JPH10113174A - Simultaneous production of human cytochrome p-450 and human cytochrome p450 reductase - Google Patents
Simultaneous production of human cytochrome p-450 and human cytochrome p450 reductaseInfo
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- JPH10113174A JPH10113174A JP8286148A JP28614896A JPH10113174A JP H10113174 A JPH10113174 A JP H10113174A JP 8286148 A JP8286148 A JP 8286148A JP 28614896 A JP28614896 A JP 28614896A JP H10113174 A JPH10113174 A JP H10113174A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子組換え技術
を用いてヒトシトクロムP−450とヒトシトクロムP
−450還元酵素を同一宿主内において簡便にかつ効率
よく同時に産生、製造する方法に関する。[0001] The present invention relates to a human cytochrome P-450 and a human cytochrome P using a gene recombination technique.
The present invention relates to a method for simultaneously and efficiently producing and producing -450 reductase in the same host.
【0002】[0002]
【従来の技術】一般に、遺伝子組換え技術による異種タ
ンパク質の製造は、目的とする異種タンパク質をコード
する遺伝子をベクターに組み込み、得られた組換えベク
ターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、これを
培養して培養液中に異種タンパク質を産生させることに
よって行っている。このような異種タンパク質を発現さ
せる宿主として、従来より、動物細胞、大腸菌(Escher
ichia coli)、酵母サッカロミセス・セレビシエ(Sacc
haromyces cerevisiae)等が汎用されてきた。2. Description of the Related Art In general, production of a heterologous protein by genetic recombination technology involves incorporating a gene encoding a desired heterologous protein into a vector and introducing the resulting recombinant vector into a host cell to produce a transformant. This is performed by culturing this to produce a heterologous protein in the culture solution. As a host for expressing such a heterologous protein, animal cells, Escherichia coli (Escher
ichia coli, yeast Saccharomyces cerevisiae (Sacc
haromyces cerevisiae) and the like have been widely used.
【0003】ところで、多種多様な水酸化反応を行う酵
素群であるシトクロムP−450は、生物界に広く存在
し、その生化学的に多様な機能から近年、注目を浴びて
おり、イン・ビトロ薬物代謝実験などに用いられてい
る。このためシトクロムP−450を遺伝組換え技術を
用いて効率的に、しかも大量に生産する技術の開発が行
われるようになった。[0003] By the way, cytochrome P-450, which is a group of enzymes that perform a wide variety of hydroxylation reactions, is widely present in the biological world, and has recently attracted attention due to its biochemically diverse functions. It is used for drug metabolism experiments. For this reason, a technique for efficiently producing cytochrome P-450 in large quantities by using genetic recombination technology has been developed.
【0004】なかでもヒト由来のシトクロムP−450
(以下、単に「ヒトP−450」と略記)を発現させる
宿主として、動物細胞、大腸菌(E. coli)、酵母サッ
カロミセス・セレビシエ(S. cerevisiae)等が試みら
れてきた。これら宿主に、目的とするヒトP−450を
コードする構造遺伝子領域を含む発現ベクターを導入
し、この発現系を用いて目的とするヒトP−450を多
量に製造する方法が広く検討され、すでに一部のヒトP
−450の製造に実用化されている。[0004] Among them, human-derived cytochrome P-450
Animal cells, Escherichia coli (E. coli), yeast Saccharomyces cerevisiae, and the like have been tried as hosts for expressing (hereinafter simply referred to as "human P-450"). A method for introducing an expression vector containing a structural gene region encoding a target human P-450 into these hosts, and producing a large amount of the target human P-450 using this expression system has been widely studied. Some human P
-450 has been put to practical use.
【0005】ところで遺伝子組換え技術を用いてP−4
50反応系に類似した酵素反応系を再現し、有用な反応
生成物を得ることを目的とする場合、P−450の反応
は細胞内小器官である小胞体の構造に依存しており、さ
らに、反応系にはP−450還元酵素が共存しなければ
ならない。[0005] By the way, P-4 using a gene recombination technique.
When the objective is to reproduce an enzyme reaction system similar to the 50 reaction system and obtain a useful reaction product, the reaction of P-450 depends on the structure of the endoplasmic reticulum, which is an intracellular organelle. In addition, P-450 reductase must coexist in the reaction system.
【0006】ヒトP−450タンパク質発現の宿主とし
て、特に酵母細胞が頻用されているが、その理由の1つ
は、酵母細胞が真核細胞であるため高等動物に類似した
小胞体の構造を持っていることにある。したがってヒト
P−450の反応に必要なヒトP−450タンパク質お
よびヒトP−450還元酵素タンパク質が酵母発現系で
小胞体の構造を介して生体内反応を実現するためには、
ヒトP−450タンパク質およびヒトP−450還元酵
素タンパク質を宿主酵母内で同時に発現させ、かつ酵母
に由来する細胞内構造を保持したミクロソーム分画とし
て酵素を回収する必要がある。このような方法として
は、現在までのところ、P−450およびP−450還
元酵素を融合酵素として単一のポリペプチドとして発現
する方法、宿主の栄養要求性や薬剤耐性などの複数の選
択マーカーを用いて複数の組換えベクターを宿主内に保
持させる方法、単一の発現ベクターに複数の構造遺伝子
およびそれらの遺伝子の発現を制御するプロモータを導
入する方法などが知られている。[0006] Yeast cells are particularly frequently used as a host for human P-450 protein expression. One of the reasons is that yeast cells are eukaryotic and have a structure of an endoplasmic reticulum similar to higher animals. Is to be. Therefore, in order for human P-450 protein and human P-450 reductase protein necessary for the reaction of human P-450 to realize an in vivo reaction via the structure of the endoplasmic reticulum in a yeast expression system,
It is necessary to simultaneously express human P-450 protein and human P-450 reductase protein in the host yeast, and to recover the enzyme as a microsomal fraction retaining the intracellular structure derived from the yeast. Such methods include, to date, a method in which P-450 and P-450 reductase are expressed as a single polypeptide as a fusion enzyme, and multiple selection markers such as auxotrophy and drug resistance of the host. There are known a method of using a plurality of recombinant vectors in a host, a method of introducing a plurality of structural genes into a single expression vector and a promoter controlling the expression of those genes, and the like.
【0007】[0007]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
方法による酵母発現系では、P−450遺伝子を含む発
現ベクターとP−450還元酵素遺伝子を含む発現ベク
ターを同時に保持する組換体を選択するためには、複数
の宿主栄養要求性をそれぞれ相補する複数のベクター
か、宿主栄養要求性を相補するベクターと薬剤耐性を付
与するベクターを組み合わせて形質転換を行い、複数の
条件でスクリーニングをする必要があった。さらに、そ
れらの発現ベクターがいずれも多コピープラスミドであ
る場合、それぞれのプラスミドのコピー数を独立にコン
トロールする方法はなかった。However, in the yeast expression system according to the conventional method, it is necessary to select a recombinant which simultaneously holds an expression vector containing a P-450 gene and an expression vector containing a P-450 reductase gene. It is necessary to perform transformation using a plurality of vectors each complementing a plurality of host auxotrophy or a combination of a vector complementing a host auxotrophy and a vector conferring drug resistance, and screening under a plurality of conditions. Was. Furthermore, when all of these expression vectors are multicopy plasmids, there has been no method for independently controlling the copy number of each plasmid.
【0008】P−450とP−450還元酵素とを融合
酵素として単一のポリペプチドとして発現させるために
は、遺伝子上のアミノ酸の読み枠をずらさないような融
合遺伝子の構築が必要であり、発現ベクターの構築方法
が煩雑であった。In order to express P-450 and P-450 reductase as a single polypeptide as a fusion enzyme, it is necessary to construct a fusion gene that does not shift the reading frame of amino acids on the gene. The construction method of the expression vector was complicated.
【0009】また、単一の発現ベクターによってP−4
50とP−450還元酵素を発現させる場合、P−45
0還元酵素と組み合わせるP−450の分子種ごとに発
現ベクターを構築する必要があるうえ、プラスミドのサ
イズが大きくなるために、酵母細胞の形質転換効率が低
下し、プラスミドのコピー数も減少する傾向があった。[0009] In addition, P-4 is expressed by a single expression vector.
When expressing 50 and P-450 reductase, P-45
It is necessary to construct an expression vector for each P-450 molecular species to be combined with zero reductase, and the size of the plasmid increases, so that the transformation efficiency of yeast cells decreases and the copy number of the plasmid tends to decrease. was there.
【0010】[0010]
【課題を解決するための手段】本発明者らはこのような
現状に鑑み、ヒトP−450およびヒトP−450還元
酵素タンパク質を同一の宿主細胞内で発現させるため
に、1種類の選択マーカーを用いて複数の発現ベクター
を同一宿主内保持させることを可能にし、しかも発現ベ
クターの構築方法が簡便な方法について検討した。Means for Solving the Problems In view of such circumstances, the present inventors have proposed a method for expressing human P-450 and human P-450 reductase protein in the same host cell using one type of selection marker. The present inventors have studied a method that allows multiple expression vectors to be maintained in the same host by using the method, and that allows a simple method for constructing the expression vector.
【0011】すなわち本発明者らは、宿主細胞内に保持
され、ヒトP−450とヒトP−450還元酵素を同時
に発現させる多コピープラスミドタイプの発現ベクター
を開発する必要があると考え、宿主細胞内における相同
的組換えによって連結することができ、かつ単一の選択
マーカーによって組換体を選択し得る発現ベクターの構
造について検討した。その結果、ヒトP−450遺伝子
を含む発現ベクター、ヒトP−450還元酵素遺伝子を
含む発現ベクターのそれぞれが、相同的組換えを起す共
通の配列部位として大腸菌薬剤耐性選択マーカー、特に
アンピシリン耐性遺伝子を持ち、かつそれらの発現ベク
ターのうちいずれか一方のみが、好ましくはP−450
還元酵素発現ベクターのみが、宿主栄養要求性選択マー
カー、特にLEU2遺伝子を持ち、および宿主細胞内で
機能し得るDNA複製開始点、特に酵母自律複製配列を
持つような構造を有し、そしてこれら2つの発現ベクタ
ーを宿主内において融合させることにより、該融合した
ベクターが宿主細胞内において安定に保持され、1回の
スクリーニングによって目的の形質転換体を選択し得る
ことを認めた。これらの発現ベクターは、宿主細胞内で
は連結された形で融合し保持されるが、構築は独立して
行うことができ、しかも、いったん構築されたものは自
由に組み合わせることが可能である。That is, the present inventors have considered that it is necessary to develop a multi-copy plasmid type expression vector capable of simultaneously expressing human P-450 and human P-450 reductase in a host cell, The structure of an expression vector that can be ligated by homologous recombination within and select a recombinant with a single selectable marker was examined. As a result, each of the expression vector containing the human P-450 gene and the expression vector containing the human P-450 reductase gene contains an Escherichia coli drug resistance selection marker, particularly an ampicillin resistance gene, as a common sequence site for causing homologous recombination. And only one of these expression vectors is preferably P-450
Only the reductase expression vector carries a host auxotrophic selectable marker, especially the LEU2 gene, and has a structure such that it has a DNA replication origin that can function in a host cell, particularly a yeast autonomously replicating sequence. It was confirmed that by fusing two expression vectors in a host, the fused vector was stably maintained in the host cell, and the desired transformant could be selected by one screening. These expression vectors are fused and held in a linked form in a host cell, but can be constructed independently, and once constructed, can be freely combined.
【0012】すなわち本発明は、大腸菌に薬剤耐性を付
与する選択マーカー遺伝子と、ヒトシトクロムP−45
0をコードする構造遺伝子領域を含有する第1の発現ベ
クターと、前記第1の発現ベクターが有する大腸菌に薬
剤耐性を付与する選択マーカー遺伝子と同一の選択マー
カー遺伝子と、ヒトシトクロムP−450還元酵素をコ
ードする構造遺伝子領域を含有する第2の発現ベクタ
ー、であって、さらに上記第1の発現ベクター、第2の
発現ベクターのいずれか一方のみが、さらに、宿主内で
機能し得る複製開始点を含む遺伝子配列と、宿主の栄養
要求性を相補する選択マーカーと、上記大腸菌に薬剤耐
性を付与する選択マーカー遺伝子内に当該一方の発現ベ
クターを1箇所のみで切断し得る特異的な制限酵素切断
部位を持つ、ような上記第1、第2の発現べクターを作
製し、次いで上記制限酵素切断部位で前記一方の発現ベ
クターを切断した後、上記第1の発現ベクターと第2の
発現ベクターを同時に同一宿主細胞内に導入して宿主細
胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養してヒトシ
トクロムP−450とヒトシトクロムP−450還元酵
素を同時に産生させ、これら両者を回収することを特徴
とする、ヒトシトクロムP−450とヒトシトクロムP
−450還元酵素の同時製造方法に関するものである。That is, the present invention relates to a selectable marker gene for conferring drug resistance on Escherichia coli and a human cytochrome P-45.
A first expression vector containing a structural gene region encoding 0, a selectable marker gene which imparts drug resistance to Escherichia coli which the first expression vector has, and a human cytochrome P-450 reductase A second expression vector containing a structural gene region encoding the following, wherein only one of the first expression vector and the second expression vector further functions in a host: , A selectable marker that complements the auxotrophy of the host, and a specific restriction enzyme cleavage that can cleave the expression vector at only one site in the selectable marker gene that confers drug resistance to Escherichia coli. After preparing the first and second expression vectors having such a site, and then cleaving the one expression vector with the restriction enzyme cleavage site, The first expression vector and the second expression vector are simultaneously introduced into the same host cell to transform the host cell, and the resulting transformant is cultured to obtain human cytochrome P-450 and human cytochrome P-450. A human cytochrome P-450 and a human cytochrome P, characterized by simultaneously producing reductase and recovering both of them.
The present invention relates to a method for simultaneously producing -450 reductase.
【0013】ここで、上記宿主細胞として***酵母シゾ
サッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pomb
e)を用いることにより、製造効率を大幅に向上させる
ことができる。Here, the fission yeast Schizosaccharomyces pombe is used as the host cell.
By using e), the production efficiency can be greatly improved.
【0014】[0014]
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳述する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail.
【0015】本発明の製造方法では、ヒトシトクロムP
−450をコードする構造遺伝子領域を含有する第1の
発現ベクターと、ヒトシトクロムP−450還元酵素を
コードする遺伝子領域を含有する第2の発現ベクターが
用いられ、これら第1、第2の発現ベクターはともに、
大腸菌に薬剤耐性を付与する同一の選択マーカー遺伝子
を有している。この選択マーカー遺伝子は両発現ベクタ
ーの相同的組換えを起こす共通の配列部位をなし、後述
するように宿主細胞内における両発現ベクターの融合
時、この部位で両発現ベクターが連結された形で形質転
換体内に保持される。大腸菌に薬剤耐性を付与する選択
マーカー遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子が好
ましく用いられるが、これに限定されるものでないこと
はもちろんである。また、これら発現ベクターを多コピ
ーし得る宿主であれば、大腸菌以外でも任意に使用で
き、その場合、それに応じた好適な薬剤耐性付与選択マ
ーカー遺伝子を用いることができるが、いずれの場合に
あっても、両発現ベクターが同一の選択マーカー遺伝子
を有している必要がある。In the production method of the present invention, human cytochrome P
A first expression vector containing a structural gene region encoding -450 and a second expression vector containing a gene region encoding human cytochrome P-450 reductase are used, and these first and second expression vectors are used. Both vectors are
It has the same selectable marker gene that confers drug resistance on E. coli. This selectable marker gene forms a common sequence site that causes homologous recombination of both expression vectors. As described below, when both expression vectors are fused in a host cell, the expression is carried out by linking both expression vectors at this site. It is held in the conversion body. As a selectable marker gene for imparting drug resistance to Escherichia coli, an ampicillin resistance gene is preferably used, but is not limited to this. In addition, any host other than Escherichia coli can be used arbitrarily as long as it is a host capable of copying these expression vectors in multiple copies, and in that case, a suitable drug resistance imparting selectable marker gene can be used. Also, both expression vectors need to have the same selectable marker gene.
【0016】そして、本発明では、第1、第2の発現ベ
クターのいずれか一方のみが、さらに、宿主内で機能し
得る複製開始点を含む遺伝子配列と、宿主の栄養要求性
を相補する選択マーカーと、上記大腸菌に薬剤耐性を付
与する選択マーカー遺伝子内に当該一方の発現ベクター
を1箇所のみで切断し得る特異的な制限酵素切断部位を
持つよう構成されている。「宿主の栄養要求性を相補す
る」選択マーカーを有するとは、例えば宿主がロイシン
要求性株であるような場合、宿主にロイシンを供給し得
るような選択マーカーを有することを意味する。いずれ
か一方の発現ベクターのみがこのような構造を持つこと
により、異なる複数の宿主栄養要求性株を用いる必要が
なく、1種類の栄養要求性株、例えばLEU要求性株だ
けを用いて、所望の形質転換体を容易に選択することが
できる。本発明では、このような一方の発現ベクターと
しては、ヒトシトクロムP−450還元酵素発現ベクタ
ー(第2の発現ベクター)を用いるのが好ましい。In the present invention, only one of the first and second expression vectors further comprises a gene sequence containing an origin of replication capable of functioning in the host and a selection sequence that complements the auxotrophy of the host. It is configured to have a marker and a specific restriction enzyme cleavage site capable of cleaving the one expression vector at only one site in the selectable marker gene for imparting drug resistance to Escherichia coli. Having a selectable marker that "complements the auxotrophy of the host" means having a selectable marker that can supply leucine to the host, for example, when the host is a leucine auxotroph. Since only one of the expression vectors has such a structure, it is not necessary to use a plurality of different host auxotrophic strains. Can easily be selected. In the present invention, it is preferable to use a human cytochrome P-450 reductase expression vector (second expression vector) as such one expression vector.
【0017】そして、上記制限酵素切断部位で該当する
一方の発現ベクターを切断した後、上記第1の発現ベク
ターと第2の発現ベクターを同時に同一宿主細胞内に導
入して宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培
養することによって、ヒトシトクロムP−450とヒト
シトクロムP−450還元酵素の同時産生させる。ここ
で、第1の発現ベクターと第2の発現ベクターがともに
同一の薬剤耐性選択マーカーを有することにより、この
部分が両発現ベクターの相同的組換えを起こす共通の配
列部位をなし、この部位で両発現ベクターが連結された
形で形質転換体内に保持される。Then, after the corresponding expression vector is cleaved at the restriction enzyme cleavage site, the host cell is transformed by simultaneously introducing the first expression vector and the second expression vector into the same host cell. By culturing the obtained transformant, human cytochrome P-450 and human cytochrome P-450 reductase are simultaneously produced. Here, since both the first expression vector and the second expression vector have the same drug resistance selection marker, this portion forms a common sequence site that causes homologous recombination of both expression vectors. Both expression vectors are maintained in a transformed form in a ligated form.
【0018】第1、第2の発現ベクターは、それぞれ、
ヒトシトクロムP−450をコードする構造遺伝子領
域、ヒトシトクロムP−450還元酵素をコードする構
造遺伝子領域を含有するが、両発現ベクターとも、これ
ら各構造遺伝子が発現し得るに必要な配列等を有してい
る必要があり、各構造遺伝子領域上流に宿主細胞内にお
いて機能し得るプロモーター領域を持っている。The first and second expression vectors are, respectively,
Both expression vectors contain a structural gene region encoding human cytochrome P-450 and a structural gene region encoding human cytochrome P-450 reductase, and both expression vectors have sequences necessary for each of these structural genes to be expressed. It has a promoter region that can function in a host cell upstream of each structural gene region.
【0019】本発明に用いられるヒトP−450をコー
ドする構造遺伝子としては、すでに知られている種々の
ヒトP−450アミノ酸配列をコードし、望ましくは遺
伝子組換えに用いる宿主細胞のコドン使用頻度に最頻度
で使用されるコドンで設計されたものが好ましく、例え
ば、ヒトP−450 2D6遺伝子(Gonzalez, F. J.
, et al., "Genomics", vol. 2, pp. 174-179(1988))
等を好適に用いることができる。The structural gene encoding human P-450 used in the present invention encodes various known amino acid sequences of human P-450, and is preferably a codon usage of a host cell used for genetic recombination. Designed with the most frequently used codons are preferred, for example, the human P-450 2D6 gene (Gonzalez, FJ
, et al., "Genomics", vol. 2, pp. 174-179 (1988))
Etc. can be suitably used.
【0020】また本発明に用いられるヒトP−450還
元酵素をコードする遺伝子としても、上記と同様に、す
でに知られている種々のヒトP−450還元酵素のアミ
ノ酸配列をコードし、望ましくは遺伝子組換えに用いる
宿主細胞のコドン使用頻度に最頻度で使用されるコドン
で設計されたものが好ましい。The gene encoding human P-450 reductase used in the present invention also encodes the amino acid sequences of various known human P-450 reductases as described above. Those designed with the codon used most frequently for the codon usage of the host cell used for recombination are preferred.
【0021】用いる宿主細胞としては、望ましくは培養
方法が容易で、低コストで培養できる微生物がよく、例
えば大腸菌、各種酵母類、枯草菌、糸状菌、当業分野で
常用されている宿主細胞等が挙げられる。本発明では、
これらのなかでも特に、遺伝学的並びに分子生物学的に
動物細胞に近い性質をもつとされ、より天然体に近い遺
伝子産物が得られることが期待される***酵母シゾサッ
カロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)が
最も好ましい。シゾサッカロミセス・ポンベは***酵母
シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)に属す
る酵母であり、酵母類のなかでは動物細胞に近い性質を
示すことが知られており、例えばその膜脂質組成につい
ては動物細胞のものと類似していることが報告されてい
る。本発明では、宿主の栄養要求性としてはロイシン要
求性株やウラシル要求性株等が好ましく用いられる。こ
のようなシゾサッカロミセス・ポンベの菌株としては、
例えば寄託番号ATCC38399(leu1−32h
-)やATCC38436(ura4−294h-)等と
してアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
(ATCC)に寄託されているものが挙げられ、入手可
能である。The host cell used is preferably a microorganism which can be easily cultured at low cost and which can be cultured at low cost, for example, Escherichia coli, various yeasts, Bacillus subtilis, filamentous fungi, host cells commonly used in the art, and the like. Is mentioned. In the present invention,
Among these, the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, which is considered to have properties close to animal cells in terms of genetics and molecular biology and is expected to obtain a gene product closer to the natural form. ) Is most preferred. Schizosaccharomyces pombe is a yeast belonging to the fission yeast Schizosaccharomyces, and among yeasts, it is known that it exhibits properties close to animal cells. Similar to those reported. In the present invention, as the auxotrophy of the host, a leucine auxotroph, a uracil auxotroph, and the like are preferably used. Such strains of Schizosaccharomyces pombe include:
For example, the deposit number ATCC38399 (leu1-32h)
-) and ATCC38436 (ura4-294h -) such as those that have been deposited with the American Type Culture Collection (ATCC) and the like as, is available.
【0022】そして、ヒトP−450をコードする構造
遺伝子、ヒトP−450還元酵素をコードする遺伝子を
各ベクターに組み込んで各発現ベクターを作製する。用
いるベクターは特に限定されるものではないが、宿主細
胞内で自律的に複製可能であって、上記遺伝子(外来遺
伝子)を組込み得る挿入部位をもち、さらにこの組み込
んだ遺伝子を宿主細胞内で発現せしめることを可能とす
る領域を有する必要がある。このようなベクターとし
て、例えば本発明者らがすでに創出に成功しているシゾ
サッカロミセス・ポンベを宿主とする外来遺伝子発現ベ
クターpTL2M(特開平7−163373号公報)
や、公知のpAL7等を有利に用いることができる。Then, each expression vector is prepared by incorporating a structural gene encoding human P-450 and a gene encoding human P-450 reductase into each vector. The vector to be used is not particularly limited, but has an insertion site capable of autonomously replicating in the host cell and having the above-mentioned gene (foreign gene) inserted therein, and further expressing the inserted gene in the host cell. It is necessary to have an area that can be used. As such a vector, for example, a foreign gene expression vector pTL2M using Schizosaccharomyces pombe as a host, which has been successfully created by the present inventors (JP-A-7-163373).
Alternatively, known pAL7 and the like can be advantageously used.
【0023】次いで上記各発現ベクターを宿主細胞内に
同時に導入し、形質転換体を得る。この際、上述したよ
うに、いずれか一方の発現ベクターの薬剤耐性選択マー
カー遺伝子の制限酵素切断部位で切断する。これによ
り、宿主内において、当該切断部位で両発現ベクターが
連結し、安定に宿主細胞内に保持される。発現ベクター
の宿主細胞内への導入法は、従来慣用的に用いられてい
る方法により行うことができ、コンピテント細胞法、プ
ロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロ
ポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソ
ーム融合法、パーティクル・ガン法等、種々のものが挙
げられるが、用いる宿主に応じてそれぞれ任意の方法を
取り得る。シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とする場
合は、例えば酢酸リチウム法(K. Okazaki et al., “N
ucleic Acids Res.”, vol. 18, pp. 6485-6489 (1990)
)等によって効率よく形質転換体を得ることができる。Next, the above-described expression vectors are simultaneously introduced into host cells to obtain transformants. At this time, as described above, cleavage is performed at the restriction enzyme cleavage site of the drug resistance selection marker gene of one of the expression vectors. As a result, in the host, both expression vectors are linked at the cleavage site, and are stably maintained in the host cell. The method of introducing an expression vector into a host cell can be carried out by a conventionally used method, such as a competent cell method, a protoplast method, a calcium phosphate coprecipitation method, an electroporation method, a microinjection method, and a liposome. Various methods, such as a fusion method and a particle gun method, can be mentioned, but any method can be used depending on the host used. When Schizosaccharomyces pombe is used as a host, for example, the lithium acetate method (K. Okazaki et al., “N.
ucleic Acids Res. ", vol. 18, pp. 6485-6489 (1990)
) And the like, a transformant can be obtained efficiently.
【0024】このようにして得られた形質転換体を培養
することにより、培養物中にヒトP−450タンパク質
並びにヒトP−450還元酵素が同時に産生される。産
生されたヒトP−450並びにヒトP−450還元酵素
は、そのほとんどが酵母ミクロソーム画分に局在する。
したがって、形質転換体を培養後、ヒトP−450並び
にヒトP−450還元酵素を分離、精製することも可能
であるが、これを分離せずにミクロソーム画分を種々の
水酸化反応に用いることも可能である。ミクロソーム画
分の分離は、公知の方法で行うことができ、例えば、菌
体をプロトプラスト化、超音波破砕後、遠心分離するこ
とにより容易に得ることができる。By culturing the thus obtained transformant, human P-450 protein and human P-450 reductase are simultaneously produced in the culture. Most of the produced human P-450 and human P-450 reductase are localized in the yeast microsomal fraction.
Therefore, after culturing the transformant, human P-450 and human P-450 reductase can be separated and purified, but the microsomal fraction can be used for various hydroxylation reactions without separation. Is also possible. The microsomal fraction can be separated by a known method, and for example, can be easily obtained by protoplasting the cells, sonication, and centrifuging.
【0025】形質転換体を得るための培地は公知であ
り、YPD培地などの栄養培地(M. D. Rose et al.,
“Methods In Yeast Genetics”,Cold Spring Harbor L
aboratory Press(1990))や、MB培地などの最少培地
(K. Okazaki et al., “NucleicAcids Res.”, vol.1
8, pp. 6485-6489 (1990))等を用いることができる。
形質転換体の培養は、通常16〜42℃、好ましくは2
5〜37℃で、8〜168時間、好ましくは24〜72
時間行う。振盪培養と静置培養のいずれも可能である
が、必要に応じて撹拌や通気を加えてもよい。A medium for obtaining a transformant is known, and a nutrient medium such as a YPD medium (MD Rose et al.,
“Methods In Yeast Genetics”, Cold Spring Harbor L
aboratory Press (1990)) and minimal medium such as MB medium (K. Okazaki et al., “NucleicAcids Res.”, vol.1)
8, pp. 6485-6489 (1990)).
Culture of the transformant is usually performed at 16 to 42 ° C, preferably 2 to 42 ° C.
8 to 168 hours at 5 to 37 ° C., preferably 24 to 72 hours
Do time. Both shaking culture and stationary culture are possible, but stirring or aeration may be added as necessary.
【0026】培養物中に産生したヒトP−450並びに
ヒトP−450還元酵素を単離・精製する場合は、公知
の方法で行うことができ、例えば塩析または溶媒沈殿法
等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過または
ゲル電気泳動法等の分子量の差を利用する方法、イオン
交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、
アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎
水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点
を利用する方法等が挙げられる。In the case of isolating and purifying human P-450 and human P-450 reductase produced in the culture, known methods can be used, for example, differences in solubility such as salting out or solvent precipitation. A method using a difference in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration or gel electrophoresis, a method using a difference in charge such as ion exchange chromatography,
Methods utilizing specific affinity such as affinity chromatography, methods utilizing the difference in hydrophobicity such as reversed phase high performance liquid chromatography, and methods utilizing the isoelectric point such as isoelectric focusing electrophoresis. .
【0027】産生されたタンパク質の確認方法として
は、公知のウエスタンブロッティング法や活性測定法等
が挙げられる。また、精製されたタンパク質は、アミノ
酸分析、アミノ末端(N−末端)分析、一次構造解析な
どによりその構造を明らかにすることができる。As a method for confirming the produced protein, there are known Western blotting method and activity measuring method. Further, the structure of the purified protein can be clarified by amino acid analysis, amino terminal (N-terminal) analysis, primary structure analysis, or the like.
【0028】[0028]
【実施例】以下に実施例により本発明を具体的に説明す
る。ただし、本発明はこれら実施例によりその技術的範
囲がなんら限定されるものでない。The present invention will be specifically described below with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by these examples.
【0029】[実施例1]ヒトP−450 2D6遺伝
子を含む発現ベクターの作製、およびヒトNADPH−
P450還元酵素遺伝子を含む発現ベクターの作製 公知のヒトP−450 2D6遺伝子配列を以下のプラ
イマー 5'-TTTCCATGGGGCTAGAAGCACTGG-3' および 5'-GG
GAAGCTTCTAGCGGGGCACAGCACAAA-3' を用いてPCR法に
より増幅し、得られた産物を制限酵素NcoI、Hin
dIIIで切断した。他方、公知の酵母(特開平7−1
63373号公報)を制限酵素AflIII、Hind
IIIで切断した。これに上記NcoI、HindII
Iで切断したヒトP−450 2D6遺伝子をライゲー
ションした後、大腸菌DH5株(東洋紡(株))に導入
して形質転換体を得た。得られた形質転換体よりベクタ
ーを調製し、目的とするベクターpTL2CYP2D6
(図1)を持った形質転換体をスクリーニングした。部
分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的と
するヒトP−450 2D6遺伝子を含む発現ベクター
pTL2CYP2D6であることを確認した。なお、図
1はこの発現ベクターpTL2CYP2D6の構築方法
を示すフローチャートである。同図中、ベクターpTL
2M、発現ベクターpTL2CYP2D6に含まれるA
mprは大腸菌にアンピシリン耐性を付与する選択マー
カー遺伝子であり、oriは大腸菌内での複製開始点で
あり、CMV pro.はサイトメガロウイルスプロモ
ーターであり、このCMVプロモーターの下流にヒトシ
トクロムPー450をコードする構造遺伝子領域が存在
する。[Example 1] Preparation of expression vector containing human P-450 2D6 gene and human NADPH-
Preparation of Expression Vector Containing P450 Reductase Gene A known human P-450 2D6 gene sequence was prepared using the following primers 5′-TTTCCATGGGGCTAGAAGCACTGG-3 ′ and 5′-GG
GAAGCTTCTAGCGGGGCACAGCACAAA-3 'was used to amplify by PCR and the resulting product was digested with restriction enzymes NcoI and Hin.
Cleavage with dIII. On the other hand, known yeasts (JP-A-7-17-1)
63373) and restriction enzymes AflIII, Hind
Cut at III. In addition to the above NcoI and HindII
After ligation of the human P-450 2D6 gene cut with I, it was introduced into Escherichia coli DH5 strain (Toyobo Co., Ltd.) to obtain a transformant. A vector was prepared from the obtained transformant, and the desired vector pTL2CYP2D6 was prepared.
Transformants having (FIG. 1) were screened. From the confirmation of the partial nucleotide sequence and the preparation of the restriction enzyme map, it was confirmed that the expression vector was the expression vector pTL2CYP2D6 containing the target human P-450 2D6 gene. FIG. 1 is a flowchart showing a method for constructing the expression vector pTL2CYP2D6. In the figure, the vector pTL
2M, A contained in the expression vector pTL2CYP2D6
mp r is a selectable marker gene that confers ampicillin resistance to E. coli, and ori is the replication origin in E. coli, CMV pro. Is a cytomegalovirus promoter, and a structural gene region encoding human cytochrome P-450 exists downstream of the CMV promoter.
【0030】一方、これとは別に、ヒトNADPH−P
450還元酵素遺伝子を公知のpTL2M CMVプロ
モーター下流に組み込んだベクターpTL2CYPOR
を還元酵素SpeI、HindIIIで切断、平滑末端
化し、CMVプロモーター/ヒトNADPH−P450
還元酵素遺伝子を得た。他方、公知の酵母ベクターpA
L7を制限酵素BsaAIで切断後、脱リン酸化した。
これに上記のCMVプロモーター/ヒトNADPH−P
450還元酵素遺伝子をライゲーションした後、大腸菌
DH5株(東洋紡(株))に導入して形質転換体を得
た。得られた形質転換体よりベクターを調製し、目的と
する発現ベクターpCSR(図2)を持った形質転換体
をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限
酵素地図の作製から目的とするヒトNADPH−P45
0還元酵素遺伝子を含む発現ベクターpCSRであるこ
とを確認した。なお、図2はこの発現ベクター pCS
Rの構築方法を示すフローチャートである。同図中、ベ
クターpAL、発現ベクターpCSRに含まれるars
は***酵母シゾサッカロミセス・ポンベ内において機能
し得る複製開始点であり、LEU2はシゾサッカロミセ
ス・ポンベの栄養要求性を相補する選択マーカーであ
り、Amprは大腸菌にアンピシリン耐性を付与する選
択マーカー遺伝子であり、この選択マーカー遺伝子内の
1点においてのみ制限酵素PvuIで発現ベクターpC
SRを特異的に切断し得るようになっている。On the other hand, human NADPH-P
Vector pTL2CYPOR incorporating the 450 reductase gene downstream of the known pTL2M CMV promoter
Was cut with reductases SpeI and HindIII, blunt-ended, and CMV promoter / human NADPH-P450
The reductase gene was obtained. On the other hand, the known yeast vector pA
L7 was digested with the restriction enzyme BsaAI and then dephosphorylated.
In addition, the above CMV promoter / human NADPH-P
After ligation of the 450 reductase gene, it was introduced into Escherichia coli DH5 strain (Toyobo Co., Ltd.) to obtain a transformant. A vector was prepared from the obtained transformant, and a transformant having the target expression vector pCSR (FIG. 2) was screened. Confirmation of partial nucleotide sequence and preparation of restriction enzyme map to target human NADPH-P45
It was confirmed to be an expression vector pCSR containing a 0 reductase gene. FIG. 2 shows the expression vector pCS
6 is a flowchart illustrating a method for constructing R. In the figure, ars contained in the vector pAL and the expression vector pCSR are shown.
An origin of replication capable of functioning in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, LEU2 is a selection marker complementing auxotrophic Schizosaccharomyces pombe, Amp r selectable marker which confers ampicillin resistance in E. coli And the expression vector pC with the restriction enzyme PvuI at only one point within this selectable marker gene.
SR can be specifically cleaved.
【0031】[実施例2]形質転換体の作製 宿主としてシゾサッカロミセス・ポンベのロイシン要求
性株leu1−32h-(ATCC38399)をロイ
シン含有最少培地で1.0×107細胞数/mlになる
まで生育させた。集菌、洗浄後、1.0×109細胞数
/mlとなるように0.1M酢酸リチウム(pH5.
0)に懸濁し、30℃で60分間インキュベートした。Becomes (ATCC38399) and 1.0 × 10 7 cell numbers leucine containing minimal medium / ml - [0031] [Example 2] Schizosaccharomyces as producing host transformants pombe leucine auxotrophic strain leu1-32h It was grown until. After harvesting and washing, 0.1 M lithium acetate (pH 5.0) was adjusted to 1.0 × 10 9 cells / ml.
0) and incubated at 30 ° C. for 60 minutes.
【0032】その後、上記懸濁液100μlに、実施例
1で得た発現ベクターpCSRを制限酵素PvuIで切
断したものを1μg、実施例1で得た発現ベクターpT
L2CYP2D6を3μg、TE(トリスEDTA)1
5μlを加え、さらに50%(W/V)ポリエチレング
リコール(PEG4000)水溶液を290μl加えて
よく撹拌した後、30℃で60分間、43℃で15分間
インキュベートし、室温で10分間放置した。遠心によ
りPEGを除去した後、培養液1mlに懸濁した。その
培養液を200mlフラスコ中に培養液のみ9mlとと
もに加えて、32℃で60分間インキュベートした後、
0.3mlを1/2YEL−Leu最少培地にまいた。
形質転換効率は105/μg(pCSR)以上であっ
た。Then, 1 μg of the expression vector pCSR obtained in Example 1 cut with the restriction enzyme PvuI was added to 100 μl of the above suspension, and the expression vector pT
3 μg of L2CYP2D6, TE (Tris EDTA) 1
After adding 5 μl, further adding 290 μl of a 50% (W / V) polyethylene glycol (PEG 4000) aqueous solution and stirring well, the mixture was incubated at 30 ° C. for 60 minutes, at 43 ° C. for 15 minutes, and left at room temperature for 10 minutes. After removing PEG by centrifugation, the suspension was suspended in 1 ml of a culture solution. After adding the culture solution together with 9 ml of the culture solution to a 200 ml flask and incubating at 32 ° C. for 60 minutes,
0.3 ml was sown in 1 / 2YEL-Leu minimal medium.
The transformation efficiency was 10 5 / μg (pCSR) or more.
【0033】[実施例3]形質転換体の培養およびミク
ロソーム画分の回収 実施例2で得た形質転換体を3%グルコース、0.5%
イースト抽出液、25μg/mlのG418(ネオマイ
シン)を含む培地2mlにて32℃で15時間培養し
た。この培養液から約1.8×107細胞数の菌体をと
り、3%グルコース、0.5%イースト抽出液、10μ
g/mlのG418を含む5mlの培地にて32℃で2
4時間培養した。この培養液から約1.7×108細胞
数の菌体をとり、3%グルコース、0.5%イースト抽
出液、10μg/mlのG418を含む100mlの培
地にて32℃で22時間培養し、さらにこの培養液から
約7.5×109細胞数の菌体をとり、3%グルコー
ス、0.5%イースト抽出液、10μg/mlのG41
8を含む1500mlの培地にて32℃で14時間培養
し、4.0 ×1010細胞数の菌体を得た。[Example 3] Culture and transformation of transformants
Recovery of rosome fraction 3% glucose, 0.5% transformant obtained in Example 2
Yeast extract, 25 μg / ml G418 (Neomy
Cultured at 32 ° C. for 15 hours in 2 ml of a medium containing
Was. About 1.8 × 107The number of cells
3% glucose, 0.5% yeast extract, 10μ
g / ml of G418 in 5 ml of medium at 32 ° C.
The cells were cultured for 4 hours. About 1.7 × 108cell
Take the number of cells and extract 3% glucose and 0.5% yeast.
Effluent: 100 ml medium containing 10 μg / ml G418
Culture at 32 ° C for 22 hours in the ground,
About 7.5 × 109Remove the cells of the cell number and add 3% glucose
, 0.5% yeast extract, 10 μg / ml G41
14 hours at 32 ° C in 1500 ml of medium containing
And 4.0 × 10TenCells of the number of cells were obtained.
【0034】得られた菌体を20mlの0.65Mマン
ニトール溶液に懸濁し、この懸濁液をフレンチプレス
(1500kg/cm2)で破砕し、細胞破砕物を得
た。この酵母細胞破砕物を4℃、9000×gで20分
間遠心し、遠心上清を得た。得られた遠心上清を4℃、
105000×gで65分間遠心し、沈殿物(「ミクロ
ソーム画分」)を得た。このミクロソーム画分を1mM
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、20%グリセロ
ールを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)に懸濁
し、再び4℃、105000×gで65分間遠心した。
遠心後、得られたミクロソーム画分を1mM EDT
A、20%グリセロールを含む0.1Mリン酸緩衝液
(pH7.4)1.2mlに懸濁した。最終的にタンパ
ク質濃度11mg/mlのミクロソーム溶液1.5ml
を得た。The obtained cells were suspended in 20 ml of a 0.65 M mannitol solution, and the suspension was crushed by a French press (1500 kg / cm 2 ) to obtain a crushed cell. The yeast cell crushed product was centrifuged at 9000 × g for 20 minutes at 4 ° C. to obtain a centrifuged supernatant. The obtained centrifuged supernatant was heated at 4 ° C.
The mixture was centrifuged at 105,000 × g for 65 minutes to obtain a precipitate (“microsome fraction”). This microsomal fraction is 1 mM
The suspension was suspended in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) containing ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and 20% glycerol, and centrifuged again at 4 ° C. and 105000 × g for 65 minutes.
After centrifugation, the obtained microsomal fraction was diluted with 1 mM EDT.
A, suspended in 1.2 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) containing 20% glycerol. Finally 1.5ml of microsome solution with protein concentration of 11mg / ml
I got
【0035】[実施例4]ミクロソームタンパク質あた
りのヒトP−450発現量 実施例3で得られたミクロソーム溶液を、タンパク質濃
度2.2mg/mlとなるように、0.25mM ED
TAを含む250mMリン酸緩衝液(pH7.4)で希
釈し、その希釈されたミクロソーム懸濁液を1mlずつ
対照セルと試料セルに入れ、両セルにハイドロサルファ
イトナトリウムを数粒ずつ加え、その後試料側のセルに
一酸化炭素を通じ500〜400nmの吸収スペクトル
を測定することによりヒトP−450のミクロソームタ
ンパク質あたりの発現量を測定した(図3)。ミクロソ
ームタンパク質あたりのヒトP−450含量は、450
nmと490nmにおける吸光度の差から、ヒトP−4
50のミリモル吸光係数(91mM-1cm-1)により求
めた。シゾサッカロミセス・ポンベでのミクロソームタ
ンパク質1mgあたりのヒトP−450の発現量は55
pmolであった。Example 4 Human P-450 Expression Amount per Microsomal Protein The microsomal solution obtained in Example 3 was mixed with a 0.25 mM ED so as to have a protein concentration of 2.2 mg / ml.
It is diluted with 250 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing TA, 1 ml of the diluted microsomal suspension is put into a control cell and a sample cell, and several particles of sodium hydrosulfite are added to both cells. The expression level of human P-450 per microsomal protein was measured by measuring the absorption spectrum at 500 to 400 nm through carbon monoxide in the cell on the sample side (FIG. 3). Human P-450 content per microsomal protein is 450
From the difference in absorbance at 490 nm and 490 nm, human P-4
It was determined by a 50 mM molar extinction coefficient (91 mM -1 cm -1 ). The expression level of human P-450 per mg microsomal protein in Schizosaccharomyces pombe was 55
pmol.
【0036】[実施例5]ミクロソーム画分におけるヒ
トNADPH−P450還元酵素のシトクロムC還元活
性 実施例3で得られたミクロソーム溶液の一部を、タンパ
ク質濃度が110μg/mlとなるように、0.25m
M EDTAを含む0.25Mリン酸緩衝液(pH7.
4)で希釈した。この希釈溶液10μlを50μMシト
クロムC、350mMリン酸カリウム(pH7.6)、
42μM NADPHを含む1mlの溶液に添加し、添
加後5分間の550nmにおける吸光度を経時的に測定
した(図4)。対照には、希釈溶液としてNADPHの
代わりに蒸留水を用いた。その結果、得られたミクロソ
ーム溶液に含まれるヒトNADPH−P450還元酵素
のシトクロムC還元活性は、ミクロソームタンパク質1
mgあたり1.4μmol/minであった。Example 5 Cytochrome C Reduction Activity of Human NADPH-P450 Reductase in Microsomal Fraction A part of the microsomal solution obtained in Example 3 was dissolved in 0.1% so that the protein concentration became 110 μg / ml. 25m
0.25 M phosphate buffer (pH 7.
Diluted in 4). 10 μl of this diluted solution was added to 50 μM cytochrome C, 350 mM potassium phosphate (pH 7.6),
It was added to 1 ml of a solution containing 42 μM NADPH, and the absorbance at 550 nm for 5 minutes after the addition was measured over time (FIG. 4). As a control, distilled water was used instead of NADPH as a diluting solution. As a result, the cytochrome C reducing activity of human NADPH-P450 reductase contained in the obtained microsomal solution was determined by microsomal protein 1
It was 1.4 μmol / min per mg.
【0037】[実施例6]ウエスタンブロッティングに
よるヒトP−450 2D6、ヒトNADPH−P45
0還元酵素の確認 実施例3で得られたミクロソーム溶液にヒトP−450
2D6およびヒトNADPH−P450還元酵素が含
まれることを確認するためにウエスタンブロットを行っ
た。[Example 6] Human P-450 2D6 and human NADPH-P45 by Western blotting
Confirmation of 0-reductase Human P-450 was added to the microsomal solution obtained in Example 3.
Western blot was performed to confirm that 2D6 and human NADPH-P450 reductase were included.
【0038】すなわち、実施例3で得られたミクロソー
ム溶液を1mg/mlになるよう希釈、可溶化したもの
5μgを用いてSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
法(SDS−PAGE)で分画し、ウエスタンブロット
を行った。その結果、ヒトP−450 2D6抗体に特
異的なバンドが検出された。同様に、ヒトNADPH−
P−450還元酵素抗体に特異的なバンドも検出され
た。対照として、ヒトP−450 2D6、ヒトNAD
PH−P450還元酵素遺伝子を含まないベクターpT
L2MとpAL7を持つシゾサッカロミセス・ポンベの
ミクロソーム画分を同様に解析したが、ヒトP−450
2D6抗体、ヒトNADPH−P450還元酵素抗体
により特異的に染色されるバンドは認められなかった
(図5)。That is, the microsomal solution obtained in Example 3 was diluted to 1 mg / ml and solubilized, and fractionated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) using 5 μg, followed by Western blotting. Was done. As a result, a band specific to the human P-450 2D6 antibody was detected. Similarly, human NADPH-
A band specific to the P-450 reductase antibody was also detected. As controls, human P-450 2D6, human NAD
Vector pT not containing PH-P450 reductase gene
The microsomal fraction of Schizosaccharomyces pombe with L2M and pAL7 was similarly analyzed, but human P-450
No band specifically stained by the 2D6 antibody or the human NADPH-P450 reductase antibody was observed (FIG. 5).
【0039】[実施例7]ブフラロールの1’−水酸化
活性の測定 実施例3で得られたミクロソーム溶液を用いて、ヒトP
−450 2D6により特異的に代謝されるブフラロー
ルの1’−水酸化活性の検出を行った。[Example 7] Measurement of 1'-hydroxylation activity of bufuralol Using the microsome solution obtained in Example 3, human P
Detection of 1'-hydroxylation activity of bufuralol, which is specifically metabolized by -450 2D6, was performed.
【0040】すなわち、100mMリン酸緩衝液(pH
7.4)、0.1mM EDTA、50μMブフラロー
ル、0.33mM β−NADP+、8.0mMグルコ
ース−6−リン酸、1.0単位/mlグルコース−6−
リン酸デヒドロゲナーゼ、6.0mM塩化マグネシウ
ム、0.4mg/mlミクロソームタンパク質を含む反
応液500μlを37℃で10分間インキュベートした
後、60%過塩素酸50μlを添加し、反応を停止し
た。その後、この反応液を2500rpm、10分間遠
心し、その上清10μlを高速液体クロマトグラフィー
(HPLC)により分析した。(図6)。ピーク面積か
ら求めたミクロソーム溶液のブフラロール1’−水酸化
活性は、ミクロソームタンパク質1mgあたり1.3n
mol/min、ヒトP−450 1pmolあたり2
4pmol/minであった。That is, a 100 mM phosphate buffer (pH
7.4), 0.1 mM EDTA, 50 μM bufuralol, 0.33 mM β-NADP + , 8.0 mM glucose-6-phosphate, 1.0 units / ml glucose-6-
After incubating 500 μl of a reaction solution containing phosphate dehydrogenase, 6.0 mM magnesium chloride and 0.4 mg / ml microsomal protein at 37 ° C. for 10 minutes, 50 μl of 60% perchloric acid was added to stop the reaction. Thereafter, the reaction solution was centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes, and 10 μl of the supernatant was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). (FIG. 6). The bufuralol 1'-hydroxylation activity of the microsomal solution determined from the peak area was 1.3 n / mg of microsomal protein.
mol / min, 2 per 1 pmol of human P-450
It was 4 pmol / min.
【0041】[実施例8]デブリソキンの4’−水酸化
活性の測定 実施例3で得られたミクロソーム溶液を用いてヒトP−
450 2D6により特異的に代謝されるデブリソキン
の4’−水酸化活性の検出を行った。[Example 8] Measurement of 4'-hydroxylation activity of debrisoquine Using the microsome solution obtained in Example 3, human P-
The 4′-hydroxylation activity of debrisoquine specifically metabolized by 450 2D6 was detected.
【0042】すなわち、100mMリン酸緩衝液(pH
7.4)、0.1mM EDTA、500μMデブリソ
キン、0.33mM β−NADP+、8.0mMグル
コース−6−リン酸、1.0単位/mlグルコース−6
−リン酸デヒドロゲナーゼ、6.0mM塩化マグネシウ
ム、0.4mg/mlミクロソームタンパク質を含む反
応液500μlを37℃で10分間インキュベートした
後、60%過塩素酸50μlを添加し、反応を停止し
た。その後、この反応液を2500rpm、10分間遠
心し、その上清100μlをHPLCにより分析した。
代謝体のスタンダードとして1mM4’−ヒドロキシデ
ブリソキンを用いた。ピーク面積から求めたミクロソー
ム溶液のデブリソキン4’−水酸化活性は、ミクロソー
ムタンパク質1mgあたり0.47nmol/min、
ヒトP−450 1pmolあたり8.5pmol/m
inであった。That is, a 100 mM phosphate buffer (pH
7.4), 0.1 mM EDTA, 500 μM debrisoquine, 0.33 mM β-NADP + , 8.0 mM glucose-6-phosphate, 1.0 unit / ml glucose-6
-500 μl of a reaction solution containing phosphate dehydrogenase, 6.0 mM magnesium chloride, and 0.4 mg / ml microsomal protein was incubated at 37 ° C. for 10 minutes, and 50 μl of 60% perchloric acid was added to stop the reaction. Thereafter, the reaction solution was centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes, and 100 μl of the supernatant was analyzed by HPLC.
1 mM 4'-hydroxy debrisoquine was used as a metabolite standard. The debrisoquin 4′-hydroxylation activity of the microsomal solution determined from the peak area was 0.47 nmol / min per mg of microsomal protein,
8.5 pmol / m per 1 pmol of human P-450
was in.
【0043】[実施例9]デキストロメトルファンのO
−脱メチル化活性の測定 実施例3で得られたミクロソーム溶液を用いてヒト2D
6により特異的に代謝されるデキストロメトルファンの
O−脱メチル化活性の検出を行った。Example 9 O of dextromethorphan
-Measurement of demethylation activity Using the microsome solution obtained in Example 3, human 2D
The O-demethylation activity of dextromethorphan specifically metabolized by No. 6 was detected.
【0044】すなわち、100mMリン酸緩衝液(pH
7.4)、0.1mM EDTA、500μMデキスト
ロメトルファン、0.33mM β−NADP+、8.
0mMグルコース−6−リン酸、1.0単位/mlグル
コース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、6.0mM塩化
マグネシウム、0.4mg/mlミクロソームタンパク
質を含む反応液500μlを37℃で10分間インキュ
ベートした後、60%過塩素酸50μlを添加し、反応
を停止した。その後、この反応液を2500rpm、1
0分間遠心し、その上清10μlをHPLCにより分析
した。ピーク面積から求めたミクロソーム溶液のデキス
トロメトルファンO−脱メチル化活性は、ミクロソーム
タンパク質1mgあたり0.62nmol/min、P
4501pmolあたり11pmol/minであっ
た。That is, a 100 mM phosphate buffer (pH
7.4), 0.1 mM EDTA, 500 μM dextromethorphan, 0.33 mM β-NADP + ,
After incubating 500 μl of a reaction solution containing 0 mM glucose-6-phosphate, 1.0 unit / ml glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6.0 mM magnesium chloride, 0.4 mg / ml microsomal protein at 37 ° C. for 10 minutes, The reaction was stopped by adding 50 μl of 60% perchloric acid. Thereafter, the reaction solution was heated at 2500 rpm, 1
After centrifugation for 0 minutes, 10 µl of the supernatant was analyzed by HPLC. The dextromethorphan O-demethylation activity of the microsomal solution determined from the peak area was 0.62 nmol / min / mg of microsomal protein, P
It was 11 pmol / min per 4501 pmol.
【0045】[0045]
【発明の効果】以上詳述したように本発明によれば、遺
伝子組換え技術を用いてヒトシトクロムP−450とヒ
トシトクロムP−450還元酵素を同一宿主内において
簡便にかつ効率よく同時に産生させることができる。As described above in detail, according to the present invention, human cytochrome P-450 and human cytochrome P-450 reductase can be produced simultaneously and efficiently in the same host using the gene recombination technique. be able to.
【図1】発現ベクターpTL2CYP2D6の構築を示
すフロー図である。FIG. 1 is a flowchart showing the construction of an expression vector pTL2CYP2D6.
【図2】発現ベクターpCSRの構築を示すフロー図で
ある。FIG. 2 is a flowchart showing the construction of an expression vector pCSR.
【図3】形質転換体のミクロソーム画分の吸収スペクト
ルである。FIG. 3 is an absorption spectrum of a microsome fraction of a transformant.
【図4】形質転換体のミクロソーム画分の波長550n
mにおける吸収スペクトルである。FIG. 4: Wavelength 550 n of microsome fraction of transformant
m is an absorption spectrum.
【図5】ウエスタンブロット観察図である。FIG. 5 is a Western blot observation diagram.
【図6】HPLC観察図である。FIG. 6 is an HPLC observation view.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI (C12N 1/19 C12R 1:645) (C12N 9/02 C12R 1:645) (72)発明者 浦橋 淳 千葉県印旛郡白井町平塚2802−1 アマシ ャム株式会社総合研究所内 (72)発明者 春日 卓郎 千葉県印旛郡白井町平塚2802−1 アマシ ャム株式会社総合研究所内 (72)発明者 浜 祐子 神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地 旭硝子株式会社中央研究所内 (72)発明者 東田 英毅 神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地 旭硝子株式会社中央研究所内 (72)発明者 熊谷 博道 神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地 旭硝子株式会社中央研究所内──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI (C12N 1/19 C12R 1: 645) (C12N 9/02 C12R 1: 645) (72) Inventor Jun Urahashi Inba-gun, Chiba 2802-1 Shiratsuka Hiratsuka Amersham Co., Ltd. (72) Inventor Takuro Kasuga 2802-1 Shiraicho Hiratsuka, Inba-gun, Chiba Prefecture Amersham Co., Ltd. (72) Inventor Yuko Hama Yokohama, Kanagawa 1150 Hazawa-cho, Kanagawa-ku Asahi Glass Co., Ltd. Central Research Laboratory (72) Inventor Hideki Higashida 1150 Hazawa-cho, Kanagawa-ku, Yokohama-shi, Kanagawa Prefecture Asahi Glass Co., Ltd. Central Research Laboratory (72) Inventor Hiromichi Kumagaya 1150 Asahi Glass Co., Ltd.
Claims (4)
遺伝子と、ヒトシトクロムP−450をコードする構造
遺伝子領域を含有する第1の発現ベクターと、 前記第1の発現ベクターが有する大腸菌に薬剤耐性を付
与する選択マーカー遺伝子と同一の選択マーカー遺伝子
と、ヒトシトクロムP−450還元酵素をコードする構
造遺伝子領域を含有する第2の発現ベクター、であっ
て、さらに上記第1の発現ベクター、第2の発現ベクタ
ーのいずれか一方のみが、さらに、宿主内で機能し得る
複製開始点を含む遺伝子配列と、宿主の栄養要求性を相
補する選択マーカーと、上記大腸菌に薬剤耐性を付与す
る選択マーカー遺伝子内に当該一方の発現ベクターを1
箇所のみで切断し得る特異的な制限酵素切断部位を持
つ、ような上記第1、第2の発現べクターを作製し、次
いで上記制限酵素切断部位で前記一方の発現ベクターを
切断した後、上記第1の発現ベクターと第2の発現ベク
ターを同時に同一宿主細胞内に導入して宿主細胞を形質
転換し、得られた形質転換体を培養してヒトシトクロム
P−450とヒトシトクロムP−450還元酵素を同時
に産生させ、これら両者を回収することを特徴とする、
ヒトシトクロムP−450とヒトシトクロムP−450
還元酵素の同時製造方法。1. A first expression vector containing a selectable marker gene for conferring drug resistance on E. coli, a structural gene region encoding human cytochrome P-450, and a drug resistance on E. coli contained in the first expression vector. A second expression vector containing a selectable marker gene identical to the selectable marker gene imparting the above, and a structural gene region encoding human cytochrome P-450 reductase, further comprising the first expression vector, Only one of the expression vectors, further, a gene sequence containing an origin of replication capable of functioning in the host, a selection marker that complements the auxotrophy of the host, and a selection marker gene that confers drug resistance to the Escherichia coli. Within one of the expression vectors
The above-mentioned first and second expression vectors having a specific restriction enzyme cleavage site that can be cleaved only at the site are prepared, and then the one expression vector is cleaved at the restriction enzyme cleavage site. The first expression vector and the second expression vector are simultaneously introduced into the same host cell to transform the host cell, and the resulting transformant is cultured to reduce human cytochrome P-450 and human cytochrome P-450. Producing the enzyme simultaneously and recovering both of them.
Human cytochrome P-450 and human cytochrome P-450
A method for producing reductase simultaneously.
ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)である、請求項
1記載の製造方法。2. The host cell is a fission yeast Schizosaccharomyces.
The production method according to claim 1, wherein the production method is pombe (Schizosaccharomyces pombe).
CYP2D6である、請求項1または2記載の製造方
法。3. The method according to claim 1, wherein the first expression vector is plasmid pTL2.
3. The production method according to claim 1, wherein the production method is CYP2D6.
である、請求項1または2記載の製造方法。4. The method according to claim 1, wherein the second expression vector is a plasmid pCSR.
The production method according to claim 1 or 2, wherein
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8286148A JPH10113174A (en) | 1996-10-08 | 1996-10-08 | Simultaneous production of human cytochrome p-450 and human cytochrome p450 reductase |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8286148A JPH10113174A (en) | 1996-10-08 | 1996-10-08 | Simultaneous production of human cytochrome p-450 and human cytochrome p450 reductase |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10113174A true JPH10113174A (en) | 1998-05-06 |
Family
ID=17700567
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP8286148A Pending JPH10113174A (en) | 1996-10-08 | 1996-10-08 | Simultaneous production of human cytochrome p-450 and human cytochrome p450 reductase |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH10113174A (en) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100665316B1 (en) | 2005-06-03 | 2007-01-09 | 한국생명공학연구원 | Novel bifunctional hydroxylase from metagenome library genes and screening method thereof |
WO2008152088A1 (en) * | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Pombiotech Gmbh | Fission yeast expressing cytochrome p450 reductase |
JP2020537646A (en) * | 2017-10-12 | 2020-12-24 | ザ ジャクソン ラボラトリーThe Jackson Laboratory | Transgenic selection method and composition |
-
1996
- 1996-10-08 JP JP8286148A patent/JPH10113174A/en active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100665316B1 (en) | 2005-06-03 | 2007-01-09 | 한국생명공학연구원 | Novel bifunctional hydroxylase from metagenome library genes and screening method thereof |
WO2008152088A1 (en) * | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Pombiotech Gmbh | Fission yeast expressing cytochrome p450 reductase |
JP2020537646A (en) * | 2017-10-12 | 2020-12-24 | ザ ジャクソン ラボラトリーThe Jackson Laboratory | Transgenic selection method and composition |
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