JPH07163373A - Multi-cloning vector, manifestation vector and production of foreign protein - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain the subject vector having a promoter region capable of functioning in eucaryotic cells, a multi-cloning site used for introducing a foreign protein structural gene, and recognition site for a specific restriction enzyme, and capable of expressing the foreign protein in a high yield. CONSTITUTION:On introducing a foreign protein structural gene governed by a promoter in down stream of the promoter region of a vector having the promoter capable of functioning in eucaryotic cells, this vector is constituted by forming a ligated portion having a sequence of -ACATGN- by ligating a tip of the foreign protein structural gene cleaved at a restriction enzyme recognition site having a sequence of from 5' side -N'CATGN- (where N is an arbitrary base; N' is a complimentary base to N) to an end of the vector cleaved at a restriction enzyme recognition site having a sequence of from 5' side -ACATGT-, by making the ATG an initiation site for translation, and by making a base next to the ATG as an arbitrary base in combining the cleaved end of restriction enzyme recognition site of the vector side and the cleaved tip of the restriction enzyme recognition site of the foreign protein structural gene side.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、***酵母シゾサッカロ
ミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe 、以下
Ｓ．ｐｏｍｂｅという）による異種蛋白質の生産を可能
とするマルチクローニングベクター、それに異種蛋白質
遺伝子を導入した発現ベクター、その発現ベクターの構
築方法、その発現ベクターを保持したＳ．ｐｏｍｂｅ形
質転換体、およびその形質転換体を用いた異種蛋白質の
製造法に関する。本発明により種々の異種蛋白質の遺伝
子の発現を効率化し、産生するペプチドまたは蛋白質の
製造コストを低下させることができる。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a multicloning vector capable of producing a heterologous protein by the fission yeast Schizosaccharomyces pombe (hereinafter referred to as S. pombe), and an expression vector into which a heterologous protein gene is introduced. , A method of constructing the expression vector, S. The present invention relates to a pombe transformant and a method for producing a heterologous protein using the transformant. INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, the expression of genes of various heterologous proteins can be made efficient and the production cost of the produced peptide or protein can be reduced.

【０００２】[0002]

【従来の技術】遺伝子組換え技術を用いた異種蛋白質の
生産は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli、以下
Ｅ．ｃｏｌｉという）、サッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）、あるいはバチルス（Ba
cillus）属等の微生物、動物細胞（昆虫細胞を含む）、
植物細胞を用いて盛んに行われてきた。様々な生物由来
のポリペプチドが対象と考えられ、既に多くのものが工
業的に生産され、医薬品等に用いられている。2. Description of the Related Art Production of a heterologous protein using gene recombination technology is carried out by Escherichia coli (hereinafter referred to as E. coli), Saccharomyces cerevisiae, or Bacillus (Bacillus).
cillus) microorganisms such as genus, animal cells (including insect cells),
It has been actively carried out using plant cells. Polypeptides derived from various organisms are considered to be targets, and many have been industrially produced and used as pharmaceuticals and the like.

【０００３】しかし、原核生物を用いる方法では必ずし
も全てのポリペプチドに対して有効ではなく、真核生物
由来の蛋白質の複雑な翻訳後修飾あるいは天然体と同じ
立体構造を再現することは必ずしも容易ではない。実
際、原核細胞にて生産された生産物の構造および活性が
不均一であるために医薬品等への利用が拒まれているも
のも知られている(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,3428-34
32(1989)) 。またＥ．ｃｏｌｉには特有のエンドトキシ
ンが存在し、最終製品の夾雑物になる可能性がある。However, the method using prokaryotes is not always effective for all polypeptides, and it is not always easy to reproduce complicated post-translational modifications of eukaryote-derived proteins or the same three-dimensional structures as natural bodies. Absent. In fact, it is known that the production and the activity of the products produced in prokaryotic cells are heterogeneous, and thus their use in medicines is rejected (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86. , 3428-34
32 (1989)). Also, E. Unique endotoxin is present in E. coli and may be a contaminant in the final product.

【０００４】動物細胞や植物細胞を用いる方法は扱いが
微生物より難しく、培養にコストがかかり、得られる細
胞濃度が低いために、生産効率が悪い。このため異種蛋
白質、特に真核生物由来のポリペプチドを生産するため
に最も理想的な生物は、微生物でありかつ真核生物であ
る酵母が最もよいとされている。酵母は、培養方法も確
立しており、真核生物の遺伝情報を発現させるという点
でも都合がよい。さらに、従来より醗酵並びに食品工業
で用いられており、人体に関する安全性も確立され、ま
たエンドトキシンも含まないという特徴も有する。The method using animal cells or plant cells is more difficult to handle than microorganisms, the culture is costly, and the resulting cell concentration is low, resulting in poor production efficiency. Therefore, the most ideal organism for producing a heterologous protein, in particular, a polypeptide derived from eukaryote is the yeast which is a microorganism and a eukaryote. Yeast has a well-established culturing method and is convenient in that it can express the genetic information of eukaryotes. Furthermore, it has been used in the fermentation and food industries for a long time, the safety for human body has been established, and it is characterized by not containing endotoxin.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】酵母類のなかでもＳ．
ｐｏｍｂｅはサッカロミセス・セレビシエよりも動物細
胞に近い性質を持つと考えられている。このため、異種
蛋白質を発現させる宿主としてＳ．ｐｏｍｂｅを用いる
ことによって、動物細胞の場合と同様の、より天然体に
近い遺伝子産物が得られることが期待される。培養方法
も酵母類で共通の点が多く、他の酵母で知られている知
見を容易に応用しうる。したがって、微生物学の方法と
組換えＤＮＡ技術を用いて、Ｓ．ｐｏｍｂｅを用いた異
種蛋白質生産法を用いることが有利であるのは明白であ
る。Among the yeasts, S.
Pombe is believed to have properties closer to animal cells than Saccharomyces cerevisiae. Therefore, as a host for expressing a heterologous protein, S. It is expected that by using the pombe, a gene product similar to that in the animal cell, which is closer to the natural form, can be obtained. The culturing methods also have a lot in common with yeasts, and the knowledge known for other yeasts can be easily applied. Therefore, using methods of microbiology and recombinant DNA technology, S. Obviously, it is advantageous to use a method for heterologous protein production using pombe.

【０００６】ところが、Ｓ．ｐｏｍｂｅを用いた遺伝子
組換えに関する研究はＥ．ｃｏｌｉやサッカロミセス・
セレビシエに比べてかなり遅れており、特に遺伝子発現
に関する研究は少ない。たとえば、特開昭６１−１８１
３９７号公報、特開平２−２８３２８８号公報、および
特開平４−６３５９６号公報等があるにすぎない。この
原因は強力なプロモータを持ち、菌体内に安定に存在
し、かつ遺伝子を導入するのに最適かつ簡便な発現ベク
ターが存在しないためである。However, S. Studies on gene recombination using pombe are described in E. coli and Saccharomyces
It lags far behind S. cerevisiae, and there are few studies on gene expression. For example, JP-A-61-181
There are only 397, JP-A-2-283288, and JP-A-4-63596. This is because there is no expression vector that has a strong promoter, is stably present in the bacterial cell, and is optimal and convenient for gene transfer.

【０００７】本発明者らは、上記問題を解決しうる発現
ベクターを提案した（特開平５−１５３８０号公報参
照）。しかし、この発現ベクターを用いて異種蛋白質遺
伝子を過不足なく発現するにはいまだ必ずしも充分とい
えるものではなく、発現ベクターのさらなる改良が求め
られている。The present inventors have proposed an expression vector capable of solving the above problems (see Japanese Patent Laid-Open No. 15380/1993). However, it cannot be said that the expression vector is sufficient for expressing a heterologous protein gene without excess or deficiency, and further improvement of the expression vector is required.

【０００８】[0008]

【課題を解決するための手段】本発明者は以上の点に鑑
み検討を行った結果、異種蛋白質遺伝子の翻訳開始部位
を制限酵素認識部位に改変することによって、目的とす
る異種蛋白質遺伝子を過不足なく発現することが可能な
発現ベクターを構築するに至った。本発明は、Ｓ．ｐｏ
ｍｂｅによる異種蛋白質の生産を可能とするマルチクロ
ーニングベクター、それに異種蛋白質遺伝子を導入した
発現ベクター、その発現ベクターの構築方法、その発現
ベクターを保持したＳ．ｐｏｍｂｅ形質転換体、および
その形質転換体を用いた異種蛋白質の製造法に関する、
下記の発明である。Means for Solving the Problems As a result of investigations in view of the above points, the present inventor has found that the heterologous protein gene of interest can be replaced by modifying the translation initiation site of the heterologous protein gene into a restriction enzyme recognition site. We have constructed an expression vector that can express without deficiency. The present invention relates to S. po
A multi-cloning vector capable of producing a heterologous protein by mbe, an expression vector into which a heterologous protein gene is introduced, a method for constructing the expression vector, and an S. The present invention relates to a pombe transformant and a method for producing a heterologous protein using the transformant,
It is the following invention.

【０００９】（１）真核細胞内において機能しうるプロ
モーター領域を有し、かつそのプロモーターによって支
配される異種蛋白質構造遺伝子を導入するためのマルチ
クローニングサイトをそのプロモーター領域の下流に有
するベクターであり、そのベクターのマルチクローニン
グサイト先端部分における異種蛋白質構造遺伝子を導入
するための制限酵素認識部位が、５’側から−ＡＣＡＴ
ＧＴ−なる配列を有する制限酵素認識部位であることを
特徴とするマルチクローニングベクター。(1) A vector having a promoter region capable of functioning in eukaryotic cells and having a multi-cloning site for introducing a heterologous protein structural gene controlled by the promoter downstream of the promoter region The restriction enzyme recognition site for introducing a heterologous protein structural gene at the tip of the multi-cloning site of the vector has -ACAT from the 5'side.
A multi-cloning vector which is a restriction enzyme recognition site having a sequence GT-.

【００１０】（２）真核細胞内において機能しうるプロ
モーター領域、およびそのプロモーター領域下流にその
プロモーターによって支配された異種蛋白質構造遺伝子
を有し、異種蛋白質構造遺伝子先端部分が５’側から−
ＡＣＡＴＧＮ−（Ｎは任意の塩基）なる配列を有し、こ
の配列におけるＡＴＧが異種蛋白質構造遺伝子の翻訳開
始部位であり、しかもこの配列がベクターに異種蛋白質
構造遺伝子が導入された際の制限酵素認識部位に由来す
る配列であることを特徴とする発現ベクター。(2) A promoter region capable of functioning in a eukaryotic cell, and a heterologous protein structural gene under the control of the promoter region downstream of the promoter region.
It has a sequence of ACATGN- (N is an arbitrary base), ATG in this sequence is the translation initiation site of the heterologous protein structural gene, and this sequence recognizes a restriction enzyme when the heterologous protein structural gene is introduced into the vector. An expression vector, which is a sequence derived from a site.

【００１１】（３）真核細胞内において機能しうるプロ
モーター領域を有するベクターのプロモーター領域下流
にそのプロモーターによって支配される異種蛋白質構造
遺伝子を導入する方法において、５’側から−ＡＣＡＴ
ＧＴ−なる配列を有する制限酵素認識部位で切断したベ
クター末端に５’側から−Ｎ’ＣＡＴＧＮ−（Ｎは任意
の塩基、Ｎ’はＮに相補的な塩基）なる配列を有する制
限酵素認識部位で切断した異種蛋白質構造遺伝子の先端
を連結して−ＡＣＡＴＧＮ−なる配列の連結部分を形成
し、その連結部分のＡＴＧを異種蛋白質構造遺伝子の翻
訳開始部位とし、しかもベクター側の制限酵素認識切断
部末端と異種蛋白質構造遺伝子側の制限酵素認識切断部
先端の組合せによりＡＴＧの次の塩基をＡ、Ｔ、Ｇ、お
よびＣから選ばれる任意の塩基とすることを特徴とする
真核細胞内で発現しうる発現ベクターの構築方法。(3) In the method of introducing a heterologous protein structural gene controlled by a promoter downstream of the promoter region of a vector having a promoter region capable of functioning in eukaryotic cells, from the 5'side to -ACAT
A restriction enzyme recognition site having a sequence of -N'CATGN- (N is an arbitrary base, N'is a complementary base to N) from the 5'side at the end of the vector cleaved at the restriction enzyme recognition site having the sequence GT- The ends of the heterologous protein structural gene cleaved by the above are ligated to form a ligation part of the sequence -ACATGN-, and the ATG of the ligation part is used as the translation initiation site of the heterologous protein structural gene, and the restriction enzyme recognition cleavage part on the vector side. Expression in a eukaryotic cell characterized by setting the base next to ATG to an arbitrary base selected from A, T, G, and C by a combination of the end and the end of a restriction enzyme recognition cleavage site on the side of a structural gene of a heterologous protein Of possible expression vectors.

【００１２】（４）上記の発現ベクターまたはその発現
ベクターと複製開始点を有する酵母ベクターとの組換え
体を保持するシゾサッカロミセス・ポンベからなる形質
転換体。(4) A transformant comprising Schizosaccharomyces pombe carrying the above expression vector or a recombinant of the expression vector and a yeast vector having an origin of replication.

【００１３】（５）上記の形質転換体を培養し、培養物
中に異種蛋白質を生成蓄積させ、これを採取することを
特徴とする異種蛋白質の製造法。(5) A method for producing a heterologous protein, which comprises culturing the above transformant, producing and accumulating the heterologous protein in the culture, and collecting the heterologous protein.

【００１４】Ｓ．ｐｏｍｂｅにおいて機能しうるマルチ
クローニングベクターに異種蛋白質構造遺伝子を導入す
るにあたり、異種蛋白質構造遺伝子を含む遺伝子とマル
チクローニングベクターをそれぞれ制限酵素で処理して
切断し、両者を連結（ライゲーション）して発現ベクタ
ーを構築する。本発明では、このとき、異種蛋白質構造
遺伝子を含む遺伝子とマルチクローニングベクターの制
限酵素認識部位はそれぞれＡＴＧを含み、切断後異種蛋
白質構造遺伝子を含む遺伝子の先端（５’末端）とマル
チクローニングベクターの末端（３’末端）を連結し、
いずれかの末端部分に存在するＡＴＧを異種蛋白質構造
遺伝子の翻訳開始部位とする。たとえば、異種蛋白質構
造遺伝子を含む遺伝子の先端がＡＴＧを含む場合、それ
に対応するマルチクローニングベクターの末端のアンチ
コード鎖部分にはＴＡＣを含む。逆に、マルチクローニ
ングベクターの末端がＡＴＧを含む場合、それに対応す
る異種蛋白質構造遺伝子を含む遺伝子の先端のアンチコ
ード鎖部分にはＴＡＣを含む。S. In introducing a heterologous protein structural gene into a multi-cloning vector that can function in pombe, the gene containing the heterologous protein structural gene and the multi-cloning vector are each treated with a restriction enzyme, cut, and ligated to form an expression vector. To build. In the present invention, at this time, the gene containing the heterologous protein structural gene and the restriction enzyme recognition site of the multi-cloning vector each contain ATG, and the end (5 ′ end) of the gene containing the heterologous protein structural gene after cleavage and the multi-cloning vector Connect the ends (3 'end),
The ATG present at either end is used as the translation initiation site of the heterologous protein structural gene. For example, when the tip of a gene containing a heterologous protein structural gene contains ATG, the corresponding anti-coding strand portion of the end of the multi-cloning vector contains TAC. On the contrary, when the end of the multi-cloning vector contains ATG, TAC is contained in the anti-coding strand at the tip of the gene containing the corresponding heterologous protein structural gene.

【００１５】種々の異種蛋白質構造遺伝子の導入を可能
とするためには、上記ＡＴＧの次の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、
Ｃのいずれであっても上記構築手段が適用できることが
好ましい。このため、マルチクローニングベクター側の
制限酵素認識切断部と異種蛋白質構造遺伝子側の制限酵
素認識切断部との組合せを選択して、ＡＴＧの次の塩基
をＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの任意のものとする手段の採用が好ま
しい。このような手段が適用できる、種々の異種蛋白質
構造遺伝子の導入が可能なマルチクローニングベクター
は、異種蛋白質構造遺伝子導入部位であるマルチクロー
ニングサイトを有する。In order to allow the introduction of various heterologous protein structural genes, the following bases of ATG are A, T, G,
It is preferable that the above construction means can be applied to any of C. Therefore, a combination of a restriction enzyme recognition cleavage site on the multi-cloning vector side and a restriction enzyme recognition cleavage site on the heterologous protein structural gene side is selected, and the next base of ATG can be any of A, T, G and C. It is preferable to adopt the means. A multi-cloning vector into which various heterologous protein structural genes can be introduced, to which such means can be applied, has a multi-cloning site which is a heterologous protein structural gene introduction site.

【００１６】本発明におけるマルチクローニングベクタ
ーの異種蛋白質構造遺伝子導入部位となる制限酵素認識
部位は、５’側から−ＡＣＡＴＧＴ−なる制限酵素認識
部位である。この制限酵素認識部位を５’側から−Ａあ
るいは−ＡＣＡＴＧなる末端を形成する制限酵素で切断
し、その末端に対応する先端を有する異種蛋白質構造遺
伝子を連結する。このための制限酵素としては、Ａｆｌ
ＩＩＩまたはＮｓｐＩが用いられる。また、ベクター
側の連結部位に−ＡＣＡＴＧＴ−なる配列を形成するに
は、これ以外の種々の連結部位を有するベクターの改変
により（たとえばＰＣＲ法を用いて）行うことができ
る。The restriction enzyme recognition site serving as the heterologous protein structural gene introduction site of the multi-cloning vector of the present invention is a restriction enzyme recognition site of -ACATGT- from the 5'side. This restriction enzyme recognition site is cleaved from the 5'side with a restriction enzyme forming an end called -A or -ACATG, and a heterologous protein structural gene having a tip corresponding to the end is ligated. As a restriction enzyme for this, Afl
III or NspI is used. Further, the formation of the sequence -ACATGT- at the vector-side ligation site can be performed by modifying the vector having various other ligation sites (for example, by using the PCR method).

【００１７】ベクター側末端に対応する先端を有する異
種蛋白質構造遺伝子は、異種蛋白質構造遺伝子を含む遺
伝子より制限酵素で切り出されたもので、その制限酵素
は−Ａあるいは−ＡＣＡＴＧなるベクター側末端に対応
する先端を形成しうる制限酵素である。異種蛋白質構造
遺伝子を切断する制限酵素は、−Ｎ’ＣＡＴＧＮ−（Ｎ
は任意の塩基、Ｎ’はＮに相補的な塩基）なる制限酵素
認識部位を認識し、ＣＡＴＧＮ−あるいはＮ−なる先端
を形成する制限酵素である。このための制限酵素として
は、Ｎｃｏ Ｉ、Ｂｓｐ ＨＩ、Ａｆｌ ＩＩＩ、Ｎｓ
ｐ Ｉ、またはＳｐｈ Ｉが用いられる。この制限酵素
認識部位が異種蛋白質構造遺伝子の先端部分に存在しな
い場合は、たとえば部位特異的変異導入法やＰＣＲ法を
用いて異種蛋白質構造遺伝子の先端部分にこの制限酵素
認識部位を配置することができる。The heterologous protein structural gene having a tip corresponding to the vector side end is one excised with a restriction enzyme from the gene containing the heterologous protein structural gene, and the restriction enzyme corresponds to the vector side end of -A or -ACATG. It is a restriction enzyme that can form a tip. A restriction enzyme that cleaves a heterologous protein structural gene is -N'CATGN- (N
Is an arbitrary base and N'is a restriction enzyme which recognizes a restriction enzyme recognition site of N) and forms a tip of CATGN- or N-. Restriction enzymes for this purpose include Nco I, Bsp HI, Afl III, Ns
p I or Sph I is used. If this restriction enzyme recognition site does not exist at the tip of the heterologous protein structural gene, it is possible to arrange the restriction enzyme recognition site at the tip of the heterologous protein structural gene using, for example, site-directed mutagenesis or PCR. it can.

【００１８】上記ベクター側末端−Ａと異種蛋白質構造
遺伝子側先端ＣＡＴＧＮ−の組合せ、または、上記ベク
ター側末端−ＡＣＡＴＧと異種蛋白質構造遺伝子側先端
Ｎ−の組合せ、を連結することにより、−ＡＣＡＴＧＮ
−なる連結部が形成される。その配列の内のＡＴＧが異
種蛋白質構造遺伝子の翻訳開始部位となる。しかもＡＴ
Ｇの次のＮは、上記したような制限酵素の組合せにより
任意のものとすることができ、これにより使用し得る異
種蛋白質構造遺伝子の制約が全くなくなる。このための
制限酵素の組合せとしては特に下記の組合せが好まし
い。By combining the vector-side end-A and the heterologous protein structural gene-side tip CATGN- or the vector-side terminal-ACATG and the heterologous protein structural gene-side tip N-, the combination of -ACATGN
A connecting portion is formed. ATG in that sequence serves as the translation initiation site of the heterologous protein structural gene. Moreover, AT
The N next to G can be made arbitrary by the combination of the restriction enzymes as described above, whereby the restriction of the structural gene of the heterologous protein that can be used is completely eliminated. As a combination of restriction enzymes for this purpose, the following combinations are particularly preferable.

【００１９】ベクターを切断する制限酵素としてＡｆｌ
ＩＩＩまたはＮｓｐ Ｉを用い、異種蛋白質構造遺伝
子を含む遺伝子を切断する制限酵素としてＮｃｏ Ｉ、
Ｂｓｐ ＨＩ、Ａｆｌ ＩＩＩ、Ｎｓｐ Ｉ、またはＳ
ｐｈ Ｉを用い、これらを組合せてＡＴＧの次の塩基を
Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの任意のものとする手段の例を表１に示
す。これらの制限酵素はいずれも６塩基パリンドローム
配列を認識し、この認識部位のセンス鎖の５’端から１
番目と２番目の塩基の間または５番目と６番目の塩基の
間、および、アンチコード鎖の３’端から１番目と２番
目の塩基の間または５番目と６番目の塩基の間で切断す
る制限酵素の１種である。この場合、表１の連結後の構
造に示すように、連結部６塩基の配列は５’−ＡＣＡＴ
ＧＮ−３’からなり、組合せを選択することによりその
翻訳開始コドンＡＴＧの次のＮをＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの任意
の塩基とすることができる。なお、表１中においてもＮ
はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかを表す（ただし、表中のア
ンチコード鎖のＮはコード鎖のＮに対応するものを表す
ものとする）。Afl is used as a restriction enzyme for cutting the vector.
III or Nsp I and Nco I as a restriction enzyme for cleaving a gene containing a heterologous protein structural gene,
Bsp HI, Afl III, Nsp I, or S
Table 1 shows an example of means for using ph I and combining them to make the next base of ATG any of A, T, G, and C. All of these restriction enzymes recognize the 6-base palindromic sequence, and the 1'from the 5'end of the sense strand at this recognition site
Cut between the 2nd and 2nd bases or between the 5th and 6th bases, and between the 1st and 2nd bases or the 5th and 6th bases from the 3'end of the anticoding strand. It is a kind of restriction enzyme. In this case, as shown in the structure after ligation in Table 1, the sequence of 6 bases at the ligation site was 5'-ACAT.
GN-3 ′, and by selecting the combination, the N next to the translation initiation codon ATG can be any base of A, T, G, and C. In Table 1, N
Represents any of A, T, G, and C (provided that N in the anticoding chain in the table corresponds to N in the coding chain).

【００２０】[0020]

【表１】 [Table 1]

【００２１】本発明のマルチクローニングベクターおよ
び発現ベクターは、導入される（あるいは導入された）
異種蛋白質構造遺伝子の発現を制御するプロモーター領
域を含む。このプロモーターはその下流に導入された前
記異種蛋白質構造遺伝子の発現を支配する。このプロモ
ーターは真核細胞内において機能しうるものであり、具
体的にはＳ．ｐｏｍｂｅ細胞内において機能しうる必要
がある。The multi-cloning vector and expression vector of the present invention are introduced (or introduced).
It contains a promoter region that controls the expression of a heterologous protein structural gene. This promoter controls the expression of the heterologous protein structural gene introduced downstream thereof. This promoter is capable of functioning in eukaryotic cells, and specifically, S. It must be able to function in pombe cells.

【００２２】上記プロモーターはＳ．ｐｏｍｂｅ内で機
能できるものであり、かつ導入された異種蛋白質構造遺
伝子の転写を促進するものである。このプロモーターと
しては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子
プロモーター、ヒトサイトメガロウィルス遺伝子プロモ
ーター、ヒトコリオニックゴナドロピンα遺伝子プロモ
ーター等がある。特に動物細胞ウィルス由来のプロモー
ターなどの転写を強力に促進するもの（R.Toyama et a
l.,FEBS Lett,268,217-221(1990) ）であることが好ま
しい。このような好ましいプロモーターとしては、動物
細胞ウィルス由来のプロモーター、特にヒトサイトメガ
ロウィルス遺伝子のプロモーターがある。The above promoter is S. It is capable of functioning in the pombe and promotes transcription of the introduced heterologous protein structural gene. Examples of this promoter include an alcohol dehydrogenase gene promoter, a human cytomegalovirus gene promoter, and a human chorionic gonadropin α gene promoter. Especially those that strongly promote transcription of promoters derived from animal cell viruses (R. Toyama et a
l., FEBS Lett, 268, 217-221 (1990)). Such preferred promoters include promoters derived from animal cell viruses, particularly promoters of human cytomegalovirus gene.

【００２３】本発明のベクターは、さらに必要により、
抗生物質耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子、異種蛋白質
を細胞外に分泌させるためのシグナルペプチドコード遺
伝子、その他の種々の遺伝子を有していてもよい。ま
た、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞内で機能しうるプロモ
ーターや薬剤耐性遺伝子等を組み込んでシャトルベクタ
ーとすることもできる。The vector of the present invention may further contain, if necessary,
It may have a drug resistance gene such as an antibiotic resistance gene, a signal peptide coding gene for secreting a heterologous protein extracellularly, and other various genes. In addition, E. It is also possible to incorporate a promoter capable of functioning in prokaryotic cells such as E. coli, a drug resistance gene and the like into a shuttle vector.

【００２４】発現ベクターが細胞内で発現するためには
複製開始点を有することが必要である。しかし、上記本
発明のマルチクローニングベクターや発現ベクターは必
ずしも複製開始点を有している必要はない。複製開始点
は発現ベクター構築後に導入することができる。また、
複製開始点を有しない発現ベクターを細胞内に入れ込ん
だ後細胞内でその発現ベクターに自動的に複製開始点を
導入できる。これらの複製開始点導入手段は公知であ
る。たとえば酵母内で機能し得る複製開始点を有するベ
クター（以下酵母ベクターという）を本発明の発現ベク
ターに組み込むことができる（特開平５−１５３８０号
公報参照）。また、本発明の発現ベクターと酵母ベクタ
ーを１つの細胞内に入れ込み、細胞内で自動的に両者を
融合させることができる。このような複製開始点導入手
段を採用できることより、本発明の発現ベクターは複製
開始点を有していてもよく、有していなくてもよい。同
様に本発明のマルチクローニングベクターも複製開始点
を有していてもよく、有していなくてもよい。ただし、
いかなる場合でも細胞内で発現ベクターの発現が起こる
ためには、最終的にはベクターに複製開始点が必要であ
る。It is necessary for an expression vector to have an origin of replication for expression in cells. However, the above-mentioned multicloning vector or expression vector of the present invention does not necessarily have to have a replication origin. The origin of replication can be introduced after the construction of the expression vector. Also,
After inserting an expression vector having no replication origin into a cell, the replication origin can be automatically introduced into the expression vector in the cell. Means for introducing these replication origins are known. For example, a vector having a replication origin capable of functioning in yeast (hereinafter referred to as yeast vector) can be incorporated into the expression vector of the present invention (see JP-A-5-15380). Further, the expression vector of the present invention and the yeast vector can be put into one cell to automatically fuse the both in the cell. Since such a replication origin introducing means can be adopted, the expression vector of the present invention may or may not have a replication origin. Similarly, the multi-cloning vector of the present invention may or may not have an origin of replication. However,
In all cases, the vector ultimately requires an origin of replication for the expression of the expression vector to occur in the cell.

【００２５】ベクターに抗生物質耐性遺伝子などの薬剤
耐性遺伝子を組み込むことはクローニングのためやマー
カーとして用いるために通常必須である。本発明のベク
ターにおいても抗生物質耐性遺伝子とその転写を促進す
るプロモーター（以下第２のプロモーターという）を有
していることが好ましい。この第２のプロモーターは、
前記異種蛋白質構造遺伝子の転写を促進するプロモータ
ーに比較してそれよりも転写促進活性の低いものである
ことが好ましい。しかもこの第２のプロモーターとして
は、動物細胞ウィルス由来のプロモーター、特にＳＶ４
０初期プロモーターが好ましい。この第２のプロモータ
ーに支配される抗生物質耐性遺伝子としては、通常のも
のであってよいが、特に本発明においてはネオマイシン
耐性遺伝子が好ましい。Incorporation of a drug resistance gene such as an antibiotic resistance gene into a vector is usually essential for cloning and for use as a marker. It is preferable that the vector of the present invention also has an antibiotic resistance gene and a promoter that promotes its transcription (hereinafter referred to as a second promoter). This second promoter is
It is preferable that the transcription promoting activity is lower than that of the promoter that promotes the transcription of the heterologous protein structural gene. Moreover, as the second promoter, a promoter derived from an animal cell virus, particularly SV4
The 0 early promoter is preferred. The antibiotic resistance gene controlled by the second promoter may be a usual one, but a neomycin resistance gene is particularly preferable in the present invention.

【００２６】本発明においては、抗生物質耐性遺伝子を
有する発現ベクターを使用することによって異種蛋白質
発現量を増大させることが可能となる。このためには第
２のプロモーターは前記異種蛋白質構造遺伝子を支配す
るプロモーターよりも転写促進活性が低い必要がある。
たとえば上記のようなＳＶ４０初期プロモーターとそれ
によって支配されるネオマイシン耐性遺伝子とを有する
発現ベクターを保持するＳ．ｐｏｍｂｅを培養する場合
を例にとって説明する。このＳ．ｐｏｍｂｅ形質転換体
をＧ４１８（ネオマイシン）含有培地で培養すると、培
地中のＧ４１８濃度に依存して菌体内で発現ベクターの
コピー数が増す。したがって、Ｇ４１８濃度を高くする
ことにより菌体内で発現ベクターのコピー数を多くする
ことができ、その結果異種蛋白質発現量を増大させるこ
とができる。この際、第２のプロモーターの活性が異種
蛋白質構造遺伝子を支配するプロモーターよりも高活性
であると、発現ベクターのコピー数が少なくても充分な
ネオマイシン耐性蛋白質（酵素）が生産されるために発
現ベクターのコピー数を増やす必要がなくなり、目的と
する異種蛋白質発現量を増大させることができない。In the present invention, the expression level of a heterologous protein can be increased by using an expression vector having an antibiotic resistance gene. For this purpose, the second promoter needs to have a lower transcription-promoting activity than the promoter controlling the heterologous protein structural gene.
For example, S. cerevisiae harboring an expression vector having the SV40 early promoter and the neomycin resistance gene controlled by it as described above. The case of culturing pombe will be described as an example. This S. When the pombe transformant is cultured in a G418 (neomycin) -containing medium, the copy number of the expression vector increases in the cells depending on the concentration of G418 in the medium. Therefore, by increasing the G418 concentration, the copy number of the expression vector can be increased in the cells, and as a result, the expression amount of the heterologous protein can be increased. At this time, if the activity of the second promoter is higher than that of the promoter governing the heterologous protein structural gene, expression will be sufficient because a sufficient neomycin resistance protein (enzyme) is produced even if the copy number of the expression vector is small. It is not necessary to increase the copy number of the vector, and it is not possible to increase the expression level of the target heterologous protein.

【００２７】図４に本発明のマルチクローニングベクタ
ーの例として実施例で作成したｐＴＬ２Ｍの制限酵素切
断地図を示す。このｐＴＬ２Ｍは大略５，０００ｂｐ
（より正確には約５，０００±２００ｂｐ）の大きさ
で、ヒトサイトメガロウィルス遺伝子（ｈＣＭＶ）のプ
ロモーター領域、プロモーター領域とマルチクローニン
グサイト（ＭＣＳ）を連結する非翻訳領域（５’−ＵＴ
Ｒ）、および異種蛋白質構造遺伝子を導入するためのＭ
ＣＳを時計回り方向にこの順に有する。ＭＣＳ先端に前
記した特定の制限酵素認識部位が存在する。一方さら
に、上記ｈＣＭＶプロモーター領域先端付近から反時計
方向回りに、ＳＶ４０プロモーター領域、およびネオマ
イシン耐性遺伝子（Ｎｍ^R ）をこの順に有する。また、
さらにＮｍ^R の下流域に前記したように、Ｅ．ｃｏｌｉ
などの原核細胞内で機能しうる薬剤耐性遺伝子であるア
ンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ^R ）を有し、また図示され
ているようにＳＶ４０ターミネーター（２か所）、原核
細胞内で機能する複製開始点（Ｏｒｉ）、および下流側
非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）を有する。FIG. 4 shows a restriction enzyme digestion map of pTL2M prepared in Examples as an example of the multicloning vector of the present invention. This pTL2M is approximately 5,000 bp
(More accurately, about 5,000 ± 200 bp), a promoter region of the human cytomegalovirus gene (hCMV), and an untranslated region (5′-UT) that connects the promoter region and the multicloning site (MCS).
R), and M for introducing a heterologous protein structural gene
It has CS in this order in the clockwise direction. The specific restriction enzyme recognition site described above is present at the MCS tip. On the other hand, it further has an SV40 promoter region and a neomycin resistance gene (Nm ^R ) in this order in the counterclockwise direction from the vicinity of the tip of the hCMV promoter region. Also,
Further, in the downstream region of Nm ^R , as described above, E. coli
Has an ampicillin resistance gene (Ap ^R ) which is a drug resistance gene capable of functioning in prokaryotic cells such as SV40 terminator (2 places), and an origin of replication functioning in prokaryotic cells ( Ori), and the downstream untranslated region (3′-UTR).

【００２８】上記非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）は、プロ
モーター領域の末端（通常ＴＡＴＡなる配列）と翻訳開
始コドンＡＴＧの間に存在する配列である。この非翻訳
領域の長さが翻訳活性に影響することが少なくない。本
発明におけるベクターのこの部分の長さは２０〜２００
ｂｐであることが好ましい。より好ましくは３０〜１０
０ｂｐである。図示したｐＴＬ２Ｍでは約５６ｂｐであ
る。The untranslated region (5'-UTR) is a sequence existing between the end of the promoter region (usually TATA sequence) and the translation initiation codon ATG. The length of this untranslated region often affects translational activity. The length of this part of the vector in the present invention is 20-200.
It is preferably bp. More preferably 30 to 10
It is 0 bp. In the illustrated pTL2M, it is about 56 bp.

【００２９】図示したｐＴＬ２Ｍ自体は真核細胞内で機
能し得る複製開始点を有していない。このｐＴＬ２Ｍを
使用するにあたっては真核細胞内で機能し得る複製開始
点を導入する必要がある。真核細胞内で機能し得る複製
開始点を有する配列やその配列を有するベクターは公知
であり、これを用いてｐＴＬ２Ｍに複製開始点を導入す
ることができる。Ｓ．ｐｏｍｂｅ細胞内で機能し得る複
製開始点を有す公知のベクターとしては、たとえばｐＡ
Ｕ５やｐＡＬ７がある（K.Okazaki et.al.,Nucleic Aci
ds Res.,18,6485-6489(1990)、K.Okayama et.al.,Molec
ular CellularBiol.,3,280-289(1983) ）。これら酵母
ベクターは自動複製配列（ａｒｓ）と安定化配列（ｓｔ
ｂ）を有し、さらに選択マーカーや抗生物質耐性遺伝子
を有する。この酵母ベクターをｐＴＬ２Ｍに組み込むこ
とにより、Ｓ．ｐｏｍｂｅ細胞内で複製し得るマルチク
ローニングベクターが得られる。同様に、マルチクロー
ニングベクターに異種蛋白質構造遺伝子を導入した発現
ベクターにこの酵母ベクターを組み込むことにより、
Ｓ．ｐｏｍｂｅ細胞内で複製し得る発現ベクターが得ら
れる。この酵母ベクターを組み込んで発現ベクターを構
築する方法については、上記文献のほか、本発明者らの
発明にかかわる特開平５−１５３８０号公報に記載され
ている。The illustrated pTL2M itself does not have an origin of replication capable of functioning in eukaryotic cells. To use this pTL2M, it is necessary to introduce a replication origin capable of functioning in eukaryotic cells. A sequence having a replication origin capable of functioning in eukaryotic cells and a vector having the sequence are known, and a replication origin can be introduced into pTL2M by using this. S. Known vectors having an origin of replication that can function in pombe cells include, for example, pA.
There are U5 and pAL7 (K.Okazaki et.al., Nucleic Aci
ds Res., 18,6485-6489 (1990), K.Okayama et.al., Molec.
ular Cellular Biol., 3,280-289 (1983)). These yeast vectors have automatic replication sequences (ars) and stabilizing sequences (st).
b), and further has a selection marker and an antibiotic resistance gene. By incorporating this yeast vector into pTL2M, S. A multi-cloning vector is obtained which can replicate in pombe cells. Similarly, by incorporating this yeast vector into an expression vector in which a heterologous protein structural gene has been introduced into a multi-cloning vector,
S. An expression vector is obtained which can replicate in pombe cells. A method for constructing an expression vector by incorporating this yeast vector is described in Japanese Patent Laid-Open No. 15380/1993 related to the inventions of the present inventors, in addition to the above-mentioned documents.

【００３０】一般に、大きなベクターを細胞に入れ込む
ことは困難なことが少なくない。上記ｐＴＬ２Ｍ自体比
較的大きなベクターであり、これに上記酵母ベクターを
組み込んで酵母細胞に入れ込むことは比較的困難であ
る。これを解決する手段としては上記酵母ベクター（通
常は制限酵素で切断した線状のＤＮＡを用いる）と本発
明のマルチクローニングベクターないし発現ベクターと
を別々に同一の細胞に入れ込む方法がある。この場合、
酵母ベクターは細胞内で自動的にマルチクローニングベ
クターないし発現ベクターに組み込まれ、上記したよう
な複製開始点を有するベクターが自動的に構築される。
後述実施例ではこの方法を用いてＳ．ｐｏｍｂｅの形質
転換を行った。In general, it is often difficult to insert a large vector into a cell. The pTL2M itself is a relatively large vector, and it is relatively difficult to incorporate the yeast vector into the pTL2M and insert it into a yeast cell. As a means for solving this, there is a method in which the above yeast vector (usually using linear DNA cleaved with a restriction enzyme) and the multicloning vector or expression vector of the present invention are separately put into the same cell. in this case,
The yeast vector is automatically incorporated into the multi-cloning vector or expression vector in the cell, and the vector having the replication origin as described above is automatically constructed.
In the examples described below, S. Transformation of pombe was performed.

【００３１】マルチクローニングベクターおよび発現ベ
クターを構築するための一般的手法は公知であり、たと
えば文献「J.Sambrook et al., "Molecular Cloning 2n
d ed.", Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)
」に記載されている。本発明のマルチクローニングベ
クターおよび発現ベクターはこの一般的手法を用い前記
した方法で構築することができる。発現ベクターの宿主
として本発明で用いるＳ．ｐｏｍｂｅの菌株としては、
たとえばＡＴＣＣ ３８３９９（ｌｅｕ１−３２ｈ−）
またはＡＴＣＣ ３８４３６（ｕｒａ４−２９４ｈ−等
が挙げられ、これらは、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション(American Type CultureCollection)
から入手可能である。General techniques for constructing multicloning and expression vectors are well known and are described, for example, in the literature “J. Sambrook et al.,“ Molecular Cloning 2n.
d ed. ", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)
"It is described in. The multi-cloning vector and expression vector of the present invention can be constructed by the method described above using this general method. S. cerevisiae used in the present invention as a host for expression vectors. As the pombe strain,
For example, ATCC 38399 (leu1-32h-)
Or ATCC 38436 (ura4-294h-, etc. are mentioned, These are American Type Culture Collection (American Type Culture Collection)
Available from.

【００３２】発現ベクターを用いてＳ．ｐｏｍｂｅを形
質転換する方法は公知であり、たとえば酢酸リチウム法
（K.Okazaki et al.,Nucleic Acids Res.,18,6485-6489
(1990)) 等によって、Ｓ．ｐｏｍｂｅの形質転換体が得
られる。形質転換体を培養するための培地は公知であ
り、ＹＰＤ培地等の栄養培地（M.D.Rose et al.,"Metho
ds In Yeast Genetics",Cold Spring Harbor Laborator
y Press(1990))あるいはＭＢ培地等の最少培地（K.Okaz
aki et al.,Nucleic Acids Res.,18,6485-6489(1990))
等を用いることができる。形質転換体の培養は、通常１
６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で、８〜１６８時
間、好ましくは４８〜９６時間行う。振盪培養と静置培
養のいずれも可能であるが、必要に応じて撹拌や通気を
加えてもよい。The expression vector was used to transform S. Methods for transforming pombe are known, for example, the lithium acetate method (K. Okazaki et al., Nucleic Acids Res., 18,6485-6489).
(1990)). A transformant of pombe is obtained. A medium for culturing the transformant is known, and a nutrient medium such as YPD medium (MDRose et al., "Metho
ds In Yeast Genetics ", Cold Spring Harbor Laborator
y Press (1990)) or minimal medium such as MB medium (K.Okaz
aki et al., Nucleic Acids Res., 18,6485-6489 (1990))
Etc. can be used. Cultivation of transformants is usually 1
It is carried out at 6 to 42 ° C., preferably 25 to 37 ° C. for 8 to 168 hours, preferably 48 to 96 hours. Both shaking culture and stationary culture are possible, but stirring and aeration may be added as necessary.

【００３３】培養物中に産生した蛋白質の単離・精製法
としては、公知の、塩析または溶媒沈澱法等の溶解度の
差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電気泳動
法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマト
グラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方
法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を
利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用
する方法等が挙げられる。As a method for isolating and purifying the protein produced in the culture, known methods such as salting out or solvent precipitation, which utilize the difference in solubility, dialysis, ultrafiltration or gel electrophoresis, etc., can be used. Utilizing difference in molecular weight, utilizing difference in charge such as ion exchange chromatography, utilizing specific affinity such as affinity chromatography, utilizing difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography And a method of utilizing a difference in isoelectric points such as an isoelectric focusing method.

【００３４】単離・精製した蛋白質の確認方法として
は、公知の、ウエスタンブロッティング法または活性測
定法等が挙げられる。また精製された蛋白質は、アミノ
酸分析、アミノ末端分析、一次構造解析などによりその
構造を明らかにすることができる。As a method for confirming the isolated / purified protein, a known Western blotting method or activity measuring method can be mentioned. The structure of the purified protein can be clarified by amino acid analysis, amino terminal analysis, primary structure analysis and the like.

【００３５】[0035]

【実施例】以下実施例によって、本発明をより具体的に
説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその
技術範囲が限定されるものではない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by these examples.

【００３６】なお、以下において、実施例１は本発明ベ
クター構築の元となるベクターｐＲＬ２Ｍの作製を示
し、実施例２はそのｐＲＬ２Ｍを使用した異種蛋白質構
造遺伝子導入前のベクターｐＴＬ２Ｍの作製を示す。こ
のベクターｐＴＬ２Ｍは本発明のマルチクローニングベ
クターであり、以下の実施例はこのベクターｐＴＬ２Ｍ
に種々の異種蛋白質構造遺伝子を導入してその発現を試
験した例である。また、実施例３はこのベクターｐＴＬ
２Ｍを含むＳ．ｐｏｍｂｅ形質転換体の製造を示し、実
施例４はこの形質転換体細胞抽出液の調製（コントロー
ル用）を示す。実施例５では特にヒトリポコルチンＩの
生産について種々の試験を行った例を示す。In the following, Example 1 shows the preparation of the vector pRL2M which is the basis of the vector construction of the present invention, and Example 2 shows the preparation of the vector pTL2M before the introduction of the heterologous protein structural gene using the pRL2M. This vector pTL2M is a multi-cloning vector of the present invention, and the examples below show this vector pTL2M.
This is an example in which various heterologous protein structural genes were introduced into and the expression was tested. In addition, Example 3 shows this vector pTL.
S. The production of pombe transformants is shown, and Example 4 shows the preparation (for control) of this transformant cell extract. Example 5 shows an example in which various tests were conducted particularly for the production of human lipocortin I.

【００３７】［実施例１］ ［ベクターｐＲＬ２Ｍの作製］公知の方法で調製したプ
ラスミドｐｃＤ４Ｂ（特開平５−１５３８０号公報参
照）を制限酵素Ｓａｃ Ｉで消化後、末端をＴ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼで平滑化し、さらに制限酵素Ｂａｍ Ｈ
Ｉで消化した後、フェノール抽出およびエタノール沈殿
によって核酸分画を回収した。さらにアガロースゲル電
気泳動後、ガラスビーズ法（旭硝子（株）製「ＤＮＡ
ＰＲＥＰ」（商品名）使用、以下同様）によって約４５
００塩基対に相当するＤＮＡを精製した。[Example 1] [Preparation of vector pRL2M] The plasmid pcD4B (see JP-A-5-15380) prepared by a known method was digested with the restriction enzyme Sac I, and the end was T4 DN.
It is blunted with A polymerase and further restricted with Bam H restriction enzyme.
After digestion with I, the nucleic acid fraction was collected by phenol extraction and ethanol precipitation. Furthermore, after agarose gel electrophoresis, the glass beads method ("DNA manufactured by Asahi Glass Co., Ltd."
Approximately 45 by using "PREP" (trade name), and so on
The DNA corresponding to 00 base pairs was purified.

【００３８】別に、やはり公知の方法で調製した、ヒト
リポコルチンＩ遺伝子（ｃＤＮＡ）を含むベクターｐｃ
Ｄ４ｌｉｐｏＩ（特開平５−１５３８０号公報参照）を
制限酵素Ｘｍｎ ＩおよびＢａｍ ＨＩで消化した後、
フェノール抽出およびエタノール沈澱によって核酸分画
を回収した。さらにアガロースゲル電気泳動後、ガラス
ビーズ法によって約１３００塩基対に相当するＤＮＡを
精製した。Separately, a vector pc containing the human lipocortin I gene (cDNA), which was also prepared by a known method.
After digesting D4lipoI (see JP-A-5-15380) with the restriction enzymes XmnI and BamHI,
The nucleic acid fraction was collected by phenol extraction and ethanol precipitation. Further, after agarose gel electrophoresis, the DNA corresponding to about 1300 base pairs was purified by the glass bead method.

【００３９】両ＤＮＡを、ライゲーションキット（宝酒
造（株）販売）でライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５
（東洋紡（株）販売）を形質転換した。得られた形質転
換体よりベクターを調製し、目的とするベクターｐＲＬ
２Ｌ（図１）を持った形質転換体をスクリーニングし
た。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から
目的のベクターであることを確認した。Both DNAs were ligated with a ligation kit (sold by Takara Shuzo Co., Ltd.), and then E. coli DH5
(Toyobo Co., Ltd.) was transformed. A vector is prepared from the obtained transformant, and the desired vector pRL is obtained.
Transformants with 2 L (Fig. 1) were screened. From the confirmation of the partial base sequence and the construction of the restriction enzyme map, the target vector was confirmed.

【００４０】このリポコルチンＩ発現ベクターｐＲＬ２
Ｌを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消
化し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロー
スゲル電気泳動により約５０００塩基対に相当するバン
ドを切り出し、ガラスビーズ法で精製した。別に、公知
のプラスミドｐＵＣ１９を制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよび
Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化し、フェノール抽出、エタノー
ル沈澱の後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動より約６
０塩基対に相当するバンドを切り出し、ゲルから抽出精
製した。This lipocortin I expression vector pRL2
L was digested with restriction enzymes Eco RI and Hind III, extracted with phenol, precipitated with ethanol, and then a band corresponding to about 5000 base pairs was cut out by agarose gel electrophoresis and purified by a glass bead method. Separately, a known plasmid pUC19 was digested with restriction enzymes Eco RI and Hind III, extracted with phenol, precipitated with ethanol, and then subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to give about 6
The band corresponding to 0 base pairs was cut out and extracted and purified from the gel.

【００４１】これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＲＬ
２Ｍ（図２）をスクリーニングした。部分塩基配列の確
認および制限酵素地図の作製から目的のベクターである
ことを確認した。After ligation of these two fragments,
Target vector pRL obtained by transforming Escherichia coli DH5
2M (Figure 2) was screened. From the confirmation of the partial base sequence and the construction of the restriction enzyme map, the target vector was confirmed.

【００４２】［実施例２］ ［ベクターｐＴＬ２Ｍの作製］ｐＲＬ２Ｍをテンプレー
トとし、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-TTGACTAG
TTATTAATAGTA-3' およびオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド 5'-CTAGAATTCACATGTTTGAAAAAGTGTCTTTATC-3' を合成
プライマーとして、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ
によって目的断片を増幅した。制限酵素Ｓｐｅ Ｉおよ
びＥｃｏ ＲＩで末端を調節し、フェノール抽出、エタ
ノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動により約６０
０塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法
で精製した。[Example 2] [Preparation of vector pTL2M] Using pRL2M as a template, oligodeoxyribonucleotide 5'-TTGACTAG
PCR using Taq polymerase with TTATTAATAGTA-3 'and oligodeoxyribonucleotide 5'-CTAGAATTCACATGTTTGAAAAAGTGTCTTTATC-3' as synthetic primers
The target fragment was amplified by. The ends were adjusted with restriction enzymes Spe I and Eco RI, phenol extraction and ethanol precipitation were performed, and then about 60 by agarose gel electrophoresis.
The band corresponding to 0 base pairs was cut out and purified by the glass bead method.

【００４３】別に、ｐＲＬ２Ｍを制限酵素Ｓｐｅ Ｉお
よびＥｃｏ ＲＩで消化し、フェノール抽出、エタノー
ル沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約４５００塩
基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で精
製した。これら両者の断片をライゲーションの後、大腸
菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＴＬ２Ｍ
（図３）をスクリーニングした。部分塩基配列の確認お
よび制限酵素切断地図の作製から目的のベクターである
ことを確認した。ｐＴＬ２Ｍの制限酵素切断地図を図４
に示す。Separately, pRL2M was digested with restriction enzymes Spe I and Eco RI, extracted with phenol and precipitated with ethanol. Then, a band corresponding to about 4500 base pairs was cut out by agarose gel electrophoresis and purified by a glass bead method. After ligation of these two fragments, Escherichia coli DH5 was transformed with the desired vector pTL2M.
(FIG. 3) was screened. From the confirmation of the partial base sequence and the construction of the restriction enzyme cleavage map, the target vector was confirmed. Figure 4 shows a restriction enzyme digestion map of pTL2M.
Shown in.

【００４４】［実施例３］ ［ｐＴＬ２Ｍの酵母への導入］Ｓ．ｐｏｍｂｅのロイシ
ン要求性株、ＡＴＣＣ ３８３９９（ｌｅｕ１−３２ｈ
−）を最少培地で０．８×１０⁷ 細胞数／ｍｌになるま
で生育させた。集菌、洗菌後１０⁹ 細胞数／ｍｌになる
ように０．１モル酢酸リチウム（ｐＨ５．０）に懸濁
し、３０℃で６０分間インキュベートした。その後、上
記懸濁液１００μｌにｐＡＬ７をＰｓｔ Ｉで切断した
ＤＮＡの１μｇ、実施例１で得たベクターｐＴＬ２Ｍの
２μｇをＴＥ（ＥＤＴＡを含んだトリスバッファー）１
５μｌに溶かして加え、５０％ＰＥＧ４０００を２９０
μｌ加えよく混合したのち３０℃で６０分間、４３℃で
１５分間、室温で１０分間の順にインキュベートした。
遠心によりＰＥＧ４０００を除去し、培養液１ｍｌに懸
濁した。[Example 3] [Introduction of pTL2M into yeast] A leucine-requiring strain of pombe, ATCC 38399 (leu1-32h
-) Was grown in a minimal medium to 0.8 × 10 ⁷ cells / ml. After the cells were collected and washed, the cells were suspended in 0.1 mol lithium acetate (pH 5.0) so that the number of cells was 10 ⁹ cells / ml, and the cells were incubated at 30 ° C. for 60 minutes. Then, in 100 μl of the above suspension, 1 μg of the DNA obtained by cleaving pAL7 with Pst I and 2 μg of the vector pTL2M obtained in Example 1 were added to TE (Tris buffer containing EDTA) 1
Dissolve in 5 μl and add 290% 50% PEG4000
After adding μl and mixing well, the mixture was incubated at 30 ° C. for 60 minutes, 43 ° C. for 15 minutes, and room temperature for 10 minutes in that order.
PEG4000 was removed by centrifugation and suspended in 1 ml of culture solution.

【００４５】このうち１００μｌを分取し、９００μｌ
の培養液を加えて、３２℃、３０分間インキュベートし
た。うち３００μｌを最少寒天培地にスプレッドした。
３２℃で３日間インキュベートし、形質転換体をＧ４１
８を含むプレートに移し、さらに３２℃で５日間培養し
た。得られたものは、目的とする形質転換体であった。Of this, 100 μl was taken and 900 μl
The culture solution was added and incubated at 32 ° C. for 30 minutes. 300 μl of this was spread on the minimal agar medium.
After incubating at 32 ° C. for 3 days, the transformants were subjected to G41
The cells were transferred to a plate containing 8 and further cultured at 32 ° C. for 5 days. The obtained product was the desired transformant.

【００４６】［実施例４］ ［形質転換体の培養および細胞抽出液の調製］実施例３
で得た形質転換体を２％グルコース、１％イースト抽出
液、２％ペプトン、およびＧ４１８を２００μｇ／ｍｌ
を含む液体培地５０ｍｌで３２℃、３日間培養した。そ
の培養液から１０⁸ 細胞程度の菌体を集菌、洗菌し、５
０ミリモルトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、
超音波破砕を行った。遠心によって細胞抽出液（上清）
を得た。この細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＴＥＦＣＯ社製 ４〜２０％ポリアクリ
ルアミドゲル、以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）にて行う
解析の陰性対象（コントロール）として以下の実施例に
ついて用いた。[Example 4] [Cultivation of transformant and preparation of cell extract] Example 3
2% glucose, 1% yeast extract, 2% peptone, and G418 at 200 μg / ml.
The cells were cultured in 50 ml of a liquid culture medium containing 32 ° C. for 3 days. About 10 ⁸ cells were collected and washed from the culture solution, and 5
Suspended in 0 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5),
Ultrasonic crushing was performed. Cell extract (supernatant) by centrifugation
Got This cell extract was used in the following examples as a negative control (control) for the analysis performed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (4-20% polyacrylamide gel manufactured by TEFCO, hereinafter referred to as SDS-PAGE).

【００４７】［実施例５］ ［ヒトリポコルチンＩの発現］公知（特開平５−１５３
８０号公報参照）のリポコルチンＩｃＤＮＡ全長をベク
ターｐｃＤ４ｌｉｐｏＩをテンプレートとし、オリゴデ
オキシリボヌクレオチド 5'ーATGCCATGGCAATGGTATCAGAAT
T-3'およびオリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-AGCCAG
TATACACTCCGCTA-3' を合成プライマーとして、Ｔａｑポ
リメラーゼを用いたＰＣＲによって目的断片を増幅し
た。制限酵素Ｎｃｏ ＩおよびＢａｍ ＨＩで末端を調
節し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロー
スゲル電気泳動により約１４００塩基対に相当するバン
ドを切り出し、ガラスビーズ法で精製した。[Example 5] [Expression of human lipocortin I] Known (JP-A 5-153
80), using the vector pcD4lipoI as a template for oligodeoxyribonucleotide 5'-ATGCCATGGCAATGGTATCAGAAT.
T-3 'and oligodeoxyribonucleotide 5'-AGCCAG
The target fragment was amplified by PCR using Taq polymerase with TATACACTCCGCTA-3 'as a synthetic primer. After adjusting the ends with restriction enzymes Nco I and Bam HI, extracting with phenol and precipitating with ethanol, a band corresponding to about 1400 base pairs was cut out by agarose gel electrophoresis and purified by a glass bead method.

【００４８】別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素Ａｆｌ ＩＩ
ＩおよびＢａｍ ＨＩで消化し、フェノール抽出、エタ
ノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約５００
０塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法
で精製した。これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＴＬ
２Ｌ（図５）をスクリーニングした。部分塩基配列の確
認および制限酵素地図の作製から目的のベクターである
ことを確認した。Separately, pTL2M was digested with the restriction enzyme Afl II.
After digestion with I and Bam HI, phenol extraction and ethanol precipitation, agarose gel electrophoresis showed about 500
The band corresponding to 0 base pairs was cut out and purified by the glass bead method. After ligation of both fragments,
Target vector pTL obtained by transforming Escherichia coli DH5
2L (Figure 5) were screened. From the confirmation of the partial base sequence and the construction of the restriction enzyme map, the target vector was confirmed.

【００４９】実施例３と同様にＳ．ｐｏｍｂｅを形質転
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。この際
細胞抽出液にプロテアーゼ（１２マイクルモルＰＭＳ
Ｆ、２５マイクロモル ロイペプチン、５マイクロモル
Ｅ−６４）を存在させておく。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて調
べたところ、分子量３６，０００の位置にコントロール
ｐＴＬ２Ｍを導入した酵母抽出液には見られないバンド
が確認され、抗ヒトリポコルチンＩ抗体（ウサギ）を用
いてウエスタンブロットを行なったところ、このバンド
のみが特異的に染色された（図６）。図６はヒトリポコ
ルチンＩの発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図およびウ
エスタンブロット観察図であり、図における１〜４は下
記のものを表す。As in the third embodiment, S. Pombe was transformed and a cell extract was prepared in the same manner as in Example 4. At this time, protease (12 micrmol PMS) was added to the cell extract.
F, 25 micromol leupeptin, 5 micromol E-64) is present. When examined by SDS-PAGE, a band not found in the yeast extract containing the control pTL2M at a molecular weight of 36,000 was confirmed, and Western blotting was performed using an anti-human lipocortin I antibody (rabbit). As a result, only this band was specifically stained (FIG. 6). FIG. 6 is an SDS-PAGE observation diagram and a Western blot observation diagram showing the expression of human lipocortin I, and 1-4 in the figure represent the following.

【００５０】１；Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ｐＴＬ２Ｍ）細胞抽
出液、 ２；Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ｐＴＬ２Ｌ）細胞抽出液、 ３；Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ｐＴＬ２Ｍ）細胞抽出液、 ４；Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ｐＴＬ２Ｌ）細胞抽出液。1; S. pombe (pTL2M) cell extract, 2; pombe (pTL2L) cell extract, 3; pombe (pTL2M) cell extract, 4; Pombe (pTL2L) cell extract.

【００５１】また、 ¹²⁵Ｉ−プロテインＡを二次抗体と
してウエスタンブロットを行い、天然体のリポコルチン
Ｉを標準として定量をしたところ、発現されたリポコル
チンは全可溶性蛋白質の５０ｗｔ％を占めていることが
わかった。Western blotting was carried out using ¹²⁵ I-Protein A as a secondary antibody, and quantification was carried out using natural lipocortin I as a standard. The expressed lipocortin occupied 50 wt% of the total soluble protein. all right.

【００５２】［***酵母で発現したヒトリポコルチンＩ
の精製］上記で得た粗抽出液をヒトリポコルチンＩのカ
ルシウム結合型のみを認識するモノクローナル抗体をリ
ガンドとしたアフィニテイーカラムに１ミリモル塩化カ
ルシウム、５０ミリモルトリス塩酸（ｐＨ７．５）、
０．１５モル塩化ナトリウムにて吸着させ２ミリモルＥ
ＧＴＡ、５０ミリモルトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．
１５モル塩化ナトリウムにて溶出させることにより、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一なバンドをなす組換えヒト
リポコルチンＩを得た（図７）。図７はヒトリポコルチ
ンＩの精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図であり、図に
おけるＡおよびＢは下記のものを表す。[Human lipocortin I expressed in fission yeast
Purification of the above] The crude extract obtained above was added to an affinity column using a monoclonal antibody that recognizes only the calcium-binding form of human lipocortin I as a ligand, 1 mM calcium chloride, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5),
Adsorbed with 0.15 mol sodium chloride and 2 mmol E
GTA, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.
By eluting with 15 molar sodium chloride, S
A single band of recombinant human lipocortin I was obtained on DS-PAGE (Fig. 7). FIG. 7 is an SDS-PAGE observation diagram showing the purification of human lipocortin I, and A and B in the figure represent the following.

【００５３】Ａ；Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ｐＴＬ２Ｌ）粗抽出
液、 Ｂ；精製ヒトリポコルチンＩ。A; S. Pombe (pTL2L) crude extract, B; purified human lipocortin I.

【００５４】［ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）阻害活
性］上記実施例にて精製した組換えヒトリポコルチンＩ
によるＰＬＡ２阻害活性をB.Rothhut らの方法(B.Rothh
ut,et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.117,878-884(19
83))にて測定した。すなわち、トリチウムを含むオレイ
ン酸で標識した大腸菌を基質として、ハチ毒ＰＬＡ２の
活性に対するヒトリポコルチンＩの阻害活性を調べた。
この結果を図８に示した。この結果より、ヒト胎盤由来
リポコルチンＩの示す阻害活性と、阻害の程度、阻害様
式が一致していることがわかった。図８は蛋白質量とＰ
ＬＡ２の活性の関係を示すグラフである。[Phospholipase A2 (PLA2) Inhibitory Activity] Recombinant human lipocortin I purified in the above Example
The PLA2 inhibitory activity by B.Rothhut et al.
ut, et al, Biochem.Biophys.Res.Commun.117,878-884 (19
83)). That is, the inhibitory activity of human lipocortin I against the activity of the bee venom PLA2 was examined using E. coli labeled with oleic acid containing tritium as a substrate.
The result is shown in FIG. From these results, it was found that the inhibitory activity exhibited by human placenta-derived lipocortin I, the degree of inhibition, and the mode of inhibition corresponded. Figure 8 shows protein mass and P
It is a graph which shows the relationship of the activity of LA2.

【００５５】［F-アクチンとの結合能］上記実施例で得
た精製ヒトリポコルチンＩが、カルシウム存在下にてＦ
−アクチンに結合するかどうかをH.Hayashi らの方法
(H.Hayashi et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.146,91
2-919(1987)) にて検討した。ヒト胎盤由来リポコルチ
ンＩと同様、１ミリモルカルシウム存在下にて５０ｗｔ
％のヒトリポコルチンＩがＦ−アクチンと結合し、１ミ
リモルＥＧＴＡ存在下では全く結合は見られなかった
（図９）。図９はアクチン結合活性を示すＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ観察図であり、図における１〜４は以下のものを示
す。[Binding ability with F-actin] The purified human lipocortin I obtained in the above-mentioned example was used in the presence of calcium in the presence of F.
− The method of H. Hayashi et al.
(H. Hayashi et al, Biochem.Biophys.Res.Commun.146,91
2-919 (1987)). Similar to human placenta-derived lipocortin I, 50 wt in the presence of 1 mM calcium
% Of human lipocortin I bound to F-actin, and no binding was observed in the presence of 1 mM EGTA (FIG. 9). FIG. 9 shows SDS-PA showing actin-binding activity.
It is a GE observation figure, and 1-4 in the figure show the following.

【００５６】１；１ミリモルＥＧＴＡ存在下の遠心残
渣、 ２；１ミリモルＥＧＴＡ存在下の遠心上清、 ３；１ミリモル塩化カルシウム存在下の遠心残渣、 ４；１ミリモル塩化カルシウム存在下の遠心上清。1; centrifugation residue in the presence of 1 mM EGTA, 2; centrifugation supernatant in the presence of 1 mM EGTA, 3; centrifugation residue in the presence of 1 mM calcium chloride, 4; centrifugation supernatant in the presence of 1 mM calcium chloride .

【００５７】［アミノ酸組成］上記実施例で得た組換え
ヒトリポコルチンＩのアミノ酸組成をアミノ酸分析機
（ＪＥＯＬ ＪＬＣ−３６０）により分析した。その結
果を表２に示す。ＤＮＡ塩基配列から予想される組成と
一致していることがわかった。[Amino acid composition] The amino acid composition of the recombinant human lipocortin I obtained in the above Example was analyzed by an amino acid analyzer (JEOL JLC-360). The results are shown in Table 2. It was found to be in agreement with the composition expected from the DNA base sequence.

【００５８】[0058]

【表２】 [Table 2]

【００５９】［アミノ末端アミノ酸配列］上記実施例で
得た組換えヒトリポコルチンＩのアミノ末端からのアミ
ノ酸配列の決定を気相法シークエンサー（ＳＨＩＭＡＤ
ＺＵ ＰＳＱ−１）にて行ったが、ＰＴＨ−アミノ酸は
検出されなかった。そこで組換えヒトリポコルチンＩを
Ｖ８プロテアーゼ（ベーリンガー社）により完全分解
し、ＯＤＳ Ｃ１８カラム（ＨＰＬＣ）にて各フラグメ
ントを分取し、各フラグメントのアミノ酸組成を調べる
ことによりアミノ末端フラグメントを選んだ。次に、そ
のペプチドにアシルアミノ酸遊離酵素を作用させた。そ
の結果を図１０に表す。[Amino-Terminal Amino Acid Sequence] The determination of the amino acid sequence from the amino terminus of the recombinant human lipocortin I obtained in the above Example was carried out by the gas phase sequencer (SHIMAD).
ZU PSQ-1), but no PTH-amino acid was detected. Therefore, recombinant human lipocortin I was completely decomposed by V8 protease (Boehringer), each fragment was separated by ODS C18 column (HPLC), and the amino-terminal fragment was selected by examining the amino acid composition of each fragment. Next, an acylamino acid-releasing enzyme was allowed to act on the peptide. The result is shown in FIG.

【００６０】図１０はＨＰＬＣによる溶出量を表すグラ
フであり、図１０ａはアミノ末端フラグメントの溶出量
を表すグラフであり、図１０ｂはそのアミノ末端フラグ
メントにアシルアミノ酸遊離酵素を作用させた後のフラ
グメントの溶出量を表すグラフである。図１０ｂに示す
ように溶出時間の早いところにピークがあらわれ、また
アミノ末端フラグメントの溶出位置は移動した。FIG. 10 is a graph showing the elution amount by HPLC, FIG. 10a is a graph showing the elution amount of the amino terminal fragment, and FIG. 10b is a fragment after the amino acid fragment is reacted with an acylamino acid-releasing enzyme. 3 is a graph showing the elution amount of As shown in FIG. 10b, a peak appeared at an early elution time, and the elution position of the amino terminal fragment moved.

【００６１】前者のピークを分取し加水分解してアミノ
酸組成を調べたところAla であり、またアセチルAla を
ＨＰＬＣにて溶出させると、図１０ｂのようにこのピー
クと一致する。また後者のピークをシークエンサーにて
解析するとMet-Val-Ser-Gluであることがわかった。し
たがって、組換えヒトリポコルチンＩのアミノ末端アミ
ノ酸配列は天然体と同様Acetyl-Ala-Met-Val-Ser-Gluで
あると考えられる。When the former peak was collected and hydrolyzed to examine the amino acid composition, it was Ala, and when acetyl Ala was eluted by HPLC, it coincided with this peak as shown in FIG. 10b. The latter peak was analyzed by a sequencer and found to be Met-Val-Ser-Glu. Therefore, the amino terminal amino acid sequence of recombinant human lipocortin I is considered to be Acetyl-Ala-Met-Val-Ser-Glu as in the natural form.

【００６２】［ヒトリポコルチンＩ発現ベクターのコピ
ー数の確認］実施例で作製した形質転換体を培養し、５
×１０⁷ 個の細胞を得た。培地中のＧ４１８濃度を各々
０、２５、５０、１００、２００μｇ／ｍｌの５種類に
対して行った以外は、培養方法は実施例４と同じ方法で
行った。ガラスビーズ、ＳＤＳおよびフェノールを用い
て菌体を破砕し、全ＤＮＡを抽出した。制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化した後、０．８％
アガロースゲル電気泳動後、ナイロンメンブレンに転写
し、ヒトリポコルチンＩ遺伝子のＥｃｏ ＲＩ−Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼ
ーションを行った。この結果を図１１に示す。図１１は
Ｇ４１８濃度とｐＴＬ２Ｌのコピー数と関係を示すグラ
フである。図に示すように、培地中のＧ４１８濃度に依
存して菌体内のベクターコピー数が増加し、最大２００
コピー程度まで上昇することがわかった。[Confirmation of copy number of human lipocortin I expression vector] The transformant prepared in Example was cultured and
× 10 ⁷ cells were obtained. The culture method was the same as that of Example 4, except that the concentration of G418 in the medium was 0, 25, 50, 100, and 200 μg / ml. The cells were disrupted using glass beads, SDS and phenol, and total DNA was extracted. Restriction enzyme Eco
0.8% after digestion with RI and Hind III
After agarose gel electrophoresis, transferred to a nylon membrane, Eco RI-Hin of human lipocortin I gene
Southern hybridization was performed using the dIII fragment as a probe. The result is shown in FIG. FIG. 11 is a graph showing the relationship between the G418 concentration and the copy number of pTL2L. As shown in the figure, the vector copy number in the cells increased depending on the G418 concentration in the medium, and the maximum vector copy number was 200.
It turned out to rise to about a copy.

【００６３】［実施例６］ ［ラットアルギナーゼの発現］熊本大学医学部森正敬教
授より供与を受けた、ラット肝臓アルギナーゼｃＤＮＡ
全長を含むベクターｐＡＲＧｒ−２［S.Kawamoto et a
l.,Biochem. Biophis.Res.Commun.,136,955-961(1986)
］より、インサートを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＰ
ｓｔ Ｉで切り出し、市販のベクターであるブルースク
リプトのＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ Ｉ部位にサブクローニン
グした。[Example 6] [Expression of rat arginase] Rat liver arginase cDNA provided by Professor Masataka Mori of Kumamoto University School of Medicine.
Vector pARGr-2 containing the full length [S. Kawamoto et a
l., Biochem.Biophis.Res.Commun., 136,955-961 (1986)
], The inserts were digested with restriction enzymes Eco RI and P
It was cut out with stI and subcloned into the EcoRI-PstI site of the commercially available vector Bluescript.

【００６４】このベクターをテンプレートとし、オリゴ
デオキシリボヌクレオチド 5'-GACTCATGAGCTCCAAGCCAAA
GCC-3'およびオリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-TTCC
CAGTCACGACGTTGTA-3' を合成プライマーとして、Ｔａｑ
ポリメラーゼを用いたＰＣＲによって目的断片を増幅し
た。制限酵素Ｂｓｐ ＨＩおよびＸｂａ Ｉで末端を調
節し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロー
スゲル電気泳動により約１３００塩基対に相当するバン
ドを切り出し、ガラスビーズ法で精製した。Using this vector as a template, oligodeoxyribonucleotide 5'-GACTCATGAGCTCCAAGCCAAA
GCC-3 'and oligodeoxyribonucleotide 5'-TTCC
Using CAGTCACGACGTTGTA-3 'as a synthetic primer, Taq
The target fragment was amplified by PCR using a polymerase. The ends were adjusted with the restriction enzymes Bsp HI and Xba I, and after phenol extraction and ethanol precipitation, a band corresponding to about 1300 base pairs was cut out by agarose gel electrophoresis and purified by the glass bead method.

【００６５】別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素Ａｆｌ ＩＩ
ＩおよびＸｂａ Ｉで消化し、フェノール抽出、エタノ
ール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約５０００
塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で
精製した。これら両者の断片をライゲーションの後、大
腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＴＬ２
Ｒ（図１２）をスクリーニングした。部分塩基配列の確
認および制限酵素地図の作製から目的のベクターである
ことを確認した。Separately, pTL2M was digested with the restriction enzyme Afl II.
After digestion with I and Xba I, extraction with phenol, precipitation with ethanol, agarose gel electrophoresis of about 5000
The band corresponding to the base pair was cut out and purified by the glass bead method. After ligation of these two fragments, Escherichia coli DH5 was transformed with the desired vector pTL2.
R (FIG. 12) was screened. From the confirmation of the partial base sequence and the construction of the restriction enzyme map, the target vector was confirmed.

【００６６】実施例３と同様にＳ．ｐｏｍｂｅを形質転
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって発現を確認したところ、ラットアル
ギナーゼに相当する分子量３５，０００付近の位置にコ
ントロールｐＴＬ２Ｍには見られない明瞭なバンドが検
出できた。その発現量は、デンシトメーターにて測定し
たところ全菌体蛋白質の３０〜５０ｗｔ％であった。ま
た、ラットアルギナーゼ特異的な抗体を用いてウエスタ
ンブロッティングを行い、ラットアルギナーゼであるこ
とを確認した。As in Example 3, S. Pombe was transformed and a cell extract was prepared in the same manner as in Example 4. SDS
When the expression was confirmed by -PAGE, a clear band not found in the control pTL2M was detected at a position near the molecular weight of 35,000 corresponding to rat arginase. The expression level was 30 to 50 wt% of the total cell protein as measured by a densitometer. Moreover, it was confirmed to be rat arginase by performing Western blotting using an antibody specific to rat arginase.

【００６７】［実施例７］ ［ヒトＩＬ−６の発現］ヒトＩＬ−６ｃＤＮＡ全長を含
む公知のベクターｐＵＣ１９をテンプレートとし、オリ
ゴデオキシリボヌクレオチド 5'-ATCGCATGCCAGTACCCCCA
GGAGAAGA-3' およびオリゴデオキシリボヌクレオチド
5'-TGAAAATCTTCTCTCATCCG-3' を合成プライマーとし
て、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲによって目的断
片を増幅した。制限酵素Ｓｐｈ ＩおよびＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩで末端を調節し、フェノール抽出、エタノール沈澱
の後、アガロースゲル電気泳動により約１０００塩基対
に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で精製し
た。[Example 7] [Expression of human IL-6] Using a known vector pUC19 containing the full-length human IL-6 cDNA as a template, oligodeoxyribonucleotide 5'-ATCGCATGCCAGTACCCCCA.
GGAGAAGA-3 'and oligodeoxyribonucleotides
The target fragment was amplified by PCR using Taq polymerase with 5'-TGAAAATCTTCTCTCATCCG-3 'as a synthetic primer. Restriction enzymes Sph I and Hind I
After adjusting the end with II, phenol extraction and ethanol precipitation, a band corresponding to about 1000 base pairs was cut out by agarose gel electrophoresis and purified by the glass bead method.

【００６８】別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素Ａｆｌ ＩＩ
ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、フェノール抽出、
エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約５
０００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビー
ズ法で精製した。これら両者の断片をライゲーションの
後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐ
ＴＬ２６ｍ（図１３）をスクリーニングした。部分塩基
配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクタ
ーであることを確認した。Separately, pTL2M was digested with the restriction enzyme Afl II.
Digested with I and Hind III, phenol extracted,
Approximately 5 after agarose gel electrophoresis after ethanol precipitation
A band corresponding to 000 base pairs was cut out and purified by the glass bead method. After ligation of these two fragments, E. coli DH5 was transformed with the desired vector p
TL26m (FIG. 13) was screened. From the confirmation of the partial base sequence and the construction of the restriction enzyme map, the target vector was confirmed.

【００６９】実施例３と同様にＳ．ｐｏｍｂｅを形質転
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって発現を確認したところ、ヒトＩＬ−
６に相当する分子量２１，０００付近の位置にコントロ
ールｐＴＬ２Ｍには見られない明瞭なバンドが検出でき
た。その発現量は、デンシトメーターにて測定したとこ
ろ全菌体蛋白質の10wt% 程度であった。また、ヒトＩＬ
−６特異的な抗体を用いてウエスタンブロッティングを
行い、ヒトＩＬ−６であることを確認した。As in Example 3, S. Pombe was transformed and a cell extract was prepared in the same manner as in Example 4. SDS
-When the expression was confirmed by PAGE, human IL-
A clear band not found in the control pTL2M was detected at a position near the molecular weight of 21,000 corresponding to 6. The expression level was about 10 wt% of the total cell protein as measured by a densitometer. Human IL
Western blotting was performed using a -6-specific antibody, and it was confirmed to be human IL-6.

【００７０】［実施例８］ ［ラットＮＤＰキナーゼα体の発現］東京都老人研究所
木村成道博士より供与を受けた、ラットＮＤＰキナーゼ
α体ｃＤＮＡ全長を含むベクターｐＮＤＰＫαを制限酵
素Ｎｃｏ ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フェノー
ル抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動
により約６００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガ
ラスビーズ法で精製した。別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素
Ａｆｌ ＩＩＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、フェ
ノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気
泳動より約５０００塩基対に相当するバンドを切り出
し、ガラスビーズ法で精製した。[Example 8] [Expression of rat NDP kinase α-form] A vector pNDPKα containing the full-length rat NDP kinase α-form cDNA, which was provided by Dr. Shigemichi Kimura of the Institute of Gerontology, Tokyo, was treated with restriction enzymes Nco I and Hind III. After digestion, phenol extraction and ethanol precipitation, a band corresponding to about 600 base pairs was cut out by agarose gel electrophoresis and purified by the glass bead method. Separately, pTL2M was digested with restriction enzymes Afl III and Hind III, extracted with phenol and precipitated with ethanol. Then, a band corresponding to about 5000 base pairs was cut out by agarose gel electrophoresis and purified by a glass bead method.

【００７１】これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＴＬ
２−Ｎα（図１４）をスクリーニングした。部分塩基配
列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクター
であることを確認した。After ligation of these two fragments,
Target vector pTL obtained by transforming Escherichia coli DH5
2-Nα (FIG. 14) was screened. From the confirmation of the partial base sequence and the construction of the restriction enzyme map, the target vector was confirmed.

【００７２】実施例３と同様にＳ．ｐｏｍｂｅを形質転
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって発現を確認したところ、ラットＮＤ
Ｐキナーゼα体に相当する分子量１７，０００付近の位
置にコントロールｐＴＬ２Ｍには見られない明瞭なバン
ドが検出できた。その発現量は、デンシトメーターにて
測定したところ全菌体蛋白質の３０〜５０ｗｔ％であっ
た。また、ラットＮＤＰキナーゼα体特異的な抗体を用
いてウエスタンブロッティングを行い、ラットＮＤＰキ
ナーゼα体であることを確認した。As in the third embodiment, S. Pombe was transformed and a cell extract was prepared in the same manner as in Example 4. SDS
-When the expression was confirmed by PAGE, rat ND
A clear band not found in the control pTL2M was detected at a position near the molecular weight of 17,000 corresponding to the P-kinase α-form. The expression level was 30 to 50 wt% of the total cell protein as measured by a densitometer. Further, Western blotting was carried out using an antibody specific to rat NDP kinase α-form, and it was confirmed to be rat NDP kinase α-form.

【００７３】［実施例９］ ［ラットＮＤＰキナーゼβ体の発現］東京都老人研究所
木村成道博士より供与を受けた、ラットＮＤＰキナーゼ
β体ｃＤＮＡ全長を含むベクターｐＮＤＰＫβを制限酵
素Ｎｃｏ ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、フェノール抽
出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動によ
り約７００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラス
ビーズ法で精製した。[Example 9] [Expression of rat NDP kinase β-form] A vector pNDPKβ containing the full-length rat NDP kinase β-form cDNA, which was provided by Dr. Shigemichi Kimura of the Institute of Gerontology, Tokyo, was treated with restriction enzymes Nco I and EcoRI. After digestion, phenol extraction and ethanol precipitation, a band corresponding to about 700 base pairs was cut out by agarose gel electrophoresis and purified by the glass bead method.

【００７４】別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素Ａｆｌ ＩＩ
ＩおよびＥｃｏ ＲＩで消化し、フェノール抽出、エタ
ノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約５００
０塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法
で精製した。これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＴＬ
２−Ｎβ（図１５）をスクリーニングした。部分塩基配
列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクター
であることを確認した。Separately, pTL2M was digested with the restriction enzyme Afl II.
After digestion with I and Eco RI, phenol extraction and ethanol precipitation, agarose gel electrophoresis gave about 500
The band corresponding to 0 base pairs was cut out and purified by the glass bead method. After ligation of both fragments,
Target vector pTL obtained by transforming Escherichia coli DH5
2-Nβ (FIG. 15) was screened. From the confirmation of the partial base sequence and the construction of the restriction enzyme map, the target vector was confirmed.

【００７５】実施例３と同様にＳ．ｐｏｍｂｅを形質転
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって発現を確認したところ、ラットＮＤ
Ｐキナーゼβ体に相当する分子量１７，０００付近の位
置にコントロールｐＴＬ２Ｍには見られない明瞭なバン
ドが検出できた。その発現量は、デンシトメーターにて
測定したところ全菌体蛋白質の３０〜５０ｗｔ％であっ
た。また、ラットＮＤＰキナーゼβ体特異的な抗体を用
いてウエスタンブロッティングを行い、ラットＮＤＰキ
ナーゼβ体であることを確認した。As in the third embodiment, S. Pombe was transformed and a cell extract was prepared in the same manner as in Example 4. SDS
-When the expression was confirmed by PAGE, rat ND
A clear band not found in the control pTL2M could be detected at a position near the molecular weight of 17,000 corresponding to the P-kinase β-form. The expression level was 30 to 50 wt% of the total cell protein as measured by a densitometer. Further, Western blotting was carried out using an antibody specific to rat NDP kinase β-form, and it was confirmed to be rat NDP kinase β-form.

【００７６】［実施例１０］ ［ヒト血清アルブミンの発現］国立予防衛生研究所遺伝
子バンクより供与を受けた、ヒト血清アルブミンｃＤＮ
Ａを含むベクターｐＩＬＭＡＬＢ５をテンプレートと
し、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-AGACCATGGATG
CACACAAGAGTGAGGT-3' およびオリゴデオキシリボヌクレ
オチド 5'-CAGGAAACAGCTATGACCAT-3' を合成プライマー
として、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲによって目
的断片を増幅した。制限酵素Ｎｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩで末端を調節し、フェノール抽出、エタノール
沈澱の後、アガロースゲル電気泳動により約１８００塩
基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で精
製した。[Example 10] [Expression of human serum albumin] Human serum albumin cDNA, donated by National Institute of Preventive Health, Gene Bank
Using the vector pILMALB5 containing A as a template, oligodeoxyribonucleotide 5'-AGACCATGGATG
The target fragment was amplified by PCR using Taq polymerase with CACACAAGAGTGAGGT-3 'and oligodeoxyribonucleotide 5'-CAGGAAACAGCTATGACCAT-3' as synthetic primers. Restriction enzymes Nco I and Hind
After adjusting the ends with III, phenol extraction and ethanol precipitation, a band corresponding to about 1800 base pairs was cut out by agarose gel electrophoresis and purified by the glass bead method.

【００７７】別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素Ａｆｌ ＩＩ
ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、フェノール抽出、
エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約５
０００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビー
ズ法で精製した。これら両者の断片をライゲーションの
後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐ
ＴＬ２Ｂｍ（図１６）をスクリーニングした。部分塩基
配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクタ
ーであることを確認した。Separately, pTL2M was digested with the restriction enzyme Afl II.
Digested with I and Hind III, phenol extracted,
Approximately 5 after agarose gel electrophoresis after ethanol precipitation
A band corresponding to 000 base pairs was cut out and purified by the glass bead method. After ligation of these two fragments, E. coli DH5 was transformed with the desired vector p
TL2Bm (FIG. 16) was screened. From the confirmation of the partial base sequence and the construction of the restriction enzyme map, the target vector was confirmed.

【００７８】実施例３と同様にＳ．ｐｏｍｂｅを形質転
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって発現を確認したところ、ヒト血清ア
ルブミンに相当する分子量６９，０００付近の位置にコ
ントロールｐＴＬ２Ｍには見られない明瞭なバンドが検
出できた。その発現量は、デンシトメーターにて測定し
たところ全菌体蛋白質の３０ｗｔ％程度であった。ま
た、ヒト血清アルブミン特異的な抗体を用いてウエスタ
ンブロッティングを行い、ヒト血清アルブミンであるこ
とを確認した。As in Example 3, S. Pombe was transformed and a cell extract was prepared in the same manner as in Example 4. SDS
When the expression was confirmed by -PAGE, a clear band which was not found in the control pTL2M was detected at a position near the molecular weight of 69,000 corresponding to human serum albumin. The expression level was about 30 wt% of the total cell protein as measured by a densitometer. Further, it was confirmed to be human serum albumin by performing Western blotting using an antibody specific to human serum albumin.

【００７９】[0079]

【発明の効果】本発明では、あらゆる蛋白質を高発現量
で発現することができるため、異種蛋白質生産の効率を
大幅に上昇させることが可能である。また上述のヒトリ
ポコルチンＩの場合に見られるようにその発現量は菌体
蛋白質の５０ｗｔ％を占め、その分子量、アミノ酸組
成、アミノ末端近傍のアミノ酸配列、などがヒト胎盤由
来リポコルチンＩ(Nature 320,77-81(1986))における各
々と同一であり、またＰＬＡ２阻害活性の程度やアクチ
ンとの結合能などについても上記天然型と同様であるこ
とから、本発明により***酵母を用いて天然型とほぼ同
一と思われる蛋白質をきわめて効率よく得られることが
可能となった。INDUSTRIAL APPLICABILITY In the present invention, any protein can be expressed at a high expression level, so that the efficiency of heterologous protein production can be significantly increased. Further, as seen in the case of human lipocortin I described above, the expression level occupies 50 wt% of the bacterial protein, and its molecular weight, amino acid composition, amino acid sequence near the amino terminus, etc. are lipocortin I derived from human placenta (Nature 320). , 77-81 (1986)), and the degree of PLA2 inhibitory activity and the ability to bind to actin are similar to those of the above-mentioned natural type. It has become possible to obtain a protein that is almost the same as that of 1.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】ベクターｐＲＬ２Ｌの構成図FIG. 1 is a structural diagram of vector pRL2L.

【図２】ベクターｐＲＬ２Ｍの構成図FIG. 2 is a block diagram of the vector pRL2M.

【図３】ベクターｐＴＬ２Ｍの構成図FIG. 3 is a block diagram of the vector pTL2M.

【図４】ベクターｐＴＬ２Ｍの制限酵素切断地図FIG. 4 Restriction enzyme digestion map of vector pTL2M

【図５】発現ベクターｐＴＬ２Ｌの構成図FIG. 5: Construction diagram of expression vector pTL2L

【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット観
察図FIG. 6 is an SDS-PAGE and Western blot observation diagram.

【図７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図FIG. 7: SDS-PAGE observation diagram

【図８】ＰＬＡ２阻害活性を示すグラフFIG. 8 is a graph showing PLA2 inhibitory activity.

【図９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図FIG. 9 is an SDS-PAGE observation diagram.

【図１０】ＨＰＬＣ溶出を示すグラフFIG. 10 is a graph showing HPLC elution.

【図１１】ｐＴＬ２Ｌのコピー数の変化を示すグラフFIG. 11 is a graph showing changes in the copy number of pTL2L.

【図１２】発現ベクターｐＴＬ２Ｒの構成図FIG. 12: Construction diagram of expression vector pTL2R

【図１３】発現ベクターｐＴＬ２６ｍの構成図FIG. 13: Construction diagram of expression vector pTL26m

【図１４】発現ベクターｐＴＬ２−Ｎαの構成図FIG. 14: Construction diagram of expression vector pTL2-Nα

【図１５】発現ベクターｐＴＬ２−Ｎβの構成図FIG. 15: Construction diagram of expression vector pTL2-Nβ

【図１６】発現ベクターｐＴＬ２Ｂｍの構成図FIG. 16: Construction diagram of expression vector pTL2Bm

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Office reference number FI technical display location C12R 1: 645) (C12P 21/02 C12R 1: 645)

Claims (14)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】真核細胞内において機能しうるプロモータ
ー領域を有し、かつそのプロモーターによって支配され
る異種蛋白質構造遺伝子を導入するためのマルチクロー
ニングサイトをそのプロモーター領域の下流に有するベ
クターであり、そのベクターのマルチクローニングサイ
ト先端部分における異種蛋白質構造遺伝子を導入するた
めの制限酵素認識部位が、５’側から−ＡＣＡＴＧＴ−
なる配列を有する制限酵素認識部位であることを特徴と
するマルチクローニングベクター。1. A vector having a promoter region capable of functioning in a eukaryotic cell, and having a multi-cloning site for introducing a heterologous protein structural gene controlled by the promoter downstream of the promoter region, The restriction enzyme recognition site for introducing a heterologous protein structural gene at the tip of the multi-cloning site of the vector is -ACATGT- from the 5'side.
A multi-cloning vector having a restriction enzyme recognition site having the following sequence. 【請求項２】ベクターがさらに第２のプロモーター領域
とその第２のプロモーターによって支配される抗生物質
耐性遺伝子を有し、かつ第２のプロモーターの転写促進
活性が第１のプロモーターの転写促進活性よりも低い、
請求項１のマルチクローニングベクター。2. The vector further has a second promoter region and an antibiotic resistance gene controlled by the second promoter, and the transcription promoting activity of the second promoter is higher than that of the first promoter. Is also low
The multi-cloning vector according to claim 1. 【請求項３】真核細胞内において機能しうるプロモータ
ー領域、およびそのプロモーター領域下流にそのプロモ
ーターによって支配された異種蛋白質構造遺伝子を有
し、異種蛋白質構造遺伝子先端部分が５’側から−ＡＣ
ＡＴＧＮ−（Ｎは任意の塩基）なる配列を有し、この配
列におけるＡＴＧが異種蛋白質構造遺伝子の翻訳開始部
位であり、しかもこの配列がベクターに異種蛋白質構造
遺伝子が導入された際の制限酵素認識部位に由来する配
列であることを特徴とする発現ベクター。3. A promoter region capable of functioning in a eukaryotic cell, and a heterologous protein structural gene under the control of the promoter region downstream of the promoter region, wherein the heterologous protein structural gene front end is from the 5 ′ side to −AC.
ATGN- (N is an arbitrary base), the ATG in this sequence is the translation initiation site of the heterologous protein structural gene, and this sequence recognizes the restriction enzyme when the heterologous protein structural gene is introduced into the vector. An expression vector, which is a sequence derived from a site. 【請求項４】−ＡＣＡＴＧＮ−なる配列が、−Ａなるベ
クター側末端とＣＡＴＧＮ−なる異種蛋白質構造遺伝子
側先端との連結によって、または、−ＡＣＡＴＧなるベ
クター側末端とＮ−なる異種蛋白質構造遺伝子側先端と
の連結によって、形成された配列である、請求項３の発
現ベクター。4. A sequence of -ACATGN- is linked to a vector-side end of -A and a heterologous protein structural gene end of CATGN-, or a -ACATGN vector-side end and a heterologous protein structural gene side of N-. The expression vector according to claim 3, which is a sequence formed by ligation with a tip. 【請求項５】プロモーター末端と異種蛋白質構造遺伝子
の翻訳開始部位との間に非翻訳領域を有し、その非翻訳
領域の長さが２０〜２００ｂｐである、請求項３または
４の発現ベクター。5. The expression vector according to claim 3, which has an untranslated region between the promoter terminal and the translation initiation site of the heterologous protein structural gene, and the length of the untranslated region is 20 to 200 bp. 【請求項６】ベクターがさらに第２のプロモーター領域
とその第２のプロモーターによって支配される抗生物質
耐性遺伝子を有し、かつ第２のプロモーターの転写促進
活性が第１のプロモーターの転写促進活性よりも低い、
請求項３、４または５の発現ベクター。6. The vector further has a second promoter region and an antibiotic resistance gene controlled by the second promoter, and the transcription promoting activity of the second promoter is higher than that of the first promoter. Is also low
The expression vector according to claim 3, 4 or 5. 【請求項７】真核細胞内において機能しうるプロモータ
ー領域を有するベクターのプロモーター領域下流にその
プロモーターによって支配される異種蛋白質構造遺伝子
を導入する方法において、５’側から−ＡＣＡＴＧＴ−
なる配列を有する制限酵素認識部位で切断したベクター
末端に５’側から−Ｎ’ＣＡＴＧＮ−（Ｎは任意の塩
基、Ｎ’はＮに相補的な塩基）なる配列を有する制限酵
素認識部位で切断した異種蛋白質構造遺伝子の先端を連
結して−ＡＣＡＴＧＮ−なる配列の連結部分を形成し、
その連結部分のＡＴＧを異種蛋白質構造遺伝子の翻訳開
始部位とし、しかもベクター側の制限酵素認識切断部末
端と異種蛋白質構造遺伝子側の制限酵素認識切断部先端
の組合せによりＡＴＧの次の塩基をＡ、Ｔ、Ｇ、および
Ｃから選ばれる任意の塩基とすることを特徴とする真核
細胞内で発現しうる発現ベクターの構築方法。7. A method of introducing a heterologous protein structural gene under the control of a promoter region downstream of a promoter region of a vector having a promoter region capable of functioning in a eukaryotic cell, from the 5'side to -ACATGT-
Cleavage at the restriction enzyme recognition site having a sequence from the 5'side to -N'CATGN- (N is an arbitrary base, N'is a complementary base to N) at the end of the vector cleaved at the restriction enzyme recognition site having the sequence The ends of the heterologous protein structural genes described above are ligated to form a ligated portion of the sequence -ACATGN-,
The ATG at the connecting portion is used as the translation initiation site of the heterologous protein structural gene, and the base next to the ATG is A by the combination of the end of the restriction enzyme recognition cleavage part on the vector side and the tip of the restriction enzyme recognition cleavage part on the heterologous protein structural gene side. A method for constructing an expression vector capable of being expressed in a eukaryotic cell, which comprises using any base selected from T, G, and C. 【請求項８】ベクター側制限酵素認識部位を切断する制
限酵素がＡｆｌ ＩＩＩまたはＮｓｐ Ｉであり、異種
蛋白質構造遺伝子側制限酵素認識部位を切断する制限酵
素がＮｃｏ Ｉ、Ｂｓｐ ＨＩ、Ａｆｌ ＩＩＩ、Ｎｓ
ｐ Ｉ、またはＳｐｈ Ｉである、請求項７の発現ベク
ターの構築方法。8. The restriction enzyme that cuts the restriction enzyme recognition site on the vector side is Afl III or Nsp I, and the restriction enzymes that cuts the restriction enzyme recognition site on the heterologous protein structural gene side are Nco I, Bsp HI, Afl III, Ns.
The method for constructing an expression vector according to claim 7, which is pI or SphI. 【請求項９】ベクターがさらに第２のプロモーター領域
とその第２のプロモーターによって支配される抗生物質
耐性遺伝子を有し、かつ第２のプロモーターの転写促進
活性が第１のプロモーターの転写促進活性よりも低い、
請求項７または８の発現ベクターの構築方法。9. The vector further has a second promoter region and an antibiotic resistance gene controlled by the second promoter, and the transcription promoting activity of the second promoter is higher than that of the first promoter. Is also low
A method for constructing the expression vector according to claim 7 or 8. 【請求項１０】複製開始点を有しない請求項３、４、５
または６の発現ベクターを複製開始点を有する酵母ベク
ターと人為的にあるいは酵母内で自動的に組換えて複製
開始点を有する発現ベクターを構築する、発現ベクター
の構築方法。10. The method according to claim 3, 4, 5 having no replication starting point.
Alternatively, a method for constructing an expression vector, which comprises constructing an expression vector having a replication origin by artificially or automatically recombining the expression vector of 6 with a yeast vector having a replication origin. 【請求項１１】請求項３、４、５または６の発現ベクタ
ーまたはその発現ベクターと複製開始点を有する酵母ベ
クターとの組換え体を保持するシゾサッカロミセス・ポ
ンベからなる形質転換体。11. A transformant comprising Schizosaccharomyces pombe carrying the expression vector of claim 3, 4, 5 or 6 or a recombinant of the expression vector and a yeast vector having a replication origin. 【請求項１２】請求項１１の形質転換体を培養し、培養
物中に異種蛋白質を生成蓄積させ、これを採取すること
を特徴とする異種蛋白質の製造法。12. A method for producing a heterologous protein, which comprises culturing the transformant according to claim 11, allowing the heterologous protein to be produced and accumulated in the culture, and collecting the heterologous protein. 【請求項１３】請求項１１の形質転換体が、請求項６の
発現ベクターまたはその発現ベクターと複製開始点を有
する酵母ベクターとの組換え体を保持するシゾサッカロ
ミセス・ポンベからなる、請求項１２の製造法。13. The transformant according to claim 11, which comprises Schizosaccharomyces pombe carrying the expression vector according to claim 6 or a recombinant of the expression vector and a yeast vector having a replication origin. 12 manufacturing methods. 【請求項１４】発現ベクターが有する抗生物質耐性遺伝
子に対応する抗生物質を含有する培養液中で形質転換体
を培養する、請求項１３の製造法。14. The method according to claim 13, wherein the transformant is cultured in a culture medium containing an antibiotic corresponding to the antibiotic resistance gene contained in the expression vector.