JPH07209187A - Laser scanning type cell analyser - Google Patents
Laser scanning type cell analyserInfo
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- JPH07209187A JPH07209187A JP29250694A JP29250694A JPH07209187A JP H07209187 A JPH07209187 A JP H07209187A JP 29250694 A JP29250694 A JP 29250694A JP 29250694 A JP29250694 A JP 29250694A JP H07209187 A JPH07209187 A JP H07209187A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、レーザ走査式顕微鏡の
細胞分析装置に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a cell analyzer for a laser scanning microscope.
【０００２】[0002]
【従来の技術】細胞内部の物質と特異的に結合するマー
カ・プローブに蛍光色素を結合して、細胞内部の蛍光量
を測定すれば、その内部物質の定量が可能となる。更
に、その細胞の画像情報を入手すれば、細胞内部での化
学物質の分布状況、目的画像の識別、細胞の形態情報に
よる分類等が可能になる。2. Description of the Related Art If a fluorescent dye is bound to a marker probe that specifically binds to a substance inside a cell and the amount of fluorescence inside the cell is measured, the substance inside the cell can be quantified. Furthermore, if the image information of the cell is obtained, it becomes possible to identify the distribution state of the chemical substance inside the cell, the identification of the target image, the classification by the cell morphological information, and the like.
【０００３】ところで、細胞内の蛍光量を測定するため
の装置として、次に示すような装置〜がある。 フローサイトメータ この装置は、細胞検体を溶液中に浮遊させ、この浮遊液
を細い管の中に通して細胞を１列に流し、この細胞のレ
ーザ光による蛍光・散乱光等を測定して、個々の細胞の
蛍光量から検体全体の蛍光量の統計的処理を行うもので
ある。この装置では、分析速度が極めて早く大量の試料
を測定することが可能なため、測定による統計的ばらつ
きを減少することができるが、形態情報を得ることはで
きない。更に、測定は１度きりのため測定データに不明
確な点があった場合でも、試料の再検査が不可能という
大きな問題点がある。 蛍光顕微測光法を用いた装置 この装置は、上記装置の問題点を解決すべく試料を保
存するために、スライドガラス上の対象試料について、
蛍光顕微鏡を用い位相差像を観察して細胞を選択し、細
胞をおよそ囲むように励起光を円形スポット状に照射す
ることにより、励起された蛍光量を測定するものであ
る。この装置では、試料が残らないという装置の問題
点を解決することができるが、対象の選択に時間が掛か
ることから、測定に時間が掛かることが欠点である。更
に、励起光を照射する範囲よりも大きな対象は測定する
ことができず、測定の際に対象の大きさが異なる場合に
は、背景の大きさが測定ごとに異なるため測定誤差が生
じ易い、という問題点もある。 顕微鏡画像の高感度ＣＣＤカメラでの取り込みを用い
た装置 この装置は、生物試料のＤＮＡ量を測定するためにスラ
イドガラス上の標本をフォイルゲン染色し、その画像を
ＣＣＤカメラで撮影し、細胞内のＤＮＡによる吸収量を
測定するものである。この装置だと、装置よりは遅い
が実用レベルの時間で測定できる。しかし、画像のノイ
ズが大きいこと、及び照明光の散乱により測定精度の劣
化が起こることから、測定精度が疑問視され、またフォ
イルゲン染色が生物試料の核内構造を破壊してしまうた
め再検査の際の判別が難しいという問題点がある。 カメンツキーの手法を用いた装置 この装置は、スライドガラス上の生物試料にレーザを照
射することによって、装置の問題点である検体の再検
査を可能にすることを目的としているものであり、試料
の再検査が可能な上に、或る程度大量のデータを入手す
ることができるため統計処理も可能である。しかしなが
ら、測定精度と測定速度を上げるためにレーザビーム径
を大きくしたため、対象生物試料の詳細な画像情報を得
ることができない上に、蛍光画像の表示は可能である
が、蛍光量の定量以外に蛍光画像を必要とする場合には
利用することができないという問題点がある。 共焦点レーザ走査顕微鏡（走査型光学顕微鏡）を用い
た装置 この装置では、装置の試料保存の問題点を解決するた
めに、共焦点レーザ走査顕微鏡を用いて試料にレーザを
照射し、その蛍光量を測定することができる。この装置
では、十分小さいビーム径で走査することと、共焦点に
よる焦点深度の浅さから、そのビームの絞れた部分の蛍
光量のみ（三次元的に或る点のみ）を測定することがで
きる。又、顕微鏡の視野において試料を測定できるた
め、不明な画像も確認することができる。しかし、レー
ザビームが点しか照射できないため、１枚の画像を得る
のに三次元的にデータを入手する必要があり、時間が掛
かることから大量のデータ測定が困難であり、また蛍光
量の測定精度の低さも問題になっている。By the way, there are the following devices as devices for measuring the amount of fluorescence in cells. Flow cytometer This device suspends a cell sample in a solution, passes this suspension through a thin tube to flow the cells in a row, and measures the fluorescence / scattered light of the cells by laser light, The fluorescence amount of the whole sample is statistically processed from the fluorescence amount of individual cells. With this device, the analysis speed is extremely fast and a large amount of sample can be measured, and thus statistical variations due to measurement can be reduced, but morphological information cannot be obtained. Further, since the measurement is performed only once, there is a big problem that the reinspection of the sample is impossible even if the measurement data has an unclear point. Device using fluorescence microphotometry This device is used for storing a sample in order to solve the problems of the above-mentioned device.
The amount of excited fluorescence is measured by observing a phase difference image using a fluorescence microscope, selecting cells, and irradiating excitation light in a circular spot shape so as to surround the cells. This device can solve the problem of the device in that the sample does not remain, however, it takes a long time to select the target, so that it takes a long time to perform the measurement. Furthermore, a target larger than the range of irradiating the excitation light cannot be measured, and when the size of the target is different during the measurement, a measurement error is likely to occur because the size of the background is different for each measurement, There is also a problem. This device uses uptake of microscopic images with a high-sensitivity CCD camera. This device stains a specimen on a slide glass with Feulgen staining to measure the amount of DNA in a biological sample, and photographs the image with a CCD camera, The amount of absorption by DNA is measured. This device is slower than the device but can be measured in a practical time. However, because the noise in the image is large and the measurement accuracy deteriorates due to the scattering of the illumination light, the measurement accuracy is questioned, and Feulgen staining destroys the nuclear structure of the biological sample, so re-examination is required. There is a problem that it is difficult to distinguish when. Device using Kamensky method This device is intended to enable re-examination of a specimen, which is a problem of the device, by irradiating a biological sample on a slide glass with a laser. In addition to re-examination, statistical processing is possible because a certain amount of data can be obtained. However, since the laser beam diameter was increased to increase the measurement accuracy and measurement speed, detailed image information of the target biological sample cannot be obtained and a fluorescence image can be displayed. There is a problem that it cannot be used when a fluorescence image is required. Device using confocal laser scanning microscope (scanning optical microscope) In this device, in order to solve the problem of sample storage of the device, a laser is irradiated to the sample using a confocal laser scanning microscope, and the fluorescence amount Can be measured. With this device, it is possible to measure only the amount of fluorescence (three-dimensionally at a certain point) in the narrowed portion of the beam by scanning with a sufficiently small beam diameter and from the shallow depth of focus due to confocal point. . Further, since the sample can be measured in the field of view of the microscope, an unknown image can be confirmed. However, since the laser beam can only irradiate points, it is necessary to obtain data in three dimensions to obtain one image, and it takes time to measure a large amount of data. Poor accuracy is also a problem.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】上記装置〜の問題
点をまとめてみると、装置が生物試料内の蛍光量を測
定する目的で実用化されているが、この装置では検査試
料の再検査を行うことができない。これに対し装置で
は、検体の再検査を行うことができるが、大量の検体を
検査する場合に膨大な時間が掛かり、対象の選択に問題
点がある。装置では、蛍光量の測定によるものでなく
他の手法で細胞内のＤＮＡの定量を行おうとするもので
あるが、測定精度のばらつきが大きな問題である。装置
は、装置と同様の情報を入手するにもかかわらず、
細胞の残らない問題を解決しようと考え出されたもので
あり、装置と同様にスライドガラス上の細胞に対して
蛍光量を測定しようとするものであるが、ビーム径が大
きいため内部構造の情報を殆ど得ることができず、蛍光
画像情報を必要とする場合には用いることができないと
考えられる。装置は、スライドガラス上の細胞を対象
とするため細胞が残り、且つ画像の分解能も高いため良
質の画像情報を得ることが可能であるが、蛍光量の定量
性に問題がある。To summarize the problems of the above-mentioned devices, the device has been put to practical use for the purpose of measuring the amount of fluorescence in a biological sample. I can't do it. On the other hand, the apparatus can re-examine the specimens, but it takes a huge amount of time to examine a large number of specimens, and there is a problem in selecting a target. Although the device attempts to quantify intracellular DNA by another method rather than by measuring the amount of fluorescence, the variation in measurement accuracy is a big problem. Even though the device gets the same information as the device,
It was conceived to solve the problem of no cells remaining, and it is intended to measure the amount of fluorescence for cells on a slide glass as with the device, but because of the large beam diameter, information on the internal structure It is considered that it cannot be used when fluorescence image information is required because it is difficult to obtain. Since the device is intended for cells on a slide glass, the cells remain, and the image resolution is high, so that it is possible to obtain high-quality image information, but there is a problem in the quantitativeness of the fluorescence amount.
【０００５】従って、本発明は、上記問題点に鑑みなさ
れたもので、再検査を可能にすること、検査に時間が掛
からないこと、精度の良い蛍光量及び画像情報が得られ
ることを併せて実現することができるレーザ走査式細胞
分析装置を提供することを目的とする。Therefore, the present invention has been made in view of the above problems, and it is possible to perform re-inspection, that the inspection does not take time, and that accurate fluorescence amount and image information can be obtained. An object is to provide a laser scanning cell analyzer that can be realized.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明のレーザ走査式細胞分析装置は、光源である
レーザ発振器と、このレーザ発振器からのレーザスポッ
トで試料細胞を二次元走査するレーザビーム偏向部と、
走査レーザビームを試料細胞に集光照射する対物レンズ
と、レーザビームの照射により試料細胞が放射する信号
光の結像位置に配置した開口と、この開口を通過した信
号光を受光する光検出器と、この光検出器の出力信号を
処理する処理部とを備えるレーザ走査式細胞分析装置に
おいて、前記試料細胞面上を走査するレーザスポット半
径ｒと走査間隔ｓとの関係が、ｓ／ｒ≦１であることを
特徴とする。In order to achieve the above object, the laser scanning cell analyzer of the present invention two-dimensionally scans a sample cell with a laser oscillator as a light source and a laser spot from this laser oscillator. A laser beam deflection unit,
An objective lens for converging and irradiating a sample cell with a scanning laser beam, an aperture arranged at an imaging position of the signal light emitted by the sample cell by the irradiation of the laser beam, and a photodetector for receiving the signal light passing through this aperture. And a processing unit for processing the output signal of the photodetector, the relationship between the laser spot radius r for scanning the cell surface of the sample and the scanning interval s is s / r ≦ It is characterized by being 1.
【０００７】[0007]
【作用】本発明の装置では、共焦点レーザ走査顕微鏡を
用いた蛍光量測定において、レーザスポット半径ｒと走
査間隔ｓとの関係をｓ／ｒ≦１にしたから、即ちレーザ
スポットを走査する際に試料面上の各点におけるレーザ
強度の総和を一様とすることによって、細胞内部の蛍光
量の測定精度が向上する。又、複数の共焦点位置に大き
さの異なる開口を配置することにより、蛍光量を測定す
るのに最適な低分解能画像情報と、形態画像を得るのに
最適な高分解能画像情報とを得て、細胞の蛍光量と形態
情報を同時に得ることができる。従って、再検査が可能
になり、検査に時間が掛からず、精度の良い蛍光量及び
画像情報が得られることとなる。In the apparatus of the present invention, in the fluorescence amount measurement using the confocal laser scanning microscope, the relation between the laser spot radius r and the scanning interval s is set to s / r≤1, that is, when the laser spot is scanned. Moreover, by making the total sum of the laser intensities at each point on the sample surface uniform, the measurement accuracy of the fluorescence amount inside the cell is improved. In addition, by disposing apertures of different sizes at a plurality of confocal positions, it is possible to obtain low-resolution image information optimal for measuring the fluorescence amount and high-resolution image information optimal for obtaining a morphological image. , It is possible to obtain the fluorescence amount of cells and morphological information at the same time. Therefore, reinspection can be performed, the inspection does not take time, and accurate fluorescence amount and image information can be obtained.
【０００８】[0008]
【実施例】以下、本発明のレーザ走査式細胞分析装置を
実施例に基づいて説明する。まず、本発明の装置の原理
について説明する。試料面を走査する強度分布がガウス
型のレーザ光においては、図１０及び図１１に示すよう
にレーザスポットの半径をｒ、走査間隔をｓとした場
合、レーザスポットを走査する間隔ｓを広げてしまう
と、試料面上の各点において一様に光が当たらなくな
る。この条件を表したのが図１２乃至図１４である。図
１２及び図１３は、ｓ／ｒの条件を０．５〜１．５まで
変化させたときの各点におけるレーザ強度の総和の変動
を示している。これらから、ｓ／ｒ＞１であると大幅に
変動が起こり、一様にレーザを照射しているとはいい難
くなる。これを定量化して示したのが図１４で、平均値
からの外れを表現すると、ｓ／ｒ≦１であれば、その変
動は±１．４％以内に収まることが分かる。このことよ
り、「レーザスポットの半径をｒ、走査間隔をｓとした
場合、ｓ／ｒ≦１において光量の変動を±１．４％以内
に抑えることができる」と定量化することができる。光
量の変動を±１．４％以内としたのは、現在の装置で最
も精度が高いとされているフローサイトメータでもｃｖ
が２〜３％であるため、少なくとも積算強度の変動幅は
±１．５％以内であることが望ましいからである。EXAMPLES The laser scanning cell analyzer of the present invention will be described below based on examples. First, the principle of the device of the present invention will be described. In the case of a laser beam whose intensity distribution for scanning the sample surface is Gaussian, as shown in FIGS. 10 and 11, when the radius of the laser spot is r and the scanning interval is s, the interval s for scanning the laser spot is widened. If this happens, the light will not be uniformly illuminated at each point on the sample surface. This condition is shown in FIGS. 12 to 14. 12 and 13 show changes in the total sum of laser intensities at each point when the s / r condition was changed from 0.5 to 1.5. From these, if s / r> 1, a large variation occurs, and it is difficult to say that laser irradiation is performed uniformly. This is quantified and shown in FIG. 14. When the deviation from the average value is expressed, it can be seen that the variation is within ± 1.4% if s / r ≦ 1. From this, it can be quantified that "when the radius of the laser spot is r and the scanning interval is s, the variation of the light amount can be suppressed within ± 1.4% when s / r≤1". The reason why the fluctuation of the light quantity is within ± 1.4% is cv even with the flow cytometer, which is said to have the highest accuracy in the current equipment.
Is 2 to 3%, so that it is desirable that at least the fluctuation range of the integrated intensity be within ± 1.5%.
【０００９】ところで、従来、レーザ走査式細胞分析装
置において、レーザを照射する範囲を広くする機能は備
わっている。しかし、重要な点は、対象試料はレーザ光
を照射すると蛍光量の退色を起こしてしまうため、対象
選択時に一様にレーザ光が照射されない場合には退色の
程度が部分ごとに異なることになり、その結果、測定精
度に誤差が発生し、蛍光量の正確な定量ができなくなる
点である。そこで、本発明では対象試料を選択する時と
測定する時との状態変更について、走査間隔を広げると
同時にレーザスポット半径も大きくして、対象選択時に
一様照射の条件を保ったまま対象の検索範囲を広げるこ
とができる構成としたのである。このため、一様照射の
条件を保ったまま広い範囲での対象選択を行い、対象の
測定時には狭い範囲にて高い精度で測定することができ
るようになる。By the way, conventionally, a laser scanning cell analyzer has a function of widening a laser irradiation range. However, the important point is that when the target sample is irradiated with laser light, the amount of fluorescence is fading, so if the laser light is not uniformly irradiated during target selection, the degree of fading will vary from part to part. As a result, an error occurs in the measurement accuracy, and it becomes impossible to accurately quantify the fluorescence amount. Therefore, in the present invention, regarding the state change between when the target sample is selected and when the measurement is performed, the scanning interval is widened and at the same time the laser spot radius is increased to search for the target while maintaining the uniform irradiation condition when the target is selected. The structure is such that the range can be expanded. Therefore, it becomes possible to select an object in a wide range while maintaining the condition of uniform irradiation, and to measure with high accuracy in a narrow range when measuring an object.
【００１０】次に、本発明装置の基本構成のブロックダ
イアグラムを図１に示す。この装置は、図１に示すよう
に、共焦点レーザ走査顕微鏡と同等の構成である。即
ち、レーザ発振器１からのレーザビーム１５を対物レン
ズ４により細胞等の試料５に集光照射し、この試料５か
らの蛍光や散乱反射光を対物レンズ４で集光し、ビーム
スプリット手段（ここでは図示せず）を用いて選択分割
し、それぞれ開口寸法の異なる開口７ａ，７ｂ，７ｃで
不要光を除去し、光検出器６ａ，６ｂ，６ｃで検出する
構成である。Next, FIG. 1 shows a block diagram of the basic configuration of the device of the present invention. As shown in FIG. 1, this device has the same configuration as a confocal laser scanning microscope. That is, the laser beam 15 from the laser oscillator 1 is focused and irradiated on the sample 5 such as a cell by the objective lens 4, and the fluorescence or scattered reflected light from the sample 5 is focused by the objective lens 4 and the beam splitting means (here (Not shown) is used for selective division, unnecessary light is removed by the openings 7a, 7b, 7c having different opening sizes, and detected by the photodetectors 6a, 6b, 6c.
【００１１】レーザ発振器１から出たレーザビーム１５
は、光量調節器２を経て、レーザビーム偏向部３で二次
元に偏向走査され、対物レンズ４により試料５上をレー
ザスポットで二次元走査する。この試料５上のレーザス
ポットの二次元走査において、レーザスポット半径ｒと
走査間隔ｓとの関係をｓ／ｒ≦１とし、レーザビームの
積算強度の変動を±１．４％以下とする。Laser beam 15 emitted from laser oscillator 1
Is two-dimensionally deflected and scanned by the laser beam deflector 3 through the light quantity adjuster 2, and the objective lens 4 two-dimensionally scans the sample 5 with a laser spot. In the two-dimensional scanning of the laser spot on the sample 5, the relationship between the laser spot radius r and the scanning interval s is set to s / r ≦ 1, and the fluctuation of the integrated intensity of the laser beam is set to ± 1.4% or less.
【００１２】このような制御方法について詳細に記す。
予め設計された光学系の条件から標本上でのレーザスポ
ット半径は一意に決定される。このレーザスポット半径
を変更するために、例えば対物レンズを交換する方法が
ある。図２は、その機構を採り入れた装置のブロックダ
イアグラムを示す。但し、図１の装置と同一要素には同
じ符号を付してある。図２の装置では、３つの交換可能
な対物レンズ４ａ，４ｂ，４ｃを有する対物レンズ切り
替え機構１４が設けられると共に、走査間隔・レンズ切
り替え・レーザ光量を制御する装置１３と、それらを制
御するための設定表を保持している記憶装置１６とが配
備されている。The control method will be described in detail.
The laser spot radius on the sample is uniquely determined from the conditions of the optical system designed in advance. In order to change the laser spot radius, there is a method of replacing the objective lens, for example. FIG. 2 shows a block diagram of an apparatus incorporating the mechanism. However, the same elements as those of the apparatus of FIG. 1 are designated by the same reference numerals. The apparatus of FIG. 2 is provided with an objective lens switching mechanism 14 having three interchangeable objective lenses 4a, 4b, 4c, and a device 13 for controlling the scanning interval, lens switching, and laser light amount, and for controlling them. And a storage device 16 which holds the setting table of the above.
【００１３】図２の装置において、対物レンズ切り替え
機構１４を用いて対物レンズを交換すると、レーザスポ
ット半径は対物レンズによって変化する。図３の表〔対
物レンズごとに予め計算したレーザスポット半径（レー
ザビーム半径）と走査間隔及びレーザ強度との関係の設
計表〕に示すように、レーザスポット半径に対応してｓ
／ｒ≦１の範囲に収まる走査間隔ｓを決定し、同時に必
要なレーザ強度を決定する。このような設計によって決
定された値に制御を行うための設定値は制御方法によっ
て異なるが、設計された値から一意に計算できる。例え
ば、走査間隔の設定値は偏光素子への入力電圧値、レー
ザ強度の設定値はレーザ強度調整器への入力電圧値とし
て、この値を示したものが図４に示す表（走査間隔及び
レーザ強度を制御するための設定表）である。In the apparatus of FIG. 2, when the objective lens is switched using the objective lens switching mechanism 14, the laser spot radius changes depending on the objective lens. As shown in the table of FIG. 3 [a design table of the relationship between the laser spot radius (laser beam radius) pre-calculated for each objective lens, the scanning interval and the laser intensity], s corresponds to the laser spot radius.
The scanning interval s within the range of / r ≦ 1 is determined, and at the same time, the required laser intensity is determined. The set value for controlling the value determined by such design varies depending on the control method, but can be uniquely calculated from the designed value. For example, the set value of the scanning interval is the input voltage value to the polarizing element, the set value of the laser intensity is the input voltage value to the laser intensity adjuster, and these values are shown in the table (scan interval and laser It is a setting table for controlling the strength).
【００１４】本発明においては、機構の制御には設定値
のみを保持しておけばよいため、装置内に図３の表の情
報を持つ必要はなく、図４の表の内容のみを予め記憶装
置１６に保存しておけばよい。本発明の請求項１記載の
ｓ／ｒ≦１の関係を保つ機構の実施例として、図５のフ
ローチャートを示す。走査間隔ｓの設定を行う場合に、
予め保持しているレーザスポット半径ｒと照合して必要
な関係を保つように制御している。即ち、まず操作者が
レーザスポット半径ｒに対する走査間隔ｓを指定し〔ス
テップ（以下、ＳＴと略す）１〕、記憶装置１６からレ
ーザスポット半径ｒを読み出す（ＳＴ２）。そして、指
定された走査間隔ｓがｓ≦ｒを満たすかどうかを判定し
（ＳＴ３）、これがＹＥＳなら走査間隔ｓを記憶装置１
６に保持して（ＳＴ４）、走査間隔設定を終了し、ＮＯ
なら走査間隔ｓが適切でないことを表示して（ＳＴ
５）、ＳＴ１に戻る。In the present invention, since only the set values need to be held for controlling the mechanism, it is not necessary to have the information in the table of FIG. 3 in the device, and only the contents of the table of FIG. 4 are stored in advance. It may be stored in the device 16. As an embodiment of the mechanism for maintaining the relationship of s / r ≦ 1 according to claim 1 of the present invention, the flowchart of FIG. 5 is shown. When setting the scanning interval s,
Control is performed so as to maintain the necessary relationship by collating with the laser spot radius r held in advance. That is, the operator first specifies the scanning interval s with respect to the laser spot radius r [step (hereinafter abbreviated as ST) 1], and reads the laser spot radius r from the storage device 16 (ST2). Then, it is determined whether or not the designated scanning interval s satisfies s ≦ r (ST3). If this is YES, the scanning interval s is stored in the storage device 1.
No. 6 is held (ST4), scanning interval setting is completed, and NO
Then, display that the scanning interval s is not appropriate (ST
5) Return to ST1.
【００１５】又、請求項２及び請求項３記載の構成に係
る実施例を、図６のフローチャートに示す。対物レンズ
を変化させることによりレーザスポット半径ｒが変化
し、この違いによって走査間隔ｓ及びレーザ強度の設定
値を読み出し、この内容に従って制御しながら画像を取
り込む。即ち、現在のレーザスポット半径ｒを読み出す
（ＳＴ１１）と共に、走査間隔ｓとレーザ強度を記憶装
置１６から読み出す（ＳＴ１２）。次いで、読み出した
設定値を用いて画像を取り込み（ＳＴ１３）、次の画像
を取り込むかどうかを問い（ＳＴ１４）、ＹＥＳの場合
は必要ならばレーザスポット半径を変更して（ＳＴ１
５）、ＳＴ１１に戻り、ＮＯの場合は画像の取り込みを
終了する。An embodiment relating to the configurations of claims 2 and 3 is shown in the flowchart of FIG. The laser spot radius r is changed by changing the objective lens, and the scanning interval s and the set value of the laser intensity are read out by this difference, and the image is captured while controlling according to the contents. That is, the current laser spot radius r is read (ST11), and the scanning interval s and laser intensity are read from the storage device 16 (ST12). Next, an image is captured using the read set value (ST13), and it is asked whether or not to capture the next image (ST14). If YES, the laser spot radius is changed if necessary (ST1).
5) The procedure returns to ST11, and in the case of NO, the capture of the image ends.
【００１６】ここでは、レーザビームの偏向素子として
ＡＯＤ（音響光学偏向素子）又はガルバノ式ミラーを用
いていることから、設定値は電圧値としているが、電流
制御或いは機械的なパルス数での制御でも同様の効果が
得られる。この場合は、記憶装置１６に保存する内容
は、このような電流値、パルス数等の数値となる。又、
対物レンズ切り替え機構１４の制御については、操作者
が行ったレンズの切替えをセンサで関知して制御装置１
３で走査間隔、レーザ強度を制御することも可能である
し、制御装置１３の制御のもとで自動的にレンズを交換
する構成も可能である。Here, since the AOD (acousto-optic deflecting element) or the galvano mirror is used as the deflecting element of the laser beam, the set value is the voltage value, but the current control or the control by the mechanical pulse number is used. However, the same effect can be obtained. In this case, the contents stored in the storage device 16 are such current values and the numbers of pulses. or,
Regarding the control of the objective lens switching mechanism 14, the control device 1 detects the lens switching performed by the operator with a sensor.
It is possible to control the scanning interval and the laser intensity by means of 3, and it is also possible to automatically replace the lenses under the control of the controller 13.
【００１７】ここで示した実施例は、対物レンズの切り
替えによってレーザスポット半径を変化させる構成とな
っているが、レーザスポット半径の変化は光路中のレン
ズ系を変化させたり、ズームレンズを用いたりすること
で連続的に変化させることも可能である。このような場
合も、レーザスポット半径から要求される走査間隔とレ
ーザ強度を決定して制御を行うことは、上述の方法と同
様の構成で行うことができる。In the embodiment shown here, the laser spot radius is changed by switching the objective lens, but the change of the laser spot radius changes the lens system in the optical path or uses a zoom lens. It is also possible to change continuously by doing. Even in such a case, the scanning interval and the laser intensity required from the laser spot radius can be determined and controlled by the same configuration as the above-described method.
【００１８】図１又は図２の構成において、試料５から
の蛍光と散乱反射光は、対物レンズ４で集光され、レー
ザビーム偏向部３を経て、蛍光用の光検出器６ａ，６ｂ
及び散乱反射光用の光検出器６ｃで受光されて電気信号
に変換される。この際、大開口７ａを通過した蛍光は蛍
光量の測定に、小開口７ｂ，７ｃを通過した光は細胞の
画像情報の取得に供される。In the structure shown in FIG. 1 or 2, the fluorescence and scattered reflected light from the sample 5 are condensed by the objective lens 4, pass through the laser beam deflecting section 3, and are then detected by the photodetectors 6a and 6b for fluorescence.
The light is also received by the photodetector 6c for scattered reflected light and converted into an electric signal. At this time, the fluorescence that has passed through the large opening 7a is used for measuring the amount of fluorescence, and the light that has passed through the small openings 7b and 7c is used for acquiring image information of the cells.
【００１９】各光検出器６ａ，６ｂ，６ｃの出力はデー
タ処理部８に入力され、それぞれ低分解能蛍光画像、高
分解能蛍光画像、散乱反射画像を得る。これら３つの画
像から、適当な画像処理により分析目標の細胞画像を抽
出する。高分解能蛍光画像と散乱反射画像から、分析目
標の細胞の周長、核の面積、重畳細胞やゴミとの識別等
の情報を得る。又、低分解能蛍光画像情報の細胞画像部
分の蛍光強度を面積積分して目標細胞の蛍光量を求め
る。The outputs of the photodetectors 6a, 6b and 6c are input to the data processing section 8 to obtain a low resolution fluorescence image, a high resolution fluorescence image and a scattered reflection image, respectively. From these three images, the cell image of the analysis target is extracted by appropriate image processing. From the high-resolution fluorescence image and the scattered reflection image, information such as the perimeter of the cell to be analyzed, the area of the nucleus, and the discrimination between the superimposed cell and dust are obtained. Further, the fluorescence intensity of the target cell is obtained by performing area integration on the fluorescence intensity of the cell image portion of the low resolution fluorescence image information.
【００２０】１画面のデータ処理が終わると、ステージ
１０を装置制御部１２の制御の下にステージ駆動部１１
を用いて自動的に移動させて、データ処理部８は新しい
画面について測定を行う。表示部９には、細胞の蛍光画
像、散乱反射光画像、個々の細胞の蛍光量データ、核の
面積、細胞の周長等のデータのヒストグラム等を表示す
る。When the data processing for one screen is completed, the stage 10 is moved under the control of the device controller 12 to the stage driver 11.
Then, the data processing unit 8 measures the new screen. The display unit 9 displays a fluorescence image of cells, a scattered reflected light image, fluorescence amount data of individual cells, a histogram of data such as the area of the nucleus and the perimeter of cells, and the like.
【００２１】このように、大開口７ａを設けた光路の光
検出器６ａからは、試料の信号光の集光範囲が広いため
低分解能画像情報が得られる。この低分解能画像は、焦
点深度が深く、信号である蛍光の、試料の深さ方向にわ
たる積算量を示している。この画像情報を基に対象部分
の面積の蛍光強度を積分すれば、対象の蛍光量を高精度
で測定することが可能になる。In this way, low-resolution image information can be obtained from the photodetector 6a in the optical path provided with the large opening 7a, because the condensing range of the signal light of the sample is wide. This low-resolution image has a deep depth of focus and shows the integrated amount of the signal fluorescence in the depth direction of the sample. If the fluorescence intensity of the area of the target portion is integrated based on this image information, the target fluorescence amount can be measured with high accuracy.
【００２２】一方、小開口７ｂ，７ｃを設けた光路の光
検出器６ｂ，６ｃからは、高分解能の蛍光画像や散乱反
射画像を得ることができ、試料の詳細な形態情報を得る
ことができる。なお、以下の実施例でも述べるように、
開口の形状は円形、角形、スリット形であり、開口の寸
法は円形のときは半径又は直径、角形のときはその長径
と短径、スリット形のときはそのスリット幅を示す。
又、蛍光量と蛍光画像に基づく形態情報は、蛍光の波長
が同じでも違っていてもよい。On the other hand, from the photodetectors 6b and 6c in the optical path provided with the small openings 7b and 7c, it is possible to obtain a high-resolution fluorescence image or a scattered reflection image and obtain detailed morphological information of the sample. . In addition, as described in the following examples,
The shape of the opening is a circle, a prism, or a slit. The size of the opening indicates a radius or a diameter when it is circular, a major axis and a minor axis when it is rectangular, and a slit width when it is slit.
Further, the fluorescence amount and the morphological information based on the fluorescence image may have the same or different wavelengths of fluorescence.
【００２３】次に、具体的な実施例を図７に示す。この
実施例では、レーザビームの偏向素子として音響光学偏
向素子（ＡＯＤ）とガルバノ式ミラーを用い、蛍光検出
用の開口がスリット形の光学系の場合である。図７にお
いて、レーザ発振器（この実施例では空冷Ａｒレーザ）
２０からのレーザビーム５０は、レンズ２１ａ及び光量
調節器である音響光学変調素子（ＡＯＭ）２２を経て、
ビームエキスパンダー２３に入射し、ビーム径が適正な
寸法に拡大される。その後、レーザビーム５０は、シリ
ンドリカルレンズ２４ａ、ＡＯＤ２５、補正用のシリン
ドリカルレンズ２４ｂ、シリンドリカルレンズ２４ｃ、
及び球面レンズ２１ｃにより構成される一次元偏向光学
系により、矢印ｍ方向に集光且つ一次元走査される。Next, a concrete example is shown in FIG. In this embodiment, an acousto-optic deflecting element (AOD) and a galvano-type mirror are used as a deflecting element for a laser beam, and an optical system having a slit-shaped aperture for detecting fluorescence is used. In FIG. 7, a laser oscillator (air-cooled Ar laser in this embodiment)
A laser beam 50 from 20 passes through a lens 21 a and an acousto-optic modulator (AOM) 22 which is a light quantity adjuster,
It is incident on the beam expander 23, and the beam diameter is expanded to an appropriate size. After that, the laser beam 50 emits the cylindrical lens 24a, the AOD 25, the correction cylindrical lens 24b, the cylindrical lens 24c, and the cylindrical lens 24c.
A one-dimensional deflection optical system constituted by the spherical lens 21c and the spherical lens 21c collects light in the direction of arrow m and performs one-dimensional scanning.
【００２４】更に、レーザビーム５０は、波長選択ミラ
ー２６、リレー用球面レンズ２１ｄを経て、ガルバノ式
偏向用ミラー２７に入射する。偏向用ミラー２７は、矢
印ｐ方向に回転振動することによってレーザビームを偏
向する。これにより、二次元走査されたレーザビーム
は、球面レンズ２１ｅを介して結像面Ｌ上に結像した
後、対物レンズ２８によって試料２９上に集光照射且つ
二次元走査される。Further, the laser beam 50 enters the galvano-deflecting mirror 27 through the wavelength selection mirror 26 and the relay spherical lens 21d. The deflection mirror 27 deflects the laser beam by rotationally vibrating in the direction of arrow p. As a result, the two-dimensionally scanned laser beam is focused on the sample 29 by the objective lens 28 after being imaged on the imaging plane L via the spherical lens 21e, and is two-dimensionally scanned.
【００２５】試料２９の発する蛍光は対物レンズ２８で
集光され、ビームスプリット手段３０を通過した成分
は、結像面Ｌで結像した後、偏向用ミラー２７で反射さ
れ、波長選択ミラー２６で蛍光成分が選択通過される。
一方、対物レンズ２８で集光された蛍光のうち、ビーム
スプリット手段３０で反射された成分は、試料２９から
反射したレーザビームをカットするフィルタ３１ｃを透
過し、接眼レンズ３２に入射し、肉眼又はＴＶカメラ等
による観察に供される。なお、ビームスプリット手段３
０は波長選択性を有していても構わない。The fluorescence emitted from the sample 29 is collected by the objective lens 28, and the component passing through the beam splitting means 30 forms an image on the image forming plane L, is then reflected by the deflecting mirror 27, and is reflected by the wavelength selection mirror 26. The fluorescent component is selectively passed.
On the other hand, of the fluorescence collected by the objective lens 28, the component reflected by the beam splitting means 30 is transmitted through the filter 31c that cuts the laser beam reflected from the sample 29, is incident on the eyepiece lens 32, and is detected by the naked eye. It is used for observation with a TV camera. The beam splitting means 3
0 may have wavelength selectivity.
【００２６】波長選択ミラー２６を通過した信号光（蛍
光）は、ビームスプリッタ３３で２光路に分けられる。
一方の光路の信号光は、開口幅の大きいスリット開口３
４ａで不要光が除去され、コリメート用球面レンズ２１
ｆで平行光とされた後、蛍光選択フィルタ３１ａを介し
て光検出器３５ａで受光され、電気信号に変換される。
光検出器３５ａからの信号は、データ処理部に入力さ
れ、低分解能蛍光画像情報を得る。他方の光路の信号光
は、開口幅の小さいスリット開口３４ｂで不要光が除去
され、コリメート用球面レンズ２１ｇで平行光とされた
後、蛍光選択フィルタ３１ｂを介して光検出器３５ｂで
受光され、電気信号に変換される。光検出器３５ｂから
の信号は、データ処理部に入力され、高分解能蛍光画像
情報を得る。但し、蛍光選択フィルタ３１ａ，３１ｂの
光学特性は異なっていてもよい。The signal light (fluorescence) that has passed through the wavelength selection mirror 26 is split into two optical paths by the beam splitter 33.
The signal light of one optical path is transmitted through the slit opening 3 having a large opening width.
The unnecessary light is removed by 4a, and the collimating spherical lens 21
After being made into parallel light by f, it is received by the photodetector 35a through the fluorescence selection filter 31a and converted into an electric signal.
The signal from the photodetector 35a is input to the data processing unit to obtain low resolution fluorescence image information. Unwanted light of the signal light of the other optical path is removed by the slit opening 34b having a small opening width, and after being collimated by the collimating spherical lens 21g, it is received by the photodetector 35b via the fluorescence selection filter 31b. It is converted into an electric signal. The signal from the photodetector 35b is input to the data processing unit to obtain high resolution fluorescence image information. However, the optical characteristics of the fluorescence selection filters 31a and 31b may be different.
【００２７】試料２９からの散乱反射光は、対物レンズ
２８で集光され、照明レーザビームと逆の経路をたどっ
てビームスプリッタ３６で反射され、球面レンズ２１ｂ
で円形の小開口３４ｃに集光されて不要光が除去された
後、光検出器３５ｃで検出され、電気信号に変換され
る。光検出器３５ｃからの信号はデータ処理部に入力さ
れ、試料２９の散乱反射光の画像情報を得る。The scattered reflection light from the sample 29 is condensed by the objective lens 28, traces a path opposite to the illumination laser beam, is reflected by the beam splitter 36, and is spherical lens 21b.
After being collected by the circular small opening 34c to remove unnecessary light, it is detected by the photodetector 35c and converted into an electric signal. The signal from the photodetector 35c is input to the data processing unit, and the image information of the scattered reflected light of the sample 29 is obtained.
【００２８】この実施例では、試料２９上に照射するレ
ーザスポット半径ｒは１μｍであり、スリット開口３４
ａのスリット幅は、試料２９面上での幅１μｍの範囲の
蛍光が通過するように設定されている。又、スリット開
口３４ｂのスリット幅と、散乱反射光検出用の小開口３
４ｃのスリット幅（又は半径）は、レーザスポットを中
心とした半径０．５μｍの蛍光又は散乱反射光が通過す
るように設定されている。従って、光検出器３５ａ，３
５ｂ，３５ｃの出力をデータ処理することにより、それ
ぞれ分解能２μｍの蛍光画像、分解能１μｍの蛍光画
像、及び散乱反射光画像を得ることができる。In this embodiment, the laser spot radius r irradiated on the sample 29 is 1 μm, and the slit opening 34
The slit width of a is set so that the fluorescence in the range of 1 μm on the surface of the sample 29 passes through. Further, the slit width of the slit opening 34b and the small opening 3 for detecting scattered reflected light
The slit width (or radius) of 4c is set so that fluorescent light or scattered reflected light having a radius of 0.5 μm centering on the laser spot passes through. Therefore, the photodetectors 35a, 3
By processing the outputs 5b and 35c with data, a fluorescence image with a resolution of 2 μm, a fluorescence image with a resolution of 1 μm, and a scattered reflected light image can be obtained.
【００２９】図８に、レーザビームの偏向素子として２
つのガルバノ式ミラー２７，３８を用い、蛍光検出用の
開口が円形の光学系である実施例を示す。但し、図７に
示す実施例と同様の作用を行う要素には同一符号を付し
てある。レーザ発振器２０からのレーザビーム５０は、
２つのガルバノ式ミラー３８，２７を通過し、対物レン
ズ２８によって試料２９上に集光照射される。FIG. 8 shows a laser beam deflection element 2
An embodiment will be described in which two galvano-type mirrors 27 and 38 are used and an opening for fluorescence detection is an optical system having a circular shape. However, the same reference numerals are given to the elements that perform the same operations as those of the embodiment shown in FIG. The laser beam 50 from the laser oscillator 20 is
After passing through the two Galvano mirrors 38 and 27, the objective lens 28 focuses and irradiates the sample 29.
【００３０】試料２９からの蛍光及び散乱反射光は、対
物レンズ２８によって集光され、２つのガルバノ式ミラ
ー２７，３８を経由して、波長選択ミラー２６で蛍光成
分が選択反射される。この蛍光成分は、蛍光選択フィル
タ３１ｃを透過した後、ビームスプリッタ３３で２光路
に分けられ、それぞれ球面レンズ２１ｆ，２１ｇにより
大開口３７ａ及び小開口３７ｂで不要光が除去された
後、光検出器３５ａ，３５ｂにて検出される。大開口３
７ａを設けた光路の光検出器３５ａで検出された光は低
分解能蛍光画像用の信号として、小開口３７ｂを設けた
光路の光検出器３５ｂで検出された光は高分解能蛍光画
像用の信号として出力される。The fluorescent light and scattered reflected light from the sample 29 are collected by the objective lens 28, pass through the two Galvano mirrors 27 and 38, and the fluorescent component is selectively reflected by the wavelength selection mirror 26. After passing through the fluorescence selection filter 31c, this fluorescence component is divided into two optical paths by the beam splitter 33, and unnecessary light is removed by the large apertures 37a and the small apertures 37b by the spherical lenses 21f and 21g, respectively, and then the photodetector. It is detected at 35a and 35b. Large opening 3
The light detected by the photodetector 35a in the optical path provided with 7a is a signal for low resolution fluorescence image, and the light detected by the photodetector 35b in the optical path provided with small aperture 37b is a signal for high resolution fluorescence image. Is output as.
【００３１】試料２９からの散乱反射光は、ビームスプ
リッタ３６で反射され、球面レンズ２１ｂで開口３７ｃ
に集光され、光検出器３５ｃで受光されて電気信号に変
換される。なお、図８に示す実施例では、開口３７ａ，
３７ｂ，３７ｃの位置は、試料２９上のレーザスポット
の位置と共役となっている。又、光偏向素子としては、
他にポリゴンミラー、ホログラフィック素子、レゾナン
ト型ミラー等も用いることができる。The scattered reflected light from the sample 29 is reflected by the beam splitter 36, and the spherical lens 21b opens the aperture 37c.
Is collected by the photodetector 35c, received by the photodetector 35c, and converted into an electric signal. In the embodiment shown in FIG. 8, the openings 37a,
The positions of 37b and 37c are conjugate with the position of the laser spot on the sample 29. Also, as the light deflection element,
Besides, a polygon mirror, a holographic element, a resonant mirror, etc. can be used.
【００３２】更に、図７に示した実施例において、スリ
ットの位置調整を容易にした光学系の実施例を図９に示
す。レーザ発振器２０からのレーザビーム５０は、波長
選択ミラー２６、ガルバノ式偏向ミラー２７等を経て、
対物レンズ２８によって試料２９上に集光照射される。
試料２９からの光は、波長選択ミラー２６により選択さ
れ、選択された成分がシリンドリカルレンズ２４ｄ、蛍
光選択ミラー３１ａ、シリンドリカルレンズ２４ｅ、開
口４２を経て、光検出器３５ａで検出される。Further, FIG. 9 shows an embodiment of an optical system which facilitates the position adjustment of the slit in the embodiment shown in FIG. A laser beam 50 from the laser oscillator 20 passes through a wavelength selection mirror 26, a galvano-type deflection mirror 27, etc.,
The sample 29 is focused and illuminated by the objective lens 28.
The light from the sample 29 is selected by the wavelength selection mirror 26, and the selected component is detected by the photodetector 35a through the cylindrical lens 24d, the fluorescence selection mirror 31a, the cylindrical lens 24e, and the opening 42.
【００３３】図９では、シリンドリカルレンズ２４ｄ，
２４ｅにより、仮想スリット開口４１の位置にできる蛍
光スポットの像をスリットの幅方向に拡大すると共にス
リットの長辺方向に縮小して、仮想スリット開口４１の
スリット幅より大きい開口を持つ開口４２の位置に移す
ことによって、実質の開口寸法を拡大した例である。こ
の実施例では、開口の寸法が大きいので、開口の制作及
び開口の寸法や位置調整が容易となる。因みに、図７に
示す実施例において、試料２９と共役な位置に仮想スリ
ット開口４１を配置する場合、スリット幅は一般に１０
〜１００μｍと狭いため、スリットの幅や位置調整が困
難である。なお、図８に示す実施例の光学系において
も、同様に円形の開口をレンズ系で拡大して調整容易な
寸法にすることもできる。In FIG. 9, the cylindrical lens 24d,
The position of the opening 42 having an opening larger than the slit width of the virtual slit opening 41 by enlarging the image of the fluorescent spot formed at the position of the virtual slit opening 41 by 24e in the width direction of the slit and reducing it in the long side direction of the slit. It is an example in which the substantial opening size is enlarged by shifting to. In this embodiment, since the size of the opening is large, it is easy to manufacture the opening and adjust the size and position of the opening. Incidentally, in the embodiment shown in FIG. 7, when the virtual slit opening 41 is arranged at a position conjugate with the sample 29, the slit width is generally 10
Since it is as narrow as -100 μm, it is difficult to adjust the width and position of the slit. In the optical system of the embodiment shown in FIG. 8 as well, the circular aperture can be similarly enlarged by a lens system so that the size can be adjusted easily.
【００３４】[0034]
【発明の効果】本発明のレーザ走査式細胞分析装置は、
以上説明したように試料を走査するレーザスポット半径
ｒと二次元走査する走査間隔ｓとの関係がｓ／ｒ≦１に
なるようにレーザ照射を制御するため、試料面上の各点
におけるレーザ強度の総和が一様となり、試料細胞の蛍
光量を精度良く測定でき、ＤＮＡ等の細胞内化学物質量
を精度良く測定できる。The laser scanning cell analyzer of the present invention is
As described above, since the laser irradiation is controlled so that the relationship between the laser spot radius r for scanning the sample and the scanning interval s for two-dimensional scanning is s / r ≦ 1, the laser intensity at each point on the sample surface , The fluorescence amount of the sample cells can be accurately measured, and the intracellular chemical substance amount such as DNA can be accurately measured.
【００３５】更に、不要光を除去する大小の開口を配備
することにより、細胞の蛍光量を測定するための低分解
能蛍光画像情報と形態情報を得る高分解能画像情報を個
別に得ることができるようになる。しかも、画像情報か
らゴミや細胞の破壊物、細胞の重なりを識別・除去でき
るので、誤った情報を取り除くことができ、より正確に
細胞を分析できるようになる。加えて、再検査が可能で
あることは勿論であり、低分解能及び高分解能画像情報
を得るのに時間が掛からない。Further, by providing large and small openings for removing unnecessary light, low resolution fluorescence image information for measuring the fluorescence amount of cells and high resolution image information for obtaining morphological information can be individually obtained. become. Moreover, since it is possible to identify and remove dust, cell debris, and cell overlap from the image information, it is possible to remove erroneous information and analyze cells more accurately. In addition, it is needless to say that re-examination is possible, and it does not take time to obtain low resolution and high resolution image information.
【００３６】従って、細胞内部の化学物質の情報に対す
る医学・生物学知見が得られることから、これらの分野
の発展に寄与するだけでなく、多数の細胞の内部情報を
得ることによって細胞の悪性度評価のための研究情報を
得ることが可能になり、病理診断の進歩に大きく寄与す
ることができる。Therefore, since the medical / biological knowledge for the information on the chemical substances inside the cells can be obtained, it not only contributes to the development of these fields, but also the malignancy of the cells can be obtained by obtaining the internal information on many cells. It becomes possible to obtain research information for evaluation, which can greatly contribute to the progress of pathological diagnosis.
【図１】本発明の装置の基本構成を示すブロックダイア
グラムである。FIG. 1 is a block diagram showing a basic configuration of an apparatus of the present invention.
【図２】図１に示す基本構成の変更例を示すブロックダ
イアグラムである。FIG. 2 is a block diagram showing a modified example of the basic configuration shown in FIG.
【図３】対物レンズごとに予め計算したレーザスポット
半径と走査間隔及びレーザ強度との関係の設計表であ
る。FIG. 3 is a design table of a relationship between a laser spot radius calculated in advance for each objective lens, a scanning interval, and a laser intensity.
【図４】走査間隔及びレーザ強度を制御するための設定
表である。FIG. 4 is a setting table for controlling a scanning interval and laser intensity.
【図５】請求項１記載のｓ／ｒ≦１の関係を保つ機構の
実施例を示すフローチャートである。FIG. 5 is a flowchart showing an embodiment of a mechanism for maintaining the relationship of s / r ≦ 1 described in claim 1;
【図６】請求項２及び請求項３記載の構成に係る実施例
を示すフローチャートである。FIG. 6 is a flow chart showing an embodiment according to the configurations of claims 2 and 3.
【図７】一実施例に係る装置の構成を示す斜視図であ
る。FIG. 7 is a perspective view showing a configuration of an apparatus according to an embodiment.
【図８】別実施例に係る装置の構成を示す斜視図であ
る。FIG. 8 is a perspective view showing the configuration of an apparatus according to another embodiment.
【図９】更に別実施例に係る装置の構成を示す斜視図で
ある。FIG. 9 is a perspective view showing the configuration of an apparatus according to another embodiment.
【図１０】試料上のレーザスポットの走査方法を示す図
である。FIG. 10 is a diagram showing a scanning method of a laser spot on a sample.
【図１１】レーザスポットの強度分布、レーザスポット
半径ｒ、及び走査間隔ｓの関係を示す図である。FIG. 11 is a diagram showing a relationship between a laser spot intensity distribution, a laser spot radius r, and a scanning interval s.
【図１２】ビーム積算強度とｓ／ｒ比（走査間隔／スポ
ット半径）との関係を示す図である。FIG. 12 is a diagram showing a relationship between integrated beam intensity and s / r ratio (scanning interval / spot radius).
【図１３】ビーム積算強度とｓ／ｒ比（走査間隔／スポ
ット半径）との関係を示す図である。FIG. 13 is a diagram showing the relationship between integrated beam intensity and s / r ratio (scanning interval / spot radius).
【図１４】ビーム積算強度の変動とｓ／ｒ比（走査間隔
／スポット半径）との関係を示す図である。FIG. 14 is a diagram showing a relationship between variations in integrated beam intensity and s / r ratio (scanning interval / spot radius).
１ レーザ発振器 ２ 光量調整器 ３ レーザビーム偏向部 ４ 対物レンズ ５ 試料 ６ａ，６ｂ，６ｃ 光検出器 ７ａ，７ｂ，７ｃ 開口 1 Laser Oscillator 2 Light Quantity Adjuster 3 Laser Beam Deflection Section 4 Objective Lens 5 Sample 6a, 6b, 6c Photodetector 7a, 7b, 7c Aperture
Claims (4)
振器からのレーザスポットで試料細胞を二次元走査する
レーザビーム偏向部と、走査レーザビームを試料細胞に
集光照射する対物レンズと、レーザビームの照射により
試料細胞が放射する信号光の結像位置に配置した開口
と、この開口を通過した信号光を受光する光検出器と、
この光検出器の出力信号を処理する処理部とを備えるレ
ーザ走査式細胞分析装置において、 前記試料細胞面上を走査するレーザスポット半径ｒと走
査間隔ｓとの関係が、ｓ／ｒ≦１であることを特徴とす
るレーザ走査式細胞分析装置。1. A laser oscillator as a light source, a laser beam deflector for two-dimensionally scanning a sample cell with a laser spot from the laser oscillator, an objective lens for converging and irradiating a sample cell with a scanning laser beam, and a laser beam. An aperture arranged at an image-forming position of the signal light emitted by the sample cell upon irradiation with, and a photodetector for receiving the signal light passing through this aperture,
In a laser scanning cell analyzer including a processing unit that processes the output signal of the photodetector, the relationship between the laser spot radius r for scanning the cell surface of the sample and the scanning interval s is s / r ≦ 1. A laser scanning cell analyzer characterized by being present.
ザビーム径とレーザの走査間隔とを同時に変化させる手
段を備えることを特徴とする請求項１記載のレーザ走査
式細胞分析装置。2. A laser scanning cell analyzer according to claim 1, further comprising means for simultaneously changing a laser beam diameter and a laser scanning interval while maintaining the relationship of s / r ≦ 1. .
段を備え、このレーザ強度変化手段は、前記レーザビー
ム径とレーザの走査間隔とを同時に変化させる手段と連
動してレーザ強度を変化させるものであることを特徴と
する請求項２記載のレーザ走査式細胞分析装置。3. A laser intensity changing means for changing the laser intensity is provided, and the laser intensity changing means changes the laser intensity in conjunction with the means for simultaneously changing the laser beam diameter and the laser scanning interval. The laser scanning cell analysis device according to claim 2, wherein
くとも１個の開口は、信号光として蛍光を受けると共
に、試料細胞からの信号光の集光範囲が他の開口の集光
範囲よりも広いものであり、この広い開口を通過した蛍
光から試料細胞の蛍光量を求め、この蛍光量に基づく蛍
光画像情報と、他の開口を用いて得られた蛍光及び／又
は散乱反射光の画像情報とを同時に取得することを特徴
とする請求項１記載のレーザ走査式細胞分析装置。4. The number of the openings is two or more, and at least one of the openings receives fluorescence as signal light, and the focusing range of the signal light from the sample cells is larger than the focusing ranges of other openings. It is wide, and the fluorescence amount of the sample cell is obtained from the fluorescence passing through this wide aperture, and the fluorescence image information based on this fluorescence amount and the fluorescence and / or scattered reflection light image information obtained using other apertures. 2. The laser scanning cell analyzer according to claim 1, wherein and are simultaneously acquired.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP29250694A JPH07209187A (en) | 1993-11-30 | 1994-11-28 | Laser scanning type cell analyser |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29918793 | 1993-11-30 | ||
| JP5-299187 | 1993-11-30 | ||
| JP29250694A JPH07209187A (en) | 1993-11-30 | 1994-11-28 | Laser scanning type cell analyser |
Publications (1)
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|---|---|---|---|
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| JP (1) | JPH07209187A (en) |
Cited By (12)
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