性澱粉
部分分解物から、このトレハロース遊離酵素と非還元性
糖質生成酵素とを用いて、トレハロースおよびそれを含
む糖質、並びにトレハロースを含有せしめた組成物を構
成とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トレハロース遊離酵素
とその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、末端
にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上
の非還元性糖質のトレハロース部分とそれ以外のグリコ
シル部分との間の結合を特異的に加水分解しトレハロー
スを遊離する新規トレハロース遊離酵素とその製造方
法、それを産生する微生物、加えて、この新規トレハロ
ース遊離酵素を用いて製造されるトレハロース、およ
び、このトレハロースを含有せしめた組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】グルコースを構成糖とする非還元性糖質
として、古くからトレハロース（α，α−トレハロー
ス）が知られており、その存在は、『アドバンシズ・イ
ン・カーボハイドレイト・ケミストリー（Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）』、第１８巻、第２０１乃至２２５頁（１９６
３年）アカデミック・プレス社（米国）および『アプラ
イド・アンド・エンビロメンタル・マイクロバイオロジ
ー（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）』、第５６巻、第３
２１３乃至３２１５頁（１９９０年）などにも記載され
ているように、少量ながら、微生物、きのこ、昆虫など
広範囲に及んでいる。トレハロースは、非還元性糖質ゆ
えにアミノ酸や蛋白質等のアミノ基を有する物質とアミ
ノカルボニル反応を起こさず、アミノ酸含有物質を損な
わないことから、褐変、劣化を懸念することなく利用、
加工できることが期待され、その工業的製造方法の確立
が望まれている。
【０００３】トレハロースの製造方法としては、例え
ば、特開昭５０−１５４４８５公報で報告されている微
生物を用いる方法や、特開昭５８−２１６６９５公報で
提案されているマルトース・ホスホリラーゼとトレハロ
ース・ホスホリラーゼとの組合わせでマルトースを変換
する方法などが知られている。しかしながら、微生物を
用いる方法は、菌体を出発原料とし、これに含まれるト
レハロースの含量が、通常、固形物当り１５ｗ／ｗ％
（以下、本明細書では、特にことわらない限り、ｗ／ｗ
％を％と略称する。）未満と低く、その上、これを抽出
・精製する工程が煩雑で、工業的製造方法としては不適
である。また、マルトース・ホスホリラーゼおよびトレ
ハロース・ホスホリラーゼを用いる方法は、いずれもグ
ルコース−１リン酸を経由しており、その基質濃度を高
めることが困難であり、また、両酵素の反応系が可逆反
応で目的物の生成率が低く、更には、両酵素の反応系を
安定に維持して反応をスムーズに進行させることが困難
であって、未だ、工業的製造方法として実現するに至っ
ていない。
【０００４】これに関係して、『月刊フードケミカ
ル』、８月号、第６７乃至７２頁（１９９２年）、「澱
粉利用開発の現状と課題」の「オリゴ糖」の項におい
て、「トレハロースについては著しく広い応用範囲が考
えられるが、本糖の澱粉糖質からの直接糖転移、加水分
解反応を用いた酵素的生産は、現在のところ学術的には
不可能であるといわれている。」と記載されているよう
に、澱粉を原料とし、酵素反応によってトレハロースを
製造することは、従来、学術的にも不可能であるといわ
れてきた。
【０００５】一方、澱粉を原料として製造させる澱粉部
分分解物、例えば、澱粉液化物、各種デキストリン、各
種マルトオリゴ糖などは、通常、その分子の末端に還元
基を有し還元性を示すことが知られている。このような
澱粉部分分解物を、本明細書では、還元性澱粉部分分解
物と称する。一般に、還元性澱粉部分分解物は、固形物
当りの還元力の大きさをデキストロース・エクイバレン
ト（ＤｅｘｔｒｏｓｅＥｑｕｉｖａｌｅｎｔ，ＤＥ）と
して表している。この値の大きいものは、通常、分子が
小さく低粘度で、甘味が強いものの、反応性が強く、ア
ミノ酸や蛋白質などのアミノ基を持つ物質とアミノカル
ボニル反応を起こし易く、褐変し、悪臭を発生して、品
質を劣化し易い性質のあることが知られている。
【０００６】このような還元性澱粉部分分解物の種々の
特性は、ＤＥの大小に依存しており、澱粉部分分解物と
ＤＥとの関係は極めて重要である。従来、当業界では、
この関係を断ち切ることは不可能とさえ信じられてき
た。
【０００７】しかしながら、本発明者等は、当業界のこ
の常識を覆し、特願平４−３６２１３１号明細書で開示
したように、澱粉を原料として製造されるグルコース重
合度が３以上の還元性澱粉部分分解物に、これからその
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３
以上の非還元性糖質を生成する非還元性糖質生成酵素と
グルコアミラーゼとを作用させることにより、還元性澱
粉部分分解物からトレハロースを酵素的に直接生産する
ことに成功している。この非還元性糖質生成酵素とグル
コアミラーゼによるトレハロース製造方法では、還元性
澱粉部分分解物からのトレハロース生成率は約３０％で
あり、工業的に十分に可能であるが、反応変換率の面か
らトレハロース製造におけるコスト高が懸念される。そ
こで、還元性澱粉部分分解物からの生成率を更に向上さ
せるトレハロースの新規製造方法の確立が望まれる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、安価で安定
供給可能な澱粉から生成率の高いトレハロースの新規製
造方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、末端にトレハロース構造を有するグ
ルコース重合度が３以上の非還元性糖質からトレハロー
スを遊離する全く新しい酵素の実現に期待を込めて、こ
の酵素を産生する微生物を広く検索してきた。その結
果、先に、特願平４−３６２１３１号明細書で開示した
土壌からの分離菌リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属
に属する非還元性糖質生成酵素産生微生物Ｍ−１１、お
よび特願平５−２６５４１６号明細書で開示した土壌か
らの分離菌アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）属に属する非還元性糖質生成酵素産生微生物Ｑ３６
が、新規トレハロース遊離酵素をも併せて産生すること
を見いだし、還元性澱粉部分分解物に、非還元性糖質生
成酵素とこの新規トレハロース遊離酵素とを作用させる
ことにより、目指していた生成率の高いトレハロース生
成反応を容易に行いうることを見いだし、また、還元性
澱粉部分分解物に、非還元性糖質生成酵素と新規トレハ
ロース遊離酵素とを作用させ、次いでグルコアミラーゼ
を作用させることにより、更に高純度トレハロース含有
反応液を得ることができ、容易にトレハロースを製造し
うることを見いだし、本発明を完成した。更に、このト
レハロース遊離酵素を産生する微生物を、公知菌より広
く検索した。その結果、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物も本発明のトレハロ
ース遊離酵素を産生することが判明し、前記のリゾビウ
ム属、アルスロバクター属に属する微生物由来のトレハ
ロース遊離酵素と同様に、末端にトレハロース構造を有
するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質からトレ
ハロースを遊離することを見いだし、本発明を完成し
た。併せて、このようにして得られるトレハロースまた
はこれを含む糖質を含有せしめた飲食物、化粧品、医薬
品などの組成物を確立し本発明を完成した。
【００１０】次に本発明のリゾビウム属に属する微生物
Ｍ−１１の同定試験結果を示す。なお、同定試験は、
『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版セン
ター、１９８５年）に準じて行った。
【００１１】
【Ａ 細胞形態】肉汁寒天培養、２７℃ 通常０．６乃至０．８×１．０乃至１．５μｍの桿菌。
単独、希に直鎖状の二対をなし、連鎖した細胞も観察さ
れる。多形性なし。運動性あり。無胞子。鞭毛は周鞭
毛。非抗酸性。グラム陰性。カプセル陰性。異染顆粒陽
性。Ｐｏｌｙ−β−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅを
蓄積。
【００１２】
【Ｂ 培養的性質】
（１） 肉汁寒天平板培養、２７℃ 形状 ：円形 大きさは２４時間で１．５ｍｍ。 周縁 ：全縁 *** ：偏平状ないし半レンズ状 光沢 ：あり 表面 ：平滑 色調 ：半透明、クリーム色、ピンク色色素生成なし （２） デキストロース・トリプトン寒天平板培養、２
７℃ コロニーは半透明、クリーム色、ｍｕｃｏｉｄ生成 （３） 酵母エキス・マンニトール寒天平板培養、２７
℃ 形状 ：円形 大きさは５日で約３ｍｍ。 色調 ：半透明、クリーム色、ｍｕｃｏｉｄ生成 （４） コンゴ−レッド含有酵母エキス・マンニトール
寒天平板培養、２７℃ コロニーは仄かなピンク色で、ほとんどコンゴ−レッド
を吸収しない。 （５） ２ｗ／ｖ％ＮａＣｌ含有酵母エキス・マンニト
ール寒天平板培養、２７℃ 生育する。 （６） 肉汁寒天斜面培養、２７℃ 生育度 ：良好 形状 ：糸状 （７） 肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃ 液化しない。
【００１３】
【Ｃ 生理学的性質】
（１） 硝酸塩の還元性 ：陽性 （２） 脱窒反応 ：陰性 （３） メチルレッド試験 ：陰性 （４） ＶＰ試験 ：陰性 （５） インドールの生成 ：陰性 （６） 硫化水素の生成 ：陽性 （７） 澱粉の加水分解 ：陰性 （８） クエン酸の利用 ：陽性 （９） 無機窒素源の利用 ：アンモニウム塩
および硝酸塩ともに利用できる。 （１０） 色素の生成 ：なし （１１） ウレアーゼ ：陽性 （１２） オキシダーゼ ：陰性 （１３） カタラーゼ ：陽性 （１４） 生育の範囲 ：ｐＨ ５．５
乃至９．０ 温度 ４乃至３５℃ （１５） 酸素に対する態度 ：好気性 （１６） 炭素源の利用と酸生成の有無 利用性 酸生成 Ｄ−グルコース 利用する 陽性 Ｄ−ガラクトース 利用する 陽性 Ｄ−フラクトース 利用する 陽性 Ｌ−アラビノース 利用する 陽性 Ｄ−キシロース 利用する 陽性 Ｌ−ラムノース 利用する 陽性 マルトース 利用する 陰性 スクロース 利用する 陽性 ラクトース 利用する 陰性 トレハロース 利用する 陰性 ラフィノース 利用する 陽性 マンニトール 利用する 陰性 デキストリン 利用する 陰性 ズルシトール 利用する 陰性 （１７） アミノ酸の脱炭酸試験 ：Ｌ−リジン、
Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、いずれに対しても陰
性。 （１８） アミノ酸の利用 ：Ｌ−グルタミ
ン酸ナトリウム、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム、Ｌ−
ヒスチジン、Ｌ−プロリンいずれも利用する。 （１９） ＤＮａｓｅ ：陰性 （２０） ３−ケトラクトースの生成 ：陰性 （２１） ＤＮＡのＧ−Ｃ含量 ：６１％
【００１４】以上の菌学的性質をもとにして、『バージ
ーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリ
オロジー（Ｂｅｒｇｅｙ´ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓ
ｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）』、
第１巻（１９８４年）を参考にして、公知の菌株との異
同を検討した。その結果、リゾビウム属に属する微生物
であることが判明した。本菌は、リゾビウム・メリロッ
チ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）に近い性
質を示すものの、この菌とは違って、マルトース、ラク
トース、マンニトールから酸を生成しない点に違いが認
められ、また、還元性澱粉部分分解物からトレハロース
構造を有する非還元性糖質を生成する非還元性糖質生成
酵素および該非還元性糖質のトレハロース部分とそれ以
外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分解し
トレハロースを遊離する新規トレハロース遊離酵素を産
生する文献未記載の特徴を有している。
【００１５】本発明者等は、これらの結果に基づき、本
菌をリゾビウム・スピーシーズ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ
ｓｐ．）Ｍ−１１と命名した。なお、本菌は、平成４年
１２月２４日付けで、茨城県つくば市東１丁目１番３号
にある通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所、特
許微生物寄託センターに、微生物受託番号、微工研条寄
第４１３０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）で受託され
た。
【００１６】本発明では、上記菌のみならず、リゾビウ
ム属に属し、末端にトレハロース構造を有するグルコー
ス重合度が３以上の非還元性糖質のトレハロース部分と
それ以外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加水
分解しトレハロースを遊離するトレハロース遊離酵素を
産生する他の菌株、更には、それらの菌株の変異株など
も適宜用いられる。
【００１７】次に本発明のアルスロバクター属に属する
微生物Ｑ３６の同定試験結果を示す。なお、同定試験
は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版
センター、１９８５）に準じて行った。
【００１８】
【Ａ 細胞形態】
（１） 肉汁寒天培養、２７℃ 通常０．５乃至０．７×０．８乃至１．６μｍの桿菌。
単独。多形性あり。運動性なし。無胞子。鞭毛なし。非
抗酸性。グラム陽性。カプセル陰性。 （２） ＥＹＧ寒天培養、２７℃ 桿菌−球菌の生育サイクルを示す。
【００１９】
【Ｂ 培養的性質】
（１） 肉汁寒天平板培養、２７℃ 形状 ：円形 大きさは３日間で２乃至２．５ｍｍ。 周縁 ：全縁 *** ：半レンズ状 光沢 ：湿光 表面 ：平滑 色調 ：半透明、白色乃至淡い黄色 （２） 肉汁寒天斜面培養、２７℃ 生育度 ：良好 形状 ：糸状 （３） 酵母エキス・ペプトン寒天斜面培養、２７℃ 生育度 ：良好 形状 ：糸状 （４） 肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃ 液化する。
【００２０】
【Ｃ 生理学的性質】
（１） 硝酸塩の還元性 ：陽性 （２） 脱窒反応 ：陰性 （３） メチルレッド試験 ：陰性 （４） ＶＰ試験 ：陽性 （５） インドールの生成 ：陰性 （６） 硫化水素の生成 ：陽性 （７） 澱粉の加水分解 ：陰性 （８） セルロースの分解 ：陰性 （９） クエン酸の利用 ：陽性 （１０） 無機窒素源の利用 ：アンモニウム
塩および硝酸塩ともに利用できる。 （１１） 色素の生成 ：なし （１２） ウレアーゼ ：陽性 （１３） オキシダーゼ ：陰性 （１４） カタラーゼ ：陽性 （１５） 生育の範囲 ：ｐＨ ５乃至
１０温度 ４乃至３７℃ （１６） 酸素に対する態度 ：好気性 （１７） 炭素源の利用性と酸生成の有無 利用性 酸生成 Ｄ−グルコース 利用する 陰性 Ｄ−ガラクトース 利用する 陰性 Ｄ−フラクトース 利用する 陰性 Ｌ−アラビノース 利用する 陰性 Ｄ−キシロース 利用する 陰性 Ｌ−ラムノース 利用する 陰性 マルトース 利用する 陰性 スクロース 利用する 陰性 ラクトース 利用する 陰性 ラフィノース 利用する 陰性 マンニトール 利用する 陰性 デキストリン 利用する 陰性 ズルシトール 利用する 陰性 （１８） アミノ酸の利用 ：Ｌ−グルタミ
ン酸ナトリウム、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム、Ｌ−
ヒスチジン、Ｌ−プロリンいずれも利用する。 （１９） ＤＮａｓｅ ：陽性 （２０） ３−ケトラクトースの生成 ：陰性 （２１） 細胞壁の主要ジアミノ酸 ：リジン （２２） ＤＮＡのＧ−Ｃ含量 ：６３％
【００２１】以上の菌学的性質をもとにして、『バージ
ーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリ
オロジー（Ｂｅｒｇｅｙ´ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓ
ｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）』、
第２巻（１９８４年）を参考にして、公知の菌株とその
異同を検討した。その結果、本菌は、アルスロバクター
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ）属に属する微生物である
ことが判明した。また、本菌は、還元性澱粉部分分解物
からトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する
非還元糖糖質生成酵素および該非還元糖糖質のトレハロ
ース部分とそれ以外のグリコシル部分との間の結合を特
異的に加水分解しトレハロースを遊離する新規トレハロ
ース遊離酵素を産生する文献未記載の特徴を有してい
る。
【００２２】本発明者等は、これらの結果に基づき、本
菌を新規微生物アルスロバクター・スピーシーズ（Ａｒ
ｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ ｓｐ．）Ｑ３６と命名した。な
お、本菌は、平成５年６月３日付けで、茨城県つくば市
東１丁目１番３号にある通商産業省工業技術院生命工業
技術研究所、特許微生物寄託センターに、微生物受託番
号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１６で受託された。
【００２３】本発明では上記菌株のみならず、アルスロ
バクター属に属し、末端にトレハロース構造を有するグ
ルコース重合度が３以上の非還元性糖質のトレハロース
部分とそれ以外のグリコシル部分との間の結合を特異的
に加水分解しトレハロースを遊離するトレハロース遊離
酵素を産生する他の菌株、更には、それらの菌株の変異
株なども適宜用いられる。
【００２４】本発明に用いられる微生物としては、本発
明のトレハロース遊離酵素産生能を有するものであれば
よく、例えば、前記の新規微生物リゾビウム・スピーシ
ーズＭ−１１ ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０およびアルス
ロバクター・スピーシーズＱ３６ ＦＥＲＭ ＢＰ−４
３１６だけでなく、公知微生物であるブレビバクテリウ
ム・ヘロボルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅ
ｌｏｖｏｌｕｍ）ＡＴＣＣ１１８２２、ミクロコッカス
・ロゼウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）
ＡＴＣＣ１８６なども有利に利用できる。
【００２５】本発明の微生物の培養に用いる培地は、微
生物が生育でき、本発明のトレハロース遊離酵素を産生
しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地
のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が資化しう
る物であればよく、例えば、グルコース、フラクトー
ス、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビト
ール、糖蜜、還元性澱粉部分分解物などの糖質、また
は、クエン酸、コハク酸などの有機酸またはそれらの塩
なども使用することができる。培地におけるこれらの炭
素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択される。例え
ば、還元性澱粉部分分解物の場合には、通常、２０％以
下が望ましく、菌の生育および増殖からは５％以下が好
ましい。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝
酸塩などの無機窒素化合物、および、例えば、尿素、コ
ーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母
エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。
また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグ
ネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マ
ンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバル
ト塩などが適宜用いられる。更に、必要に応じて、アミ
ノ酸、ビタミンなども適宜用いられる。
【００２６】培養は、通常、温度４乃至４０℃、好まし
くは２０乃至３７℃、ｐＨ４乃至１０、好ましくは５乃
至９から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は
本微生物が増殖しうる時間であればよく、好ましくは１
０時間乃至１００時間である。また、培養液の溶存酸素
濃度には特に制限はないが、通常、０．５乃至２０ｐｐ
ｍが好ましい。そのため、通気量を調節したり、撹拌し
たり、通気に酸素を追加したり、また、ファーメンター
内の圧力を高めるなどの手段が採用される。また、培養
方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。
【００２７】このようにして、微生物を培養した後、本
発明の酵素を回収する。本酵素活性は、培養物の菌体お
よび除菌液いずれにも認められ、菌体および除菌液を粗
酵素液として採取することも、また、培養物全体を粗酵
素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去
するには公知の固液分離法が採用される。例えば、培養
物そのものをそのまま遠心分離する方法、あるいは、プ
レコートフィルターなどを用いて瀘過分離する方法、平
膜、中空糸膜などの膜瀘過により分離する方法などが適
宜採用される。除菌液をそのまま酵素液として用いるこ
とができるが、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮
方法としては、例えば、硫安塩析法、アセトンおよびア
ルコール沈殿法、平膜、中空糸膜など膜濃縮法などが採
用される。
【００２８】更に、除菌液およびその濃縮物を公知の方
法により固定化することもできる。例えば、イオン交換
体への結合法、樹脂および膜などとの共有結合・吸着
法、高分子物質を用いた包括法などが採用される。ま
た、培養物から分離した菌体もそのまま粗酵素として用
いることができるが、これを固定化して用いてもよい。
一例として、これをアルギン酸ナトリウムと混合して、
塩化カルシウム溶液中に滴下して粒状にゲル化させて固
定化する。この粒状化物をさらにポリエチレンイミン、
グルタールアルデヒドで処理して固定化してもよい。菌
体から酵素を抽出して、その抽出液を粗酵素液として用
いることもできる。例えば、超音波による破砕法、ガラ
スビーズおよびアルミナによる機械的破砕法、フレンチ
プレスによる破砕法などで菌体から酵素を抽出し、遠心
分離または膜瀘過などで清澄な粗酵素液を得ることがで
きる。
【００２９】本酵素液はそのまま用いることができる
が、公知の方法によって更に精製して利用することもで
きる。一例として、培養液の処理物を硫安塩析して濃縮
した粗酵素標品を透析後、ＤＥＡＥ−トヨパール樹脂を
用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続い
て、ブチルトヨパール樹脂を用いた疎水カラムクロマト
グラフィー、トヨパール ＨＷ−５５樹脂を用いたゲル
瀘過クロマトグラフィーを用いて精製することにより、
電気泳動的に単一な酵素を得ることができる。
【００３０】このようにして得られる本発明のトレハロ
ース遊離酵素は、下記の理化学的性質を有する。 （１） 作用 末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３
以上の非還元性糖質のトレハロース部分とそれ以外のグ
リコシル部分との間の結合を特異的に加水分解する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約５７，０００乃至６
８，０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．３乃
至４．６。 （４） 至適温度 ｐＨ７．０、３０分間反応で、３５乃至４５℃付近。 （５） 至適ｐＨ ４０℃、３０分間反応で、ｐＨ約６．０乃至７．５。 （６） 温度安定性 ｐＨ７．０、６０分間保持で、３０乃至４５℃付近まで
安定。 （７） ｐＨ安定性 ２５℃、１６時間保持で、ｐＨ約５．０乃至１０．０。
【００３１】本発明のトレハロース遊離酵素の活性は次
のようにして測定する。基質としてマルトトリオシルト
レハロース（別名、α−マルトテトラオシル α−グル
コシド）１．２５ｗ／ｖ％（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐ
Ｈ７．０）４ｍｌに酵素液を１ｍｌ加え４０℃で３０分
間反応させた後、ソモギー銅液を加え反応を停止させ、
還元力をソモギー・ネルソン法にて測定する。対照とし
て、あらかじめ１００℃で１０分間加熱することにより
失活させた酵素液を用いて同様に測定する。上記の測定
方法を用いて、１分間に１μｍｏｌｅのグルコースに相
当する還元力を増加させる酵素量を１単位と定義する。
【００３２】本酵素の基質としては、末端にトレハロー
ス構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖
質であればよく、例えば、マルトトリオース、マルトテ
トラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
ス、マルトヘプタオースなどに非還元性糖質生成酵素を
作用させ得られるグルコシルトレハロース、マルトシル
トレハロース、マルトトリオシルトレハロース、マルト
テトラオシルトレハロース、マルトペンタオシルトレハ
ロースなどのグリコシルトレハロースが用いられる。ま
た、澱粉、アミロペクチン、アミロースなどの澱粉質を
アミラーゼまたは酸などによって部分的に加水分解し得
られる還元性澱粉部分分解物に、非還元性糖質生成酵素
を作用させ得られる末端にトレハロース構造を有するグ
ルコース重合度が３以上の非還元性糖質を含む低還元性
の澱粉部分分解物が用いられる。
【００３３】澱粉を部分的に加水分解するアミラーゼと
しては、例えば、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ
・アンド・リレイテッド・エンザイムズ（Ｈａｎｄｂｏ
ｏｋｏｆ Ａｍｙｌａｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ
Ｅｎｚｙｍｅｓ）』（１９８８年）パーガモン・プレ
ス社（東京）に記載されている、α−アミラーゼ、マル
トペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生
成アミラーゼなどが用いられる。これらアミラーゼとプ
ルラナーゼおよびイソアミラーゼなどの枝切酵素を併用
することも有利に実施できる。
【００３４】基質濃度は特に限定されない。例えば、
０．１％の基質溶液として用いた場合でも、５０％の基
質溶液として用いた場合でも、本酵素の反応は進行し、
トレハロースを生成する。また、基質溶液中に完全に溶
けきれない不溶性基質を含有するものであってもよい。
反応温度は酵素反応が進行する温度、すなわち５５℃付
近までで行えばよいが、好ましくは４０乃至５０℃の範
囲を用いる。反応ｐＨは、通常、５乃至１０の範囲に調
整すればよいが、好ましくは約ｐＨ６乃至８の範囲に調
整する。反応時間は、酵素反応の進行具合により適宜選
択すればよく、通常、基質固形物グラム当り約０．１乃
至１００単位の酵素使用量で０．１乃至１００時間程度
である。
【００３５】原料基質からのトレハロース生成率につい
ては、比較的低ＤＥで高分子の還元性澱粉部分分解物、
すなわちグルコース重合度の高い還元性澱粉部分分解物
からトレハロースを製造する場合、本発明による方法
は、非還元性糖質生成酵素とグルコアミラーゼとを用い
る特願平４−３６２１３１号明細書に記載の方法と比較
して、その生成率が顕著に増大する特長を有している。
先願の非還元性糖質生成酵素とグルコアミラーゼの反応
によって得られるトレハロース生成率が約３０％である
のに対して、本発明の非還元性糖質生成酵素とトレハロ
ース遊離酵素とを共に作用させる反応は、トレハロース
生成率が約６０％またはそれ以上の高率となる。
【００３６】この作用の原理は、次の通りである。すな
わち、まず、比較的グルコース重合度の高い還元性澱粉
部分分解物が、非還元性糖質生成酵素によりその末端に
トレハロース構造を有する１分子のグルコース重合度が
同じ非還元性糖質に変換され、その非還元性糖質がトレ
ハロース遊離酵素の加水分解反応により１分子のトレハ
ロースとグルコース重合度で２を減少した１分子の還元
性澱粉部分分解物とを生成する。新たに生成した還元性
澱粉部分分解物のグルコース重合度が３以上であれば、
この還元性澱粉部分分解物が、更に、非還元性糖質生成
酵素によりその末端にトレハロース構造を有する非還元
性糖質に変換されるとともにトレハロース遊離酵素によ
り１分子のトレハロースとグルコース重合度で２を減少
した１分子の還元性澱粉部分分解物とを生成する。この
ように、非還元性糖質生成酵素の反応とトレハロース遊
離酵素の反応とを繰り返すことにより、１分子の還元性
澱粉部分分解物から複数分子のトレハロースとグルコー
ス重合度が生成トレハロース分子数の２倍相当を減じた
非還元性澱粉部分分解物とを生成させることができる。
【００３７】この作用の方法は、グルコース重合度が３
以上の還元性澱粉部分分解物に非還元性糖質生成酵素と
本発明のトレハロース遊離酵素とを同時に作用させるこ
とも、また、該還元性澱粉部分分解物に、まず、非還元
性糖質生成酵素を作用させ、次いで、トレハロース遊離
酵素を作用させることもできる。また、該両酵素を作用
させた後、グルコアミラーゼを作用させてトレハロース
生成率を更に高めることも有利に実施できる。
【００３８】反応液は、常法により、瀘過、遠心分離な
どして不溶物を除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ
型イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮し、シラップ状製品と
する。更に、乾燥して粉末状製品にすることも随意であ
る。
【００３９】必要ならば、更に、精製、例えば、イオン
交換カラムクロマトグラフィーによる分画、活性炭カラ
ムクロマトグラフィーによる分画、シリカゲルカラムク
ロマトグラフィーによる分画、アルコールおよびアセト
ンなど有機溶媒による分別、アルカリ処理による還元性
糖質の分解除去などの方法で精製することにより、最高
純度のトレハロース製品を得ることも容易である。
【００４０】このようにして得られた本発明のトレハロ
ースを含む糖質を、必要により、α−アミラーゼ、β−
アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、
トレハラーゼなどで加水分解したり、シクロマルトデキ
ストリン・グルカノトランスフェラーゼやグルコシルト
ランスフェラーゼなどで糖転移したりして、甘味性、還
元力などを調整したり、粘性を低下させたりすること
も、また、水素添加して還元性糖質を糖アルコールにし
て還元力を消滅せしめることなどの更なる加工処理を施
すことも随意である。これを、前述の精製方法、例え
ば、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどにより、
グルコースを除去し、トレハロース高含有画分を採取す
る。これを精製、濃縮して、シラップ状製品を得ること
も、更に濃縮して過飽和にし、晶出させてトレハロース
含水結晶または無水結晶トレハロースを得ることも有利
に実施できる。
【００４１】イオン交換カラムクロマトグラフィーとし
ては、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７
２５９８号公報などに開示されている塩型強酸性カチオ
ン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、
夾雑糖類を除去してトレハロース高含有画分を採取する
方法が有利に実施できる。この際、固定床方式、移動床
方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも
随意である。
【００４２】トレハロース含水結晶を製造するには、例
えば、純度約６０％以上、濃度約６５乃至９０％のトレ
ハロース含有液を助晶缶にとり、０．１乃至２０％の種
晶共存下で、温度９５℃以下、望ましくは、１０乃至９
０℃の範囲で、撹拌しつつ徐冷し、トレハロース含水結
晶を含有するマスキットを製造する。マスキットからト
レハロース含水結晶またはこれを含有する含蜜結晶を製
造する方法は、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、
流動造粒方法、噴霧乾燥方法など公知の方法を採用すれ
ばよい。
【００４３】分蜜方法の場合には、通常、マスキットを
バスケット型遠心分離機にかけ、トレハロース含水結晶
と蜜（母液）とを分離し、必要により、該結晶に少量の
冷水をスプレーして洗浄することも容易な方法であり、
より高純度のトレハロース含水結晶を製造するのに好適
である。噴霧乾燥方法の場合には、通常、濃度６０乃至
８５％、晶出率２０乃至６０％程度のマスキットを高圧
ポンプでノズルから噴霧し、結晶粉末が溶解しない温
度、例えば、６０乃至１００℃の熱風で乾燥し、次いで
３０乃至６０℃の温風で約１乃至２０時間熟成すれば非
吸湿性または難吸湿性の含蜜結晶が容易に製造できる。
また、ブロック粉砕方法の場合には、通常、水分１０乃
至２０％、晶出率１０乃至６０％程度のマスキットを数
時間乃至３日間静置して全体をブロック状に晶出固化さ
せ、これを粉砕または切削などの方法によって粉末化し
乾燥すれば、非吸湿性または難吸湿性の含蜜結晶が容易
に製造できる。また、無水結晶トレハロースを製造する
には、トレハロース含水結晶を乾燥して変換させること
もできるが、一般的には、水分１０％未満の高濃度トレ
ハロース高含有溶液を助晶缶にとり、種晶共存下で５０
乃至１６０℃、望ましくは８０乃至１４０℃の範囲で撹
拌しつつ無水結晶トレハロースを含有するマスキットを
製造し、これを比較的高温乾燥条件下で、例えば、ブロ
ック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法などの方法
で晶出、粉末化して製造される。
【００４４】このようにして製造される本発明のトレハ
ロースは、還元力がなく、安定であり、他の素材、特に
アミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸また
はアミノ基を含有する物質と混合、加工しても、褐変す
ることも、異臭を発生することも、混合した他の素材を
損なうことも少ない。また、それ自身が良質で上品な甘
味を有している。更に、トレハロースはトレハラーゼに
より容易にグルコースにまで分解することから、経口摂
取により、消化吸収され、カロリー源として利用され
る。虫歯誘発菌などによって、醗酵されにくく、虫歯を
起こしにくい甘味料として利用できる。また、本発明の
トレハロースは、経管栄養剤、輸液剤などとして非経口
的に使用され、毒性、副作用の懸念もなく、よく代謝利
用され、生体へのエネルギー補給に有利に利用すること
ができる。
【００４５】また、安定な甘味料であることより、結晶
製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスター
チ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤
の糖衣剤として利用することも有利に実施できる。ま
た、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘
性、他糖の晶出防止性、難醗酵性、糊化澱粉の老化防止
性などの性質を具備している。
【００４６】従って、本発明のトレハロースおよびこれ
を含む糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定
剤、賦形剤などとして飲食物、嗜好物、飼料、化粧品、
医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００４７】本発明のトレハロースおよびこれを含む糖
質は、そのまま甘味付けのための調味料として使用する
ことができる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、
果糖、マルトース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メイプルシ
ュガー、エリスリトール、ソルビトール、マルチトー
ル、ラクチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、
α−グリコシルステビオシド、レバウディオシド、グリ
チルリチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン
メチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなど
のような他の甘味料の１種または２種以上の適量と混合
して使用してもよく、また必要ならば、デキストリン、
澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用すること
もできる。
【００４８】また、本発明のトレハロースおよびこれを
含む糖質の粉末乃至結晶状製品は、そのままで、または
必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合し
て、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種
形状に成型して使用することも随意である。
【００４９】また、本発明のトレハロースおよびこれを
含む糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味
などの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸
性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付け、呈
味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００５０】例えば、アミノ酸、ペプチド類、醤油、粉
末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、
マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし
酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、
焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、
ダシの素、核酸系調味料、複合調味料、みりん、新みり
ん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味
料として有利に使用できる。
【００５１】また、例えば、せんべい、あられ、おこ
し、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊
羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、
パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリ
ン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリ
ーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレ
ート、チューインガム、キャラメル、キャンディーなど
の洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、
果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペ
ースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプ
レッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロ
ップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、
べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たく
あん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素類、ハム、ソー
セージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、
かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカ
の塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの
各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造
されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻など
の惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン
詰、缶詰類、合成酒、洋酒などの酒類、紅茶、コーヒ
ー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲
料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミ
ックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更に
は、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍
食品、乾燥食品などの各種飲食物への甘味付けに、呈味
改良に、また、品質改良などに有利に利用できる。
【００５２】また、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚な
どの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上さ
せる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練
歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トロー
チ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤な
ど各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧
品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、または
呈味改良剤、矯味剤として、さらには品質改良剤として
有利に利用できる。
【００５３】品質改良剤、安定剤としては、有効成分、
活性などを失い易い各種生理活性物質またはこれを含む
健康食品、医薬品などに有利に適応できる。例えば、イ
ンターフェロン−α、−β、−γ、ツモア・ネクロシス
・ファクター−α、−β、マクロファージ遊走阻止因
子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、イ
ンターロイキン２などのリンホカイン、インシュリン、
成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細
胞刺激ホルモンなどのホルモン、ＢＣＧワクチン、日本
脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘
苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリ
ンなどの生物製剤、ペニシリン、エリスロマイシン、ク
ロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマ
イシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質、チアミン、
リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイ
ド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミ
ン、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテア
ーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナー
ゼ、ラクターゼなどの酵素、薬用人参エキス、スッポン
エキス、胎盤エキス、クロレラエキス、アロエエキス、
プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、
酵母などの生菌、ロイヤルゼリーなどの各種生理活性物
質も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品
質の健康食品や医薬品などを容易に製造できることとな
る。
【００５４】以上述べたような各種組成物にトレハロー
スを含有せしめる方法は、その製品が完成するまでの工
程に含有せしめればよく、例えば、混和、溶解、融解、
浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶出、固
化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常、
０．１％以上、望ましくは、１％以上含有せしめるのが
好適である。
【００５５】次に実験により本発明をさらに具体的に説
明する。
【００５６】まず、新規微生物リゾビウム・スピーシー
ズ Ｍ−１１からのトレハロース遊離酵素の生産、精製
およびその性質などを説明し、次いで、アルスロバクタ
ー・スピーシーズ Ｑ３６からのトレハロース遊離酵素
について同様に説明する。更に、公知微生物からのトレ
ハロース遊離酵素について説明する。
【００５７】
【実験１ リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１からの
トレハロース遊離酵素の生産】パインデックス＃４（松
谷化学工業株式会社製造）２．０ｗ／ｖ％、ペプトン
０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ％、リン酸二
ナトリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一カリウム０．１ｗ
／ｖ％および水からなる液体培地をｐＨ７．０に調整し
た。５００ｍｌ容三角フラスコにこの培地を約１００ｍ
ｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃で２０分間滅菌
し、冷却して、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４１３０）を接種し、２７℃、１３０ｒ
ｐｍで２４時間培養したものを種培養液とした。
【００５８】容量３０ｌのファーメンターに種培養の場
合と同組成の培地約２０ｌを入れて殺菌、冷却して温度
２７℃とした後、種培養液１ｗ／ｖを接種し、温度２７
℃、ｐＨは６．０乃至８．０に保ちつつ、約７２時間通
気撹拌培養した。
【００５９】培養液の非還元性糖質生成酵素の酵素活性
は約１．５単位／ｍｌで、本発明のトレハロース遊離酵
素の酵素活性は約２単位／ｍｌであった。培養液の一部
を採り遠心分離して菌体と培養液上清とに分離し、更に
菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で元の培養
液と同じ液量の懸濁液とした後、菌体懸濁液と培養上清
との酵素活性を測定したところ、菌体懸濁液には、非還
元性糖質生成酵素の酵素活性が約０．６単位／ｍｌ、ト
レハロース遊離酵素の酵素活性が約０．８単位／ｍｌ認
められ、培養上清には、非還元性糖質生成酵素の酵素活
性が約０．９単位／ｍｌ、トレハロース遊離酵素の酵素
活性が約１．２単位／ｍｌ認められた。
【００６０】なお、非還元性糖質生成酵素の活性測定方
法は、基質としてマルトペンタオース１．２５ｗ／ｖ％
（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）４ｍｌに酵素液
を１ｍｌ加え４０℃で６０分間反応させた後、１００℃
で１０分間加熱して反応を停止させ、その反応液を正確
に１０倍に希釈し、その希釈液の還元力をソモギー・ネ
ルソン法にて測定する。対照として、あらかじめ１００
℃で１０分間加熱することにより失活させた酵素液を用
いて同様に測定する。上記の測定方法を用いて、１分間
に１μｍｏｌｅのマルトペンタオースに相当する還元力
を減少させる酵素量を１単位と定義した。
【００６１】
【実験２ 酵素の精製】実験１の方法で得られた培養液
約１８ｌを超高圧菌体破砕装置ミニラボ（大日本製薬株
式会社製）で処理し、含まれる菌体を破砕した。処理液
を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）すること
により、約１６ｌの遠心上清液を得た。その液に飽和度
０．２になるように硫安を加え溶解させ、４℃、１時間
放置した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分
間）することにより上清を回収した。
【００６２】更に、その液に硫安を飽和度０．６になる
ように溶解させ、４℃、２４時間放置した後、遠心分離
（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して硫安塩析物を回
収した。得られた硫安塩析物を１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して２
４時間透析し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分
間）し、不溶物を除いた。その透析液（３６０ｍｌ）を
２回に分けて、ＤＥＡＥ−トヨパールゲル（東ソー株式
会社製造）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィ
ー（ゲル量３００ｍｌ）を行った。
【００６３】本発明のトレハロース遊離酵素、非還元性
糖質生成酵素ともＤＥＡＥ−トヨパールゲルに吸着し、
食塩を含む同緩衝液でカラムから異なる食塩濃度におい
てそれぞれ溶出した。ＤＥＡＥ−トヨパールゲルからの
溶出パターンを図１に示す。非還元性糖質生成酵素は食
塩濃度約０．２Ｍで、トレハロース遊離酵素は食塩濃度
約０．３Ｍで溶出し、それぞれの酵素活性画分を回収
し、以下、両酵素を別々に精製した。
【００６４】非還元性糖質生成酵素活性画分を２Ｍ硫安
を含む同緩衝液に対して透析し、その透析液を遠心分離
（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）し不溶物を除き、得
られる上清をブチルトヨパール ６５０ゲル（東ソー株
式会社製造）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー
（ゲル量３００ｍｌ）を行った。吸着した本酵素を２Ｍ
から０Ｍ硫安のリニアグラジエントでカラムより溶出さ
せ、酵素活性画分を回収した。続いて、トヨパール Ｈ
Ｗ−５５樹脂（東ソー株式会社製造）を用いたゲル濾過
クロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行い、非還
元性糖質生成酵素活性画分を回収した。
【００６５】トレハロース遊離酵素の精製は、ＤＥＡＥ
−トヨパールカラムから溶出したトレハロース遊離酵素
活性画分を用いて、上記の非還元性糖質生成酵素の精製
方法と同様に、２Ｍ硫安を含む緩衝液に対して透析し、
次いで疎水カラムクロマトグラフィー、ゲル瀘過クロマ
トグラフィーを行った。
【００６６】精製の各工程における酵素活性量、比活
性、収率を、非還元性糖質生成酵素の場合は表１に、本
発明のトレハロース遊離酵素の場合は表２に示す。
【００６７】
【表１】
【００６８】
【表２】
【００６９】表１および表２の工程でそれぞれゲル瀘過
溶出液として得られた、精製非還元性糖質生成酵素標品
および精製トレハロース遊離酵素標品をポリアクリルア
ミドゲル（ゲル濃度７．５％）を用いる電気泳動法で純
度を検定したところ、蛋白バンドは単一であることが示
され、得られた酵素標品は電気泳動的に単一な純度の高
い標品であった。
【００７０】
【実験３ トレハロース遊離酵素の性質】実験２の方法
で得られた精製トレハロース遊離酵素標品をＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル（ゲル濃度１０％）を用いる電気
泳動法に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バ
イオ・ラド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本
酵素の分子量を測定したところ、分子量約５８，０００
乃至６８，０００ダルトンであった。
【００７１】精製酵素標品をポリアクリルアミドゲル
（２％アンフォライン含有、スウエーデン国、ファルマ
シア・エルケイビー社製）を用いる等電点電気泳動法に
供し、泳動後、ゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を
求めたところ、等電点は約３．３乃至４．３であった。
【００７２】本酵素活性に対する温度の影響、ｐＨの影
響を活性測定方法に準じて調べた。結果を図２（温度の
影響）、図３（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度
は、ｐＨ７．０、３０分間反応で、４５℃付近、至適ｐ
Ｈは、４０℃、３０分間反応で、約６．０乃至７．５で
あった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭリ
ン酸緩衝液を含む、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保
持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することに
より求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの５
０ｍＭ緩衝液中で２５℃、１６時間保持した後、ｐＨを
７に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求
めた。それぞれの結果を図４（温度安定性）、図５（ｐ
Ｈ安定性）に示した。本酵素の熱安定性は約４０℃付近
までであり、ｐＨ安定性は約５乃至１０であった。
【００７３】
【実験４ 末端にトレハロース構造を有す
るグルコース重合度が３以上の非還元性糖質からのトレ
ハロースの調製】基質として用いる末端にトレハロース
構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質
は、特願平４−３６２１３１号明細書に記載する方法に
従って調製した。即ち、マルトトリオース、マルトテト
ラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースお
よびマルトヘプタオースから選ばれる還元性澱粉部分分
解物の２０％水溶液に実験２の方法で得られた精製非還
元性糖質生成酵素標品を基質固形物グラム当りそれぞれ
２単位の割合で加え、４０℃、ｐＨ７．０で４８時間作
用させた後、常法に従って、加熱失活、瀘過、脱色、脱
塩、濃縮し、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂
（ＸＴ−１０１６，Ｎａ+型、架橋度４％、東京有機化
学工業株式会社製造）を用いたイオン交換カラムクロマ
トグラフィーを行った。樹脂を内径２．０ｃｍ、長さ１
ｍのジャケット付ステンレス製カラム３本に充填し、直
列につなぎ、カラム内温度を５５℃に維持しつつ、反応
糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに５５℃の温
水をＳＶ０．１３で流して分画し、末端にトレハロース
構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質
の高純度標品を調製した。得られた高純度標品のうち、
グルコシルトレハロース標品中のグルコシルトレハロー
スの純度は９７．６％で、マルトシルトレハロース標品
中のマルトシルトレハロースの純度は９８．６％で、マ
ルトトリオシルトレハロース標品中のマルトトリオシル
トレハロースの純度は９９．６％で、マルトテトラオシ
ルトレハロース標品中のマルトテトラオシルトレハロー
スの純度は９８．３％で、マルトペンタオシルトレハロ
ース標品中のマルトペンタオシルトレハロースの純度は
９８．１％であった。
【００７４】上記５種の非還元性糖質（グリコシルトレ
ハロース）の２０％水溶液を調製し、それぞれに実験２
で得られた精製トレハロース遊離酵素を基質固形物グラ
ム当り２単位の割合で加え、４０℃、ｐＨ７．０で４８
時間作用させた後、脱塩し、ワコービーズ ＷＢ−Ｔ−
３３０カラム（和光純薬工業株式会社製）を用いた高速
液体クロマトグラフィーで反応生成物を分析した。対照
として、マルトトリオース、マルトテトラオース、マル
トペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオ
ースに精製トレハロース遊離酵素を同様に作用させ、高
速液体クロマトグラフィーで分析した。それらの結果を
表３に示す。
【００７５】
【表３】
【００７６】表３の結果から明らかなように、 １．トレハロース遊離酵素は、末端にトレハロース構造
を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質のト
レハロース部分とグリコシル部分との間の結合を特異的
に加水分解し、トレハロースとグルコース重合度が１以
上の還元性糖質とを生成する。 ２．マルトオリゴ糖は、トレハロース遊離酵素によって
全く作用をうけない。
【００７７】これらの結果から、本発明のトレハロース
遊離酵素は、末端にトレハロース構造を有するグルコー
ス重合度が３以上の非還元性糖質のトレハロース部分と
その他のグリコシル部分との間の結合を極めて特異的に
加水分解し、トレハロースを遊離する全く新しい作用機
構の酵素であると判断される。
【００７８】次いで、それぞれの反応物からトレハロー
スを精製するため、脱色、脱塩、濃縮し、アルカリ金属
型強酸性カチオン交換樹脂（ＸＴ−１０１６）を用いた
カラム分画を行い、トレハロース含量９７％以上の高純
度画分を採取した。得られた高純度画分を濃縮して濃度
約６５％にし、２５℃で２日間放置して含水トレハロー
ス結晶を晶出させ、分蜜し、真空乾燥して、トレハロー
ス含量９９％以上の高純度標品を調製した。原料基質に
対するそれぞれの収率は、固形物換算で、グルコシルト
レハロースから９．５％、マルトシルトレハロースから
１４．９％、マルトトリオシルトレハロースから１６．
０％、マルトテトラオシルトレハロースから１８．５
％、マルトペンタオシルトレハロースから１７．７％で
あった。得られたそれぞれの高純度トレハロース標品用
いてを、市販の試薬トレハロース（和光純薬工業株式会
社販売）を標準品として、融点、融解熱、比旋光度、赤
外線吸収スペクトル、粉末Ｘ線回折パターンおよびブタ
腎臓由来トレハラーゼ（シグマ社販売）での分解性につ
いて比較したところ、調製したすべての高純度トレハロ
ース標品は、融点９７．０±０．５℃、融解熱５７．８
±１．２ＫＪ／ｍｏｌｅ、比旋光度＋１８２±１．１°
で、試薬トレハロースの実測値とよく一致し、また、赤
外線吸収スペクトルおよび粉末Ｘ線回折パターンについ
ても、試薬トレハロースのスペクトルまたはパターンと
よく一致した。更に、ブタ腎臓由来トレハラーゼ（シグ
マ社販売）によって、高純度トレハロース標品は試薬ト
レハロースと同様にグルコースに分解された。以上の結
果から明らかなように、末端にトレハロース構造を有す
るグルコース重合度が３以上の非還元性糖質に本発明の
トレハロース遊離酵素を作用させ生成した糖質はトレハ
ロースであると確認された。
【００７９】
【実験５ 還元性澱粉部分分解物からのトレハロースの
調製】５％ワキシーコーンスターチ懸濁液を加熱糊化さ
せた後、ｐＨ４．５、温度５０℃に調整し、これにイソ
アミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉
グラム当り４，０００単位の割合になるように加え、２
０時間反応させた。その反応液をオートクレーブ（１２
０℃、１０分間）し、次いで６０℃に冷却し、これをト
ヨパール ＨＷ−５０Ｓ樹脂（東ソー株式会社製造）を
用いたゲル瀘過クロマトグラフィー（ゲル量７５０ｍ
ｌ）でグルコース重合度３５乃至１０の還元性澱粉部分
分解物を調製した。
【００８０】得られた還元性澱粉部分分解物、またはグ
ルコース重合度３のマルトトリオースを、１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１％濃度に調整し、これに実
験２の方法で調製した精製非還元性糖質生成酵素標品お
よび精製トレハロース遊離酵素標品をそれぞれ基質固形
物当り４単位の割合で加え、４０℃で２４時間作用させ
た後、一部を採り、脱塩し、高速液体クロマトグラフィ
ーで反応生成物を分析した。
【００８１】残りの反応液は、更に、５０℃、ｐＨ４．
５に調整した後、グルコアミラーゼ（生化学工業株式会
社製造）を基質固形物当り５０単位の割合で加え、２４
時間作用させ、同様に脱塩し、高速液体クロマトグラフ
ィーで反応生成物を分析した。それらの結果を表４に示
す。
【００８２】
【表４】
【００８３】表４に示すように、非還元性糖質生成酵素
およびトレハロース遊離酵素を作用させた後のトレハロ
ース生成率は、グルコース重合度３のマルトトリオース
では４．２％と幾分低い値であったが、グルコース重合
度１０乃至３４．１の澱粉部分分解物では６６．１乃至
８０．８％の高い値が得られた。また、原料の還元性澱
粉部分分解物のグルコース重合度が高い程、得られるト
レハロース純度が高いことも判明した。更に、該両酵素
を作用させた反応液にグルコアミラーゼを作用させ、残
存する末端にトレハロース構造を有するグルコース重合
度が３以上の非還元性糖質をトレハロースとグルコース
とに分解することにより、生成するトレハロース純度が
より高まることも判明した。
【００８４】
【実験６ メイラード反応】実験４の方法で得られた高
純度トレハロース標品（純度９９．５％）の１０％とグ
リシン１％と、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）と
を含む溶液を１００℃で９０分間保ち、冷却後、この溶
液の４８０ｎｍ、１ｃｍセルにおける吸光度を測定し
た。対照として、グルコース、マルトースを用いて、同
様に処理し、４８０ｎｍにおける吸光度を測定した。結
果を表５に示す。
【００８５】
【表５】
【００８６】表５の結果から明らかなように、トレハロ
ース標品は、メイラード反応による着色度は僅かであ
り、グルコースやマルトースの着色度の僅か０．４乃至
０．６％程度であり、本発明のトレハロース標品はメイ
ラード反応をほとんど示さない糖質であることが判明し
た。従って、本糖質は、アミノ酸と混合しても、アミノ
酸を損なうことが少ない糖質である。
【００８７】
【実験７ 生体内での利用試験】厚治等が、『臨床栄
養』、第４１巻、第２号、第２００乃至２０８頁（１９
７２年）で報告している方法に準じて、実験４の方法で
得られた高純度トレハロース標品（純度９９．５％）３
０ｇを２０ｗ／ｖ％水溶液とし、これをボランティア６
名（健康な２６才、２７才、２８才、２９才、３０才、
３１才の男性）にそれぞれ経口投与し、経時的に採血し
て、血糖値およびインスリン値を測定した。対照として
は、グルコースを用いた。その結果、トレハロースは、
グルコースの場合と同様の挙動を示し、血糖値、インス
リン値ともに、投与後、約０．５乃至１時間で最大値を
示した。トレハロースは、容易に消化吸収、代謝利用さ
れて、エネルギー源になることが判明した。
【００８８】
【実験８ 急性毒性試験】マウスを使用して、実験４の
方法で得られた高純度トレハロース標品（純度９９．５
％）を経口投与して急性毒性試験を行った。その結果、
トレハロースは低毒性の物質で、投与可能な最大投与量
においても死亡例は認められなかった。従って、正確な
値とはいえないが、そのＬＤ５０値は、５０ｇ／ｋｇ以
上であった。
【００８９】
【実験９ アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６か
らのトレハロース遊離酵素の生産】リゾビウム・スピー
シーズ Ｍ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）に代え
て、アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４３１６）を用いた以外は、実験１と同様
に、ファーメンターで約７２時間培養した。培養液の非
還元性糖質生成酵素の酵素活性は約１．３単位／ｍｌ
で、本発明のトレハロース遊離酵素の酵素活性は約１．
８単位／ｍｌであった。実験１と同様にして菌体懸濁液
と培養上清との酵素活性を測定したところ、菌体懸濁液
には、非還元性糖質生成酵素の酵素活性が約０．５単位
／ｍｌ、トレハロース遊離酵素の酵素活性が約０．５単
位／ｍｌ認められ、培養上清には、非還元性糖質生成酵
素の酵素活性が約０．８単位／ｍｌ、トレハロース遊離
酵素の酵素活性が約１．３単位／ｍｌ認められた。
【００９０】
【実験１０ 酵素の精製】実験９の方法で得られた培養
液約１８ｌを用いて、実験２と同様の方法で精製した。
精製の各工程結果は非還元性糖質生成酵素の場合は表６
に、トレハロース遊離酵素の場合は表７にまとめた。
【００９１】
【表６】
【００９２】
【表７】
【００９３】表６および表７の工程で，それぞれゲル瀘
過溶出液として得られた精製非還元性糖質生成酵素およ
び精製トレハロース遊離酵素を，実験２の場合と同様に
電気泳動法で純度を検定したところ、蛋白バンドは単一
であることが示され、得られた両精製酵素は電気泳動的
に単一な純度の高い標品であった。
【００９４】
【実験１１ 酵素の性質】実験１０の方法で得られた精
製トレハロース遊離酵素を、実験３の場合と同様にＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量を測定
したところ、約５７，０００乃至６７，０００ダルトン
であった。また、本酵素の等電点を実験３の場合と同様
に等電点電気泳動法で求めたところ、等電点は３．６乃
至４．６であった。また、本酵素活性に対する温度の影
響、ｐＨの影響、および本酵素の温度安定性、ｐＨ安定
性について、実験３の場合と同様にして求めた。結果
は、温度の影響を図６に、ｐＨの影響を図７に、温度安
定性を図８に、ｐＨ安定性を図９に示した。
【００９５】図から明らかなように酵素の至適温度は４
５℃付近、至適ｐＨは約６．０乃至７．５である。温度
安定性は４５℃付近までであり、ｐＨ安定性は約５．０
乃至１０．０である。
【００９６】
【実験１２ 末端にトレハロース構造を有
するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質からのト
レハロースの調製】実験１０の方法で得られた精製酵素
を用いて、実験４の方法に従って、末端にトレハロース
構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質
からのトレハロースの調製の実験を行ったところ、リゾ
ビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来のトレハロース遊
離酵素の場合と同様に、末端にトレハロース構造を有す
るグルコース重合度が３以上の非還元性糖質からのトレ
ハロースを遊離することが判明した。
【００９７】
【実験１３ 公知微生物からのトレハロース遊離酵素の
生産とその性質】公知微生物のうち、本発明のトレハロ
ース遊離酵素産生能の確認されたブレビバクテリウム・
ヘロボルムＡＴＣＣ１１８２２およびミクロコッカス・
ロゼウスＡＴＣＣ１８６を、実験１の場合と同様にファ
ーメンターで２７℃で７２時間培養した。それぞれの培
養液約１８ｌを用いて、実験２の場合と同様に、培養液
を破砕装置で処理し、その遠心上清を回収し、続いて、
硫安塩析、透析、イオン交換カラムクロマトグラフィー
し、得られた部分精製酵素標品の性質を調べた。これら
の結果を、前述のリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１
およびアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６の場合
とともに表８にまとめた。
【００９８】
【表８】
【００９９】また、これらの公知微生物由来の部分精製
酵素を用いて、実験１２の方法に従って、末端にトレハ
ロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元
性糖質からのトレハロースの調製の実験を行ったとこ
ろ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１由来のトレハロ
ース遊離酵素の場合と同様に、末端にトレハロース構造
を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質から
トレハロースを遊離することが判明した。
【０１００】
【実験１４ トレハロース遊離酵素の部分アミノ酸配
列】 （１）Ｎ末端アミノ酸配列 実験２の方法で得られたリゾビウム・スピーシーズ Ｍ
−１１由来の精製酵素標品および実験１０の方法で得ら
れたアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来の精
製酵素標品の一部をそれぞれ蒸留水に対して透析した
後、蛋白量として約８０μｇをＮ末端アミノ酸配列分析
用の試料とした。Ｎ末端アミノ酸配列は、プロテインシ
ーケンサー モデル４７３Ａ（アプライドバイオシステ
ムズ社製造、米国）を用い、Ｎ末端から１０残基まで分
析した。それぞれ得られたＮ末端配列を表９に示す。
【０１０１】
【表９】
【０１０２】表９から明らかなように、Ｎ末端アミノ酸
は、リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来酵素の場
合アラニンで、それに続くアミノ酸配列は、リジン−プ
ロリン−バリン−グルタミン−グリシン−アラニン−グ
リシン−アルギニン−フェニルアラニンであることが判
明した。一方、アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３
６由来酵素の場合、そのＮ末端アミノ酸はトレオニンで
あり、それに続くアミノ酸配列は、プロリン−トレオニ
ン−チロシン−プロリン−アルギニン−グルタミン酸−
アルギニン−アラニン−リジンであることが判明した。
【０１０３】（２）内部部分アミノ酸配列 実験２の方法で得られたリゾビウム・スピーシーズ Ｍ
−１１由来の精製酵素標品および実験１０の方法で得ら
れたアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来の精
製酵素標品の一部をそれぞれ１０ｍＭトリス・塩酸緩衝
液（ｐＨ９．０）に対して透析した後、同緩衝液で約１
ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。これら試料液
（１ｍｌ）それぞれに１０μｇのリジルエンドペプチダ
ーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時
間反応させることによりペプチド化した。生成したペプ
チドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行った。リゾビウ
ム・スピーシーズ Ｍ−１１由来酵素の場合、カプセル
パックＣ１８カラム（直径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍ
ｍ、株式会社資生堂製造）を用い、流速０．６ｍｌ／
分、室温で、０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸−１６ｖ
／ｖ％アセトニトリル溶液から０．１ｖ／ｖ％トリフル
オロ酢酸−４８ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液の６０分間
のリニアーグラジエントの条件で行った。アルスロバク
ター・スピーシーズ Ｑ３６由来酵素の場合、マイクロ
ボンダパックＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ×長さ１５
０ｍｍ、ウオーターズ社製造、米国）を用い、流速０．
９ｍｌ／分、室温で、０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸
−３０ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液から０．１ｖ／ｖ％
トリフルオロ酢酸−５５ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液の
６０分間のリニアーグラジエントの条件で行った。カラ
ムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を
測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離
したそれぞれ３ペプチド［リゾビウム属酵素由来ペプチ
ド、ＲＴ４１（保持時間約４１分）、ＲＴ４６（保持時
間約４６分）、ＲＴ５４（保持時間約５４分）；アルス
ロバクター酵素由来ペプチド、ＡＴ７（保持時間約７
分）、ＡＴ３０（保持時間約３０分）、ＡＴ４８（保持
時間約４８分）］を分取し、それぞれを真空乾燥した
後、２００μｌの０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸−５
０ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液に溶解した。それらペプ
チド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ１
０残基までアミノ酸配列を分析した。得られた部分内部
配列を表１０に示す。
【０１０４】
【表１０】
【０１０５】表１０から明らかなように、リゾビウム・
スピーシーズ Ｍ−１１酵素のペプチドＲＴ４１の配列
と、アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６酵素のペ
プチドＡ３０とは分析した１０残基中の９残基が一致
し、ペプチドＲＴ４６とペプチドＡＴ４８も分析した１
０残基中の９残基が一致し、また、ペプチドＲＴ５４と
ペプチドＡＴ７とでは８残基が一致した。このことか
ら、リゾビウム属に属する微生物由来の酵素とアルスロ
バクター属に属する微生物由来の酵素間においては、内
部部分アミノ酸配列に高い相同性を有すると判断され、
これらの内部部分アミノ酸配列を、ロイシン−アスパラ
ギン−トリプトファン−アラニン−グルタミン酸−アラ
ニン−Ｘ1−Ｘ2−グリシン−アスパラギン酸（但し、Ｘ
1はセリンまたはアラニンを意味し、Ｘ2はアラニンまた
はグルタミン酸を意味する。）、および、アスパラギン
酸−グルタミン酸−アルギニン−アラニン−バリン−ヒ
スチジン−イソロイシン−ロイシン−グルタミン酸−Ｘ
3（但し、Ｘ3はグルタミン酸またアスパラギン酸を意味
する。）、更に、Ｘ4−グリシン−グルタミン酸−グリ
シン−アスパラギン−トレオニン−トリプトファン−グ
リシン−アスパラギン−セリン（但し、Ｘ4はヒスチジ
ンまたはグルタミンを意味する。）と表すことができ
る。
【０１０６】以下、本発明のトレハロース遊離酵素の製
造方法とそれを利用したトレハロースおよびそれを含む
糖質の製造方法を実施例Ａで、トレハロースおよびそれ
を含む糖質を含有せしめた組成物を実施例Ｂで示す。
【０１０７】
【実施例Ａ−１】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）を実験１の方法に準じ
て、ファーメンターで約８０時間培養した。培養後、Ｓ
Ｆ膜を用いて除菌瀘過し、約１８ｌの培養瀘液を回収
し、更に、その瀘液をＵＦ膜濃縮し、非還元性糖質生成
酵素（１７．２単位／ｍｌ）とトレハロース遊離酵素
（２０．８単位／ｍｌ）とを含む濃縮酵素液約１ｌを回
収した。
【０１０８】１５％とうもろこし澱粉乳に最終濃度０．
１重量％となるように炭酸カルシウムを加えた後、ｐＨ
６．０に調整し、これにα−アミラーゼ（ノボ社製造、
商品名ターマミール６０Ｌ）を澱粉グラム当り０．２重
量％になるよう加え、９５℃で１５分間反応させた。そ
の反応液をオートクレーブ（２ｋｇ／ｃｍ2）を３０分
間行った後、４５℃に冷却し、これにプルラナーゼ（株
式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉グラム当り１，
０００単位、前記方法で調製した非還元性糖質生成酵素
とトレハロース遊離酵素とを含む濃縮液を澱粉グラム当
り０．２ｍｌの割合になるように加え、４８時間反応さ
せた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却
し、瀘過して得られる瀘液を、常法に従って、活性炭で
脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して
精製し、更に濃縮して濃度６０％のシラップを固形物当
り約９２％で得た。
【０１０９】本品は固形物当りトレハロースを７０．２
％、グルコシルトレハロースを２．４％、マルトシルト
レハロースを３．３％、グルコースを０．７％、マルト
ースを１０．１％、マルトトリオースを１２．９％およ
びマルトテトラオース以上のマルトオリゴ糖を０．４％
含有しており、まろやかで上品な甘味、低い還元性、低
い粘度、適度の保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、品
質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化
粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１１０】
【実施例Ａ−２】実施例Ａ−１の方法で得られた糖液を
原糖液とし、トレハロースの含量を高めるため、アルカ
リ金属型強酸性カチオン交換樹脂（ＸＴ−１０１６、Ｎ
ａ+型、架橋度４％、東京有機化学工業株式会社製造）
を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーを行っ
た。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付ステンレス製
カラム４本に充填し、直列につなぎ樹脂層全長２０ｍと
した。カラム内温度を５５℃に維持しつつ、糖液を樹脂
に対して５ｖ／ｖ％加え、これに５５℃の温水をＳＶ
０．１３で流して分画し、マルトースおよびマルトトリ
オースなどの夾雑糖類を除去し、トレハロース高含有画
分を採取した。更に、精製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕
して、トレハロース高含有粉末を固形物当り約５６％の
収率で得た。本品はトレハロースを約９７％含有してお
り、極めて低い還元性、まろやかで上品な甘味を有し、
甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤など
として、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に
有利に利用できる。
【０１１１】
【実施例Ａ−３】実施例Ａ−２の方法で得られたトレハ
ロース高含有画分を、常法に従って、活性炭で脱色しイ
オン交換樹脂により脱塩して精製した溶液を濃度約７０
％に濃縮した後、助晶機にとり、種晶としてトレハロー
ス含水結晶約２％を加えて徐冷し、晶出率約４５％のマ
スキットを得た。本マスキットを乾燥塔上のノズルより
１５０ｋｇ／ｃｍ2の高圧にて噴霧した。これと同時に
８５℃の熱風を乾燥塔の上部より送風し、底部に設けた
移送金網コンベア上に結晶粉末を補集し、コンベアの下
より４５℃の温風を送りつつ、該粉末を乾燥塔外に徐々
に移動させて、取り出した。この結晶粉末を熟成塔に充
填して温風を送りつつ、１０時間熟成させ、結晶化と乾
燥を完了し、トレハロース含水結晶粉末を、原料のトレ
ハロース高含有糖液に対して固形物当り約９０％の収率
で得た。
【０１１２】本品は、実質的に吸湿性を示さず、取扱い
が容易であり、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定
剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品な
ど各種組成物に有利に利用できる。
【０１１３】
【実施例Ａ−４】実施例Ａ−２の方法で得られたトレハ
ロース高含有画分を、実施例Ａ−３と同様に精製し、次
いで蒸発釜にとり、減圧下で煮詰め、水分約３．０％の
シラップとした。次いで、助晶機に移し、これに種晶と
して無水結晶トレハロースをシラップ固形物当り１％加
え、１２０℃で５分間撹拌助晶し、次いで、アルミ製バ
ットに取り出し、１００℃で６時間晶出熟成させてブロ
ックを調製した。
【０１１４】次いで、本ブロックを切削機にて粉砕し、
流動乾燥して、水分０．３％の無水結晶トレハロース粉
末を、原料のトレハロース高含有糖液に対して固形物当
り約８５％の収率で得た。本品は、食品、化粧品、医薬
品、その原材料、または加工中間物などの含水物の脱水
剤としてのみならず、上品な甘味を有する白色粉末甘味
料としても、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成
物に有利に利用できる。
【０１１５】
【実施例Ａ−５】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）の変異株を実施例Ａ−１
の方法に準じて、ファーメンターで約７０時間培養し
た。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌瀘過し、約１００ｌの
培養瀘液を回収し、更に、その瀘液をＵＦ膜濃縮し、非
還元性糖質生成酵素（約４１０単位／ｍｌ）とトレハロ
ース遊離酵素（約４９０単位／ｍｌ）とを含む濃縮酵素
液約５ｌを回収した。
【０１１６】６％馬鈴薯澱粉乳を加熱糊化させた後、ｐ
Ｈ４．５、温度５０℃に調整し、これにイソアミラーゼ
（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉グラム当り
５００単位の割合になるように加え、２０時間反応させ
た。その反応液をｐＨ６．５に調整し、オートクレーブ
（１２０℃）を１０分間行い、次いで９５℃に冷却し、
これにα−アミラーゼ（ノボ社製造、商品名ターマミー
ル６０Ｌ）を澱粉グラム当り０．１％重量部の割合にな
るよう加え、１５分間反応させた。その反応液をオート
クレーブ（１３０℃）を３０分間行った後、４５℃に冷
却し、これに前記の方法で調製した非還元性糖質生成酵
素とトレハロース遊離酵素とを含む濃縮液を澱粉グラム
当り０．０１ｍｌの割合になるよう加え、６４時間反応
させた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、５０
℃、ｐＨ５．０に調整し、グルコアミラーゼ（ナガセ生
化学工業株式会社製造、商品名グルコチーム）を澱粉グ
ラム当り１０単位加えて４０時間反応させ、次いで加熱
して酵素を失活させた。本溶液を、常法に従って、活性
炭で脱色し、イオン交換樹脂により脱塩し、濃度約６０
％に濃縮した。本糖液中には固形物当り８０．５％のト
レハロースを含有していた。本溶液を濃度約８４％に濃
縮した後、助晶機にとり、種晶としてトレハロース含水
結晶約２％を加えて攪拌助晶し、次いで、プラスチック
製バットに取り出し、室温で３日間放置し晶出熟成させ
てブロックを調製した。次いで、本ブロックを切削機に
て粉砕してトレハロース含水結晶粉末を、原料澱粉に対
して固形物当り約９０％の収率で得た。
【０１１７】本品は、実質的に吸湿性を示さず、取扱い
が容易であり、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定
剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品な
ど各種組成物に有利に利用できる。
【０１１８】
【実施例Ａ−６】アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ
３６（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１６）を実験９の方法に準
じて、ファーメンターで約７２時間培養した。培養液を
遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して除菌し
た後、ＵＦ膜で濃縮し、非還元性糖質生成酵素（１６．
３単位／ｍｌ）とトレハロース遊離酵素（２５．１単位
／ｍｌ）とを含む濃縮液約１ｌを回収した。
【０１１９】馬鈴薯澱粉１重量部に水６重量部とα−ア
ミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製造、商品名ネオ
スピターゼ）０．０１重量部とを加え、攪拌混合し、こ
の懸濁液のｐＨを６．２に調整した後、８５乃至９０℃
に保ち、澱粉の糊化・液化を行い、その液化液を１２０
℃で１０分間加熱してα−アミラーゼを失活させた後、
４５℃に冷却し、これにイソアミラーゼ（林原生物化学
研究所製造）を澱粉グラム当り５００単位、および上記
の方法で調製した非還元性糖質生成酵素とトレハロース
遊離酵素とを含む濃縮液を澱粉グラム当り０．２ｍｌの
割合になるように加え４８時間反応させた。その反応液
を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させた後、５０
℃、ｐＨ５．０に調整し、グルコアミラーゼ（ナガセ生
化学工業株式会社製造、商品名グルコチーム）を澱粉グ
ラム当り１０単位加えて４０時間反応させ、次いで加熱
して酵素を失活させた。本溶液を、常法に従って、活性
炭で脱色し、イオン交換樹脂により脱塩し、濃度約６０
％に濃縮した。本糖液中には固形物当り７８．３％のト
レハロースを含有していた。イオン交換樹脂として、ア
ルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（オルガノ株式会
社販売、商品名ＣＧ６０００、Ｎａ+型）を用いた以外
は、実施例Ａ−２の方法に従ってイオン交換カラムクロ
マトグラフィーを行い、トレハロース高含有画分を採取
した。本高含有液は、固形物当り約９５％のトレハロー
スを含有していた。本溶液を濃度７５％に濃縮した後、
助晶機にとり、種晶としてトレハロース含水結晶約２％
を加えて攪拌助晶し、次いで、プラスチック製バットに
取り出し、室温で３日間放置し晶出熟成させてブロック
を調製した。次いで、本ブロックを切削機にて粉砕して
トレハロース含水結晶粉末を、原料澱粉に対して固形物
当り約７０％の収率で得た。
【０１２０】本品は、実質的に吸湿性を示さず、取扱い
が容易であり、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定
剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品な
ど各種組成物に有利に利用できる。
【０１２１】
【実施例Ａ−７】ブレビバクテリウム・ヘロボルム Ａ
ＴＣＣ１１８２２を実験１３の方法に準じて、ファーメ
ンターで約７２時間培養し、培養液を破砕装置で処理
し、その処理液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０
分間）して残渣を除いた後、ＵＦ膜で濃縮し、非還元性
糖質生成酵素（約８単位／ｍｌ）とトレハロース遊離酵
素（約１２単位／ｍｌ）とを含む濃縮液約７００ｍｌを
回収した。
【０１２２】３３％タピオカ澱粉乳に最終濃度０．１％
となるように炭酸カルシウムを加えた後、ｐＨ６．０に
調整し、これにα−アミラーゼ（ノボ社製造、商品名タ
ーマミール６０Ｌ）を澱粉グラム当り０．３％になるよ
う加え、９５℃で２０分間反応させた。その反応液をオ
ートクレーブ（２ｋｇ／ｃｍ2）を３０分間行った後、
４０℃に冷却し、これにイソアミラーゼ（株式会社林原
生物化学研究所製造）を澱粉グラム当り２００単位、前
記方法で調製した非還元性糖質生成酵素とトレハロース
遊離酵素とを含む濃縮液を澱粉グラム当り０．２ｍｌの
割合になるように加え、４８時間反応させた。その反応
液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、瀘過して得ら
れる瀘液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及び
ＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮
して濃度６０％のシラップを固形物当り約９０％で得
た。
【０１２３】本品は固形物当りトレハロースを６０．１
％、グルコシルトレハロースを１．４％、マルトシルト
レハロースを１．５％、グルコースを１．０％、マルト
ースを６．５％、マルトトリオースを８．３％およびマ
ルトテトラオース以上のマルトオリゴ糖を２１．２％含
有しており、まろやかで上品な甘味、低い還元性、適度
の保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安
定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品
など各種組成物に有利に利用できる。
【０１２４】
【実施例Ａ−８】実施例Ａ−６の方法で得たトレハロー
ス含量約９５％のトレハロース高含有液を常法にしたが
って、脱色、脱塩した。本溶液を濃度約７５％に濃縮し
た後、助晶缶にとり、種晶としてトレハロース含水結晶
約２％を加えて５０℃とし、ゆっくり撹拌しつつ徐冷し
て、２５℃まで下げ、バスケット型遠心分離機で分蜜
し、結晶を少量の水でスプレーし、洗浄して、純度９９
％以上の高純度トレハロース含水結晶を収率約５０％で
得た。
【０１２５】
【実施例Ｂ−１ 甘味料】実施例Ａ−５の方法で得たト
レハロース含水結晶粉末１重量部に、α−グリコシルス
テビオシド（東洋精糖株式会社販売、商品名αＧスイー
ト）０．０１重量部およびＬ−アスパルチル−Ｌ−フェ
ニルアラニンメチルエステル（商品名アスパルテーム）
０．０１重量部を均一に混合し、顆粒成型機にかけて、
顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の
約２．５倍の甘味度を有し、甘味度当りカロリーは、蔗
糖の約１／２．５に低下している。
【０１２６】本甘味料は、それに配合した高甘味度甘味
物の分解もなく、安定性に優れており、低カロリー甘味
料として、カロリー摂取を制限している肥満者、糖尿病
者などのための低カロリー飲食物などに対する甘味付け
に好適である。
【０１２７】また、本甘味料は、虫歯誘発菌による酸の
生成が少なく、不溶性グルカンの生成も少ないことよ
り、虫歯を抑制する飲食物などに対する甘味付けにも好
適である。
【０１２８】
【実施例Ｂ−２ ハードキャンディー】濃度５５％蔗糖
溶液１００重量部に実施例Ａ−７の方法で得たトレハロ
ース含有シラップ３０重量部を加熱混合し、次いで減圧
下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン
酸１重量部および適量のレモン香料と着色料とを混和
し、常法に従って成型し、製品を得た。
【０１２９】本品は、歯切れ、呈味良好で、蔗糖の晶出
も起こらない高品質のハードキャンデーである。
【０１３０】
【実施例Ｂ−３ チューインガム】ガムベース３重量部
を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに蔗糖４重量部
および実施例Ａ−３の方法で得たトレハロース含水結晶
３重量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合
し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、包
装して製品を得た。
【０１３１】本品は、テクスチャー、風味とも良好なチ
ューインガムである。
【０１３２】
【実施例Ｂ−４ 加糖練乳】原乳１００重量部に実施例
Ａ−１の方法で得たトレハロース含有シラップ３重量部
および蔗糖１重量部を溶解し、プレートヒーターで加熱
殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰し
て製品を得た。
【０１３３】本品は、温和な甘味で、風味もよく、乳幼
児食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味
用に有利に利用できる。
【０１３４】
【実施例Ｂ−５ 乳酸菌飲料】脱脂粉乳１７５重量部、
実施例Ａ−１の方法で得たトレハース含有シラップ１３
０重量部および特開平４−２８１７９５号公報で開示さ
れているラクトスクロース高含有粉末５０重量部を水
１，１５０重量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、
４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスタ
ーターを３０重量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳
酸菌飲料を得た。
【０１３５】本品は、風味良好な乳酸菌飲料である。ま
た、本品は、オリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に保持す
るだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用をも有する。
【０１３６】
【実施例Ｂ−６ 粉末ジュース】噴霧乾燥により製造し
たオレンジ果汁粉末３３重量部に対して、実施例Ａ−２
の方法で得たトレハロース高含有粉末５０重量部、蔗糖
１０重量部、無水クエン酸０．６５重量部、リンゴ酸
０．１重量部、Ｌ−アスコルビン酸０．１重量部、クエ
ン酸ソーダ０．１重量部、プルラン０．５重量部、粉末
香料適量をよく混合撹拌し、粉砕し微粉末にしてこれを
流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これに、
実施例Ａ−１の方法で得たトレハロース含有シラップを
バインダーとしてスプレーし、３０分間造粒し、計量、
包装して製品を得た。
【０１３７】本品は、果汁含有率約３０％の粉末ジュー
スである。また、本品は異味、異臭がなく、長期に安定
であった。
【０１３８】
【実施例Ｂ−７ カスタードクリーム】コーンスターチ
１００重量部、実施例Ａ−７の方法で得たトレハロース
含有シラップ１００重量部、マルトース８０重量部、蔗
糖２０重量部および食塩１重量部を充分に混合し、鶏卵
２８０重量部を加えて撹拌し、これに沸騰した牛乳１，
０００重量部を徐々に加え、更に、これを火にかけて撹
拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透
明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ
香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。
【０１３９】本品は、なめらかな光沢を有し、温和な甘
味で美味である。
【０１４０】
【実施例Ｂ−８ ういろうの素】米粉９０重量部に、コ
ーンスターチ２０重量部、蔗糖４０重量部、実施例Ａ３
の方法で得たトレハロース含水結晶粉末８０重量部およ
びプルラン４重量部を均一に混合してういろうの素を製
造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混練し、こ
れを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶ういろうを製
造した。
【０１４１】本品は、照り、口当りも良好で、風味も良
い。また、澱粉の老化も抑制され、日持ちも良い。
【０１４２】
【実施例Ｂ−９ あん】原料あずき１０重量部に、常法
に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きし、水
溶性夾雑物を除去して、あずきつぶあん約２１重量部を
得た。この生あんに、蔗糖１４重量部、実施例Ａ−１の
方法で得たトレハロース含有シラップ５重量部および水
４重量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイルを
加えてつぶあんをこわさないように練り上げ、製品のあ
んを約３５重量部得た。
【０１４３】本品は、色焼けもなく、舌ざわりもよく、
風味良好で、あんパン、まんじゅう、だんご、もなか、
氷菓などのあん材料として好適である。
【０１４４】
【実施例Ｂ−１０ パン】小麦粉１００重量部、イース
ト２重量部、砂糖５重量部、実施例Ａ−３の方法で得た
トレハロース含有粉末１重量部および無機フード０．１
重量部を、常法に従って、水でこね、中種を２６℃で２
時間発酵させ、その後３０分間熟成し、焼き上げた。
【０１４５】本品は、色相、すだちともに良好で適度な
弾力、温和な甘味を有する高品質のパンである。
【０１４６】
【実施例Ｂ−１１ ハム】豚もも肉１，０００重量部に
食塩１５重量部および硝酸カリウム３重量部を均一にす
り込んで、冷室に１昼夜堆積する。これを水５００重量
部、食塩１００重量部、硝酸カリウム３重量部、実施例
Ａ−６の方法で得たトレハロース含水結晶粉末４０重量
部および香辛料からなる塩漬液に冷室で７日間漬け込
み、次いで、常法に従い、冷水で洗浄し、ひもで巻き締
め、燻煙し、クッキングし、冷却包装して製品を得た。
【０１４７】本品は、色合いもよく、風味良好な高品質
のハムである。
【０１４８】
【実施例Ｂ−１２ 粉末ペプチド】４０％食品用大豆ペ
プチド溶液（不二製油株式会社製造、商品名ハイニュー
トＳ）１重量部に、実施例Ａ−６の方法で得たトレハロ
ース含水結晶粉末２重量部を混合し、プラスチック製バ
ットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチ
ドを得た。
【０１４９】本品は、風味良好で、プレミックス、冷菓
などの製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管
流動食などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に
利用できる。
【０１５０】
【実施例Ｂ−１３ 粉末味噌】赤味噌１重量部に実施例
Ａ−４の方法で得た結晶性無水トレハロース粉末３重量
部を混合し、多数の半球状凹部を設けた金属板に流し込
み、これを室温下で一夜静置して固化し、離型して１個
当り約４ｇの固形味噌を得、これを粉砕機にかけて粉末
味噌を得た。
【０１５１】本品は、即席ラーメン、即席吸物などの調
味料として有利に利用できる。
【０１５２】また、固形味噌は、固形調味料としてだけ
でなく味噌菓子などとしても利用できる。
【０１５３】
【実施例Ｂ−１４ 粉末卵黄】生卵から調製した卵黄を
プレート式加熱殺菌機で６０乃至６４℃で殺菌し、得ら
れる液状卵黄１重量部に対して、実施例Ａ−４の方法で
得た無水結晶トレハロース粉末４重量部の割合で混合し
た後バットに移し、一夜放置して、トレハロース含水結
晶に変換させてブロックを調製した。本ブロックを切削
機にかけて粉末化し、粉末卵黄を得た。
【０１５４】本品は、プレミックス、冷菓、乳化剤など
の製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流動
食などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に利用
できる。また、美肌剤、育毛剤などとしても有利に利用
できる。
【０１５５】
【実施例Ｂ−１５ 化粧用クリーム】モノステアリン酸
ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モ
ノステアリン酸グリセリン５重量部、実施例Ａ−２の方
法で得たトレハロース高含有粉末２重量部、α−グリコ
シルルチン１重量部、流動パラフィン１重量部、トリオ
クタン酸グリセリン１０重量部および防腐剤の適量を常
法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２重量部、１，
３−ブチレングリコール５重量部および精製水６６重量
部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適
量を加えて撹拌混合しクリームを製造した。
【０１５６】本品は、抗酸化性を有し、安定性が高く、
高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に
利用できる。
【０１５７】
【実施例Ｂ−１６ 粉末薬用人参エキス】薬用人参エキ
ス０．５重量部に実施例Ａ−４の方法で得た無水結晶ト
レハロース粉末１．５重量部を混捏した後、バットに移
し、２日間放置してトレハロース含水結晶に変換させブ
ロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化
し、分級して粉末薬用人参エキスを得た。
【０１５８】本品を適量のビタミンＢ１およびビタミン
Ｂ２粉末とともに顆粒成型機にかけ、ビタミン含有顆粒
状薬用人参エキスとした。
【０１５９】本品は、疲労回復剤、強壮、強精剤などと
して有利に利用できる。また、育毛剤などとしても利用
できる。
【０１６０】
【実施例Ｂ−１７ 固体製剤】ヒト天然型インターフェ
ロン−α標品（株式会社林原生物化学研究所製造、コス
モ・バイオ株式会社販売）を、常法に従って、固定化抗
ヒトインターフェロン−α抗体カラムにかけ、該標品に
含まれるヒト天然型インターフェロン−αを吸着させ、
安定剤である牛血清アルブミンを素通りさせて除去し、
次いで、ｐＨを変化させて、ヒト天然型インターフェロ
ン−αを実施例Ａ−２の方法で得たトレハロース高含有
粉末を５％含有する生理食塩水を用いて溶出した。本液
を精密濾過し、約２０倍量の無水結晶マルトース粉末
（株式会社林原商事販売、商品名ファイントース）に加
えて脱水、粉末化し、これを打錠機にて打錠し、１錠
（約２００ｍｇ）当りヒト天然型インターフェロン−α
を約１５０単位含有する錠剤を得た。
【０１６１】本品は、舌下錠などとして、一日当り、大
人１乃至１０錠程度が経口的に投与され、ウイルス性疾
患、アレルギー性疾患、リューマチ、糖尿病、悪性腫瘍
などの治療に有利に利用できる。とりわけ、近年、患者
数の急増しているエイズ、肝炎などの治療剤として有利
に利用できる。本品は、トレハロースと共にマルトース
が安定剤として作用し、室温でも放置してもその活性を
長期間よく維持する。
【０１６２】
【実施例Ｂ−１８ 糖衣錠】重量１５０ｍｇの素錠を芯
剤とし、これに実施例Ａ−３の方法で得たトレハロース
含水結晶粉末４０重量部、プルラン（平均分子量２０
万）２重量部、水３０重量部、タルク２５重量部および
酸化チタン３重量部からなる下掛け液を用いて錠剤重量
が約２３０ｍｇになるまで糖衣し、次いで、同じトレハ
ロース含水結晶粉末６５重量部、プルラン１重量部およ
び水３４重量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更
に、ロウ液で艶出しして光沢のある外観の優れた糖衣錠
を得た。
【０１６３】本品は、耐衝撃性にも優れており、高品質
を長期間維持する。
【０１６４】
【実施例Ｂ−１９ 練歯磨】 配合 第２リン酸カルシウム ４５．０％ プルラン ２．９５％ ラウリル硫酸ナトリウム １．５％ グリセリン ２０．０％ ポリオキシエチレンソルビタンラウレート ０．５％ 防腐剤 ０．０５％ 実施例３の方法で得たトレハロース含水結晶粉末 １２．０％ マルチトール ５．０％ 水 １３．０％ 上記の材料を常法に従って混合し、練歯磨を得た。
【０１６５】本品は、適度の甘味を有しており、特に子
供用練歯磨として好適である。
【０１６６】
【実施例Ｂ−２０ 流動食用固体製剤】実施例Ａ−６の
方法で製造したトレハロース含水結晶粉末５００重量
部、粉末卵黄２７０重量部、脱脂粉乳２０９重量部、塩
化ナトリウム４．４重量部、塩化カリウム１．８重量
部、硫酸マグネシウム４重量部、チアミン０．０１重量
部、アスコルビン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミン
Ｅアセテート０．６重量部及びニコチン酸アミド０．０
４重量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラ
ムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールし
て製品を得た。
【０１６７】本品は、１袋分を約１５０乃至３００ｍｌ
の水に溶解して流動食とし、経口的、又は鼻腔、胃、腸
などへ経管的使用方法により利用され、生体へのエネル
ギー補給用に有利に利用できる。
【０１６８】
【実施例Ｂ−２１ 輸液剤】実施例Ａ−８の方法で製造
した高純度トレハロース含水結晶を水に濃度約１０ｗ／
ｖ％に溶解し、次いで、常法に従って、精密濾過してパ
イロジェンフリーとし、プラスチック製ボトルに無菌的
に充填し施栓して製品を得た。
【０１６９】本品は、経日変化もなく安定な輸液剤で、
静脈内、腹腔内などに投与するのに好適である。本品は
濃度１０ｗ／ｖ％で血液と等張で、グルコースの場合の
２倍濃度でエネルギー補給できる。
【０１７０】
【実施例Ｂ−２２ 輸液剤】実施例Ａ−８の方法で製造
した高純度トレハロース含水結晶と下記の組成のアミノ
酸配合物とがそれぞれ５ｗ／ｖ％、３０ｗ／ｖ％になる
ように水に混合溶解し、次いで実施例１０と同様に精製
してパイロジェンフリーとし、更に、プラスチック製バ
ックに充填し施栓して製品を得た。
【０１７１】 アミノ酸配合物の組成（ｍｇ／１００ｍｌ） Ｌ−イソロイシン １８０ Ｌ−ロイシン ４１０ Ｌ−リジン塩酸塩 ６２０ Ｌ−メチオニン ２４０ Ｌ−フェニルアラニン ２９０ Ｌ−スレオニン １８０ Ｌ−トリプトファン ６０ Ｌ−バリン ２００ Ｌ−アルギニン塩酸塩 ２７０ Ｌ−ヒスチジン塩酸塩 １３０ グリシン ３４０
【０１７２】本品は、糖質とアミノ酸との複合輸液剤に
もかかわらず、トレハロースが還元性を示さないため、
経日変化もなく安定な輸液剤で、静脈内、腹腔内などへ
投与するのに好適である。本品は、生体へのエネルギー
補給のみならず、アミノ酸補給のためにも有利に利用で
きる。
【０１７３】
【実施例Ｂ−２３ 外傷治療用膏薬】実施例Ａ−２の方
法で製造したトレハロース高含有粉末２００重量部およ
びマルトース３００重量部に、ヨウ素３重量部を溶解し
たメタノール５０重量部を加え混合し、更に１０ｗ／ｖ
％プルラン水溶液２００重量部を加えて混合し、適度の
延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。
【０１７４】本品は、ヨウ素による殺菌作用のみなら
ず、トレハロースによる細胞へのエネルギー補給剤とし
ても作用することから、治癒期間が短縮され、創面もき
れいに治る。
【０１７５】
【発明の効果】上記から明らかなように、本発明の新規
トレハロース遊離酵素は、末端にトレハロース構造を有
するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質からトレ
ハロースを遊離し、また、還元性澱粉部分分解物に非還
元性糖質生成酵素とともに作用させることによって、高
収率でトレハロースを生成する。そのトレハロースの分
離、精製も容易であり、このようにして得られるトレハ
ロースおよびそれを含む糖質は安定性に優れ、良質で上
品な甘味を有している。また、経口摂取により消化吸収
され、カロリー源となる。また、輸液剤などとして非経
口的に使用され、よく代謝利用される。トレハロースお
よびそれを含む糖質は甘味料、呈味改良剤、品質改良
剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、
医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１７６】従って、本発明の確立は、安価で無限の資
源である澱粉に由来する澱粉部分分解物から、従来、望
むべくして容易に得られなかったトレハロースおよびそ
れを含む糖質を工業的に大量かつ安価に供給できる全く
新しい道を拓くこととなり、それが与える影響の大きさ
は、澱粉科学、酵素科学、生化学などの学問分野は言う
に及ばず、産業界、とりわけ食品、化粧品、医薬品分野
は勿論のこと、農水畜産業、化学工業にも及び、これら
産業界に与える工業的意義は計り知れないものがある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＥＡＥ−トヨパールからの本発明のトレハロ
ース遊離酵素と非還元性糖質生成酵素の溶出パターンを
示す図である。
【図２】本発明のリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１
由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼす温度の
影響を示す図である。
【図３】本発明のリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１
由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの
影響を示す図である。
【図４】本発明のリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１
由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼす温度の影
響を示す図である。
【図５】本発明のリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１
由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼすｐＨの影
響を示す図である。
【図６】本発明のアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ
３６由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼす温
度の影響を示す図である。
【図７】本発明のアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ
３６由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼすｐ
Ｈの影響を示す図である。
【図８】本発明のアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ
３６由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼす温度
の影響を示す図である。
【図９】本発明のアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ
３６由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼすｐＨ
の影響を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:265） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:41） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:265）

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 末端にトレハロース構造を有するグルコ
    ース重合度が３以上の非還元性糖質のトレハロース部分
    とそれ以外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加
    水分解するトレハロース遊離酵素。
  2. 【請求項２】 グリコシル部分が、重合度１以上のグル
    コース残基から構成されている請求項１記載のトレハロ
    ース遊離酵素。
  3. 【請求項３】 トレハロース遊離酵素が、微生物由来の
    酵素であることを特徴とする請求項１または請求項２記
    載のトレハロース遊離酵素。
  4. 【請求項４】 微生物が、リゾビウム属、アルスロバク
    ター属、ブレビバクテリウム属およびミクロコッカス属
    から選ばれる微生物である請求項３記載のトレハロース
    遊離酵素。
  5. 【請求項５】 下記の理化学的性質を有するトレハロー
    ス遊離酵素。 （１） 作用 末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３
    以上の非還元性糖質のトレハロース部分とそれ以外のグ
    リコシル部分との間の結合を特異的に加水分解する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約５７，０００乃至６
    ８，０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．３乃
    至４．６。 （４） 至適温度 ｐＨ７．０、３０分間反応で、３５乃至４５℃付近。 （５） 至適ｐＨ ４０℃、３０分間反応で、ｐＨ約６．０乃至７．５。 （６） 温度安定性 ｐＨ７．０、６０分間保持で、３０乃至４５℃付近まで
    安定。 （７） ｐＨ安定性 ２５℃、１６時間保持で、ｐＨ約５．０乃至１０．０。
  6. 【請求項６】 末端にトレハロース構造を有するグルコ
    ース重合度が３以上の非還元性糖質のトレハロース部分
    とそれ以外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加
    水分解する作用を有し、部分アミノ酸配列として、 （１） ロイシン−アスパラギン酸−トリプトファン−
    アラニン−グルタミン酸−アラニン−Ｘ1−Ｘ2−グリシ
    ン−アスパラギン酸（但し、Ｘ1はセリンまたはアラニ
    ンを意味し、Ｘ2はアラニンまたはグルタミン酸を意味
    する。） （２） アスパラギン酸−グルタミン酸−アルギニン−
    アラニン−バリン−ヒスチジン−イソロイシン−ロイシ
    ン−グルタミン酸−Ｘ3（但し、Ｘ3はグルタミン酸また
    はアスパラギン酸を意味する。） （３） Ｘ4−グリシン−グルタミン酸−グリシン−ア
    スパラギン−トレオニン−トリプトファン−グリシン−
    アスパラギン酸−セリン（但し、Ｘ4はヒスチジンまた
    はグルタミンを意味する。） から選ばれる１種または２種以上の部分アミノ酸配列を
    有するトレハロース遊離酵素。
  7. 【請求項７】 末端にトレハロース構造を有するグルコ
    ース重合度が３以上の非還元性糖質のトレハロース部分
    とそれ以外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加
    水分解するトレハロース遊離酵素産生能を有する微生物
    を栄養培地に培養して、得られる培養物から該トレハロ
    ース遊離酵素を採取することを特徴とする末端にトレハ
    ロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元
    性糖質のトレハロース部分とそれ以外のグリコシル部分
    との間の結合を特異的に加水分解するトレハロース遊離
    酵素の製造方法。
  8. 【請求項８】 微生物が、リゾビウム属、アルスロバク
    ター属、ブレビバクテリウム属およびミクロコッカス属
    から選ばれる微生物である請求項７記載のトレハロース
    遊離酵素の製造方法。
  9. 【請求項９】 リゾビウム・スピーシーズ（Ｒｈｉｚｏ
    ｂｉｕｍ ｓｐ．）Ｍ−１１（工業技術院微生物工業技
    術研究所、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）、ま
    たは、アルスロバクター・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒｏ
    ｂａｃｔｅｒｓｐ．）Ｑ３６（工業技術院生命工学工業
    技術研究所、受託番号 ＦＥＲＭＢＰ−４３１６）から
    なる末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度
    が３以上の非還元性糖質のトレハロース部分とそれ以外
    のグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分解する
    トレハロース遊離酵素産生能を有する微生物。
  10. 【請求項１０】 末端にトレハロース構造を有するグル
    コース重合度が３以上の非還元性糖質を含有する溶液
    に、該非還元性糖質のトレハロース部分とそれ以外のグ
    リコシル部分との間の結合を特異的に加水分解するトレ
    ハロース遊離酵素を作用させて得られるトレハロース、
    または、これを含む糖質。
  11. 【請求項１１】 グルコース重合度が３以上から選ばれ
    る１種または２種以上の還元性澱粉部分分解物を含有す
    る溶液に、還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロー
    ス構造を有するグルコース重合度が３以上から選ばれる
    １種または２種以上の非還元性糖質を生成する非還元性
    糖質生成酵素と該非還元性糖質のトレハロース部分とそ
    れ以外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分
    解するトレハロース遊離酵素とを作用させることを特徴
    とする還元性澱粉部分分解物の還元力を増加させること
    なくグルコース重合度を低減させる方法。
  12. 【請求項１２】 グルコース重合度が３以上から選ばれ
    る１種または２種以上の還元性澱粉部分分解物を含有す
    る溶液に、還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロー
    ス構造を有するグルコース重合度が３以上から選ばれる
    １種または２種以上の非還元性糖質を生成する非還元性
    糖質生成酵素と該非還元性糖質のトレハロース部分とそ
    れ以外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分
    解するトレハロース遊離酵素とを作用させ、得られるト
    レハロース、または、これを含む糖質。
  13. 【請求項１３】 澱粉を部分的に加水分解して得られる
    グルコース重合度が３以上から選ばれる１種または２種
    以上の還元性澱粉部分分解物を含有する溶液に、還元性
    澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有するグ
    ルコース重合度が３以上から選ばれる１種または２種以
    上の非還元性糖質を生成する非還元性糖質生成酵素と該
    非還元性糖質のトレハロース部分とそれ以外のグリコシ
    ル部分との間の結合を特異的に加水分解するトレハロー
    ス遊離酵素とを作用させ、得られるトレハロース、また
    は、これを含む糖質。
  14. 【請求項１４】 グルコース重合度が３以上から選ばれ
    る１種または２種以上の還元性澱粉部分分解物を含有す
    る溶液に、還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロー
    ス構造を有するグルコース重合度が３以上から選ばれる
    １種または２種以上の非還元性糖質を生成する非還元性
    糖質生成酵素と該非還元性糖質のトレハロース部分とそ
    れ以外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分
    解するトレハロース遊離酵素とを作用させ、トレハロー
    スおよびそれ以外の夾雑糖質含有溶液とし、これを強酸
    性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー
    にかけ、得られる含量を向上させたトレハロース。
  15. 【請求項１５】 トレハロースが含水結晶、または無水
    結晶である請求項１２、請求項１３または請求項１４記
    載のトレハロース。
  16. 【請求項１６】 グルコース重合度が３以上から選ばれ
    る１種または２種以上の還元性澱粉部分分解物を含有す
    る溶液に、還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロー
    ス構造を有するグルコース重合度が３以上から選ばれる
    １種または２種以上の非還元性糖質を生成する非還元性
    糖質生成酵素と該非還元性糖質のトレハロース部分とそ
    れ以外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分
    解するトレハロース遊離酵素とを作用させ、次いでグル
    コアミラーゼを作用させ、トレハロースおよびそれ以外
    の夾雑糖類を含有する溶液とし、これを強酸性カチオン
    交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけ、得
    られる含量を向上させたトレハロース。
  17. 【請求項１７】 グルコース重合度が３以上から選ばれ
    る１種または２種以上の還元性澱粉部分分解物を含有す
    る溶液に、還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロー
    ス構造を有するグルコース重合度が３以上から選ばれる
    １種または２種以上の非還元性糖質を生成する非還元性
    糖質生成酵素と該非還元性糖質のトレハロース部分とそ
    れ以外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分
    解するトレハロース遊離酵素とを作用させ、得られるト
    レハロース、または、これを含む糖質を含有せしめた組
    成物。
  18. 【請求項１８】 組成物が、飲食物、化粧品または医薬
    品である請求項１７記載の組成物。
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