JPH07121219B2 - Method for producing new BamHI restriction endonuclease - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はBamH I制限エンドヌクレアーゼの遺伝子を含む
染色体DNA断片を組み込んでなる新規な組換えプラスミ
ド、該プラスミドを導入して形質転換した新規な微生物
及び該微生物よりBamH I制限エンドヌクレアーゼを製造
する新規な方法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Field of Industrial Application) The present invention relates to a novel recombinant plasmid incorporating a chromosomal DNA fragment containing the gene for BamHI restriction endonuclease, and a novel recombinant plasmid transformed by introducing the plasmid. The present invention relates to a microorganism and a novel method for producing a BamHI restriction endonuclease from the microorganism.

（従来の技術） II型制限酵素はデオキシリボ核酸（DNA）鎖中のある特
定の塩基配列を認識し、これを切断する極めて特異性の
高い酵素であり、このすぐれた特異性による遺伝子工学
の分野で幅広く利用されている。(Prior Art) Type II restriction enzyme is a highly specific enzyme that recognizes a specific base sequence in the deoxyribonucleic acid (DNA) chain and cleaves it. Widely used in.

現在までのところ、細菌等から約100種類のII型制限酵
素が発見され、商品化されている。本発明に記載のBamH
Iも、このII型制限酵素のひとつであり、遺伝子工学の
分野では極めて利用されることの多い酵素のひとつであ
る。BamH I制限エンドヌクレアーゼはDNAの塩基配列中
のGGATCCを認識し、これを切断する酵素であり、バチル
ス アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefac
iens）Ｈ株において生産されることが知られている〔Jo
urnal of Molecular Biology 97 123（1975）,Journal
of Biological Chemistry 254 1003（1979）〕。So far, about 100 types of type II restriction enzymes have been discovered from bacteria and commercialized. BamH according to the invention
I is also one of these type II restriction enzymes, and is one of the enzymes that is very often used in the field of genetic engineering. BamH I restriction endonuclease is an enzyme that recognizes and cleaves GGATCC in the nucleotide sequence of DNA, and is a Bacillus amyloliquefacens.
iens) H strain is known to be produced [Jo
urnal of Molecular Biology 97 123 (1975), Journal
of Biological Chemistry 254 1003 (1979)].

II型制限酵素を遺伝子工学の分野で利用するには最低
限、次の４つの条件を満足する必要がある。In order to use the type II restriction enzyme in the field of genetic engineering, at least the following four conditions must be satisfied.

すなわち 他の制限酵素を含まない。That is, it does not contain other restriction enzymes.

フォスファターゼを含まない。 Does not contain phosphatase.

非特異的DNaseを含まない。 Does not contain non-specific DNase.

３′および５′−エキソヌクレアーゼを含まない。 Free of 3'and 5'-exonucleases.

であり、そのため市販されている制限酵素は除核酸法、
塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法等を組み合わ
せることにより高純度に精製されている。Therefore, the commercially available restriction enzymes are the nucleic acid removal method,
It is highly purified by a combination of salting out method, gel filtration method, ion exchange chromatography method, affinity chromatography method and the like.

しかしながら一般に微生物の生産するII型制限酵素の量
は少量であり、得られる精製酵素の量も少なかった。近
年、遺伝子工学の進歩により組換えDNA技術が多くの酵
素生産に用いられるようになった。II型制限酵素につい
ても同様であり、組換えDNA技術による生産性の向上が
幾つかの酵素において報告されている（Journal of Bac
teriology 164 501（1985）,Proceeding of National A
cademy Science 78 1503（1981），特開昭61−265094
号，特開昭63−87982号）。However, in general, the amount of type II restriction enzyme produced by microorganisms was small and the amount of purified enzyme obtained was also small. In recent years, advances in genetic engineering have led to the use of recombinant DNA technology for the production of many enzymes. The same applies to type II restriction enzymes, and productivity improvement by recombinant DNA technology has been reported for some enzymes (Journal of Bac.
teriology 164 501 (1985), Proceeding of National A
cademy Science 78 1503 (1981), JP-A-61-265094
No. 63-87982).

しかしながらこれらの報告は、いずれも大腸菌を宿主と
した検討であり、バチルス（Bacillus）属細菌を宿主と
した検討は全く報告されていない。本発明のBamH I制限
エンドヌクレアーゼについても特開昭63−87982号に報
告はあるが、それは大腸菌を宿主とした検討でありしか
も２種類のベクターを使用するという非常に複雑な方法
である。However, all of these reports are studies using Escherichia coli as a host, and no studies using Bacillus bacterium as a host have been reported. The BamHI restriction endonuclease of the present invention is also reported in JP-A-63-87982, which is a study using E. coli as a host and is a very complicated method of using two types of vectors.

（発明の目的） 本発明者らはバチルス（Bacillus）属細菌を宿主とした
BamH I制限エンドヌクレアーゼのクローニングに取り組
み、前記バチルス アミロリケファシエンス（Bacillus
amyloliquefaciens）Ｈ株からBamH I制限エンドヌク
レアーゼの遺伝子を含む染色体DNA断片を抽出し、これ
をベクターに組み込んで組換えプラスミドを作成し、該
プラスミドの導入により形質転換させた微生物を得るこ
とに成功した。(Object of the Invention) The present inventors have used a bacterium of the genus Bacillus as a host.
Efforts have been made to clone the BamHI restriction endonuclease to obtain the Bacillus amyloliquefaciens (Bacillus
A chromosomal DNA fragment containing the gene for BamH I restriction endonuclease was extracted from the amyloliquefaciens) H strain, and a recombinant plasmid was prepared by incorporating this into a vector, and the transformed microorganism was successfully obtained by introducing the plasmid. .

しかも、バチルス（Bacillus）属細菌においては制限
系、修飾系の遺伝子をひとつのベクターに組み込むこと
が可能であることを始めて見いだした。本発明は、この
新しい知見に基づいて完成されたものである。Moreover, it was found for the first time that in Bacillus bacteria, it is possible to incorporate restriction and modification genes into one vector. The present invention has been completed based on this new finding.

（発明の構成） 即ち、本発明はバチルス アミロリケファシエンス（Ba
cillus amyloliquefaciens）Ｈ株由来のBamH I制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子を含む制限酵素、Hind IIIにより
切断された5kbである染色体DNA断片を組み込だ、バチル
ス（Bacillus）属細菌にて複製できる新規な組換えプラ
スミド、該プラスミドで形質転換されたバチルス（baci
llus）属に属する新規な微生物及び該形質転換微生物を
培養して、培養物からBamH I制限エンドヌクレアーゼを
採取することを特徴とするBamH I制限エンドヌクレアー
ゼの新規な製造法に係わる。(Structure of the Invention) That is, the present invention relates to Bacillus amyloliquefaciens (Ba
cillus amyloliquefaciens) H strain-derived BamHI restriction endonuclease gene-containing restriction enzyme, a novel recombinant plasmid capable of replicating in a Bacillus bacterium that has a 5 kb chromosomal DNA fragment cleaved by Hind III. , A Bacillus transformed with the plasmid
The present invention relates to a novel method for producing a BamH I restriction endonuclease, which comprises culturing a novel microorganism belonging to the genus Llus) and the transformed microorganism, and collecting BamH I restriction endonuclease from the culture.

本発明の上記組換えプラスミド及びこれを導入した形質
転換株はBamH I制限エンドヌクレアーゼを大量に生産す
るため大量のBamH I制限エンドヌクレアーゼを容易に製
造することが可能となった。Since the above recombinant plasmid of the present invention and the transformant into which it is introduced produce a large amount of BamHI restriction endonuclease, a large amount of BamHI restriction endonuclease can be easily produced.

以下本発明につき詳細に説明する。The present invention will be described in detail below.

（ａ）プラスミド及びその調製 本発明の新規プラスミドは、例えばバチルス（Bacillu
s）属に属する微生物の染色体外遺伝子（プラスミド）
として知られるpTB53等の、培養された細胞内で増殖し
うる形式をとるプラスミドにバチルス アミロリケファ
シンス（Bacillus amyloliquefaciens）Ｈ株由来のBam
H I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むDNA断片を組み
込んでなるプラスミドであり、前記ベクターDNAとして
は、天然に存在するものを抽出したものの他、増殖に必
須な部分以外のDNAの部分が一部欠落しているものでも
よい。(A) Plasmid and its preparation The novel plasmid of the present invention is, for example, Bacillus (Bacillus).
s) Extrachromosomal genes (plasmids) of microorganisms belonging to the genus
Bam from Bacillus amyloliquefaciens H strain is added to a plasmid having a format capable of growing in cultured cells, such as pTB53 known as
A plasmid comprising a DNA fragment containing a HI restriction endonuclease gene, wherein the vector DNA is a naturally-extracted one, in which a part of the DNA other than the essential part for growth is partially deleted. You may have something.

また前記ベクターDNAに前記染色体DNA断片を組み込む方
法は、既知のいずれの方法も適用しうる。例えば、適当
な制限酵素（Endonuclease）で処理して染色体DNAを特
定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターDNAと
混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられ
る。As a method for incorporating the chromosomal DNA fragment into the vector DNA, any known method can be applied. For example, a method is used in which chromosomal DNA is cleaved at a specific site by treatment with an appropriate restriction enzyme (Endonuclease), then mixed with similarly treated vector DNA, and religated with ligase.

ベクターDNAとして、pTB53プロスミドを用い、これにバ
チルス アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliqu
efaciens）Ｈ株から調製された染色体DNA断片を組み込
むことにより、新規プラスミドpBamHIRM22が得られる。
pBamHIRM22プラスミドの調製工程及び制限酵素地図を第
１図に示す。第１図から明らかなように、このプロスミ
ドはpTB53プラスミドの制限酵素サイトのHind IIIサイ
トに、バチルス アミロリケファシンス（Bacillus amy
loliquefaciens）Ｈ株のBamH I制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子を含むDNA断片が組み込まれた22Kbの塩基対を有
する円形分子である。As the vector DNA, pTB53 prosmid was used, and the Bacillus amyloliquefaciens (Bacillus amyloliqu
efaciens) H strain, a novel plasmid pBamHIRM22 is obtained by incorporating a chromosomal DNA fragment.
The preparation process of pBamHIRM22 plasmid and the restriction enzyme map are shown in FIG. As is clear from FIG. 1, this prosmid is located at the Hind III site of the restriction enzyme site of the pTB53 plasmid at the Bacillus amyloliquefacins.
loliquefaciens) H strain is a circular molecule having a 22 Kb base pair in which a DNA fragment containing the BamHI restriction endonuclease gene is incorporated.

（ｂ）微生物の調製 このようにして得られた前記染色体DNA断片とベクターD
NAの結合物を既知の形質転換法、例えばジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology） 8
1 41（1961）に記憶のコンピテント・セル法により受容
菌の微生物菌体中に導入すると、所望の遺伝形質とベク
ターDNAの形質を併せもつ形質転換株が得られる。(B) Preparation of microorganisms The chromosomal DNA fragment thus obtained and vector D
A known transformation method for a ligated product of NA, for example, Journal of Bacteriology 8
When introduced into microbial cells in recipient bacteria by 1 41 competent cell method of storage in the (1961), transformed strain having both traits desired genetic trait and the vector DNA can be obtained.

受容菌としては、前記のバチルス・ズブチリス（Bacill
us subtilis）MT2,MI113等の通常この種の技術分野で用
いられる微生物が有利に用いられる。その典型的な例と
してバチルス・ズブチルスMT2株が挙げられる［ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriol
ogy 831 154（1983）：遺伝形質:trpC2,leuC7,r_M ^-,m_M ^-,
Npr^-）］。As the recipient bacterium, the above-mentioned Bacillus subtilis (Bacill
Microorganisms commonly used in this type of technical field, such as us subtilis) MT2 and MI113, are advantageously used. A typical example is the Bacillus subtilis MT2 strain [Journal of Bacteriol.
ogy 831 154 (1983): genetic ^{_{traits: trpC2, leuC7, r M -}} , m M -,
Npr ^-)].

制限系遺伝子のクローニングされたクローンを選択的に
単離する手段としては現在２つの方法がある。まず第一
の方法はバクテリオファージ感染を利用する方法である
（Proceeding of National Academy Science 78 1503,
（1981））。すなわち細菌中に制限修飾系が存在してい
ることにより、該系はバクテリオファージによる感染に
抵抗し得るので、クローニングされた制限・修飾系遺伝
子をもっているクローンは、ファージにさらされたライ
ブラリーから生存体として選択的に単離される。第２の
方法は修飾系遺伝子を選択することにより制限系遺伝子
のクローニングされたクローンを選択する方法である
（Journal of Bacteriology 164 501,（1985））。すな
わち制限エンドヌクレアーゼに抵抗性を示すプラスミド
を選択することによりまず修飾系遺伝子のクローニング
されたクローンを選択する。次に修飾系遺伝子、制限系
遺伝子は多くの場合近接して存在するため、修飾系遺伝
子に隣接するより大きい領域をクローニングすることに
より、制限系遺伝子のクローニングされたクローンを選
択する。本発明記載のBamH I制限酵素エンドヌクレアー
ゼクローンの選択にはいずれの方法を用いることも可能
である。There are currently two methods for selectively isolating cloned clones of restriction gene. The first method is to utilize bacteriophage infection (Proceeding of National Academy Science 78 1503,
(1981)). That is, the presence of a restriction modification system in the bacterium allows the system to resist infection by bacteriophage, so clones with the cloned restriction / modification system gene survived from the phage-exposed library. It is selectively isolated as a body. The second method is a method of selecting a clone in which a restriction gene has been cloned by selecting a modification gene (Journal of Bacteriology 164 501, (1985)). That is, by selecting a plasmid that is resistant to the restriction endonuclease, a clone in which the modification system gene has been cloned is first selected. Next, since the modification gene and the restriction gene are often present in close proximity to each other, a cloned clone of the restriction gene is selected by cloning a larger region adjacent to the modification gene. Any method can be used for the selection of the BamHI restriction endonuclease clone described in the present invention.

（ｃ）制限エンドヌクレアーゼの生産 工程（ｂ）で得られた形質転換株を培養するには、特定
の遺伝情報によって生成される物質の生産に適した培地
であって且つ宿主微生物の成育に適した培地を用い得る
が、本発明方法では、通常、バチルス・ズブチルス（ba
cillus subtilis）の生育培地として用いられるＬ−Bro
th培地（トリプトン、酵母エキス、食塩）を基本培地と
して調製したものを用いればよい。(C) Production of restriction endonuclease In order to culture the transformant obtained in step (b), it is a medium suitable for the production of substances produced by specific genetic information and suitable for the growth of host microorganisms. However, in the method of the present invention, Bacillus subtilis (ba
Cillus subtilis) L-Bro used as a growth medium
A th medium (tryptone, yeast extract, salt) prepared as a basic medium may be used.

その他、必要に応じて炭素源、窒素源の他にアミノ酸、
ビタミン等の栄養素を添加してもよい。In addition to the carbon and nitrogen sources, amino acids,
Nutrients such as vitamins may be added.

培養方法は、pH、温度、酸素供給量等の条件として通常
のバチルス（Bacillus）属の微生物の成育に適した条件
を採り得るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微
生物が生育してその菌体量が最大に達したとき、即ち対
数増殖後期まで生育させるのが好ましい。培養温度は、
通常30〜37℃、pH条件は、pH5〜８の範囲、特に中性付
近が適当である。Culture method, pH, temperature, can be taken conditions suitable for growth of microorganisms of the genus Bacillus as a condition such as oxygen supply, after inoculating the medium with the microorganisms, the microorganisms are grown. It is preferable to grow when the cell amount reaches the maximum, that is, to the late logarithmic growth stage. The culture temperature is
Usually, the temperature is 30 to 37 ° C., and the pH condition is preferably in the range of pH 5 to 8, particularly around neutral.

得られた菌体を集菌後、遠心分離、超音波破砕工程等に
より抽出し、次いで除核酸法、塩析法、ゲル濾過法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、アフィニティフロマト
グラフィー法等を組み合わせることによりBamH I制限エ
ンドヌクレアーゼを得ることができる。After collecting the obtained bacterial cells, centrifugation, extraction by ultrasonication, etc., and then combining nucleic acid removal method, salting out method, gel filtration method, ion exchange chromatography method, affinity chromatography method, etc. Gives a BamHI restriction endonuclease.

（発明の効果） 本発明のプロスミド及びこれを導入した形質転換株はBa
mH I制限エンドヌクレアーゼを大量に生産するために、
その精製工程において大量のBamH I制限エンドヌクレア
ーゼを製造することが可能となった。(Effect of the invention) The prosmid of the present invention and the transformant into which it is introduced are Ba
To produce large quantities of mH I restriction endonuclease,
In the purification process, it became possible to produce a large amount of BamHI restriction endonuclease.

以下本発明を実施例により、更に詳細に説明するが、本
発明は何らこれらに限定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.

（実施例） （１） ベクタープラスミドpTB53の調製 ベクタープラスミドpTB53のDNAを保有するバチルス・ブ
ズチリス（Bacillus subtilis）MT−２を以下の通り調
製してベクタープラスミドpTB53を得た。(Example) (1) Preparation of vector plasmid pTB53 Bacillus subtilis MT-2 carrying the DNA of vector plasmid pTB53 was prepared as follows to obtain vector plasmid pTB53.

LB培地〔純水１あたりバクト・トリプトン（Difco）1
0g、バクト・イーストエキス（Difco）5g、NaCl 10gをp
H7.0に調製したもの〕100mlを500ml容坂口フラスコに分
注し、120℃で20分間オートクレーブ滅菌した。この培
地にカナマイシン0.0004％、テトラサイクリン0.025％
を添加し、pTB53のDNAをプラスミドとして保有するバチ
ルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）MT−２を１白
金耳接種し、30℃で16分間振盪培養した後、800rpm、５
分間、４℃にて遠心分離し、菌体を集めた。次に集めた
菌体5mg/mlのリゾチーム（太陽化学（株）製）、50mMグ
ルコース、10mM EDTAを含む25mMトリス塩酸緩衝液（pH
8.0）5mlに懸濁し、37℃で30分間静止した。次に氷中で
５分静置した後、１％SDSを含む0.2N NaOH四液10mlを加
え、氷中で10分間静置した。更に3Mの酢酸ナトリウム溶
液（pH4.8）を7.5ml加えて氷中で15分間静置した。16,0
00rpm、20分間、４℃にて遠心分離を行った。LB medium [Bacto tryptone (Difco) 1 per 1 pure water
0g, Bact yeast extract (Difco) 5g, NaCl 10g
100 ml prepared in H7.0] was dispensed into a 500 ml Sakaguchi flask and autoclaved at 120 ° C. for 20 minutes. 0.0004% kanamycin and 0.025% tetracycline in this medium
Was added, and 1 platinum loop of Bacillus subtilis MT-2 harboring pTB53 DNA as a plasmid was inoculated, followed by shaking culture at 30 ° C. for 16 minutes, then 800 rpm, 5
The cells were collected by centrifugation at 4 ° C for minutes. Next, a 25 mM Tris-HCl buffer (pH: 5 mg / ml of lysozyme (Tayo Kagaku Co., Ltd.), 50 mM glucose, 10 mM EDTA)
8.0) Suspended in 5 ml and kept still at 37 ° C. for 30 minutes. Then, the mixture was allowed to stand in ice for 5 minutes, then 10 ml of 0.2N NaOH 4 solution containing 1% SDS was added, and allowed to stand in ice for 10 minutes. Furthermore, 7.5 ml of 3M sodium acetate solution (pH 4.8) was added, and the mixture was allowed to stand for 15 minutes on ice. 16,0
Centrifugation was performed at 00 rpm for 20 minutes at 4 ° C.

この上清に12mlのイソプロパノールを加え、10,000rp
m、30分間、18℃にて遠心分離を行い、得られた沈澱物
について、70％エタノール洗浄後、6mlの50mM EDTA含む
50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解させた。次に5.9
gの塩化セシウム、0.3mlのエチジウムブロマイド溶液
（５％ジメチルスルホキシドを含む１％エチジウムブロ
マイド溶液）と混合し、38,000rpm、40時間、18℃にて
遠心分離を行った。プラスミドDNA層を注射器で抜き取
り、ｎ−ブタノール抽出によってエチジウムブロマイド
を除去し、1mM EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
5）に透析することにより、約30μｇのpTB53DNAを取得
した。Add 12 ml of isopropanol to the supernatant and add 10,000 rp
Centrifuge at 18 ℃ for 30 minutes, wash the precipitate with 70% ethanol, and then add 6ml of 50mM EDTA.
It was dissolved in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). Then 5.9
The mixture was mixed with g of cesium chloride and 0.3 ml of ethidium bromide solution (1% ethidium bromide solution containing 5% dimethyl sulfoxide), and centrifuged at 38,000 rpm, 40 hours, 18 ° C. The plasmid DNA layer was extracted with a syringe, ethidium bromide was removed by n-butanol extraction, and 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.
By dialysis to 5), about 30 μg of pTB53 DNA was obtained.

（２） BamH I制限エンドヌクレアーゼの遺伝子をもつ
染色体DNAの調製 バチルス アシロリケファシエンス（Bacillusamyloliq
uefaciens）Ｈ株をＬ−Broth培地［純水1lあたりトリプ
トン（Difco）10g、酵母エキス5g、NaCl 10gをpH7.0に
調製したもの］50mlに接種し、30℃で振盪培養を行なっ
た。14時間後に菌体を集めた。次に集めた菌体を10mg/m
lのリゾチーム［太陽化学（株）製］、20％ショ糖、1mM
EDTAを含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）20mlに懸濁
し、37℃で10分間静置した。次に１％ラウロイルサルコ
シン酸を含む0.1M EDTA（pH9.6）44ml及び5.44mg/mlの
プロナーゼ溶液2.0mlを加え、50℃で30分間静置した。
次に塩化セシウム66g、10mg/mlのエチジウムブロマイド
溶液3.3mlを加え、混合した後に38,000rpm、40時間の遠
心分離を行なった。DNA層を注射器で抜きとり、ｎ−ブ
タノール抽出によってエチジウムブロマイドを除去し、
1mM EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に透析
することにより約500μｇの染色体DNAを取得した。(2) Preparation of chromosomal DNA containing the gene for BamHI restriction endonuclease Bacillus amyloliquefaciens
Uefaciens) strain H was inoculated into 50 ml of L-Broth medium [10 g of tryptone (Difco), 5 g of yeast extract, and 10 g of NaCl adjusted to pH 7.0 per 1 l of pure water], and shake culture was performed at 30 ° C. After 14 hours, the bacterial cells were collected. Next, collect 10 mg / m
l lysozyme [manufactured by Taiyo Kagaku], 20% sucrose, 1 mM
The cells were suspended in 20 ml of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) containing EDTA and left standing at 37 ° C for 10 minutes. Next, 44 ml of 0.1 M EDTA (pH 9.6) containing 1% lauroyl sarcosinic acid and 2.0 ml of a 5.44 mg / ml pronase solution were added, and the mixture was allowed to stand at 50 ° C. for 30 minutes.
Next, 66 g of cesium chloride and 3.3 ml of a 10 mg / ml ethidium bromide solution were added, mixed, and then centrifuged at 38,000 rpm for 40 hours. Remove the DNA layer with a syringe and remove ethidium bromide by n-butanol extraction,
About 500 μg of chromosomal DNA was obtained by dialysis against 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 mM EDTA.

（３） 染色体DNA断片のベクターへの挿入 （１）で得られた染色体DNA3μｇについて1.0ユニット
のHind III制限エンドヌクレアーゼを加え、37℃、１時
間の反応を行なうことにより、これを部分分解した。次
に（１）で得られたベクタープラスミドpTB53 1μｇに
ついて４ユニットのHind III制限エンドヌクレアーゼを
加え、37℃、１時間の反応を行なうことによりこれを完
全分解した。(3) Insertion of chromosomal DNA fragment into vector. About 3 μg of chromosomal DNA obtained in (1), 1.0 unit of Hind III restriction endonuclease was added, and the reaction was carried out at 37 ° C. for 1 hour to partially decompose it. Next, 1 unit of the vector plasmid pTB53 obtained in (1) was completely decomposed by adding 4 units of Hind III restriction endonuclease and performing a reaction at 37 ° C. for 1 hour.

以上の反応により得られた３μｇの染色体DNA断片と１
μｇのpBR322のDNA断片を混合し、更に1mMATP及び5mMジ
チオスレイトールの存在下に５ユニットのT₄ファージ由
来のDNAリカーゼを用いて15℃、16時間の連結反応を行
なうことにより染色体DNAを組み込んだプラスミドDNAを
取得した。3 μg of the chromosomal DNA fragment obtained by the above reaction and 1
Chromosomal DNA was incorporated by mixing μg of pBR322 DNA fragment and further ligating the DNA ligase derived from 5 units of T ₄ phage in the presence of 1 mM ATP and 5 mM dithiothreitol at 15 ° C for 16 hours. The plasmid DNA was obtained.

（４） BamH I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む組
み換えプラスミドによる形質転換 バチルス・ズブチリス、MT2株を前記Ｌ−Broth培地5ml
に接種し、37℃で終夜振盪培養した。次にその1mlをTF
I培地（純水1lあたり（NH₄）₂SO₄0.2g、K₂HPO₄1.4g、KH
₂PO₄0.6g、クエン酸ナトリウム0.1g、カザミノ酸0.2g、
グルコース5g、MgSO₄0.2g、アルギニン0.05g、トリプト
ファン0.05g）20mlに植菌し、37℃３時間45分振盪培養
した。更にその4mlをTF II培地（純水1lあたり（NH₄）₂
SO₄0.2g、K₂HPO₄1.4g、KH₂PO₄0.6g、クエン酸ナトリウ
ム0.1g、カザミノ酸0.1g、グルコース5g.MgSO₄0.2g、ア
ルギニン0.005g、トリプトファン0.005g）36mlに植菌
し、コンピテントセルを調製した。得られたコンピテン
トセル1mlに（３）で得られたプラスミドDNAの溶解液を
加え、37℃で30分間激しく振盪した後、これを遠心分離
（3,000rpm10min）集菌後、1mlの前記Ｌ−Broth培地を
加え37℃で2.5時間振盪培養し、更にテトラサイクリン
を含んだＬ−broth寒天培地に広げ、37℃で終夜培養し
た。得られた形質転換株をバチルス・ズブチリス（Baci
llus subfilis）のバクテリオファージであるρ11C3フ
ァージ（Journal of General Applied Microbiology 25
223,（1979））を10³〜10⁴pfu含んだ前記LB培地にレプ
リカした。同培地で生育してくる株を選択することによ
りカナマイシン及びテトラサイクルリン耐性を有し、且
つBamH I制限エンドヌクレアーゼを生産する株バチルス
・ズブチルス（Bacillus subtilis）MT2（pBamHIRM22）
（微工研菌寄第10175号）を分離した。(4) Transformation with recombinant plasmid containing BamHI restriction endonuclease gene Bacillus subtilis, MT2 strain was transformed with 5 ml of the above L-Broth medium.
And cultured at 37 ° C. overnight with shaking. Next, 1 ml of that is TF
I medium (per 1 liter of pure water (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 0.2 g, K ₂ HPO ₄ 1.4 g, KH
₂ PO ₄ 0.6 g, sodium citrate 0.1 g, casamino acid 0.2 g,
Glucose 5 g, MgSO ₄ 0.2 g, arginine 0.05 g, tryptophan 0.05 g) 20 ml) was inoculated and cultured with shaking at 37 ° C. for 3 hours and 45 minutes. Furthermore, 4 ml of it was added to TF II medium ((NH ₄ ) ₂
SO ₄ 0.2 g, K ₂ HPO ₄ 1.4 g, KH ₂ PO ₄ 0.6 g, sodium citrate 0.1 g, casamino acid 0.1 g, glucose ₅ g. MgSO ₄ 0.2 g, arginine 0.005 g, tryptophan 0.005 g) Then, a competent cell was prepared. The lysis solution of the plasmid DNA obtained in (3) was added to 1 ml of the obtained competent cells, and the mixture was vigorously shaken at 37 ° C for 30 minutes, and then the cells were collected by centrifugation (3,000 rpm 10 min), and 1 ml of the L- Broth medium was added, and the mixture was cultured at 37 ° C. for 2.5 hours with shaking, further spread on L-broth agar medium containing tetracycline, and cultured at 37 ° C. overnight. The obtained transformant was transformed with Bacillus subtilis (Baci
llus subfilis) bacteriophage ρ11C3 phage (Journal of General Applied Microbiology 25
223, (1979)) was replicated in the LB medium containing 10 ³ to 10 ⁴ pfu. Strains Bacillus subtilis MT2 (pBamHIRM22) that have kanamycin and tetracyclerin resistance by selecting a strain that grows in the same medium and that produce a BamHI restriction endonuclease
(Microtechnology Research Institute, No. 10175) was separated.

（５） バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）M
T2（pBamHIRM22）によるBamH I制限エンドヌクレアーゼ
の生産 （４）で得られた形質転換株バチルス・ズブチリスMT2
（pBamHIRM22）（微工研菌寄第10175号）を前記Ｌ−Bro
th培地500mlを含む２容のフラスコ37℃、16時間振盪
培養を行なった。これを遠心分離して集菌、洗浄後10mM
MgCl₂,7mM 2−メルカプトエタノールを含んだ20mMのト
リス塩酸緩衝液（pH7.5）25mlに懸濁し、０℃で10分間
の超音波破砕を行なった。更に12,000rpmで10分間の遠
心分離により酵素抽出液を得た。次にこの酵素抽出液に
硫安粉末を氷冷下添加溶解し、30〜80％飽和画分を（飽
和度はOsborne法で表示）を遠心分離により回収した。
この回収沈殿物を2mMメルカプトエタノール、５％グリ
セロールを含んだ10mMリン酸緩衝液（pH7.5）2mlに溶解
し、更に透析チューブに入れて、100倍量の同緩衝液に
対して１夜透析した。続いて同緩衝液にて平衡化したホ
スホセルロース（ワットマン社製）のカラム（容量20m
l）に吸着させた。５倍量の同緩衝液で洗浄後０〜1.0M
kClグラジエント溶出を行なった。BamH I制限エンドヌ
クレアーゼはKCl濃度0.5M付近で溶出された。溶出した
酵素液を透析チューブに入れ、2mMメルカプトエタノー
ル、50％グリセロールを含んだリン酸緩衝液に透析する
ことにより0.2mlの酵素液が得られた。得られた酵素液
の酵素活性を測定したところ10,000ユニットであり、こ
れは親株のバチルス・アミロリクファシエンス（Bacill
us amyloliquefaciens）Ｈ株の約５倍の生産量であっ
た。(5) Bacillus subtilis M
Production of BamHI restriction endonuclease with T2 (pBamHIRM22) (4) Transformant Bacillus subtilis MT2
(PBamHIRM22) (Microtechnology Research Institute, No. 10175) was added to the L-Bro
A two-volume flask containing 500 ml of th medium was cultured at 37 ° C. for 16 hours with shaking. This was centrifuged to collect the cells, and after washing, 10 mM
It was suspended in 25 ml of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing MgCl ₂ , 7 mM 2-mercaptoethanol, and ultrasonically disrupted at 0 ° C. for 10 minutes. Further, an enzyme extract was obtained by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes. Next, ammonium sulfate powder was added to and dissolved in this enzyme extract under ice-cooling, and a 30-80% saturated fraction (saturation degree was represented by Osborne method) was collected by centrifugation.
The recovered precipitate was dissolved in 2 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 2 mM mercaptoethanol and 5% glycerol, put into a dialysis tube, and dialyzed against 100 times the volume of the same buffer overnight. did. Subsequently, a column of phosphocellulose (manufactured by Whatman) equilibrated with the same buffer solution (capacity 20 m
l). 0-1.0M after washing with 5 volumes of the same buffer
A kCl gradient elution was performed. BamHI restriction endonuclease was eluted at a KCl concentration of around 0.5M. The eluted enzyme solution was put into a dialysis tube and dialyzed against a phosphate buffer containing 2 mM mercaptoethanol and 50% glycerol to obtain 0.2 ml of the enzyme solution. The enzyme activity of the obtained enzyme solution was measured and found to be 10,000 units. This was Bacillus amyloliquefaciens (Bacill).
The production amount was about 5 times higher than that of the H. amyloliquefaciens) H strain.

この様にして得られた酵素液は他の制限エンドヌクレア
ーゼ、フォスファターゼ、非特異的DNaseなどを含んで
おらず、遺伝子工学の分野で利用することが可能であっ
た。なおBamH I制限エンドヌクレアーゼの活性の測定
は、１μｇのλ−DNAを10mMトリス塩酸緩衝液、10mM塩
化マグネシウム溶液、50mM硫酸アンモニウム、7mM2−メ
ルカプトエタノールからなる反応液45μに溶解し、そ
の混合液５μの酵素液を加えて、37℃で１時間の反応
を行なった後、アガロース電気泳動を行なうことにより
測定する。酵素活性における１単位は37℃、pH7.5にお
いて１時間に１μｇのλ−DNAを完全に分解する酵素活
性をいう。The enzyme solution thus obtained did not contain any other restriction endonuclease, phosphatase, non-specific DNase, etc., and could be used in the field of genetic engineering. The activity of BamHI restriction endonuclease was measured by dissolving 1 μg of λ-DNA in a reaction solution of 45 μm consisting of 10 mM Tris-HCl buffer, 10 mM magnesium chloride solution, 50 mM ammonium sulfate, and 7 mM2-mercaptoethanol. The enzyme solution is added and the reaction is carried out at 37 ° C. for 1 hour, followed by agarose electrophoresis for measurement. One unit in the enzyme activity means an enzyme activity that completely decomposes 1 μg of λ-DNA in 1 hour at 37 ° C. and pH 7.5.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

第１図は本願発明のpBamHIRM22のプラスミドの調製工程
及び制限酵素地図を示す。FIG. 1 shows a process for preparing a plasmid of pBamHIRM22 of the present invention and a restriction enzyme map.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:07） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI Technical indication C12R 1:07) (C12N 9/16 A C12R 1:07)

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】バチルス アミロリケファシエンス（Baci
llus amyloliquefaciens）Ｈ株由来のBamH I制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子を含む、制限酵素、Hind IIIによ
り切断された5kbである染色体DNA断片を組み込んだ組換
えプラスミドで形質転換されたバチルス（Bacillus）属
に属する新規な微生物。1. A Bacillus amyloliquefaciens (Baci)
llus amyloliquefaciens) H strain-derived BamH I restriction endonuclease gene-containing Bacillus genus transformed with a recombinant plasmid incorporating a 5 kb chromosomal DNA fragment cleaved by Hind III Microorganisms. 【請求項２】バチルス アミロリケファシエンス（Baci
llus amyloliquefaciens）Ｈ株由来のBamH I制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子を含む、制限酵素、Hind IIIによ
り切断された5kbである染色体DNA断片を組み込んだ組換
えプラスミドで形質転換されたバチルス（Bacillus）属
に属する微生物を培養して、培養物からBamH I制限エン
ドヌクレアーゼを採取することを特徴とする新規なBamH
I制限エンドヌクレアーゼの製造法。2. Bacillus amyloliquefaciens
llus amyloliquefaciens) Strain-derived BamHI restriction endonuclease gene-containing microorganisms belonging to the genus Bacillus transformed with a recombinant plasmid incorporating a 5 kb chromosomal DNA fragment cleaved by a restriction enzyme, Hind III Novel BamH characterized by culturing BamH I and collecting BamH I restriction endonuclease from the culture
Method for producing I restriction endonuclease.