JPH07121219B2 - 新規なＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法 - Google Patents
新規なＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法Info
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- JPH07121219B2 JPH07121219B2 JP63208919A JP20891988A JPH07121219B2 JP H07121219 B2 JPH07121219 B2 JP H07121219B2 JP 63208919 A JP63208919 A JP 63208919A JP 20891988 A JP20891988 A JP 20891988A JP H07121219 B2 JPH07121219 B2 JP H07121219B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はBamH I制限エンドヌクレアーゼの遺伝子を含む
染色体DNA断片を組み込んでなる新規な組換えプラスミ
ド、該プラスミドを導入して形質転換した新規な微生物
及び該微生物よりBamH I制限エンドヌクレアーゼを製造
する新規な方法に関する。
染色体DNA断片を組み込んでなる新規な組換えプラスミ
ド、該プラスミドを導入して形質転換した新規な微生物
及び該微生物よりBamH I制限エンドヌクレアーゼを製造
する新規な方法に関する。
（従来の技術） II型制限酵素はデオキシリボ核酸（DNA）鎖中のある特
定の塩基配列を認識し、これを切断する極めて特異性の
高い酵素であり、このすぐれた特異性による遺伝子工学
の分野で幅広く利用されている。
定の塩基配列を認識し、これを切断する極めて特異性の
高い酵素であり、このすぐれた特異性による遺伝子工学
の分野で幅広く利用されている。
現在までのところ、細菌等から約100種類のII型制限酵
素が発見され、商品化されている。本発明に記載のBamH
Iも、このII型制限酵素のひとつであり、遺伝子工学の
分野では極めて利用されることの多い酵素のひとつであ
る。BamH I制限エンドヌクレアーゼはDNAの塩基配列中
のGGATCCを認識し、これを切断する酵素であり、バチル
ス アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefac
iens）Ｈ株において生産されることが知られている〔Jo
urnal of Molecular Biology 97 123（1975）,Journal
of Biological Chemistry 254 1003（1979）〕。
素が発見され、商品化されている。本発明に記載のBamH
Iも、このII型制限酵素のひとつであり、遺伝子工学の
分野では極めて利用されることの多い酵素のひとつであ
る。BamH I制限エンドヌクレアーゼはDNAの塩基配列中
のGGATCCを認識し、これを切断する酵素であり、バチル
ス アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefac
iens）Ｈ株において生産されることが知られている〔Jo
urnal of Molecular Biology 97 123（1975）,Journal
of Biological Chemistry 254 1003（1979）〕。
II型制限酵素を遺伝子工学の分野で利用するには最低
限、次の４つの条件を満足する必要がある。
限、次の４つの条件を満足する必要がある。
すなわち 他の制限酵素を含まない。
フォスファターゼを含まない。
非特異的DNaseを含まない。
３′および５′−エキソヌクレアーゼを含まない。
であり、そのため市販されている制限酵素は除核酸法、
塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法等を組み合わ
せることにより高純度に精製されている。
塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法等を組み合わ
せることにより高純度に精製されている。
しかしながら一般に微生物の生産するII型制限酵素の量
は少量であり、得られる精製酵素の量も少なかった。近
年、遺伝子工学の進歩により組換えDNA技術が多くの酵
素生産に用いられるようになった。II型制限酵素につい
ても同様であり、組換えDNA技術による生産性の向上が
幾つかの酵素において報告されている（Journal of Bac
teriology 164 501（1985）,Proceeding of National A
cademy Science 78 1503（1981），特開昭61−265094
号，特開昭63−87982号）。
は少量であり、得られる精製酵素の量も少なかった。近
年、遺伝子工学の進歩により組換えDNA技術が多くの酵
素生産に用いられるようになった。II型制限酵素につい
ても同様であり、組換えDNA技術による生産性の向上が
幾つかの酵素において報告されている（Journal of Bac
teriology 164 501（1985）,Proceeding of National A
cademy Science 78 1503（1981），特開昭61−265094
号，特開昭63−87982号）。
しかしながらこれらの報告は、いずれも大腸菌を宿主と
した検討であり、バチルス（Bacillus）属細菌を宿主と
した検討は全く報告されていない。本発明のBamH I制限
エンドヌクレアーゼについても特開昭63−87982号に報
告はあるが、それは大腸菌を宿主とした検討でありしか
も２種類のベクターを使用するという非常に複雑な方法
である。
した検討であり、バチルス（Bacillus）属細菌を宿主と
した検討は全く報告されていない。本発明のBamH I制限
エンドヌクレアーゼについても特開昭63−87982号に報
告はあるが、それは大腸菌を宿主とした検討でありしか
も２種類のベクターを使用するという非常に複雑な方法
である。
（発明の目的） 本発明者らはバチルス（Bacillus）属細菌を宿主とした
BamH I制限エンドヌクレアーゼのクローニングに取り組
み、前記バチルス アミロリケファシエンス（Bacillus
amyloliquefaciens）Ｈ株からBamH I制限エンドヌク
レアーゼの遺伝子を含む染色体DNA断片を抽出し、これ
をベクターに組み込んで組換えプラスミドを作成し、該
プラスミドの導入により形質転換させた微生物を得るこ
とに成功した。
BamH I制限エンドヌクレアーゼのクローニングに取り組
み、前記バチルス アミロリケファシエンス（Bacillus
amyloliquefaciens）Ｈ株からBamH I制限エンドヌク
レアーゼの遺伝子を含む染色体DNA断片を抽出し、これ
をベクターに組み込んで組換えプラスミドを作成し、該
プラスミドの導入により形質転換させた微生物を得るこ
とに成功した。
しかも、バチルス（Bacillus）属細菌においては制限
系、修飾系の遺伝子をひとつのベクターに組み込むこと
が可能であることを始めて見いだした。本発明は、この
新しい知見に基づいて完成されたものである。
系、修飾系の遺伝子をひとつのベクターに組み込むこと
が可能であることを始めて見いだした。本発明は、この
新しい知見に基づいて完成されたものである。
（発明の構成） 即ち、本発明はバチルス アミロリケファシエンス（Ba
cillus amyloliquefaciens）Ｈ株由来のBamH I制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子を含む制限酵素、Hind IIIにより
切断された5kbである染色体DNA断片を組み込だ、バチル
ス（Bacillus）属細菌にて複製できる新規な組換えプラ
スミド、該プラスミドで形質転換されたバチルス（baci
llus）属に属する新規な微生物及び該形質転換微生物を
培養して、培養物からBamH I制限エンドヌクレアーゼを
採取することを特徴とするBamH I制限エンドヌクレアー
ゼの新規な製造法に係わる。
cillus amyloliquefaciens）Ｈ株由来のBamH I制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子を含む制限酵素、Hind IIIにより
切断された5kbである染色体DNA断片を組み込だ、バチル
ス（Bacillus）属細菌にて複製できる新規な組換えプラ
スミド、該プラスミドで形質転換されたバチルス（baci
llus）属に属する新規な微生物及び該形質転換微生物を
培養して、培養物からBamH I制限エンドヌクレアーゼを
採取することを特徴とするBamH I制限エンドヌクレアー
ゼの新規な製造法に係わる。
本発明の上記組換えプラスミド及びこれを導入した形質
転換株はBamH I制限エンドヌクレアーゼを大量に生産す
るため大量のBamH I制限エンドヌクレアーゼを容易に製
造することが可能となった。
転換株はBamH I制限エンドヌクレアーゼを大量に生産す
るため大量のBamH I制限エンドヌクレアーゼを容易に製
造することが可能となった。
以下本発明につき詳細に説明する。
（ａ）プラスミド及びその調製 本発明の新規プラスミドは、例えばバチルス（Bacillu
s）属に属する微生物の染色体外遺伝子（プラスミド）
として知られるpTB53等の、培養された細胞内で増殖し
うる形式をとるプラスミドにバチルス アミロリケファ
シンス（Bacillus amyloliquefaciens）Ｈ株由来のBam
H I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むDNA断片を組み
込んでなるプラスミドであり、前記ベクターDNAとして
は、天然に存在するものを抽出したものの他、増殖に必
須な部分以外のDNAの部分が一部欠落しているものでも
よい。
s）属に属する微生物の染色体外遺伝子（プラスミド）
として知られるpTB53等の、培養された細胞内で増殖し
うる形式をとるプラスミドにバチルス アミロリケファ
シンス（Bacillus amyloliquefaciens）Ｈ株由来のBam
H I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むDNA断片を組み
込んでなるプラスミドであり、前記ベクターDNAとして
は、天然に存在するものを抽出したものの他、増殖に必
須な部分以外のDNAの部分が一部欠落しているものでも
よい。
また前記ベクターDNAに前記染色体DNA断片を組み込む方
法は、既知のいずれの方法も適用しうる。例えば、適当
な制限酵素（Endonuclease）で処理して染色体DNAを特
定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターDNAと
混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられ
る。
法は、既知のいずれの方法も適用しうる。例えば、適当
な制限酵素（Endonuclease）で処理して染色体DNAを特
定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターDNAと
混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられ
る。
ベクターDNAとして、pTB53プロスミドを用い、これにバ
チルス アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliqu
efaciens）Ｈ株から調製された染色体DNA断片を組み込
むことにより、新規プラスミドpBamHIRM22が得られる。
pBamHIRM22プラスミドの調製工程及び制限酵素地図を第
１図に示す。第１図から明らかなように、このプロスミ
ドはpTB53プラスミドの制限酵素サイトのHind IIIサイ
トに、バチルス アミロリケファシンス（Bacillus amy
loliquefaciens）Ｈ株のBamH I制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子を含むDNA断片が組み込まれた22Kbの塩基対を有
する円形分子である。
チルス アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliqu
efaciens）Ｈ株から調製された染色体DNA断片を組み込
むことにより、新規プラスミドpBamHIRM22が得られる。
pBamHIRM22プラスミドの調製工程及び制限酵素地図を第
１図に示す。第１図から明らかなように、このプロスミ
ドはpTB53プラスミドの制限酵素サイトのHind IIIサイ
トに、バチルス アミロリケファシンス（Bacillus amy
loliquefaciens）Ｈ株のBamH I制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子を含むDNA断片が組み込まれた22Kbの塩基対を有
する円形分子である。
（ｂ）微生物の調製 このようにして得られた前記染色体DNA断片とベクターD
NAの結合物を既知の形質転換法、例えばジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology） 8
1 41（1961）に記憶のコンピテント・セル法により受容
菌の微生物菌体中に導入すると、所望の遺伝形質とベク
ターDNAの形質を併せもつ形質転換株が得られる。
NAの結合物を既知の形質転換法、例えばジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology） 8
1 41（1961）に記憶のコンピテント・セル法により受容
菌の微生物菌体中に導入すると、所望の遺伝形質とベク
ターDNAの形質を併せもつ形質転換株が得られる。
受容菌としては、前記のバチルス・ズブチリス（Bacill
us subtilis）MT2,MI113等の通常この種の技術分野で用
いられる微生物が有利に用いられる。その典型的な例と
してバチルス・ズブチルスMT2株が挙げられる［ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriol
ogy 831 154（1983）：遺伝形質:trpC2,leuC7,rM -,mM -,
Npr-）］。
us subtilis）MT2,MI113等の通常この種の技術分野で用
いられる微生物が有利に用いられる。その典型的な例と
してバチルス・ズブチルスMT2株が挙げられる［ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriol
ogy 831 154（1983）：遺伝形質:trpC2,leuC7,rM -,mM -,
Npr-）］。
制限系遺伝子のクローニングされたクローンを選択的に
単離する手段としては現在２つの方法がある。まず第一
の方法はバクテリオファージ感染を利用する方法である
（Proceeding of National Academy Science 78 1503,
（1981））。すなわち細菌中に制限修飾系が存在してい
ることにより、該系はバクテリオファージによる感染に
抵抗し得るので、クローニングされた制限・修飾系遺伝
子をもっているクローンは、ファージにさらされたライ
ブラリーから生存体として選択的に単離される。第２の
方法は修飾系遺伝子を選択することにより制限系遺伝子
のクローニングされたクローンを選択する方法である
（Journal of Bacteriology 164 501,（1985））。すな
わち制限エンドヌクレアーゼに抵抗性を示すプラスミド
を選択することによりまず修飾系遺伝子のクローニング
されたクローンを選択する。次に修飾系遺伝子、制限系
遺伝子は多くの場合近接して存在するため、修飾系遺伝
子に隣接するより大きい領域をクローニングすることに
より、制限系遺伝子のクローニングされたクローンを選
択する。本発明記載のBamH I制限酵素エンドヌクレアー
ゼクローンの選択にはいずれの方法を用いることも可能
である。
単離する手段としては現在２つの方法がある。まず第一
の方法はバクテリオファージ感染を利用する方法である
（Proceeding of National Academy Science 78 1503,
（1981））。すなわち細菌中に制限修飾系が存在してい
ることにより、該系はバクテリオファージによる感染に
抵抗し得るので、クローニングされた制限・修飾系遺伝
子をもっているクローンは、ファージにさらされたライ
ブラリーから生存体として選択的に単離される。第２の
方法は修飾系遺伝子を選択することにより制限系遺伝子
のクローニングされたクローンを選択する方法である
（Journal of Bacteriology 164 501,（1985））。すな
わち制限エンドヌクレアーゼに抵抗性を示すプラスミド
を選択することによりまず修飾系遺伝子のクローニング
されたクローンを選択する。次に修飾系遺伝子、制限系
遺伝子は多くの場合近接して存在するため、修飾系遺伝
子に隣接するより大きい領域をクローニングすることに
より、制限系遺伝子のクローニングされたクローンを選
択する。本発明記載のBamH I制限酵素エンドヌクレアー
ゼクローンの選択にはいずれの方法を用いることも可能
である。
（ｃ）制限エンドヌクレアーゼの生産 工程（ｂ）で得られた形質転換株を培養するには、特定
の遺伝情報によって生成される物質の生産に適した培地
であって且つ宿主微生物の成育に適した培地を用い得る
が、本発明方法では、通常、バチルス・ズブチルス（ba
cillus subtilis）の生育培地として用いられるＬ−Bro
th培地（トリプトン、酵母エキス、食塩）を基本培地と
して調製したものを用いればよい。
の遺伝情報によって生成される物質の生産に適した培地
であって且つ宿主微生物の成育に適した培地を用い得る
が、本発明方法では、通常、バチルス・ズブチルス（ba
cillus subtilis）の生育培地として用いられるＬ−Bro
th培地（トリプトン、酵母エキス、食塩）を基本培地と
して調製したものを用いればよい。
その他、必要に応じて炭素源、窒素源の他にアミノ酸、
ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
培養方法は、pH、温度、酸素供給量等の条件として通常
のバチルス（Bacillus）属の微生物の成育に適した条件
を採り得るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微
生物が生育してその菌体量が最大に達したとき、即ち対
数増殖後期まで生育させるのが好ましい。培養温度は、
通常30〜37℃、pH条件は、pH5〜８の範囲、特に中性付
近が適当である。
のバチルス（Bacillus）属の微生物の成育に適した条件
を採り得るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微
生物が生育してその菌体量が最大に達したとき、即ち対
数増殖後期まで生育させるのが好ましい。培養温度は、
通常30〜37℃、pH条件は、pH5〜８の範囲、特に中性付
近が適当である。
得られた菌体を集菌後、遠心分離、超音波破砕工程等に
より抽出し、次いで除核酸法、塩析法、ゲル濾過法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、アフィニティフロマト
グラフィー法等を組み合わせることによりBamH I制限エ
ンドヌクレアーゼを得ることができる。
より抽出し、次いで除核酸法、塩析法、ゲル濾過法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、アフィニティフロマト
グラフィー法等を組み合わせることによりBamH I制限エ
ンドヌクレアーゼを得ることができる。
（発明の効果） 本発明のプロスミド及びこれを導入した形質転換株はBa
mH I制限エンドヌクレアーゼを大量に生産するために、
その精製工程において大量のBamH I制限エンドヌクレア
ーゼを製造することが可能となった。
mH I制限エンドヌクレアーゼを大量に生産するために、
その精製工程において大量のBamH I制限エンドヌクレア
ーゼを製造することが可能となった。
以下本発明を実施例により、更に詳細に説明するが、本
発明は何らこれらに限定されるものではない。
発明は何らこれらに限定されるものではない。
（実施例） （１） ベクタープラスミドpTB53の調製 ベクタープラスミドpTB53のDNAを保有するバチルス・ブ
ズチリス（Bacillus subtilis）MT−２を以下の通り調
製してベクタープラスミドpTB53を得た。
ズチリス（Bacillus subtilis）MT−２を以下の通り調
製してベクタープラスミドpTB53を得た。
LB培地〔純水１あたりバクト・トリプトン（Difco）1
0g、バクト・イーストエキス（Difco）5g、NaCl 10gをp
H7.0に調製したもの〕100mlを500ml容坂口フラスコに分
注し、120℃で20分間オートクレーブ滅菌した。この培
地にカナマイシン0.0004％、テトラサイクリン0.025％
を添加し、pTB53のDNAをプラスミドとして保有するバチ
ルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）MT−２を１白
金耳接種し、30℃で16分間振盪培養した後、800rpm、５
分間、４℃にて遠心分離し、菌体を集めた。次に集めた
菌体5mg/mlのリゾチーム（太陽化学（株）製）、50mMグ
ルコース、10mM EDTAを含む25mMトリス塩酸緩衝液（pH
8.0）5mlに懸濁し、37℃で30分間静止した。次に氷中で
５分静置した後、１％SDSを含む0.2N NaOH四液10mlを加
え、氷中で10分間静置した。更に3Mの酢酸ナトリウム溶
液（pH4.8）を7.5ml加えて氷中で15分間静置した。16,0
00rpm、20分間、４℃にて遠心分離を行った。
0g、バクト・イーストエキス（Difco）5g、NaCl 10gをp
H7.0に調製したもの〕100mlを500ml容坂口フラスコに分
注し、120℃で20分間オートクレーブ滅菌した。この培
地にカナマイシン0.0004％、テトラサイクリン0.025％
を添加し、pTB53のDNAをプラスミドとして保有するバチ
ルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）MT−２を１白
金耳接種し、30℃で16分間振盪培養した後、800rpm、５
分間、４℃にて遠心分離し、菌体を集めた。次に集めた
菌体5mg/mlのリゾチーム（太陽化学（株）製）、50mMグ
ルコース、10mM EDTAを含む25mMトリス塩酸緩衝液（pH
8.0）5mlに懸濁し、37℃で30分間静止した。次に氷中で
５分静置した後、１％SDSを含む0.2N NaOH四液10mlを加
え、氷中で10分間静置した。更に3Mの酢酸ナトリウム溶
液（pH4.8）を7.5ml加えて氷中で15分間静置した。16,0
00rpm、20分間、４℃にて遠心分離を行った。
この上清に12mlのイソプロパノールを加え、10,000rp
m、30分間、18℃にて遠心分離を行い、得られた沈澱物
について、70％エタノール洗浄後、6mlの50mM EDTA含む
50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解させた。次に5.9
gの塩化セシウム、0.3mlのエチジウムブロマイド溶液
（５％ジメチルスルホキシドを含む１％エチジウムブロ
マイド溶液）と混合し、38,000rpm、40時間、18℃にて
遠心分離を行った。プラスミドDNA層を注射器で抜き取
り、ｎ−ブタノール抽出によってエチジウムブロマイド
を除去し、1mM EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
5）に透析することにより、約30μｇのpTB53DNAを取得
した。
m、30分間、18℃にて遠心分離を行い、得られた沈澱物
について、70％エタノール洗浄後、6mlの50mM EDTA含む
50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解させた。次に5.9
gの塩化セシウム、0.3mlのエチジウムブロマイド溶液
（５％ジメチルスルホキシドを含む１％エチジウムブロ
マイド溶液）と混合し、38,000rpm、40時間、18℃にて
遠心分離を行った。プラスミドDNA層を注射器で抜き取
り、ｎ−ブタノール抽出によってエチジウムブロマイド
を除去し、1mM EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
5）に透析することにより、約30μｇのpTB53DNAを取得
した。
（２） BamH I制限エンドヌクレアーゼの遺伝子をもつ
染色体DNAの調製 バチルス アシロリケファシエンス（Bacillusamyloliq
uefaciens）Ｈ株をＬ−Broth培地［純水1lあたりトリプ
トン（Difco）10g、酵母エキス5g、NaCl 10gをpH7.0に
調製したもの］50mlに接種し、30℃で振盪培養を行なっ
た。14時間後に菌体を集めた。次に集めた菌体を10mg/m
lのリゾチーム［太陽化学（株）製］、20％ショ糖、1mM
EDTAを含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）20mlに懸濁
し、37℃で10分間静置した。次に１％ラウロイルサルコ
シン酸を含む0.1M EDTA（pH9.6）44ml及び5.44mg/mlの
プロナーゼ溶液2.0mlを加え、50℃で30分間静置した。
次に塩化セシウム66g、10mg/mlのエチジウムブロマイド
溶液3.3mlを加え、混合した後に38,000rpm、40時間の遠
心分離を行なった。DNA層を注射器で抜きとり、ｎ−ブ
タノール抽出によってエチジウムブロマイドを除去し、
1mM EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に透析
することにより約500μｇの染色体DNAを取得した。
染色体DNAの調製 バチルス アシロリケファシエンス（Bacillusamyloliq
uefaciens）Ｈ株をＬ−Broth培地［純水1lあたりトリプ
トン（Difco）10g、酵母エキス5g、NaCl 10gをpH7.0に
調製したもの］50mlに接種し、30℃で振盪培養を行なっ
た。14時間後に菌体を集めた。次に集めた菌体を10mg/m
lのリゾチーム［太陽化学（株）製］、20％ショ糖、1mM
EDTAを含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）20mlに懸濁
し、37℃で10分間静置した。次に１％ラウロイルサルコ
シン酸を含む0.1M EDTA（pH9.6）44ml及び5.44mg/mlの
プロナーゼ溶液2.0mlを加え、50℃で30分間静置した。
次に塩化セシウム66g、10mg/mlのエチジウムブロマイド
溶液3.3mlを加え、混合した後に38,000rpm、40時間の遠
心分離を行なった。DNA層を注射器で抜きとり、ｎ−ブ
タノール抽出によってエチジウムブロマイドを除去し、
1mM EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に透析
することにより約500μｇの染色体DNAを取得した。
（３） 染色体DNA断片のベクターへの挿入 （１）で得られた染色体DNA3μｇについて1.0ユニット
のHind III制限エンドヌクレアーゼを加え、37℃、１時
間の反応を行なうことにより、これを部分分解した。次
に（１）で得られたベクタープラスミドpTB53 1μｇに
ついて４ユニットのHind III制限エンドヌクレアーゼを
加え、37℃、１時間の反応を行なうことによりこれを完
全分解した。
のHind III制限エンドヌクレアーゼを加え、37℃、１時
間の反応を行なうことにより、これを部分分解した。次
に（１）で得られたベクタープラスミドpTB53 1μｇに
ついて４ユニットのHind III制限エンドヌクレアーゼを
加え、37℃、１時間の反応を行なうことによりこれを完
全分解した。
以上の反応により得られた３μｇの染色体DNA断片と１
μｇのpBR322のDNA断片を混合し、更に1mMATP及び5mMジ
チオスレイトールの存在下に５ユニットのT4ファージ由
来のDNAリカーゼを用いて15℃、16時間の連結反応を行
なうことにより染色体DNAを組み込んだプラスミドDNAを
取得した。
μｇのpBR322のDNA断片を混合し、更に1mMATP及び5mMジ
チオスレイトールの存在下に５ユニットのT4ファージ由
来のDNAリカーゼを用いて15℃、16時間の連結反応を行
なうことにより染色体DNAを組み込んだプラスミドDNAを
取得した。
（４） BamH I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む組
み換えプラスミドによる形質転換 バチルス・ズブチリス、MT2株を前記Ｌ−Broth培地5ml
に接種し、37℃で終夜振盪培養した。次にその1mlをTF
I培地（純水1lあたり（NH4）2SO40.2g、K2HPO41.4g、KH
2PO40.6g、クエン酸ナトリウム0.1g、カザミノ酸0.2g、
グルコース5g、MgSO40.2g、アルギニン0.05g、トリプト
ファン0.05g）20mlに植菌し、37℃３時間45分振盪培養
した。更にその4mlをTF II培地（純水1lあたり（NH4）2
SO40.2g、K2HPO41.4g、KH2PO40.6g、クエン酸ナトリウ
ム0.1g、カザミノ酸0.1g、グルコース5g.MgSO40.2g、ア
ルギニン0.005g、トリプトファン0.005g）36mlに植菌
し、コンピテントセルを調製した。得られたコンピテン
トセル1mlに（３）で得られたプラスミドDNAの溶解液を
加え、37℃で30分間激しく振盪した後、これを遠心分離
（3,000rpm10min）集菌後、1mlの前記Ｌ−Broth培地を
加え37℃で2.5時間振盪培養し、更にテトラサイクリン
を含んだＬ−broth寒天培地に広げ、37℃で終夜培養し
た。得られた形質転換株をバチルス・ズブチリス（Baci
llus subfilis）のバクテリオファージであるρ11C3フ
ァージ（Journal of General Applied Microbiology 25
223,（1979））を103〜104pfu含んだ前記LB培地にレプ
リカした。同培地で生育してくる株を選択することによ
りカナマイシン及びテトラサイクルリン耐性を有し、且
つBamH I制限エンドヌクレアーゼを生産する株バチルス
・ズブチルス（Bacillus subtilis）MT2（pBamHIRM22）
（微工研菌寄第10175号）を分離した。
み換えプラスミドによる形質転換 バチルス・ズブチリス、MT2株を前記Ｌ−Broth培地5ml
に接種し、37℃で終夜振盪培養した。次にその1mlをTF
I培地（純水1lあたり（NH4）2SO40.2g、K2HPO41.4g、KH
2PO40.6g、クエン酸ナトリウム0.1g、カザミノ酸0.2g、
グルコース5g、MgSO40.2g、アルギニン0.05g、トリプト
ファン0.05g）20mlに植菌し、37℃３時間45分振盪培養
した。更にその4mlをTF II培地（純水1lあたり（NH4）2
SO40.2g、K2HPO41.4g、KH2PO40.6g、クエン酸ナトリウ
ム0.1g、カザミノ酸0.1g、グルコース5g.MgSO40.2g、ア
ルギニン0.005g、トリプトファン0.005g）36mlに植菌
し、コンピテントセルを調製した。得られたコンピテン
トセル1mlに（３）で得られたプラスミドDNAの溶解液を
加え、37℃で30分間激しく振盪した後、これを遠心分離
（3,000rpm10min）集菌後、1mlの前記Ｌ−Broth培地を
加え37℃で2.5時間振盪培養し、更にテトラサイクリン
を含んだＬ−broth寒天培地に広げ、37℃で終夜培養し
た。得られた形質転換株をバチルス・ズブチリス（Baci
llus subfilis）のバクテリオファージであるρ11C3フ
ァージ（Journal of General Applied Microbiology 25
223,（1979））を103〜104pfu含んだ前記LB培地にレプ
リカした。同培地で生育してくる株を選択することによ
りカナマイシン及びテトラサイクルリン耐性を有し、且
つBamH I制限エンドヌクレアーゼを生産する株バチルス
・ズブチルス（Bacillus subtilis）MT2（pBamHIRM22）
（微工研菌寄第10175号）を分離した。
（５） バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）M
T2（pBamHIRM22）によるBamH I制限エンドヌクレアーゼ
の生産 （４）で得られた形質転換株バチルス・ズブチリスMT2
（pBamHIRM22）（微工研菌寄第10175号）を前記Ｌ−Bro
th培地500mlを含む２容のフラスコ37℃、16時間振盪
培養を行なった。これを遠心分離して集菌、洗浄後10mM
MgCl2,7mM 2−メルカプトエタノールを含んだ20mMのト
リス塩酸緩衝液（pH7.5）25mlに懸濁し、０℃で10分間
の超音波破砕を行なった。更に12,000rpmで10分間の遠
心分離により酵素抽出液を得た。次にこの酵素抽出液に
硫安粉末を氷冷下添加溶解し、30〜80％飽和画分を（飽
和度はOsborne法で表示）を遠心分離により回収した。
この回収沈殿物を2mMメルカプトエタノール、５％グリ
セロールを含んだ10mMリン酸緩衝液（pH7.5）2mlに溶解
し、更に透析チューブに入れて、100倍量の同緩衝液に
対して１夜透析した。続いて同緩衝液にて平衡化したホ
スホセルロース（ワットマン社製）のカラム（容量20m
l）に吸着させた。５倍量の同緩衝液で洗浄後０〜1.0M
kClグラジエント溶出を行なった。BamH I制限エンドヌ
クレアーゼはKCl濃度0.5M付近で溶出された。溶出した
酵素液を透析チューブに入れ、2mMメルカプトエタノー
ル、50％グリセロールを含んだリン酸緩衝液に透析する
ことにより0.2mlの酵素液が得られた。得られた酵素液
の酵素活性を測定したところ10,000ユニットであり、こ
れは親株のバチルス・アミロリクファシエンス（Bacill
us amyloliquefaciens）Ｈ株の約５倍の生産量であっ
た。
T2（pBamHIRM22）によるBamH I制限エンドヌクレアーゼ
の生産 （４）で得られた形質転換株バチルス・ズブチリスMT2
（pBamHIRM22）（微工研菌寄第10175号）を前記Ｌ−Bro
th培地500mlを含む２容のフラスコ37℃、16時間振盪
培養を行なった。これを遠心分離して集菌、洗浄後10mM
MgCl2,7mM 2−メルカプトエタノールを含んだ20mMのト
リス塩酸緩衝液（pH7.5）25mlに懸濁し、０℃で10分間
の超音波破砕を行なった。更に12,000rpmで10分間の遠
心分離により酵素抽出液を得た。次にこの酵素抽出液に
硫安粉末を氷冷下添加溶解し、30〜80％飽和画分を（飽
和度はOsborne法で表示）を遠心分離により回収した。
この回収沈殿物を2mMメルカプトエタノール、５％グリ
セロールを含んだ10mMリン酸緩衝液（pH7.5）2mlに溶解
し、更に透析チューブに入れて、100倍量の同緩衝液に
対して１夜透析した。続いて同緩衝液にて平衡化したホ
スホセルロース（ワットマン社製）のカラム（容量20m
l）に吸着させた。５倍量の同緩衝液で洗浄後０〜1.0M
kClグラジエント溶出を行なった。BamH I制限エンドヌ
クレアーゼはKCl濃度0.5M付近で溶出された。溶出した
酵素液を透析チューブに入れ、2mMメルカプトエタノー
ル、50％グリセロールを含んだリン酸緩衝液に透析する
ことにより0.2mlの酵素液が得られた。得られた酵素液
の酵素活性を測定したところ10,000ユニットであり、こ
れは親株のバチルス・アミロリクファシエンス（Bacill
us amyloliquefaciens）Ｈ株の約５倍の生産量であっ
た。
この様にして得られた酵素液は他の制限エンドヌクレア
ーゼ、フォスファターゼ、非特異的DNaseなどを含んで
おらず、遺伝子工学の分野で利用することが可能であっ
た。なおBamH I制限エンドヌクレアーゼの活性の測定
は、１μｇのλ−DNAを10mMトリス塩酸緩衝液、10mM塩
化マグネシウム溶液、50mM硫酸アンモニウム、7mM2−メ
ルカプトエタノールからなる反応液45μに溶解し、そ
の混合液５μの酵素液を加えて、37℃で１時間の反応
を行なった後、アガロース電気泳動を行なうことにより
測定する。酵素活性における１単位は37℃、pH7.5にお
いて１時間に１μｇのλ−DNAを完全に分解する酵素活
性をいう。
ーゼ、フォスファターゼ、非特異的DNaseなどを含んで
おらず、遺伝子工学の分野で利用することが可能であっ
た。なおBamH I制限エンドヌクレアーゼの活性の測定
は、１μｇのλ−DNAを10mMトリス塩酸緩衝液、10mM塩
化マグネシウム溶液、50mM硫酸アンモニウム、7mM2−メ
ルカプトエタノールからなる反応液45μに溶解し、そ
の混合液５μの酵素液を加えて、37℃で１時間の反応
を行なった後、アガロース電気泳動を行なうことにより
測定する。酵素活性における１単位は37℃、pH7.5にお
いて１時間に１μｇのλ−DNAを完全に分解する酵素活
性をいう。
第１図は本願発明のpBamHIRM22のプラスミドの調製工程
及び制限酵素地図を示す。
及び制限酵素地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (2)
- 【請求項１】バチルス アミロリケファシエンス（Baci
llus amyloliquefaciens）Ｈ株由来のBamH I制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子を含む、制限酵素、Hind IIIによ
り切断された5kbである染色体DNA断片を組み込んだ組換
えプラスミドで形質転換されたバチルス（Bacillus）属
に属する新規な微生物。 - 【請求項２】バチルス アミロリケファシエンス（Baci
llus amyloliquefaciens）Ｈ株由来のBamH I制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子を含む、制限酵素、Hind IIIによ
り切断された5kbである染色体DNA断片を組み込んだ組換
えプラスミドで形質転換されたバチルス（Bacillus）属
に属する微生物を培養して、培養物からBamH I制限エン
ドヌクレアーゼを採取することを特徴とする新規なBamH
I制限エンドヌクレアーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63208919A JPH07121219B2 (ja) | 1988-08-22 | 1988-08-22 | 新規なＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63208919A JPH07121219B2 (ja) | 1988-08-22 | 1988-08-22 | 新規なＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0257185A JPH0257185A (ja) | 1990-02-26 |
| JPH07121219B2 true JPH07121219B2 (ja) | 1995-12-25 |
Family
ID=16564295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63208919A Expired - Fee Related JPH07121219B2 (ja) | 1988-08-22 | 1988-08-22 | 新規なＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07121219B2 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IN166864B (ja) * | 1985-03-01 | 1990-07-28 | New England Biolabs Inc | |
| DE3751923T2 (de) * | 1986-06-06 | 1997-04-03 | New England Biolabs Inc | Verfahren zur Klonierung von Restriktions-Modifikationssystemen |
-
1988
- 1988-08-22 JP JP63208919A patent/JPH07121219B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0257185A (ja) | 1990-02-26 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |