JPH07165797A - 立体配座的に安定化された細胞接着ペプチド - Google Patents
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
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- B65—CONVEYING; PACKING; STORING; HANDLING THIN OR FILAMENTARY MATERIAL
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- B65H3/02—Separating articles from piles using friction forces between articles and separator
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 目的の受容体にとって最適の特異性を与える
アミノ酸構造を有するペプチドを提供すること。 【構成】 本発明は、立体化学的な配座が制限されてい
るために、受容体に対して高い親和性および特異性を有
している新規な合成ペプチドに関する。このような制
限、あるいは安定化は、例えば環化によって、螺旋など
の制約立体配座構造中に包含させることによって、天然
アミノ酸の異性体もしくはアミドなどの別の化学構造を
付与することによって、またはその他の方法によって得
ることができる。このようなペプチドは、あらゆる数の
範囲の残基を有し得るが、好ましくは3〜100の範囲で
あり、さらに好ましくは7〜30の範囲である。
アミノ酸構造を有するペプチドを提供すること。 【構成】 本発明は、立体化学的な配座が制限されてい
るために、受容体に対して高い親和性および特異性を有
している新規な合成ペプチドに関する。このような制
限、あるいは安定化は、例えば環化によって、螺旋など
の制約立体配座構造中に包含させることによって、天然
アミノ酸の異性体もしくはアミドなどの別の化学構造を
付与することによって、またはその他の方法によって得
ることができる。このようなペプチドは、あらゆる数の
範囲の残基を有し得るが、好ましくは3〜100の範囲で
あり、さらに好ましくは7〜30の範囲である。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、一般にはペプチド類、
さらに詳しくは細胞接着系に関与しているペプチド類に
関する。
さらに詳しくは細胞接着系に関与しているペプチド類に
関する。
【0002】
【発明の背景】細胞の他の細胞との、あるいは細胞外マ
トリックスとの接着は、生物における細胞の秩序ある発
育および機能発揮に重要である。細胞接着は、ある種の
接着リガンドおよびそれに対応する受容体によって媒介
される。このような接着リガンドには糖タンパク質であ
るフィブロネクチン、ビトロネクチンおよびコラーゲン
が含まれる。これら3種の全てはトリペプチド配列であ
るアルギニン−グリシン−アスパラギン酸(Arg−Gly−
Asp、すなわちR−G−D)を含んでおり、これがこれ
ら分子に結合する細胞表面の受容体の1次認識部位とし
て機能している。Arg−Gly−Asp配列を含有する合成ペ
プチドは、ペプチド被覆された表面として細胞に供され
ると、天然のフィブロネクチンまたはビトロネクチンと
同様に細胞接着を促進する。溶液中では、そのようなペ
プチドは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラー
ゲン、そのペプチド自体またはArg−Gly−Asp細胞接着
部位を有するいくつかの他の接着タンパク質で被覆され
た表面への細胞付着を阻害し得る。
トリックスとの接着は、生物における細胞の秩序ある発
育および機能発揮に重要である。細胞接着は、ある種の
接着リガンドおよびそれに対応する受容体によって媒介
される。このような接着リガンドには糖タンパク質であ
るフィブロネクチン、ビトロネクチンおよびコラーゲン
が含まれる。これら3種の全てはトリペプチド配列であ
るアルギニン−グリシン−アスパラギン酸(Arg−Gly−
Asp、すなわちR−G−D)を含んでおり、これがこれ
ら分子に結合する細胞表面の受容体の1次認識部位とし
て機能している。Arg−Gly−Asp配列を含有する合成ペ
プチドは、ペプチド被覆された表面として細胞に供され
ると、天然のフィブロネクチンまたはビトロネクチンと
同様に細胞接着を促進する。溶液中では、そのようなペ
プチドは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラー
ゲン、そのペプチド自体またはArg−Gly−Asp細胞接着
部位を有するいくつかの他の接着タンパク質で被覆され
た表面への細胞付着を阻害し得る。
【0003】現在、それぞれのリガンドのArg−Gly−As
p配列を認識するいくつかの受容体が同定されている。
これらの受容体の中には、特異的なリガンドにだけ親和
性を有しているものと、程度は異なるが上記のトリペプ
チドを含有する2またはそれ以上のリガンドと相互作用
するものがある。従って、受容体認識および結合には、
Arg−Gly−Asp配列で十分ではあるが、それでもなお、
このペプチドの残りのアミノ酸配列がリガンド−受容体
相互作用の特異性に重要であることがわかる。この残り
の配列が結合に影響を与える正確な機序は今までわかっ
ていなかった。
p配列を認識するいくつかの受容体が同定されている。
これらの受容体の中には、特異的なリガンドにだけ親和
性を有しているものと、程度は異なるが上記のトリペプ
チドを含有する2またはそれ以上のリガンドと相互作用
するものがある。従って、受容体認識および結合には、
Arg−Gly−Asp配列で十分ではあるが、それでもなお、
このペプチドの残りのアミノ酸配列がリガンド−受容体
相互作用の特異性に重要であることがわかる。この残り
の配列が結合に影響を与える正確な機序は今までわかっ
ていなかった。
【0004】当分野のある研究者らが持っている1つの
見解は、所与の接着タンパク質のその受容体に対する特
異性は、その付着タンパク質中の、Arg−Gly−Asp部位
以外の1またはそれ以上の受容体結合部位の存在に依存
しうるというものである。この見解に従えば、Arg−Gly
−Asp部位は共通の結合部位であり、別の1つあるいは
それ以上の部位が特異性の原因となる[例えば、Yamada
ら,(1987),Biochem. and Biophys. Res. Comm. 14
4:35;Wrightら,(1987),PNAS 84:1965を参照]。
別の可能性は、Arg−Gly−Asp配列が受容体結合のため
の実質的に全ての情報を与え、接着タンパク質に受容体
特異性を付与するのはこの配列の立体配座であるという
ものである。種々のペプチドホルモン類の結合部位は小
さいことが知られており(Roseら,(1985), Adv. in C
hemistry 37:1)、通常、これらのペプチド類は全部
で約10個のアミノ酸を含有しているにすぎない。対照的
に、2つのフィブロネクチンポリペプチド鎖は、それぞ
れ2000個を越えるアミノ酸を含有している。ただ1つの
アミノ酸トリプレットの立体配座が、それを保持してい
る多数の異なったタンパク質の機能に重要でありうると
いう考えは新規である。
見解は、所与の接着タンパク質のその受容体に対する特
異性は、その付着タンパク質中の、Arg−Gly−Asp部位
以外の1またはそれ以上の受容体結合部位の存在に依存
しうるというものである。この見解に従えば、Arg−Gly
−Asp部位は共通の結合部位であり、別の1つあるいは
それ以上の部位が特異性の原因となる[例えば、Yamada
ら,(1987),Biochem. and Biophys. Res. Comm. 14
4:35;Wrightら,(1987),PNAS 84:1965を参照]。
別の可能性は、Arg−Gly−Asp配列が受容体結合のため
の実質的に全ての情報を与え、接着タンパク質に受容体
特異性を付与するのはこの配列の立体配座であるという
ものである。種々のペプチドホルモン類の結合部位は小
さいことが知られており(Roseら,(1985), Adv. in C
hemistry 37:1)、通常、これらのペプチド類は全部
で約10個のアミノ酸を含有しているにすぎない。対照的
に、2つのフィブロネクチンポリペプチド鎖は、それぞ
れ2000個を越えるアミノ酸を含有している。ただ1つの
アミノ酸トリプレットの立体配座が、それを保持してい
る多数の異なったタンパク質の機能に重要でありうると
いう考えは新規である。
【0005】Arg−Gly−Asp配列を含有する合成ペプチ
ドは、細胞の付着の促進と阻害の両方を行うことができ
るという点で有用である。1またはそれ以上の種々の接
着タンパク質中のArg−Gly−Asp配列を認識することが
知られているか、または認識すると推定されている、少
なくとも10種類の異なる接着受容体が存在する。十分正
確に、そのような接着タンパク質の機能を再現するか、
またはそのような機能を特異的に阻害するペプチドは、
例えば血栓、転移、炎症、傷治癒、および補欠インプラ
ントの拒絶などの重要な生理学的現象の操作に大きな可
能性を与える。
ドは、細胞の付着の促進と阻害の両方を行うことができ
るという点で有用である。1またはそれ以上の種々の接
着タンパク質中のArg−Gly−Asp配列を認識することが
知られているか、または認識すると推定されている、少
なくとも10種類の異なる接着受容体が存在する。十分正
確に、そのような接着タンパク質の機能を再現するか、
またはそのような機能を特異的に阻害するペプチドは、
例えば血栓、転移、炎症、傷治癒、および補欠インプラ
ントの拒絶などの重要な生理学的現象の操作に大きな可
能性を与える。
【0006】従って、目的の受容体にとって最適の特異
性を与えるアミノ酸構造を有するペプチドが必要とされ
ている。本発明はこの要求を満たし、そしてそれに関連
したその他の利点をも提供する。
性を与えるアミノ酸構造を有するペプチドが必要とされ
ている。本発明はこの要求を満たし、そしてそれに関連
したその他の利点をも提供する。
【0007】
【発明の要旨】本発明は、立体化学的な配座が制限され
ているために、受容体に対して高い親和性および特異性
を有している新規な合成ペプチドに関する。このような
制限、あるいは安定化は、例えば環化によって、螺旋な
どの制約立体配座構造中に包含させることによって、天
然アミノ酸の異性体もしくはアミドなどの別の化学構造
を付与することによって、またはその他の方法によって
得ることができる。このようなペプチドは、あらゆる数
の範囲の残基を有し得るが、好ましくは3〜100の範囲
であり、さらに好ましくは7〜30の範囲である。特に、
直鎖状のArg−Gly−Asp含有の合成ペプチドより、ビト
ロネクチン受容体に対する親和性および選択性が高い環
状ペプチドが提供される。この環状ペプチドの親和性お
よび選択性は天然ビトロネクチンのそれに匹敵する。
ているために、受容体に対して高い親和性および特異性
を有している新規な合成ペプチドに関する。このような
制限、あるいは安定化は、例えば環化によって、螺旋な
どの制約立体配座構造中に包含させることによって、天
然アミノ酸の異性体もしくはアミドなどの別の化学構造
を付与することによって、またはその他の方法によって
得ることができる。このようなペプチドは、あらゆる数
の範囲の残基を有し得るが、好ましくは3〜100の範囲
であり、さらに好ましくは7〜30の範囲である。特に、
直鎖状のArg−Gly−Asp含有の合成ペプチドより、ビト
ロネクチン受容体に対する親和性および選択性が高い環
状ペプチドが提供される。この環状ペプチドの親和性お
よび選択性は天然ビトロネクチンのそれに匹敵する。
【0008】ある態様では、本発明は、Arg−Gly−Asp
配列の周囲のアミノ酸の間で架橋が形成された約10アミ
ノ酸を有するペプチドを含む。その適当な構造は次のよ
うである:
配列の周囲のアミノ酸の間で架橋が形成された約10アミ
ノ酸を有するペプチドを含む。その適当な構造は次のよ
うである:
【0009】
【化1】
【0010】このペプチドは、Arg−Gly−Asp配列と架
橋を形成する残基の間に約1〜4個のアミノ酸を有し得
る。架橋残基は、例えばペニシラミンおよびシステイ
ン、またはジスルフィド架橋などの架橋を形成すること
ができるその他のアミノ酸であり得る。
橋を形成する残基の間に約1〜4個のアミノ酸を有し得
る。架橋残基は、例えばペニシラミンおよびシステイ
ン、またはジスルフィド架橋などの架橋を形成すること
ができるその他のアミノ酸であり得る。
【0011】別の適当な構造は次のようである:
【0012】
【化2】
【0013】あるいは、ペプチドはアミノ酸残基の間の
ペプチド結合によって環化され得る。その適当な構造の
1つは次のようである:
ペプチド結合によって環化され得る。その適当な構造の
1つは次のようである:
【0014】
【化3】
【0015】本発明は、接着リガンドの特異性がArg−G
ly−Asp部位の外側の別の結合部位に帰するものではな
く、そのような特異性は、残りのペプチドの構造によっ
てArg−Gly−Asp配列に賦課された立体配座構造に起因
することの証拠を与えるものである。実際的には、本発
明は、立体配座が制限された、Arg−Gly−Asp含有のペ
プチドが、制限を受けていないその対応ペプチドに比べ
てより高い結合親和性および異なる受容体特異性を有し
得る、ということを示している。このことにより、種々
の受容体特性および親和性を有する他のArg−Gly−Asp
立体配座の合成が可能である。
ly−Asp部位の外側の別の結合部位に帰するものではな
く、そのような特異性は、残りのペプチドの構造によっ
てArg−Gly−Asp配列に賦課された立体配座構造に起因
することの証拠を与えるものである。実際的には、本発
明は、立体配座が制限された、Arg−Gly−Asp含有のペ
プチドが、制限を受けていないその対応ペプチドに比べ
てより高い結合親和性および異なる受容体特異性を有し
得る、ということを示している。このことにより、種々
の受容体特性および親和性を有する他のArg−Gly−Asp
立体配座の合成が可能である。
【0016】本発明の安定化されたペプチドはその細胞
接着の性質に関連した種々の応用分野を有している。例
えば、ペプチドの構造が、
接着の性質に関連した種々の応用分野を有している。例
えば、ペプチドの構造が、
【0017】
【化4】
【0018】である1つの態様では、このペプチドは直
鎖状の合成 Arg−Gly−Asp含有ペプチドに比べて、ビ
トロネクチン受容体に対する親和性が高く、そしてフィ
ブロネクチン受容体に対する親和性が低い。従って、こ
のペプチドを用いてビトロネクチン受容体含有細胞が細
胞培養用の基質に結合するのを効率的に阻害することが
できる。別の態様では、この安定化ペプチドは、例えば
細胞培養基質を被覆することによって、ビトロネクチン
受容体を発現している細胞の接着を促進するために有用
に用いられ得る。さらに、この安定化ペプチドは、細胞
の付着が望ましい人工補欠物などのインビトロ移植用の
材料を被覆するのに用い得る。
鎖状の合成 Arg−Gly−Asp含有ペプチドに比べて、ビ
トロネクチン受容体に対する親和性が高く、そしてフィ
ブロネクチン受容体に対する親和性が低い。従って、こ
のペプチドを用いてビトロネクチン受容体含有細胞が細
胞培養用の基質に結合するのを効率的に阻害することが
できる。別の態様では、この安定化ペプチドは、例えば
細胞培養基質を被覆することによって、ビトロネクチン
受容体を発現している細胞の接着を促進するために有用
に用いられ得る。さらに、この安定化ペプチドは、細胞
の付着が望ましい人工補欠物などのインビトロ移植用の
材料を被覆するのに用い得る。
【0019】
【発明の構成】本明細書の用語「立体配座的に安定化さ
れた」または「立体配座的に制約された」は、あるペプ
チドがとり得る可能性のある立体化学構造の数に制限が
課された状態を意味する。本発明に関しては、そのよう
な制限は、Arg−Gly−Asp結合部位の立体配座に課され
るものであり、その制限は、該結合部位の可能性のある
構造的立体配座を、トリペプチド配列単独の場合に仮定
される数よりも少ないものに制限する該結合部位の周囲
の化学構造の存在に起因している。このような立体配座
的に安定化されたArg−Gly−Asp含有ペプチドは、それ
でもなお、少なくとも1つの受容体との結合活性を示
す。「周囲の化学構造」は、アミノ酸またはその他の化
学的部分を指し得、結合部位にすぐに隣接して存在する
部分、ならびに介在アミノ酸の存在によって結合部位そ
れ自体から離れている部分の両方を指し得る。用語「Ar
g−Gly−Asp配列の周囲のアミノ酸」は、Arg−Gly−Asp
配列に隣接する残基ならびに介在残基によってArg−Gly
−Asp配列から離れている残基の両方を指す。
れた」または「立体配座的に制約された」は、あるペプ
チドがとり得る可能性のある立体化学構造の数に制限が
課された状態を意味する。本発明に関しては、そのよう
な制限は、Arg−Gly−Asp結合部位の立体配座に課され
るものであり、その制限は、該結合部位の可能性のある
構造的立体配座を、トリペプチド配列単独の場合に仮定
される数よりも少ないものに制限する該結合部位の周囲
の化学構造の存在に起因している。このような立体配座
的に安定化されたArg−Gly−Asp含有ペプチドは、それ
でもなお、少なくとも1つの受容体との結合活性を示
す。「周囲の化学構造」は、アミノ酸またはその他の化
学的部分を指し得、結合部位にすぐに隣接して存在する
部分、ならびに介在アミノ酸の存在によって結合部位そ
れ自体から離れている部分の両方を指し得る。用語「Ar
g−Gly−Asp配列の周囲のアミノ酸」は、Arg−Gly−Asp
配列に隣接する残基ならびに介在残基によってArg−Gly
−Asp配列から離れている残基の両方を指す。
【0020】本明細書の用語、「Arg−Gly−Asp含有ペ
プチド」は、「Arg−Gly−Aspファミリーの受容体」、
即ちArg−Gly−Asp配列を認識し、これに結合する受容
体のための結合部位として機能することができる1また
はそれ以上のArg−Gly−Asp含有結合部位を有するペプ
チドを意味する。Arg−Gly−Asp配列は結合活性を保持
するために不変であることが必須とわかっているが、残
りのペプチドの組成ならびにペプチドと結合して存在す
る他のあらゆる化学的結合部分は、結合部位の活性に必
ずしも影響することなく変わり得る。Arg−Gly−Asp配
列以外に特異的な化学構造または配列が存在する場合、
結合部位の機能を破壊しない種々の修飾は当該ペプチド
の定義から逸脱することなく包含される。
プチド」は、「Arg−Gly−Aspファミリーの受容体」、
即ちArg−Gly−Asp配列を認識し、これに結合する受容
体のための結合部位として機能することができる1また
はそれ以上のArg−Gly−Asp含有結合部位を有するペプ
チドを意味する。Arg−Gly−Asp配列は結合活性を保持
するために不変であることが必須とわかっているが、残
りのペプチドの組成ならびにペプチドと結合して存在す
る他のあらゆる化学的結合部分は、結合部位の活性に必
ずしも影響することなく変わり得る。Arg−Gly−Asp配
列以外に特異的な化学構造または配列が存在する場合、
結合部位の機能を破壊しない種々の修飾は当該ペプチド
の定義から逸脱することなく包含される。
【0021】本明細書の用語「架橋」は、ペプチド骨格
を形成しているアミド結合以外のペプチド中の2つのア
ミノ酸の間の化学結合を意味する。
を形成しているアミド結合以外のペプチド中の2つのア
ミノ酸の間の化学結合を意味する。
【0022】本発明の用語「ペプチド結合」または「ペ
プチド連結」は、あるアミノ酸のカルボキシル基と別の
アミノ酸のα−アミノ基の間のアミド結合を意味する。
プチド連結」は、あるアミノ酸のカルボキシル基と別の
アミノ酸のα−アミノ基の間のアミド結合を意味する。
【0023】本明細書で用いるアミノ酸の略語を以下に
挙げる: Ala アラニン α−ABA α−アミノイソ酪酸 Arg アルギニン Asp アスパラギン酸 Cys システイン Glu グルタミン酸 Gly グリシン Leu ロイシン Lys リジン Pen ペニシラミン Pro プロリン Ser セリン SuccAla セクシニル−アラニン。
挙げる: Ala アラニン α−ABA α−アミノイソ酪酸 Arg アルギニン Asp アスパラギン酸 Cys システイン Glu グルタミン酸 Gly グリシン Leu ロイシン Lys リジン Pen ペニシラミン Pro プロリン Ser セリン SuccAla セクシニル−アラニン。
【0024】本発明は、立体配座的に安定化された形態
の、Arg−Gly−Asp配列を含有する新規な合成ペプチド
を提供するものである。ある態様では、このペプチド
は、X−R1−R2−Arg−Gly−Asp−R3−R4−Yの配
列を含む。配列中、R1およびR4はペプチド結合、また
はジスルフィド架橋などの架橋を形成するか、または形
成し得るアミノ酸であり、R2およびR3はそれぞれ0〜
5個のアミノ酸の配列であり、Xは1またはそれ以上の
アミノ酸またはHであり、Yは1またはそれ以上のアミ
ノ酸またはOHまたはNH2であり、そしてXとYの合計数
は約0〜100個のアミノ酸であるのが好ましく、より
長い配列が有用であることもある。好ましい実施態様で
は、R1はペニシラミンであり、R4はシステインであ
り、R2はグリシンであり、そしてR3はSer−Proであ
る。それぞれXおよびYで示されているNH2およびCOOH
末端に付加的なアミノ酸が存在しうる。
の、Arg−Gly−Asp配列を含有する新規な合成ペプチド
を提供するものである。ある態様では、このペプチド
は、X−R1−R2−Arg−Gly−Asp−R3−R4−Yの配
列を含む。配列中、R1およびR4はペプチド結合、また
はジスルフィド架橋などの架橋を形成するか、または形
成し得るアミノ酸であり、R2およびR3はそれぞれ0〜
5個のアミノ酸の配列であり、Xは1またはそれ以上の
アミノ酸またはHであり、Yは1またはそれ以上のアミ
ノ酸またはOHまたはNH2であり、そしてXとYの合計数
は約0〜100個のアミノ酸であるのが好ましく、より
長い配列が有用であることもある。好ましい実施態様で
は、R1はペニシラミンであり、R4はシステインであ
り、R2はグリシンであり、そしてR3はSer−Proであ
る。それぞれXおよびYで示されているNH2およびCOOH
末端に付加的なアミノ酸が存在しうる。
【0025】このようなペプチドは、公知の化学合成法
を含むあらゆる適当な方法によって合成し得る。直鎖状
の配列は、市販の自動ペプチド合成機を用いて合成する
のが好ましい。このようにして合成した物質は、沈澱さ
せ、例えば高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に
よってさらに精製し得る。95%以上の純度の合成ペプ
チドが好ましいが、それより低い純度であってもよい。
を含むあらゆる適当な方法によって合成し得る。直鎖状
の配列は、市販の自動ペプチド合成機を用いて合成する
のが好ましい。このようにして合成した物質は、沈澱さ
せ、例えば高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に
よってさらに精製し得る。95%以上の純度の合成ペプ
チドが好ましいが、それより低い純度であってもよい。
【0026】細胞接着系に関連する特定の細胞表面受容
体に対して高い特異性および親和性を有する本発明の安
定化ペプチドの1つを得るために、当分野で公知の方法
を用いて合成されたペプチドを環化する。例えば、残基
がスルフヒドリルを含有している場合、ペプチドの希水
溶液をK3[Fe(CN)6]で酸化することによってジスル
フィド架橋を得ることができる。当分野で既知の他の環
化の方法もまた用い得る。
体に対して高い特異性および親和性を有する本発明の安
定化ペプチドの1つを得るために、当分野で公知の方法
を用いて合成されたペプチドを環化する。例えば、残基
がスルフヒドリルを含有している場合、ペプチドの希水
溶液をK3[Fe(CN)6]で酸化することによってジスル
フィド架橋を得ることができる。当分野で既知の他の環
化の方法もまた用い得る。
【0027】また、本発明の安定化された環化ペプチド
は、隣接していないアミノ酸残基の間にペプチド結合を
形成させることによっても調製し得る。そのようなペプ
チド結合の形成方法は、Schillerら., Int. J. Peptide
Protein Res. 25:171(1985)に記載されており、この
文献の記載は本明細書に援用されている。簡単に言う
と、
は、隣接していないアミノ酸残基の間にペプチド結合を
形成させることによっても調製し得る。そのようなペプ
チド結合の形成方法は、Schillerら., Int. J. Peptide
Protein Res. 25:171(1985)に記載されており、この
文献の記載は本明細書に援用されている。簡単に言う
と、
【0028】
【化5】
【0029】およびBocおよび3級−ブチルタンパク質
を用いてペプチド鎖を組み立てることにより、メリフィ
ールド樹脂上で環状ペプチドを合成し得る。
を用いてペプチド鎖を組み立てることにより、メリフィ
ールド樹脂上で環状ペプチドを合成し得る。
【0030】また、安定化されたペプチドを、当分野で
公知の方法に従い、アルファ(α)螺旋または三重螺旋
などの螺旋を形成するように設計または処理することに
よっても調製し得る。
公知の方法に従い、アルファ(α)螺旋または三重螺旋
などの螺旋を形成するように設計または処理することに
よっても調製し得る。
【0031】本明細書に記載の安定化されたペプチド
は、例えばビトロネクチンを含む接着タンパク質の類似
物として用い得る。好ましい配列を持った環状ペプチド
のビトロネクチン受容体に対する親和性は、類似の直鎖
状配列のそれよりも高いので、この環状ペプチドを用い
て、フィブロネクチン受容体などの他の受容体の機能に
影響を及ぼすことなくビトロネクチンの結合を阻害し得
る。別の方法では、この環状ペプチドを用いて、細胞培
養の基質を被覆するなどの処置によってビトロネクチン
受容体を発現している細胞の付着を促進することができ
る。
は、例えばビトロネクチンを含む接着タンパク質の類似
物として用い得る。好ましい配列を持った環状ペプチド
のビトロネクチン受容体に対する親和性は、類似の直鎖
状配列のそれよりも高いので、この環状ペプチドを用い
て、フィブロネクチン受容体などの他の受容体の機能に
影響を及ぼすことなくビトロネクチンの結合を阻害し得
る。別の方法では、この環状ペプチドを用いて、細胞培
養の基質を被覆するなどの処置によってビトロネクチン
受容体を発現している細胞の付着を促進することができ
る。
【0032】Arg−Gly−Asp配列を含有するある特定の
構造が、結合部位に特定の特異性またはその他の特性を
付与することがわかった。そのような構造には、配列−
Arg−Gly−Asp−NH2、−D−Arg−Gly−Asp−および−A
rg−Gly−Asp−D−Ser−が含まれる。立体配座的に安
定化された後者の配列は、フィブロネクチン受容体に対
して有用な親和性を示すが、ビトロネクチン受容体には
そのような親和性を示さない。天然のアミノ酸の鏡像異
性体が存在すると、D−Argの場合において、トリプシ
ンなどの分解酵素に対して耐性が付与されることがわか
っている。その他の有用なペプチドには、配列Phe−Arg
−Gly−Asp−Ser−Pro、Gly−Arg−Gly−Asp−Ser−Phe
およびPhe−Arg−Gly−Asp−Ser−Pheが含まれる。
構造が、結合部位に特定の特異性またはその他の特性を
付与することがわかった。そのような構造には、配列−
Arg−Gly−Asp−NH2、−D−Arg−Gly−Asp−および−A
rg−Gly−Asp−D−Ser−が含まれる。立体配座的に安
定化された後者の配列は、フィブロネクチン受容体に対
して有用な親和性を示すが、ビトロネクチン受容体には
そのような親和性を示さない。天然のアミノ酸の鏡像異
性体が存在すると、D−Argの場合において、トリプシ
ンなどの分解酵素に対して耐性が付与されることがわか
っている。その他の有用なペプチドには、配列Phe−Arg
−Gly−Asp−Ser−Pro、Gly−Arg−Gly−Asp−Ser−Phe
およびPhe−Arg−Gly−Asp−Ser−Pheが含まれる。
【0033】本発明のペプチドを人工補欠物またはイン
プラント(例えば、血管インプラント)を含む医学装置
の被覆などのインビボの用途に工業的に用いて、それら
に対する細胞の付着を容易にし得る。さらに、本ペプチ
ドは、細胞接着を促進するための基質(細胞培養基質な
ど)の被覆への、インビトロでの用途も有している。本
発明の他の特徴および利点は、以下に挙げるさらに詳細
な実施例によって明らかとなる。これらの実施例は本発
明の原理を説明するものであるが、これらは例示に過ぎ
ない。
プラント(例えば、血管インプラント)を含む医学装置
の被覆などのインビボの用途に工業的に用いて、それら
に対する細胞の付着を容易にし得る。さらに、本ペプチ
ドは、細胞接着を促進するための基質(細胞培養基質な
ど)の被覆への、インビトロでの用途も有している。本
発明の他の特徴および利点は、以下に挙げるさらに詳細
な実施例によって明らかとなる。これらの実施例は本発
明の原理を説明するものであるが、これらは例示に過ぎ
ない。
【0034】
【実施例】実施例1 ペプチド合成 自動ペプチド合成機(Model 430A;Applied Biosystem
s, Foster City, California)を用い、製造元の指示に
従って、ペプチドGly−Pen−Gly−Arg−Gly−Asp−Ser
−Pro−Cys−Alaを合成した。フッ化水素を用いて樹脂
から切断した後、ペプチドを冷エチルエーテルで洗浄
し、氷冷エーテルでトリフルオロアセテート溶液から沈
澱させた。次いで、このペプチドを蒸留水に再溶解し、
凍結乾燥した。このペプチドを、Waters BondapakTM C
18(3×30cm;10μmパッキング、Waters Assoc., Mil
ford, MA)を用いるHPLCでさらに精製した。
s, Foster City, California)を用い、製造元の指示に
従って、ペプチドGly−Pen−Gly−Arg−Gly−Asp−Ser
−Pro−Cys−Alaを合成した。フッ化水素を用いて樹脂
から切断した後、ペプチドを冷エチルエーテルで洗浄
し、氷冷エーテルでトリフルオロアセテート溶液から沈
澱させた。次いで、このペプチドを蒸留水に再溶解し、
凍結乾燥した。このペプチドを、Waters BondapakTM C
18(3×30cm;10μmパッキング、Waters Assoc., Mil
ford, MA)を用いるHPLCでさらに精製した。
【0035】実施例2 ペプチドの環化 実施例1に記載のようにして合成したペプチド611mg
を、予め煮沸して冷却しておいた4リットルの水に溶解
した。ペプチドの添加直前の45分間、窒素を水中に吹き
込んだ。ペプチドを溶解した後、フェロシアン化カリウ
ムK3[Fe(CN)6]の0.1μg/mlの水溶液を、黄色が5
分間持続するようになるまで(約5ml)、攪拌ペプチド
溶液に滴下した。この操作の間はNH4OHの添加によって
溶液のpHを7.0に維持した。この溶液を弱い吸引下で20
時間放置し、次いで凍結乾燥した。環化された物質をSe
phadex G-15カラム(1.8×120cm)にかけることによっ
て過剰のK3[Fe(CN)6]を除去した。このペプチド
を、Waters BondapakTM C18カラム(3×30cm;10μmパ
ッキング)(Waters Assoc., Milford, MA)を用いて逆
相HPLCによって精製した。ペプチドを、緩衝液A(20mM
酢酸アンモニウム、pH7.5)を用いてカラムにかけ、40
%緩衝液Aおよび60%アセトニトリルからなる緩衝液B
の勾配液で溶離した。図1は、逆相HPLCによる環化ペプ
チドの精製結果を示すものである。トレースaはC18カ
ラムでのペプチドの精製を示すものである。細胞のフィ
ブロネクチンまたはビトロネクチンへの付着を阻害する
能力を試験するために分画1、2および3をプールし
た。環状ペプチドを含有する分画2を同じ方法でC18カ
ラムのクロマトグラフィーにもう一度かけ、単一のピー
クを得た(トレースb)。
を、予め煮沸して冷却しておいた4リットルの水に溶解
した。ペプチドの添加直前の45分間、窒素を水中に吹き
込んだ。ペプチドを溶解した後、フェロシアン化カリウ
ムK3[Fe(CN)6]の0.1μg/mlの水溶液を、黄色が5
分間持続するようになるまで(約5ml)、攪拌ペプチド
溶液に滴下した。この操作の間はNH4OHの添加によって
溶液のpHを7.0に維持した。この溶液を弱い吸引下で20
時間放置し、次いで凍結乾燥した。環化された物質をSe
phadex G-15カラム(1.8×120cm)にかけることによっ
て過剰のK3[Fe(CN)6]を除去した。このペプチド
を、Waters BondapakTM C18カラム(3×30cm;10μmパ
ッキング)(Waters Assoc., Milford, MA)を用いて逆
相HPLCによって精製した。ペプチドを、緩衝液A(20mM
酢酸アンモニウム、pH7.5)を用いてカラムにかけ、40
%緩衝液Aおよび60%アセトニトリルからなる緩衝液B
の勾配液で溶離した。図1は、逆相HPLCによる環化ペプ
チドの精製結果を示すものである。トレースaはC18カ
ラムでのペプチドの精製を示すものである。細胞のフィ
ブロネクチンまたはビトロネクチンへの付着を阻害する
能力を試験するために分画1、2および3をプールし
た。環状ペプチドを含有する分画2を同じ方法でC18カ
ラムのクロマトグラフィーにもう一度かけ、単一のピー
クを得た(トレースb)。
【0036】C18カラムによって得られた主ピーク(図
1の分画2)は90%の回収ペプチドからなっており、単
量体の環状ペプチドであると推定された。この理由は、
それが該配列に予想される時間、カラムに保持されたこ
と、ならびに環化していない物質および多量体の形態が
主ピークから十分に離れていたためである。
1の分画2)は90%の回収ペプチドからなっており、単
量体の環状ペプチドであると推定された。この理由は、
それが該配列に予想される時間、カラムに保持されたこ
と、ならびに環化していない物質および多量体の形態が
主ピークから十分に離れていたためである。
【0037】実施例3 三重螺旋構造の形成 実施例1のようにして得られた直鎖状ペプチドの細胞付
着促進Arg−Gly−Asp配列を、その記載が本明細書に援
用されている、Dedharら、(1987), J. CellBiol. 10
4:585の方法に従い、このペプチドに螺旋構造をとらせ
ることによって立体配座的に制約を加えた。簡単に説明
すると、配列(Pro−Hyp−Gly)4−Ala−Pro−Gly−Leu
−Arg−Gly−Asp−Thr−Gly−(Pro−Hyp−Gly)4を有
する33アミノ酸のペプチドを、自動ペプチド合成機(Mo
del 43OA;Applied Biosystems,Foster City, CA)を用
いて合成した。この配列を、図3に示すように、気相シ
ークエンサー(Model 470A;Applied Biosystems, Fost
er City, CA)を用い、自動エドマン分解によって確認
した。この直鎖状のペプチドを、必要最小限の量の0.05
%酢酸中、4℃で一晩、溶解させた。その記載が本明細
書に援用されている、Rhodesら、(1978), Biochemist
ry,17:3442の方法に従い、偏光分析を用いて螺旋構造
をとっていることを認識した。このペプチドは、図4に
示すように、30℃の変曲点(二次導関数が0に等しい:
Tm)を有する「融解」曲線を与え、温度の上昇につれて
顕著に変化する高い度数の負の旋光度によって判断され
るように、低温では三重螺旋として存在していた。
着促進Arg−Gly−Asp配列を、その記載が本明細書に援
用されている、Dedharら、(1987), J. CellBiol. 10
4:585の方法に従い、このペプチドに螺旋構造をとらせ
ることによって立体配座的に制約を加えた。簡単に説明
すると、配列(Pro−Hyp−Gly)4−Ala−Pro−Gly−Leu
−Arg−Gly−Asp−Thr−Gly−(Pro−Hyp−Gly)4を有
する33アミノ酸のペプチドを、自動ペプチド合成機(Mo
del 43OA;Applied Biosystems,Foster City, CA)を用
いて合成した。この配列を、図3に示すように、気相シ
ークエンサー(Model 470A;Applied Biosystems, Fost
er City, CA)を用い、自動エドマン分解によって確認
した。この直鎖状のペプチドを、必要最小限の量の0.05
%酢酸中、4℃で一晩、溶解させた。その記載が本明細
書に援用されている、Rhodesら、(1978), Biochemist
ry,17:3442の方法に従い、偏光分析を用いて螺旋構造
をとっていることを認識した。このペプチドは、図4に
示すように、30℃の変曲点(二次導関数が0に等しい:
Tm)を有する「融解」曲線を与え、温度の上昇につれて
顕著に変化する高い度数の負の旋光度によって判断され
るように、低温では三重螺旋として存在していた。
【0038】実施例4 α螺旋構造の形成 Arg−Gly−Asp含有ペプチドを適当な条件のもとでα螺
旋の立体配置をとるアミノ酸配列を有するように設計し
た。その記載が本明細書に援用されている、Carbone
ら、(1987),J.Immunology 138:1838が示したよう
に、α−アミノイソ酪酸(α−ABA)およびアラニン(A
la)残基を交互に含有するペプチドは構造形成有機溶媒
中で螺旋立体配座をとる。さらに、アミノ末端に負に荷
電した基およびカルボキシル末端に正に荷電した基が存
在すると、そのような螺旋を安定化するように働く双極
子が得られる(その記載が本明細書に援用されている、
Shoemakerら、(1987), Nature 326:563)。さらに、
親水性残基が螺旋の一方の側に存在し、親油性残基が螺
旋の他方の側に存在する両親媒性の2次構造が得られる
アミノ酸の配列を選択した(その記載が本明細書に援用
されているKaiserら、(1984), Science 223:249)。
旋の立体配置をとるアミノ酸配列を有するように設計し
た。その記載が本明細書に援用されている、Carbone
ら、(1987),J.Immunology 138:1838が示したよう
に、α−アミノイソ酪酸(α−ABA)およびアラニン(A
la)残基を交互に含有するペプチドは構造形成有機溶媒
中で螺旋立体配座をとる。さらに、アミノ末端に負に荷
電した基およびカルボキシル末端に正に荷電した基が存
在すると、そのような螺旋を安定化するように働く双極
子が得られる(その記載が本明細書に援用されている、
Shoemakerら、(1987), Nature 326:563)。さらに、
親水性残基が螺旋の一方の側に存在し、親油性残基が螺
旋の他方の側に存在する両親媒性の2次構造が得られる
アミノ酸の配列を選択した(その記載が本明細書に援用
されているKaiserら、(1984), Science 223:249)。
【0039】自動ペプチドシークエンサー(Model 430
A;Applied Biosystems, Foster City, CA)によって次
の直鎖状配列を調製した:SuccAla−Leu−Glu−Glu−α
ABA−Ala−Lys−Arg−Gly−Asp−Ser−Leu−αABA−Gly
−Lys−αABA−Ala−Lys。
A;Applied Biosystems, Foster City, CA)によって次
の直鎖状配列を調製した:SuccAla−Leu−Glu−Glu−α
ABA−Ala−Lys−Arg−Gly−Asp−Ser−Leu−αABA−Gly
−Lys−αABA−Ala−Lys。
【0040】実施例1の方法に従ってペプチドを合成
し、精製した。このペプチドのα螺旋の立体配座を図5
に図示する。
し、精製した。このペプチドのα螺旋の立体配座を図5
に図示する。
【0041】実施例5 細胞接着アッセイ その記載が本明細書に援用されているRuoslahtiら、(1
982), Meth. Enz. 82:803およびHaymanら(1983), P
NAS 80:4003の方法に従って、それぞれフィブロネクチ
ンおよびビトロネクチンをヒト血漿から精製した。フィ
ブロネクチンおよびビトロネクチンに対する正常ラット
腎細胞の接着をRuoslahtiら(前出)の記載のようにし
てアッセイした。簡単に言うと、0.1M PBS中の12μg/m
lの濃度のフィブロネクチンまたはビトロネクチンの溶
液0.1mlを96ウェルのプラスチック製マイクロタイター
プレートのそれぞれのウェルに入れ、室温で2時間放置
した。未結合のタンパク質をPBSによる3回の洗浄で除
去した。
982), Meth. Enz. 82:803およびHaymanら(1983), P
NAS 80:4003の方法に従って、それぞれフィブロネクチ
ンおよびビトロネクチンをヒト血漿から精製した。フィ
ブロネクチンおよびビトロネクチンに対する正常ラット
腎細胞の接着をRuoslahtiら(前出)の記載のようにし
てアッセイした。簡単に言うと、0.1M PBS中の12μg/m
lの濃度のフィブロネクチンまたはビトロネクチンの溶
液0.1mlを96ウェルのプラスチック製マイクロタイター
プレートのそれぞれのウェルに入れ、室温で2時間放置
した。未結合のタンパク質をPBSによる3回の洗浄で除
去した。
【0042】アッセイの1日前に、正常ラット腎細胞の
集密化培養物を通常の組織培養トリプシンを用いて1:
2に分けた。この細胞をPBS(pH7.2)で3回洗浄した。
PBS中、0.1mg/mlの2x結晶化トリプシン(Sigma;タイ
プIII)(10ml)を加え、細胞が分離するまで37℃でイ
ンキュベートした。次いで、分離した細胞を遠心して集
め、PBS中の0.5mg/ml大豆トリプシンインヒビターの溶
液で3回洗浄して、トリプシンの中和を確実なものにし
た。最後の遠心の前に試料を取り、トリパン・ブルー排
除によって細胞数および生存性を測定した。この細胞を
106細胞/mlの濃度で最少必須培地(MEM)に懸濁し、1
つずつの細胞の懸濁液が得られるまでピペッティングに
よって分散させた。
集密化培養物を通常の組織培養トリプシンを用いて1:
2に分けた。この細胞をPBS(pH7.2)で3回洗浄した。
PBS中、0.1mg/mlの2x結晶化トリプシン(Sigma;タイ
プIII)(10ml)を加え、細胞が分離するまで37℃でイ
ンキュベートした。次いで、分離した細胞を遠心して集
め、PBS中の0.5mg/ml大豆トリプシンインヒビターの溶
液で3回洗浄して、トリプシンの中和を確実なものにし
た。最後の遠心の前に試料を取り、トリパン・ブルー排
除によって細胞数および生存性を測定した。この細胞を
106細胞/mlの濃度で最少必須培地(MEM)に懸濁し、1
つずつの細胞の懸濁液が得られるまでピペッティングに
よって分散させた。
【0043】マイクロタイターウェル中に細胞を確実に
均等に分散させるために、0.1mlのMEMをそれぞれのウェ
ルに加え、次に0.1mlの細胞懸濁液を加えた。このプレ
ートを37℃で1時間インキュベートした。
均等に分散させるために、0.1mlのMEMをそれぞれのウェ
ルに加え、次に0.1mlの細胞懸濁液を加えた。このプレ
ートを37℃で1時間インキュベートした。
【0044】付着していない細胞は、単に培地を除き、
ウェルを洗浄することによって除去した。このプレート
をPBSに浸漬し、洗浄液を除去した。次に、この細胞をP
BS中の3%パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中の1
%トルイジン・ブルー、パラホルムアルデヒドで染色
し、付着した細胞を数えた。細胞は、表面に付着した細
胞を数えることができる細胞カウンター(Dynatech Lab
oratories, Alexandria,VA)を用いて数を測定した。
ウェルを洗浄することによって除去した。このプレート
をPBSに浸漬し、洗浄液を除去した。次に、この細胞をP
BS中の3%パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中の1
%トルイジン・ブルー、パラホルムアルデヒドで染色
し、付着した細胞を数えた。細胞は、表面に付着した細
胞を数えることができる細胞カウンター(Dynatech Lab
oratories, Alexandria,VA)を用いて数を測定した。
【0045】基質に対する細胞の付着を阻害する本発明
の環状化ペプチドの能力を、MEM中に溶解したペプチド
の保存溶液を加えてウェル中の最終濃度を0〜10.0mMに
することによって、アッセイした。アッセイに加える前
に、保存溶液は炭酸水素ナトリウムで中和した。前述の
ようにしてラット腎細胞を加え、ウェルをインキュベー
トし、そしてアッセイした。
の環状化ペプチドの能力を、MEM中に溶解したペプチド
の保存溶液を加えてウェル中の最終濃度を0〜10.0mMに
することによって、アッセイした。アッセイに加える前
に、保存溶液は炭酸水素ナトリウムで中和した。前述の
ようにしてラット腎細胞を加え、ウェルをインキュベー
トし、そしてアッセイした。
【0046】フィブロネクチンおよびビトロネクチン基
質への正常ラット腎細胞の付着を阻害する環状化ペプチ
ドの能力をさらに詳しく測定するために、配列Gly−Pen
−Gly−Arg−Gly−Asp−Ser−Pro−Cysを有する非環状
化、即ち直鎖状のペプチド結合をアッセイした。図2に
示したように、本発明の環状ペプチドは直鎖状ペプチド
よりも10倍低いモル濃度でビトロネクチンへの付着を阻
害したが、フィブロネクチンへの付着を阻害するには有
効ではなかった。対照的に、直鎖状のペプチドは比較的
同程度の濃度で両基質への細胞の付着を阻害した。
質への正常ラット腎細胞の付着を阻害する環状化ペプチ
ドの能力をさらに詳しく測定するために、配列Gly−Pen
−Gly−Arg−Gly−Asp−Ser−Pro−Cysを有する非環状
化、即ち直鎖状のペプチド結合をアッセイした。図2に
示したように、本発明の環状ペプチドは直鎖状ペプチド
よりも10倍低いモル濃度でビトロネクチンへの付着を阻
害したが、フィブロネクチンへの付着を阻害するには有
効ではなかった。対照的に、直鎖状のペプチドは比較的
同程度の濃度で両基質への細胞の付着を阻害した。
【0047】本発明に拘束されることを望むものではな
いが、本発明の環状ペプチドはフィブロネクチンおよび
ビトロネクチン受容体の結合部位に対して異なる親和性
を有しているようである。このことは、本アッセイに用
いたラット腎細胞がフィブロネクチンおよびビトロネク
チンに対して別々の受容体を有することが知られている
事実に合致するものである。
いが、本発明の環状ペプチドはフィブロネクチンおよび
ビトロネクチン受容体の結合部位に対して異なる親和性
を有しているようである。このことは、本アッセイに用
いたラット腎細胞がフィブロネクチンおよびビトロネク
チンに対して別々の受容体を有することが知られている
事実に合致するものである。
【0048】実施例6 ペプチド結合による環状化 その記載が本明細書に援用されているSchillerら、Int.
J.Peptide ProteinRes. 25:171(1985)の方法の改
良法を用いて、シクロ−(1−7)Gly−Arg−Gly−Asp
−Ser−Pro−Asp−Glyペプチドを合成した。
J.Peptide ProteinRes. 25:171(1985)の方法の改
良法を用いて、シクロ−(1−7)Gly−Arg−Gly−Asp
−Ser−Pro−Asp−Glyペプチドを合成した。
【0049】合成は、0.80ミリモル/gの置換率で樹脂
に結合したt-Boc Glyを有するPAM樹脂−TFA(Applied B
iosystems, Inc.,Foster City, CA)を用いて行った
(図6を参照)。全てのアミノ酸をBachem Bioscience,
Inc. (Philadelphia, PA)から入手した。樹脂(1.25
g;1.0ミリモル)を20mlのジクロロメタン(DCM)とと
もに15分間振盪して膨張させ、N2圧をかけてDCMを除去
し、この操作を繰返した。t-Boc保護基を20mlの20%TFA
[Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA;DCM
(Pfizer, Groton, CN)中]で15分間反応させ、切断し
た。この反応を繰返し、この時は30分間振盪した。これ
らの反応の間には、樹脂を20mlのDCMで1回、2分間洗
浄した。第2の反応の後には、樹脂を20mlのDCMで6
回、それぞれ2分間づつ洗浄し、続いて、20mlのDCM中
の10%トリエチルアミン(TEA)で2回、それぞれ3分
間づつ中和した。この樹脂を20mlのDCMで6回、それぞ
れ2分間づつ洗浄し、次の反応に備えた。
に結合したt-Boc Glyを有するPAM樹脂−TFA(Applied B
iosystems, Inc.,Foster City, CA)を用いて行った
(図6を参照)。全てのアミノ酸をBachem Bioscience,
Inc. (Philadelphia, PA)から入手した。樹脂(1.25
g;1.0ミリモル)を20mlのジクロロメタン(DCM)とと
もに15分間振盪して膨張させ、N2圧をかけてDCMを除去
し、この操作を繰返した。t-Boc保護基を20mlの20%TFA
[Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA;DCM
(Pfizer, Groton, CN)中]で15分間反応させ、切断し
た。この反応を繰返し、この時は30分間振盪した。これ
らの反応の間には、樹脂を20mlのDCMで1回、2分間洗
浄した。第2の反応の後には、樹脂を20mlのDCMで6
回、それぞれ2分間づつ洗浄し、続いて、20mlのDCM中
の10%トリエチルアミン(TEA)で2回、それぞれ3分
間づつ中和した。この樹脂を20mlのDCMで6回、それぞ
れ2分間づつ洗浄し、次の反応に備えた。
【0050】攪拌機を装着した50mlの丸底フラスコ中
で、Fmoc−Asp−t−ブチルエステル[(OtBu)OH](1.
03g;2.5モル)を15mlのDCMに溶解し、次いでDCMの1M
DIC(Aldrich Chem. Co.,Milwaukee, WI)を2.5ml加
えた。この混合ジイソプロピルカルボジイミドを5分間
攪拌し、次いで0℃でDMF(Pfizer)中の2.0Mヒドロキ
シベンゾトリアゾール(HOBT;Aldrich)を1.25ml加
え、さらに10〜15分間攪拌した。この混合物を樹脂に加
え、1〜2時間振盪した。この反応をもう1回繰返し
(2回結合)、結合の間には樹脂を20mlのDCMで2回洗
浄した。第2の結合が完了した後に、樹脂を20mlのDCM
で3回洗浄した。
で、Fmoc−Asp−t−ブチルエステル[(OtBu)OH](1.
03g;2.5モル)を15mlのDCMに溶解し、次いでDCMの1M
DIC(Aldrich Chem. Co.,Milwaukee, WI)を2.5ml加
えた。この混合ジイソプロピルカルボジイミドを5分間
攪拌し、次いで0℃でDMF(Pfizer)中の2.0Mヒドロキ
シベンゾトリアゾール(HOBT;Aldrich)を1.25ml加
え、さらに10〜15分間攪拌した。この混合物を樹脂に加
え、1〜2時間振盪した。この反応をもう1回繰返し
(2回結合)、結合の間には樹脂を20mlのDCMで2回洗
浄した。第2の結合が完了した後に、樹脂を20mlのDCM
で3回洗浄した。
【0051】Fmoc基の切断は20mlのDCM中の20%ピペリ
ジン(Aldrich)(新たに調製)で行い、15分間振盪し
た。この反応をさらに30分間繰返した。次いで、この樹
脂をDMFで1回およびDCMで5回、それぞれ2.0分間づつ
洗浄した。この樹脂を次の結合に備えた。
ジン(Aldrich)(新たに調製)で行い、15分間振盪し
た。この反応をさらに30分間繰返した。次いで、この樹
脂をDMFで1回およびDCMで5回、それぞれ2.0分間づつ
洗浄した。この樹脂を次の結合に備えた。
【0052】攪拌棒を装着した50mlの丸底フラスコ中
で、Fmoc−Pro−OH(0.84g;2.5ミリモル)を15mlのDC
Mに溶解し、次いでDCM中の1M DICを2.5ml加えた。この
混合物を5.0分間攪拌し、次いで、0℃でDMF中の2M HO
BTを1.25ml加え、さらに10〜15分間攪拌した。この混合
物を樹脂に加え、1〜2時間振盪した。この反応をもう
1回繰返し(2回結合)、結合の間には樹脂を20mlのDC
Mで2回洗浄した。第2の結合が完了した後に、樹脂を2
0mlのDCMで3回洗浄した。前述と同じ方法を用いてFmoc
を切断し、この物質を次の結合に備えた。
で、Fmoc−Pro−OH(0.84g;2.5ミリモル)を15mlのDC
Mに溶解し、次いでDCM中の1M DICを2.5ml加えた。この
混合物を5.0分間攪拌し、次いで、0℃でDMF中の2M HO
BTを1.25ml加え、さらに10〜15分間攪拌した。この混合
物を樹脂に加え、1〜2時間振盪した。この反応をもう
1回繰返し(2回結合)、結合の間には樹脂を20mlのDC
Mで2回洗浄した。第2の結合が完了した後に、樹脂を2
0mlのDCMで3回洗浄した。前述と同じ方法を用いてFmoc
を切断し、この物質を次の結合に備えた。
【0053】攪拌棒を装着した50mlの丸底フラスコ中
で、Fmoc−Asp−ベンジルエステル[(OBzl)−OH]
(1.11g;2.5ミリモル)を15mlのDCMに溶解し、次いで
DCM中の1M DICを2.5ml加えた。この混合物を5.0分間攪
拌し、次いで0℃でDMF中の2.0MHOBTを1.25ml加え、10
〜15分間攪拌した。この混合物を樹脂に加え、1〜2時
間振盪した。この反応をもう1回繰返し(2回結合)、
結合の間には樹脂を20mlのDCMで2回洗浄した。第2の
結合が完了した後に、樹脂を20mlのDCMで3回洗浄し
た。前述と同じ方法を用いてFmocを切断し、この物質を
次の結合に備えた。
で、Fmoc−Asp−ベンジルエステル[(OBzl)−OH]
(1.11g;2.5ミリモル)を15mlのDCMに溶解し、次いで
DCM中の1M DICを2.5ml加えた。この混合物を5.0分間攪
拌し、次いで0℃でDMF中の2.0MHOBTを1.25ml加え、10
〜15分間攪拌した。この混合物を樹脂に加え、1〜2時
間振盪した。この反応をもう1回繰返し(2回結合)、
結合の間には樹脂を20mlのDCMで2回洗浄した。第2の
結合が完了した後に、樹脂を20mlのDCMで3回洗浄し
た。前述と同じ方法を用いてFmocを切断し、この物質を
次の結合に備えた。
【0054】攪拌棒を装着した50mlの丸底フラスコ中
で、Fmoc−Gly−OH(0.74g;2.5ミリモル)を15mlのDM
Fに溶解し、次いでDCM中の1M DICを2.5ml加えた。この
混合物を5.0分間攪拌し、次いで0℃でDMF中の2.0M HOB
Tを1.25ml加え、さらに10〜15分間攪拌した。この混合
物を樹脂に加え、1〜2時間振盪した。この反応を2回
行い(2回結合)、結合の間には樹脂を20mlのDCMで2
回洗浄した。第2の結合が完了した後に樹脂を20mlのDC
Mで3回洗浄した。前述の方法と同じ方法を用いてFmoc
を切断し、この物質を次の結合に備えた。
で、Fmoc−Gly−OH(0.74g;2.5ミリモル)を15mlのDM
Fに溶解し、次いでDCM中の1M DICを2.5ml加えた。この
混合物を5.0分間攪拌し、次いで0℃でDMF中の2.0M HOB
Tを1.25ml加え、さらに10〜15分間攪拌した。この混合
物を樹脂に加え、1〜2時間振盪した。この反応を2回
行い(2回結合)、結合の間には樹脂を20mlのDCMで2
回洗浄した。第2の結合が完了した後に樹脂を20mlのDC
Mで3回洗浄した。前述の方法と同じ方法を用いてFmoc
を切断し、この物質を次の結合に備えた。
【0055】攪拌棒を装着した50mlの丸底フラスコ中
で、Fmoc−Argトシレート[(Tos)OH](1.37g;2.5
ミリモル)を15mlのDCMに溶解し、次いで、DCM中の1M
DICを2.5ml加えた。この混合物を5.0分間攪拌し、次い
で0℃でDMF中の2.0M HOBTを1.25ml加え、さらに10〜15
分間攪拌した。この混合物を樹脂に加え、1〜2時間振
盪した。この反応をもう一度繰返し(2回結合)、結合
の間には樹脂を20mlのDCMで2回洗浄した。第2の結合
を行った後に、樹脂を20mlのDCMで3回洗浄した。前述
の方法と同じ方法でFmocの脱保護を行い、この物質を次
の結合に備えた。
で、Fmoc−Argトシレート[(Tos)OH](1.37g;2.5
ミリモル)を15mlのDCMに溶解し、次いで、DCM中の1M
DICを2.5ml加えた。この混合物を5.0分間攪拌し、次い
で0℃でDMF中の2.0M HOBTを1.25ml加え、さらに10〜15
分間攪拌した。この混合物を樹脂に加え、1〜2時間振
盪した。この反応をもう一度繰返し(2回結合)、結合
の間には樹脂を20mlのDCMで2回洗浄した。第2の結合
を行った後に、樹脂を20mlのDCMで3回洗浄した。前述
の方法と同じ方法でFmocの脱保護を行い、この物質を次
の結合に備えた。
【0056】攪拌棒を装着した50mlの丸底フラスコ中
で、t−Boc−Gly−OH(0.44g;2.5ミリモル)を15mlの
DCMに溶解し、次いでDCM中の1M DICを2.5ml加えた。こ
の混合物を5.0分間攪拌し、次いで0℃でDMF中の2M HO
BTを1.25ml加え、さらに10〜15分間攪拌した。この混合
物を樹脂に加え、1〜2時間振盪した。この反応を繰返
し(2回結合)、結合の間には樹脂を20mlのDCMで2
回、それぞれ2分間づつ洗浄した。第2の結合を行った
後に、樹脂を20mlのDCMで3回、それぞれ2分間づつ洗
浄した。
で、t−Boc−Gly−OH(0.44g;2.5ミリモル)を15mlの
DCMに溶解し、次いでDCM中の1M DICを2.5ml加えた。こ
の混合物を5.0分間攪拌し、次いで0℃でDMF中の2M HO
BTを1.25ml加え、さらに10〜15分間攪拌した。この混合
物を樹脂に加え、1〜2時間振盪した。この反応を繰返
し(2回結合)、結合の間には樹脂を20mlのDCMで2
回、それぞれ2分間づつ洗浄した。第2の結合を行った
後に、樹脂を20mlのDCMで3回、それぞれ2分間づつ洗
浄した。
【0057】Gly 1のt−Boc基およびAsp7のt−ブチル
エステル側鎖の脱保護は、DCM中の20%TFAを20ml加える
ことによって同時に15分間行った。この反応をもう一度
30分間繰返した。反応の間には、樹脂をDCMで1回、2
分間洗浄した。第2の反応の後に、樹脂を20mlのDCMで
6回、それぞれ2分間洗浄づつし、次いでDCM中の10%T
EA、20mlで2回、それぞれ3分間づつ中和した。この樹
脂を20mlのDCMで6回、それぞれ2.0分間づつ洗浄した。
エステル側鎖の脱保護は、DCM中の20%TFAを20ml加える
ことによって同時に15分間行った。この反応をもう一度
30分間繰返した。反応の間には、樹脂をDCMで1回、2
分間洗浄した。第2の反応の後に、樹脂を20mlのDCMで
6回、それぞれ2分間洗浄づつし、次いでDCM中の10%T
EA、20mlで2回、それぞれ3分間づつ中和した。この樹
脂を20mlのDCMで6回、それぞれ2.0分間づつ洗浄した。
【0058】Gly1のN−末端をAsp7の側鎖カルボキシ
ル基に環化させた。この環化はDMF中の2M HOBTを5m
l、および1M DIC溶液を10ml加え、4日間振盪すること
によって行った。それぞれの日に古い試薬を抜き取り、
樹脂を20mlのDMFで1回、DCMで3回、それぞれ2分間づ
つ洗浄した。次いで、新しい試薬(DICおよびHOBT)を
加えた。
ル基に環化させた。この環化はDMF中の2M HOBTを5m
l、および1M DIC溶液を10ml加え、4日間振盪すること
によって行った。それぞれの日に古い試薬を抜き取り、
樹脂を20mlのDMFで1回、DCMで3回、それぞれ2分間づ
つ洗浄した。次いで、新しい試薬(DICおよびHOBT)を
加えた。
【0059】この樹脂を、当分野で公知の方法を用い、
フッ化水素で切断した。切断の後、ペプチド含有の樹脂
を冷エチルエーテルで洗浄し、次いで10%酢酸で溶解
し、樹脂からペプチドを除去した。この濾液を凍結乾燥
した。回収された粗生成物は508mgであった。この粗生
成物を、C18(1×20cm;10-μmパッキング)カラムのH
PLCによる精製にかけた。ペプチドを緩衝液A(10mM酢
酸アンモニウム、pH6.0)中でこのカラムにかけ、60%
アセトニトリルおよび40%緩衝液Aからなる緩衝液Bの
勾配で溶離した。精製後の収量は210mgであった。
フッ化水素で切断した。切断の後、ペプチド含有の樹脂
を冷エチルエーテルで洗浄し、次いで10%酢酸で溶解
し、樹脂からペプチドを除去した。この濾液を凍結乾燥
した。回収された粗生成物は508mgであった。この粗生
成物を、C18(1×20cm;10-μmパッキング)カラムのH
PLCによる精製にかけた。ペプチドを緩衝液A(10mM酢
酸アンモニウム、pH6.0)中でこのカラムにかけ、60%
アセトニトリルおよび40%緩衝液Aからなる緩衝液Bの
勾配で溶離した。精製後の収量は210mgであった。
【0060】DMSO-d6を溶媒とするプロトンNMRによっ
て、この化合物が目的の環状ペプチド構造を有している
ことを確認した。この化合物の1Dおよび2D(COSY、COSY
-Relay、およびNOESY)スペクトルを、カリフォルニア
大学、サンジエゴNMR施設で、Nicoletソフトウェアを装
備した360 MHz FT-NMRによって得た(Wuthrich, K. の
「タンパク質および核酸のNMR」(John Wiley & Son, N
Y(1986)を参照;この文献は本明細書に援用されてい
る)。
て、この化合物が目的の環状ペプチド構造を有している
ことを確認した。この化合物の1Dおよび2D(COSY、COSY
-Relay、およびNOESY)スペクトルを、カリフォルニア
大学、サンジエゴNMR施設で、Nicoletソフトウェアを装
備した360 MHz FT-NMRによって得た(Wuthrich, K. の
「タンパク質および核酸のNMR」(John Wiley & Son, N
Y(1986)を参照;この文献は本明細書に援用されてい
る)。
【0061】現時点で好ましい態様を参考にして本発明
を説明したが、本発明から逸脱することなく当業者が種
々の修飾を加え得ることは理解される。従って、本発明
は上記請求範囲によってのみ限定されるものである。
を説明したが、本発明から逸脱することなく当業者が種
々の修飾を加え得ることは理解される。従って、本発明
は上記請求範囲によってのみ限定されるものである。
【0062】
【発明の効果】本発明の安定化されたペプチドはその細
胞接着の性質に関連した種々の応用分野を有している。
例えば、本発明のペプチドを用いてビトロネクチン受容
体含有細胞が細胞培養用の基質に結合するのを効率的に
阻害することができる。別の態様では、この安定化ペプ
チドは、例えば細胞培養基質を被覆することによって、
ビトロネクチン受容体を発現している細胞の接着を促進
するために有用に用いられ得る。さらに、この安定化ペ
プチドは、細胞の付着が望ましい人工補欠物などのイン
ビトロ移植用の材料を被覆するのに用い得る。
胞接着の性質に関連した種々の応用分野を有している。
例えば、本発明のペプチドを用いてビトロネクチン受容
体含有細胞が細胞培養用の基質に結合するのを効率的に
阻害することができる。別の態様では、この安定化ペプ
チドは、例えば細胞培養基質を被覆することによって、
ビトロネクチン受容体を発現している細胞の接着を促進
するために有用に用いられ得る。さらに、この安定化ペ
プチドは、細胞の付着が望ましい人工補欠物などのイン
ビトロ移植用の材料を被覆するのに用い得る。
【図1】環状ペプチドの粗調製物(a);および精製した
環状ペプチド(b)のHPLC分析のグラフである。
環状ペプチド(b)のHPLC分析のグラフである。
【図2】同じアミノ酸配列を有する環状および直鎖状ペ
プチドの存在下での、正常ラット腎細胞のフィブロネク
チンおよびビトロネクチンへの付着を示すグラフであ
る。
プチドの存在下での、正常ラット腎細胞のフィブロネク
チンおよびビトロネクチンへの付着を示すグラフであ
る。
【図3】実施例3のペプチドの配列および自動エドマン
分解によって回収したその分解産物の回収を示すもので
ある。
分解によって回収したその分解産物の回収を示すもので
ある。
【図4】図3のペプチドの溶液によって得られる旋光度
の変化を温度上昇の関数として記録しており、低温で立
体配座が制限されていることを示す。
の変化を温度上昇の関数として記録しており、低温で立
体配座が制限されていることを示す。
【図5】実施例4のペプチドの軸投影図である。破線よ
り上の残基は親油性であり、破線より下の残基は親水性
である。
り上の残基は親油性であり、破線より下の残基は親水性
である。
【図6】実施例6の環状ペプチドの合成を反応式によっ
て示すものである。
て示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エリッキ・アイ ルオスラーチ アメリカ合衆国 カリフォルニア92067 ランチョ・サンタ・フェ、ピー・オー・ボ ックス1054番
Claims (1)
- 【請求項1】 精製した螺旋状のArg−Gly−As
p含有ペプチドであって、類似の配列を持つ直鎖状ペプ
チドより、高くなったか、あるいは低くなった受容体親
和性で、Arg−Gly−Asp結合受容体と結合する
ペプチド。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US13139087A | 1987-12-10 | 1987-12-10 | |
US131,390 | 1987-12-10 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1500647A Division JP2547263B2 (ja) | 1987-12-10 | 1988-12-08 | 立体配座的に安定化された細胞付着ペプチド |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07165797A true JPH07165797A (ja) | 1995-06-27 |
Family
ID=22449259
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1500647A Expired - Fee Related JP2547263B2 (ja) | 1987-12-10 | 1988-12-08 | 立体配座的に安定化された細胞付着ペプチド |
JP6290238A Pending JPH07165797A (ja) | 1987-12-10 | 1994-11-24 | 立体配座的に安定化された細胞接着ペプチド |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1500647A Expired - Fee Related JP2547263B2 (ja) | 1987-12-10 | 1988-12-08 | 立体配座的に安定化された細胞付着ペプチド |
Country Status (8)
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---|---|
US (2) | US6020460A (ja) |
EP (2) | EP0394326B1 (ja) |
JP (2) | JP2547263B2 (ja) |
AT (1) | ATE140926T1 (ja) |
AU (1) | AU639409B2 (ja) |
CA (1) | CA1341106C (ja) |
DE (1) | DE3855458T2 (ja) |
WO (1) | WO1989005150A1 (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1989005150A1 (en) * | 1987-12-10 | 1989-06-15 | La Jolla Cancer Research Foundation | Conformationally stabilized cell adhesion peptides |
US5827821A (en) * | 1987-12-10 | 1998-10-27 | The Burnham Institute | Conformationally stabilized cell adhesion peptides |
ZW6189A1 (en) * | 1988-05-09 | 1990-05-09 | Smithkline Beckman Corp | Anti-aggregatory peptides |
JP2945680B2 (ja) * | 1988-09-09 | 1999-09-06 | 旭硝子株式会社 | ペプチド誘導体およびその用途 |
US5196510A (en) * | 1988-12-29 | 1993-03-23 | Cytogen Corporation | Molecular recognition units |
US5795867A (en) * | 1989-06-16 | 1998-08-18 | Cor Therapeutics, Inc. | Platelet aggregation inhibitors |
US5686566A (en) * | 1989-06-16 | 1997-11-11 | Cor Therapeutics, Inc. | Platelet aggregation inhibitors |
US5384309A (en) | 1989-07-17 | 1995-01-24 | Genentech, Inc. | Cyclized peptides and their use as platelet aggregation inhibitors |
EP0410539A1 (en) * | 1989-07-28 | 1991-01-30 | Merck & Co. Inc. | Fibrinogen receptor antagonists |
US5061693A (en) * | 1989-07-28 | 1991-10-29 | Merck & Co., Inc. | Fibrinogen receptor antagonists |
CA2021950A1 (en) * | 1989-07-28 | 1991-01-29 | Ruth F. Nutt | Fibrinogen receptor antagonists |
US5023233A (en) * | 1989-07-28 | 1991-06-11 | Merck & Co., Inc. | Fibrinogen receptor antagonists |
US5120859A (en) * | 1989-09-22 | 1992-06-09 | Genentech, Inc. | Chimeric amino acid analogues |
NZ235564A (en) * | 1989-10-13 | 1993-10-26 | Merck & Co Inc | Fibrinogen receptor antagonist and pharmaceutical compositions |
US5643872A (en) * | 1989-10-23 | 1997-07-01 | Smithkline Beecham Corporation | Cyclic anti-aggregatory peptides |
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